JP7036909B2 - 抗cd38抗体および使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年10月10日に出願された米国仮出願第62/570,655号、2017年10月11日に出願された米国仮出願第62/570,660号、2018年5月24日に出願された米国仮出願第62/676,221号、および2018年8月3日に出願されたEP出願第EP18187186.4号の優先権の利益を主張し、これらのすべてを参照によってその全体として本明細書に組み入れる。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出の内容を参照によってその全体として本明細書に組み入れる:配列表のコンピュータで読み込み可能な形式(CRF)(ファイル名:183952029941seqlist.TXT、記録日:2018年10月8日、サイズ:158KB)。
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNG(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)もしくはGYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)もしくはIYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)もしくはQSVSSYGQG(配列番号132)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)もしくはGAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH1ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH2ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH2ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;またはVH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GYTFTSFN(配列番号31)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGNGGT(配列番号32)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、ESVDSYGNGF(配列番号34)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、LAS(配列番号35)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;またはVH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号5のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;VH3ドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む;またはVH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
(a)VH1ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、GFTFSSYG(配列番号41)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IWYDGSNK(配列番号42)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARMFRGAFDY(配列番号43)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QGIRND(配列番号44)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、AAS(配列番号45)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびLQDYIYYPT(配列番号46)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む。一部の実施形態では、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;またはVH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む;またはVH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、VH3ドメインは、配列番号9のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4のうちの少なくとも1つは、独立して、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、L1、L2、L3またはL4は、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である。一部の実施形態では、(a)L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、0アミノ酸長であるかもしくはGGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含み;または(b)L1、L2、L3およびL4は、それぞれ独立して、GGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、L1は、配列GQPKAAP(配列番号58)を含み、L2は、配列TKGPS(配列番号57)を含み、L3は、配列Sを含み、L4は、配列RTを含む;L1は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L2は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である;L1は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L2は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L3は、0アミノ酸長であり、L4は、0アミノ酸長である;またはL1は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L2は、0アミノ酸長であり、L3は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L4は、0アミノ酸長である。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wである。一部の実施形態では、第2のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vである。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号62のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号65のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号67のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号68のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号70のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の
ポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号69のアミノ酸配列を含む。
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し;
(a)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである;または(b)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である、結合タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~237位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、配列EFLGGがPVAGによって置きかえられる。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、ならびにVH3およびVL3のうちの少なくとも1対は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、ならびにVH3およびVL3のうちの1、2、または3対は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1からなる群から選択される抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第1の対は、ヒトCD3ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、VH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第2の対は、ヒトCD28ポリペプチドに結合する抗原結合部位を形成し、ならびにVH1およびVL1、VH2およびVL2、およびVH3およびVL3のうちの第3の対は、A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BlyS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL24、CCL25、CCL26、CCR3、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD23、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD70、CD80、CD86、CD122、CD137、CD137L、CD152、CD154、CD160、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279、CDH1、キチナーゼ、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1、CSF-2、CSF-3、CX3CL1、CXCL12、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNα、IgE、IGF1R、IL2Rベータ、IL1、IL1A、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、IL9R、IL10、rhIL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、レプチン、LPFS2、MHCクラスII、NCR3LG1、NKG2D、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受容体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2、STEAP2、Sykキナーゼ、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TNFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM、およびXCR1からなる群から選択されるヒト抗原標的に結合する抗原結合部位を形成する。
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別段に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。文脈によって別段に要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。この明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、別段に明確に定義されない限り、複数形を含む。よって、例えば、「分子(a molecule)」への言及は、場合により、2つまたはそれ以上のこのような分子の組合せなどを含む。
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro;
(2)極性親水性:Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr;
(3)脂肪族:Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro;
(4)脂肪族疎水性:Ala、Ile、Leu、Val、Pro;
(5)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(6)酸性:Asp、Glu;
(7)塩基性:His、Lys、Arg;
(8)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(9)芳香族:His、Trp、Tyr、Phe;および
(10)芳香族疎水性:Phe、Trp、Tyr。
本開示のある特定の態様は、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチド)に結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質に関する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、単一特異性および/もしくは一価、二重特異性および/もしくは二価、三重特異性および/もしくは三価、または多重特異性および/または多価である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位を含む。抗原結合部位が抗原に結合するか否かを決定するための例示的なアッセイは本明細書に記載されており、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、ELISAアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、SPRアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、それらの細胞表面にCD38ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって決定される。例えば、実施例1、3、および4を参照されたい。
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI(配列番号1)
ヒトCD38アイソフォームEポリペプチド配列
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRHFWECGSP(配列番号105)
カニクイザルCD38ポリペプチド配列
RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI(配列番号30)
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位および異なる標的抗原に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位および1つまたはそれ以上のCD38ポリペプチドに結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、2つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する4つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖(例えば、国際公開第WO2012/135345号に記載された構造を有する)を含む二重特異性および/または二価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、二価および/または二重特異性である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、四価および/または四重特異性である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、四価および/または二重特異性である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合する。
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
で表される構造を有する2つのポリペプチド鎖を含み
2つのポリペプチド鎖は、式:
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
で表される構造を有し、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
VL1-L1-VL2-L2-CL-Fc
を含み、
第2のポリペプチド鎖は、
VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc
を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
第1および第2のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
VL1-L1-VL2-L2-CL
を含み、
第2のポリペプチド鎖は、
VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc
を含み、
第3のポリペプチド鎖は、抗体Fc領域を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
Fcは、免疫グロブリンヒンジ領域およびCH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み;
L1、L2、L3、およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
第1および第2のポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
で表される構造を含む第1のポリペプチド鎖、および式:
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
で表される構造を含む第2のポリペプチド鎖を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、VH1およびVL1は、CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH2およびVL2は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、VH2およびVL2は、 CD38ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを形成し、VH1およびVL1は、別の抗原標的に結合する抗原結合ドメインを形成する。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、3つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および/または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、CD38ポリペプチド(例えば、ヒトおよび/またはカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメイン)に結合する。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結したFc領域をさらに含み、Fc領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。
一部の実施形態では、リンカーL1、L2、L3およびL4は、アミノ酸なし(長さ=0)から約100アミノ酸長、または100、50、40、30、20、または15アミノ酸未満またはそれ以下の範囲である。リンカーはまた、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸長である。1つの結合タンパク質におけるL1、L2、L3およびL4は、すべて同じアミノ酸配列を有するかまたはすべて異なるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、全長抗体重鎖またはFc領域を含むポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトFc領域、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、抗体のヒンジ、CH1、CH2、CH3、場合によりCH4ドメインを含む。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、上に記載された変異のうちの1つまたはそれ以上を含む。
本開示は、ヒトおよび/もしくはカニクイザルCD38ポリペプチドに結合し、T細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+T細胞)の増殖を誘導し、ならびに/またはCD38+細胞のアポトーシスを誘導する抗原結合タンパク質を提供する。これらのパラメータを測定し、このような結合タンパク質を同定するための例示的なアッセイが、本明細書において提供される。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質またはその抗原結合断片と精製されたCD38ポリペプチドの間の結合親和性は、SPRによって測定され(例えば、上に記載されているように)、結合タンパク質またはその抗原結合断片と細胞表面で発現されたCD38ポリペプチドの間の結合親和性は、フローサイトメトリーによって測定される(例えば、上に記載されているように)。
結合タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを組換え発現ベクター中に組み込み、このようなベクターを宿主細胞中に導入するために、標準組換えDNA方法が使用される。例えば、Sambrookら、2001、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版)を参照されたい。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野で通常達成されるように、または本明細書に記載されているように実施される。特別の定義が提供されない限り、本明細書に記載の解析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学に関連して利用される命名法、ならびにその実験手順および技法は、周知のものであり、当技術分野において通常使用される。同様に、従来の技法は、化学的合成、化学的解析、医薬品製造、製剤化、送達、および患者の処置のために使用される。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の1つまたはそれ以上の単離されたポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞、ポリヌクレオチドのキット、ベクター、および/またはベクター系に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞(例えば、大腸菌(E.coli)細胞)である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞(例えば、S.セレビシエ(S.cerevisiae)細胞)である。一部の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例として、例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)細胞(例えば、S2細胞)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞(例えば、High Five(商標)細胞)およびツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)細胞(例えば、Sf21またはSf9細胞)を挙げることができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の例として、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞(例えば、懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた293または293細胞)、Expi293TM細胞、CHO細胞、ベビーハムスター腎臓細胞(例えば、BHK、ATCC CCL 10)、マウスセルトリ細胞(例えば、TM4細胞)、サル腎臓細胞(例えば、CV1 ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(例えば、VERO-76、ATCC CRL-1587)、ヒト子宮頸癌細胞(例えば、HELA、ATCC CCL 2)、イヌ腎臓細胞(例えば、MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝臓細胞(例えば、BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(例えば、W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝臓細胞(例えば、Hep G2、HB 8065)、マウス***腫瘍細胞(例えば、MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞、MRC 5細胞、FS4細胞、ヒト肝細胞腫系統(例えば、Hep G2)および骨髄腫細胞(例えば、NS0およびSp2/0細胞)を挙げることができる。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、1つまたはそれ以上(例えば、3つ)の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および/または三価の結合タンパク質である。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中:
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は、2つの別個の抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向を有する。上述のように、第2および第3のポリペプチド鎖は、FC領域(例えば、ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む)を含む。一部の実施形態では、Fc領域のうちの一方または両方は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、233~236、および/または409位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、S228P;E233P、F234V、L235A、および236における欠失;ならびに/またはR409Kである。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および/または329位に対応する位置に1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、L234A、L235A、および/またはP329Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および/または300位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S298N、T299A、および/またはY300Sである。
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第2および第3のポリペプチド鎖は、CH1に連結したFc領域をさらに含み、Fc領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにCH2およびCH3免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228、233~236、および/または409位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトIgG4 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、S228P;E233P、F234V、L235A、および236における欠失;ならびに/またはR409Kである。一部の実施形態では、一方または両方のFc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および/または329位に対応する位置に1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、L234A、L235A、および/またはP329Aである。一部の実施形態では、Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および/または300位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトIgG1 Fc領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、S298N、T299A、および/またはY300Sである。
結合タンパク質は、1つまたはそれ以上の標的抗原の検出および定量化のための、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような任意の公知のアッセイ方法において用いることができる。結合タンパク質は、用いられているアッセイ方法にとって適当である親和性で、1つまたはそれ以上の標的抗原と結合する。
結合タンパク質を含む治療用組成物または医薬組成物は、本開示の範囲内である。このような治療用組成物または医薬組成物は、治療有効量の結合タンパク質、または結合タンパク質-薬物コンジュゲートを、投与様式との適合性について選択された薬学的にまたは生理学的に許容される製剤と混合して含む場合がある。
抗CD38_C2-CD38-1:mAb1
抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1またはCD38VH1:mAb2
抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3:mAb3
抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3:mAb4
抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3:mAb5
抗CD38_1370またはCD38HHY1370:mAb6
抗CD38_SB19またはイサツキシマブ:mAb7。
以下の実施例は、モノクローナル抗CD38抗体の生成および特徴付けについて記載する。有利には、ヒトおよびサルCD38タンパク質と交差反応し、それによって安全性研究と臨床研究の両方のために使用することができる分子を提供する抗体が本明細書において提供される。これらの抗体は、アポトーシスおよび抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)によってCD38+細胞を死滅させることも可能である。
モノクローナル抗体の生成
ヒトCD38細胞外ドメインR45-I300(配列番号1)を使用して、ヒトCD38への抗体を生成した。Q.Liu、I.Krilksunov、R.Graeff、C.Munshi、H.C.Lee、およびQ.Hao 2005 Structure 13::1331~1339頁を参照されたい。ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む正常BalbCマウスまたはトランスジェニックTrianni Mice(商標)(Trianni、San Francisco、CA)のいずれかに対して、免疫原を、免疫応答を刺激するためにアジュバントとともに直接投与した。
骨髄腫細胞に融合させずに、抗CD38抗体もまた、抗原陽性B細胞から直接単離した。この方法を使用して、mAb1のようないくつかの抗CD38抗体を得た(VHおよびVL配列については、それぞれ、配列番号5および6、ならびに重鎖および軽鎖配列については、それぞれ、配列番号7および8を参照されたい)。簡潔には、6~8週齢の雌BALB/cマウス(S082342;Charles River Labs、Bar Harbor、 ME)はそれぞれ、A. Wennerbergら(1993 Am.J.Pathol. 143:1050~1054頁)に記載された古典的方法を使用して、41日をかけて3回の免疫化を受けた。マウスの腹側の部位に抗原を腹腔内投与した。最後の注射の3日後に、マウスを屠殺し、脾臓を無菌で単離し、新鮮なRPMI培地で洗浄した。リンパ球を脾臓から放出させ、蛍光抗体と二重のヒトおよびサルCD38タンパク質のパネルを含む4色の選別戦略を使用して選別する前に、単一細胞の懸濁液をRPMI培地で2回洗浄し、次いで、フローサイトメトリー細胞選別を使用して分離し、ヒト/サル交差反応性IgG-CD38特異的B細胞を単離した。単一細胞をPCRチューブへと直接選別し、RT-PCRによってVHおよびVL遺伝子のコグネイト対を増幅させた(T.Tiller、C.BusseおよびH. Wardemann 2009 J.Immunol.Methods 350:183~193頁)。得られたDNAをシークエンシングした。
Kilpatrickら 1997 Hybridoma 16:381389頁に記載されているヒトCD38の細胞外ドメインを有するP3X63-Ag8.653骨髄腫細胞を使用して、免疫化、融合およびスクリーニングを実施した。Kilpatrickらによって記載されたRIMMS方法を使用して、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む6~8週齢の雌トランスジェニックTrianni Mice(商標)はそれぞれ、3~4日間隔で14日かけて4回の免疫化を受けた。RIBIのアジュバント(Sigma 番号T2684)中に乳化されたCD38タンパク質を、マウスの背に沿った流入領域リンパ節の近位の6つの部位および腹部に沿った6つの並列部位に皮下投与した。最後の注射の4日後に、マウスを屠殺した。両側の膝窩、浅鼠径、腋窩および上腕のリンパ節を無菌で単離し、新鮮なRPMI培地で洗浄した。リンパ球をリンパ節から放出させ、ポリエチレングリコールを使用してP3X63-AG8.653骨髄腫細胞と融合させる前に、単一細胞の懸濁液をRPMI培地で2回洗浄した。融合後に、細胞混合物をインキュベーター中で、37℃にて16~24時間インキュベートした。得られた細胞調製物を選択的半固体培地中に移し、100mmのペトリ皿中に無菌でプレートアウトし、37℃でインキュベートした。選択開始の10日後に、ハイブリドーマの成長についてプレートを調査し、目に見えるコロニーをピックアップし、成長培地200μLを含有する96ウェルプレート中に置いた。96ウェルプレートを、インキュベーター中で、37℃にて2から4日間保持した。この技法、および上述の免疫原を使用し、mAb6のようないくつかの抗CD38キメラ抗体を得た(VHおよびVL配列については、それぞれ、配列番号9および10、ならびに重鎖および軽鎖配列については、それぞれ、配列番号11および12を参照されたい)。VHおよびVL配列をRT-PCRによって回収し、上述したように一過的発現によってmAb6を産生した。
抗huCD38mabの結合特性を、BIAcore 2000(BIAcore Inc.、Uppsala、NJ)を使用して評価した。簡潔には、CM5 BIAcoreバイオセンサーチップを機器へとドッキングし、室温で、1:1のNHS/EDC 250μLで活性化した。マウス抗ヒトFc IgG1(GE Healthcare 番号BR-1008-39)(0.05Mの酢酸緩衝液中13.5μg/mL、pH5)をフローセル1中の活性化チップ上で固定化した。固定化は、流速5μL/分で行った。次いで、エタノールアミン-HCl(pH8.5)55μLの注射によってチップをブロックし、続いて、50mMのNaOH、1MのNaClで5回洗浄した。ヒトCD38タンパク質またはcynoCD38タンパク質への抗CD38mabの結合を測定するために、BIAcoreランニング緩衝液(HBS-EP)中2μg/mLの抗体を使用した。抗原(ヒトCD38-histag(ID2)またはcynoCD38-histag(ID3))を3から1000nM注射した。注射期の完了後、同じ流速で360秒間、BIAcoreランニング緩衝液中で解離をモニタリングした。50mMのNaOH-1MのNaCl 30μLを使用して、注射間に表面を再生した。BIAsimulationソフトウェアを使用して、個々のセンソグラムを解析した。
組換えマウスプレB::300.19細胞表面で発現されるCD38への抗CD38抗体の結合を、フローサイトメトリーによって決定した。組換え細胞株は、J.Deckketら 2014 Clin.Cancer Res 20:4574~4583頁に記載されていた。マウスpreB::300.19 CD38発現細胞を、96ウェルHigh Bindプレート(MSD L15XB-3)上に40,000細胞/ウェルでコーティングし、抗CD38抗体100μL/ウェルを4℃で45分間添加し、PBS中1%のBSAで3回洗浄した。Alexa488(Jackson ImmunoResearch;番号109-545-098)とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG 100μL/ウェルを4℃で45分間添加し、PBS中1%のBSAで3回洗浄した。遠心分離とPBS中1%のBSA 200μl/ウェルを添加することによる細胞の再懸濁後に、抗体結合を評価し、Guava(登録商標) easyCyte(商標)8HTフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った。見かけのKDおよびEC50値を、それぞれ、BIOST@T-BINDINGおよびBIOST@T-SPEEDソフトウェアを使用して推定した。
ヒトSU-DHL-8またはMOLP-8細胞への新たに単離したmAb1の結合を、フローサイトメトリーを使用して、イサツキシマブのものと比較した(図1A)。両方の抗体は、両方の細胞株に対して高親和性の結合を示した。しかしながら、mAb1だけが、それらの表面にカニクイザルCD38を発現する細胞に結合することができた(図1B)。
この実施例は、実施例1で生成した抗体のヒト化について記載する。
次に、実施例2で生成したヒト化抗CD38バリアントを、ヒトおよびカニクイザルCD38ポリペプチドへの結合ならびにアポトーシス誘導について特徴付けた。
アポトーシス誘導アッセイ
表示した抗体1.5μg/mL(10nM)を含む完全培地(RPMI-1640、10%のFBS、2mMのL-グルタミン)中で、37℃にて20時間、5%のCO2とともに、2×105細胞/mLの細胞をインキュベートした。製造業者の使用説明書(Life Technologies)に従って、細胞をAnnexinV-FITCで染色した。acquisition controlとデータ解析のためのBD FACSDivaソフトウェアを有するBD FACSAria(商標)フローサイトメーター(いずれもBD Biosciences)で、フローサイトメトリーによってサンプルを解析した。
上述したように産生した、選択された抗ヒトCD38抗体の結合特性を調査した(図2A~2H)。可溶性ヒトCD38およびカニクイザルCD38への抗体の結合を、ELISAおよびSPRを使用して調査した。ELISAのデータを使用して、ヒト化抗CD38抗体であるmAb2(図2A)、mAb3(図2C)、mAb4、mAb5(図2E)、およびヒト抗CD38抗体であるmAb6(図2I)について、ヒトおよびカニクイザルCD38への抗体結合のEC50を決定した。
次に、実施例1~3に記載した選択した抗CD38抗体の抗原結合ドメインの結合特性を、図3Aに示した三重特異性形式において解析した。
以下の実施例は、mAb2およびmAb6抗体に由来する可変ドメインを含有する新規T細胞エンゲージャーの安定性、結合特性、および活性を特徴付けるための実験について記載する。三重特異性結合タンパク質の抗CD38、CD3およびCD28アームのバリアントを含む追加の抗CD38×CD28×CD3抗体を生成した。新規の抗CD38/CD3/CD28抗体は:1)抗CD38結合ドメイン(mAb2またはmAb6);2)抗CD3結合ドメイン(CD3highまたはCD3low;それぞれ、抗CD3low VHおよびVL配列についての配列番号84および85を参照されたい);3)抗CD28結合ドメイン(CD28supまたはCD28cvn)において異なる。可能な組合せ内で、抗CD38×CD28×CD3の回収を設計し、産生し、次に、様々な機能について試験した。
三重特異性結合タンパク質の産生および精製
製造業者の使用説明書に従って、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Thermo Fisher Scientific)を使用して、4つの発現プラスミドをExpi293細胞へと一過的にトランスフェクションすることによって、三重特異性結合タンパク質を産生した。簡潔には、25%(w/w)の各プラスミドをOpti-MEM中に希釈し、予め希釈したExpiFectamine試薬と、室温(RT)で20~30分間混合し、Expi293細胞中に添加した(2.5×106細胞/ml)。良好な収率および純度を有する三重特異性結合タンパク質を産生するために、プラスミドの最適な比率を決定するためのトランスフェクションの最適化が使用されることが多かった。
精製抗体の結合特性を、ELISAまたはSPRのいずれかの方法を使用して解析した。ELISAでは、三重特異性結合タンパク質の各結合部位に対応する抗原を使用して、4℃で終夜96ウェルImmuno Plate(Nunc 439454、Thermo Fisher Scientific)をコーティングした(PBS(pH7.4)中2μg/mlの各抗体を使用する)。PBS中5%のスキムミルク+2%BSAを使用して、RTで1時間、コーティングしたプレートをブロックし、続いて、PBS+0.25%のTween 20で3回洗浄した(Aqua Max 400、Molecular Devices)。抗体(三重特異性および対照のAb)の連続希釈液を調製し、ELISAプレート上に添加し(二連で100μl/ウェル)、RTで1時間インキュベートし、続いて、PBS+0.25%のTween 20で5回洗浄した。
抗CD38×CD28×CD3三重特異性抗体またはアイソタイプ対照抗体(ヒトIgG4)の結合を決定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗Fab二次抗体(Jackson ImmunoResearch Inc 番号109-035-097)を使用して、結合した抗体を検出した。
様々な三重特異性結合タンパク質を使用する様々ながん細胞に対するin vitro死滅アッセイのために、精製されたヒトPBMCを使用していた。簡潔には、96ウェルV底プレートにおいて死滅アッセイを設定した。各プレートについて、各ドナーからのPBMC 40mlを2×10^6細胞/mlでプレーティングし、2.5x10^5細胞/mlのPKH26(Sigma 番号MINI26)30mlで標識した標的細胞(最大1×10^7個の細胞を染色するための色素4μL)を調製した。最初に、様々な濃度の20μL/ウェルの試験タンパク質またはPMAを、各ウェル中に添加し、続いて、80μL/ウェルの標識された標的細胞を、各ウェル中に添加した(2×10^4細胞/ウェル)。次いで、PBMC 100μLを、各ウェルに添加し、E:T=10:1ウェル(2×10^5細胞/ウェル)に達し、37℃にて5%のCO2インキュベーターで24時間インキュベートした。細胞を遠沈させ、上清をサイトカイン放出を測定するために回収するか、または破棄した。細胞を、Vivid LIVE/DEAD(商標)Fixable VioleT Dead Cell Staining緩衝液(Life Technology 番号L34955)を用いて染色した(染色緩衝液は、Vivid試薬60μLをPBS 60ml中添加することによって調製した)。暗所でRTにて15分間のインキュベーションによって細胞を染色緩衝液100μL中に再懸濁した。細胞を1×PBSを用いて洗浄した後、細胞を0.5%パラホルムアルデヒドを有するPBS 200μL中に再懸濁し、Fortessaフローサイトメーター(Beckton Dickinson、San Jose、CA)によってPKH26+Vivid+がん細胞を回収し、続いて、Flowjoソフトウェアを使用して解析した。死滅のパーセンテージを、特定の死滅-特発性死滅/総細胞として計算し、示されるようにプロットした。
CD34+臍帯細胞ヒト化NSGマウスにおけるin vitro活性化アッセイ、in vitro死滅アッセイ、in vivo活性化アッセイにおいて炎症性サイトカイン濃度を測定するために、および毒性研究のために、細胞培養上清を回収し、Milliplex Human High Sensitiity T細胞 13-plexキット(EMD Millipore)を使用して製造業者のプロトコールに従って血清サンプルを希釈した。次に、これらをEMD Millipore MAGPIX(登録商標)システム、およびMILLIPLEX(登録商標)Analyst 5.1ソフトウェアによって解析した。
ヒトCD34+造血幹細胞を移植されたNSGマウス(hu-CD34)を、in vivoマウスモデルとして使用した。これらのマウスは、複数系統のヒト免疫細胞を発達させ、癌免疫療法有効性研究の検証されたプラットフォームである(例えば、Shultz,L.D.ら(2014) Cold Spring Harb.Protoc. 2014:694~708頁を参照のこと)。hu-CD34+ NSGマウスは、CD34+造血幹細胞を注射することによって作成され、T細胞、B細胞、およびいくつかの他の集団を含むヒト免疫細胞集団の有効な複数系統移植を示す(McDermott,S.P.ら(2010) Blood 116:193~200頁)。複数系統造血発生は12週間以内に起こる。移植は、移植片対宿主病を伴わず、1年間にわたって安定である。
3つの標的抗原すべてに結合する抗体の能力をELISAアッセイによって試験した。CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28sup×CD3low IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、CD38VH1×CD28cvn×CD3low IgG4は、ヒトおよびサルのCD3およびCD38に対して類似する結合親和性を示したが、CD28supに関して、CD28(ヒトおよびサルは、同一の細胞外ドメインを有する)に対する可変結合親和性は、より良好な親和性を示した(図7A)。CD38VH1×CD28sup×CD3midおよびCD38HHY1370×CD28sup×CD3mid IgG4 FALAバリアントならびにIgG1 LALA P329AおよびNNASバリアントはすべて、ヒトCD3、CD28、およびCD38に対して類似する結合を示した(図7B)。
配列番号108:ベンチマーク重鎖1(CD38に結合する)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNWVRQAPGKGLEWVSEINPQSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号109:ベンチマーク重鎖2(CD3に結合する)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPGSGKPGSGKPGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREQMTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号110:ベンチマーク軽鎖(CD38に結合する)
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDTWVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
材料および方法
すべてのNHP研究は、Covance ICUCAプロトコールに従って、Covance(Princeton、New Jersey、USA)によって行った。薬物およびタンパク質ナイーブまたはタンパク質ナイーブ雄カニクイザルをすべての研究において使用した。研究設計に基づき、各三重特異性結合タンパク質について、サルを選択し、グループ化した。伏在静脈を介して、1時間、静脈内注入することによって抗体を与えた。漸増用量を、低用量(<10μg/kg)で連日与えたが、1~2日の間隔を空けて、観察を目的として高用量(>10μg/kg)で与えた。特定したように、各投与後に、すべての動物に関して、注入開始から0時間目(1日目のみ)、0.5時間目(中間の注入)、1、および6時間目に血液サンプルを回収した。追加の予定外の血液サンプルを、研究責任者、病理学者、および/または臨床獣医師の裁量で回収した。60日目に、すべての動物をコロニーに返却した。標準的方法を使用して、PBMCと血清を血液サンプルから調製し、将来の解析のために保存した。
mAb2含有CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4、およびmAb6含有CD38hhy1370×CD28sup×CD3mid IgG4、mAb2含有CD38VH1×CD28cvn×CD3mid IgG4、およびmAb6含有CD38hhy1370×CD28cvn×CD3mid IgG4三重特異性結合タンパク質を使用する用量漸増毒性研究を非ヒト霊長類で行った。4つの結合タンパク質における3つの結合ドメインはすべて、カニクイザルCD38/CD3/CD28ポリペプチドと交差反応性である。分子の潜在的毒性プロファイルを評価するためにこの研究を考案した。血清およびPBMCの単離のために血液サンプルを回収した。T細胞亜集団の活性化(CD69+)(図14A~14D)と一緒に、循環T細胞集団を各投与後に調査した(図14E~14H)。循環するCD4およびCD8 T細胞のパーセンテージは、用量漸増とともに低下した。有意なCD4およびCD8 T細胞活性化は、2.5μg/kgの用量での開始で顕著であり、mAb2およびmAb6含有分子に関する有効な活性化能力を示唆した。有意な循環T細胞の欠失は、12.5μg/kgのすべてのタンパク質で見られ(図14I~14L)、再度、有効性と相関した。循環T細胞の欠失はむしろ一過的であり、24~48時間後に処置前のレベルに戻った(図14M~14P)。いくつかのサイトカインの血清レベルも測定した。すべての分子に関して12.5μg/kgで、有意なIL-6およびIL-10放出が確認されたが、これはむしろ一過的であり、24時間でベースラインに戻った(図14U)。
材料および方法
C末端6-Hisタグ付き組換えヒトFcγ RI(R&D Systems 番号1257-FC-050)、C末端10-Hisタグ付き組換えヒトFcγ RIIA(R&D Systems 番号1330-CD-050/CF)およびC末端HPC4タグ付き組換えヒトFcγRIII(V158またはF158)をBiacoreチップに捕捉した。200、100および50nMの抗体を2分間注射し、続いて、Biacore 200を使用して、30μL/分の流速で、HBS-P+、2mM CaCl2(pH7.4)緩衝液中で2分解離された。200nMの結合曲線を示した。
次に、上述の三重特異性結合タンパク質のバリアントを、薬物動態(PK)/薬力学(PD)を最適化するために様々なFc受容体への結合についてアッセイした。
材料および方法
ヒトPBMCからのサイトカイン放出
ヒトPBMCを、100pMの結合タンパク質と24時間インキュベートした。上清を回収し、Drop Arrayプレートを使用するLuminexによって、サイトカインを測定した(三連で)。腫瘍標的細胞を使用する実験では、ヒトPBMCを、10:1のE:T比で、24時間、抗体100pMと(RPMI-8226標的細胞の有無にかかわらず)インキュベートした。PBMCを三重特異性タンパク質とともにインキュベートした後、上清を回収し、MILLIPLEX(登録商標) MAPキットを用いてサイトカインについてアッセイし、MAGPIX(登録商標) Systemで解析した。
PBMCから負選別(磁性)したT細胞を、100nMのプレートに結合したAbとともに、1日間インキュベートした。次いで、T細胞を洗浄し、T細胞マーカーおよびBcl-xLに特異的な蛍光的にコンジュゲートした抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
PBMCから負選別した(磁性ビーズ細胞分離)T細胞を、プレートに結合したAb(100nM)とともに、1から6日間インキュベートした。インキュベーション開始の特定日数後に、ビーズの計数を使用するフローサイトメトリーによって、細胞総数を計数した。0日目の細胞計数(500細胞/uL)から倍率変化を計算した。結果は3名のPBMCドナーに由来する。
GloResponse(商標)IL2-luc2P Jurkat細胞を、三重特異性タンパク質と6時間インキュベートし、次いで、Bio-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を検出した。
抗CD38×CD28×CD3三重特異性抗体または対照のIgG4結合タンパク質で処置したヒトPBMC細胞の活性化(CD69+)を決定した。
播種hu-PBMC NSGマウスモデルでは、1~5×106個の細胞を、0日目に各マウス中に静脈内注射した。3日目に、ベースラインの輝度イメージングを無作為化のために得た。4日目に、健常なドナー由来の10×106個のヒトPBMCを各マウスに対して腹腔内に(IP)再構成させた。5、12、19日目に、表示した用量を使用して、マウスを毎週処置した。各動物の腫瘍体積をモニターするために、10、17、24日目に、毎週、輝度身体像を得た。研究の終わりに、病理組織学研究のために、血液、脾臓、骨および骨髄を回収した。
IgG4 FALAバリアントFc領域を有するmAb2含有抗CD38×抗CD28×抗CD3三重特異性結合タンパク質は、野生型Fc領域を有する類似する結合タンパク質と比較して、ヒトPBMCにおける非特異的IFN-γ放出レベルを著しく低下させた(図18A)。IL-2(図18B)およびTNF-α(図18C)の放出に関して、同様の結果が観察された。重要なことに、サイトカイン放出は、ベンチマーク二重特異性抗CD38×抗CD3二重特異性抗体に対するよりも、これらのFcバリアント三重特異性結合タンパク質で有意に低かった。これらの結果は、非特異的サイトカイン放出の低下に起因するFcバリアントに関する三重特異性結合タンパク質の安全性プロファイルの改善を意味する。
CD38VH1×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA:p=0.0023;CD38HHY1370×CD28sup×CD3mid IgG4 FALA:p=0.0088;ベンチマーク二重特異性CD38×CD3 Fab-scFv-Fc:p=0.6045。
最適なエフェクター機能および増殖維持のために、T細胞を刺激するための2つのシグナルが必要とされる。T細胞受容体(TCR)-CD3複合体に介在される活性化によって、サイトカイン分泌をもたらす転写活性化が誘導される。第2の表面膜タンパク質であるCD28の会合により、代わりのシグナル伝達経路が刺激され、プログラム細胞死が阻害される(Esensten JH、Helou YAら Immunity 44:973~88頁(2016);Hui E、Cheung Jら Science 355:1428~1433頁(2017))。第2のシグナルの非存在下で、CD3のみによるT細胞刺激によって、典型的には、活性化誘導細胞死がもたらされる(Chai JG、Lechler RI. Int Immunol. 9:935~44頁(1997))。T細胞の増殖は、これらの2つの異なる標的に対する特異性を組み合わせることによって増加すると仮定された。
抗体のFc領域は、非特異的炎症を誘導する単球およびNK細胞上の細胞受容体に結合し、処置対象をサイトカイン放出症候群に罹りやすくする場合がある。サイトカイン放出を刺激する際のFc受容体の役割を、FcγI、FcγIIa,bおよびFcγIII結合を排除した突然変異体を試験することによって調査した。このために、補体を固定しないIgG4アイソタイプを使用した。
各結合部位または結合部位の組合せに関する三重特異性Ab突然変異体を生成し、高い(RPMI-8226)または低い(KMS-11)CD38およびCD28の表面発現を有する多発性骨髄腫細胞株に対するそれらの細胞溶解活性について試験した。
CD38/CD3×CD28三重特異性Abが細胞の免疫機能を増強することができるかどうかを決定するために、in vitroで拡大されたT細胞の表現型を評価した。
Research Blood Components,LLC(Boston、MA)により回収された健常なヒトドナーの血液から、末梢血単核細胞を単離した。PBMCを、以前に上記したように、抗体をコーティングしたプレート(350ng/ウェル)に添加し(5×105細胞/mL)、37℃で3および7日間インキュベートした。特定の時点で、細胞を回収し、T細胞のサブセット:ナイーブ(CCR7+ CD45RO-)、Tcm(CCR7+ CD45RO+)、Tem(CCR7- CD45RO+)、Tregs(CD4+ Foxp3+ CD25hi)についてフローサイトメトリーで解析した。細胞内のサイトカイン発現:Th1(CD4+ IFN-γ+)、Th2(CD4+ IL-4+)、およびTh17(CD4+ IL-17+)を決定するために、フロー染色の少なくとも6時間前に、細胞をモネシン(GolgiStop)(BD Biosciences、CA)でも処置した。PBMCドナーのHLA(A*02:01/NLVPMVATV)(ProImmune、Oxford、UK)に限定される蛍光標識五量体(fluorescent-conjugated pentamer)を使用して、CMV pp65-特異的CD8+ T細胞を検出した。公知のCMV陽性集団およびHLA型を有するドナー由来のHemaCare(Van Nuys、CA)から、PBMCを得た。限定しているHLA型に対して陰性のドナー由来のPBMCを陰性対照として使用した。製造業者のプロトコールにより染色を行った。
ヒトのPBMCを、サイトカインの非存在下で、三重特異性Abまたは三連の変異陰性対照とともに、7日間インキュベートした。CD4サブセットの解析により、セントラルメモリープールにおいて最も多い増殖が明らかとなり、エフェクターメモリー細胞ではより少ない増加しかなかった(図37A)。また、CD4サブセットの解析により、Th2またはTh17細胞(図37B)と比較したTh1細胞(6倍を超える)の最も高い増殖も明らかとなった(図37B)。CD8サブセットでは、7日目までに、セントラルメモリーCD8サブセットにおいて150倍を超える増加があり、エフェクターメモリー細胞では、増加はより少なかった(図37C)。重要なことに、四量体染色(Gratama JW、van Esser JWら Blood 98:1358~1364頁(2001))を使用する血清陽性HLA-A2ドナーのpp65エピトープを対象とするCMVに対する既存の抗原特異的CD8の応答は、陰性対照と比較して、CD38三重特異性の存在下で44倍を超えて増加した(図37D)。
材料および方法
フローサイトメトリー
記載したように(S4)、QIFIキット(Dako、Denmark、カタログ番号K007811)を使用するフローサイトメトリーによって、表示した腫瘍細胞株上のCD28およびCD38のレベルを決定した。簡潔には、マウス抗ヒトCD38(クローンAT13/5、マウスのIgG1、Santa Cruz Biotech、カタログ番号59028)および抗ヒトCD28(クローンCD28.2、マウスIgG1、k,BioLegend、カタログ番号3029123)を、製造業者のプロトコールを使用して、細胞株上の表面CD38およびCD28を検出するために、一次抗体(10ug/ml)として使用した。QIFIキットの較正標準物質およびキットによって提供された配合を使用して、表面密度を計算した。
KMS-11細胞株では、CRISPR CD28ヒトノックアウトキット(Origene)を使用して、CD28のノックアウトを実施した。キットは、GFP-ピューロマイシンの機能的カセットを含むドナーベクターと、異なる予め設計されたガイドRNA(CD28のエクソン1およびイントロン1をそれぞれ標的とするgRNA 1:TACCTGTTACTTGAATTGAA(配列番号117)およびgRNA 2:ATTTTTTGAGGTCTTCCAAT(配列番号118))をそれぞれ有する2つの別個のCas-9ベクターとを含有する。10%のFBSを補充したRPMI 1640 GlutaMAX Medium中、3.105細胞/ウェルの密度で、細胞を6ウェルプレート中に播種し、製造業者の使用説明書に従って、Lipofectamine(商標)3000 Transfection Reagent(ThermoFisher Scientific)を使用して、3つのベクターすべてを用い、24時間後に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、最終濃度0.5μg/mLのピューロマイシンを添加した。6.25μL/ウェルのLipofectamine(商標)3000、各Cas-9/gRNAベクター1.25μgおよびGFP-ピューロマイシンドナーベクター2.5μgを使用する場合、トランスフェクション効率は30%であった。CD28sgRNA CRISPRオールインワンレンチウイルスセット(Applied Biological Materials Inc.)を使用して、RPMI 8226細胞株上でCD28のノックアウトを実施した。これは、Cas9遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子および様々なsgRNA(CD28エクソン2を標的とするsgRNA 1:ATTGTCGTACGCTACAAGCA(配列番号119)およびsgRNA 2:CAAAAGGGCTTAGAAGGTCC(配列番号120)およびCD28エクソン3を標的とするsgRNA 3:CTATAGCTTGCTAGTAACAG(配列番号121))を発現する3つのレンチウイルスオールインワンベクターのセットからなる。レンチウイルス粒子(10UI/細胞)、8μg/mLのポリブレンおよび1:100のViralPlus Transduction Enhancer(Applied Biological Materials Inc.)と混合した2.105細胞を用いるスピノキュレーションプロトコールを使用して、細胞を感染させた。混合物を、室温で20分間プレインキュベートし、次いで、32℃にて、800×gで30分間遠心分離し、12ウェルプレート中に播種した。感染の48時間後に、最終濃度0.25μg/mLでピューロマイシンを添加した。両細胞株を少なくとも5回(または細胞生存率が安定となるまで)継代した後、フローサイトメトリーによって、タンパク質レベルでCD28のノックダウンを確認した(CD28PE Clone 28.2抗体-BioLegend)。次いで、CD28陰性細胞を、Sony SH800S Cell Sorterで選別し、0.25μg/mLまたは0.5μg/mLのピューロマイシン、100ユニット/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific)を補充した培地中で培養した。次いで、限定希釈によって細胞をクローニングし、フローサイトメトリーによってならびに以下に列挙したフォワードおよびリバースプライマーを使用するPCRおよびSangerシークエンスによってCD28ノックアウトを検証した。
CD28を三重特異性Ab中に組み込み、T細胞の増殖および生存を改善した;しかしながら、細胞表面のマーカーを多発性骨髄腫細胞上で評価した場合、細胞株の大多数(>95%)は、CD28糖タンパク質を発現することが判明した(表S)。
以前の実施例は、多発性骨髄腫細胞の細胞溶解を促進する三重特異性抗CD38/CD3/CD28抗体について実証する。他のがん細胞株の細胞溶解を促進するこれらの抗体の能力を試験した。
TGN1412(TGN)、単一結合アームTGN1412(TGNslg)および単一結合アーム抗CD28sup(CD28supslg)によるヒトPBMCのin vitroでの活性化を記載されているように実施した(Findlay L、Eastwood Dら J Immunol Methods 352:1~12頁(2010))。以前に記載されているように、表示した抗体で24時間ドライコーティングしたポリプロピレン96ウェルプレート(1ug/ウェル)上に、105個のヒトPBMCを播種した。上清中のIFN-γ、TNF-α、およびIL2のようなサイトカインを、実施例8に記載したLuminexによって測定した。
Claims (47)
- CD38ポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、抗原結合部位は:
(a)GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに
(b)QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む抗体軽鎖可変(VL)ドメイン;
を含む前記結合タンパク質。 - (a)VHドメインは、N末端からC末端に向かって、配列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4を含み;FR1は、配列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(配列番号86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(配列番号87)、もしくはQVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(配列番号88)を含み;FR2は、配列MHWVKEAPGQRLEWIGY(配列番号90)もしくはMHWVKEAPGQGLEWIGY(配列番号91)を含み;FR3は、配列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(配列番号93)もしくはNYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(配列番号94)含み;FR4は、配列WGQGTLVTVSS(配列番号96)含む;または
(b)VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VLドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む;
請求項1に記載の結合タンパク質。 - 配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、請求項2に記載の結合タンパク質。
- 抗体結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する、請求項1~3のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドに結合する、請求項4に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、2.1nMまたはそれ以下の平衡解離定数(K D )で、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD38ポリペプチドに結合する、請求項5に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、配列番号105のアミノ酸配列を含むヒトアイソフォームE CD38ポリペプチドに結合する、請求項4に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する、、請求項4~7のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- 抗原結合部位は、1.3nMまたはそれ以下の平衡解離定数(K D )で、配列番号30のアミノ酸配列を含むカニクイザルCD38ポリペプチドに結合する、請求項8に記載の結合タンパク質。
- キメラもしくはヒト化抗体である;または、モノクローナル抗体である、請求項1~9のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- Fc領域を含む1つまたはそれ以上の全長抗体重鎖を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- Fc領域は、Fc受容体結合および/もしくはFc領域のエフェクター機能を低減もしくは排除する1つもしくはそれ以上の変異を含むヒトFc領域である、請求項11に記載の結合タンパク質。
- Fc領域は、ヒトIgG1 Fc領域である、請求項11に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG1 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである、請求項13に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG1 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである、請求項13に記載の結合タンパク質。
- Fc領域は、ヒトIgG4 Fc領域である、請求項11に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである、請求項16に記載の結合タンパク質。
- ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL23
5Aである、または、ヒトIgG4 Fc領域は、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である、請求項16または17に記載の結合タンパク質。 - 抗体F(ab)、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、またはscFv断片を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の結合タンパク質。
- (a)細胞毒性剤もしくは標識にコンジュゲートされる;
(b)CD38ポリペプチドに結合する第1の抗原結合部位および第2の抗原結合部位を含む二重特異性結合タンパク質である;または
(c)CD38ポリペプチドに結合する第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質である、
請求項1~19のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 第1の抗原結合部位は、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインに結合し、第2および第3の抗原結合部位はそれぞれ、T細胞表面タンパク質に結合する、請求項20に記載の結合タンパク質。
- 第2の抗原結合部位は、ヒトCD28ポリペプチドに結合し、第3の抗原結合部位は、ヒトCD3ポリペプチドに結合するか、または、第2の抗原結合部位は、ヒトCD3ポリペプチドに結合し、第3の抗原結合部位は、ヒトCD28ポリペプチドに結合する、請求項21に記載の結合タンパク質。
- それぞれ、1つまたはそれ以上の標的タンパク質に結合する3つの抗原結合部位を含む結合タンパク質であって、3つの抗原結合部位のうちの少なくとも1つは、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応し、ここで、ヒトCD38ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルCD38ポリペプチドの細胞外ドメインと交差反応する、少なくとも1つの抗原結合部位は:
(a)GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含む抗体重鎖可変(VH)ドメイン;ならびに
(b)QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む、
前記結合タンパク質。 - それぞれT細胞表面タンパク質に結合する2つの抗原結合部位をさらに含む、請求項23に記載の結合タンパク質。
- T細胞表面タンパク質は、CD28およびCD3である、請求項24に記載の結合タンパク質。
- 3つの抗原結合部位を形成する4つのポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、式:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
で表される構造を含み、
第2のポリペプチド鎖は、式:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [II]
で表される構造を含み、
第3のポリペプチド鎖は、式:
VH3-CH1-ヒンジ-CH2-CH3 [III]
で表される構造を含み、
第4のポリペプチド鎖は、式:
VL3-CL [IV]
で表される構造を含み、
式中、
VL1は、第1の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL2は、第2の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VL3は、第3の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VH1は、第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH2は、第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
VH3は、第3の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CH1は、免疫グロブリンCH1重鎖定常ドメインであり;
CH2は、免疫グロブリンCH2重鎖定常ドメインであり;
CH3は、免疫グロブリンCH3重鎖定常ドメインであり;
ヒンジは、CH1およびCH2ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり;
L1、L2、L3およびL4は、アミノ酸リンカーであり;
式Iのポリペプチドと式IIのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖-重鎖対を形成し、
そしてここで:
(a)VH1ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL1ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;
(b)VH2ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL2ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含み;または
(c)VH3ドメインは、GYTFTSYA(配列番号37)のアミノ酸配列を含むCDR-H1配列、IYPGQGGT(配列番号38)のアミノ酸配列を含むCDR-H2配列、およびARTGGLRRAYFTY(配列番号33)のアミノ酸配列を含むCDR-H3配列を含み、VL3ドメインは、QSVSSYGQGF(配列番号39)のアミノ酸配列を含むCDR-L1配列、GAS(配列番号40)のアミノ酸配列を含むCDR-L2配列、およびQQNKEDPWT(配列番号36)のアミノ酸配列を含むCDR-L3配列を含む、
請求項23~25のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - VH3ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、VL3ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の結合タンパク質。
- (a)VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含
み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;
(b)VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;
(c)VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;
(d)VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む;
(e)VH1ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;
(f)VH2ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;
(g)VH1ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH2ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;または
(h)VH2ドメインは、配列番号51のアミノ酸配列を含み、VL2ドメインは、配列番号52のアミノ酸配列を含み、VH1ドメインは、配列番号84のアミノ酸配列を含み、VL1ドメインは、配列番号85のアミノ酸配列を含む;
請求項26または27に記載の結合タンパク質。 - V H1 ドメインは、配列番号49のアミノ酸配列を含み、V L1 ドメインは、配列番号50のアミノ酸配列を含み、V H2 ドメインは、配列番号53のアミノ酸配列を含み、V L2 ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含み、V H3 ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、V L3 ドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の結合タンパク質。
- L1、L2、L3またはL4のうちの少なくとも1つは、独立して、0アミノ酸長であり;または、
L1、L2、L3またはL4は、それぞれ独立して、少なくとも1アミノ酸長である;
請求項26~29のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - (a)L 1 、L 2 、L 3 およびL 4 は、それぞれ独立して、0アミノ酸長であるかもしくはGGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む;
(b)L 1 、L 2 、L 3 およびL 4 は、それぞれ独立して、GGGGSGGGGS(配列番号55)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)、S、RT、TKGPS(配列番号57)、GQPKAAP(配列番号58)、およびGGSGSSGSGG(配列番号59)からなる群から選択される配列を含む;
(c)L 1 は、配列GQPKAAP(配列番号58)を含み、L 2 は、配列TKGPS(配列番号57)を含み、L 3 は、配列Sを含み、L 4 は、配列RTを含む;
(d)L 1 は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L 2 は、配列GGGGSGGGGS(配列番号55)を含み、L 3 は、0アミノ酸長であり、L 4 は、0アミノ酸長である;
(e)L 1 は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L 2 は、配列GGSGSSGSGG(配列番号59)を含み、L 3 は、0アミノ酸長であり、L 4 は、0アミノ酸長である;または
(f)L 1 は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L 2 は、0アミノ酸長であり、L 3 は、配列GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号56)を含み、L 4 は、0アミノ酸長である;
請求項30に記載の結合タンパク質。 - (a)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の234および235位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、F234AおよびL235Aである;
(b)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG4のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の233~236位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、E233P、F234V、L235A、および236における欠失である;
(c)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の234、235、および329位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、L234A、L235A、およびP329Aである;
(d)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインはそれぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG1の298、299、および300位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S298N、T299A、およびY300Sである;または
(e)第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-CH2-CH3ドメインは、ヒトIgG1のヒンジ-CH2-CH3ドメインであり、ヒンジ-CH2-CH3ドメインは、それぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである;
請求項26~31のいずれか1項に記載の結合タンパク質。 - 第2および第3のポリペプチド鎖のヒンジ-C H2 -C H3 ドメインはヒトIgG4のヒンジ-C H2 -C H3 ドメインであり、ヒンジ-C H2 -C H3 ドメインはさらに、それぞれ、EUインデックスに従い、ヒトIgG4の228および409位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S228PおよびR409Kである、請求項32に記載の結合タンパク質。
- 第2のポリペプチド鎖のヒンジ-C H2 -C H3 ドメインは、さらに、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-C H2 -C H3 ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wである;または
第2のポリペプチド鎖のヒンジ-C H2 -C H3 ドメインは、さらに、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の354および366位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、S354CおよびT366Wであり;第3のポリペプチド鎖のヒンジ-C H2 -C H3 ドメインは、EUインデックスに従い、ヒトIgG1またはIgG4の349、366、368、および407位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ア
ミノ酸置換は、Y349C、T366S、L368A、およびY407Vである、
請求項32または33に記載の結合タンパク質。 - (a)第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号62のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む;
(b)第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号65のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む;または
(c)第1のポリペプチド鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチド鎖は、配列番号66のアミノ酸配列を含み、第3のポリペプチド鎖は、配列番号67のアミノ酸配列を含み、第4のポリペプチド鎖は、配列番号63のアミノ酸配列を含む;請求項26に記載の結合タンパク質。 - ポリヌクレオチドのキットであって:
(a)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号72の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号74の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;
(b)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号76の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号77の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;または
(c)配列番号73の配列を含む第1のポリヌクレオチド、配列番号78の配列を含む第2のポリヌクレオチド、配列番号79の配列を含む第3のポリヌクレオチド、および配列番号75の配列を含む第4のポリヌクレオチド;
を含む前記キット。 - 請求項1~35のいずれか1項に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項37に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 宿主細胞であって、請求項36に記載のポリヌクレオチドのキット、請求項37に記載のポリヌクレオチド、または請求項38に記載のベクターを含む前記宿主細胞。
- 結合タンパク質を産生する方法であって、結合タンパク質が産生されるように、請求項39に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
- 宿主細胞から結合タンパク質を回収することをさらに含む、請求項に40記載の方法。
- 請求項1~35のいずれか1項に記載の結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 患者のがんを防止および/または処置する方法で使用するための、請求項42に記載の医薬組成物。
- 患者はヒトである、請求項43に記載の医薬組成物。
- 方法は、少なくとも1つの医薬組成物と化学療法剤との同時投与を含む、請求項43または44に記載の医薬組成物。
- がんは、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、またはB細胞リンパ腫である、請求項43~45のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- がん細胞がそれらの細胞表面にヒトCD38アイソフォームEポリペプチドを発現するため、患者は、処置のために選択される、請求項43~46のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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