JP7036820B2 - 配列変異体の検出 - Google Patents
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Description
●直線性比が1.0以上(302)であれば、対立遺伝子はGGである;
●直線性比が-0.2~0.6の間で、デルタCTが存在する場合(303)、対立遺伝子はGAである;
●GA緩衝地帯における直線性比が0.6~1.0の間であり、デルタCTが-4.0~1.0の間である場合(304)、対立遺伝子はGAである;
●AA緩衝地帯における直線性比が-0.6~-0.2の間にあり、デルタCTが3.0以上であるか、又は欠落している(305)場合、対立遺伝子はAAである;又は、
●直線性比が-0.6(306)以下の場合、対立遺伝子はAAである。
直線性からの偏差比=デルタB1/デルタB2。
log10(デルタB1/デルタB2)。
従来の遺伝子型論理はストレス条件下で不正確な遺伝子型を同定することが分かった(例えば、PCR阻害剤を試料に添加した場合)。これらの不正確な結果は、cobas(商標)4800システムにおけるFAM(トレオニンリンカーを有する6-カルボキシフルオレセイン)又はHEX(トレオニンリンカーを有するヘキサクロロ-フルオレセイン)チャネルのいずれかにおけるRFI(相対蛍光強度)値の変動に起因し、RFIカットオフを越える結果となった。従来の方法を使用して、RFI値がカットオフを下回る場合、CT値はこのチャネルについて除去された。続いて、遺伝子型をチャンネルのサブセット(例えば、図4参照)のみに存在するCT値で決定した。例えば、FAM RFI値がヘテロ接合標本GAのカットオフ値を下回った場合、HEX及びCY5.5CTのみが存在することになり、他のすべての値が仕様の範囲内であれば、GG遺伝子型を誤って同定することになる。
●RFI最小を高くすると、CY5.5又はFAM(AAのみ)がカットオフ値を下回ったために一部の試料が無効になった(図9);
●ΔCT値が範囲外であったためGA検体を無効とした(図10);
●HEX RFI値がカットオフ値以上であったため、AA検体は無効となった。すべてのチャネル(FAM、HEX、CY5.5)CTが存在したが、ΔCTカットオフに失敗したので、試料をGA試料として処理した(図11)。
Claims (14)
- 試料中の少なくとも2つの核酸配列変異体を検出する方法であって、以下のステップ:
(a)少なくとも2つの配列変異体を増幅して、第1の変異体アンプリコン及び第2の変異体アンプリコンを含む少なくとも2つの増幅産物を製造し、ここで増幅ステップは第1及び第2のアンプリコンについてそれぞれ第1及び第2の増幅曲線を生じるステップ;
(b)プロセッサを用いて、第1の増幅曲線の直線性からの第1の偏差及び第2の増幅曲線の直線性からの第2の偏差を作り、且つ直線性からの第1及び第2の偏差を比較して直線性からの偏差の比を作ることによって、第1及び第2の増幅曲線の直線性からの相対偏差を分析するステップ、ここで第1増幅曲線についてのデルタB 1 を算出し、第2増幅曲線についてのデルタB 2 を算出することを含み、ここで
(c)プロセッサを用いて、閾値マトリックスに対する直線性からの相対偏差を比較するステップ、ここで前記閾値マトリックスが、複数の既知の特異的核酸配列の個別の増幅曲線を分析することにより決定され、そして評価中の各変異体に対する直線性からの偏差の比の許容可能な範囲のセットを含み;並びに、
(d)プロセッサを用いて、前記比較ステップ(c)の結果に基づく2つ以上の配列変異体を同定するステップ;
を含む、方法。 - 前記直線性からの相対偏差が、log10(デルタB1/デルタB2)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ベースライン切片が、y中央値、幾何平均、調和平均、又は一般化平均を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ベースライン切片が、y中央値を含む、請求項3~4のいずれか一項に記載の方法。
- 直線性からの偏差がサイクルm~pより評価され、0<m<pである、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の2つ以上の核酸配列変異体を検出するシステムであって、システムは、メモリ、プロセッサ、及びディスプレイと動作可能に接続された核酸増幅モジュールを含み、プロセッサは、2つ以上の配列変異体を検出するコンピュータ実施方法を実行するように構成され、方法は、以下:
(a)核酸増幅モジュールを用いて、少なくとも2つの配列変異体を増幅して、第1の変異体アンプリコン及び第2の変異体アンプリコンを含む少なくとも2つの増幅産物を製造するステップ;
(b)プロセッサを用いて、第1及び第2の増幅曲線を、それぞれ第1及び第2のアンプリコンについて作成するステップ;
(c)プロセッサを用いて、第1の増幅曲線の直線性からの第1の偏差及び第2の増幅曲線の直線性からの第2の偏差を作り、且つ直線性からの第1及び第2の偏差を比較して直線性からの偏差比を作ることによって、第1及び第2の増幅曲線の直線性からの相対偏差を分析するステップ、ここで第1増幅曲線についてのデルタB 1 を算出し、第2増幅曲線についてのデルタB 2 を算出することを含み、ここで
(d)プロセッサを用いて、閾値マトリックスに対する直線性からの相対偏差を比較するステップ、ここで前記閾値マトリックスが、複数の既知の特異的核酸配列の個別の増幅曲線を分析することにより決定され、そして評価中の各変異体に対する直線性からの偏差の比の許容可能な範囲のセットを含み;並びに、
(e)プロセッサを用いて、前記比較ステップ(d)の結果に基づく2つ以上の配列変異体を同定するステップ;
を含む、システム。 - 前記直線性からの相対偏差が、log10(デルタB1/デルタB2)を含む、請求項8に記載のシステム。
- 前記ベースライン切片が、y中央値、幾何平均、調和平均、又は一般化平均を含む、請求項10に記載のシステム。
- 前記ベースライン切片が、y中央値を含む、請求項10~11のいずれか一項に記載のシステム。
- 直線性からの偏差がサイクルm~pより評価され、0<m<pである、請求項8~13のいずれか一項に記載のシステム。
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