JP7032817B2 - 三次元画像化可能な顕微鏡及び画像化方法 - Google Patents

三次元画像化可能な顕微鏡及び画像化方法 Download PDF

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Description

本発明は、画像化顕微鏡及び顕微画像化方法に関し、特に、生物学及び医学を主たる応用分野としたハイスループットの三次元デジタル画像化顕微鏡及びハイスループットの三次元デジタル顕微画像化方法に関する。
三次元デジタル画像化は、現代の顕微画像化の重要な内容の１つである。解像度を低下させることなくより多くの試料を非破壊的に画像化することは、三次元顕微画像化方法の重要な目標である。
一般に、三次元デジタル画像化は、何らかのコントラスト応答（例えば、蛍光）を発生させる方法により試料を検出（励起）し、何らかの方法でこれらのコントラストを記録し（光電変換してデジタル化する）、さらに検出すべき領域内の各々の立体単位のコントラストをデジタル化した立体画素を最終出力とする。これをもって、立体画素の数（すなわち、試料の検出すべき領域の体積/立体画素の対応する体積（所望の解像度により決められる））、及びデジタル化の速度は、三次元デジタル画像化速度の１つの上限を決める。しかしながら、従来技術の画像化速度は、この限界に遥かに及ばない。例として、従来の主たる画像化装置の４００メガピクセル／秒のデジタル化（１６ｂｉｔ）速度で０．５立方センチメートルのマウスの脳を画像化する場合に、三次元立体画素が１×１×１ミクロン単位（細胞内解像）に対応するデジタル画像化速度の上限は、１２５０秒、約２１分間であり、立体画素が５×５×５ミクロン単位（細胞体解像）に対応する場合は、所要時間はただ１０秒である。従来技術において、サブミクロンの解像度のマウスの脳の画像化速度は、典型的に３日であり（Ｇｏｎｇ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ７：１２１４２、２０１６）、細胞体解像の最新結果は約２時間である（Ｌｉ Ｙｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １６５（７）， １６ Ｊｕｎｅ ２０１６，）。従来技術において、励起及び記録の速度はボトルネックになっていない。この差を引き起こす重要な原因の１つは、従来技術では画像化過程において、画像化中断を避けることができず、有効画像化時間が短縮されてしまうことである。
従来の画像化技術は、通常、以下のような方法を用いる。まず、画像化方向（すなわち、検出主軸方向、通常、ｚ方向と呼ばれる）に垂直な１つの平面を画像化する（１スポットずつ画像化してもよいし、視野の一部／全体を同時に画像化してもよく、走査型共焦点（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ）又は光学シート（ＳＰＩＭであるが、ＬＳＭと略称されることもある）画像化が例として挙げられる）。ｚ方向において、解像度の要求に応じて相対運動し、１つの新しい平面に到達する。この過程は約１０ミリ秒が必要とされる。新しい平面を画像化する。ｚ方向において試料がカバーされるまで以上の運動及び画像化を繰り返し、１つの視野内の三次元画像化を完成し、その後、ｚに垂直な方向において１つの新しい視野へ移動し、この過程は約数百ミリ秒が必要とされる。ｚに垂直な方向においても試料がカバーされるまで以上の運動及び画像化を繰り返し、試料の三次元画像化を完成する。以上の過程は、画像化中断の過程を大量に含み、毎回の移動自体は時間がかかり、画像化を継続するためにはさらに起動、停止による振動が消失するのを待つ必要があるので、長時間の画像化中断が発生してしまう。試料の体積が大きく、解像度の要求が高い場合、上述した画像化中断の回数が３乗で増大し、画像化の効率がひどく影響される。一部の技術は、電気フォーカスレンズ等の方法により画像化中断の時間を低減したが、ｚ方向のみに適用され、かつサイズが大きく制限されるので、三次元デジタル画像化のスループットが部分的に改善されるに過ぎない。
図１Ａから図１Ｇは、従来技術において三次元画像化を実現するために一般に用いられる方法を示している。まず、図１Ａに示すように、画像化方向（すなわち、検出主軸方向であり、通常、ｚ方向と称される）に垂直な１つの平面を画像化する（１スポットずつ画像化してもよいし、視野の一部／全体を同時に画像化してもよく、走査型共焦点（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ）又は光学シート（ＳＰＩＭであるが、ＬＳＭとも略称される）画像化が例として挙げられる）。ｚ方向において解像度の要求に応じて相対運動し、図１Ｂのように１つの新しい画像化位置に到達する。画像化位置での画像化を図１Ｃに示す。図１Ｄに示すように、ｚ方向に試料がカバーされるまで以上の運動及び画像化を繰返し、１つの視野内の三次元画像化を完成する。その後、図１Ｅに示すようにｚに垂直な方向において１つの新しい視野へ移動する。当該視野での三次元画像化を図１Ｆに示す。図１Ｇに示すように、ｚに垂直な方向においても試料がカバーされるまで以上の運動及び画像化を繰り返し、試料の三次元画像化を完成する。以上の過程は大量の画像化中断の過程を含み、毎回の移動自体は時間がかかり、画像化を継続するためには、さらに起動及び停止による振動が消失するのを待つ必要があるので、長時間の画像化中断が発生してしまう。発明者は、上述した画像化中断が移動に関連することを見出した。複数回の局部画像化を組み合わせて全体画像化とした三次元画像化技術において、試料及び検出のある形の相対移動が必要であるが、全ての相対運動において画像化中断が要求されることはない。従来の三次元画像化に含まれる相対運動は、２種類に分けられ、すなわち、第１種の運動は、単一の視野内の三次元画像化過程において異なる面の画像化のために、毎回のデータ読み取りの間に発生する小さい相対移動である（通常、数ミクロン以下である）。第２種の運動は、視野変換過程において発生する大きい相対移動である（通常、百ミクロン以上である）。
Ｇｏｎｇ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｕａｌ－ｃｏｌｏｕｒ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ－ｗｉｄｅ ｃｏｎｎｅｃｔｏｍｅ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｏｎｉｃ ｌａｎｄｍａｒｋｓ ａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ７：１２１４２、 ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２１４２ （２０１６）。 Ｌｉ Ｙｅ， ｅｔ ａｌ． Ｗｉｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ Ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ， Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌｕｍｅ １６５， Ｉｓｓｕｅ ７， １６ Ｊｕｎｅ ２０１６， Ｐａｇｅｓ １７７６－１７８８， ＩＳＳＮ ００９２－８６７４，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０５．０１０。
本発明が主に解決しようとする技術課題は、有効画像化時間を改善することでハイスループットの三次元デジタル顕微画像化が実現可能な三次元デジタル画像化顕微鏡及び三次元デジタル顕微画像化方法を提供することである。
上述した技術課題を解決するために、本発明の一態様によれば、励起主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で検出可能なコントラストを生成するための、少なくとも１つの励起装置と、検出主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で生成されたコントラストを検出するための、少なくとも１つの検出装置と、試料と前記励起装置及び前記検出装置との相対運動を発生させるための、少なくとも１つの移動手段と、を含み、前記相対運動の方向は、前記励起主軸方向に平行も垂直もせず、前記相対運動の方向は、前記検出主軸方向に平行も垂直もしない、三次元画像化可能な顕微鏡を提供する。試料の１つの三次元領域を画像化する全過程において、画像化も前記相対運動も中断しない特徴を有し、かつ、前記相対運動の方向は、励起主軸方向又は検出主軸方向に平行も垂直もしない。ここで、相対運動の方向についての選択は、画像化の中断が必須な視野変換を低減することに寄与する。
画像化するときの前記相対運動は等速であり、且つほぼ中断しない特徴を有するため、速度変化又は起動、中断による不規則な振れが除去される。尚存在可能な運動によるブレは、簡単で一致しているので、デコンボリューション等の方法により便利に算出、除去することができる。
好ましくは、前記検出装置の有効検出領域において、画像化する立体画素の各々に対応する試料単位は、所定時間以内においてのみ前記励起装置に励起され、前記所定時間内において、前記相対運動による変位は前記顕微鏡の解像度の要求を超えない。このようにして、前記相対運動による運動ブレを無視することができる。
好ましくは、前記試料が位置する環境において透明な物質が充填され、前記透明な物質と、その時の前記試料とは、屈折率が略同一である。
好ましくは、前記励起装置は、１つ又は複数の発光ダイオード、連続波レーザ、パルスレーザの組み合わせにより、光源を励起する。
好ましくは、前記検出可能なコントラストは、蛍光、弾性散乱光、ラマン散乱、ＳＨＧ、ＴＨＧ、誘導ラマン散乱等の信号の１種又はそれらの組み合わせである。
好ましくは、前記励起装置は、パルス時間が前記所定時間以内のパルスを用い、光学シート照明の方法により試料を励起する。
好ましくは、前記励起装置は、パルスレーザ、パルス作動の発光ダイオード、又は異なる方法で変調された連続光源の組み合わせである。
好ましくは、前記励起装置と前記検出装置とは同期的に作動する。
好ましくは、前記励起装置は、１つ又は複数のシリンドリカルミラー、シリンドリカルレンズ 、変形ミラー、透過型位相素子、反射型位相素子を含むことによって、前記光学シート照明を形成する。
好ましくは、前記励起装置は、検出領域内において前記検出装置の検出方向に略垂直な励起光束を少なくとも１つ発生する。
好ましくは、前記励起装置は、前記励起光束を走査移動させることができる走査手段を少なくとも１つ含む。
好ましくは、前記励起光束は、検出領域内で光束方向に沿った光束半径の変化が３倍を超えない。
好ましくは、前記走査手段は、１つ又は複数の走査ガルバノミラー、共振走査鏡、回転多面鏡、音響光学変調器の組み合わせを含む。
好ましくは、前記検出装置は、マトリックス状の感光素子を画像化素子としたものであり、前記画像化素子は前記走査手段と同期的に作動する。
好ましくは、前記検出装置は、前記走査手段と同期的に作動する走査解除手段を含み、さらにアレイ又はマトリックス状の感光素子を画像化素子としたものである。
好ましくは、前記励起装置は、１つの励起光束を複数の励起光束に分割するための光束分割手段を１つ含む。
好ましくは、前記光束分割手段は、１つ又は複数のレンズアレイ、反射鏡アレイ、ハーフミラーアレイの組み合わせを含むか、あるいは、固定又は変調可能なフェーズフィルタ又はデジタルマイクロミラーアレイを含む。
好ましくは、前記励起装置及び前記検出装置は走査型共焦点画像化の構造を構成する。
本発明は、少なくとも１つの励起装置を利用して、励起主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で検出可能なコントラストを生成すること、及び少なくとも１つの検出装置を利用して、検出主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で生成されたコントラストを検出すること（前記検出装置と前記励起装置とは、素子を共用するのが排除されない）、を含み、前記試料と、前記励起装置、前記検出装置との相対運動の方向は、前記励起主軸方向に平行も垂直もせず、前記相対運動の方向は、前記検出主軸方向に平行も垂直もしない、三次元顕微画像化方法をさらに提供する。
本発明は、好ましくはデコンボリューション等の方法により運動によるブレを除去することである。
本発明が提供する上記の装置及び方法によれば、本発明の利点及び有益な効果は、三次元画像化における画像化中断を低減し（試料を移動しながら画像化を中断せずに行い、画像化の中断が必須な視野変換を低減することを含む）、同時に、画像化するときの試料運動によるブレを除去し、生じた収差を改善することを含む。従来技術に比べると、本発明が提供する装置及び方法は、同等の解像度条件下において、三次元画像化のスループットを高めることができる。
従来技術における三次元画像化を実現するために一般に用いられる方法を示す。 従来技術における三次元画像化を実現するために一般に用いられる方法を示す。 従来技術における三次元画像化を実現するために一般に用いられる方法を示す。 従来技術における三次元画像化を実現するために一般に用いられる方法を示す。 従来技術における三次元画像化を実現するために一般に用いられる方法を示す。 従来技術における三次元画像化を実現するために一般に用いられる方法を示す。 従来技術における三次元画像化を実現するために一般に用いられる方法を示す。 本発明の三次元画像化の原理を示す。 本発明の三次元画像化の原理を示す。 本発明の三次元画像化の原理を示す。 本発明の１つの応用例として一台の三次元画像化顕微鏡の原理図を示す。 図３に示すシステムが採集したマウスの脳の蛍光画像化の実例を示し、その中、（ａ）は厚さが数百ミクロンの脳のスライスの画像化結果を三次元に再構成した冠状断面図を示し、（ｂ）は脳のスライスの局所範囲内でのニューロン細胞体及び樹状突起の微細構造を示し、（ｃ）はある画像化面内で捕獲したニューロン軸索等の細胞の微細構造を示す。 本発明のもう１つの応用例としてもう一台の三次元画像化顕微鏡の原理図を示す。 本発明の又もう１つの応用例として又もう一台の三次元画像化顕微鏡の原理図を示す。 デコンボリューション算法により運動ブレを除去して画像の品質を改善する説明であり、静止時に撮影したナノ蛍光ビーズである。 デコンボリューション算法により運動ブレを除去して画像の品質を改善する説明であり、１ミリメートル／秒で運動するときに１０ミリ秒露光する場合である。 デコンボリューション算法により運動ブレを除去して画像の品質を改善する説明であり、デコンボリューション処理後の結果である。 本発明の顕微鏡及び画像化方法において、連続光源を用いて走査方式により運動ブレを抑制する原理を説明する図である。 本発明の顕微鏡及び画像化方法において、屈折率マッチングを用いて本発明の顕微鏡が採集した画像の品質を改善することを説明する図である。
以下の発明内容において、発明者は、上述した第１種の運動において画像化を中断することなく、第２種の運動の存在を最大限に低減することにより、有効画像化時間を増加し、画像化スループットを高めることができる装置及び方法を提供する。
本発明の中心となる内容は、不要な画像化中断の低減であり、この内容に対応する一連の技術組み合わせを用い、その基本的な内容は、試料を移動しながらほとんど画像化を中断せずに行い、画像化の中断が必須な視野変換を低減させ、画像化するときの試料運動によるブレを除去し、生じた収差等を改善することである。
上述した技術課題を解決するために、本発明の一態様によれば、励起主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で検出可能なコントラストを生成するための、少なくとも１つの励起装置を含む三次元画像化可能な顕微鏡を提供する。前記顕微鏡は、検出主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で生成されたコントラストを検出するための、少なくとも１つの検出装置をさらに含み、前記検出装置と前記励起装置とは、素子を共用することを排除しない。前記顕微鏡は、試料と前記励起装置及び検出装置との相対運動を発生させるための、少なくとも１つの移動手段をさらに含む。試料の１つの三次元領域を画像化する全過程において、画像化も前記相対運動も中断しない特徴を有し、かつ、前記相対運動の方向は、励起主軸方向又は検出主軸方向に平行も垂直もしない。ここで、相対運動の方向の選択は、画像化の中断が必須な視野変換を低減させることに寄与する。
画像化するときの前記相対運動が等速であり且つほぼ中断しない特徴を有するため、速度変化又は起動、中断による不規則な振れを除去することができる。尚存在可能な運動によるブレは簡単で一致しているので、デコンボリューション等の方法により便利に算出、除去することができる。
さらに、本発明は、前記検出装置の有効検出領域において、画像化する立体画素の各々に対応する試料単位が所定時間以内においてのみ前記励起装置に励起され、前記所定時間内において、前記相対運動による変位が前記顕微鏡の解像度の要求を超えないという技術的態様を用いてもよい。このようにして、前記相対運動による運動ブレを無視することができる。
さらに、本発明は、画像化するときに、前記試料が位置する環境において透明な物質が充填され、前記透明な物質と、そのときの前記試料とは、屈折率がほぼ同一であるという技術的態様を用いてもよい。
前記励起装置は、１つ又は複数の発光ダイオード、連続波レーザ、パルスレーザの組み合わせを励起光源として用いてもよい。前記検出可能なコントラストは、蛍光、弾性散乱光、ラマン散乱、ＳＨＧ、ＴＨＧ、誘導ラマン散乱等の信号の１種又は組み合わせである。前記検出装置は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ感光素子、フォトダイオード（ＰＤ）（アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を含む）、及び光電子増倍管で構成されたスポット、アレイ、又はマトリックス状の素子のうちの１種又はそれらの組み合わせを感光素子として用いる。
前記励起装置は、パルス時間が前記所定時間を超えないパルスを用い、光学シート照明の方法により試料を励起してもよい。かつ、前記検出装置は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳカメラのようなマトリックス状の感光素子を画像化素子としてもよい。
前記励起装置は、前記光学シート照明を形成するために、１つ又は複数のシリンドリカルミラー、シリンドリカルレンズ 、変形ミラー、透過型位相素子、反射型位相素子を含んでもよい。
前記パルス光源は、１つ又は複数のパルスレーザ、パルス作動の発光ダイオード、又は異なる方法で変調された連続光源の組み合わせを含んでもよい。かつ、前記パルス光源は、前記画像化素子と同期的に作動することができる。
本発明の１つの実施形態において、前記励起装置は、前記検出装置の検出方向に略垂直な励起光束を少なくとも１つ発生させ、前記励起装置は、少なくとも１つの走査手段を含み、該走査手段は前記励起光束を走査移動させることができる。
好ましくは、前記励起光束は、検出領域内において光束方向に沿った光束半径の変化が３倍を超えない。
前記走査手段の１つの実施形態において、１つ又は複数の走査ガルバノミラー（ｇａｌｖａｎｏｍｅｔｅｒ ｓｃａｎｎｅｒ）、共振走査鏡、回転多面鏡、音響光学変調器の組み合わせを含む。
もう１つの実施形態において、前記検出装置は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳカメラのようなマトリックス状の感光素子を画像化素子としたものであり、前記画像化素子は、前記走査手段と同期的に作動する。前記検出装置は、前記走査手段と同期的に作動する走査解除手段を含み、さらに、ＬＥＤアレイ、ＣＣＤ、ＣＭＯＳカメラのようなアレイ又はマトリックス状の感光素子を画像化素子としてもよい。
本発明によれば、前記励起装置は、１つの励起光束を複数の励起光束に分割するための光束分割手段を１つ含んでもよい。前記光束分割手段は、１つ又は複数のレンズアレイ、反射鏡アレイ、ハーフミラーアレイの組み合わせを含んでもよいし、固定又は変調可能なフェーズフィルタあるいはデジタルマイクロミラーアレイ（ＤＭＤ）を含んでもよい。
１つの実施形態において、前記励起装置及び前記検出装置は、走査型共焦点画像化の構造を構成する。
また、本発明は、少なくとも１つの励起装置を利用して、励起主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で検出可能なコントラストを生成すること、少なくとも１つの検出装置を利用して、検出主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で生成されたコントラストを検出すること（前記検出装置と前記励起装置とは、素子を共用するのが排除されない）、及び少なくとも１つの移動手段を利用して、試料と前記励起装置及び検出装置との相対運動を発生させることを含む、三次元顕微画像化方法をさらに提供する。試料の１つの三次元領域を画像化する全過程において、画像化も前記相対運動も中断しない特徴を有し、かつ前記相対運動の方向は、励起主軸方向又は検出主軸方向に平行も垂直もしない。
図２Ａ～図２Ｃは、本発明の三次元画像化の原理を示す。図２Ａ～図２Ｃに示すように、画像化と同時に、試料と画像化システムは、継続的な等速運動を維持し、運動方向が画像化方向に平行も重合もせず、図２Ａは運動方向と画像化方向とが４５°の角度をなす例を示す。図２Ｂ及び図２Ｃに示すように、本発明は、大きいサイズの試料に対して、中断せずに新しい位置を画像化し続けて、最後に、試料の三次元画像化を完成させる。
以下、図面を参照しながら本発明の具体的な実施例を説明する。
本発明の１つの応用実施例として、図３は一台の三次元画像化顕微鏡を示し、厚さ３００ミクロンの試料に対して、解像度が１ミクロンであることが要求される。画像化におけるコントラストは蛍光を例とする。例として、蛍光コントラストは、４８８ミクロンのレーザによりＧＦＰ等の蛍光蛋白質を励起することにより提供される。励起装置１及び検出装置２は、対称的で多重化の構造を用いることができ、すなわち、両側のいずれも励起及び検出の機能を含む。例えば、網掛け部分の素子を外せば、左側が励起装置のみに簡略化され、右側が検出装置のみとなる。励起装置１と検出装置２とは互いに光路の主軸が垂直し、水平面（机上面又は地面）と４５°の角度をなす。試料台３が水平面に平行し、試料を載置して試料を画像化位置に移動させる。画像化するときに試料は連続的に水平運動する。励起装置１及び検出装置２の最先端は対物レンズ１０（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＭＰＬＦＬＮ ２０ＸＷ）であり、開口数が０．５、作動距離が３．５ミリメートルである。励起光４は、４８８ミクロンのレーザが用いられ、望遠鏡又は開口絞り（図示しない）を経て、パワー調節、ビーム径調節され、走査ガルバノミラー５に入射し、対物レンズ１０の後に、検出方向に垂直な平面において走査する線形の励起光を発生する。リレーレンズ６、７は、走査ガルバノミラー５を対物レンズ１０の後側焦点面に共役させる。反射鏡８、９は、走査線をねじり回し、空間的にコンパクトにするためである。ただし、網掛け部分の素子を含むシステムにおいて、反射鏡９は、長波長側の光を通過させるダイクロイックミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｍｉｒｒｏｒ）である必要がある。励起装置１は、励起光束を試料内の符号１１に示すような位置に集光し、蛍光を励起する。励起装置１は、有効開口数が０．０３～０．０４であり、集光された励起光束のウエスト半径の、最細部の近傍約４２０ミクロンの範囲内での変化が２倍を超えないことを保証する。検出装置２は、符号１１に示す位置を画像化し、その主な素子が対物レンズ１２、鏡筒レンズ１３（焦点距離１２５ミリメートル）及びカメラ１４（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｆｌａｓｈ４．０ｓＣＭＯＳカメラ）である。カメラの画素数が２０４８×２０４８、画素のサイズが６．５×６．５ミクロン、全幅フレームレートが１００Ｈｚ、すなわち、１０ミリ秒／フレームである。ガルバノミラー５は、片方向の１０ミリ秒の鋸歯状波で同期的に走査する。試料台３の移動速度が１００ミクロン／秒、すなわち、１ミクロン／フレームである。運動によるブレが１／２００未満であり、無視できる。試料は、屈折率１．４５を目標としてマッチングを行い、選択可能なマッチング溶液はＨｉｓｔｏＤｅｎｚを含む。前記システムは、１×１センチメートルの試料に対し、解像度が１ミクロンの三次元画像化を完成するには約１６分間が必要とされ、マウスの全脳の蛍光画像化を完成する時間は約５～６時間であり、従来技術より明らかに優れている。図４の（ａ）－（ｃ）～は、前記システムが採集したマウスの脳の蛍光画像化の実例を示し、そのうち、図４の（ａ）は、１つの厚さが数百ミクロンの脳のスライスの画像化結果を三次元に再構成した冠状断面図を示し、（ｂ）は、脳のスライスの局所範囲内でのニューロン細胞体及び樹状突起の微細構造を示し、（ｃ）は、ある画像化面内で捕獲したニューロン軸索等の細胞精細構造を示す。
もう１つの実施例において、図５に示すように、図３と類似する構造を用いているが、パルス光源を用いて光学シートの方法により照明する。ただし、パルス光源４は、作動周波数が３０～１００Ｈｚのナノ秒窒素分子／色素レーザが例として用いられ、望遠鏡又は開口絞り（図示しない）を経て、パワー調節、ビーム径調節され、矩形光束を形成し、シリンドリカルミラー５に入射する。シリンドリカルミラーの焦点距離は、１００ミリメートルであってもよく、柱面が励起装置１及び検出装置２の光路主軸により画定された平面に垂直する。他の素子は図３に示すシステムと同様である。カメラ撮像がパルス光源と同期的に行われる。作動周波数が１００Ｈｚの場合には、システムの三次元画像化能力は図５に示すシステムと同様である。
もう１つの実施例において、図６に示すように、多光子走査画像化の構造を用いた。励起装置１及び検出装置２は先端部分の素子を共用する。励起装置１（及び検出装置２）の光路主軸と机上面（地面）の垂直方向とは４５°の角度をなす。試料台３は机上面に平行し、試料を載置して試料を画像化位置に移動させる。画像化するときに試料が連続的に水平運動する。励起装置１及び検出装置２の最先端は対物レンズ１０（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＭＰＬＦＬＮ ２０ＸＷ）であり、開口数が０．５、作動距離が３．５ミリメートルである。多光子励起光を発生可能なパルス励起光４は、一般に、フェムト秒レーザ又はピコ秒レーザであり、望遠鏡又は開口絞り（図示しない）を経て、パワー調節、ビーム径調節され、二次元走査手段５に入射し、対物レンズ１０の後に、検出方向に垂直な平面において走査するスポット状励起を発生させる。リレーレンズ６、７は、ガルバノミラー５を対物レンズ１０の後側焦点面に共役させるためである。反射鏡８、９は走査線をねじり回し、空間的にコンパクトにするためである。ただし、反射鏡９は、長波長側の光を通過させるダイクロイックミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｍｉｒｒｏｒ）である。励起装置１の有効開口数が０．５である。励起装置１は、試料内の符号１１に示すような位置で励起を発生する。検出装置２は、符号１１に示す位置を画像化し、その主な素子は図５に示すシステムと類似する。本システムは、速度よりも信号対雑音比の要求が高い場合に適用される。
もう１つの実施例において、図３又は図６に示すシステムと類似する装置において、励起光４が走査手段５に入る前に、１つの光束分割手段を挿入することができる。当該光束分割手段は、１つの励起光束を複数の励起光束に分割して、画像化位置１１の範囲内における異なるサブ領域を同時に励起することにより、全体の走査速度を向上させることができる。
もう１つの実施例において、図６に示すシステムと類似し、顕微画像化分野の専門家によく知られているように、その検出装置は、その他のタイプの高速検出器、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）（アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を含む）、光電子増倍管等を用いることができる。
もう１つの実施例において、図６に示すシステムと類似し、顕微画像化分野の専門家によく知られているように、励起装置１及び検出装置２が共用する先端部分素子は、対物レンズから走査手段まで含み、その後、分離されている検出部分において試料と共役する位置に共焦点ピンホールを更に設けることにより、共焦点走査型画像化の構造を構成することができる。
さらにもう１つの実施例において、前述した各システムと類似し、顕微画像化分野の専門家によく知られているように、励起装置が用いた励起光源は、１つ又は複数の発光ダイオード、連続波レーザ、パルスレーザの組み合わせであってもよく、画像化におけるコントラストは、蛍光、弾性散乱光、ラマン散乱、ＳＨＧ、ＴＨＧ、誘導ラマン散乱等の信号の１種又は組み合わせであってもよい。
上述した実施例において、検出方向はいずれも相対運動方向と４５°の角度をなす場合のみを挙げたが、その他の応用において、前記角度は、必要に応じて適切に選択することができ、主に、選択された対物レンズの接触角に適応したものである。例えば、解像度の要求がより高いシステムにおいて、開口数がより大きい対物レンズを選択し、それに応じて前記角度を５５°～６５°を選択することができる。同様に、相対運動の形式も直線に制限されない。例えば、円周運動は、もう１つの好適な形式とすることもできる。
画像化するときに運動が存在し、採集した画像は運動によるブレを有する場合がある。ここでは、運動モードが簡単で一定であるため、１種の解決案として、本発明は、運動ブレを除去する一般的な算法を用いて撮像した画像の品質を効果的に改善することができる。図７Ａは静止時に撮像したナノ蛍光ビーズであり、図７Ｂは１ミリメートル／秒の速度で運動するときに１０ミリ秒露光する場合の撮像である。図からわかるように、明らかであるが一致する運動ブレが見られる。デコンボリューション処理により画像の詳細を効果的に復元することができ、その結果を図７Ｃに示す。もう１つの解決案として、励起時間を制限する方法を用いて運動ブレを抑制することもできる。この場合、特に重要なポイントは、試料中の各々のスポットの励起時間内における運動が解像度の要求に対して無視できるのを保証することである。簡単に言えば、励起時間＊運動速度の値は、最小解像度よりも著しく小さければよい。もし解像度要求が１ミクロン、運動速度が１ミリメートル／秒であれば、励起時間が１ミリ秒未満であることが要求される。パルス幅が適切なパルス光源は、この要求を直接に満たすことができる。連続光源は、適切なスイッチング変調により照明に用いられてもよいが、より高い効率のために、連続光源は、走査方式によりスポットに対する短時間励起を実現することもできる。図８に示す例において、顕微鏡の視野は、画像化カメラを参考にして、幅が２０００ピクセルである。それに応じて、線形の励起光の幅が約１０ピクセルである。励起光が０．０１秒内で全視野を走査したとき、１ピクセル毎の実際に励起される時間が約０．０１秒／２０００＊１０、すなわち、５０マイクロ秒に過ぎない。
他方、試料が位置する空間（励起光が励起装置から離れ、試料に入るまでの経路、及び信号光が試料から離れ、検出装置に入るまでの経路を含む）に、屈折率の差が存在すれば、厚い試料は透明性を失う恐れがある。同時に、画像化に大きい収差が生じる恐れがある。良い信号対雑音比及び解像度を得るために、本発明は、前記経路において、透明化／屈折率の均一化処理を行うように提案する。図９は、処理前後の効果の比較を示している。
上述した具体的な実施例は、本発明の目的、技術的態様及び有益な効果をさらに詳しく説明したが、上述したものは本発明の具体的な実施例であることに過ぎず、本発明を制限するためのものではなく、本発明の精神及び範囲内で行われた変形、均等物、改良等の全ても本発明の保護範囲に含まれると理解されるであろう。
（図３において）
１ 励起装置
２ 検出装置
３ 試料台
４ 励起光源
５ 走査ガルバノミラー
６ リレーレンズ
７ リレーレンズ
８ 反射鏡
９ 反射鏡又はダイクロイックミラー
１０ 対物レンズ
１１ 試料内励起，検出領域
１２ 対物レンズ
１３ 鏡筒レンズ
１４ カメラ
（図５において）
１ 励起装置
２ 検出装置
３ 試料台
４ 励起光源
５ シリンドリカルミラー
１０ 対物レンズ
１１ 試料内励起，検出領域
１２ 対物レンズ
１３ 鏡筒レンズ
１４ カメラ
（図６において）
１ 励起装置
２ 検出装置
３ 試料台
４ 励起光源
５ 二次元走査手段
６ リレーレンズ
７ リレーレンズ
８ 反射鏡
９ ダイクロイックミラー
１０ 対物レンズ
１１ 試料内励起，検出領域
１２ 鏡筒レンズ
１３ カメラ

Claims (15)

  1. 励起主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で検出可能なコントラストを生成するための、少なくとも１つの励起装置と、
    検出主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で生成されたコントラストを検出するための、少なくとも１つの検出装置と、
    試料と前記励起装置及び前記検出装置との相対運動を発生させるための、少なくとも１つの移動手段と、
    を含み、
    前記相対運動の方向は、前記励起主軸方向に平行も垂直もせず、前記相対運動の方向は、前記検出主軸方向に平行も垂直もせず、画像化するときの前記相対運動は等速であり且つ中断しない、三次元画像化可能な顕微鏡において、
    試料の１つの三次元領域を画像化する全過程において、前記検出装置の有効検出領域において、画像化する立体画素の各々に対応する試料単位は、所定時間以内においてのみ前記励起装置に励起され、前記所定時間内において、前記相対運動による変位は前記顕微鏡の解像度の要求を超えず、
    前記励起装置と前記検出装置とは同期的に作動し、
    前記励起装置は、パルス時間が前記所定時間以内のパルスを用い、光学シート照明の方法により試料を励起し、
    前記励起装置は、検出領域内において前記検出装置の検出方向に略垂直な励起光束を少なくとも１つ発生し、
    前記励起装置は、前記励起光束を走査移動させることができる走査手段を少なくとも１つ含む、
    三次元画像化可能な顕微鏡。
  2. 前記試料が位置する環境において透明な物質が充填され、前記透明な物質と、その時の前記試料とは、屈折率が略同一である、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  3. 前記励起装置は、１つ又は複数の発光ダイオード、連続波レーザ、パルスレーザの組み合わせにより、光源を励起する、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  4. 前記検出可能なコントラストは、蛍光、弾性散乱光、ラマン散乱、ＳＨＧ、ＴＨＧ、誘導ラマン散乱の信号の１種又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  5. 前記励起装置は、パルスレーザ、パルス作動の発光ダイオード、又は異なる方法で変調された連続光源の組み合わせである、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  6. 前記励起装置は、１つ又は複数のシリンドリカルミラー、シリンドリカルレンズ、変形ミラー、透過型位相素子、反射型位相素子を含むことによって、前記光学シート照明を形成する、請求項５に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  7. 前記励起光束は、検出領域内で光束方向に沿った光束半径の変化が３倍を超えない、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  8. 前記走査手段は、１つ又は複数の走査ガルバノミラー、共振走査鏡、回転多面鏡、音響光学変調器の組み合わせを含む、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  9. 前記検出装置は、マトリックス状の感光素子を画像化素子としたものであり、前記画像化素子は前記走査手段と同期的に作動する、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  10. 前記検出装置は、前記走査手段と同期的に作動する走査解除手段を含み、さらにアレイ又はマトリックス状の感光素子を画像化素子としたものである、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  11. 前記励起装置は、１つの励起光束を複数の励起光束に分割するための光束分割手段を１つ含む、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  12. 前記光束分割手段は、１つ又は複数のレンズアレイ、反射鏡アレイ、ハーフミラーアレイの組み合わせを含むか、あるいは、固定又は変調可能なフェーズフィルタ又はデジタルマイクロミラーアレイを含む、請求項１１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  13. 前記励起装置及び前記検出装置は走査型共焦点画像化の構造を構成する、請求項１に記載の三次元画像化可能な顕微鏡。
  14. 少なくとも１つの励起装置を利用して、励起主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で検出可能なコントラストを生成すること、及び
    少なくとも１つの検出装置を利用して、検出主軸方向に沿って試料の検出すべき領域内で生成されたコントラストを検出すること（前記検出装置と前記励起装置とは、素子を共用するのが排除されない）、
    を含み、
    前記試料と前記励起装置、前記検出装置との相対運動の方向は、前記励起主軸方向に平行も垂直もせず、前記相対運動の方向は、前記検出主軸方向に平行も垂直もせず、画像化するときの前記相対運動は等速であり且つ中断しない、三次元顕微画像化方法において、
    試料の１つの三次元領域を画像化する全過程において、前記検出装置の有効検出領域において、画像化する立体画素の各々に対応する試料単位は、所定時間以内においてのみ前記励起装置に励起され、前記所定時間内において、前記相対運動による変位は前記画像化の解像度の要求を超えず、
    前記励起装置と前記検出装置とは同期的に作動し、
    前記励起装置は、パルス時間が前記所定時間以内のパルスを用い、光学シート照明の方法により試料を励起し、
    前記励起装置は、検出領域内において前記検出装置の検出方向に略垂直な励起光束を少なくとも１つ発生し、
    前記励起装置は、前記励起光束を走査移動させることができる走査手段を少なくとも１つ含む、
    三次元顕微画像化方法。
  15. デコンボリューションにより前記相対運動によるブレを除去することをさらに含む、請求項１４に記載の三次元顕微画像化方法。
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