JP7028800B2 - 全血から核酸を単離するための装置及び方法 - Google Patents
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Description
少なくとも1つのグアニジン塩、好ましくはグアニジンチオシアネート、
少なくとも1つの緩衝物質、好ましくは2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、
非イオン性界面活性剤、好ましくはTriton X-100及び
二価カチオンに対する錯化剤、好ましくはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)
を有するか、又はそれらからなり
及び特に還元剤を含まず、例えばチオール結合、若しくはその前駆体結合を含まず、特にβ-メルカプトエタノール及びジチオトレイトール(DTT)を含まない。
少なくとも1つのグアニジン塩を、例えば1.8から2.6Mまで、好ましくは2.0から2.4Mまで、より好ましくは2.2Mを含有し、
それが血液容量を5.0から8.0までのpH、例えばpH5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9若しくは6.0から7.5、7.6、7.7、7.8、7.9まで、好ましくはpH6.5から7.3までに緩衝する、少なくとも1つの緩衝物質を、例えばMESを少なくとも50mMまで、好ましくは少なくとも70mM、例えば100mMまで、若しくは74mMまでの濃度で、
非イオン性界面活性剤、例えばTriton X-100を10から20%(w/v)まで、好ましくは12から18%(w/v)まで、
二価カチオンに対する錯化剤を、特に例えば50から100mMまで、好ましくは70から80mMまで、より好ましくは約72mMのEDTAを、
例えば血液容量の水性組成物の容量に対する比、1:13若しくは1:3又は1:2まで、好ましくは1:2.6まで、又は1:2.5若しくは1:2.4まで
を有するか、又はそれらからなる。
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. pH5.0から8.0までに緩衝するための少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、及び
d. 二価カチオンに対する少なくとも1つの錯化剤を含有し、並びに
e. 還元剤は含まない
使用に関する。
好ましくは組成物は、
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. 少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、及び
d. 少なくとも1つの錯化剤、
並びに場合によってはプロテイナーゼ及び/又はDNaseの
水性溶液からなる。
核酸用吸着剤と接触させられ、
その場合に、場合によっては添加されたプロテイナーゼ及び/又はDNaseも含めて、この混合物からは吸着剤との接触前に含有物質は分離されず、
続いて吸着剤に結合されなかった物質が、例えば吸着剤の洗浄によって除去され、
及び、例えば吸着剤と、吸着剤に結合されていた核酸を溶解する、一つのpH値、アルコール成分及び/又はイオン濃度を持つ水性緩衝剤との接触によって、この吸着剤に結合した核酸が溶離されることで単離される。
本発明の組成物として水性溶液が使用され、それは水中の2.2Mのグアニジンチオシアネート、72mMのMES、14.4%(w/v)のTriton X-100及び72mMのEDTAから構成されている。この組成物から6.5mLが従来の採血管内に含有され、その中に直前に採取された血液が吸引されたが、その血液は更なる加工はされておらず、添加物も含有しなかった。この全血は容量0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL及び2.5mLがそれぞれ1つの採血管内に吸引された。混合は血液容量の吸引によって、場合によっては、特に気泡を吸引した後では更に振ることによって実施される。
組成物と全血の混合物を生成するために、本発明の組成物(RNA Exact)として実施例1がそれぞれ6.5mL使用され、直前に直接採取された、他の別の添加物質を含有しない血液2.5mLと混合された。比較対象としては、水中の4.0Mのグアニジンチオシアネート、45mMのトリス/HCl、18.0%(w/v)のTriton X-100及び0.8%(w/v)のDTTから構成されていて、pH値6.0に調整された溶液が使用された(対応するWO 00/09746 A1と比較)。比較溶液2.5mlがWO 00/09746 A1に記載されているように(比1+1)、同じく2.5mlの、直前に直接採取された血液試料と混合された。この混合物は22.5℃で保存され、Macherey-Nagel社のNucleoSpin RNA Blood Midi Kitを用いてRNAが混合物から単離された。この比較溶液中にMacherey-Nagel社のプロトコルに設定されているように、70%エタノールが容量の1/3添加された。これは本発明の組成物との混合物に対しては不必要である。図3及び図4はRNA Nano-Chip上のこの溶離液をBioanalyzer2100で電気泳動的分離した結果を示す。本発明の組成物と試料との混合物からは3日後及び5日後もRNAを高い完全性で単離可能である一方で、比較溶液の使用下では0日目、すなわち血液との混合の直後でのみそれが可能である。
組成物と全血の混合物を生成するために、本発明の組成物として実施例1がそれぞれ6.5mL使用され、直前に直接採取された、他の別の添加物質を含有しない血液2.5mLと混合された。比較のために、凝固を抑制するためのEDTAを含有する採血管内に血液が吸引された(S-Monovetten EDTA-K3、Sarstedt社から入手可能)。血液はそれぞれ3人の異なった献血者からであった。
2人の異なった献血者からの全血から、それぞれ2.5mLが採取後直接、水中の2.2Mのグアニジンチオシアネート、72mMのMES、14.4%(w/v)のTriton X-100及び72mMのEDTAからなる本発明の組成物6.5mLに添加され22.5℃で培養された。この混合物から、直ちに(T0)及び3日後(T3)、4日後(T4)及び5日後(T5)にそれぞれ一定分量が採取され、-80℃で冷凍された。続いて全ての試料が並行して解凍され、核酸吸着剤(NucleoSpin RNA Blood、Macherey-Nagel社)に与えられた。吸着剤は製造元の指示に従って洗浄され、核酸が溶離された。溶離液にはDNase(DNase I、DNaseフリー、製品番号EN0521、Thermo Fisher Scientific社)が添加された。cDNAを得るために、このRNAは「first strand cDNA synthesis kit」(製品番号K1612、Thermo Fisher Scientific社)で逆転写された。この生成物は、β-アクチン、GAPDH、IL-8、c-Fos、IL-1B及びTNF-αに対する遺伝子の核酸配列に特有であるプライマーで、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用い、Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(製品番号#K0222、Thermo Fisher Scientific社)の使用下で、ダブルアプローチとして増幅され、定量化された。
Claims (19)
- 全血中に含有される細胞の分解剤として、全血中の全RNAの安定化剤として、及び全血と組成物との混合物から核酸用吸着剤にRNAを吸着により単離するための組成物の使用であって、前記組成物が採血管に含有されており、かつ水性溶液中で、
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. pH5.0から8.0までに緩衝するための少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、及び
d. 二価カチオンに対する少なくとも1つの錯化剤
からなり、
e. 還元剤を含まない
使用において、前記使用が、全血中に含有される全RNAの安定化剤としてであって、生物学的試料と組成物との混合物から直接核酸用吸着剤に核酸を吸着により単離するためであり、前記組成物が、1:13までの生物学的試料と組成物との可変な容量比で混合物中に存在し、しかも、混合物から成分が分離されておらず、かつ混合物が吸着剤と接触させられる前に、核酸が混合物から沈殿及び分離されていないことにより、前記吸着が混合物から直接実施されることを特徴とする、使用。 - グアニジン塩がグアニジンチオシアネートであり、緩衝物質が2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、トリス(トリスヒドロキシメチル-アミノメタン)、クエン酸塩、リン酸塩(リン酸水素二ナトリウム)二水和物、ビス-トリス緩衝剤(ビス-(2-ヒドロキシエチル)-イミノ-トリス-(ヒドロキシメチル)-メタン)、ACES(N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸)、炭化水素ナトリウム、若しくはリン酸塩(リン酸水素ナトリウム)二水和物であり、非イオン性界面活性剤がTriton X-100、Tween 20、Tween 80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)、Brij 58(ポリエチレングリコール-ヘキサデシルエーテル)、Triton X-114(オクチルフェニルポリエチレングリコールエーテル)若しくはNonidet P40であり、錯化剤がエチレンジアミン四酢酸(EDTA)であって、前記組成物が還元剤としてのチオール化合物若しくはその前駆体化合物を含まないことを特徴とする、請求項1に記載の使用。
- 全血及び組成物からなる混合物の遠心分離を介してあらかじめ核酸を沈殿及び分離することなく、前記混合物と核酸用吸着剤との接触によって、前記混合物から核酸を単離することを含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の使用。
- 混合物にプロテイナーゼ及び/又はDNaseが添加されていることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記採血管が、生物学的試料の可変な容量を吸引するために設けられていることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
- 全血中の全RNAの安定化剤としての全血中に含有される細胞の分解剤としての組成物を含有する、全血と組成物との混合物から核酸用吸着剤にRNAを吸着により単離するための採血管の使用であって、前記採血管が、生物学的試料の可変な容量を吸引するために設けられており、前記分解剤が水性溶液中で、
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. pH5.0から8.0までに緩衝するための少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、及び
d. 二価カチオンに対する少なくとも1つの錯化剤
からなり、
e. 還元剤を含まない
ことを特徴とし、分解剤の前記使用が、全血中に含有される全RNAの安定化剤として、及び生物学的試料と組成物との混合物から直接核酸用吸着剤に核酸を吸着により単離するためであり、前記組成物が、1:13までの生物学的試料と組成物との可変な容量比で混合物中に存在しており、しかも混合物から成分が分離されておらず、かつ混合物が吸着剤と接触させられる前に、核酸が混合物から沈殿及び分離されていないことにより、前記吸着が混合物から直接実施されることを特徴とする、採血管の使用。 - 直接血液を採取するための採血管の使用であって、前記分解剤が水性溶液中で、
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. pH5.0から8.0までに緩衝するための少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、及び
d. 二価カチオンに対する少なくとも1つの錯化剤、
e. 並びにプロテイナーゼ及び/又はDNaseからなり、
還元剤を含まないことを特徴とする、請求項6に記載の使用。 - 直接血液を採取するための採血管の使用であって、生物学的試料と組成物とからなる混合物にプロテイナーゼ及び/又はDNaseが添加されていることを特徴とする、請求項6又は7に記載の使用。
- 全血から全RNAを単離するための方法であって、採血管に含有されており、かつ水性溶液中で、
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. 少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、及び少なくとも1つの錯化剤
からなり、全血中のRNAの分解及び再合成を妨げる還元剤を含まない、組成物と全血との混合と、1:13までの血液と組成物との容量比の全血及び組成物からなる混合物の生成と、混合物と核酸用吸着剤との接触であって、吸着剤との接触前に混合物から含有物質が分離されていない接触と、結合されなかった物質の吸着剤からの除去と、吸着剤からのRNAの溶離とを特徴とする、方法。 - 混合物と吸着剤との前記接触が、あらかじめ核酸を混合物から沈殿、分離及び溶解することなく実施されることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも3日間、最高25℃での混合物の保存を特徴とする、請求項9又は10に記載の方法。
- 生物学的試料と組成物との前記混合が、1:13までの容量比で行われることを特徴とする、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
- 生物学的試料と組成物との前記混合が、1:2までの容量比で行われることを特徴とする、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記吸着剤がシリカコーティングされた粒子であり、生物学的試料と組成物の前記混合物に、混合物の容量の少なくとも50%の容量の希釈液が添加されることを特徴とする、請求項9から13のいずれか一項に記載の方法。
- 1:13までの血液と組成物との容量比の全血及び組成物からなる得られた混合物の0℃超での貯蔵を特徴とする、請求項9から14のいずれか一項に記載の方法。
- 1:13までの血液と組成物との容量比の全血及び組成物からなる混合物へのプロテイナーゼ及び/又はDNaseの添加を特徴とする、請求項9から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水性溶液は、
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. 少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤と、少なくとも1つの錯化剤、及びプロテイナーゼ及び/又はDNaseからなることを特徴とする、請求項9から16のいずれか一項に記載の方法。 - 全血中に含有される細胞の分解剤として、全血中の全RNAの安定化剤として、及び全血と組成物との混合物から核酸用吸着剤にRNAを吸着により単離するための組成物であって、前記組成物が採血管に含有されており、かつ水性溶液中で、
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. pH5.0から8.0までに緩衝するための少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、及び
d. 二価カチオンに対する少なくとも1つの錯化剤
からなり、
e. 還元剤を含まない
組成物において、前記組成物が、全血中に含有される全RNAの安定化剤としてであって、生物学的試料と組成物との混合物から直接核酸用吸着剤に核酸を吸着により単離するためのものであり、前記組成物が、1:13までの生物学的試料と組成物との可変な容量比で混合物中に存在し、しかも、混合物から成分が分離されておらず、かつ混合物が吸着剤と接触させられる前に、核酸が混合物から沈殿及び分離されていないことにより、前記吸着が混合物から直接実施されることを特徴とする、組成物。 - 全血中に含有される細胞の分解剤として、全血中の全RNAの安定化剤として、及び全血と組成物との混合物から核酸用吸着剤にRNAを吸着により単離するための組成物を含有する採血管であって、前記採血管が、生物学的試料の可変な容量を吸引するために設けられており、前記分解剤が水性溶液中で、
a. 少なくとも1つのグアニジン塩、
b. pH5.0から8.0までに緩衝するための少なくとも1つの緩衝物質、
c. 少なくとも1つの非イオン性界面活性剤、及び
d. 二価カチオンに対する少なくとも1つの錯化剤
からなり、
e. 還元剤を含まない
採血管において、前記組成物が、全血中に含有される全RNAの安定化剤としてであって、生物学的試料と組成物との混合物から直接核酸用吸着剤に核酸を吸着により単離するためのものであり、前記組成物が、1:13までの生物学的試料と組成物との可変な容量比で混合物中に存在し、しかも、混合物から成分が分離されておらず、かつ混合物が吸着剤と接触させられる前に、核酸が混合物から沈殿及び分離されていないことにより、前記吸着が混合物から直接実施されることを特徴とする、採血管。
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