JP7020700B2 - 抗菌組成物 - Google Patents

Description

分野
本発明は、バイオフィルム及び前記バイオフィルム内又は周囲に生存する微生物を衛生化及び／又は実質的に除去するための化合物、組成物、方法、及び使用に関する。特に、本発明は、バイオフィルム及び前記バイオフィルム内及び周囲に生存する病原性微生物を処理する創傷処置、創傷被覆材、医療機器、水処理、食品加工、及び歯科治療に使用することができる金属ＥＤＴＡ化合物に関する。

背景
微生物による、皮膚及び医療機器を含む表面（非生物及び生物）のコロニー形成は、患者への重大な感染リスクを表す。これらの微生物が表面上に付着して増殖する際、それらはバイオフィルムを形成する。バイオフィルム環境内に生存する微生物集団が治癒の遅延及び感染リスクの増加に寄与することがますます認識されている。例えば、慢性創傷は、病原性バイオフィルムが存在する場合には、効果的に治癒しないであろう。そのようなバイオフィルムは、患者の免疫系及び抗菌処置に抵抗し、組織破壊、炎症、及び／又は重篤な感染に導きうる。これらの創傷は、しばしば、多微生物集団によりコロニー形成される。そのような慢性創傷において、バイオフィルム内の微生物は、それらのプランクトン対応物と比較して、抗菌性介入に対して１００～１０００倍耐性でありうる（Singh and Barbul, Wound Rep Reg. 16:1, 2008）。Jamesらによる最近の試験（Wound Rep Reg. 16: 37-44, 2008）では、それらの試験において分析された慢性創傷の少なくとも６０%がバイオフィルムによりコロニー形成されることが示されている。

バイオフィルムが表面（生物学的又は非生物的な表面を問わず）上で発生するためには、微生物は最初に表面に付着しなければならない。一度、表面にしっかりと付着すると、それらは増殖し、細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）を産生する。ＥＰＳは、多糖類、タンパク質、細胞外ＤＮＡ、ならびに他の生物学的及び無機的な物質からなる。ＥＰＳは、バイオフィルムのマトリックスを形成し、免疫細胞及び抗菌剤から微生物を保護するのに役立ち、抗菌剤（例、抗生物質及び殺生物剤、特に消毒剤）の有効性を低下させる。従って、バイオフィルムを破壊し、バイオフィルムに適用される抗菌剤に微生物を曝露し、そのようにする際に、バイオフィルム中に生存する微生物を効果的に処理するために必要なそのような抗菌剤の濃度を低下させることが望ましい。

二ナトリウム塩又はカルシウム二ナトリウム塩として加えられるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、局所感染を処置するために、又はカテーテルなどの硬質表面を処理するために使用されてきた。ＷＯ０３／０４７３４１には、例えば練り歯磨き用の添加剤としてのＥＤＴＡの使用が記載されている。ＥＤＴＡはまた、水硬度の影響を低下させるための配合剤及び一般的にはキレート剤として使用される。

他の抗生物質剤とのＥＤＴＡの組み合わせは、例えば、ＵＳ ５９９８４８８に開示されており、そこでは、ＥＤＴＡは、眼科用溶液中の抗菌性保存剤との組み合わせで使用される。

発明の概要
とりわけ、本明細書又は他所で特定されているかにかかわらず、先行技術の少なくとも１つの欠点に対処する化合物を提供すること、又は既存の抗菌剤、例えば先行技術の金属－ＥＤＴＡ化合物の代替物を提供することが、本発明の１つの目的である。例えば、創傷処置又は医療機器において抗バイオフィルム活性及び／又は抗菌活性及び／又は抗炎症活性を提供する化合物又は組成物を提供することが、本発明の目的でありうる。

本発明の態様によれば、添付の特許請求の範囲に記載する化合物、組成物、産物、及び使用が提供される。本発明の他の特徴は、従属請求項及び以下の記載から明らかになるであろう。

本明細書を通じて、用語「含んでいる」又は「含む」は、特定された成分を含むが、他の成分の存在を排除するものではないことを意味する。用語「から本質的になっている」又は「から本質的になる」は、特定された成分を含むが、不純物として存在する物質、成分を提供するために使用されるプロセスの結果として存在する不可避の物質を除く他の成分、及び本発明の技術的効果を達成する以外の目的のために加えられる成分を排除することを意味する。典型的には、組成物を指す場合、１組の成分から本質的になる組成物は、５重量%未満、典型的には３重量%未満、より典型的には１重量%未満の非特定成分を含む。

用語「からなっている」又は「からなる」は、特定された成分を含むが、他の成分の添加を排除することを意味する。

適当な場合はいつでも、文脈に依存して、用語「含む」又は「含んでいる」の使用は、「から本質的になる」又は「から本質的になっている」という意味を包含する、又は含むと取ってもよく、「からなる」又は「からなっている」という意味を含むと取ってもよい。

本明細書に記載する任意の特徴は、適当な場合、個別に、又は互いに組み合わせてのいずれかで、特に添付の特許請求の範囲に記載する組み合わせで使用してもよい。本明細書に記載する本発明の各々の態様又は例示的な実施態様の任意の特徴は、適切な場合、本発明の任意の他の態様又は例示的な実施態様にも適用可能として読むべきである。換言すれば、本明細書を読んだ当業者は、本発明の各々の例示的な実施態様についての任意の特徴を、異なる例示的な実施態様の間で互換的かつ組み合わせ可能と考えるべきである。

本明細書において、用語「抗菌」は、ウイルス、プリオン、原生動物、アメーバ、細菌、真菌、及び酵母を含む、任意の１つ又は複数の型の微生物、又は微生物の特定の種の任意の１つ又は複数を殺傷しうる及び／又は阻害しうる及び／又は増殖を停止しうる化合物又は組成物を指す。

用語「バイオフィルム」は、細胞外ポリマーマトリックス（ＥＰＳで構成される）中に封入され、生物学的又は非生物的な表面に付着した、微生物の単培養及び多微生物群コミュニティの両方を指す。

用語「バイオフィルム形成」は、表面への微生物の付着及びその後のＥＰＳマトリックス内の複数の細胞層の発生を指す。

用語「抗バイオフィルム」は、微生物バイオフィルムの形成の阻害、ならびに／あるいはバイオフィルムの破壊及び／又は分散、ならびに／あるいはバイオフィルムのＥＰＳの分離及び／又は分散及び／又は分解を指す。

用語「抗炎症性」は、典型的には創傷における炎症又は腫脹を低下させる物質又は処置の特性を指す。

用語「感染」は、体内に通常は存在しない微生物（例えば細菌、ウイルス、真菌、酵母、及び寄生虫など）の侵入及び増殖を指す。感染は症状を起こさず、無症状でありうる、又はそれは症状を起こし、臨床的に明らかでありうる。感染は局在したままであるか、又はそれは血液又はリンパ管を通じて広がり、全身性（体全体）になりうる。体内に自然に生存する微生物は、感染性とは考えられない。

用語「創傷」は、皮膚が裂ける、切開される、穿刺される（開放創）傷害、又は鈍力外傷が挫傷（閉創）を起こす傷害の型を指す。

用語「急性創傷」は、新しく、治癒の第１段階にある創傷を指す。急性創傷は、外力又は物体により穿刺された又は壊された皮膚層により特徴付けられる。急性創傷は、予期された時間内に治癒しない場合、又は血液、酸素、栄養素の供給不良の結果として、もしくは不良な衛生を通じて、慢性創傷に進行することがありうる。急性創傷を適切に処置して、感染及び／又は炎症を避けるべきである。急性創傷は、原因（例えば裂傷、擦過傷、穿刺、切開、銃砲、火傷など）に基づき、ならびにそれらのサイズ及び深さ（表面又は深部）に従って分類する。

用語「慢性創傷」は、経時的にそれ自体を修復しない創傷を指す。慢性創傷は、しばしば、創傷治癒段階の１つに「停滞」していると考えられ、高齢の成人集団において最も多く見られる。典型的には、創傷が２～３ヶ月以内に予期されたように治癒しない場合、それは慢性と考えられる。慢性創傷には、褥瘡（例、床ずれ）、動脈及び静脈脚潰瘍、ならびに糖尿病性潰瘍が含まれる。

本発明の第１の態様によれば、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物を提供する；式中：
ｎは２～４の整数であり；
各々のＭは金属イオンであり；そして
Ｍ_ｎは、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも２つの異なる金属イオンを含む。

式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、金属－ＥＤＴＡ化合物として記載してもよい。用語「金属－ＥＤＴＡ化合物」は、前記金属及び前記ＥＤＴＡ化合物が塩、イオン、又は中性種として存在するか否かにかかわらず、少なくとも１つの金属及び少なくとも１つのＥＤＴＡ分子を含む任意の型の化学種を指し、従って、金属－ＥＤＴＡ塩、キレート、及び配位錯体を包含する。式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、塩及び／又はキレート及び／又は配位錯体でありうる。適切には、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、金属原子とＥＤＴＡ分子との間のイオン結合を含む塩である。適切には、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は中性化合物である。電荷情報が特定の式において与えられていない場合、その式により表される化合物は全体的な電荷を有しないと仮定してもよい。

化合物は固体の形態でありうる。代替的に、化合物は、溶液又は懸濁液、適切には水溶液又は水性懸濁液、適切には水溶液中に存在してもよい。

ｎは２～４の整数である。従って、化合物は、二金属－ＥＤＴＡ化合物、三金属ＥＤＴＡ化合物、又は四金属ＥＤＴＡ化合物でありうる。

この化合物は、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の混合物でありうる。式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の混合物は、異なる数の金属イオン、例えば以下の種の少なくとも２つを含みうる：Ｍ_２（ＥＤＴＡ）、Ｍ_３（ＥＤＴＡ）、及びＭ_４（ＥＤＴＡ）。

式がＭ_４（ＥＤＴＡ）である化合物において、各々の金属イオンは１＋電荷を有し、化合物は全体的な電荷を有さず、ＥＤＴＡ成分は遊離カルボン酸基を有さない。式がＭ_３（ＥＤＴＡ）である化合物において、各々の金属イオンは１＋電荷を有し、化合物は全体的な電荷を有さず、ＥＤＴＡ成分は１つの遊離カルボン酸基を有する。式がＭ_２（ＥＤＴＡ）である化合物において、各々の金属イオンは１＋電荷を有し、化合物は全体的な電荷を有さず、ＥＤＴＡ成分は２つの遊離カルボン酸基を有する。化合物が含む金属イオン（Ｍ）の数は、化合物が存在しうる溶液のｐＨに依存しうる。例えば、酸性ｐＨは、化合物中に存在する金属イオン（Ｍ）の数を低下させうる。

式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物中に存在する金属イオン（Ｍ）のいずれかが１＋より高い電荷を有し（例えば、Ｚｎ^２＋）、化合物が全体的な電荷を有さない場合、化合物中に存在しうる金属イオン（Ｍ）の数は低下し（即ち、ｎは２又は３である）、化合物中に存在する遊離カルボン酸の数はそれに応じて低下するであろう。

Ｍ_ｎは、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも２つの異なる金属イオンを含む。適切には、Ｍ_ｎは、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｅ、Ｃｕ、Ｇａ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも２つの異なる金属イオンを含む。

化合物が式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）を有し、Ｍ_ｎがＡｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも２つの異なる金属イオンを含むため、化合物はＥＤＴＡ、少なくとも第１の金属イオンＭ^１及び少なくとも第２の金属イオンＭ^２を含むと考えてもよく、そこでＭ^１とＭ^２は異なり、各々がＡｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される。

Ｍ_ｎは４つまでの金属イオンを含むことができる。ｎが３又は４である場合、Ｍ_ｎは、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも２つの異なる金属イオンに加えて、他の金属イオンを含みうる。一部の実施態様において、Ｍ_ｎが含む他の金属イオンはＮａイオンである。例えば、ｎ＝３又は４の場合、Ｍ_ｎは１つのＮａイオンを含むことができ、又はｎ＝４の場合、Ｍ_ｎは２つのＮａイオンを含みうる。

一部の実施態様において、Ｍ_ｎは、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される金属イオンだけを含む。例えば、Ｍ_ｎは、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される２つ、３つ、又は４つの異なる金属イオンを含みうる。代替的に、Ｍ_ｎは、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される１を上回る任意の特定の金属イオン、例えば１を上回るＡｇイオンを含みうる。

適切には、ｎ＝３又は４であり、Ｍ_ｎは２つのＡｇイオンを含む。この場合において、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物はまた、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも１つの金属イオンを含む。

適切には、Ｍ_ｎは少なくとも１つのＡｇイオンを含む。適切には、Ｍ_ｎは、少なくとも１つのＡｇイオンと、Ｃｕ、Ｇａ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも１つの金属イオンを含む。適切には、Ｍ_ｎは、少なくとも２つのＡｇイオンと、Ｃｕ、Ｇａ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも１つの金属イオンとを含む。

適切には、Ｍ_ｎは、少なくとも１つのＡｇイオン及び１つのＺｎイオンを含む。適切には、ｎは３であり、Ｍ_ｎは２つのＡｇイオン及び１つのＺｎイオンを含む。適切には、この第１の態様の化合物は、式Ａｇ_２Ｚｎ（ＥＤＴＡ）を有する。

一部の実施態様において、ｎは２であり、Ｍ_ｎは１つのＡｇイオン及び１つのＺｎイオンを含む。適切には、この第１の態様の化合物は、式ＡｇＺｎＮａ（ＥＤＴＡ）を有する。

身体への外部存在物として、バイオフィルムによって、免疫プロセスにおける上方調節がある場合、人体に炎症応答が開始される。Ｚｎイオンは抗炎症特性を有し、従って、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物が１つ又は複数のＺｎイオンを含む場合、Ｚｎイオンは、化合物の任意の抗菌及び／又は抗バイオフィルム効果に加えて、この第１の態様の化合物が適用されうる創傷に有益な抗炎症効果を提供しうる。

適切には、Ｍ_ｎは、少なくとも１つのＡｇイオン及び１つのＣｕイオンを含む。適切には、ｎは３であり、Ｍ_ｎは２つのＡｇイオン及び１つのＣｕイオンを含む。適切には、この第１の態様の化合物は式Ａｇ_２Ｃｕ（ＥＤＴＡ）を有する。

一部の実施態様において、ｎは２であり、Ｍ_ｎは１つのＡｇイオン及び１つのＣｕイオンを含む。適切には、この第１の態様の化合物は式ＡｇＣｕＮａ（ＥＤＴＡ）を有する。

適切には、ｎは２であり、Ｍ_ｎはＣｕイオン及びＺｎイオンを含む。適切には、化合物は式ＣｕＺｎ（ＥＤＴＡ）を有する。

Ｍ_ｎがＣｕイオン及びＺｎイオンを含む場合、Ｚｎイオンと組み合わせたＣｕイオンは、相乗的な抗菌効果を示しうるが、それは、他の方法で可能でありうるよりも、この第１の態様の化合物のより低い、従ってより少ない細胞傷害濃度を使用することを可能にしうる。

この第１の態様の化合物は、実施例において記載する方法に従って合成してもよい。一般的に、この第１の態様の化合物は、商業的に入手可能なＥＤＴＡの四ナトリウム塩（Ｎａ_４（ＥＤＴＡ））を、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも２つの異なる金属イオン（Ｍ）の塩の混合物と反応させることにより合成することができる。そのような塩の例には、硫酸塩及び塩化物が含まれる。

本発明者らは、この第１の態様の化合物が有用な生物学的活性を示しうることを見出した。化合物は、使用中に抗菌活性、抗バイオフィルム活性、及び抗炎症活性の任意の１つ又は複数を示しうる。化合物は、好ましくは、ヒト投与のために安全であり、生体適合性及び非腐食性である。適切には、化合物は、例えば、創傷被覆材又は医療器具中に組み入れられた場合、使用中に抗菌活性及び／又は抗バイオフィルム活性及び／又は抗炎症活性を示す。

この第１の態様の化合物は、バイオフィルムを処理する及び／又はそれに対抗する上で、例えばバイオフィルムの破壊及び／又は分散、ならびに前記バイオフィルム上及びその中に生存する微生物に対する抗菌作用の提供、及び／又はバイオフィルムのＥＰＳ破壊において有用でありうる。この第１の態様の化合物は、創傷被覆材、医療器具において、皮膚あるいは水処理（水分貯蔵及び分配を含む）、食品調製及び加工、又は歯科において重要な他の非生物的又は生物的表面上で使用してもよい。一部の実施態様において、この第１の態様の化合物は、溶液又は懸濁液の形態で、例えば表面、食品調製及び加工装置、及び／又は食品、特に肉加工装置及び肉製品を汚染除去するために使用してもよい。そのような溶液は、***炎浸漬溶液、眼科用溶液として、創傷灌流用に又は歯科において使用してもよい。例えば、この第１の態様の化合物は、歯内灌流溶液中で、及び／又は歯科用水ラインを洗浄／衛生化するために使用してもよい。

一部の実施態様において、この第１の態様の化合物は、医薬として、例えばクリーム、ペースト、又はローション中で使用してもよい。

理論に拘束されるものではないが、第１の態様に従った化合物の使用によって、創傷に適用した場合、例えば化合物を創傷被覆材に組み入れた場合、創傷に関連するバイオフィルム中に存在するＣａ及び／又はＭｇイオンと反応しうる。この反応は、バイオフィルムからＣａ及び／又はＭｇイオンを除去しうるが、それは次にバイオフィルムの完全性を破壊する。Ｃａ及びＭｇイオンは、これらのイオンがバイオフィルムのマトリックスを構成するＥＰＳと一緒に結合するため、バイオフィルムの構造的完全性の維持のために重要であると考えられている。この反応はまた、金属イオン（Ｍ）を化合物から置換し、従って創傷及び／又はバイオフィルム中に放出されて所望の生物学的活性を産生させうる。例えば、化合物の金属イオン（Ｍ）がＡｇ及びＺｎイオンを含む場合、バイオフィルム中に存在するＣａ及び／又はＭｇとの反応によって、Ａｇイオンが創傷及び／又はバイオフィルム中に放出されて、有益な抗菌効果を提供し、ならびに／あるいはＺｎイオンが創傷及び／又はバイオフィルム中に放出されて、有益な抗炎症効果を提供しうる。Ｚｎイオンは、抗炎症効果を提供すると考えられている。この第１の態様の化合物の使用は、従って、同時に微生物感染を防止及び処置すること、ならびに／あるいは創傷炎症を低下させることにより創傷治癒を改善しうる。

本発明の第２の態様によれば、第１の態様に従った式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の１つ又は複数の化合物を含む組成物を提供する。

第２の態様の組成物中の式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、第１の態様に関して本明細書に記載する適切な特徴及び／又は有利な特性のいずれかを有しうる。

この第２の態様の組成物は、任意の適切な形態で、例えば溶液もしくは懸濁液の形態で、又は乾燥形態などで提供してもよい。

適切には、組成物は液体である。

組成物は、水溶液、ローション、クリーム、バーム、ゲル、ペースト、又は固体、適切には粉末状の組成物でありうる。

一部の実施態様において、この第２の態様の組成物は、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の溶液である。そのような溶液において、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、適切な溶媒中に適切に溶解させる。この溶液は、水溶液（例えば水又は生理食塩水など）、又は式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物が可溶性である別の生体適合性溶液を含みうる。この溶液はアルコール、例えばエタノールを含んでもよい。

一実施態様において、組成物は、水とエタノールとの混合物中の式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の溶液である。そのような溶液は非常に有効でありうるが、水中の式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の濃縮原液を作製し、次に所望の濃度のエタノールを導入することにより調製してもよい。

式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の溶液は、好ましくは、滅菌非発熱性形態で提供し、任意の都合のよい様式で包装してもよい。

一部の実施態様において、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の溶液は、医療機器、例えば予め充填されたシリンジ又は別の医療機器などに接続して、あるいはその一部として提供してもよい。式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の溶液は、滅菌無菌条件下で調製してもよく、あるいは種々の適切な滅菌技術のいずれかを使用した調製及び／又は包装に続いて滅菌してもよい。式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の溶液の単回使用バイアル、シリンジ、又は容器を提供してもよい。複数回使用バイアル、シリンジ、又は容器も提供してもよい。

一部の実施態様において、この第２の態様の組成物は、実質的に乾燥した形態で、例えばチュービング、あるいは導管、あるいは医療機器又は工業機器、例えばカテーテルもしくは容器などの表面上の実質的に乾燥したコーティングで提供する。この第２の態様の組成物のそのような実質的に乾燥した形態は、溶剤の添加により再構成して溶液を形成しうる粉末又は凍結乾燥形態で提供してもよい。組成物の実質的に乾燥した形態は、代替的に、コーティングとして提供してもよく、又はゲルもしくは別の型の担体中に組み入れてもよく、又はカプセル化してもよく、もしくは他の方法で包装してもよく、コーティングとして又は容器中で表面上に提供してもよい。この第２の態様の組成物のそのような実質的に乾燥した形態は、溶媒の存在下で、実質的に乾燥した組成物が、上に記載する特性を有する式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の溶液又は懸濁液を形成するように製剤化する。特定の実施態様において、異なるカプセル化又は保存技術を、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の効果的な経時放出が溶液への長期間の曝露時に達成されるように用いてもよい。この実施態様において、この第２の態様の実質的に乾燥した組成物は、長期間にわたる及び／又は溶液への複数回の曝露時に、抗菌活性及び／又は抗バイオフィルム活性及び／又は抗炎症活性を提供しうる。

適切には、組成物は水溶液である。

適切には、組成物のｐＨは１２．５までである。適切には、組成物のｐＨは、４．０～１２．０の範囲内、適切には４．０～１０．０の範囲内、適切には４．５～８．０の範囲内である。適切には、組成物のｐＨは、４．０～７．０の範囲内、適切には４．０～６．０の範囲内、適切には４．０～５．０である。

適切には、組成物は、４．０～１２．０の範囲内、適切には４．０～１１．０の範囲内、適切には４．０～１０．０の範囲内、適切には４．５～８．０のｐＨを有する水溶液である。適切には、組成物のｐＨは、４．０～７．０の範囲内、適切には４．０～６．０の範囲内、適切には４．０～５．０である。

適切には、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、少なくとも０．０１ppm、適切には少なくとも０．１ppm、適切には少なくとも１．０ppm、適切には少なくとも１０ppm、適切には少なくとも１００ppm、適切には少なくとも１，０００ppm、適切には少なくとも５，０００ppmの量で組成物中に存在する。

適切には、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、１００，０００ppmまで、適切には１０，０００ppmまで、適切には５，０００ppmまでの量で組成物中に存在する。

適切には、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、０．０１ppm～１００，０００ppm、適切には０．１ppm～１０，０００ppm、適切には１．０ppm～１０，０００ppm、適切には１０ppm～１００ppm、適切には１００ppm～１０，０００ppm、適切には１，０００ppm～１０，０００ppmの量で組成物中に存在する。

組成物中の式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の存在の結果として、組成物は、ＥＤＴＡ及び少なくとも第１の金属イオンＭ^１及び第２の金属イオンＭ^２を含み、Ｍ^１及びＭ^２は異なり、各々がＡｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される。

適切には、ＥＤＴＡは、少なくとも０．０１ppm、適切には少なくとも０．１ppm、適切には少なくとも１．０ppm、適切には少なくとも１０ppm、適切には少なくとも１００ppm、適切には少なくとも１，０００ppmからの量で組成物中に存在する。

適切には、ＥＤＴＡは、１００，０００ppmまで、適切には１０，０００ppmまで、適切には５，０００ppmまでの量で組成物中に存在する。

適切には、ＥＤＴＡは、０．０１ppm～１００，０００ppm、適切には０．１ppm～１０，０００ppm、適切には１．０ppm～１０，０００ppm、適切には１０ppm～１００ppm、適切には１００ppm～１０，０００ppm、適切には１，０００ppm～１０，０００ppmの量で組成物中に存在する。

適切には、第１の金属イオンＭ^１は、少なくとも０．０１ppm、適切には少なくとも０．１ppm、適切には少なくとも１．０ppm、適切には少なくとも１０ppm、適切には少なくとも１００ppm、適切には少なくとも１，０００ppmからの量で組成物中に存在する。

適切には、第１の金属イオンＭ^１は、１００，０００ppmまで、適切には１０，０００ppmまで、適切には５，０００ppmまでの量で組成物中に存在する。

適切には、第１の金属イオンＭ^１は、０．０１ppm～１００，０００ppm、適切には０．１ppm～１０，０００ppm、適切には１．０ppm～１０，０００ppm、適切には１０ppm～１００ppm、適切には１００ppm～１０，０００ppm、適切には１，０００ppm～１０，０００ppmの量で組成物中に存在する。

適切には、第２の金属イオンＭ^２は、少なくとも０．０１ppm、適切には少なくとも０．１ppm、適切には少なくとも１．０ppm、適切には少なくとも１０ppm、適切には少なくとも１００ppm、適切には少なくとも１，０００ppmからの量で組成物中に存在する。

適切には、第２の金属イオンＭ^２は、１００，０００ppmまで、適切には１０，０００ppmまで、適切には５，０００ppmまでの量で組成物中に存在する。

適切には、第２の金属イオンＭ^２は、０．０１ppm～１００，０００ppm、適切には０．１ppm～１０，０００ppm、適切には１．０ppm～１０，０００ppm、適切には１０ppm～１００ppm、適切には１００ppm～１０，０００ppm、適切には１，０００ppm～１０，０００ppmの量で組成物中に存在する。

第１及び／又は第２ならびに／あるいは任意のさらなる金属イオンの適切な濃度は、存在する特定の金属イオンに依存しうる。例えば、銀金属イオンは、比較的低い濃度で存在してもよく、所与の適用において依然として効果的でありうる。

組成物は、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも２つの異なる金属イオンに加えて、他の金属イオンを含みうる。そのような他の金属イオンは、任意の適切な金属イオン、例えばＮａイオンでありうる。

組成物は、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される２を上回る異なる金属イオンを含みうる。

組成物は、担体及び／又は賦形剤、適切には医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含みうる。適切な担体及び／又は賦形剤は、水、エタノール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、親水コロイド、ポリオキシエチレンブロックコポリマー、カルボキシメチルセルロース、プルロニックＦ－１２７、綿、キトサン、シリコーン、ポリウレタン、アクリル、ヒドロゲル、竹、大豆、油／脂肪、ミセル、エマルジョン、塗料、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、増粘剤、例えばＣａｒｂｏｐｏｌ（商標）など、及びそれらの混合物より選択されうる。

この第２の態様の組成物は、水性ゲルの形態であってもよい。適切には、組成物は、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の１つ又は複数の化合物を含むヒドロゲルである。適切には、そのようなヒドロゲルは、湿潤創傷治癒環境を維持し、前記組成物が、例えば創傷被覆材の一部として創傷に適用された場合、創傷治癒を促進することができる。そのようなヒドロゲルは、創傷に適用されて創傷床と緊密な接触を形成する場合、創傷中に流入し、抗菌効果及び／又は抗炎症効果を創傷全体に提供しうる。適切には、ヒドロゲルは、患者が動く間に非水平である又は非水平になる身体の領域上の創傷から流出しない十分高い粘度を有する。適切には、ヒドロゲルは、適切にはヒドロゲルのｐＨを５．５～１２．０に緩衝する緩衝液を含む。適切な緩衝液は当技術分野において公知である。

この組成物は、非金属イオン抗菌剤を含んでもよい。

適切な非金属イオン抗菌剤は、クロルヘキシジン、クロルヘキサジン塩、トリクロサン、ポリモキシン、テトラサイクリン、アミノグリコシド（例、ゲンタマイシン又はトブラマイシン（商標））、リファンピシン、バシトラシン、エリスロマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、ミコナゾール、キノロン、ペニシリン、ノノキシノール９、フシジン酸、セファロスポリン、ムピロシン、メトロニダゾール、セクロピン、プロテグリン、バクテリオシン（bacteriolcin）、デフェンシン、ニトロフラゾン、マフェニド、アシクロビル、バノクマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、スルホンアミド、ノルフロキサシン、ペフロキサシン、ナリジツ酸（nalidizic acid）、シュウ酸、エノキサシン酸（enoxacin acid）、シプロフロキサシン、ビグアニド、ヨード、ティーツリーオイル、蜂蜜、及びスーパーオキシドの任意の１つ又は複数より選択してもよい。一実施態様において、抗菌剤は、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）及び／又はその誘導体を含む。

非金属イオン抗菌剤は、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物により提供される任意の抗菌効果に付加的及び／又は相乗的である有益な抗菌性を提供しうる。

この組成物は、界面活性剤を含んでもよい。

適切な界面活性剤は、ヘキサメタリン酸ナトリウム又は第４級アンモニウム化合物でありうる。界面活性剤によって、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の作用中及び／又は後にバイオフィルムから物質を除去してバイオフィルムを破壊することにより、組成物の抗バイオフィルム有効性が改善されうる。例えば、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物は、バイオフィルムを破壊するように作用し、そのようにする際に、凝集した細胞を産生しうる。界面活性剤は、これらの細胞を少なくとも部分的に可溶化及び除去し、バイオフィルムに再付着するのを防止し、そのようにする際に、バイオフィルムの分解及び除去を補助するように作用しうる。

この組成物は、適切には式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の任意の抗バイオフィルム特性及び／又は存在する場合には任意の非金属イオン抗菌剤、及び／又は存在する場合には任意の界面活性剤に加えて、抗バイオフィルム剤を含んでもよい。この組成物は、ＤｉｓｐｅｒｉｎＢ、ＤＮａｓｅ１、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、プロテイナーゼＫ、アピラーゼ、シス－２－デセン酸、アルギン酸リアーゼ、ラクトフェリン、ガリウム、セルロース、及び５フルオロウラシルの任意の１つ又は複数より選択される抗バイオフィルム剤を含んでもよい。

一部の実施態様において、この組成物は、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の１つ又は複数の化合物と接触している繊維を含む。

繊維を含むそのような組成物は、組成物を繊維中に含浸させ、及び／又は組成物を繊維上にコーティングすることにより形成してもよい。適切な繊維は、天然繊維、合成繊維、及びそれらの組み合わせから選択してもよい。適切な繊維は、セルロース、アルギン酸塩、綿、キトサン、大豆、竹、カルボキシメチルセルロース、レーヨン、ナイロン、アクリル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリウレタン発泡体、及びそれらの組み合わせの任意の１つ又は複数の繊維より選択してもよい。

繊維を含むそのような組成物は、創傷被覆材中に組み入れてもよく、及び／又は創傷被覆材を形成するために使用してもよい。そのような創傷被覆材は、組成物中に存在する式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の１つ又は複数の化合物が創傷に送達され、第１の態様に関して言及する、有益な効果を産生するという利点を有しうる。例えば、創傷被覆材は、使用中に抗菌活性、抗バイオフィルム活性、及び抗炎症活性のいずれか１つ又は複数を示し、従って、存在する場合、感染に対抗しながら創傷治癒を促進しうる。

本発明の第３の態様によれば、第１の態様に従った化合物又は第２態様に従った組成物を含む創傷被覆材を提供する。

創傷被覆材は、第１及び第２の態様に関して記載する、適切な特徴及び利点のいずれかを有しうる。

適切には、創傷被覆材は、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物で含浸、コーティング、浸漬、積層、及び／又は噴霧された創傷接触層中の式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物を含む。代替的に又は追加的に、創傷被覆材は、創傷接触層に付着した吸収剤層中の式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物を含んでもよい。代替的に又は追加的に、創傷被覆材は、使用中に皮膚に接触する接着剤中の式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物を含んでもよい。

本発明の第４の態様によれば、第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物を含む医療機器を提供する。

医療機器はカテーテルであってもよい。一部の実施態様において、医療機器は挿管チューブであってもよい。医療機器は、医療チューブ、導管、血管内機器、埋め込み医療機器、医療又は獣医器具、コンタクトレンズ、光学インプラント、又は歯科機器、歯列矯正機器、もしくは歯周機器であってもよい。

適切には、第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物は、医療機器の表面の少なくとも一部、適切には使用中の患者の身体の一部と接触することが意図された表面上にコーティングする。そのような表面上に化合物又は組成物をコーティングする方法は、当技術分野において公知である。

適切には、この第４の態様の医療機器は、そのような化合物又は組成物を含まない先行技術の同等の医療機器よりも、バイオフィルム形成のための低下した能力を有する。この第４の態様の医療機器は、従って、医療機器上でのバイオフィルム形成及び病原性微生物の増殖により起こされる感染を低下又は実質的に防止しうる。

本発明の第５の態様によれば、バイオフィルムを衛生化する及び／又は基質からバイオフィルムを実質的に除去するための第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物の使用が提供される。

代替的に及び／又は追加的に、バイオフィルムを衛生化及び／又は基質から実質的に除去する方法を提供し、この方法は、基質を、第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物を用いて処理することを含む。

基質は、バイオフィルム処理及び／又は除去が要求される任意の表面でありうる。基質は、ヒト又は動物の身体上の創傷であってもよく、創傷は、上に記載する型のいずれかである。基質は、医療機器の一部でありうる。一部の実施態様において、基質は、食品調製及び加工装置又は食品、例えば肉加工装置又は肉製品の一部でありうる。

適切には、使用及び／又は方法によって、少なくともバイオフィルムが破壊及び／又は分散される。適切には、使用及び／又は方法によって、第１の態様の化合物及び／又は化合物から放出された任意の金属イオンならびに／あるいは第２の態様に従った組成物中に存在する任意の追加の薬剤（例えば非金属イオン抗菌剤及び／又は抗バイオフィルム剤など）により攻撃されるバイオフィルム及びその中の微生物の感受性が増加される。適切には、使用及び／又は方法によって、基質からバイオフィルムが完全に除去される。適切には、この使用及び／又は方法によって、基質が衛生化される。適切には、使用及び／又は方法によって、バイオフィルムが基質から完全に除去されて、基質を衛生化する。

創傷上で行われる使用及び／又は方法によって、有利には、創傷治癒が促進される、及び／又は感染が処置される、及び／又は炎症が低下されうる。

医療機器上で行われる使用及び／又は方法によって、有利には、医療機器が洗浄される、及び／又は衛生化され、従って、病原性微生物を有するバイオフィルムを含む医療機器により起こされる感染が防止されうる。

食品上で行われる使用及び／又は方法によって、有利には、食品上での病原性微生物の成長が遅くなる、又は好ましくは停止させ、従って、病原微生物で汚染されたそのような食品を摂取することによって生じうる食品の腐敗及び食中毒が防止されうる。

本発明の第６の態様によれば、医薬としての使用のための、第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物を提供する。

適切には、化合物又は組成物は、バイオフィルムを衛生化する及び／又は創傷からバイオフィルムを実質的に除去するための使用のためである。

第６の態様における使用のための化合物又は組成物は、切傷、挫傷、手術部位、裂傷、擦過傷、穿刺、切開、銃創、火傷、膿皮症、アトピー性皮膚炎、湿疹、圧迫潰瘍、静脈及び動脈脚潰瘍、糖尿病性足部潰瘍、嚢胞性線維症（ＣＦ）関連感染症、乳腺炎、耳炎、市中感染症もしくは院内感染症、又は食物媒介性疾患の感染症を処置するために使用されうる。

本発明の第７の態様によれば、第１の態様の化合物を産生する方法であって、金属－ＥＤＴＡ化合物を、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される第１の金属イオンの塩及びＡｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される第２の金属イオンの塩と反応させることを含み；第１及び第２の金属イオンが異なる方法を提供する。

適切には、本方法は、金属－ＥＤＴＡ錯体を第１の金属イオンの塩及び第２の金属イオンの塩と同時に反応させることを含む。

別の実施態様において、この第７の態様の方法は、
ａ）金属－ＥＤＴＡ錯体を、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される第１の金属イオンの塩と反応させる工程；及び
ｂ）工程ａ）において形成された、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される１つの金属イオンを含むＥＤＴＡ錯体を、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される第２の金属イオンの塩と反応させる工程；
を含み、ここで、第１及び第２の金属イオンは異なる。

適切には、方法の工程は、工程ａ）、それに続く工程ｂ）の順番で行う。

本発明の第７の態様によれば、第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物及び医療機器又は創傷被覆材を含むキットを提供する。

適切には、キットは、予め充填されたシリンジ又は別の医療機器中に適切に含まれる、式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物の溶液又は懸濁液を含む。

適切には、医療機器はカテーテル又は挿管チューブである。

本発明の第８の態様によれば、医療機器の少なくとも一部をコーティングするための第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物の使用を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、創傷被覆材における第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物の使用を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、水処理の方法における第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物の使用を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、食品調製又は食品加工の方法における第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物の使用を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、歯科手順における第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物の使用を提供する。

本発明の第９の態様によれば、創傷処置又は医療機器において抗バイオフィルム活性及び／又は抗菌活性及び／又は抗炎症活性を提供するための、第１の態様に従った化合物又は第２の態様に従った組成物の使用を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書に実質的に記載する化合物、組成物、創傷被覆材、医療機器もしくは使用、及び／又は、添付の図面を参照して本明細書に実質的に記載する化合物、組成物、創傷被覆材、医療機器もしくは使用、及び／又は、添付の図面において実質的に示す化合物、組成物、創傷被覆材、医療機器もしくは使用を提供する。

実施例

比較例１－四銀－ＥＤＴＡの形成及び溶出。

標準曲線

原理：Ｆｅ^３＋はチオシアン酸塩と反応して赤色錯体を産生する。Ｎａ_４（ＥＤＴＡ）（四ナトリウムＥＤＴＡ）はＦｅ^３＋と反応し、その結果、赤色はＮａ_４ＥＤＴＡのレベルが増加するにつれて減少する。

装置：ＵＶ分光光度計

試薬：
Ｎａ_４（ＥＤＴＡ）標準、
塩酸（ＨＣｌ）ＡＣＳ試薬、
チオシアン酸塩溶液－１００mlの水中のチオシアン酸アンモニウム、
Ｆｅ^３＋溶液－少量のＨＣｌ中にアンモニウム硫酸鉄（ＩＩＩ）１２水和物を溶解し、酢酸ナトリウム緩衝液を加えて、次に水に加えることにより形成する。

図１は、四ナトリウムＥＤＴＡについての標準相関曲線を示す。結果は、０～１１．９mMの濃度の溶液中でのＯＤ（光学密度）値と四ナトリウムＥＤＴＡの量の間での直線的な相関があることを示しており、この方法を、固体として又は溶液中で四ナトリウムＥＤＴＡを定量的に測定するために使用できることを意味する。

四銀ＥＴＤＡの発生及び溶出測定。

方法
１．１gのＰＵを１０mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に６０℃で一晩溶解させることによりポリウレタン（ＰＵ）溶液を調製する。
２．四銀ＥＤＴＡ錯体を調製し、異なる濃度（１００mg/ml、５０mg/ml、１０mg/ml、１mg/ml、及び０mg/ml）でＰＵ溶液中に懸濁する。
３．ガラスカバースリップ及びプラスチックディスク上に四銀ＥＤＴＡをコーティングしてフィルムを作製する。
４．コーティングしたカバースリップ及びプラスチックディスクを次に、２mlの脱イオン水中に１週間にわたり浸漬する。
５．四銀ＥＤＴＡの溶出を、標準曲線方法に従って測定する。

結果

ガラスカバースリップ上のＰＵフィルムを、異なる濃度の四銀ＥＤＴＡ錯体と相関するＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、及びＧ５と命名した。溶出結果を以下の表２に示す。

結果は、脱イオン水に１週間浸漬した後、約３０%～３６%の四銀ＥＤＴＡがフィルムから溶出したことを示した。

比較例２－Ａｇ_４（ＥＤＴＡ）
合成：４Ａｇ^＋（ａｑ） ＋ ＥＤＴＡ^４－（ａｑ） → Ａｇ_４（ＥＤＴＡ） （ｓ）

硝酸銀を、激しい撹拌の下で４：１のモル比でＥＤＴＡの四ナトリウム塩と反応させた。結果として得られた固体を濾過し、冷たい脱イオン水を用いて３回洗浄し、５０%エタノール、７０%エタノール、及び１００%エタノールを用いて各々１回洗浄し、次に、直接光への曝露を避けるために、暗いフラスコ中で５０℃の真空オーブン中で乾燥させた。Ａｇ_４（ＥＤＴＡ）の白色粉末を、以下の収率で産生した。

ＥＤＴＡ、Ｎａ_４（ＥＤＴＡ）、及びＡｇ_４（ＥＤＴＡ）のＦＴＩＲを図２Ａ～Ｃに示す。ＣＯＯＨ中のカルボニルの伸縮振動に起因する図２Ａ（ＥＤＴＡ）における１７４０cm^-1を中心とする吸収帯は、図２Ｂ及び２Ｃ（それぞれＮａ_４ＥＤＴＡ及びＡｇ_４ＥＤＴＡ）のスペクトル中には存在しない。純粋なＮａ_４ＥＤＴＡ（図２Ｂ）のスペクトルは、４つのイオン性カルボキシレート基（Ｖｓ _ＣＯＯ ^－）におけるカルボニルの非対称性伸縮振動に起因する約１５８０cm^-1を中心とする吸収帯により特徴付けられる。対応する対称性伸縮振動は１４６５cm^-1（Ｖｓ _ＣＯＯ ^－）の近くで生じる。Ａｇ_４ＥＤＴＡ（図２Ｃ）におけるカルボニルの非対称性伸縮振動吸着バンドは、Ｎａ_４ＥＤＴＡ中のそれぞれのピークよりもずっと強く、バンド中心は約１５５０cm^-1に移動する。対応する対称性伸縮振動バンドは１４６５cm^-1を中心とし、１５５０cm^-1よりも弱い吸収帯である。結果は、Ａｇ_４ＥＤＴＡ錯体が形成されることを示した。

Ａｇ_４（ＥＤＴＡ）懸濁コーティングプロセス

Ａｇ_４（ＥＤＴＡ）粉末を脱イオン水中に１mg/mlで懸濁させた。１００μlの懸濁液を第１のガラスカバースリップ上に滴下した。５０μlの懸濁液を５０μlの１．７%ＮａＣｌ溶液に加え、第２のガラスカバースリップ上に滴下した。５０μlの懸濁液を５０μlのＰＵ溶液と混合し、次に第３のガラスカバースリップ上に滴下した。全てのカバースリップを、直接光への曝露を避けるために、暗いフラスコ中で５０℃の真空オーブン中で乾燥させた。結果は、Ａｇ_４（ＥＤＴＡ）がガラス上に又はポリマーのフィルム（確かに少なくともポリウレタン）としてコーティングできることを示した。

置換実験

生理食塩水をＡｇ_４（ＥＤＴＡ）の懸濁液に加えて、懸濁液は速やかに固体（ＡｇＣｌ）を沈殿させた。沈殿物を濾別し、脱イオン水で４回洗浄し、次に、直接光への曝露を避けるために、暗いフラスコ中で５０℃の真空オーブン中で乾燥させた。

実施例－銀及び銅ＥＤＴＡ錯体の合成 － 化合物１及び２

これらの化合物を、最初に３８gのエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩水和物（四ナトリウムＥＤＴＡ）を１０００mlのＨ_２Ｏ中に溶解して、溶液１を提供することにより調製した。次に、６８gの硝酸銀（ＡｇＮＯ_３）を１０００mlのＨ_２Ｏ中に溶解し、溶液２を提供した。２５gの硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ）を１０００mlのＨ_２Ｏ中に溶解し、溶液３を提供した。

化合物１の調製－ＡｇＣｕＮａＥＤＴＡ

４０mlの溶液１を２０mlの溶液２と、激しく撹拌しながら１０分間にわたり混合した。混合物を次に濾過して固体を得た。この固体を、水を用いて２回洗浄した。約６０mlの溶液３を固体に加えて、この混合物を、固体が完全に溶解するまで激しく撹拌した。結果として得られた溶液を、０．４５μmシリンジフィルターを用いて濾過し、産物である化合物１－ＡｇＣｕＮａＥＤＴＡを提供した。

化合物２の調製－Ａｇ_２ＣｕＥＤＴＡ

３０mlの溶液１を３０mlの溶液２と、激しく撹拌しながら１０分間にわたり混合した。この混合物を次に濾過して固体を得た。約８０mlの溶液３を固体に加えて、この混合物を、固体が完全に溶解するまで激しく撹拌した。結果として得られた溶液を、０．４５μmシリンジフィルターを用いて濾過し、産物である化合物２－Ａｇ_２ＣｕＥＤＴＡを提供した。図３は、Ａｇ_２Ｃｕ（ＥＤＴＡ）の暗青色粉末のＡＴＲ－ＦＴＩＲスペクトルを示す。

実施例－銀及び亜鉛ＥＤＴＡ錯体の合成－化合物３及び４

これらの化合物を、最初に３８gのエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩水和物（四ナトリウムＥＤＴＡ）を１０００mlのＨ_２Ｏ中に溶解して、溶液１を提供することにより調製した。次に、６８gの硝酸銀（ＡｇＮＯ_３）を１０００mlのＨ_２Ｏ中に溶解し、溶液２を提供した。１８．６gの硫酸亜鉛一水和物（ＺｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ）を１０００mlのＨ_２Ｏ中に溶解し、溶液４を提供した。

化合物３の調製－ＡｇＺｎＮａＥＤＴＡ

４０mlの溶液１を２０mlの溶液２と、激しく撹拌しながら１０分間にわたり混合した。混合物を次に濾過して固体を得た。この固体を、水を用いて４回洗浄した。約１００mlの溶液４を固体に加えて、この混合物を、固体が完全に溶解するまで激しく撹拌した。結果として得られた溶液を、０．４５μmシリンジフィルターを用いて濾過し、産物である化合物３－ＡｇＺｎＮａＥＤＴＡを提供した。

化合物４の調製－Ａｇ_２ＺｎＥＤＴＡ

３０mlの溶液１を３０mlの溶液２と、激しく撹拌しながら１０分間にわたり混合した。この混合物を次に濾過して固体を得た。約１２０mlの溶液４を固体に加えて、この混合物を、固体が完全に溶解するまで激しく撹拌した。結果として得られた溶液を、０．４５μmシリンジフィルターを用いて濾過し、産物である化合物４－Ａｇ_２Ｚｎ４ＥＤＴＡを提供した。

全ての化合物１～４を、予防措置として暗所において室温で保存した。

以下の実験を、上に記載するように調製した以下のＥＤＴＡ化合物／錯体を用いて行った：
化合物１ － ＡｇＣｕＮａＥＤＴＡ
化合物２ － Ａｇ_２ＣｕＥＤＴＡ
化合物３ － ＡｇＺｎＮａＥＤＴＡ
化合物４ － Ａｇ_２ＺｎＥＤＴＡ

ＥＤＴＡ錯体の置換プロファイル

上に記載する置換実験を、化合物１～４について繰り返し、生理食塩水によるＥＤＴＡ錯体からの銀、銅、亜鉛の置換のパーセントを提供した。結果を以下の表３に示す。

置換実験の結果によって、銀、銅、及び亜鉛形態の化合物１～４が、生理食塩水（ナトリウムイオン）により置換されうることが実証された。この結果（表３）は、約８０%の銀、４０～５０%の銅及び亜鉛が生理食塩水中のナトリウムにより置換されたことを示した。

コラーゲン中へのＥＤＴＡ錯体の取り込み

ＥＤＴＡ化合物１～４をコラーゲンフィルムに加え、次に、これらの錯体の溶出を調べた。コラーゲンフィルムを、酸化ウシアテロコラーゲンＩ型、グリセロール、及びＥＤＴＡ化合物１～４の溶液から調製した。１．８mlの１０%グリセロール溶液を２０mlの酸化ウシアテロコラーゲンＩ型溶液中に加えた。５mlのＥＤＴＡ錯体を、激しく撹拌しながら溶液中に加えて、この混合物を５%ＮａＯＨの滴下によりｐＨ＝７．０に調整した。最終溶液を超純水により３０mlに調整し、ＰＶＣ鋳型に流し込んだ。この溶液を一晩ドラフトチャンバー中で乾燥させた。全てのコラーゲンフィルムに、ＥＤＴＡ錯体を含浸させて、水、生理食塩水、又は疑似創傷液中に浸漬した。

水及び生理食塩水中のコラーゲンフィルムの溶出結果を表４に示す。銀について、最も高い溶出率は１日目であった（水中で１９．０８±０．９２ppm、生理食塩水中で２０．３４±１．４２ppm）。次に溶出率は減少したが、溶出率は依然として水中では１０ppm、生理食塩水中では１３ppmより高かった。生理食塩水中では水中より溶出した銀が多かった。合計では、５４．０３%及び６６．２２%の銀がそれぞれ水中及び生理食塩水中で５日間にわたってコラーゲンフィルムから溶出した。亜鉛については、水中での最も高い溶出率は１日目であった（９．８６±０．３９ppm）。次に溶出率はわずかに減少したが、５日目には６．５ppmを超えたままであった。しかし、生理食塩水中での溶出率は、１日目から５日目まで約６ppmで一定のままあった。全体として、３７．８９%及び２７．３６%の亜鉛がそれぞれ水中及び生理食塩水中で５日間にわたりコラーゲンフィルムから溶出した。ＥＤＴＡについては、結果は、大半のＥＤＴＡが水中及び生理食塩水中の両方で１日目に溶出したことを示す。１日後、少量のＥＤＴＡだけが溶出した。合計で、１６．９５%及び１３．４４%のＥＤＴＡがそれぞれ水中及び生理食塩水中で５日間にわたってコラーゲンフィルムから溶出した。

ガーゼプラットフォーム及びＥＤＴＡ化合物４の溶出

ガーゼの断片を水、２%ＥＤＴＡ、４%ＥＤＴＡ、及び高濃度（試料１）又は低濃度（試料２）のＥＤＴＡ化合物４のいずれかに１時間にわたり浸漬させた。次にガーゼを取り出し、６０mmポリスチレン培養プレート中に入れ、ドラフトチャンバー中で２４時間にわたり乾燥させた。ガーゼを、浸漬前、浸漬後、及び２４時間にわたる乾燥後に秤量した。

ガーゼからのＥＤＴＡ錯体の溶出プロファイルを評価するために、充填したガーゼを水及び生理食塩水中に浸漬した（表６及び表７）。結果は、銀、亜鉛、及びＥＤＴＡが、水及び生理食塩水の両方において１日目及び２日目に迅速に溶出したことを示した。２日後、銀、亜鉛、及びＥＤＴＡの溶出は、１日目と比較して５倍超減少した。

ヒドロゲル中へのＥＤＴＡ錯体の取り込み。

ヒドロゲルにＥＤＴＡ化合物を充填し、銀、亜鉛、及びＥＤＴＡの溶出について調べた。Ｃａｒｂｏｐｏｌ ＥＴＤ ２０２０をLubrizol Advanced Materials, Inc. USAから入手した。１．２gのカルボポール粉末を４２．３６gの脱イオン水中に１時間にわたり溶解して完全に水和させた。次に、８．４mlのＥＤＴＡ錯体及び４．８gのグリセリンを、激しく撹拌しながらカルボポール溶液中に加えた。最後に、３gの５０%トリエタノールアミンを懸濁液中に滴下して最終産物：ＥＤＴＡ錯体を伴うカルボポールヒドロゲルを得た。

ヒドロゲルから水及び生理食塩水中へのＥＤＴＡ錯体の累積溶出プロファイルを表８及び表９に示す。結果は、銀、亜鉛、及びＥＤＴＡが１日目に迅速に溶出し、１日後に水中での明確な累積溶出がなかったことを示す。銀、亜鉛、及びＥＤＴＡは、日々、生理食塩水中で増加し、銀、亜鉛、及びＥＤＴＡの放出がヒドロゲルから制御できることを示した。

銀含量

１gのヒドロゲルを１０mlの３７%硝酸に入れて溶解させた。濾過後、溶液を０．５mlの正確な容量に希釈した。希釈溶液を０．５%の１%ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び０．５mlの１M硫酸と混合し、０．５mlの１×１０^－３Mジチゾン溶液の添加が続いた。吸光度を、対応する試薬ブランクに対して４９０nmで測定した。未知試料中の銀含量を、同時に調製した較正グラフを使用して決定した。銀の濃度を次に、一連の較正標準に対して、改変分光光度法により測定した。濃度を次に、使用した被覆材の重量に基づき重量%に変換する。

分光光度法により測定したヒドロゲル上の銀含量実験の結果を表１０に示す。結果は、低レベルの銀ハイドロゲルは０．０９５%の銀だけを有したことを示し、ＥＤＴＡ化合物４、試料１ヒドロゲル（高レベルのＥＤＴＡ－Ａｇ－Ｚｎ）中に０．１０１%の銀（ｗ／ｗ）及び他のＥＤＴＡ化合物４、試料１ヒドロゲル（低レベルのＥＤＴＡ－Ａｇ－Ｚｎ）中に０．０４６%の銀（ｗ／ｗ）があった。

水の供与／吸収。

表１１は、全てのヒドロゲルが１ｂ型又は１ｃ型に属することを示す。それは、全てのヒドロゲルが供与型であることを意味する。四ナトリウムＥＤＴＡだけのヒドロゲルは、１ｃヒドロゲル群（大半の液体を供与する）中にあることが見出された。他のゲルは１ｂゲルとして特徴付けられ、ヒドロゲルからゼラチンに５～１０%の水を供与した。

ＥＤＴＡ錯体の微生物学的分析。

四ナトリウムＥＤＴＡの微生物学的評価。

四ナトリウムＥＤＴＡの初期試験は、ＥＤＴＡ四ナトリウムが、短期収縮時間での未成熟及び成熟の黄色ブドウ球菌及び緑膿菌バイオフィルムに対する処理として効果的ではなかったことを示した（表１２、表１３、及び表１４）。繊維状被覆材フレームワーク中への四ナトリウムＥＤＴＡの取り込みは、しかし、２４時間の処理後に黄色ブドウ球菌及び緑膿菌バイオフィルムにおいてそれぞれ３Ｌｏｇの低下をもたらした（表１５及び表１５）。

最小阻害濃度（ＭＩＣ）、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）、及び最小バイオフィルム除菌（ＭＢＥＣ）を決定した。値は、ストック抗菌剤溶液（８%）のパーセンテージを表す。「×」は、試験した抗菌剤（純粋な形状の抗菌剤を含む）の全ての濃度が無効であったことを示す。

平均Ｌｏｇ値を算出し、平均ＬＲの標準誤差（ＳＥ）を決定した（ＬＲ±ＳＥ）。未処理対照の平均Ｌｏｇ_１０密度を算出した（±標準偏差）。

平均Ｌｏｇ値を算出し、平均ＬＲの標準誤差（ＳＥ）を決定した（ＬＲ±ＳＥ）。未処理対照の平均Ｌｏｇ_１０密度を算出した（±標準偏差）。

被覆材の抗菌有効性の結果を、殺菌性（Ｌｏｇ_１０低下≧３）又は静菌性（Ｌｏｇ_１０低下≦３）として表した。ＳＤは標準偏差を表す。実験を３通りの被覆材で実施した。

被覆材の抗菌有効性の結果を、殺菌性（Ｌｏｇ_１０低下≧３）又は静菌性（Ｌｏｇ_１０低下≦３）として表した。ＳＤは標準偏差を表す。実験を３通りの被覆材で実施した。

ＥＤＴＡ錯体（ＥＤＴＡ－Ａｇ－Ｚｎ及びＥＤＴＡ－Ａｇ－Ｃｕ）の微生物学的評価。

異なるＥＤＴＡ錯体は、黄色ブドウ球菌及び緑膿菌のバイオフィルムにおいて完全な殺傷を達成した（表１７）。

ＥＤＴＡ化合物１～４（上に記載するように調製した）を緑膿菌及び黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対して１００ppmの銀濃度で試験し、それに対して、Ａｇ／Ｃｕ／ＮａＥＤＴＡ及びＡｇ／Ｚｎ／ＮａＥＤＴＡ化合物は黄色ブドウ球菌における１００%殺傷及び緑膿菌における３．５ｌｏｇ低下を示した（表１８）。

微生物培養物を化合物に２４時間にわたり曝露した。化合物を１００ppmの銀に従って希釈した。バイオフィルムを、ＣＤＣバイオリアクターを使用して形成した。試料を三通りに実施した。平均Ｌｏｇ値を算出し、平均ＬＲの標準誤差（ＳＥ）を決定した（ＬＲ±ＳＥ）。ゼロのｌｏｇが数学的に定義されていないと仮定すると、コロニーが抗菌処理後に検出されなかった場合、「未定」についての「Ｎ．Ｄ」を使用する。

液体としてのＥＤＴＡ－Ａｇ－Ｚｎ化合物の抗バイオフィルム有効性を、ＭＢＥＣモデルを使用して評価した。種々の濃度の錯体（１０００ppm～６２．５ppm）を用いた処理後での緑膿菌バイオフィルムの１００%殺傷（生存コロニーが検出されない）が観察された（表１９）。

バイオフィルムを、ＭＢＥＣプレート法を使用して形成した。Ｌｏｇ低下（ＬＲ）値を、標準誤差を用いて表す。コロニーが計数時に検出されなかった場合、Ｎ．Ｄ（未定）を記載する。

抗バイオフィルム能力（ＭＢＥＣ）。

ＭＢＥＣモデル（ＡＳＴＭ Ｅ２７９９）を使用し、液体処方物の抗バイオフィルム効果を評価した。バイオフィルムを、ＭＢＥＣモデルでポリスチレンペグ上に、処理前２４時間又は４８時間のいずれかにわたり増殖させた。液体形態のＥＤＴＡ錯体を使用し、２４時間及び４８時間のバイオフィルムを試験した（表２０）。結果は、錯体及び銀溶液（５０ppm及び１００ppm）が、２４時間及び４８時間のバイオフィルムの１００%殺傷を起こしたことを示す。同様に、４%ＥＤＴＡ四ナトリウムによって、黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ、表皮ブドウ球菌、及びＥ．フェカリスのバイオフィルム上で２４時間及び４８時間内に１００%殺傷が起こった。しかし、緑膿菌の２４時間及び４８時間のバイオフィルムについては、それぞれ５．９４±３．４３及び６．９９±４．０４ｌｏｇ低下があった。２４時間のバイオフィルムと比較した場合の４８時間のバイオフィルムのｌｏｇ低下の増加によって、抗バイオフィルム剤としてのＥＤＴＡ錯体の有効性が強調される。

２４時間及び４８時間のバイオフィルムを、ＭＢＥＣプレート法を使用して形成し、２４時間にわたり処理した。技術的反復ｎ＝３。Ｌｏｇ低下（ＬＲ）値は、ＬＲ値の±標準誤差（ＳＥ）を示す。未処理対照（２４時間及び４８時間バイオフィルム）のＬｏｇ密度±標準偏差は、緑膿菌ＮＣＴＣ １０６６２（７．４４±０．０６及び８．４４±０．０３４）、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２９２１３（６．４５±０．０５及び６．５０±０．３８）、黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ ＢＡＡ－４３（５．４０±０．４１及び６．４３±０．２５）、Ｅ．フェカリスＡＴＣＣ ２９２１２（６．３５±０．０４及び６．４０±０．０９）、及び表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ ３５９８４（６．０９±０．３６及び６．４１±０．６２）である。

錯体を用いたガーゼの含浸。

ＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎ化合物４を含浸させたガーゼは、２４時間後に完全なバイオフィルム殺傷を示し（表２１を参照のこと）、それは最大量の銀及びＥＤＴＡが２４時間で溶出した溶出データと相関し、さらに、ＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎ化合物４を含むガーゼは、２%及び４%で四ナトリウムＥＤＴＡよりも効果的であった。２%ＥＤＴＡより４%ＥＤＴＡを含むガーゼを用いて処理した場合、バイオフィルムのｌｏｇ低下がより大きかった。この化合物を含むコラーゲンフィルムは、ガーゼよりも効果が低かった。

バイオフィルム（４８時間）を種々のプラットフォームに２４時間にわたり曝露した。プラットフォームを含浸させるために使用した化合物は、ＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎ（化合物４）であった。試料を３通りに繰り返した。平均Ｌｏｇ値を算出し、平均ＬＲの標準誤差（ＳＥ）を決定した（ＬＲ±ＳＥ）。コロニーが処理後に検出されなかった場合、「未定」についての「Ｎ．Ｄ」を使用し、これは１００%殺傷を表す。表２１は、本発明の錯体が薬剤間の潜在的な相乗作用を実証し、四ナトリウムＥＤＴＡよりも優れているとの証拠を提供する。

ヒドロゲルへの錯体の添加。

ＣＤＣバイオフィルムバイオリアクターモデル（ＡＳＴＭ Ｅ２８７１）を使用し、ヒドロゲル製剤の抗バイオフィルム有効性を試験した。バイオフィルムをバイオリアクター中のポリカーボネートクーポン上で４８時間（４８時間バイオフィルム）増殖させた。錯体を含むヒドロゲルの製剤は、２４時間の処理後にＣＤＣモデルにおいて完全なバイオフィルム殺傷を示した（表２２を参照のこと）。化合物４を含むヒドロゲルは、銀だけを含むヒドロゲルより優れていた。

バイオフィルム（４８時間）をヒドロゲルに２４時間にわたり曝露した。プラットフォームを含浸させるために使用した化合物は、ＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎ（化合物４）であった。試料を３通りに繰り返した。平均Ｌｏｇ値を算出し、平均ＬＲの標準誤差（ＳＥ）を決定した（ＬＲ±ＳＥ）。コロニーが処置後に検出されなかった場合、「未定」についての「Ｎ．Ｄ」を使用し、これは１００%殺傷を表す。表２２は、ＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎの錯体が、抗バイオフィルム活性において銀ヒドロゲル単独より優れているとの証拠を実証する。

ヒドロゲルＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎ化合物４の抗バイオフィルム有効性を試験するために、本発明者らは、ＣＤＣバイオフィルムバイオリアクターを使用してバイオフィルム形態の５つの微生物に対してヒドロゲルを試験した。ヒドロゲル対照は、微生物数のわずかなｌｏｇ低下を示した。銀を含むヒドロゲルは、黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ、表皮ブドウ球菌、及びＥ．フェカリスにおいて１００%殺傷をもたらした。しかし、銀ヒドロゲルだけが、緑膿菌において３．１６±１．８３のｌｏｇ低下を起こした（表２３）。亜鉛を含むヒドロゲルは、１００%殺傷が記録された表皮ブドウ球菌を除く全ての微生物においてそれぞれ１．２４～１．８４の間のｌｏｇ低下を生じた。同様に、四ナトリウムＥＤＴＡを含むヒドロゲルは、大半の微生物においてわずかなｌｏｇ低下を起こしたが、しかし、表皮ブドウ球菌において１００%殺傷を起こした。低濃度の化合物４（ＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎ）を含むヒドロゲル製剤は、大半の微生物において有意な低下を有さなかったが、表皮ブドウ球菌において１００%殺傷を起こした。ヒドロゲル中に取り込まれた高濃度の化合物４は、試験した全ての微生物バイオフィルムにおいて１００%殺傷を起こした。

表２３は、化合物４（ＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎ）が、抗バイオフィルム活性において、銀ハイドロゲル単独、亜鉛ハイドロゲル単独、及び四ナトリウムＥＤＴＡ単独よりも優れていることを実証する。

細胞データ。

直接的細胞傷害性を、細胞によるＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄの取り込みは細胞生存率に比例するＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ Ｕｐｔａｋｅアッセイを使用して試験した（Borenfreund, E. & Puerner, J. A. 1985, A simple quantitative procedure using monolayer cultures for cytotoxicity assays (HTD/NR-90), Methods in Cell Science, 9, 7-9）。国際標準ＩＳＯ １０９９３－５（Wallin, R. F. & Arscott, E. 1998, A practical guide to ISO 10993-5: Cytotoxicity. Medical Device and Diagnostic Industry, 20, 96-98）によれば、生存パーセンテージが未処理対照の７０%より低い場合、その物質は細胞傷害性と考えられる。結果は、増加濃度の四ナトリウムＥＤＴＡが、細胞に細胞傷害性であり、生存率パーセンテージが３．８７%～１４．２３%の間であったことを示した。化合物１及び３の全ての濃度が細胞傷害性として分類され、生存率はそれぞれ５２．５７%～５３．６６%及び４６．４６%～６３．０８%の範囲であった。全ての濃度の化合物２は、非細胞傷害性であると解釈され、生存率パーセンテージは７２．０１%～７２．２１%の範囲であった。５０ppmの化合物４も非細胞傷害性であり、７２．９３%の生存率であるが、しかし、他の濃度は細胞傷害性であった（表２４）。間接的細胞傷害性についての寒天拡散方法によって、細胞傷害性の定性的評価が可能になる。ＩＳＯ １０９９３－５によれば、２より大きい数値グレードの達成は、細胞傷害性効果と考えられる。

表２４は、本発明の化合物が四ナトリウムＥＤＴＡ単独と比較して毒性が有意に低かったことを実証する。

全ての濃度でのＥＤＴＡについてのゾーン指数の評価によって、細胞傷害性が示され、Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ取り込みのないゾーンがフィルターディスクを超えて０．５cm～１cm伸長した。この知見にもかかわらず、溶解指数の解釈は、２%、４%、及び８%のＥＤＴＡは細胞に対して細胞傷害性でなかったのに対し、１０%及び１５%の濃度は細胞傷害性であったことを示した。１００ppm及び５０ppmの化合物１はゾーン指数に従って細胞に対して細胞傷害性であると解釈されるのに対し、ニュートラルレッド取り込みを示さない細胞のゾーンは、フィルターディスク標本を超えて０．５cm～１cm伸長した。しかし、これらの濃度は、溶解指数を解釈する際に細胞傷害性とは見なさなかった。２５ppmの化合物１は細胞に対して細胞傷害性ではなかった。１００ppmの化合物３は、ゾーン指数（溶解指数ではない）に従って細胞傷害性をもたらした。全ての濃度の化合物２及び４は、細胞に対して細胞傷害性ではなかった（表２５）。

表２５は、錯体が四ナトリウムＥＤＴＡ単独と比較して毒性が有意に低かったことを実証する。

創傷バイオフィルムモデルにおけるＥＤＴＡ－Ａｇ_２Ｚｎ化合物（化合物４）の有効性。６日目に、未処理の黄色ブドウ球菌の創傷バイオフィルムが組織の５０%を上回り存在した。１００ppmのＡｇ－Ｚｎ_２－ＥＤＴＡ（化合物４）を用いた処理後、組織内に低下量の微生物があるように見えたが、しかし、同定可能な表皮はなく、真皮層中の線維芽細胞の核はかすかであった。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用し、以前に公開された方法（Foster, A. M., Baliwag, J., Chen, C. S., Guzman, A. M., Stoll, S. W., Gudjonsson, J. E., Ward, N. L. & Johnston, A. 2014, IL-36 promotes myeloid cell infiltration, activation, and inflammatory activity in skin, The Journal of Immunology, 192, 6053-6061）に従い、炎症性サイトカインインターロイキン－６（ＩＬ－６）の分泌レベルを評価した。同じ実験における分泌ＩＬ－６のＥＬＩＳＡ検出は、黄色ブドウ球菌の創傷バイオフィルム対照においてＩＬ－６の低下を示した（図４）。Ａｇ－Ｚｎ_２－ＥＤＴＡ（化合物４）を用いた創傷バイオフィルムの処理によって、組織学的検査時に微生物の存在が低下することが示された。ＩＬ－６レベルは、黄色ブドウ球菌の創傷バイオフィルム対照と比較した場合、さらに低下した。

図４は、液体Ａｇ－Ｚｎ_２－ＥＤＴＡ（化合物４）を用いた処理後の、創傷バイオフィルム含有ＬａｂｓｋｉｎからのＩＬ－６サイトカイン分泌を示す。ＥＬＩＳＡを使用し、条件付けられた細胞培養培地中のＩＬ－６のレベルを評価した。培養培地をＩＬ－６の低下が説明される４日目に交換し、これによって、バイオフィルムを、５０ppm又は１００ppmのいずれかのＥＤＴＡ化合物４を用いて処理した。試験を２通りに実施した。エラーバーは標準偏差を示す。

図４は、１００ppmのＡｇ－Ｚｎ_２－ＥＤＴＡ（化合物４）によって、炎症マーカーの有意な低下が起こったことを実証する。

要約すると、本発明は、バイオフィルムに対抗する及び／又は創傷を処置するための金属－ＥＤＴＡ化合物／錯体を提供する。この化合物／錯体は、ＥＤＴＡ及び２～４つの金属イオンを含む。これら２～４の金属イオンのうち、少なくとも２つは、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される異なる金属イオンである。金属－ＥＤＴＡ化合物／錯体は、使用中に抗菌活性、抗バイオフィルム活性、及び抗炎症活性のいずれか１つ又は複数を示しうるが、抗菌剤による攻撃に対するバイオフィルム及び前記バイオフィルム内の微生物の感受性を増加させ、バイオフィルムを除去及び衛生化するために役立ちうる。金属－ＥＤＴＡ錯体を含む組成物、創傷被覆材、及び医療機器も提供する。医薬としての、ならびに／あるいはバイオフィルムを衛生化する及び／又は基質からバイオフィルムを実質的に除去するための金属－ＥＤＴＡ化合物／錯体の使用も開示する。

いくつかの好ましい実施態様を示し、記載してきたが、種々の変更及び改変を、添付の特許請求の範囲において定義する本発明の範囲から逸脱することなくなされうることが、当業者には理解されるであろう。

本願と関連して、本明細書と同時に、又はそれ以前に出願され、本明細書を用いて一般に閲覧可能な全ての論文及び文書に注目が、向けられ、全てのそのような論文及び文書の内容が参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書（任意の添付の特許請求の範囲及び図面を含む）おいて開示する全ての特徴、ならびに／あるいはそのように開示した任意の方法又はプロセスの工程の全てを、そのような特徴及び／又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせにおいて組み合わせてもよい。

本明細書（任意の添付の特許請求の範囲及び図面を含む）に開示する各々に特徴は、他に明示的に記載しない限り、同じ、等価、又は類似の目的に役立つ代替の特徴により置換してもよい。このように、他に明示的に記載しない限り、開示する各々の特徴は、一般的な一連の等価又は類似の特徴の一例に過ぎない。

本発明は、前述の実施態様の詳細に制限されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲及び図面を含む）に開示する特徴の任意の新規のもの、又は任意の新規の組み合せ、あるいはそのように開示する任意の方法もしくはプロセスの工程の任意の新規のもの、又は任意の新規の組み合わせに及ぶ。

図１は、四ナトリウムＥＤＴＡについての標準相関曲線を示す。 図２Ａは、ＥＤＴＡのＦＴＩＲを示す。 図２Ｂは、Ｎａ_４（ＥＤＴＡ）のＦＴＩＲを示す。 図２Ｃは、Ａｇ_４（ＥＤＴＡ）のＦＴＩＲを示す。 図３は、Ａｇ_２Ｃｕ（ＥＤＴＡ）の暗青色粉末のＡＴＲ－ＦＴＩＲスペクトルを示す。 図４は、液体Ａｇ－Ｚｎ_２－ＥＤＴＡ（化合物４）を用いた処理後の、創傷バイオフィルム含有ＬａｂｓｋｉｎからのＩＬ－６サイトカイン分泌を示す。

Claims (16)

1. 式Ｍ_ｎ（ＥＤＴＡ）の化合物であって、式中：
   ｎが２～４の整数であり；
   各々のＭが金属イオンであり；そして
   Ｍ_ｎが、Ａｇ、Ａｌ、Ａｕ、Ｂａ、Ｂｉ、Ｔｌ、Ｃｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｇａ、Ｉｒ、Ｍｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｔｉ、及びＺｎイオンより選択される少なくとも２つの異なる金属イオンを含む化合物。
2. ｎ＝３又は４であり、Ｍ_ｎが２つのＡｇイオンを含む、請求項１記載の化合物。
3. Ｍ_ｎが少なくとも１つのＡｇイオン及び１つのＺｎイオンを含む、請求項１又は請求項２記載の化合物。
4. 式Ａｇ_２Ｚｎ（ＥＤＴＡ）を有する請求項３記載の化合物。
5. Ｍ_ｎが少なくとも１つのＡｇイオン及び１つのＣｕイオンを含む、請求項１又は請求項２記載の化合物。
6. 式Ａｇ_２Ｃｕ（ＥＤＴＡ）を有する、請求項５記載の化合物。
7. 請求項１～６のいずれかに記載の１つ又は複数の化合物を含む組成物。
8. １つ又は複数の化合物を含むヒドロゲルである、請求項７記載の組成物。
9. １つ又は複数の化合物と接触する繊維を含む、請求項７記載の組成物。
10. 非金属イオン抗菌剤を含む、請求項７～９のいずれかに記載の組成物。
11. 界面活性剤を含む、請求項７～１０のいずれかに記載の組成物。
12. 請求項１～６のいずれかに記載の化合物又は請求項７～１１のいずれかに記載の組成物を含む創傷被覆材。
13. 請求項１～６のいずれかに記載の化合物又は請求項７～１１のいずれかに記載の組成物を含む医療機器。
14. 基質のバイオフィルムを衛生化する及び／又は基質からバイオフィルムを実質的に除去するための、請求項１～６のいずれかに記載の化合物又は請求項７～１１のいずれかに記載の組成物の使用であって、ここで基質が、医療機器の一部、あるいは食品調製及び加工装置又は食品の一部である使用。
15. 医薬として使用するための、請求項７～１１のいずれかに記載の組成物。
16. 請求項１～６のいずれかに記載の化合物又は請求項７～１１のいずれかに記載の組成物及び医療機器又は創傷被覆材を含むキット。

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