JP7015322B2 - Mic-1化合物およびその使用 - Google Patents
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Description
「配列表」と題される配列表は、205.032バイトであり、2018年5月23日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
Chem.1は、
Chem.1A: HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*、
Chem.1C: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)y-CO-*、および
Chem.1D: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)x-CO-*からなる群から選択され、
式中、xは、12~20の範囲の整数であり、
式中、yは、5~15の範囲の整数であり、
Chem.2は、
Chem.2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*、
Chem.2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*、および
Chem.2C: *-(NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO)k-*からなる群から選択され、
式中、Chem.2のmは、1~5の範囲の整数であり、かつ
Chem.2のkは、0~4の範囲の整数であり、
Chem.3は、*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)lであり、
式中、Chem.3のkは、1~10の範囲の整数であり、
nは、1~5の範囲の整数であり、かつ
lは、0~5の範囲の整数であり、
Chem.4は、
Chem.4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*、
Chem.4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*、
Chem.4C: *-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*、および
Chem.4D
式中、Chem.4のmは、1~5の範囲の整数であり、nは、2~6の範囲の整数であり、かつ
Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4は、Chem.の*-NH末端を別のChem.のCO-*末端に連結するアミド結合を介して相互連結され、Chem.4は、アミノ酸延長部のシステイン残基のイオウ原子に連結されている。
本明細書で使用する場合、「MIC-1」という用語は、増殖分化因子15(GDF-15)、胎盤骨形成タンパク質(placental bone morphogenetic protein)(PLAB)、および非ステロイド性抗炎症薬物活性化遺伝子(NAG-1)としても知られる、マクロファージ阻害性サイトカイン-1(MIC-1)を意味する。次いで、MIC-1は、62kDaの細胞内ホモ二量体前駆体タンパク質として合成され、これはフーリン様プロテアーゼによって24.5kDaのホモ二量体へと切断される。全長野生型ヒトMIC-1の配列は、アクセッション番号Q99988にてUNIPROTデータベースから入手可能である。308個のアミノ酸の前駆体配列は、シグナルペプチド(アミノ酸1~29)、プロペプチド(アミノ酸30~196)、およびMIC-1単量体配列(アミノ酸197~308)を含む。112個のアミノ酸のMIC-1単量体配列は、配列番号1として本明細書に含まれる。MIC-1単量体は、9個のシステイン残基を含有し、これは、4個の鎖内ジスルフィド結合および1個の鎖間ジスルフィド結合の形成を生じさせて、共有結合した24.5KDaのホモ二量体を生成させる。MIC-1単量体配列(配列番号1)中のH6Dに対応する自然発生の変異が記載されている。
グリシン:GおよびGly;プロリン:PおよびPro;アラニン:AおよびAla;バリン:VおよびVal;ロイシン:LおよびLeu;イソロイシン:IおよびIle;メチオニン:MおよびMet;システイン:CおよびCys;フェニルアラニン:FおよびPhe;チロシン:YおよびTyr;トリプトファン:WおよびTrp;ヒスチジン:HおよびHis;リジン:KおよびLys;アルギニン:RおよびArg;グルタミン:QおよびGin;アスパラギン:NおよびAsn;グルタミン酸:EおよびGlu;アスパラギン酸:DおよびAsp;セリン:SおよびSer;ならびにトレオニン:TおよびThr。
本発明のMIC-1化合物は、N末端アミノ酸延長部を含む。
本発明のMIC-1化合物は、プロトラクターを含む。プロトラクターは、MIC-1ポリペプチドまたはN末端アミノ酸延長部の特定のアミノ酸残基に共有結合している。
本発明の一態様では、プロトラクターは、Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4の各々のうちの少なくとも一つを含むか、またはそれらからなり、
Chem.1は、
Chem.1A: HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*、
Chem.1C: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)y-CO-*、および
Chem.1D: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)x-CO-*からなる群から選択され、
式中、xは、12~20の範囲の整数であり、
式中、yは、5~15の範囲の整数であり、
Chem.2は、
Chem.2A: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO-*、
Chem.2B: *-NH-S(=O)2-(CH2)m-CO-*、および
Chem.2C: *-NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO-*からなる群から選択され、
式中、Chem.2のmは、1~5の範囲の整数であり;
Chem.3は、*NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*であり、
式中、Chem.3のkは、1~10の範囲の整数であり、
nは、1~5の範囲の整数であり、かつ
Chem.4は、
Chem.4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*、
Chem.4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*、
Chem.4C:*-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*、および
Chem.4D
式中、Chem.4のmは、1~5の範囲の整数であり、かつnは、2~6の範囲の整数であり、または
Chem.4は、式I、式II、または式IIIからなる群から選択され:
Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4は、Chem.の*-NH末端を別のChem.のCO-*末端に連結するアミド結合を介して相互連結されている。
Chem.1a: HOOC-(CH2)16-CO-*、
Chem.1b: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*、
Chem.1c: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)9-CO-*、および
Chem.1d: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)15-CO-*からなる群から選択される。
Chem.2a:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem.2b:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*、および
Chem.2c:*-NH-CH2-シクロヘキサン-CO-*からなる群から選択される。
Chem.1は、
Chem.1A: HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*、
Chem.1C: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)y-CO-*、および
Chem.1D: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)x-CO-*からなる群から選択され、
式中、xは、12~20の範囲の整数であり、
式中、yは、5~15の範囲の整数であり、
Chem.2は、
Chem.2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*、
Chem.2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*、および
Chem.2C: *-(NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO)k-*からなる群から選択され、
式中、Chem.2のmは、1~5の範囲の整数であり、また
kは、0~4の範囲の整数であり;
Chem.3は、*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)lであり、
式中、Chem.3のkは、1~10の範囲の整数であり、
nは、1~5の範囲の整数であり、また
lは、0~5の範囲の整数であり、
Chem.4は、
Chem.4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*、および
Chem.4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*から選択され、
式中、Chem.4のmは、1~5の範囲の整数であり、また
Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4は、Chem.の*-NH末端を別のChem.のCO-*末端に連結するアミド結合を介して相互連結され、Chem.4のCH2-*末端は、アミノ酸延長部のシステイン残基のイオウ原子に連結されている。
Chem.1は、
Chem.1A: HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*、
Chem.1C: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)y-CO-*、および
Chem.1D: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)x-CO-*からなる群から選択され、
式中、xは、12~20の範囲の整数であり、
式中、yは、5~15の範囲の整数であり、
Chem.2は、
Chem.2A:*-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*、
Chem.2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*、および
Chem.2C: *-(NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO)k-*からなる群から選択され、
式中、Chem.2のmは、1~5の範囲の整数であり、
kは、0~4の範囲の整数であり;
Chem.3は、*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)lであり、
式中、Chem.3のkは、1~10の範囲の整数であり、
nは、1~5の範囲の整数であり、また
lは、0~5の範囲の整数であり、
Chem.4は、式I、式II、または式III:
からなる群から選択され、Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4は、Chem.の*-NH末端を別のChem.のCO-*末端に連結するアミド結合を介して相互連結され、Chem.4のCH2-*末端は、アミノ酸延長部のN末端のアルファ-アミノ基に連結されている。
N末端アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドのpI計算値は、N延長部を有するMIC-1ポリペプチドの正味の電荷計算値がゼロであるpHとして定義される。pHの関数としてのN延長部を有するMIC-1ポリペプチドの電荷計算値は、表1に記載されるアミノ酸残基のpKa値、およびB.Skoog and A.Wichman(Trends in Analytical Chemistry,1986,vol.5,pp.82-83)によって記載された方法を使用して得られる。システイン(Cys)の側鎖pKaは、遊離スルフヒドリル基を有するシステインに対する電荷の計算にのみ含まれる。一例として、ホモ二量体としてのヒトの野生型MIC-1のpI計算値は8.8である。
一態様では、本発明のMIC-1化合物は、良好な生物物理学的特性を有する。
一態様では、本発明の化合物は、ヒトMIC-1(配列番号1)に対してMIC-1受容体効力を保持している。受容体効力および有効性は、ヒトMIC-1受容体(hGFRAL、GDNFファミリー受容体アルファ様)およびそのシグナル伝達共受容体hRET(癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼ受容体Ret)をトランスフェクトした哺乳動物細胞で測定することができる。受容体複合体のMIC-1化合物活性化は、実施例6に記載されるように、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)のリン酸化によって測定される。
一態様では、本発明の化合物は、インビボで効力があり、これは任意の好適な動物モデルで当該技術分野で公知のようにして決定され得る。
一態様では、本発明のMIC-1化合物は、長期化され、延長されたインビボ血漿半減期を有し、これは好適なインビボ薬物動態研究で決定することができる。
ヒト野生型MIC-1は、ホモ二量体に基づき、8.8のpI計算値を有する疎水性タンパク質である。結果として、野生型MIC-1は、中性pHの水性緩衝液系中では約0.5mg/mlまでしか可溶化することができない。MIC-1の低溶解度は医薬製剤の特性および治療使用を著しく妨げるので、溶解度が改善されたMIC-1化合物を開発することは治療の有用性を大幅に改善することになる。
ヒト野生型MIC-1配列は化学的に不安定であり、アミノ酸配列のいくつかの残基は、3位のアスパラギン(N3)の脱アミド化ならびにメチオニンM43、M57、およびM86の酸化を含んで、保存中に修飾される可能性がある。ある特定の残基の化学的不安定性は医薬特性に影響を与える可能性があるため、化学的に安定なMIC-1化合物の開発は、MIC-1治療化合物を作製するための別の重要な部分であることになる。
一態様では、本発明のMIC-1化合物は、低い免疫原性のリスクを有する。
本発明のN末端アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドは、当業者には公知である組み換え型タンパク質技術によって産生され得る。一般に、目的のタンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸配列は、N延長部を有する所望のMIC-1ポリペプチドをコードするように修飾される。次いで、この修飾された配列が発現ベクターに挿入され、これが次に発現宿主細胞へと形質転換またはトランスフェクトされる。
N末端アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドは、E.coliなどの細菌において発現させることができる。本発明の文脈では、N延長部を有するMIC-1ポリペプチドの大規模なタンパク質産生は、封入体(IB)を使用し得るが、それは、該封入体が、プロセスの回復、タンパク質純度、プロテアーゼ分解、および一般的なタンパク質安定性を制御する有利なアプローチを示すためである。これは大規模なタンパク質産生に特に重要となる。pI計算値によって部分的に制御されるN延長部を有するMIC-1ポリペプチドの溶解度とIB形成とのバランスは、IBの質のために非常に重要である。
投与経路は、本発明の化合物を、例えば非経口的に、例えば皮下、筋肉内、または静脈内で体内の望ましい場所または適切な場所に効果的に運ぶ任意の経路であり得る。あるいは、本発明の化合物は、経口、肺、直腸内、経皮、口腔内、舌下、または経鼻で投与することができる。
本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で公知のように調製され得る。
本発明による化合物を用いた処置は、例えば、抗肥満剤、食欲調節剤、ならびに肥満により生じるまたは肥満に関連する合併症および障害の処置および/または予防のための薬剤から選択される、一つ以上の薬理活性物質とも組み合わされてもよい。
一態様では、本発明は、薬剤として使用するための本発明の化合物に関する。
(i)例えば、食物摂取量を減少させ、体重を減少させ、食欲を抑制し、かつ/または満腹感を誘発することによって、肥満などの摂食障害の防止および/または処置。
(ii)高血糖症、インスリン抵抗性、および/または耐糖能障害の予防および/または処置。
(iii)脂質異常症の防止および/または処置。
本発明は、本発明の以下の非限定的実施形態によってさらに説明される:
1.N末端アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドおよびプロトラクターを含むMIC-1化合物であって、プロトラクターが、アミノ酸延長部に結合されている、MIC-1化合物。
2.化合物が、ホモ二量体である、実施形態1に記載のMIC-1化合物。
3.N末端アミノ酸延長部が、システイン残基を含み、かつプロトラクターが、システイン残基においてアミノ酸延長部に結合されている、実施形態1または2に記載のMIC-1化合物。
4.プロトラクターが、Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4の各々のうちの少なくとも一つを含むか、またはそれらからなり、
Chem.1は、
Chem.1A: HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*、
Chem.1C: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)y-CO-*、および
Chem.1D: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)x-CO-*からなる群から選択され、
式中、xは、12~20の範囲の整数であり、
式中、yは、5~15の範囲の整数であり、
Chem.2は、
Chem.2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*、
Chem.2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*、および
Chem.2C: *-(NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO)k-*からなる群から選択され、
式中、Chem.2のmは、1~5の範囲の整数であり、かつ
kは、0~4の範囲の整数であり、
Chem.3は、*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)lであり、
式中、Chem.3のkは、1~10の範囲の整数であり、
nは、1~5の範囲の整数であり、かつ
lは、0~5の範囲の整数であり、
Chem.4は、
Chem.4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*、および
Chem.4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*、
Chem.4C:*-NH-(CH2)m-CH(COOH)-NH-CO-CH2-*、および
Chem.4D:
式中、Chem.4のmは、1~5の範囲の整数であり、nは、2~6の範囲の整数であり、かつ
Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4が、Chem.の*-NH末端を別のChem.のCO-*末端に連結しているアミド結合を介して相互連結され、かつChem.4のCH2-*末端が、アミノ酸延長部の前記システイン残基のイオウ原子に連結されている、実施形態3に記載のMIC-1化合物。
5.プロトラクターが、アミノ酸延長部のN末端アミノ酸に結合されている、実施形態1または2に記載のMIC-1化合物。
6.プロトラクターが、Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4の各々のうちの少なくとも一つを含むか、またはそれらからなり、
Chem.1は、
Chem.1A: HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*、
Chem.1C: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)y-CO-*、および
Chem.1D: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)x-CO-*からなる群から選択され、
式中、xは、12~20の範囲の整数であり、
式中、yは、5~15の範囲の整数であり、
Chem.2は、
Chem.2A: *-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*、
Chem.2B: *-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*、および
Chem.2C: *-(NH-(CH2)m-シクロヘキサン-CO)k-*からなる群から選択され、
式中、Chem.2のmは、1~5の範囲の整数であり、かつ
kは、0~4の範囲の整数であり、
Chem.3は、*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)lであり、
式中、Chem.3のkは、1~10の範囲の整数であり、
nは、1~5の範囲の整数であり、かつ
lは、0~5の範囲の整数であり、
Chem.4は、式I、式II、または式IIIからなる群から選択され:
Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4が、Chem.の*-NH末端を別のChem.のCO-*末端に連結するアミド結合を介して相互連結され、かつ化合物4のCH2-*末端が、アミノ酸延長部のN末端のアミノ残基に連結されている、実施形態5に記載のMIC-1化合物。
7.Chem.1が、
Chem.1a: HOOC-(CH2)16-CO-*、
Chem.1b: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*、
Chem.1c: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)9-CO-*、および
Chem.1c: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)15-CO-*からなる群から選択される、実施形態4および6のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
8.Chem.2が、
Chem.2a:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
Chem.2b:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*、および
Chem.2c:*-NH-CH2-シクロヘキサン-CO-*からなる群から選択される、実施形態4、6、および7のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
9.Chem.2-Chem.3が、以下の式IV:
であり、式中、nが0~3であり、mが0~3である、実施形態4、6、および7のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
10.Chem.4が、
Chem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*、および
Chem.4b:*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*からなる群から選択される、実施形態4および7~9のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
11.Chem.4が、
からなる群から選択され、nが1~4である、実施形態4および7~9のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
12.Chem.4が、以下の
であり、pが1~5であり、qが1~5である、実施形態4および7~9のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
13.プロトラクターが、式IX、式X、式XI、式XII、および式XIII:
からなる群から選択される、実施形態1~3および5のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
14.プロトラクターが、生体適合性脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、例えば、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(Glyx-Sery)n(HAP)、ヒアルロン酸(HA)、ヘパロサンポリマー(HEP)、ホスホリルコリン系のポリマー(PCポリマー)、Fleximer、デキストラン、ポリシアル酸(PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、XTENポリマー、アルブミン結合ペプチド、CTPペプチド、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態1~3および5のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
15.アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドが、6.5より低いpI計算値を有する、実施形態1~14のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
16.pI計算値が6.1より低い、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
17.pI計算値が6.0より低い、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
18.pI計算値が、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、もしくは5.2、5.1、もしくは5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、または4.0より低い、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
19.pI計算値が4.7より高い、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
20.pI計算値が4.8より高い、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
21.pI計算値が4.9より高い、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
22.pI計算値が5.0より高い、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
23.pI計算値が5.1より高い、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
24.pI計算値が、6.5~3.0、6.5~3.5、6.5~4.0、6.1~3.0、6.1~3.5、6.1~4.0、6.1~4.7、6.1~4.9、6.1~5.0、6.1~5.1、6.0~3.0、6.0~3.5、6.0~4.0、5.9~3.0、5.9~3.5、5.9~4.0、5.9~5.0、5.9~5.1、5.8~3.0、5.8~3.5、5.8~4.0、5.8~5.1、5.8~5.2、5.5~3.0、5.5~3.5、5.5~4.0、または5.0~4.0の範囲内である、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
25.pI計算値が、5.8~5.2の範囲内である、実施形態15に記載のMIC-1化合物。
26.アミノ酸延長部が、3~200個のアミノ酸残基を含む、実施形態1~25のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
27.アミノ酸延長部が、3~100、3~50、3~40、3~30、5~100、5~50、5~40、5~30、10~100、10~50、10~40、10~30、3~36、3~30、3~25、3~24、3~12、4~36、4~30、、4~24、4~12、5~36、5~30、5~24、5~12、6~36、6~30、6~24、6~12、7~36、7~30、7~24、7~12、8~36、8~30、8~24、8~12、30~36、32~36、30~34、または30~32個の範囲内のアミノ酸残基の長さである、先行する実施形態の1~26いずれか一つに記載のMIC-1化合物。
28.アミノ酸延長部が、3~36または30~32個の範囲内のアミノ酸残基の長さである、実施形態1~27のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
29.アミノ酸延長部が、塩基性アミノ酸残基(リジン、アルギニン、またはヒスチジン)の数と比較して、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の過剰な酸性アミノ酸残基(アスパラギン酸またはグルタミン酸)を有する、実施形態1~28のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
30.アミノ酸延長部が、塩基性アミノ酸残基(リジン、もしくはアルギニン、またはヒスチジン)の数と比較して、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、または75%過剰な酸性アミノ酸残基(アスパラギン酸またはグルタミン酸)を含む、実施形態1~29のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
31.アミノ酸延長部が、少なくとも10%の酸性アミノ酸残基を含む、実施形態30に記載のMIC-1化合物。
32.アミノ酸延長部が、少なくとも15%の酸性アミノ酸残基を含む、実施形態30に記載のMIC-1化合物。
33.アミノ酸延長部が、少なくとも25%の酸性アミノ酸残基を含む、実施形態11に記載のMIC-1化合物。
34.アミノ酸延長部が、A、C、E、G、P、S、T、Q、N、およびDからなる群の中から選択されるアミノ酸残基から構成され、かつアミノ酸延長部が、少なくとも3個のEおよび/またはDアミノ酸残基を含む、実施形態1~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
35.アミノ酸延長部が、アミノ酸残基A、C、E、G、P、S、およびTから構成される、実施形態34に記載のMIC-1化合物。
36.アミノ酸延長部が、少なくとも3個のEおよび少なくとも1個のPを含む、実施形態35に記載のMIC-1化合物。
37.アミノ酸延長部が、少なくとも6個のSer、少なくとも4個のPro、少なくとも4個のGly、少なくとも4個のThr、少なくとも4個のGlu、および少なくとも2個のAlaを含む、実施形態36に記載のMIC-1化合物。
38.アミノ酸延長部が、SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG、およびSEPATSGSETPGからなる群から選択された二つの配列を含み、かつアミノ酸延長部のアミノ酸のうちの一つが、システインで置き換えられている、実施形態37に記載のMIC-1化合物。
39.アミノ酸延長部が、最初の6~8個のアミノ酸残基、最後の6~8個の残基、または内部の6~8個の残基などの、SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG、またはSEPATSGSETPGの6~8個の連続したアミノ酸をさらに含み、かつアミノ酸延長部のアミノ酸のうちの一つが、システインで置き換えられている、実施形態38に記載のMIC-1化合物。
40.システインが、N末端アミノ酸延長部の任意の位置にある、実施形態3~39のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
41.N末端延長部のシステイン残基とMIC-1ポリペプチドのN末端アミノ酸との間の距離が、少なくとも1個、3個、5個、10個、15個、19個、23個、26個、29個、または32個のアミノ酸(N末端延長部のシステイン残基を含むが、MIC-1ポリペプチドのN末端アミノ酸を含まない)である、実施形態40に記載のMIC-1化合物。
42.N末端延長部のシステイン残基とMIC-1ポリペプチドのN末端アミノ酸との間の距離が、少なくとも10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、または32個のアミノ酸(N末端延長部のシステイン残基を含むが、MIC-1ポリペプチドのN末端アミノ酸を含まない)である、実施形態40に記載のMIC-1化合物。
43.N末端延長部のシステイン残基とMIC-1ポリペプチドのN末端アミノ酸との間の距離が、26~29個のアミノ酸(N末端延長部のシステイン残基を含むが、MIC-1ポリペプチドのN末端アミノ酸を含まない)である、実施形態42に記載のMIC-1化合物。
44.アミノ酸延長部が、Sで始まる、実施形態1~43のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
45.アミノ酸延長部が、SEで始まる、実施形態1~44のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
46.アミノ酸延長部が、SEPで始まる、実施形態1~45のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
47.アミノ酸延長部が、以下の配列のうちの一つ以上:
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号223)
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号224)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号225)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号240)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTE(配列番号241)
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPG(配列番号242)、
SEPCTSGSETPGTSESATPES(配列番号243)、
SEPCTSGSETPG(配列番号244)
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(配列番号245)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(配列番号246)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(配列番号247)、
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(配列番号248)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(配列番号249)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(配列番号250)、
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(配列番号251)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(配列番号252)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(配列番号253)、
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(配列番号254)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(配列番号255)
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(配列番号256)、
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(配列番号257)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(配列番号258)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(配列番号259)、
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(配列番号260)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(配列番号261)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(配列番号262)、
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(配列番号263)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(配列番号264)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(配列番号265)
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(配列番号266)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(配列番号267)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(配列番号268)
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(配列番号269)、
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(配列番号270)、
SEPCTSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(配列番号271)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(配列番号272)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(配列番号273)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(配列番号274)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(配列番号275)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(配列番号276)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(配列番号277)
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(配列番号278)、
SEPCTSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(配列番号279)、
SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(配列番号280)、
SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(配列番号281)、
SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(配列番号282)、
SEPCTSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(配列番号283)
GPCEGPSEGPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(配列番号284)、
GECPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(配列番号285)、
PACEEEDDPDGGGSGGGSGGGS(配列番号286)
PDECTEEETEGGGSGGGSGGGS(配列番号287)、
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号226)、
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号227)、
SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号229)、
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号230)、
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号231)、
SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号232)、
SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号233)、
SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG(配列番号234)、
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG(配列番号235)、
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG(配列番号236)、
SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG(配列番号237)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSCEPSEG(配列番号238)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPCEG(配列番号239)、を含む、実施形態1~46のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
48.アミノ酸延長部が、A、E、G、P、S、T、D、N、およびQからなる群の中から選択されるアミノ酸残基から構成され、アミノ酸延長部が、少なくとも3個のEおよび/またはDアミノ酸残基を含む、実施形態1~2および5~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
49.アミノ酸延長部が、A、E、G、P、S、T、Q、およびDからなる群の中から選択されるアミノ酸残基からなり、アミノ酸延長部が、少なくとも3個のEおよび/またはDアミノ酸残基を含む、実施形態1~48のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
50.アミノ酸延長部が、少なくとも3個のEおよび少なくとも1個のPを含む、実施形態48または49に記載のMIC-1化合物。
51.アミノ酸延長部が、S、G、T、およびAをさらに含む、実施形態50に記載のMIC-1化合物。
52.アミノ酸延長部が、6個のSer、4個のPro、4個のGly、4個のThr、4個のGlu、および2個のAlaを含む、実施形態51に記載のMIC-1化合物。
53.アミノ酸延長部が、SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG、およびSEPATSGSETPGからなる群から選択される配列のうちの二つを含む、実施形態51に記載のMIC-1化合物。
54.アミノ酸延長部が、最初の6~8個のアミノ酸残基、最後の6~8個の残基、または内部の6~8個の残基などの、SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG、またはSEPATSGSETPGの6~8個の連続したアミノ酸をさらに含む、実施形態53に記載のMIC-1化合物。
55.アミノ酸延長部が、Sで始まる、実施形態48~54のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
56.アミノ酸延長部が、SEで始まる、実施形態55に記載のMIC-1化合物。
57.アミノ酸延長部が、SEPで始まる、実施形態56に記載のMIC-1化合物。
58.アミノ酸延長部が、以下の配列SPAGSP(配列番号4)、TSESAT(配列番号5)、TSTEPE(配列番号6)、SEPATS(配列番号7)、TSTEEG(配列番号8)、PESGPG(配列番号9)、SGSAPG(配列番号10)、GSETPG(配列番号11)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(配列番号12)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG(配列番号13)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(配列番号14)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(配列番号15)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(配列番号16)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(配列番号17)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(配列番号18)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(配列番号19)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(配列番号20)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(配列番号21)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(配列番号22)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(配列番号23)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(配列番号24)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(配列番号25)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(配列番号26)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(配列番号27)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(配列番号28)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(配列番号29)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(配列番号30)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(配列番号31)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(配列番号32)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(配列番号33)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(配列番号34)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(配列番号35)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(配列番号36)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(配列番号37)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(配列番号38)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号70)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号71)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(配列番号39)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(配列番号40)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(配列番号41)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(配列番号42)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(配列番号43)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(配列番号44)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(配列番号45)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(配列番号46)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(配列番号47)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(配列番号48)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(配列番号49)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(配列番号50)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(配列番号51)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(配列番号52)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(配列番号53)、
GEPS(配列番号118)、GPSE(配列番号119)、GPES(配列番号120)、GSPE(配列番号121)、GSEP(配列番号122)、GEPQ(配列番号123)、GEQP(配列番号124)、GPEQ(配列番号125)、GPQE(配列番号126)、GQEP(配列番号127)またはGQPE(配列番号128)、PEDEETPEQE(配列番号129)、PDEGTEEETE(配列番号130)、PAAEEEDDPD(配列番号131)、AEPDEDPQSED(配列番号132)、AEPDEDPQSE(配列番号133)、AEPEEQEED(配列番号134)、AEPEEQEE(配列番号135)、GGGS(配列番号136)、GSGS(配列番号137)、GGSS(配列番号138)、およびSSSG(配列番号139)のうちの一つ以上を含む、請求項1~2および5~33のいずれか一項に記載のMIC-1化合物。
59.アミノ酸の延長部が、以下の配列SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG,
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG、
GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS、およびSSSGのうちの一つ以上を含む、請求項1~2および5~33のいずれか一項に記載のMIC-1化合物。
60.アミノ酸延長部が、以下の配列SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS、およびSSSGのいずれか2個6個のうちの任意の組み合わせを含む、実施形態1~2および5~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
61.アミノ酸延長部が、以下の配列GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS、およびSSSGのうちの一つ以上を含む、実施形態1~2および5~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
62.アミノ酸延長部が、以下の配列GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS、およびSSSGのうちの2個9個の任意の組み合わせを含む、実施形態61に記載のMIC-1化合物。
63.アミノ酸延長部が、以下の配列GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS、およびSSSGのうちの一つ以上を含む、実施形態1~2および5~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
64.アミノ酸延長部が、以下の配列GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS、およびSSSGのうちの2個9個の任意の組み合わせを含む、実施形態63に記載のMIC-1化合物。
65.アミノ酸延長部が、以下の配列GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS(配列番号140)、GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(配列番号141)、GPESGPESGPESGPESGPES(配列番号142)、GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE(配列番号143)、およびGSEPGSEPGSEPGSEPGSEP(配列番号144)のうちの一つ以上を含む、実施形態64に記載のMIC-1化合物。
66.アミノ酸延長部が、以下の配列GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS、およびSSSGのうちの一つ以上を含む、実施形態1~2および5~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
67.アミノ酸延長部が、以下の配列GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS、およびSSSGのうちの2個9個の任意の組み合わせを含む、実施形態66に記載のMIC-1化合物。
68.アミノ酸延長部が、以下の配列GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ(配列番号145)、GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(配列番号146)、GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(配列番号147)、GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE(配列番号148)、GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP(配列番号149)、およびGQPEGQPEGQPEGQPEGQPE(配列番号150)のうちの一つ以上を含む、実施形態67に記載のMIC-1化合物。
69.アミノ酸延長部が、以下の配列PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED、およびAEPEEQEE、GGGS、GSGS、GGSS、ならびにSSSGのうちの一つ以上を含む、実施形態1~2および5~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
70.アミノ酸延長部が、以下の配列PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED、AEPEEQEE、およびAEEAEEAEEAEEAEEのうちの2個または3個の任意の組み合わせを含む、実施形態1~2および5~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
71.アミノ酸延長部が、以下の配列、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号161、配列番号162、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、および配列番号195のうちの一つ以上を含む、実施形態1~2および5~33のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
72.アミノ酸延長部が、1~3個のアラニンアミノ酸残基をN末端に含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
73.アミノ酸延長部が、1~4個のグリシンおよびセリンアミノ酸残基をC末端に含む、実施形態1~72のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
74.アミノ酸延長部が、(Gly-Ser)nまたは(Ser-Gly)n配列をC末端に含み、nが、1~8の整数である、実施形態1~73のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
75.アミノ酸延長部が、GGGS、GSGS、GGSS、またはSSSGをC末端に含む、実施形態1~74のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
76.MIC-1ポリペプチドが、野生型MIC-1(配列番号1)と少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を示す、実施形態1~75のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
77.MIC-1ポリペプチドが、野生型MIC-1(配列番号1)と少なくとも95%の配列同一性を示す、実施形態70に記載のMIC-1化合物。
78.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、最大10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、または1個のアミノ酸修飾を有する、実施形態1~70のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
79.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、最大7個、6個、5個、4個、3個、または2個のアミノ酸修飾を有する、実施形態1~72のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
80.MIC-1ポリペプチドが、野生型MIC-1(配列番号1)と比較して、以下の置換P11E、H18E、R21E、A30E、M43L、M43E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86F、M86L、Q90E、T92E、L105E、K107E、K69R、K107R、およびK91Rのうちの一つ以上を含む、実施形態1~79のMIC-1化合物。
81.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、以下の置換R2S、R2A、R2E、N3S、N3E、N3A、N3T、N3P、N3G、N3V、N3H、N3Y、またはN3Qのうちの一つ以上を含む、実施形態1~80のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
82.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、N3の欠失(des-N3)を含む、実施形態1~81のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
83.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、M57E置換またはM57L置換を含む、実施形態1~82のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
84.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、M86L置換またはM86F置換を含む、実施形態1~83のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
85.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、Q90E置換またはT92E置換をさらに含む、実施形態84に記載のMIC-1化合物。
86.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、H66E置換を含む、実施形態1~85のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
87.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、R67E置換を含む、実施形態1~86のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
88.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、最初の3個、4個、5個、または6個の残基の欠失を含む、実施形態1~87のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
89.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して、最初の3個の残基の欠失を含む、実施形態1~88のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
90.MIC-1ポリペプチドが、配列番号154(M43L/des-N3)による配列を有する、実施形態1~75のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
91.MIC-1ポリペプチドが、配列番号155(M43L/Δ1-3)による配列を有する、実施形態1~75のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
92.MIC-1ポリペプチドが、配列番号156(M57E/H66E/des-N3)による配列を有する、実施形態1~75のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
93.MIC-1ポリペプチドが、配列番号157(M57L/Δ1-3)による配列を有する、実施形態1~75のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
94.MIC-1ポリペプチドが、配列番号158(M57L/des-N3)による配列を有する、実施形態1~75のいずれか一つに記載の化合物。
95.MIC-1ポリペプチドが、配列番号159(M86L/Δ1-3)によるものを有する、実施形態1~75のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
96.MIC-1ポリペプチドが、配列番号160(M86L/des-N3)または配列番号222(M57L、M86L/des-N3)による配列を有する、実施形態1~75のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
97.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1による配列を有する、実施形態1~75のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
98.MIC-1ポリペプチドおよびN末端アミノ酸延長部が一緒に、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号164、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号288)、
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号289)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号290)、
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号291)、
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号292)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPCEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号293)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANEHAQIKTSLERLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号294)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号295)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号296)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号297)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号298)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号299)、
SAPATSGSATPGSAPATSGSATPGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号300)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号301)、
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号302)、
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号303)、
SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号304)、
SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号305)、
SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号306)、
SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号307)、
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号308)、
SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号309)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSCEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号310)、
EEAEADDDDKESGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(配列番号311)、または
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGARGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANLHAQIKTSLHRLRPDTVPAPCCVPASYNPLVLIQRTDTGVSLQTYDDLLARDCHCI(配列番号312)によるアミノ酸配列を含む、実施形態1~97のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
99.以下の式:
のうちの一つを有する、実施形態1に記載のMIC-1化合物。
100.配列番号1のMIC-1と比較して延長された血漿半減期を示す、実施形態1~99のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
101.化合物をラットに静脈内投与し、そして経時的な化合物の血漿濃度の変化から終末相半減期を推定することにより測定したときに、配列番号1のMIC-1と比較して改善された血漿半減期を示す、実施形態1~100のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
102.配列番号1のMIC-1と比較して維持された効力を示す、実施形態1~101のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
103.化合物をラットに皮下投与し、そして毎日の食物摂取量の変化を測定することにより測定したときに、配列番号1のMIC-1と比較して保持された有効性を示す、実施形態1~102のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
104.アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較して許容可能な溶解度を有する、実施形態1~103のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
105.アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドが、トリス緩衝液系中でpH8.0にて測定したときに、0.5、1.0、5.0、10、30、または50mg/mlの溶解度を有する、実施形態1~99のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
106.MIC-1ポリペプチドが、配列番号1のMIC-1と比較してN3の欠失(des-N3)を含み、アミノ酸延長部が、以下の配列SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号225)を有し、プロトラクターが、以下の式:
かつプロトラクターが、アミノ酸延長部のシステインに結合されている、実施形態1また2に記載のMIC-1化合物。
107.N末端アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドが、配列番号288による配列を有し、プロトラクターが、以下の式:
プロトラクターが、アミノ酸延長部のシステインに結合されている、実施形態1または2に記載のMIC-1化合物。
108.実施形態1~107のいずれか一つに記載のMIC-1化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
109.化合物が、配列番号1のMIC-1と比較して、食物摂取量の低下および/または体重の低下に対して改善されたインビボでの有効性を有する、実施形態1~108のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
110.薬剤として使用するための実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
111.代謝障害の予防および/または処置に使用するための実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
112.代謝障害が、肥満、2型糖尿病、脂質異常症、または糖尿病性腎症である、代謝障害の予防および/または処置に使用するための実施形態111に記載のMIC-1化合物。
113.肥満などの摂食障害の予防および/または処置に使用するための実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
114.食物摂取量を減少させ、体重を減少させ、食欲を抑制し、かつ/または満腹感を誘発することによる肥満の防止および/または処置に使用するための実施形態113に記載のMIC-1化合物。
115.心血管疾患の予防および/または処置に使用するための実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物。
116.脂質異常症、動脈硬化症、脂肪性肝炎、または糖尿病性腎症の予防および/または処置に使用するための実施形態115に記載のMIC-1化合物。
117.実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物、または薬学的に許容される塩、アミド、もしくはそのエステル、および一つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
118.代謝障害の予防および/または処置のための薬剤の製造における、実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物の使用であって、代謝障害が、肥満、2型糖尿病、脂質異常症、または糖尿病性腎症である、使用。
119.摂食障害の予防および/または処置のための薬剤の製造における、実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物の使用。
120.肥満の予防および/または処置のための薬剤の製造における、実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物の使用。
121.食物摂取量を減少させ、体重を減少させ、食欲を抑制し、かつ/または満腹感を誘発することによる肥満の予防および/または処置のための薬剤の製造における、実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物の使用。
122.心血管疾患の予防および/または処置のための薬剤の製造における、実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物の使用。
123.脂質異常症、動脈硬化症、脂肪性肝炎、または糖尿病性腎症の予防および/または処置のための薬剤の製造における、実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物の使用。
124.薬学的に活性な量の実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物を投与することによる、代謝障害の処置および/または防止の方法であって、代謝障害が、肥満、2型糖尿病、脂質異常症、または糖尿病性腎症である、方法。
125.薬学的に活性な量の実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物を投与することによる、摂食障害の処置および/または防止の方法。
126.薬学的に活性な量の実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物を投与することによる、肥満の処置および/または防止の方法。
127.薬学的に活性な量の実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物の薬学的に活性量を投与することによって、食物摂取量を減少させ、体重を減少させ、食欲を抑制し、かつ/または満腹感を誘発することによる、肥満の処置および/または防止の方法。
128.薬学的に活性な量の実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物を投与することによる、心血管疾患の処置および/または防止の方法。
129.薬学的に活性な量の実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物を投与することによる、脂質異常症、動脈硬化症、脂肪性肝炎、または糖尿病性腎症の処置および/または防止の方法。
130.実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物をコードするポリヌクレオチド分子。
131.薬学的に活性な量の実施形態1~109および132~152のいずれか一つに記載のMIC-1化合物を投与することによって、食物摂取量を減少させ、体重を減少させ、食欲を抑制し、かつ/または満腹感を誘発することによる、過体重の処置および/または防止の方法。
132.式01:
によるMIC-1化合物。
133.式02:
によるMIC-1化合物。
134.式03:
によるMIC-1化合物。
135.式04:
によるMIC-1化合物。
136.式05:
によるMIC-1化合物。
137.式06:
によるMIC-1化合物。
138.式07:
によるMIC-1化合物。
139.式08:
によるMIC-1化合物。
140.式09:
によるMIC-1化合物。
141.式10:
によるMIC-1化合物。
142.式11:
によるMIC-1化合物。
143.式12:
によるMIC-1化合物。
144.式13:
によるMIC-1化合物。
145.式14:
によるMIC-1化合物。
146.式15:
によるMIC-1化合物。
147.式16:
によるMIC-1化合物。
148.式17:
によるMIC-1化合物。
149.式18:
によるMIC-1化合物。
150.式19:
によるMIC-1化合物。
151.式20:
によるMIC-1化合物。
152.式21:
によるMIC-1化合物。
「主ピーク」とは、ミリ吸光度単位の最も高いUV強度を有し、融合タンパク質を含有する精製クロマトグラムのピークを指す。
HPLCは、高速液体クロマトグラフィーである。
SDS-PAGEは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動である。
IMACは、固定化金属親和性クロマトグラフィーである。
SECは、サイズ排除クロマトグラフィーである。
MSは、質量分析である。
この説明において、ギリシャ文字は、その記号または対応する名称、例えば:α=アルファ、β=ベータ、ε=イプシロン、γ=ガンマ、ω=オメガ、Δ=デルタなどによって表される場合がある。また、μのギリシャ文字は、「u」によって表されてもよく、例えばμl=ulまたはμM=uMである。
本発明の一態様では、MIC-1ポリペプチドは溶解度が増加するように設計された。
N末端アミノ酸延長部の設計において、F、I、L、M、V、W、およびYは、タンパク質凝集の原因となり得るので除外した。H、K、およびRもまた、細胞膜上で望ましくない結合を起こし得るので除外した。A、C、E、G、P、S、T、D、N、およびQは、N延長部配列に対して好ましい。EおよびDは、化合物のpI値を減少させることによって溶解度を増加させるので特に好ましい。Cは、脂肪酸結合およびPEG化など、長期化の目的で使用することができる-SH基を提供する。特に、いくつかのN延長部では、N延長部を有するMIC-1ポリペプチドをE.coliで発現させたとき、当初のメチオニンの除去効率を高めるために、一つまたは二つの追加のアラニン、グリシン、またはセリンを各N末端に付加した。
MIC-1のある特定の内部残基(配列番号1)を例えば置換によって修飾した。例えば、MIC-1化合物の溶解度を増加させるために、MIC-1の疎水性残基を親水性残基、好ましくは酸性残基で置換することができ、陽性に荷電した残基を酸性残基などで置換することができた。酸化を減少させるために、メチオニンを他のアミノ酸、例えば、E、F、またはLで置換することができた。
N末端アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドのpI計算値は、N末端アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドの正味の電荷計算値(net calculated charge)がゼロであるpHとして定義される。pHの関数としてのN末端アミノ酸延長部を有するMIC-1ポリペプチドの電荷計算値は、表1に記載されるアミノ酸残基のpKa値およびB.Skoog and A.Wichman(Trends in Analytical Chemistry,1986,vol.5,pp.82-83)に記載される方法を使用して得られる。システイン(Cys)の側鎖pKaは、遊離スルフヒドリル基を有するシステインについての電荷の計算にのみ含まれる。N延長部は一つのシステイン変異を含有し得る。一例として、ホモ二量体としてのヒト野生型MIC-1のpI計算値は8.8である。MIC-1ポリペプチドのpI計算値を表4に示す。
調製の一般的な方法
実施例1:MIC-1ポリペプチドまたはN末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドの発現および発酵
MIC-1ポリペプチドまたはN末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドのcDNAをpET11b由来のベクターへとサブクローニングした。細胞密度が1.0のOD600に達したときに、封入体としてのMIC-1fポリペプチドまたはN末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドの過剰発現を、E.coli中で0.5mMのイソプロピルβ-d-チオガラクトシド(IPTG)により誘導した。TB中37℃で20時間継続的に増殖させた後、細胞を採取し、LC/MSおよびUPLCの両方のための試料を調製して、分子量を確認した。
以下のようにして、MIC-1ポリペプチドまたはN末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドをさらに精製した。
この実験の目的は、溶解度が改善されたN延長部を有するMIC-1ポリペプチドについてスクリーニングし、製剤のための最適pHウィンドウを決定することであった。
最大溶解度を試験するために、N末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドを、水およびエタノール(60%の水および40%エタノール)の混合物中に3mg/ml~10mg/mlの濃度範囲で溶解した。次いで、溶液(各ウェルにつき150μL)を96ウェルプレート(Corning)の中へと等分した。溶媒をSpeedVac(Concentrator Plus、Eppendorf)で6時間蒸発させて、N末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドのペレットを得た。トリス緩衝液(pH8.0、賦形剤なし)を96ウェルプレートの各ウェルの中へと添加した。ウェルに添加された緩衝液の量は、最大濃度が達成されるように、ウェル中のペレット全体を溶解するのに必要な量よりも少なくした。プレートを、プレート振盪装置上で800rpm(MixMate,Eppendorf)で2時間振盪した。ペレットを3600gで5分間遠心分離した。上清を96ディープウェルプレートに移し、40%エタノールを用いて20倍に希釈した。次いで、すべての試料をUPLC(Acquity、Waters)、プレートリーダー(Infinite M200 pro、Tecan)、およびUV分光計(NanoDrop 8000、Thermo Scientific)に供し、濃度を決定した(表7)。
実施例5:BHK21-hGFRAL-IRES-hRET細胞株の確立
本実施例の目的は、MIC-1活性を試験するための細胞ベースのインビトロアッセイを確立することであった。哺乳動物細胞をトランスフェクトし、該細胞は全長MIC-1受容体(hGFRAL)およびその完全なシグナル伝達共受容体hRET51を安定して発現した。
野生型MIC-1およびN末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドは、BHK21-hGFRAL-IRES-hRET安定細胞中でERK1/2の両方のリン酸化を誘発した(表8)。この結果から、MIC-1、GFRAL、およびRETの3個からなる複合体は、RETタンパク質チロシンキナーゼをリン酸化し、ERK1/2のリン酸化により、ERK/MAPK経路を含むシグナル伝達経路を通してMIC-1のインビボ活性を誘発すると結論することができる。
実施例7:痩せたSprague Dawleyラットの食物摂取量に対するN末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドの効果
N末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドのインビボでの有効性を、9~11週齢の痩せた雄Sprague Dawleyラットで測定した。8nmol/kg体重の用量で、一日一回、暗期間の開始の1~2時間前に、動物に注射した。適切な緩衝溶液中の化合物を皮下投与した(1~4ml/kg)。自動食物モニタリングシステム(ラット用のBioDAQシステムおよびHM2システム)によって、食物摂取量の変化を測定した。BioDAQシステムでは、動物は1匹で収容され、HM2システムでは、動物は1ケージあたり最大3匹の動物の群で収容された。各化合物がn=4~8匹の動物で試験された。動物を実験前に少なくとも7日間順化させた。収集したデータは、各日の12時間の暗期間の開始から翌日の暗期間まで測定した1日の食物摂取量(24時間の食物摂取量)として表される。投与化合物に応答した食物摂取量の日ごとの変化は、処理群の1日の平均食物摂取量からビヒクル群の1日の平均食物摂取量を減算することによって算出した。スチューデントの両側t検定を使用して、p<0.1である場合に変化を有意とみなした。結果は、研究期間中に記録されたビヒクルと比較した食物摂取量の「最大減少」(パーセント)として表される。データは、研究期間中の食物摂取量の有意な(p<0.1)日ごとの減少の合計としての食物摂取量の「減少の累計」(パーセント)としても表される。
ヒトの体内で、N-ホルミル-メチオニンは、異物としてまたは損傷した細胞が放出する警報信号として免疫系によって認識され、そして身体を刺激して潜在的感染症に対して闘わせる(Pathologic Basis of Veterinary Disease5:Pathologic Basis of Veterinary Disease,By James F.Zachary,M.Donald McGavin)。さらに、メチオニンは、容易に酸化される可能性がある不安定な残基である。したがって、N-Met切断効率は、MIC-1発現に非常に重要である。
単一の12mer試験のために設計された化合物および結果を表10および図1に示す。
(1)2.5*12merのN延長部を有するMIC-1ポリペプチドの発現
タンパク質産生方法については実施例8を参照のこと。表12、図3および図4に結果を示す。
タンパク質の大規模な産生のために、封入体は、主に高い発現レベル、単純な回収工程および高純度、プロテアーゼ耐性、ならびに良好なプロセス安定性を含む、その良好なアップスケーリング特性に主に起因して、通常、良好な選択肢とみなされる。
N末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドの半減期を増加させるために、部位特異的変異によって導入されたシステインによって媒介されるアルキル化を通して、長期化のために使用される異なる脂肪酸鎖をN末端延長部に結合させた。Cys変異の位置を体系的にマッピングし、得られたN末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドを実施例8に記載の方法に従ってリフォールディングし、精製した。
合計20個の異なるシステイン変異体をPCR法を使用した部位特異的変異によって生成し、構築を表15にリストする。
野生型MIC-1ホモ二量体は合計で9対のジスルフィド結合を含有し、かつ理論的には、新しいシステインを導入することにより、ジスルフィド結合のスクランブリング(scrambling)によって元のジスルフィド結合マッチングが壊され、これによリフォールディング収率がさらに減少する可能性がある。本発明者らの実験において、リストするこれらのCys変異体が、野生型MIC-1のリフォールディングのために使用された同一のリフォールディング緩衝液中で試験され、そして記載される野生型MIC-1または溶解度操作されたN末端延長部を有するMIC-1ポリペプチドと同様のリフォールディング収率(約50%~60%)を示したことは驚くべきことである。
pH依存性溶解度および最大溶解度を実施例4に記載したものと同じ方法によって決定した。表16および表17に結果を示す。
実施例10.1:17-[(S)-1-カルボキシ-3-(2-{2-[(2-{2-[(4-ホルミルベンジルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)-メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸の調製
t-Bu-N-(4-ホルミルベンジル)カルバメート(100mg)をTFA/DCM(1:1)で1時間処理した。混合物を真空中で濃縮し、トルエンを用いて共濃縮した(2回)。残渣をTHF(2.5ml)中に溶解し、THF(5mL)中の17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ヘプタデカン酸(320mg、国際特許公開公報第2009/083549号に以前に記載されるように調製した)の溶液を添加した。DIPEA(0.5mL)をゆっくりと添加した。130分後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をEtOAcおよび1NのHClに溶解した。有機層を1NのHClおよび食塩水で抽出した。有機層を乾燥し(Na2SO4)、真空中で濃縮して、表題化合物を白色固体として得て、これをさらに精製することなく使用した。
収率:234mg(72%)
LCMS2:理論的質量:851.0、実測値:851.5(M+1)+
固相合成プロトコル:
ジクロロメタン(500Ml)中のN-(ベンジルオキシカルボニルオキシ)スクシンイミド(ZOSu、100g、401mmol)の溶液を、ジクロロメタン(750Ml)中のエチレンジアミン(1、189mL、2.81mol)の溶液に2時間にわたって滴下して添加した。30分後、懸濁液を濾過し、固体をジクロロメタンで洗浄した。濾液を蒸発乾固し、残渣をトルエン(1.00L)および水(0.50L)で希釈した。得られた混合物を濾過し、濾液を分離して2相を得た。水相は生成物を含有し、したがって、これをジクロロメタン(2×250mL)で抽出した。すべての有機相を組み合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をトルエン(750mL)で希釈し、2Mの塩酸水溶液(500mL)および1Mの塩酸水溶液(100mL)で抽出した。酸性の水相を組み合わせ、水(90mL)中の水酸化ナトリウム(60.0g、1.50mol)の溶液で塩基性化した。得られた混合物をジクロロメタン(4×200mL)で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空中で濃縮し、ヘキサン(200mL)で希釈した。エーテル中の4Mの塩化水素溶液(100mL、400mmol)をその溶液に添加し、得られた懸濁液を真空中で濃縮し、ヘキサン(1.00L)で希釈した。沈殿した固体を濾過し、ヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥して、(2-アミノ-エチル)-カルバミン酸ベンジルエステル塩酸塩を白色の粉末として得た。
収率:62.62g(68%)。
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール4:1):0.25(遊離塩基)。
1H NMRスペクトル(300MHz,AcOD-d4,80℃,dH):7.42-7.26(m,5H);5.16(s,2H);3.60(t,J=5.7Hz,2H);3.32(t,J=5.7Hz,2H)。
2-クロロトリチル樹脂100~200メッシュ、1.7mmol/g(3,40.1g、68.1mmol)を、乾燥ジクロロメタン(250mL)中に20分間放置して膨潤させた。乾燥ジクロロメタン(50mL)中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-Ado-OH、17.5g、45.4mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(30.1mL、173mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を5時間振盪した。樹脂を濾過し、メタノール/ジクロロメタン混合物(4:1、250mL、2×5分)中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(15.8mL、90.8mmol)の溶液で処理した。次いで樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×250mL)、ジクロロメタン(2×250mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)で洗浄した。ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×10分、1×30分、3×250mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)、2-プロパノール(2×250mL)、およびジクロロメタン(300mL、2×250mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(140mL)中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-Ado-OH、26.3g、68.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、24.2g、68.1mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(21.4mL、123mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×250mL)、ジクロロメタン(2×250mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(250mL)で洗浄した。ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×10分、1×30分、3×250mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)、2-プロパノール(2×250mL)、およびジクロロメタン(300mL、2×250mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(140mL)中の(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタンジオン酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu-OtBu、29.0g、68.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、24.2g,68.1mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(21.4mL,123mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×250mL)、ジクロロメタン(2×250mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(250mL)で洗浄した。ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジンで処理(1×5分、1×10分、1×30分、3×250mL)することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)、2-プロパノール(2×250mL)、およびジクロロメタン(300mL、2×250mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド/ジクロロメタン混合物(4:1、200mL)中の16-(tert-ブトキシ)-16-オキソヘキサデカン酸(23.3g、68.1mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、24.2g、68.1mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(21.4mL、123mmol)の溶液を樹脂に添加した。樹脂を1時間振盪し、濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(3×250mL)、ジクロロメタン(2×250mL)、メタノール(2×250mL)、およびジクロロメタン(350、6×250mL)で洗浄した。2,2,2-トリフルオロエタノール(250mL)で18時間処理することによって、生成物を樹脂から切断した。樹脂を濾過して取り除き、ジクロロメタン(2×250mL)、2-プロパノール/ジクロロメタン混合物(1:1、2×250mL)、2-プロパノール(250mL)、およびジクロロメタン(3×250mL)で洗浄した。溶液を組み合わせ、溶媒を蒸発し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲルl60、0.040~0.060mm、溶出液:ジクロロメタン/メタノール1:0~9:1)により精製した。純粋な(S)-22-(tert-ブトキシカルボニル)-41,41-ジメチル-10,19,24,39-テトラオキソ-3,6,12,15,40-ペンタオキサ-9,18,23-トリアザドテトラコンタン酸を真空中で乾燥し、淡黄色の濃黄色の油状物として得た。
収率:30.88g(83%)。
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール4:1):0.30。
1H NMRスペクトル(300MHz,CDCl3,dH):7.36(t,J=5.7Hz,1H);7.02(t,J=5.4Hz,1H);6.55(d,J=7.7Hz,1H);4.46(m,1H);4.18(s,2H);4.02(s,2H);3.83-3.36(m,16H);2.44-2.12(m,7H);2.02-1.86(m,1H);1.60(m,4H);1.47(s,9H);1.45(s,9H);1.36-1.21(m,20H)。
LC-MS法4:
純度:100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm、アセトニトリル/水50:50~100:0+0.1%FA):3.60分
実測値m/z、z=1:818.7(M+H)+
その後、2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオホスフェート(HATU、11.4g、30.1mmol)およびトリエチルアミン(8.77mL、62.9mmol)を、乾燥ジクロロメタン(110mL)中の(S)-22-(tert-ブトキシカルボニル)-41,41-ジメチル-10,19,24,39-テトラオキソ-3,6,12,15,40-ペンタオキサ-9,18,23-トリアザドテトラコンタン酸(22.4g、27.4mmol)の溶液に添加した。トリエチルアミン(5.72mL、41.0mmol)を乾燥ジクロロメタン(165mL)中の(2-アミノ-エチル)-カルバミン酸ベンジルエステル塩酸塩(6.94g、30.1mmol)の懸濁液に添加し、得られた混合物を上記溶液に添加した。混合物を室温で一晩攪拌し、次いでこれを蒸発乾固した残渣を酢酸エチル(500mL)中に再溶解し、1M塩酸水溶液(2×200mL)、5%炭酸ナトリウム水溶液(2×200mL、非常に遅い相分離)、1M塩酸水溶液(8×200mL)および食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空中で蒸発乾固した。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040~0.060mm、溶出液:ジクロロメタン/メタノール95:5)により精製して、15-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-ベンジルオキシカルボニルアミノ-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-1-tert-ブトキシカルボニル]-プロピルカルバモイル]ペンタデカン酸tert-ブチルエステルを淡黄色の濃い油状物として得た
収率:23.84g(88%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール9:1):0.35
1H NMR スペクトル(300MHz,CDCl3、Dh):7.39-7.26(m、6H);7.19(t、J=6.3Hz、1H);6.91(t、J=5.7Hz、1H);6.52(d,J=7.5Hz,1H);5.83(t,J=5.5Hz,1H);5.09(s,2H)4.41(ddd,J=12.3、4.6および4.3Hz, 1 H);3.99(s,2H);3.97(s,2H);3.71-3.30(m,20H);2.33-2.08(m,7H);1.97-1.83(m,1H);1.67-1.51(m,4H);1.45(s,9H);1.44(s,9H);1.35-1.20(m、20H)。
LCMS法4
純度:100%
Rt(Kinetex 4.6×50mm、アセトニトリル/水50:50~100:0+0.1%FA):4.18分
実測値m/z、z=1:994.9(M+H)+
パラジウム炭素(10%、1.27g、1.20mmol)をメタノール(350mL)中の上記化合物(23.8g、24.0mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を常圧で4時間水素化した。触媒を濾過して取り除き、濾液を蒸発乾固したメタノールの残渣を除去するために残渣をジクロロメタンから数回蒸発させ、真空中で乾燥して、tert-ブチル(S)-1-アミノ-25-(tert-ブトキシカルボニル)-4,13,22,27-テトラオキソ-6,9,15,18-テトラオキサ-3,12,21,26-テトラアザドテトラコンタン-42-オエートを濃い無色の油状物として得た。
収率:20.50g(99%)。
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール9:1)0.05.
1H NMRスペクトル(300MHz,CDCl3,dH):7.54(t,J=5.7Hz,1H);7.41(t,J=5.6Hz,1H);7.14(t,J=5.5Hz,1H);6.68(d,J=7.5Hz,1H);5.25(bs,2H);4.39(td,J=8.3および4.2Hz,1H);4.01(s,4H);3.74-3.39(m,18H);2.96(t,J=5.7Hz,2H);2.34-2.06(m,7H);1.97-1.83(m,1H);1.68-1.50(m,4H);1.45(s,9H);1.43(s,9H);1.37-1.19(m,20H)。
LCMS法4
純度:100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm、アセトニトリル/水50:50~100:0+0.1%FA):1.43分
実測値m/z、z=1:860.8(M+H)+
N,N-ジイソプロピルエチルアミン(4.98mL、28.6mmol)を、乾燥ジクロロメタン(290mL)中の上記アミン(6、20.5g、23.8mmol)の溶液にアルゴン下で-30℃で添加した。臭化ブロモアセチル(2.48mL、28.6mmol)を滴下して添加し、得られた溶液を-30℃でさらに3時間攪拌した。冷浴を取り除き、混合物を室温で1時間攪拌し、次いで溶媒を真空中で除去した。残渣を酢酸エチル(450mL)中に再溶解し、5%クエン酸水溶液(300mL)で洗浄した。相は1時間以内に分離された。有機層を水(300mL)で洗浄し、得られた乳濁液を一晩分離して放置し、3相を得た。透明な水層を除去し、残りの2相を、臭化カリウム(100mL)の飽和水溶液とともに振盪し、添加した。これらの相を一晩分離して放置し、次いで水相を除去し、そして有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空中で除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60、0.040~0.060mm、溶出液:ジクロロメタン/メタノール95:5)により精製して、tert-ブチル(S)-1-ブロモ-28-(tert-ブトキシカルボニル)-2,7,16,25,30-ペンタオキソ-9,12,18,21-テトラオキサ-3,6,15,24,29-ペンタアザペンタテトラコンタン-45-オエートを無色の固体として得た。
収率:19.46g(83%)。
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール9:1):0.25
1H NMRスペクトル(300MHz,CDCl3,dH):7.46(m,1H);7.33(t,J=5.9Hz,1H);7.21(t,J=5.1Hz,1H);6.92(t,J=5.2Hz,1H);6.50(d,J=7.5Hz,1H);4.41(ddd,J=12.2,4.5および4.2Hz,1H);4.01(s,4H),3.85(s,2H);3.75-3.40(m,20H),2.36-2.08(m,7H);1.99-1.84(m,1H);1.68-1.51(m,4H),1.46(s,9H);1.44(s,9H);1.38-1.19(m,20H)。
LCMS法4
純度:100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm、アセトニトリル/水50:50~100:0+0.1%FA):3.51分。
実測値:m/z、z=1:980.9、982.9(M+H)+
上記化合物(19.5g、19.8mmol)をトリフルオロ酢酸(120mL)中に溶解し、得られた溶液を室温で1.5時間攪拌した。トリフルオロ酢酸を真空中で除去し、残渣をジクロロメタン(6×200mL)から蒸発させた。ジエチルエーテル(200mL)を油状の残渣に添加し、混合物を一晩攪拌して懸濁液を得た。固体生成物を濾過し、ジエチルエーテルおよびヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥して、表題生成物15-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸を白色粉末として得た。
収率:16.74g(97%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,AcOD-d4,dH):4.61(dd,J=8.8および4.8Hz,1H);4.12(s,2H),4.10(s,2H);3.96(s,2H);3.77-3.39(m,20H),2.49-2.18(m,7H);2.16-1.04(m,1H);1.71-1.56(m,4H),1.30(bs,20H)
LCMS法4:
純度:100%
Rt(Kinetex 4.6mm×50mm、アセトニトリル/水50:50~100:0+0.1%FA):3.51分
理論的m/z、z=1:869,8、実測値:m/z、z=1:868.7、870.7
13-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ブロモアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}トリデカン酸を実施例10.2に記載したのと同じ方法によって調製し、濃黄色の油状物を得た。
1H NMRスペクトル(300MHz,AcOD-d4,dH):4.61(dd,J=8.9および4.9Hz,1H);4.13(s,2H);4.11(s,2H);3.96(s,2H);3.77-3.40(m,20H);2.49-2.18(m,7H);2.16-2.07(m,1H);1.70-1.56(m,4H);1.31(bs,16H)。
LCMS法4:
純度:100%(ELSD)
Rt(Kinetex、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):2.94分
理論的m/z、z=1:841.9、実測値:m/z、z=1:841.7,843.7
18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸の調製
溶液相合成プロトコル:
工程1:ベンジル18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アミノエチルアミノ)-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-ベンジルオキシカルボニル-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカノエート。0℃のDCM(80ml)およびトリエチルアミン(5.2ml)中のエチレンジアミン(8.5ml ml)の溶液に、DCM(320ml)中に、国際特許公開公報第10029159号に記載のように調製したベンジル18-[[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカノエート(26g)の溶液を75分間にわたって滴下して添加した。2時間攪拌した後、沈殿物を濾過して取り除いた。濾液に水(200ml)およびイソプロパノール(50ml)を添加した。混合物を抽出した。有機層をMgSO4を使用して乾燥した。MGSO4を濾過により除去し、濾液を真空中で乾燥して、表題化合物20.07g(81%)を得た。
LCMS:理論的質量:956.2;実測値m/z、z=1:957.0
工程2:ベンジル18-[[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカノエート。
クロロ酢酸(0.19g)をDCM(15mL)中に溶解した。N-ヒドロキシスクシンイミド(0.22g)およびEDAC HCl(0.42g)を添加した。2.5時間攪拌した後、DCM(5mL)中のベンジル18-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-アミノエチルアミノ)-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-ベンジルオキシカルボニル-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカノエート(1.5g)を添加した。室温(RT)で一晩攪拌した後、混合物を1MのHCl(2×20ml)および水/食塩水2:1(30ml)で抽出した。有機層を乾燥し(MgSO4)、濾過し、真空中で濃縮して、透明な油状物1.37g(84%)を得た。
LCMS:理論的質量:1032.7;実測値m/z、z=1:1033.1
工程3:18-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸。
窒素通気後、アセトン(140ml)中のベンジル18-[[(1S)-1-ベンジルオキシカルボニル-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカノエート(10.5g)の溶液に10%のPD/C(1.0g)を添加した。6時間水素化した後、混合物を40~50℃に加熱した後に濾過した冷えた濾液中の沈殿物を単離し、アセトンで洗浄し、乾燥して、表題化合物7.42g(85%)を得た。
工程4:8-[[(1S)-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-1-カルボキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸。
アセトン(60ml)中の18-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(2-クロロアセチル)アミノ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸の懸濁液に臭化ナトリウム(5当量、1.21g)を添加した。混合物を暗所で室温で攪拌した。2時間後、臭化ナトリウム(10当量、2.41g)をさらに添加した。2日後、臭化ナトリウム(5当量、1.21g)をさらに添加した。5日後、混合物を濃縮した。半分の残渣にDCM(30ml)、10%アスコルビン酸(20ml)、および水30mlを添加した。乳濁液にイソプロパノール(50ml)および水(30ml)を添加した。有機相を分離し、10%アスコルビン酸(20mL)およびイソプロパノール(10mL)の混合物で二回洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO4)、濾過し、濃縮して、固形油を得た。これをアセトン中で結晶化し、濾過により単離して、出発材料が混ざっている表題化合物0.80g(72%)を得た。
LCMS:理論的質量:896.9.実測値m/z、z=1:898.9(M+1)
化合物を、例えば10.1に記載のものと同じ方法で調製した。
1H NMRスペクトル(300MHz,CDCl3,dH):7.39-7.29(m,1H);7.03-6.93(m,1H);6.59-6.51(m,1H);4.49-4.37(m,1H);4.15(s,2H);4.01(s,2H);3.78-3.39(m,16H);2.36-2.10(m,7H);2.01-1.85(m,1H);1.68-1.50(m,4H);1.48-1.41(m,18H);1.34-1.22(m,12H)。
2-クロロトリチル樹脂100~200メッシュ、1.5mmol/g(18.0g、27.0mmol)を、乾燥ジクロロメタン(160mL)中に20分間放置して膨潤させた。乾燥ジクロロメタン(100mL)中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH,6.94g、18.0mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(12.5mL、72.0mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、メタノール/ジクロロメタン混合物(4:1、2×5分、2×100mL)中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(4.12mL、23.7mmol)の溶液で処理した。次いで、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×100mL)、ジクロロメタン(2×100mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×100mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×30分、2×100mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×100mL))、2-プロパノール(2×100mL)、およびジクロロメタン(3×100mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、10.4g、27.0mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、9.60g、27.0mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(8.50mL、48.6mmolの溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×100mL)、ジクロロメタン(2×100mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×100mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×30分、2×100mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×100mL))、2-プロパノール(2×100mL)、およびジクロロメタン(3×100mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中の(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-gGlu-OtBu、11.5g、27.0mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、9.60g、27.0mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(8.50mL、48.6mmolの溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×100mL)、ジクロロメタン(2×100mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(2×100mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×30分、2×100mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂(2)をN,N-ジメチルホルムアミド(3×100mL)、2-プロパノール(2×100mL)、およびジクロロメタン(3×100mL)で洗浄した。樹脂を4等分に分け、元の量(4.50mmol)の4分の1でこの合成を継続した。ジメチルスルホキシド(180mL)中の16-スルホ-ヘキサデカン酸(3、6.16g、17.2mmol、調製は化合物REaD-22296、バッチ番号195-257-1の合成の手順に記載されている)、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP、8.95g、17.2mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(6.00mL、34.0mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を4時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×100mL)、N,N-ジメチルホルムアミド/水(2:1、2×100mL)、ジメチルスルホキシド(2×100mL)、水(2×100mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×100mL)で洗浄した。1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(80mL)で2時間処理することによって、生成物を樹脂から切断した。
樹脂を濾過して取り除き、ジクロロメタン(4×100mL)で洗浄した。溶液を組み合わせ、揮発物を蒸発させ、粗製の(S)-22-(tert-ブトキシカルボニル)-10,19,24-トリオキソ-39-スルホ-3,6,12,15-テトラオキサ-9,18,23-トリアザノナトリアコンタン酸(4)をさらに精製することなく次の工程に使用した。
収率:定量的(ELSDに基づく)。
LC-MS純度:96%。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×100mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):3.07分。
LC-MS m/z:812.9(M+H)+。
収率:定量的(ELSDに基づく)。
LC-MS純度:83%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):3.35分。
LC-MS m/z:989.1(M+H)+。
収率:1.95g(45%、1から)。
LC-MS純度:98%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):2.87分。
LC-MS m/z:854.7(M+H)+。
収率:定量的(ELSDに基づく)。
LC-MS純度:95%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):3.04分。
LC-MS m/z:976.9(M+H)+。
収率:1.92g(2工程で98%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,AcOD-d4,80 C,dH):4.68-4.58(m,1H);4.20-4.08(m,4H);3.94(s,2H);3.82-3.64(m,12H);3.60-3.46(m,8H);3.20-3.10(m,2H);2.51(t,J=7.2Hz,2H);2.37(t,J=7.3Hz,2H);2.26(bs,1H);1.92-1.80(m,2H);1.73-1.62(m,2H);1.55-1.44(m,2H);1.43-1.29(m,21H)。
LC-MS純度:95%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):2.73分。
LC-MS m/z:920.9(M+H)+。
Wang Fmoc-Lys(Mtt)樹脂0.29mmol/g(17.24g、5.0mmol)をDMF(60mL)中に7×5分間放置して膨潤させ、洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(2×60mL、2×15分)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(6×60mL)で洗浄した。Fmoc-OEG-OHを、二つの反応のために量り分けた(2x20mmol 15.416g)。Oxyma(0.3M)を含む120mLのDMF中に溶解し、2×53mLの体積に分けた。DMF中のFmoc-OEG-OHおよびOxymaの溶液(53.2mL、0.3M)をDMF中のDIC(26.6mL、0.6M)と混合した。AAを10分間にわたって活性化し、次いで樹脂に添加し、混合物を8時間振盪した。
LC-MS m/z:1026.39(M+H)+。
2-クロロトリチル樹脂100~200メッシュ、1.5mmol/g(1,2.70g、4.05mmol)を、乾燥ジクロロメタン(40mL)中に30分間放置して膨潤させた。乾燥ジクロロメタン(40mL)中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、1.04g、2.70mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.82mL、10.3mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、メタノール/ジクロロメタン混合物(4:1、2×5分、2×40mL)中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.94mL、5.40mmol)の溶液で処理した。次いで樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、ジクロロメタン(4×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×10分、1×30分、2×40mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)、2-プロパノール(2×40mL)、ジクロロメタン(3×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(40mL)中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、3.18g、8.20mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、2.93g、8.20mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.87mL、16.4mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、ジクロロメタン(4×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×10分、1×30分、2×40mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)、2-プロパノール(2×40mL)、ジクロロメタン(3×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(40mL)中の(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-L-Glu-OtBu、3.50g、8.20mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、2.93g、8.20mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.87mL、16.4mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、ジクロロメタン(4×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×10分、1×30分、2×40mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)、2-プロパノール(2×40mL)、ジクロロメタン(3×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(40mL)中の10-(4-(tert-ブトキシカルボニル)フェノキシ)デカン酸(CNB、3.00g、8.20mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、2.93g、8.20mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.87mL、16.4mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、ジクロロメタン(4×40mL)、N,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、およびジクロロメタン(10×40mL)で洗浄した。
収率:2.26g(100%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,CDCl3,dH):7.95-7.87(m,2H);7.41-7.32(m,1H);7.05-6.95(m,1H);6.92-6.82(m,2H);6.61(d,J=7.7Hz,1H);4.49-4.37(m,1H);4.15(s,2H);4.04-3.95(m,4H);3.76-3.36(m,17H);2.39-2.09(m,5H);2.04-1.85(m,1H);1.84-1.70(m,2H);1.67-1.52(m,10H);1.50-1.39(m,11H);1.37-1.24(m,8H)。
LC-MS純度:100%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水50:50~100:0+0.1%FA):4.49分。
LC-MS m/z:841.2(M+H)+。
収率:1.33g(100%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,DMSO-d6+DCl,dH):7.93-7.76(m,2H);7.05-6.89(m,2H);4.16-4.05(m,3H);4.05-3.93(m,2H);3.93-3.79(m,5H);3.60-3.48(m,9H);3.46-3.32(m,4H);3.30-3.21(m,2H);3.21-3.12(m,2H);3.10-3.00(m,2H);2.19-1.77(m,6H);1.77-1.49(m,7H);1.48-1.22(m,12H)。
LC-MS純度:95%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):3.02分。
LC-MS m/z:977.3(M+H)+。
2-クロロトリチルクロリド樹脂100~200メッシュ、1.5mmol/g(2.60g、3.90mmol)を、乾燥ジクロロメタン(40mL)中に30分間放置して膨潤させた。乾燥ジクロロメタン(40mL)中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、1.02g、2.60mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.75mL、10.0mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、メタノール/ジクロロメタン混合物(4:1、2×5分、2×40mL)中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.90mL、5.20mmol)の溶液で処理した。次いで樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、ジクロロメタン(4×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×10分、1×30分、2×40mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)、2-プロパノール(2×40mL)、ジクロロメタン(3×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(40mL)中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、3.06g、7.90mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、2.82g、7.90mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.76mL、15.0mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、ジクロロメタン(4×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×10分、1×30分、2×40mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)、2-プロパノール(2×40mL)、ジクロロメタン(3×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(40mL)中の(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-L-Glu-OtBu、3.40g、7.90mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、2.82g、7.90mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.76mL、15.0mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、ジクロロメタン(4×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×10分、1×30分、2×40mL)で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)、2-プロパノール(2×40mL)、ジクロロメタン(3×40mL)、およびN,N-ジメチルホルムアミド(3×40mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(40mL)中の12-(4-(tert-ブトキシカルボニル)フェノキシ)ドデカン酸(CUB、3.12g、7.90mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、2.82g、7.90mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.76mL、15.0mmol)の溶液を樹脂に添加し、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、ジクロロメタン(4×40mL)、N,N-ジメチルホルムアミド(4×40mL)、およびジクロロメタン(10×40mL)で洗浄した。
収率:1.93g(86%)。
LC-MS純度:100%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):4.88分。
LC-MS m/z:869.2(M+H)+。
収率:1.10g(99%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,DMSO-d6+DCl,dH):7.93-7.74(m,2H);7.06-6.86(m,2H);4.20-3.93(m,5H);3.92-3.78(m,6H);3.54(s,9H);3.46-2.94(m,12H);2.19-1.84(m,5H);1.81-1.52(m,6H);1.51-1.23(m,15H)。
LC-MS純度:97%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):3.20分。
LC-MS m/z:1005.3(M+H)+。
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCHCl、6.25g、32.6mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(70mL)中の16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカン酸(1、5.28g、16.3mmol)およびN-ヒドロキシコハク酸イミド(HOSu、3.75g、32.6mmol)の攪拌溶液に添加し、混合物を一晩攪拌した。反応混合物を1Mの塩酸(400mL)水溶液で希釈した。粗生成物を酢酸エチル(4×400mL)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下で除去した。2-プロパノール(100mL)を油状の残渣に添加し、沈殿した白色固体を濾過して取り除いた。純粋な生成物(2)を、2-プロパノール(70mL)から再結晶することにより白色の微結晶性固体として得た。
収率:4.73g(69%)。
RF(SiO2、酢酸エチル):0.35。
1H NMRスペクトル(300MHz,AcOD-d4,dH):3.02(t,J=7.7Hz,2H);2.86(s,4H);2.62(t,J=7.3Hz,2H);1.90-1.63(m,4H);1.30(bs,22H)。
収率:9.49g(99%、2当量のHFIPとの付加物に対して計数した)。
1H NMRスペクトル(300MHz,CDCl3,dH):7.72-7.64(m,1H);7.59-7.50(m,1H);4.00(s,2H);3.94(s,2H);3.94-3.85(m,1H);3.71-3.32(m,16H);2.56-2.45(m,2H);2.42-2.26(m,1H);2.16-2.02(m,1H);1.49(s,9H)。
収率:1.39g(22%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,DMSO-d6,dH):8.13-8.07(m,1H);8.01-7.93(m,1H);7.74-7.68(m,1H);4.11-3.99(m,1H);3.88(s,2H);3.82(s,2H);3.62-3.49(m,8H);3.49-3.37(m,4H);3.33-3.15(m,4H);2.73-2.65(m,2H);2.18-2.03(m,4H);1.94-1.81(m,1H);1.80-1.67(m,1H);1.66-1.53(m,2H);1.53-1.41(m,2H);1.38(s,9H);1.23(s,22H)。
収率:1.63g(97%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,AcOD-d4,dH):7.35(bs,5H);5.25-5.12(m,2H);4.50-4.42(m,1H);4.14(s,2H);4.09(s,2H);3.79-3.30(m,20H);3.02(t,J=7.6Hz,2H);2.46-2.27(m,4H);2.26-2.09(m,1H);2.05-1.92(m,1H);1.88-1.72(m,2H);1.72-1.53(m,2H);1.47(s,9H);1.29(bs,22H)。
収率:1.32g(94%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,AcOD-d4,dH):4.50-4.42(m,1H);4.16-4.10(m,4H);3.71-3.61(m,14H);3.59-3.51(m,2H);3.51-3.45(m,2H);3.40-3.32(m,2H);3.02(t,J=7.6Hz,2H);2.45-2.28(m,4H);2.27-2.12(m,1H);2.05-1.93(m,1H);1.89-1.74(m,2H);1.70-1.58(m,2H);1.47(s,9H);1.30(bs,22H)。
収率:210mg(15%)。
1H NMRスペクトル(300MHz,AcOD-d4,dH):4.64-4.56(m,1H);4.12(s,2H);4.10(s,2H);3.95(s,2H);3.77-3.59(m,12H);3.59-3.37(m,8H);3.02(t,J=7.6Hz,2H);2.44(t,J=7.8Hz,2H);2.34(t,J=8.0Hz,2H);2.28-2.18(m,1H);2.15-2.04(m,1H);1.86-1.70(m,2H);1.70-1.56(m,2H),1.29(bs,22H)。
LC-MS純度:100%。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:80~100:0+0.1%FA):3.35分。
LC-MS m/z:908.8(M+H)+。
実施例11.1:化合物01
SerA-32、GluA-31、ProA-30、S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1,des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
30mgのプロトラクター(実施例10.4、8当量)を1.5mLの飽和NaHCO3中に溶解し、PBS緩衝液(pH7.4、2.1mg/mL)中の108mgのN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号288)に添加した。19mgのビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン、カリウム塩二水和物、Sigma-Aldrich 698539(8当量)を添加した。室温で24時間静置後、タンパク質を10~50%エタノール/リン酸緩衝液pH3.0の勾配を使用してC4逆相カラム上で精製した。
精製後の収率約20%。
理論的質量:32006.3;実測値:32006.5。
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
N延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号291)を使用して実施例11.1に記載された手順を使用して、化合物02を調製した。
理論的質量:31974.3;実測値:31974.0
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.2に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号291)を使用して実施例11.1に記載された手順を使用して、化合物03を調製した。
理論的質量31918.2;実測値:31918.0.
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.3に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号291)を使用して実施例11.1に記載された手順を使用して、化合物04を調製した。
理論的質量:31862.1;実測値:31862.0。
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.4に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号289)を使用して実施例11.1に記載された手順を使用して、化合物05を調製した。
理論的質量:31962.2;実測値:31962.0.
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.4に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号303)を使用して実施例11.1に記載された手順を使用して、化合物06を調製した。
理論的質量:31902.1;実測値:31902.0
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.4に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号292)を使用して実施例11.1に記載された手順を使用して、化合物07を調製した。
理論的質量:31874.1;実測値:31873.0.
SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.4に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号293)を使用して実施例11.1に記載された手順を使用して、化合物08を調製した
理論的質量:31902.1;実測値:31901.0
化合物09:
N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物10:
N{A-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル,N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
2mLの40%ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンに溶解した20mgのプロトラクター(実施例10.1、8当量)を、40mLのPBS緩衝液(pH7.4)中で75mgのN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号164)に添加し、100μLのボランピリジン複合体(8M)を添加した。室温で24時間静置後、20mgのプロトラクターおよび100μLのボラン試薬を再度添加した。
48時間後、モノアルキル化およびジアルキル化タンパク質混合物を、10~50%エタノール/リン酸緩衝液pH3.0勾配を使用してC4逆相カラム上で精製した。精製後、約19%のモノアルキル化タンパク質(化合物09)および6%のジアルキル化タンパク質(化合物10)を得た。
化合物09:理論的質量:31073.0;実測値:31073.5
化合物10:理論的質量:31908.1;実測値:31908.5
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,LeuA86,LeuB57,LeuB86],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.4に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号290)を使用して実施例11.1に記載された手順を使用して、化合物11を調製した。
理論的質量:31934.1;実測値:31938.5。
化合物12:
N{A-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル,N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
化合物13:
N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
実施例10.1に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号311)を使用して実施例11.10に記載された手順を使用して、化合物12および13を調製した。
化合物12:理論的質量:28212.3;実測値:28211.9
化合物13:理論的質量:27377.2;実測値:27376.8
N{A-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル,N{B-9}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-GluA-9,GluA-8,AlaA-7,GluA-6,AlaA-5,AspA-4,AspA-3,AspA-2,AspA-1,GluB-9,GluB-8,AlaB-7,GluB-6,AlaB-5,AspB-4,AspB-3,AspB-2,AspB-1[LysA1,GluA2,SerA3,LysB1,GluB2,SerB3]-MIC-1
実施例10.5に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号311)を使用して実施例11.10に記載された手順を使用して、化合物14を調製した。
理論的質量:28043.9;実測値:28043.6。
化合物15:
N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,ArgA69,LeuA86,ArgA91,ArgA107,LeuB57,ArgB69,LeuB86,ArgB91,ArgB107],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
化合物16:
N{A-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル,N{B-32}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-SerA-32,GluA-31,ProA-30,AlaA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,AlaB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1[LeuA57,ArgA69,LeuA86,ArgA91,ArgA107,LeuB57,ArgB69,LeuB86,ArgB91,ArgB107],des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.1に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号312)を使用して実施例11.10に記載された手順を使用して、化合物15および16を調製した。
化合物15:理論的質量:31241.1;実測値:31242.0。
化合物16:理論的質量:32076.0;実測値:32075.0。
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
4mLの2Mトリス緩衝液を、15mMのクエン酸/450mMの塩化ナトリウム、pH3、2.2mg/mL中の176mgのN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号288)に添加した。実施例10.6に記載されたプロトラクターを、飽和炭酸水素ナトリウム中に溶解し、20mg/L、8当量とした。次いで、プロトラクターをポリペプチド溶液に添加した。水に溶解した12.4mgのビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン、カリウム塩二水和物、Sigma-Aldrich 698539(0.1mg/mL)を添加し、反応混合物を10秒間穏やかに振盪した。6時間後、10~50%エタノール/リン酸緩衝液pH3.0を使用して、C4逆相カラムを使用したC4カラム上で、化合物を精製した。
理論的質量:32050.3;実測値:32050.0。
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{ベータ}-[2-[[(5S)-5-カルボキシ-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘプタデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ペンチル]アミノ]-2-オキソエチル]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{ベータ}-[2-[[(5S)-5-カルボキシ-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[17-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘプタデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ペンチル]アミノ]-2-オキソエチル]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.7に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号288)を使用して実施例11.17に記載された手順を使用して、化合物18を調製した。
理論的質量:32266.6;実測値:32266.0。
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{ベータ}-[2-[[(1S)-1-カルボキシ-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ペンチル]アミノ]-2-オキソエチル]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{ベータ}-[2-[[(1S)-1-カルボキシ-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ペンチル]アミノ]-2-オキソエチル]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.8に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号288)を使用して実施例11.17に記載された手順を使用して、化合物19を調製した。
理論的質量:32166.3;実測値:32166.0。
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{ベータ}-[2-[[(1S)-1-カルボキシ-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ペンチル]アミノ]-2-オキソエチル]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{ベータ}-[2-[[(1S)-1-カルボキシ-5-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ペンチル]アミノ]-2-オキソエチル]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.9に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号288)を使用して実施例11.17に記載された手順を使用して、化合物20を調製した。
理論的質量:32222.4;実測値:32222.0。
SerA-32,GluA-31,ProA-30,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysA-29,ThrA-28,SerA-27,GlyA-26,SerA-25,GluA-24,ThrA-23,ProA-22,GlyA-21,ThrA-20,SerA-19,GluA-18,SerA-17,AlaA-16,ThrA-15,ProA-14,GluA-13,SerA-12,GlyA-11,ProA-10,GlyA-9,ThrA-8,SerA-7,ThrA-6,GluA-5,ProA-4,SerA-3,GluA-2,GlyA-1,SerB-32,GluB-31,ProB-30,S{ベータ}-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エチルアミノ]-2-オキソエチル]CysB-29,ThrB-28,SerB-27,GlyB-26,SerB-25,GluB-24,ThrB-23,ProB-22,GlyB-21,ThrB-20,SerB-19,GluB-18,SerB-17,AlaB-16,ThrB-15,ProB-14,GluB-13,SerB-12,GlyB-11,ProB-10,GlyB-9,ThrB-8,SerB-7,ThrB-6,GluB-5,ProB-4,SerB-3,GluB-2,GlyB-1des-AsnA3,AsnB3-MIC-1
実施例10.10に記載されたプロトラクターおよびN延長部を有するMIC-1ポリペプチド(配列番号288)を使用して実施例11.17に記載された手順を使用して、化合物21を調製した。
理論的質量:32026.3;実測値:32026.0。
化合物01~21の構造を表18に要約する。
MIC-1化合物の試料をPBS緩衝液(pH7.4)中で調製し、続いて、試料をより濃縮して35mg/ml超とした。
細胞株
安定細胞株BHK21-hGFRAL-IRES-hRETを、ルシフェラーゼレポーターの前に血清応答因子(SRE)を有するベクターを添加して、Novo Nordiskにおいて生成した(実施例5を参照のこと)。ヒトGFRALおよびヒトRETの配列をUniprot:UniProtKB-Q6UXV0(GFRAL_HUMAN)およびUniProtKB-P07949(RET_HUMAN)にて取得した。この細胞株を、機能性ルシフェラーゼアッセイならびにシンチレーション近接アッセイ(SPA)結合用の膜調製のために使用した。
凍結細胞を含むバイアルを急速に解凍し、この細胞を高グルコースおよびピルビン酸ナトリウムを含むDMEM、熱不活性化10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1mg/mlのG418-ジェネティシン(Geneticin)、および400μg/mlのハイグロマイシンからなる10mlの事前に温めた完全培地を含む50mlのコーニングチューブに移した。細胞を1200rpmで遠心分離し、上清を捨てた。この洗浄手順を1回反復して、細胞を2回洗浄する。細胞を完全培地中に再懸濁し、1.2×106細胞/mlの濃度とした。96ウェルのポリ-D-リジンで被覆したアッセイプレート中に、ウェルあたり1.2×105細胞(100μl/ウェル)で細胞を播種した。細胞を+34℃で4~6時間ウェルの底面に付着させ、続いて、培地を15mMのHEPESを含むRPMI培地からなる80μlの飢餓培地(starvation medium)に変えた。細胞を、5%CO2を有する加湿環境中で、+34℃にて一晩放置してインキュベートした。試験化合物を、5%のヒト血清アルブミン(HSA)を含むまたは含まない、RPMI、15mMのHEPES、および0.5%のオボアルブミンからなるアッセイ培地中で段階希釈した。試験化合物を含有する20μlのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、0.1%のオボアルブミン、1%のHSA、および30000pM~3pMの範囲の試験化合物の最終濃度(ブランクを含む)を得た。プレートを、5%のCO2を有する加湿環境中で、+37℃にて4時間インキュベートした。インキュベーション後、100μlのルシフェラーゼ基質溶液を各ウェルに添加し、密封した。プレートを15分間インキュベートし、続いて発光を読み取った。発光の強度測定値を、シグモイド用量応答曲線の非線形回帰分析によるEC50値の計算に使用した。
BHK21-hGFRAL-IRES-hRET細胞を、5%のCO2を有する加湿雰囲気中で、+37℃にて、高グルコースおよびピルビン酸ナトリウムを含むDMEM、熱不活性化した10%のウシ胎児血清、1%のペニシリン-ストレプトマイシン、1mg/mlのG418-ジェネティシン、および400ug/mlハイグロマイシンからなる完全培地中で培養した。細胞を、氷冷したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中で2回洗浄し、スクレイピング(scraping)によって機械的に分離し、氷冷したDPBS中で円錐状の遠心分離用チューブの中へと移し、+20℃にて均質化1500rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを、10mlの合計量の氷冷した均質化緩衝液A(50mMトリス、2.5mMのEDTA、1個のEDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤/50mlでpH7.4に調整)に再懸濁し、20秒間均質化した。ホモジネートを+4℃にて16000rpmで20分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを10mlの均質化緩衝液B(50mMトリス、320mMのスクロース、1個のEDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤/50mlでpH7.4に調整)中で再構成し、20秒間均質化し、+4℃にて16000rpmで20分間遠心分離した。この手順をもう一回反復した。上清を捨て、ペレットを3mlの均質化緩衝液B中で再構成し、低速で10秒間均質化した。タンパク質濃度を標準的なBradford法によって決定し、1.5mgタンパク質/チューブをでクライオチューブ(cryotube)中に等分し、-80℃で貯蔵した。結合アッセイを、白色の96ウェルプレート中で、1ウェルあたり200μlの総体積で実施した。小麦胚細胞凝集素SPAビーズをアッセイ緩衝液(50mMのトリス/HCl、4.5mMのMgCl2、0.02%のTween20、および0.25%のオボアルブミン、pH7.4)中で再構成し、膜調製物と混合して、1ウェルあたり0.5mgのSPAビーズおよび10μgの合計タンパク質の最終濃度を得た。1ウェルあたり1分あたり50000カウントの放射性リガンドヒト[125I]-MIC-1(Novo Nordiskにおいて生成された)を50pMの濃度に対応して添加した。試験されるMIC-1化合物をアッセイ緩衝液中で段階希釈し、1μM~1pMの範囲の最終アッセイ濃度を得た。プレートを密封し、350rpmで設定したプレート振盪機内で+22℃にて2時間インキュベートし、その後、1500rpmで10分間遠心分離した後、SPAビーズ発光を読み取った。放射性リガンドの変位をSPAビーズからの発光の減少として測定し、シグモイド用量-応答曲線の非線形回帰分析によってIC50値を計算した(表20)。
本発明のMIC-1化合物のインビボでの有効性を、9~11週齢の痩せた雄のSprague Dawleyラットで測定した。暗期間開始の1~2時間前に毎日、8nmol/kg体重の用量を動物に注射した。適切な緩衝溶液中の化合物を皮下(1~4ml/kg)投与した。自動食物モニタリングシステム(ラット用のBioDAQシステムおよびHM2システム)を使用して、食物摂取量の変化を7日間測定した。BioDAQシステムでは、動物は1匹で収容され、HM2システムでは、動物は1ケージあたり最大3匹の動物の群で収容された。8日目に、化合物の投与の2~3時間後に尾部血液試料を採取し、この試料を使用して投与化合物の血漿濃度を測定した。各化合物を、n=4~8匹の動物で試験した。動物を実験前に少なくとも7日間順化させた。収集した食物摂取量データは、各日の12時間の暗期間の開始から翌日の暗期間まで測定した1日の食物摂取量(24時間の食物摂取量)として表される。投与化合物に応答した食物摂取量の日ごとの変化は、処理群の1日の平均食物摂取量からビヒクル群の1日の平均食物摂取量を減算することによって算出した。スチューデントの両側t検定を使用して、p<0.1である場合に変化を有意とみなした。結果は、研究期間中に記録されたビヒクルと比較した(緩衝溶液、パーセント)食物摂取量の「最大減少」として表される。データは、研究期間中の食物摂取量の有意な(p<0.1)日ごとの減少の合計としての食物摂取量の「減少の累計」(パーセント)としても表される。較正された秤を使用して、動物の体重を試験終了日に測定した。体重における処理の効果を、研究終了時のビヒクル処理動物と比較した化合物処理動物の体重のパーセント差として計算した(表21)。
本実験の目的は、ブタにおける食物摂取量および体重に対するMIC-1化合物の効果を研究することであった。これは、ビヒクル処理対照群と比較して、MIC-1化合物の単回投与の1~21日後に食物摂取量を測定する、以下に記載する薬力学(PD)研究において行われた。
本研究の目的は、痩せたSprague Dawleyラットに静脈内および皮下投与した後のMIC-1化合物のインビボでの終末相半減期(T1/2)、平均滞留時間(MRT)、最大血漿レベルに対する時間(Tmax)、およびバイオアベイラビリティ(F)時間を決定することである。これは薬物動態(PK)研究において行われ、問題のMIC-1化合物のPKパラメータが決定された。T1/2は、一般に、静脈内投与での初期分布相(initial distribution phase)の後に測定される、ある特定の血漿濃度を半減するのにかかる時間期間を意味する。MRTは、一般に、問題の化合物が体内に滞留する平均時間の長さを意味する。Tmaxは、一般に、問題の化合物の皮下投与後の、問題の化合物が血漿中で最高濃度に達したときの時点を意味する。Fは、一般に、血漿中に存在する皮下投与化合物の割合を意味する。前述のPKパラメータは、化合物を尾静脈または頸部皮下組織のいずれかの中へと注射し、続いて曝露分析のために様々な時点で血漿試料の採取を行うことにより、300g~500gの痩せたSDラットにおいて測定された。化合物(4~5nmol/kg体重)を適切な緩衝溶液中で静脈内投与した(1ml/kg)。静脈内群の群の大きさは典型的には4であり、皮下群の群の大きさは典型的には5であった。ラットは全実験の間は目覚めており、食物および水を摂ることができた。
本研究の目的は、ミニブタへの静脈内投与後のMIC-1化合物のインビボでの長期化、すなわち体内での該化合物の時間の長期化、およびそれによる該化合物の作用時間の延長を決定することであった。これは薬物動態(PK)研究において行われ、問題の化合物の終末相半減期が決定された。終末相半減期は、終末消失相においてある特定の血漿濃度を半減するのにかかる時間を意味する。
以下の結果が得られた(表25)。
Claims (27)
- MIC-1ポリペプチドと、
前記MIC-1ポリペプチドのN末端に結合されたアミノ酸延長部と、
前記アミノ酸延長部に結合されたプロトラクターと、を含むMIC-1化合物であって、
前記アミノ酸延長部が、30~36個のアミノ酸残基を含み、
前記アミノ酸延長部が、
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号223)、
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号224)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号225)、
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号226)、
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号227)、
SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号229)、
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号230)、
SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号231)、
SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号232)、
SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号233)、
SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG(配列番号234)、
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG(配列番号235)、
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG(配列番号236)、および
SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG(配列番号237)からなる群から選択される配列を含み、
前記Cys残基と前記MIC-1ポリペプチドの前記N末端アミノ酸との間の距離が、少なくとも3個のアミノ酸であり、
前記プロトラクターが、前記Cys残基において前記アミノ酸延長部に結合され、
前記プロトラクターが、Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4を含み、
Chem.1が、
Chem.1A: HOOC-(CH2)x-CO-*、
Chem.1B: HO-S(=O)2-(CH2)x-CO-*
Chem.1C: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)y-CO-*、および
Chem.1D: (1H-テトラゾール-5-イル)-(CH2)x-CO-*からなる群から選択され、
式中、xは、12~20の範囲の整数であり、かつ
式中、yは、5~15の範囲の整数であり、
Chem.2が、
Chem.2A:*-(NH-CH(COOH)-(CH2)m-CO)k*および
Chem.2B:*-(NH-S(=O)2-(CH2)m-CO)k*からなる群から選択され、
式中、Chem.2のmは、1~5の範囲の整数であり、かつ
式中、Chem.2のkは、0~4の範囲の整数であり、
Chem.3が、*(NH-(CH2)2-[O-(CH2)2]k-O-[CH2]n-CO-*)lであり、
式中、Chem.3のkは、1~10の範囲の整数であり、
式中、nは、1~5の範囲の整数であり、かつ
式中、lは、0~5の範囲の整数であり、
Chem.4が、
Chem.4A: *-NH-(CH2)m-NH-CO-CH2-*および
Chem.4B: *-NH-CH(COOH)-(CH2)m-NH-CO-CH2-*からなる群から選択され、
式中、Chem.4のmは、1~5の範囲の整数であり;
Chem.1、Chem.2、Chem.3、およびChem.4が、アミド結合を介して相互連結され、
Chem.4が、そのCH2-*末端において、前記アミノ酸延長部の前記Cys残基のイオウ原子に連結され、かつ
前記アミノ酸延長部を有する前記MIC-1ポリペプチドが、6.5より低いpI計算値を有する、MIC-1化合物。 - Chem.1が、
Chem.1a: HOOC-(CH2)16-CO-*、
Chem.1b: HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*、および
Chem.1c: HOOC-ベンゼン-O-(CH2)9-CO-*からなる群から選択される、請求項1に記載のMIC-1化合物。 - Chem.2が、
Chem.2a:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*および
Chem.2b:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*からなる群から選択される、請求項1に記載のMIC-1化合物。 - Chem.4が、
Chem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*および
Chem.4b:*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*からなる群から選択される、請求項1に記載のMIC-1化合物。 - Chem.1が、
Chem.1a:HOOC-(CH2)16-CO-*、
Chem.1b:HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*、および
Chem.1c:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)9-CO-*からなる群から選択され、
Chem.2が、
Chem.2a:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*および
Chem.2b:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*からなる群から選択され、
Chem.4が、
Chem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*および
Chem.4b:*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*からなる群から選択される、請求項1に記載のMIC-1化合物。 - 前記MIC-1ポリペプチドが、配列番号1と比較したとき、M57LおよびM86Lのうちの少なくとも一つを含む、請求項1に記載のMIC-1化合物。
- 前記MIC-1ポリペプチドが、配列番号1と比較したとき、最初の三つの残基の欠失またはN3の欠失を含む、請求項1に記載のMIC-1化合物。
- 前記MIC-1ポリペプチドが、配列番号1と比較したとき、(i)M57LおよびM86Lのうちの少なくとも一つ、ならびに(ii)最初の三つの残基の欠失またはN3の欠失を含む、請求項1に記載のMIC-1化合物。
- 前記MIC-1ポリペプチドと前記アミノ酸延長部との組み合わせが、配列番号288、配列番号289、配列番号290、配列番号291、および配列番号292からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のMIC-1化合物。
- 請求項1に記載のMIC-1化合物を含む、肥満を処置するための医薬組成物。
- Chem.1が、
Chem.1a:HOOC-(CH2)16-CO-*、
Chem.1b:HO-S(=O)2-(CH2)15-CO-*、および
Chem.1c:HOOC-ベンゼン-O-(CH2)9-CO-*からなる群から選択され、
Chem.2が、
Chem.2a:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*および
Chem.2b:*-NH-S(=O)2-(CH2)3-CO-*からなる群から選択され、かつ
Chem.4が、
Chem.4a:*-NH-(CH2)2-NH-CO-CH2-*および
Chem.4b:*-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-CO-CH2-*からなる群から選択される、請求項23に記載の医薬組成物。 - 前記アミノ酸延長部が、
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号223)、
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPS(配列番号224)、
SEPCTSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号225)、
SEPATCGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号226)、
SEPATSCSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号227)、
SEPACSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号229)、
SEPATSGCETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号230)、
SEPATSGSECPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号231)、
SEPATSGSETPCTSESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号232)、
SEPATSGSETPGTCESATPESGPGTSTEPSEG(配列番号233)、
SEPATSGSETPGTSECATPESGPGTSTEPSEG(配列番号234)、
SEPATSGSETPGTSESACPESGPGTSTEPSEG(配列番号235)、
SEPATSGSETPGTSESATPECGPGTSTEPSEG(配列番号236)、および
SEPATSGSETPGTSESATPESCPGTSTEPSEG(配列番号237)からなる群から選択される配列を含む、請求項23に記載の医薬組成物。 - 前記MIC-1ポリペプチドと前記アミノ酸延長部との組み合わせが、配列番号288、配列番号289、配列番号290、配列番号291、および配列番号292からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の医薬組成物。
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