JP7011327B2 - 植物ウイルスベクターを利用したゲノム編集植物の生産方法 - Google Patents
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Description
下記(a)および(b)の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入し、
(a)各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
(b)ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む
植物細胞内で、当該分割されたゲノム編集酵素の会合体とガイドRNAとを含む複合体を形成させ、当該複合体により部位特異的にゲノムを編集させることを含む方法。
下記(a)および(b)の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入し、
(a)各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む
(b)ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む
植物細胞内で、当該分割されたゲノム編集酵素の会合体とガイドRNAとを含む複合体を形成させ、当該複合体により部位特異的にゲノムを編集させ、当該植物細胞から植物体を再生させることを含む方法。
(b)ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを挿入するための部位を含む
(8)植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターの組み合わせを含む、(7)に記載のキット。
(b)ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含む
本発明における「ゲノム編集酵素」としては、ガイドRNAと複合体を形成し、部位特異的にゲノムを編集することが可能な酵素であれば特に制限はないが、代表的には、ヌクレアーゼ(典型的には、エンドヌクレアーゼ)である。エンドヌクレアーゼとしては、例えば、Cas9タンパク質やCpf1タンパク質が挙げられるが、これらに制限されない。その他、例えば、ヌクレアーゼ活性を一部または全部消失させたCas9タンパク質とデアミナーゼの融合タンパク質を利用することも考えられる。従って、本発明におけるゲノムの「編集」には、切断のみならず、脱アミノ化などのその他のゲノムの修飾、およびそれら修飾を介したゲノムの改変(例えば、変異導入)も含まれる。
(b)ウイルスベクターの少なくとも1つにガイドRNAをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを挿入するための部位を含む
キットには、一つまたは複数の追加の要素をさらに含んでもよい。追加の要素としては、例えば、細胞へのベクターの導入試薬、希釈緩衝液、洗浄緩衝液、培地、対照試薬(例えば、対照ベクター)などが挙げられるが、これらに制限されない。キットには、一般に、使用説明書が含まれる。
・供試植物:Nicotiana benthamiana、Nicotiana tabacum
・その他:カーボランダム(ナカライテスク)、KOD plus neo(TOYOBO)、DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(タカラバイオ)
[実施例1]
自己切断型リボザイムの作用によりガイドRNA(gRNA)の5'側が切断されるように、自己切断型リボザイムの3'側にgRNAが結合されているToMVベクターを構築した(図1a)。自己切断型リボザイムとしては、HamRz(CTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCGTAAGGAGTC/配列番号:3)を用い、その5'側には、gRNAの5'側と相補的な様々な鎖長の配列を配置した。構築したToMVベクターに対して試験管内転写(37℃で2.5時間)を行い、得られた転写産物であるウイルスRNAをアガロース電気泳動により展開した。その結果、リボザイムの5'側に配置した配列の違いにより、gRNAの5'側の切断効率が変化することが判明した(図1b)。
タバコのPDS遺伝子を標的としたgRNAをToMVベクターに挿入した。自己切断型リボザイムHamRzの5'側には、gRNAの5'側と相補的な様々な鎖長の配列を配置した(図2a;一部の配列には、gRNAの3'側と相補的でない塩基も導入した)。構築したToMVベクターに対して試験管内転写(37℃で2.5時間)を行い、得られた転写産物であるウイルスRNAをアガロース電気泳動により展開した。その結果、リボザイムの5'側に配置した配列の違いにより、gRNAの5'側の切断効率が変化することが判明した(図2b)。
以上の実施例1と2から、HamRzの5'側に配置したgRNAと相補的な配列における配列の長さや種類を調節し、gRNAとの塩基対形成効率を適度に保つことにより、ゲノム編集効率が格段に向上することが判明した(図1、2)。そこで、次に、分割されたCas9遺伝子が挿入されたベクターの構築を行った。
Staphylococcus aureusから単離されたSaCas9遺伝子(3159bp)をN末端側(2217bp,「N739」と称する)とC末端側(942bp,「C740」と称する)に分割した。それぞれをKOD plus neoを用いてクローニングし、それぞれpTLW3およびpP2C2Sのサブゲノミックプロモーター下流へ導入することでpTL-739N、pTL-740C、pPVX-739N、pPVX-740Cを作成した。さらにpTL-739N、pTL-740Cの分割Cas9下流には、上記のタバコPDS遺伝子をターゲットとしたgRNA配列を自己切断型リボザイムであるHamRzを介して結合した(pTL-739N-Rz5a、pTL-740C-Rz5a)。
制限酵素(ToMVはMluI、PVXはSpeI)で開環したプラスミドDNAをテンプレートにAmpliCap-MaxTM T7 High Yield Message Maker Kitを用いてウイルスRNAを合成した。合成したRNAを[TL-739N-Rz5a、PVX-740C]と[TL-740C-Rz5a、PVX-739N]の2通りの組み合わせで混合し、タバコ(Nicotiana benthamianあるいはNicotiana tabacum)葉(約4週齢、第5葉)にカーボランダムと共に擦り込むことで感染させた。
接種後12日目のNicotiana benthamiana葉をサンプルとして回収し、液体窒素にて凍結破砕後、500μLのDNAisoを用いてゲノムを抽出した。このゲノムを鋳型にして、gRNAの標的部位を含む約250bpの断片をPCRにて増幅した。次いでPCR反応液2μLを制限酵素BstNIにて消化し、CAPS解析を行った結果、いずれのウイルスの組み合わせでも標的部位のゲノム編集を確認することができた(図3)。
実施例3において、ウイルスベクターから分割されたSaCas9を発現させてゲノム編集を行う際、ウイルスゲノム中に挿入したリボザイムがgRNAの5′側を切断することにより、gRNAが供給されている。しかしながら、この場合でも、供給されるgRNAの3′側にはウイルス由来の配列が付加されている。そこで、本実施例では、gRNAの3′側で低効率で切断を生じさせるリボザイムをさらに配置することにより、ゲノム編集効率が変化するか否かを検討した。
実施例3では、ウイルスベクターから発現するゲノム編集酵素として、分割されたSaCas9を用いた。本実施例では、本技術の汎用性を裏付けるため、分割されたSpCas9を用いて同様に検証した。
・人工的に合成したリボザイム配列(HamRz)
配列番号:4
・Cas9標的配列が挿入されているLuc遺伝子
・挿入した配列
・Cas9標的配列
Claims (7)
- ゲノムが部位特異的に編集された植物細胞の生産方法であって、
下記(a)および(b)の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入し、植物細胞内で、当該分割されたゲノム編集酵素の会合体とガイドRNAとを含む複合体を形成させ、当該複合体に部位特異的にゲノムを編集させることを含む方法。
(a)各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。
(b)少なくとも1つのウイルスベクターが、5'末端および3'末端に自己切断型リボザイムが結合されたガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ウイルスベクターから5'末端および3'末端に自己切断型リボザイムが結合されたガイドRNAを含む転写産物が発現し、転写産物中の自己切断型リボザイムによるガイドRNAの5'側および3'側の少なくとも一方の切断が総転写産物に対して5~30%の割合で生じる。 - ゲノムが部位特異的に編集された植物の生産方法であって、
下記(a)および(b)の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを植物細胞に導入し、植物細胞内で、当該分割されたゲノム編集酵素の会合体とガイドRNAとを含む複合体を形成させ、当該複合体に部位特異的にゲノムを編集させ、当該植物細胞から植物体を再生させることを含む方法。
(a)各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。
(b)少なくとも1つのウイルスベクターが、5'末端および3'末端に自己切断型リボザイムが結合されたガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ウイルスベクターから5'末端および3'末端に自己切断型リボザイムが結合されたガイドRNAを含む転写産物が発現し、転写産物中の自己切断型リボザイムによるガイドRNAの5'側および3'側の少なくとも一方の切断が総転写産物に対して5~30%の割合で生じる。 - 植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターの組み合わせを含む、請求項1または2に記載の方法。
- ゲノム編集酵素がCas9タンパク質またはCpf1タンパク質である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から4のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、下記(a)および(b)の特徴を有する複数種の植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせを含むキット。
(a)各ウイルスベクターが分割されたゲノム編集酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。
(b)少なくとも1つのウイルスベクターが、5'末端および3'末端に自己切断型リボザイムが結合されたガイドRNAをコードするポリヌクレオチドを含み、当該ウイルスベクターから5'末端および3'末端に自己切断型リボザイムが結合されたガイドRNAを含む転写産物が発現し、転写産物中の自己切断型リボザイムによるガイドRNAの5'側および3'側の少なくとも一方の切断が総転写産物に対して5~30%の割合で生じる。 - 植物一本鎖プラス鎖RNAウイルスベクターの組み合わせが、トバモウイルス属ウイルスベクターとポテックスウイルス属ウイルスベクターの組み合わせを含む、請求項5に記載のキット。
- ゲノム編集酵素がCas9タンパク質またはCpf1タンパク質である、請求項5または6に記載のキット。
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