JP7008688B2 - アッセイ - Google Patents
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Description
a)目的の結合部位と目的の結合部位内またはその近傍にあるチオール基とを含む標的分子を提供する工程;
b)反応混合物中で標的分子をリガンド候補と接触させる工程、ここで、リガンド候補は、チオール基と不可逆的な共有結合を形成することができる官能基を含む、工程;
c)標的分子のチオール基とリガンド候補の官能基との間で不可逆的な共有結合を形成させ、それによって標的分子-リガンドコンジュゲートを形成させる工程;
d)反応中の定義された時点で反応混合物またはそのアリコートをチオール定量化試薬と接触させる工程、ここで、チオール定量化試薬は、遊離チオール基に結合して、反応混合物またはそのアリコートに生物物理学的方法によって評価可能な生物物理学的性質を付与する定量化コンジュゲートを形成することができる、工程;
e)反応混合物またはそのアリコートの生物物理学的性質を測定する工程;ならびに
f)標的分子とリガンド候補との間の反応速度を計算する工程;を含む方法を提供する。
a)目的の結合部位と目的の結合部位内またはその近傍にあるチオール基とを含む標的分子を提供する工程;
b)反応混合物中で標的分子をリガンド候補と接触させる工程、ここで、リガンド候補は、チオール基と不可逆的な共有結合を形成することができる官能基を含む、工程;
c)標的分子のチオール基とリガンド候補の官能基との間で不可逆的な共有結合を形成させ、それによって標的分子-リガンドコンジュゲートを形成させる工程;
d)反応中の初めの時点で反応混合物のアリコートをチオール定量化試薬を含むクエンチプレートへ移す工程、ここで、チオール定量化試薬は、遊離チオール基に結合して、アリコートに生物物理学的方法によって評価可能な生物物理学的性質を付与する定量化コンジュゲートを形成することができる、工程;
e)そのアリコートの生物物理学的性質を測定する工程;ならびに
f)標的分子とリガンドとの間の反応速度を計算する工程;
ここで、工程d)およびe)はさらに1回以上繰り返され、この繰り返しの間、工程d)は反応中の1つ以上のさらなる異なる時点で実施される、工程;を含む。
1.T=0(標的分子-リガンドコンジュゲートが全く形成されていない場合)における生物物理学的性質の値が、リガンド候補が全く導入されていない場合(第1の態様による本方法の工程b)およびc)を省略した場合と等価)の生物物理学的性質に等しい;ならびに
2.標的分子が完全に標的分子-リガンドコンジュゲートに変換した場合の生物物理学的性質の値は、a)標的分子が全く導入されていない場合の生物物理学的性質に等しいか、またはb)ゼロに等しい、のいずれかである。
g)標的分子の代わりにモデルチオールを用いて工程a)~f)を繰り返し、同じリガンド候補を用いて、モデルチオールとリガンド候補との間の反応速度を計算する工程;ならびに
h)標的分子とリガンド候補との間の反応速度を、モデルチオールとリガンド候補との間の反応速度と比較することによって、リガンド候補についての速度増大を計算する工程;が含まれ得る。
i)リガンド候補についての速度増大が、選択された閾値レベルを上回るかどうかを決定する工程、ここで、この閾値レベルを上回る速度増大を伴うリガンド候補はヒットリガンドとして分類される、工程、を含み得る。
j)1つ以上のさらなるリガンド候補を用いて工程a)~f)を繰り返す工程、を含んでもよい。
j)候補リガンドについての解離定数を決定する工程、を含んでもよい。
a)目的の結合部位と目的の結合部位内またはその近傍にあるチオール基とを含む標的分子を提供する工程;
b)反応混合物中で標的分子をリガンド候補と接触させる工程、ここで、リガンド候補は、チオール基と不可逆的共有結合を形成することができる官能基を含む、工程;
c)標的分子のチオール基とリガンド候補の官能基との間で不可逆的な共有結合を形成させ、それによって標的分子-リガンドコンジュゲートを形成させる工程;
d)反応中の定義された時点で反応混合物またはそのアリコートをチオール定量化試薬と接触させる工程、ここで、チオール定量化試薬は、遊離チオール基に結合して、反応混合物またはそのアリコートに生物物理学的方法によって評価可能な生物物理学的性質を付与する定量化コンジュゲートを形成することができる、工程;
e)反応混合物またはそのアリコートの生物物理学的性質を測定する工程;
f)標的分子とリガンド候補との間の反応速度を計算する工程;
g)複数の異なる濃度のリガンド候補を用いて工程a)~f)を繰り返す工程;ならびに
h)標的分子とリガンド候補との間の解離定数を計算する工程;を含む方法を提供する。
k)ヒットリガンドを薬物または他の阻害剤に開発する工程、を含み得る。
-例えばX線結晶構造解析またはNMRによって、標的分子に結合したリガンドの構造を得る工程;
-標準的な医化学技術に従って行われるフラグメントを作製する工程;
-より高い親和性のリガンド候補を選択するためにヒットリガンドの類似体を使用して、本発明の第1の態様による方法を繰り返す工程;
-タンパク質修飾を確認し、修飾残基を同定するための、質量分析法またはNMRを使用する工程;
-例えばタンパク質阻害を確認するために、ヒットおよびその誘導体に対して他の生化学アッセイを並行して実施する工程(標的分子がCdk2の場合、これらの他の生化学アッセイは、サイクリン結合アッセイおよび/またはキナーゼ活性アッセイを含み得る)。
a)チオールを、該チオールと反応することができる分子と接触させて、反応混合物中に反応生成物を形成する工程;
b)反応中の定義された時点で反応混合物またはそのアリコートをチオール定量化試薬と接触させる工程、ここで、チオール定量化試薬は、遊離チオール基に結合して、反応混合物またはそのアリコートに生物物理学的方法によって評価可能な生物物理学的性質を付与する定量化コンジュゲートを形成することができる、工程;
c)反応混合物またはそのアリコートの生物物理学的性質を測定する工程;ならびに
d)チオールと、該チオールと反応することができる分子との間の反応速度を計算する工程;を含む方法を提供する。
a)チオールを、該チオールと反応することができる分子と接触させて、反応混合物中に反応生成物を形成する工程;
b)反応中の定義された時点で反応混合物のアリコートをチオール定量化試薬を含むクエンチプレートへ移す工程、ここで、チオール定量化試薬は、遊離チオール基に結合して、アリコートに生物物理学的方法によって評価可能な生物物理学的性質を付与する定量化コンジュゲートを形成することができる、工程;
c)そのアリコートの生物物理学的性質を測定する工程;ならびに
d)チオールと、該チオールと反応することができる分子との間の反応速度を計算する工程;
ここで、工程b)およびc)はさらに1回以上繰り返され、この繰り返しの間、工程b)は反応中の1つ以上のさらなる異なる時点で実施される、工程;を含む。
方法論:
標準的技法を用いてcDNAをpRSETA細菌発現ベクターにクローニングして、ポリヒスチジンタグ付きCdk2融合体を作成し、これをE.coliから精製することにより調製したa)ヒトサイクリン依存性キナーゼ2(Cdk2、1つの表面露出システイン残基-C177を含む)、ならびにb)モデルチオール(具体的な詳細は以下に示す)に対して、120個のアクリルアミドのライブラリーをスクリーニングした。これら120個のアクリルアミドの構造は、上記表1に示されている。
実施例1におけるモデルチオールは、グルタチオン(GSH)である。結果を以下の表3に示す。ヒットは、kCdk2/kGSH>5.8(経験論的に平均値に対する3標準偏差として決定される)であるフラグメントとして定義された。
実施例2で使用したモデルチオールは、2つの操作された表面露出システイン残基を含むヒトCdk2(C177A、F80C、K278C)の突然変異体である。標準的技法を用いて、部位特異的突然変異誘発によって突然変異を導入し、得られたcDNAをpRSETA細菌発現ベクターにクローニングし、ポリヒスチジンタグ付きCdk2融合体を作成し、これをE.coliから精製した。結果を以下の表3に示す。
グルタチオンに伴う速度定数(k(GSH))、Cdk2に伴う速度定数(k(Cdk2))、Cdk2[C177A、F80C、K278C]に伴う速度定数(k(Cdk2_mut))、ならびにスクリーニングされた各リガンド候補について計算された速度増大(k(Cdk2)/k(GSH)およびk(Cdk2)/k(Cdk2_mut))が以下の表3に示される。
さらなるCdk2突然変異体のさらなるセットのセットをスクリーニングした。これらは全てC177A突然変異を含み、したがって表面上に1つだけシステインを含む。
F80C(K278C突然変異なし)
H71C
S276C
N272
T182C
R122C
S181C
このスクリーニングからのデータを表4および5に示す。
実施例1では、対照チオール、グルタチオンと比較して、速度増大を計算した。実施例3からのデータは、数個の異なるチオールの平均を対照として使用できることを示している。
Cdk2(C177A、F80C)に対して同定されたヒットリガンドのうちの1つ(CA37)についてのk2およびKdの決定の一例として、観察された速度定数は、2、1、0.5、0.35、0.2、0.1、0.05および0.02mMのリガンド候補濃度で計算した(下記表7参照)。実施例1および2の方法論セクションに記載されているように、速度定数を計算した。
本方法によって同定されたヒットリガンドの結合を検証するために、質量分析法およびX線結晶構造解析を使用した。
参考文献
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上記の全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (25)
- 標的分子とリガンド候補との間の反応速度を測定する方法であって、
a)目的の結合部位と目的の結合部位内またはその近傍にあるチオール基とを含む標的分子を提供する、工程;
b)反応混合物中で標的分子をリガンド候補と接触させる工程、リガンド候補は、前記チオール基と不可逆的共有結合を形成することができる官能基を含む、工程;
c)標的分子のチオール基とリガンド候補の官能基との間で不可逆的な共有結合を形成させ、それによって標的分子-リガンドコンジュゲートを形成させる、工程;
d)反応中の定義された時点で前記反応混合物またはそのアリコートをチオール定量化試薬と接触させる工程、前記チオール定量化試薬は、遊離チオール基に結合して、前記反応混合物またはそのアリコートに生物物理学的方法によって評価可能な生物物理学的性質を付与する定量化コンジュゲートを形成することができる、工程;
e)前記反応混合物またはそのアリコートの前記生物物理学的性質を測定する、工程;ならびに
f)前記標的分子と前記リガンド候補との間の反応速度を計算する、工程;を含む方法。 - 工程d)が、
i)前記反応混合物のアリコートを前記チオール定量化試薬と接触させることを含み、工程d)およびe)がさらに1回以上繰り返され、各繰り返しの間、工程d)が反応中の1つ以上のさらなる異なる時点で実施される、または、
ii)前記反応混合物全体またはその実質的な割合を前記チオール定量化試薬と接触させることを含み、工程a)~e)がさらに1回以上繰り返され、各繰り返しの間、工程d)が反応中の1つ以上のさらなる異なる時点で実施される、または、
iii)反応中の単一の時点で実施され、工程f)がその時点での前記標的分子の前記標的分子-リガンド候補への変換を計算することを含む、請求項1に記載の方法。 - 工程f)が、前記標的分子-リガンドコンジュゲートの形成についての速度定数の近似値を計算することを含む、請求項2に記載の方法。
- 工程f)が、前記標的分子-リガンドコンジュゲートの形成についての速度定数を計算することを含む、請求項2に記載の方法。
- a)前記標的分子が、タンパク質、ポリペプチド、核タンパク質、糖ペプチド、およびリンタンパク質からなる群より選択される、および/または、
b)前記チオール基がシステイン残基によって提供される、および/または、
c)前記リガンド候補がフラグメントである、および/または、
d)前記官能基が求電子剤である、および/または、
e)前記チオール定量化試薬がチオール反応性染料である、
請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記リガンド候補が薬物様フラグメントである、、請求項5に記載の方法。
- 前記求電子剤が、アクリルアミド、アクリレート、α,β-不飽和ケトン、ビニルスルホンアミド、ビニルスルホン、ビニルスルホネート、α-ハロゲン化カルボニル誘導体、エポキシド、ニトリル誘導体、SNAr基質、ならびにそれらの置換誘導体からなる群から選択される、請求項5または6に記載の方法。
- 前記求電子剤がマイケルアクセプターである、請求項7に記載の方法。
- 前記標的分子と前記リガンド候補とを還元剤の存在下で接触させる、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記還元剤が固定化されている、請求項9に記載の方法。
- g)前記標的分子の代わりにモデルチオールを用いて工程a)~f)を繰り返し、同じリガンド候補を用いて、前記モデルチオールと前記リガンド候補との間の反応速度を計算する工程;ならびに
h)前記標的分子と前記リガンド候補との間の反応速度を、前記モデルチオールと前記リガンド候補との間の反応速度と比較することによって、前記リガンド候補についての速度増大を計算する工程;をさらに含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記モデルチオールがグルタチオンである、請求項11に記載の方法。
- i)前記リガンド候補についての速度増大が、選択された閾値レベルを上回るかどうかを決定する工程、この閾値レベルを上回る速度増大を伴うリガンド候補はヒットリガンドとして分類される、工程、をさらに含む、請求項11または12に記載の方法。
- j)1つ以上のさらなるリガンド候補を用いて工程a)~i)を繰り返す工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記リガンド候補が、リガンド候補のライブラリーを含む、請求項13に記載の方法。
- k)ヒットリガンドを薬物または他の阻害剤に開発する工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記チオール基が標的分子に対して内因性であり、かつ
a)前記ヒットリガンドが不可逆的な共有結合的阻害剤に開発されるか;または
b)前記ヒットリガンドが非共有結合的類似体に修飾されて、可逆的な阻害剤に開発されるか;のいずれかである、請求項16に記載の方法。 - 前記標的分子が前記チオール基を含むように修飾され、かつ前記ヒットリガンドが非共有結合的類似体に修飾されて、可逆的な阻害剤に開発される、請求項16に記載の方法。
- チオールと、前記チオールと反応することができる分子との間の反応速度を測定する方法であって、
a)チオールを、前記チオールと反応することができる分子と接触させて、反応混合物中に反応生成物を形成する工程;
b)反応中の定義された時点で前記反応混合物またはそのアリコートをチオール定量化試薬と接触させる工程、前記チオール定量化試薬は、遊離チオール基に結合して、前記反応混合物またはそのアリコートに生物物理学的方法によって評価可能な生物物理学的性質を付与する定量化コンジュゲートを形成することができる、工程;
c)前記反応混合物またはそのアリコートの前記生物物理学的性質を測定する工程;ならびに
d)前記チオールと、前記チオールと反応することができる分子との間の反応速度を計算する工程;を含む方法。 - 前記工程b)が、
i)前記反応混合物のアリコートを前記チオール定量化試薬と接触させることを含み、工程b)およびc)がさらに1回以上繰り返され、各繰り返しの間、工程b)が反応中の1つ以上のさらに異なる時点で実施される、または、
ii)前記反応混合物全体またはその実質的な割合を前記チオール定量化試薬と接触させることを含み、工程a)~c)がさらに1回以上繰り返され、各繰り返しの間、工程b)が反応中の1つ以上のさらに異なる時点で実施される、または、
iii)反応中の単一の時点で実施され、工程d)がその時点での前記チオールの前記反応生成物への変換を計算することを含む、請求項19に記載の方法。 - 工程d)が、反応生成物の形成についての速度定数の近似値を計算することを含む、請求項20に記載の方法。
- 工程d)が、反応生成物の形成についての速度定数を計算することを含む、請求項20に記載の方法。
- 工程a)において、前記チオールを、前記チオールと反応することができる分子と並行して還元剤とも接触させ、前記還元剤は、前記反応混合物またはそのアリコートをチオール定量化試薬と接触させる前に、工程b)において除去される、請求項19に記載の方法。
- 前記チオール定量化試薬が前記チオールに不可逆的に結合する、請求項19~23のいずれか1項に記載の方法。
- 標的分子とリガンド候補との間の解離定数を測定する方法であって、
a)目的の結合部位と、目的の結合部位内またはその近傍にあるチオール基とを含む標的分子を提供する工程;
b)反応混合物中で標的分子をリガンド候補と接触させる工程、リガンド候補は、チオール基と不可逆的な共有結合を形成することができる官能基を含む、工程;
c)標的分子のチオール基とリガンド候補の官能基との間で不可逆的な共有結合を形成させ、それによって標的分子-リガンドコンジュゲートを形成させる工程;
d)反応中の定義された時点で前記反応混合物またはそのアリコートをチオール定量化試薬と接触させる工程、前記チオール定量化試薬は、遊離チオール基に結合して、前記反応混合物またはそのアリコートに生物物理学的方法によって評価可能な生物物理学的性質を付与する定量化コンジュゲートを形成することができる、工程;
e)前記反応混合物またはそのアリコートの前記生物物理学的性質を測定する工程;
f)前記標的分子と前記リガンド候補との間の反応速度を計算する工程;
g)複数の異なる濃度の前記リガンド候補を用いて工程a)~f)を繰り返す工程;ならびに
h)標的分子とリガンド候補との間の解離定数を計算する工程;を含む方法。
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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Christian K. Riener et al.,Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4'-dithiodipyridine,Anal Bioanal Chem,2002年06月06日,373,266-276 |
Stefan G. Kathman et al.,Covalent tethering of fragments for covalent probe discovery,MedChemComm,2016年01月28日,vol17, no4,576-585 |
Also Published As
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