JP7007261B2 - アルブミン変異体及びコンジュゲート - Google Patents

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Description

本願はコンピューター読み取り可能な形式の配列表を含む。斯かるコンピューター読み取り可能な形式は援用により本明細書に組み込まれる。
本発明は、コンジュゲーション可能なアルブミン及びアルブミン関連ポリペプチド、それらと少なくとも１つの（例えば数個の）部分とのコンジュゲート、並びにそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。
血清アルブミンは、生体活性分子に貴重な足場材料を提供する。この足場材料に生体活性分子は遺伝子融合または化学融合のいずれかにより融合されて融合分子の特性が向上することがある（Leger, R. et al. (2004), Bioorg Med Chem Lett 14(17): 4395-8; Thibaudeau, K., et al. (2005). Bioconjug Chem 16(4): 1000-8; Balan, V. et al. (2006), Antivir Ther 11(1): 35-45；欧州特許公開第０４１３６２２号；国際公開第９０／１３６５３号；欧州特許公開第１６８１３０４号；国際公開第１９９７／０２４４４５号)。アルブミンは約１９日と血漿半減期が長く、この特性のため、薬物送達に用いることが提案されている。
ヒト血清アルブミン（human serum albumin：ＨＳＡ）のポリペプチド分子鎖は３５個のシステイン残基を有する。これらのシステイン残基は、１７個のジスルフィド結合を形成し、成熟タンパク質（配列番号２）の３４位に不対（遊離）システインを１個有する。システイン－３４は分子をアルブミンに結合(conjugation)させるのに用いられており(Leger et al. (2004) Bioorg Med Chem Lett 14(17): 4395-8; Thibaudeau et al. (2005), Bioconjug Chem 16(4): 1000-8)、結合のための精密でよく定義された部位を提供する。しかしながら、システイン－３４での結合は、単一部分の接合に１つの部位のみが提供されるので、結合部分の選択がない。また、単一結合部分の提供とは、１つの部分のみが各アルブミン分子に結合することができることを意味する。国際公開第２００９／１２６９２０号及び国際公開第２０１０／０５９３１５号には、１つ以上（例えば数個の）の選択されたアルブミンの表面に露出したトレオニンまたはセリン残基をシステインで置換することが提案されている。しかしながら、このような変異体の実際の生成物は開示されていない。国際公開第２０１０／０９２１３５号には、３個以上（数個）のコンジュゲーション可能なシステイン残基（システイン－３４及び少なくともさらに２個のシステイン残基）を含むアルブミン変異体、システイン－３４が他のアミノ酸で置換されており、少なくともさらに３個の遊離システインを有する変異体が開示されている。
医薬品又はその前駆体は、一般に、均質な種として調製されて、品質制御を可能にする。ＨＳＡでは、３４位の遊離システインは、９．５Åの深さを有する疎水性の間隙内に位置しており（Cornell CN, Chang R, Kaplan LJ. 1981. Arch. Biochem. Biophys. 209(1):1-6）、ＨＳＡのホモ二量化に関連するとは考えられていない。しかしながら、ポリペプチドの表面に露出したシステイン残基は、天然に生じる免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との間の分子間ジスルフィド架橋のように安定した分子間ジスルフィド架橋を形成してもよい。望ましいのは、二量体または多量体を形成する傾向が低いシステイン残基を導入したアルブミン変異体を提供することである。
国際公開第２０００／６９９０２号には、薬学的に有益な化合物をＨＳＡのシステイン－３４に結合することが開示されている。また、このコンジュゲート（conjugate）はアルブミンの長い血漿半減期を維持していることが分かった。得られたコンジュゲートの血漿半減期は、一般に、有益な治療化合物のみの血漿半減期よりも相当長いものであった。さらに、アルブミンは、治療に有益なペプチドと遺伝子融合しており（国際公開第２００１／７９２７１号及び国際公開第２００３／５９９３４号）、典型的な結果として、この遺伝子融合は治療に有益なペプチドの活性及び治療に有益なペプチドのみの血漿半減期よりも相当長い血漿半減期を有していた。
アルブミンは、生体内でその受容体、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）「ブランベル」（Brambell）に結合する。この相互作用は、アルブミンの血漿半減期に重要であることが知られている。ＦｃＲｎは、多くの種類の細胞及び組織で発現する膜結合タンパク質である。ＦｃＲｎは、アルブミンを細胞内分解から保護することが分かっている（Roopenian D. C. and Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725.）。ＦｃＲｎは、ヒトなどの哺乳類の血漿中のＩｇＧ及びアルブミンを高い濃度で維持することに関与する二官能分子である。データによれば、ＩｇＧ及びアルブミンはＦｃＲｎの異なる部位に非共同的に結合する(Andersen et al. (2006), Eur. J. Immunol 36, 3044-3051; Chaudhury et al. (2006), Biochemistry 45, 4983-4990)。Andersen et al. (2010), Journal of Biological Chemistry 285(7): 4826-36には、ヒトＦｃＲｎ及びマウスＦｃＲｎのマウスアルブミン及びヒトアルブミンに対する親和性（すべての可能な組み合わせ）が記載されている。これらの種に由来するアルブミンの生理的ｐＨでのこれらの受容体と結合は、いずれも観察されなかった。酸性のｐＨでは、結合親和性が１００倍異なることが観察された。
アルブミンの主要ＦｃＲｎ受容体結合部分は、ドメインIII（DIII, 381-585）、（Andersen et al. (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372）内に位置する。主要アミノ酸残基の多くは、とりわけヒトアルブミンのヒスチジンＨ４６４、Ｈ５１０、及びＨ５３６ならびリシンＫ５００の結合において重要であることが示された (Andersen et al. (2010), Nat. Commun. 3:610. DOI:10.1038/ncomms1607)。一般に、ＦｃＲｎに対するアルブミンの親和性が高い程、その血漿半減期は長くなる。国際公開第２０１１／１２４７１８号には、ＦｃＲｎに対する結合親和性が調節された変異体アルブミンの種類が開示されている。これらの変異体は、アルブミンの他のドメインを１つ以上（例えば数個）有するアルブミンのドメインIIIを含み、必要であれば１つ以上（例えば数個）の点変異を含む。国際公開第２０１２／０５９４８６号には、ドメインIIIのＣ－端末部分が、異なる動物種のアルブミンの対応する部分と交換されているアルブミンの変異体が開示されている。国際公開第２０１３／０７５０６６号、国際公開第２０１１／１０３０７６号、国際公開第２０１２／１１２１８８号、国際公開第２０１１／０５１４８９号、及び国際公開第２０１４／０７２４８１号には、アルブミンのＦｃＲｎに対する結合親和性を変化させるドメインIII内の点変異、又はそのような点変異の組み合わせが開示されている。
また、近年、ドメインＩ又はドメインＩＩに位置するアルブミンの様々なアミノ酸残基は、アルブミンのＦｃＲｎとの相互作用に影響を及ぼすことが分かった。国際公開第２０１３／１３５８９６号には、ドメインＩに１つ以上（例えば数個）の変化及びドメインIIIに１つ以上（例えば数個）の変化を有するアルブミン変異体が開示されている。国際公開第２０１５／０３６５７９号には、ドメインＩＩに１つ以上（例えば数個）の変化を有するアルブミン変異体が開示されている。
本明細書において、一見して先に公開された文書のリスト又は議論は、必ずしもその文書が最先端技術の一部、或いは一般的な知識であると認識として解釈されるものではない。
導入された遊離システイン残基自体はアルブミンのＦｃＲｎ結合に大きな影響を及ぼさないこと、或いは遊離システインと相手分子との結合がＦｃＲｎ結合の立体障害にならないように配置された１つ以上（例えば数個）の導入されたシステイン残基を有するアルブミン変異体を提供することが望ましい。このようなことを考慮すると、単一のアルブミン変異体に２個以上の遊離システインの組み合わせを導入する際に予測できない効果の危険性を低減することができる。このような変異体ポリペプチドをさらに変性して、このポリペプチド又はそのコンジュゲートの血漿半減期を特定の用途に合わせるようにアルブミンのＦｃＲｎに対する結合親和性に影響を及ぼすことが知られている変化を含めてもよい。
本発明者等は、ＦｃＲｎに結合するヒト血清アルブミン（human serum albumin：ＨＳＡ）の３次元構造分析に基づき、１又は２以上の（例えば数個の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を有するアルブミンの変異ポリペプチド（ムテイン）を設計した。本明細書において「チオアルブミン」（thio-albumin）という語は、１又は２以上の（例えば数個の）対を形成していないシステイン残基を含むアルブミン変異体、特に anin whichof the 斯かる対を形成していないシステイン残基のうち１又は２以上（例えば数個）がアルブミンの天然変異体には生じ得ないようなシステイン残基であるアルブミン変異体を意味する。即ち、チオアルブミンは、「コンジュゲーション可能なアルブミン」（conjugation-competent albumin）である。チオアルブミンは「アルブミンのシステイン変異体」という場合もある。より具体的に、本発明は、ヒトアルブミン、特に配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列の残基１～５８５、又はその断片と少なくとも６０％同一のアミノ酸配列を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチドであって、ここで配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８から選択される位置に等しい少なくとも１つの位置が、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含み；ここで好ましくは、前記のコンジュゲーション可能なポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の、少なくとも７０％である、コンジュゲーション可能なポリペプチドに関する。
より好ましくは、前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも７５％であると共に、Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｌ２８４、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８から選択される位置に等しい少なくとも１つの位置が、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含む。
また、本発明は、前記定義のアミノ酸配列を含むと共に、配列番号２と比較して少なくとも１つの（例えば数個の）更なる修飾、例えば、前記ポリペプチドに少なくとも１つの（例えば数個の）更なるコンジュゲーション可能なシステインを付与する、又は前記ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性を改変する、又は前記ポリペプチドの血漿中半減期を変更する更なる修飾を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチドにも関する。また、本発明は、前記変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、ベクター、及び宿主細胞；並びに、前記変異体を製造する方法にも関する。
また、本発明は、本発明に係る変異体アルブミン又はその断片と、有益な治療部分とを含むコンジュゲート又はアソシエイト、或いは、本発明の変異体アルブミン又はその断片と、融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチドにも関する。
更に、本発明は、本発明に係る変異体アルブミン若しくはその断片、本発明に係る変異体アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は本発明に係る変異体アルブミン若しくはその断片を含むコンジュゲート若しくはアソシエイトを含む組成物にも関する。斯かる組成物として好ましくは医薬組成物である。
更に、本発明は、前記の変異体アルブミン若しくはその断片、前記の変異体アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は前記の変異体アルブミン若しくはその断片を含むコンジュゲート若しくはアソシエイトを含む医薬組成物にも関する。
また、本発明は、前記の変異体、断片、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエイト、ナノ粒子、及びマイクロ粒子の使用にも関する。
また、本発明は、前記の変異体アルブミン若しくはその断片、前記の変異体アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は前記の変異体アルブミン若しくはその断片を含むコンジュゲート若しくはアソシエイトを調製するための方法にも関する。
図１は以下の複数のアミノ酸配列を並べたものである。（ｉ）完全な長さの成熟ＨＳＡ（Ｈｕ＿１＿２＿３）、（ｉｉ）ＨＳＡのドメインＩ及びドメインIIIを含むアルブミン変異体（Ｈｕ＿１＿３）、（ｉｉｉ）ＨＳＡのドメインＩＩ及びドメインIIIを含むアルブミン変異体（Ｈｕ＿２＿３）、（ｉｖ）完全な長さのアカゲザル（Macaca mulatta）アルブミン（Ｍａｃ＿ｍｕｌ）、（ｖ）完全な長さのラット（Rattus norvegicus）アルブミン、及び（ｖｉ）完全な長さのマウス（Mus musculus）アルブミン。５００位、５５０位、及び５７３位（完全な長さのＨＳＡに対する）が矢印で示されている。 同上。
図２は、ヒト、ヒツジ、マウス、ウサギ、及びヤギ由来の成熟アルブミンのアミノ酸配列、及びチンパンジー（「Ｃｈｉｍｐ」）、マカク、ハムスター、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、イヌ、ニワトリ、及びブタ由来の未成熟アルブミンのアミノ酸配列を複数並べたものである。成熟ヒトアルブミンについては、ドメイン１、２、及び３（Dockal et al (The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310)で定義された）の開始アミノ酸及び終止アミノ酸が示されている。 同上。 同上。 同上。
図３は、２０種のアミノ酸の種類及び関係を示すベン図である。
図４Ａは、遊離チオール基を含むタンパク質をマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンでビオチン化する反応スキームであり、図４Ｂは、スキームＡで形成されたコンジュゲートで起こりうる逆マイケル（retro-Michael）反応及びコハク酸イミド加水分解反応を概略的に示したものである。 図４Ａでは、マレイミドは、チオール基と付加物を形成し、従って、コハク酸イミド部位はチオエーテル結合で形成される。 図４Ｂは付加物の形成を示す。この付加物は、逆マイケル経路によりマレイミド及び遊離チオールに戻ってもよい。或いは、コハク酸イミド部位は、ｐＨ９での加水分解により安定化されて開環し、コハク酸としてもよい。このコンジュゲートのチオエーテル結合は保持され、コハク酸部位は、存在してもよい他のチオール化合物に対して非反応性である。加水分解される際、遊離マレイミドもまた、チオールに非反応性になる。
図５は、マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンと結合した精製した変異体（Ａ：Ｃ３４Ａ＋Ｉ２７１Ｃ変異体；Ｂ：Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ変異体）のＭＳスペクトルである。Ａ：コンジュゲートのピークは６６９２４．１である。小さいピークは、非コンジュゲート（unconjugated）タンパク質である。この相対的なピークの高さは、結合割合が７２％であることを示している。+MS, 7.7-9.2min、ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（デコンボリューション）（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｂ：コンジュゲートのピークは６６９０８．３である。遊離比率がなく、これは１００％結合していることを示す。+MS, 7.6-9.4min、ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
図６は、マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンに結合させ、制御した加水分解を行った精製アルブミン（Ａ：野生型；Ｂ：Ｃ３４Ａ＋Ｅ２９４Ｃ変異体）のＭＳスペクトルである。Ａでは、アルブミンの５３％は、６６９７８．４にピークを有するチオール安定性コンジュゲートとして存在し、４７％は、逆マイケル脱結合（deconjugation）を受けて遊離アルブミンとして存在する。+MS, 7.0-9.6min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｂでは、１００％のＣ３４Ａ＋Ｅ２９４Ｃ変異体が６６９２５．７にピークを有するチオール安定性コンジュゲートとして存在する。+MS, 7.6-9.5min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
図７は、マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンと結合させ、制御した加水分解を行った（Ｂ及びＣ）精製アルブミン変異体（Ａ：Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ；Ｂ：Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ；Ｃ：Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ）のＭＳスペクトルである。Ａでは、Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃの単一ピーク（６７９６７．７）は、３個の遊離チオールのそれぞれに１００％結合していることを示す。+MS, 1.6-2.6min, ベースライン減算（０．４０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｂでは、Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃの三重コンジュゲートの２０％は、加水分解後にチオール安定性になる。６７４７６．２の主ピークは、２つのチオール安定性コンジュゲート結合を示しており、逆マイケル脱結合で１つのマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンが脱離している。+MS, 1.8-2.9min, ベースライン減算（０．４０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｃでは、主要な種は６７４４３．１にピークを有するＣ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃの二重コンジュゲートであり、その他の種は６６８９４．６にピークを有する単一コンジュゲートである。+MS, 1.7-2.8min, ベースライン減算（０．４０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
図８は、精製アルブミン変異体Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ（天然Ｃｙｓ３４を含む）のＭＳスペクトルである。Ａ：３個の遊離チオールのそれぞれに１００％結合していることを示している。+MS, 7.3-9.7min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｂでは、Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ（天然Ｃｙｓ３４を含む）の三重コンジュゲートの２３％は、加水分解後にチオール安定性になる。６７４４７．３にある主ピークは、２個のチオール安定性コンジュゲート結合を示しており、逆マイケル脱結合により１個のマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンが脱離している。+MS, 7.4-9.5min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
図９において、Ａは、Alexa Fluor（登録商標）４８８－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素の概略を示している。Alexa Fluor（登録商標）４８８－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素に結合させた精製アルブミン変異体（Ｂ：Ｋ５７３Ｐ；Ｃ：Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ）のＭＳスペクトルが示されている。Ｂでは、Ｋ５７３Ｐの６７４６８．５にある単一ピークは、Ｃｙｓ３４にある１個の遊離チオールに１００％結合していることを示している。+MS, 7.6-9.7min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧA）。Ｃでは、６９５３５．８にピークがある主要な種はＫ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ（天然Ｃｙｓ３４を含む）の三重コンジュゲートである。短いピークは、二重コンジュゲートのものである。ピークの相対的な高さは、それぞれ三重コンジュゲートが５８％、二重コンジュゲートが４２％であることを示している。+MS, 7.6-9.3min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
図１０では、Ａは、５－カルボキシフルオレセイン－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素の概略を示している。５－カルボキシフルオレセイン－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素に結合させた精製アルブミン変異体（Ｂ：Ｋ５７３Ｐ；Ｃ：Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ）のＭＳスペクトルが示されている。Ｂでは、Ｋ５７３Ｐの単一ピーク（６７３１０．６）は、Ｃｙｓ３４にある１個の遊離チオールに１００％結合していることを示している。+MS, 7.2-9.3min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｃでは、６８１２９．７にピークがある主要な種は、Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐの二重コンジュゲートである。短いピークは、単一のコンジュゲートされたタンパク質を示すものである。ピークの相対的な高さは、それぞれ、二重コンジュゲートが９１％、単一のコンジュゲートされたタンパク質が９％であることを示している。+MS, 7.3-9.3min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
図１１において、Ａは、モノブロモマレイミド－パクリタキセルの概略を示している。モノブロモマレイミド－パクリタキセルに結合させた精製アルブミン変異体（Ｂ：Ｋ５７３Ｐ；Ｃ：Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ）のＭＳスペクトルが示されている。Ｂでは、Ｋ５７３Ｐのピーク（６７４１２．２）は、Ｃｙｓ３４にある１個の遊離チオールへの結合を示している。短いピークは、非コンジュゲートタンパク質のものである。ピークの相対的な高さは、それぞれ、単一コンジュゲートが７７％、非コンジュゲートタンパク質が２３％であることを示している。+MS, 7.1-8.9min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｃでは、６８３６４．２にピークがある主要な種は、Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐの二重コンジュゲートである。短いピークは、三重コンジュゲートタンパク質のものである。ピークの相対的な高さは、それぞれ、二重コンジュゲートタンパク質が６０％、三重コンジュゲートタンパク質が３０％であることを示している。+MS, 7.2-9.0min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
図１２において、Ａは、モノブロモマレイミド－ＰＥＧ２－エキセナチドペプチドを示す。モノブロモマレイミド－ＰＥＧ２－エキセナチドペプチドに結合させた精製アルブミン変異体（Ｂ：Ｋ５７３Ｐ；Ｃ：Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ）のＭＳスペクトルが示されている。Ｂでは、Ｋ５７３Ｐのピーク（７１０１８．７）は、Ｃｙｓ３４にある１個の遊離チオールへの結合を示している。６６４０９．２にある主ピークは、非コンジュゲートタンパク質のものである。ピークの相対的な高さは、それぞれ、単一コンジュゲートが３３％、非コンジュゲートタンパク質が６７％であることを示している。+MS, 7.2-8.8ｍin, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｃでは、Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐの二重コンジュゲートは７５５５７．３にピークを有する。７０９４１．７にある主ピークは、一項コンジュゲートのものである。６６３２２．４にある最も短いピークは、非コンジュゲートタンパク質のものである。ピークの相対的な高さは、それぞれ、二重コンジュゲートが３３％、単一コンジュゲートが４５％、非コンジュゲートタンパク質が２２％であることを示している。+MS, 7.2-9.2ｍin, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
図１３において、Ａは、マレイミド－プロピル－ＦＬＡＧペプチドの概要を示す。マレイミド－プロピル－ＦＬＡＧペプチドに結合させた精製アルブミン変異体（Ｂ：Ｋ５７３Ｐ；Ｃ：Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ）のＭＳスペクトルが示されている。Ｂでは、Ｋ５７３Ｐのピーク（６７５７３．４）は、Ｃｙｓ３４にある１個の遊離チオールへの結合を示している。主ピークは、非コンジュゲートタンパク質のものである。ピークの相対的な高さは、それぞれ、一重コンジュゲートが２９％、非コンジュゲートタンパク質が７１％であることを示している。+MS, 7.3-8.7min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。Ｃでは、Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ（天然Ｃｙｓ３４を含む）の三重コンジュゲートは６９８５０．５にピークを有する。６８６８５．５にある主ピークは、二重コンジュゲートのものである。６７５２０．３にあるピークは、単一コンジュゲートのものである。６６３５０．２にある最も短いピークは、非コンジュゲートタンパク質のものである。ピークの相対的な高さは、それぞれ、三重コンジュゲートが２９％、二重コンジュゲートが５０％、単一コンジュゲートが２０％、非コンジュゲートタンパク質が２％であることを示している。+MS, 7.2-8.8min, ベースライン減算（０．５０）、ピーク分離（ＭａｘＥｎｔ）、平滑化（０．００，１，ＧＡ）。
定義
変異体：「変異体」（variants）という語は、親アルブミンから、１又は２以上の（例えば数個の）位置における１又は２以上の（例えば数個の）改変、即ち置換、挿入、及び／又は、欠失により誘導されるポリペプチドを意味する。置換（substitution）とは、ある位置を占めるアミノ酸を、異なるアミノ酸に交換することを意味する。欠失（deletion）とは、ある位置を占めるアミノ酸を除去することを意味する。挿入（insertion）とは、ある位置を占めるアミノ酸に直接隣接する位置に、１又はそれ以上の（例えば数個の）、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の、好ましくは１～３のアミノ酸を付加することを意味する。挿入に関して、「直接隣接する」（immediately adjacent）とは、ある位置を占めるアミノ酸（「指名されたアミノ酸」（named amino acid））のＮ側（「上流」（upstream））又はＣ側（「下流」（downstream））の何れであってもよい。従って、「Ｘ」と指名／番号付けされたアミノ酸の場合、挿入は位置「Ｘ＋１」（「下流」）であってもよく、位置「Ｘ－１」（「上流」）であってもよい。
ミュータント：「ミュータント」（mutant）という語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
野生型アルブミン：「野生型」（wild type：ＷＴ）アルブミンとは、動物又はヒトの天然アミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するアルブミンを意味する。
親アルブミン：「親」（parent）又は「親アルブミン」（parent albumin）とは、本発明のアルブミン変異体を作製するために人為的な改変を加える対象となるアルブミンを意味する。親は天然（野生型）ポリペプチドでもそのアレルでもよく、更にはその変異体でもよい。
アルブミン：アルブミンは哺乳類の血漿に最も豊富に存在するタンパク質であり、多数の哺乳類のアルブミンが生化学的手法及び／又は配列情報により特性解析されている。幾つかのアルブミン、例えばＨＳＡ等は、結晶学的にも特性解析されており、その構造が決定されている（HSA: He XM, Carter DC (July 1992), "Atomic structure and chemistry of human serum albumin", Nature 358 (6383): 209-15; horse albumin: Ho, J.X. et al. (2001). X-ray and primary structure of horse serum albumin (Equus caballus) at 0.27-nm resolution. Eur J Biochem. 215(1):205-12）。本発明はあらゆるアルブミン及びその構造に関する。
「アルブミン」（albumin）という語は、ＨＳＡ又はＨＳＡドメインと同一及び／又はきわめて類似の三次元（三次）構造を有するタンパク質であって、ＨＳＡ又はその関連ドメインと類似した特性を有するタンパク質を意味する。類似の三次元構造とは、例えば本明細書に記載の種に由来するアルブミンの構造である。アルブミンの主要な特性の例としては、ｉ）血漿体積制御能（膠質浸透活性）、ii）約１９日±５日という長い血漿中半減期、iii）ＦｃＲｎへの結合、iv）リガンドとの結合、例えばビリルビン、脂肪酸、ヘミン、及びチロキシン等の例えば酸性親油性化合物等の内因性分子との結合（Kragh-Hansen et al., 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１も参照。本文献は引用により本明細書に組み込まれる。）、ｖ）酸性又は電気陰性特性を有する小型有機化合物との結合、例えば例えばワルファリン、ジアゼパム、イブプロフェン、及びパクリタキセル等の薬物との結合（Kragh-Hansen et al., 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１も参照。本文献は引用により本明細書に組み込まれる。）、vi）gp60、別名アルボンジン（albondin）との結合等が挙げられる。あるタンパク質又は断片をアルブミンと特定するのに、これらの特性の全てが満たされる必要は無い。ある断片が、例えば特定のリガンド又は有機化合物との結合に関与するドメインを含まない場合には、斯かる断片の変異体もこれらの特性を有さないと予想される。
アルブミンは概して約２０日又はそれ以上という長い血漿中半減期を有する。例えば、ＨＳＡの血漿中半減期は１９日である。ＨＳＡの長い血漿中半減期は、その受容体ＦｃＲｎとの相互作用により媒介されることが知られているが、斯かるＨＳＡの長い半減期の背後にある機序を正確に理解又は知得することは、本発明にとって重要ではない。
本発明に係るアルブミン変異体を作製するための出発物質たる親「骨格」（backbones）のアルブミンタンパク質としては、ＨＳＡ（例えばＡＡＡ９８７９７又はＰ０２７６８－１、配列番号２（成熟）、配列番号３（未成熟））、霊長類血清アルブミン、（例えばチンパンジー血清アルブミン（例えば予測配列ＸＰ＿５１７２３３．２、配列番号４）、ゴリラ血清アルブミン又はマカクザル血清アルブミン（例えばＮＰ＿００１１８２５７８、配列番号５）、齧歯類血清アルブミン（例えばハムスター血清アルブミン（例えばＡ６ＹＦ５６、配列番号６）、モルモット血清アルブミン（例えばＱ６ＷＤＮ９－１、配列番号７）、マウス血清アルブミン（例えばＡＡＨ４９９７１又はＰ０７７２４－１バージョン３、配列番号８）及びラット血清アルブミン（例えばＡＡＨ８５３５９又はＰ０２７７０－１バージョン２、配列番号９）、ウシ血清アルブミン（例えば乳牛血清アルブミンＰ０２７６９－１、配列番号１０）、ウマ血清アルブミン例えばウマ血清アルブミン（例えばＰ３５７４７－１、配列番号１１）又はロバ血清アルブミン（例えばＱ５ＸＬＥ４－１、配列番号１２）、ウサギ血清アルブミン（例えばＰ４９０６５－１バージョン２、配列番号１３）、ヤギ血清アルブミン（例えばＡＣＦ１０３９１、配列番号１４）、ヒツジ血清アルブミン（例えばＰ１４６３９－１、配列番号１５）、イヌ血清アルブミン（例えばＰ４９８２２－１、配列番号１６）、ニワトリ血清アルブミン（例えばＰ１９１２１－１バージョン２、配列番号１７）及びブタ血清アルブミン（例えばＰ０８８３５－１バージョン２、配列番号１８）、又は斯かるアルブミンに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．２、９９．４、９９．６、又は少なくとも９９．８％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明の範囲に含まれるアルブミン他の例としては、オボアルブミン（例えばＰ０１０１２．ｐｒｏ：ニワトリオボアルブミン；Ｏ７３８６０．ｐｒｏ：シチメンチョウオボアルブミン）が挙げられる。成熟アルブミン配列は、未成熟アルブミン配列を元に、当業者に公知の技術、例えば（成熟及び未成熟領域が既知の）ＨＳＡとのアラインメントを用いて特定することが可能である。例えば、未成熟ＨＳＡは６０９アミノ酸長を有し、うちアミノ酸１～１９がシグナル配列（別名リーダー配列又はプレ配列）、アミノ酸２０～２４がプロ配列、アミノ酸２５～６０９が成熟タンパク質である。図２に示すアラインメントによれば、当業者であれば数種の動物アルブミンの成熟配列を予測することが可能である（「D1 Start」参照）。
配列番号２に示すＨＳＡ、又はその任意の天然アレルは、本発明に係る好ましい親アルブミンである。ＨＳＡは５８５アミノ酸残基からなるタンパク質であり、その分子量は６７ｋＤａである。自然形態ではグリコシル化されていない。当業者であれば理解するように、ＨＳＡと実質的に同一の特性を有するが、配列番号２と比較して１又は２以上の（例えば数個の）アミノ酸の変更を伴う天然アレルが存在する可能性もあり、斯かる天然アレルを本発明に係る親アルブミンとして使用することも、本発明者等が想定するところである。
本発明に係る親アルブミン、その断片、又はコンジュゲーション可能なアルブミン変異体、又はアルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチド又はコンジュゲートのアルブミン部分は、配列番号２に示すＨＳＡの配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、又は少なくとも９９．８％、又は１００％の配列同一性を有することが好ましい。親アルブミンは、アルブミンの主要な特性の少なくとも１つ、又は、アルブミン、例えばＨＳＡと類似の三次構造を維持していることが好ましい。配列同一性は配列番号２の全長に亘っていてもよく、又は、例えば配列番号２の１又は２以上の（例えば数個の）ドメイン等の断片等を含む、又は当該断片からなる分子に亘って、例えばドメインIII（例えば配列番号１９）を含む、又は当該ドメインからなる分子、ドメインII及びドメインIII（例えば配列番号２０）を含む、又は当該ドメインからなる分子、ドメインＩ及びドメインIII（例えば配列番号２１）を含む、又は当該ドメインからなる分子、２コピーのドメインIII（例えば配列番号２２）を含む、又は当該ドメインからなる分子、３コピーのドメインIII（例えば配列番号２３）を含む、又は当該ドメインからなる分子、或いは、ドメインＩ及び２コピーのドメインIII（例えば配列番号２４）を含む、又は当該ドメインからなる分子に亘っていてもよい。
本発明に係る親アルブミン、その断片、又はコンジュゲーション可能なアルブミン変異体、又はアルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチド又はコンジュゲートのアルブミン部分は、折り畳まれた場合、配列番号２のポリペプチドの天然の１７個のジスルフィド結合のうち数個を有していてもよく、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び適切には１７個全てを有していてもよい。
当該親は、配列番号３のアミノ酸配列（ＨＳＡの未成熟配列）又は配列番号２のアミノ酸配列（ＨＳＡの成熟配列）を含み、又は当該配列からなることが好ましい。
他の態様によれば、当該親は、成熟配列番号２のポリペプチドのアレル変異体である。
当該親アルブミンは、極めて低いストリンジェント条件、低いストリンジェント条件、中程度のストリンジェント条件、中度～高度のストリンジェント条件、高いストリンジェント条件、又は極めて高度のストリンジェント条件で、（ｉ）配列番号２の配列をコードする成熟ポリペプチド、又は（ii）（ｉ）の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされていてもよい（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。
配列番号１又はそのサブ配列、並びに配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列のポリヌクレオチド又はその断片を用い、本技術分野で周知の方法に従って、異なる属又は種の株から親をコードするＤＮＡを同定及びクローン化するための核酸プローブを設計してもよい。特に、斯かるプローブを用いて、所望の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、続いて標準的なサザンブロッティング法を行うことにより、その中の対応する遺伝子を同定及び単離してもよい。斯かるプローブは全長配列よりも顕著に短くてもよいが、少なくとも１４、例えば少なくとも２５、少なくとも３５、又は少なくとも７０ヌクレオチドの長さを有するべきである。斯かる核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長、例えば少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、又は少なくとも９００ヌクレオチド長であることが好ましい。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの何れを用いることもできる。典型的には、プローブは対応する遺伝子を検出するために、（例えば３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、又はアビジン等により）標識される。斯かるプローブも本発明に包含される。
斯かる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、上述のプローブにハイブリダイズすると共に親をコードするＤＮＡを得ることもできる。斯かる他の生物由来のゲノム又は他のＤＮＡの分離は、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動によってもよく、又は他の分離技術によってもよい。ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離されたＤＮＡを、ニトロセルロース又は他の適切な担体材料に移送し、又は当該材料に不動化してもよい。配列番号１又はそのサブ配列と相同のクローン又はＤＮＡを同定するために、斯かる担体材料をサザンブロットに用いてもよい。
本発明の目的によれば、ハイブリダイゼーションは、斯かるポリヌクレオチドが、配列番号１に示すポリヌクレオチド、その相補鎖、又はそのサブ配列に対応する標識されたヌクレオチドプローブに対して、低度～極めて高度のストリンジェント条件下でハイブリダイズすることを示す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルムや、本技術分野で公知の他の検出手段等を用いて検出することができる。
核酸プローブは、配列番号１の配列、即ち配列番号１のヌクレオチド１～１７８５をコードする成熟ポリペプチドを含んでいてもよく、又は当該ポリペプチドからなっていてもよい。核酸プローブは、配列番号２５のポリヌクレオチド（ＨＳＡをコードするヌクレオチド配列、当該ヌクレオチド配列は制限酵素部位を導入するべく改変されていてもよい）又はその断片を含んでいてもよく、又は当該ポリペプチドからなっていてもよい。
少なくとも１００ヌクレオチド長という長いプローブの場合、極めて低度～極めて高度のストリンジェント条件は、最適には、４２℃で５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの剪断変性サケ***ＤＮＡ中で、且つ、極めて低度及び低度のストリンジェンシーの場合は２５％のホルムアミド、培地及び中度～高度のストリンジェンシーの場合は３５％のホルムアミド、高度及び極めて高度のストリンジェンシーの場合は５０％のホルムアミド中での、標準的なサザンブロッティング法に従った１２～２４時間のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。その後、最終的には担体材料を２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中で、４５℃（極めて低度のストリンジェンシー）、５０℃（低度のストリンジェンシー）、５５℃（中度のストリンジェンシー）、６０℃（中度～高度のストリンジェンシー）、６５℃（高度のストリンジェンシー）、又は７０℃（極めて高度のストリンジェンシー）で、１５分間ずつ三回洗浄する。
約１５ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド長という短いプローブの場合、ストリンジェント条件は、最適にはBolton及びMcCarthy（1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390）の計算法により算出されるＴｍよりも約５℃～約１０℃低い温度で、１ｍＬ当たり０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９Ｍ トリスＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ-４０、１×デンハルト溶液、１ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中で、標準的なサザンブロッティング法に従った１２～２４時間のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。その後、最終的には担体材料を６×ＳＣＣ及び０．１％のＳＤＳで１５分間一回、次いで６×ＳＳＣを用いて、算出されるＴｍよりも５℃～１０℃低い温度で１５分間ずつ二回洗浄する。
親又はコンジュゲーション可能なアルブミンは、配列番号１の配列をコードする成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、アルブミンとして機能し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。ある態様では、親は、配列番号１を含む、又は配列番号１からなるポリヌクレオチドによりコードされる。
三次元（３Ｄ）モデル
本明細書ではＨＳＡの結晶構造として、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（protein databank：ＰＤＢ、http://www.rcsb.org/pdb/より参照可能）に登録されているＰＤＢ識別番号１ＡＯ６又は１ａｏ６を参照する（Sugio, S., A. Kashima, et al. (1999), Protein Eng 12(6): 439-46）。成熟ＨＳＡ配列（配列番号２）と比較して、１ＡＯ６構造は配列番号２の残基Ｓ５から開始する（即ち、最初の４アミノ酸は当該構造には存在しない）と共に、配列番号２のＡ５８２で終了する（即ち、最後の３アミノ酸は当該構造には存在しない）。本明細書において、コンジュゲーション可能なシステインを生成するために改変すべき位置の記載に使用するアミノ酸位置は、１ａｏ６ではなく配列番号２上の位置を指すものとする。当業者であれば、更なるアルブミンの構造が利用可能である。例えば、ヒトアルブミンの三次構造の原子座標は、ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡデータベースで公開されており、www.ncbi.nlm.nih.govにて閲覧可能である。構造の閲覧には、適切なソフトウェア、例えばRasM.1 Chimeを利用できる（Sayle, TIBS 20, 374, 1995）。利用可能なアルブミンの座標としては、以下が挙げられる。
１ＡＯ６、１ＢＭ０（Sugio et al. (1999), Protein Eng 12(6): 439-46）。これはリクエストの多い上位１７種のタンパク質に含まれる。
１ＵＯＲ、He & Carter (1992), Nature 358(6383): 209-15
１ｂｊ５及び１ｂｋｅ、Curry et al. (1998), Nat Struct Biol 5(9): 827-35
１ｅ７ａ、１ｅ７ｂ、及び１ｅ７ｃ、Bhattacharya et al. (2000), J Biol Chem 275(49): 38731 8
１ｅ７ｅ、１ｅ７ｆ、１ｅ７ｇ、１ｅ７ｈ、及び１ｅ７ｉ、Bhattacharya et al. (2000), J Mol Biol 303(5): 721-32
１ＧＮＪ、Petitpas et al. (2001), J Mol Biol 314(5): 955-60
１ＨＡ２及び１Ｈ９Ｚ、Petitpas et al. (2001), J Biol Chem 276(25): 22804-9.
４Ｋ７１、Schmidt et al. (2013),. Structure 21:1966-1978
４Ｎ０Ｆ及び４Ｎ０Ｕ、Oganesyan et al. (2014), J Biol Chem 289(11):7812-24.
アルブミン部分：本発明に係るアルブミン変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエイト、ナノ粒子、又は組成物のアルブミン部分は、「アルブミン部分」（albumin moiety）又は「アルブミン要素」（albumin component）と呼ばれる場合がある。本発明に係るポリペプチドは、アルブミン部分を含むものでもよく、アルブミン部分からなるものでもよい。
単離された変異体：「単離された変異体」（isolated variant）という語は、天然には存在しない形態又は環境にある変異体を意味する。単離された変異体の非限定的な例としては、（１）任意の非天然変異体；（２）天然で連結されている天然成分のうち１又は２以上（例えば数個）又は全てが少なくとも部分的に除去されてなる任意の変異体；（３）元のポリペプチドから人為的に改変されてなる任意の変異体（例えば天然で見いだされる元のポリペプチドから改変されたポリペプチド）；又は（４）天然で連結されている他の要素に対する当該変異体の量が増加されてなる任意の変異体（例えば前記物質をコードする遺伝子の多数コピーの使用や、前記物質をコードする遺伝子に天然で連結されているプロモータよりも強力なプロモータの使用等）。単離された変異体は、発酵ブロス試料中に存在するものでもよい。単離された変異体は組換体でも合成体でもよい。
実質的に純粋な変異体：「実質的に純粋な変異体」（substantially pure variant）という語は、天然又は組換により連結された他のポリペプチド物質を、重量比で最高１０％、最高８％、最高６％、最高５％、最高４％、最高３％、最高２％、最高１％、及び最高０．５％しか含有しない調製物を意味する。斯かる変異体は、調製物中に存在する総ポリペプチド物質に対する重量比で、少なくとも９２％の純度、例えば少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度、及び１００％の純度を有することが好ましい。純度は例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ又はＧＰ－ＨＰＬＣにより決定される。本発明の変異体は実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは例えば、変異体を周知の組換法及び精製法で調製することにより達成することができる。
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」（mature polypeptide）という語は、翻訳及びＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等の翻訳後修飾を経たポリペプチドの最終形態を意味する。成熟ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１～５８５であってもよく、例えば本発明に係る改変及び／又は任意の翻訳後修飾を含んでいてもよい。
成熟ポリペプチドコーディング配列：「成熟ポリペプチドコーディング配列」（mature polypeptide coding sequence）とは、成熟アルブミンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。成熟ポリペプチドコーディング配列は配列番号１のヌクレオチド１～１７５８であってもよく、例えば本発明に係る変異体をコードするのに必要な改変を含んでいてもよい。
配列同一性：２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の間の類縁性を「配列同一性」（sequence identity）というパラメーターで表す。
本発明の目的において、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）の好ましくはバージョン３．０．０以降、より好ましくはバージョン５．０．０以降のNeedleプログラムにより実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて決定される。使用されるパラメーターは、ギャップ開放ペナルティ（gap open penalty）が１０、ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）が０．５、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。（-nobriefオプションを用いて得られる）「最長同一性」（longest identity）と付されたNeedleの出力を％同一性として使用する。これは以下の式で算出される。
（同一残基数×１００）／（アラインメント長－アラインメント中のギャップ総数）
本発明の目的において、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の間の配列同一性は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 同上）の好ましくはバージョン３．０．０以降、より好ましくはバージョン５．０．０以降のNeedleプログラムにより実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 同上）を用いて決定される。使用されるパラメーターは、ギャップ開放ペナルティ（gap open penalty）が１０、ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）が０．５、EDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。T（-nobriefオプションを用いて得られる）「最長同一性」（longest identity）と付されたNeedleの出力を％同一性として使用する。これは以下の式で算出される。
（同一オキシリボヌクレオチド数×１００）／（アラインメント長－アラインメント中のギャップ総数）
断片：本明細書で使用する場合、「断片」（fragment）という語は、全長アルブミン又はその変異体の任意の断片であって、少なくとも１つの（例えば数個の）基本特性、例えば結合活性（例えばビリルビンへの結合等、活性の種類及び比活性）、オスモル濃度（膠質浸透圧、コロイド浸透圧）、所定のｐＨ範囲における挙動（ｐＨ安定性）等が実質的に変化していないものをいう。ここで「実質的に」（significantly）とは、当初のタンパク質の特性と比較して、斯かる変異体の特性が異なるものの、明確に異なるとまでは言えないと、当業者であれば判断する程度をいう。断片はＨＳＡ由来の中断のない一つの配列からなっていてもよいが、ＨＳＡ由来の２又はそれ以上の（例えば数個の）配列を含んでいてもよい。本発明に係る断片のサイズは、約２０アミノ酸残基超、好ましくは３０アミノ酸残基超、より好ましくは４０アミノ酸残基超、より好ましくは５０アミノ酸残基超、より好ましくは７５アミノ酸残基超、より好ましくは１００アミノ酸残基超、より好ましくは２００アミノ酸残基超、より好ましくは３００アミノ酸残基超、より一層好ましくは４００アミノ酸残基超、最も好ましくは５００アミノ酸残基超である。断片は、アルブミン又はアルブミンのドメインの少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列を含み、又は当該配列からなっていてもよい。本発明の好ましいアルブミンドメインは、配列番号２のアミノ酸残基１～１９４±１～１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインＩに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％、又は１００％の同一性を有するドメイン；配列番号２のアミノ酸残基１９２～３８７±１～１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインIIに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％又は１００％の同一性を有するドメイン；及び、配列番号２のアミノ酸残基３８１～５８５±１～１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインIIIに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％又は１００％の同一性を有するドメインが挙げられる。
ドメインＩ、II及びIIIは、例えばＨＳＡ（配列番号２）を参照して定義することができる。例えば、ＨＳＡドメインＩは、配列番号２のアミノ酸１～１９４（±１～１５アミノ酸）を含み、或いはこれらのアミノ酸からなり、ＨＳＡドメインIIは、配列番号２のアミノ酸１９２（±１～１５アミノ酸）～３８７（±１～１５アミノ酸）を含み、或いはこれらのアミノ酸からなり、ドメインIIIは、配列番号２のアミノ酸残基３８１（±１～１５アミノ酸）～５８５（±１～１５アミノ酸）を含み、或いはこれらのアミノ酸からなる。ここで「±１～１５アミノ酸」とは、指定されるアミノ酸位置のＣ末端及び／又はＮ末端側に、残基数が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５アミノ酸分ずれていてもよいことを意味する。ドメインＩ、II及びIIIの例は、Dockal等（The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310）及びKjeldsen等（Protein Expression and Purification, 1998, Vol 13: 163-169）に記載されている。これらを以下の表に示す。
Figure 0007007261000001
断片は、ここに記載のアルブミンの１又は２以上の（例えば数個の）ドメイン、例えばＤＩ＋ＤII、ＤＩ＋ＤIII、ＤII＋ＤIII、ＤIII＋ＤIII、ＤＩ＋ＤIII＋ＤIII、ＤIII＋ＤIII＋ＤIIIを含み、又はこれらのドメインからなっていてもよく、或いは斯かるドメイン又は複数のドメインの組合せの断片を含み、又はこれらのドメインからなっていてもよい。
当業者であれば、非ヒトアルブミンのドメインＩ、II及びIIIを、ＨＳＡとのアミノ酸配列アラインメントにより、例えばEMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）の好ましくはバージョン３．０．０以降、より好ましくはバージョン５．０．０以降のNeedleプログラムにより実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて決定することができる。使用するオプショナルパラメーターは、ギャップ開放ペナルティ（gap open penalty）が１０、ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）が０．５、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。他の適切なソフトウェアとしては、MUSCLE（Multiple sequence comparison by log-expectation, Robert C. Edgar, Version 3.6, http://www.drive5.com/muscle; Edgar (2004) Nucleic Acids Research 32(5), 1792-97 and Edgar (2004) BMC Bioinformatics, 5(1):113）が挙げられる。これはユーザーガイド（バージョン３．６、２００５年９月）に記載のデフォルト設定で使用してもよい。MUSCLE3.6よりも後のバージョンも、本発明の任意の側面に使用できる。適切なアラインメントの例を図１及び２に示す。
ドメインは、ＨＳＡ（配列番号２）のドメインＩ、II又はIIIに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％の同一性又は１００％の同一性を有することが好ましい。
更に、上記の何れかを含む単一又は多重の異種融合体；或いは、アルブミンに対する単一又は多重の異種融合体、又はこれらの任意の変異体又は断片を使用してもよい。斯かる融合体としては、国際公開第２００１／０７９２７１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のアルブミンＮ末端融合体、アルブミンＣ末端融合体、及び、アルブミンＮ末端及びＣ末端共融合体が挙げられる。
等価のアミノ酸位置：本明細書を通じて、アミノ酸位置は全長成熟ＨＳＡ（即ちリーダー配列を含まない、配列番号２）を基準に定める。しかし、当業者であれば理解するように、本発明は、非ヒトアルブミン（例えば本明細書に記載のもの）の変異体、及び／又は、ヒト又は非ヒトアルブミンの断片にも関する。明確化のため、ＨＳＡ（配列番号２）以外のアルブミンについては、等価の残基に変異が存在することが好ましい。ＨＳＡの断片、動物アルブミン、及びそれらの断片、融合体、及び他の誘導体又は変異体における等価の位置は、アミノ酸配列の一対（例えばClustalW）又は多重（例えばMUSCLE）アラインメントを用いて特定できる。例えば、図１に示すように、全長ＨＳＡの５００、５５０及び５７３に等しい位置を、ＨＳＡの断片及び他の種のアルブミンにおいて特定するのは容易である。位置５００、５５０及び５７３を矢印で示す。更なる詳細を以下の表２に示す。
Figure 0007007261000002
図１はMUSCLEにより、ClustalW 1.81フォーマットの出力を含むデフォルトパラメーターを用いて生成した。原出力データをBoxShade 3.21（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.htmlにてアクセス可能）を用いてシェードし、出力フォーマット（Output Format）：RTF_new；フォントサイズ：１０；コンセンサスライン（Consensus Line）：コンセンサスラインなし（no consensus line）；配列の割合（fraction of sequences）(シェーディングのためには一致させる必要あり）：０．５；入力配列フォーマット（Input sequence format）：ＡＬＮを用いた。従って、本明細書を通じて、ＨＳＡにより定義されるアミノ酸位置は、ＨＳＡの断片、誘導体、又は変異体及び融合体、他の種のアルブミン及びその断片及び融合体における等価の位置にも適用される。斯かる等価の位置は、（ｉ）その天然タンパク質とは異なる残基数、及び／又は、（ii）その天然タンパク質とは異なる天然アミノ酸を有する場合がある。同様に、図２に示すように、アルブミンの断片（例えばドメイン）における等価の位置は、配列番号２（ＨＳＡ）を基準として特定することができる。
保存的置換：本明細書で使用する場合、「保存的」（conservative）アミノ酸置換という語は、同一の群内での置換であって、通常はタンパク質の機能に影響を及ぼさない置換をいう。「保存的置換」（conservative substitution）という語は、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒ等の組合せを意図している。斯かる変異体は、本技術分野で周知の技術により、例えば米国特許第４,３０２,３８６号（１９８１年１１月２４日、Stevens：本公報は参照により本明細書に組み込まれる）に開示の部位特異的突然変異生成法等により作製することができる。
一態様によれば、図３のベン図を用いて、保存的アミノ酸置換を決定することができる。図３を用いることにより、保存変異スコア（conservation mutation score：０～５の間の値）を算出できる。スコア０は保存性が最も高く、例えばシステインの場合、システイン残基を他のシステイン残基で置換する場合のみが該当する。他の任意のアミノ酸からシステインへの置換（又はシステインから他の任意のアミノ酸への置換）の場合、スコアは１、２、３、４、又は５の何れかとなる。スコア１はスコア２、３、４又は５よりも保存性の高い置換である。スコア５はシステインと置換アミノ酸との間の保存性が最も低いことを意味する。０～５のスコアは、図３においてシステインから対象のアミノ酸へと移動する際に横断する境界（即ち線）の数から求められる。即ち、システイン同士の場合、何れの境界も横断しないので、スコアは０となる。同様に、アスパラギン酸（Ｄ）に移動する際には３つの境界を横断するので、そのスコアは３となる。２０種の異なるアミノ酸の保存変異スコアは（図３によれば）以下のように定義される（アミノ酸は一文字コードで表す）：Ａ＝１、Ｃ＝０、Ｄ＝３、Ｅ＝４、Ｆ＝４、Ｇ＝２、Ｈ＝５、Ｉ＝４、Ｋ＝４、Ｌ＝４、Ｍ＝３、Ｎ＝２、Ｐ＝３、Ｑ＝３、Ｒ＝５、Ｓ＝１、Ｔ＝１、Ｖ＝３、Ｗ＝３、Ｙ＝３。
以上の代わりに、或いは以上に加えて、「保存的」アミノ酸置換とは、同一の群内で行われる置換、例えば塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）及び小型アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）という群内での置換を意味する。
例えば、配列番号２のアラニン－２の保存的置換としては、グリシン又はセリンでの置換が挙げられる。非保存的置換には、ある群のアミノ酸を他の群のアミノ酸で置換することが挙げられる。例えば、非保存的置換の例としては、極性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換が挙げられる。
変異体の指定の取り決め
本発明の目的においては、配列番号２に開示される成熟ポリペプチドを用いて、他のアルブミンにおける対応するアミノ酸残基を決定する。他のアルブミンのアミノ酸配列を配列番号２に開示される成熟ポリペプチドとアラインし、そのアラインメントに基づいて、配列番号２に開示される成熟ポリペプチドにおけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置の番号を、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 同上）の好ましくはバージョン３．０．０以降、より好ましくはバージョン５．０．０以降のNeedleプログラムにより実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 同上）を用いて決定する。使用されるパラメーターは、ギャップ開放ペナルティ（gap open penalty）が１０、ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）が０．５、EBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。
他のアルブミンにおける対応するアミノ酸残基の番号は、幾つかのコンピュータープログラムを用いて、複数のポリペプチド配列のアラインメントを行うことにより、決定または確認することが可能である。斯かるコンピュータープログラムとしては、これらに限定されるものではないが、MUSCLE（multiple sequence comparison by log-expectation；バージョン３．５以降；Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797）、MAFFT （バージョン６．８５７以降；Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900）、及びClustalWを用いるEMBOSS EMMA（１．８３以降；Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680）を、それぞれのデフォルトパラメーターで実施することが挙げられる。
配列番号２の成熟ポリペプチドから分岐した他のポリペプチド（又はタンパク質）について、従来の配列に基づく比較ではそれらの類縁性を検出できない場合は（Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615）、他の一対配列比較アルゴリズムを用いることができる。ポリペプチドファミリーの確率的表現（プロファイル）を利用してデータベースの検索を行う検索プログラムを用いれば、配列に基づく検索でもより高い感度が達成できる。例えばPSI-BLASTプログラムでは、反復データベース検索プロセスを通じてプロファイルを生成し、遠縁のホモログを検出することができる（Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーがタンパク質構造データベース内に１又は２以上の（例えば数個の）表現を有する場合は、更に高い感度が達成できる。GenTHREADER（Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881）等のプログラムは、種々の情報源（PSI-BLAST、二次構造予測、構造アラインメントプロファイル、及び溶媒和ポテンシャル）からの情報を入力として利用するニューラルネットワークによって、照会される配列の折り畳み構造を予測する。同様に、Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919の方法を用いれば、構造未知の配列をSCOPデータベース内に存在するスーパーファミリーモデルとアラインすることができる。こうして得られたアラインメントを用いて、当該ポリペプチドのホモログモデルを生成することができる。斯かるモデルの精度は、そうした目的のために開発された種々のツールを用いて検証することができる。
構造既知のタンパク質の場合、構造アラインメントの検索及び生成のために、幾つかのツールやリソースを利用できる。例えばSCOPスーパーファミリーのタンパク質は構造的にアラインされており、斯かるアラインメントはアクセス及びダウンロード可能である。２種以上の（例えば数種の）タンパク質構造のアラインメントは、種々のアルゴリズムを用いて行うことができる。斯かるアルゴリズムの例としては、距離アラインメントマトリックス（distance alignment matrix）（Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96）又は組合伸長（combinatorial extension）（Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Enginee環 11: 739-747）が挙げられる。これらのアルゴリズムを実行することで、更に構造データベース内の所望の構造を照合し、構造ホモログの候補を検索する事も可能である（例えばHolm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567）。
本発明のアルブミン変異体を記述するに際して、参照を容易にするために、以下に説明する命名法を採用するものとする。ＩＵＰＡＣで認められている１文字又は３文字のアミノ酸の略称を用いる。「点変異」（point mutation）及び／又は「改変」（alteration）という語は、欠失、挿入、及び置換を含むものとする。
置換：アミノ酸の置換は、元のアミノ酸、位置、置換後のアミノ酸、という順序で記載する。従って、位置２２６のトレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ３２６Ａｌａ」又は「Ｔ３２６Ａ」と表される。多重変異（又は多重改変）は加算記号（「＋」）で区切って示す。例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）及び位置４１１のセリン（Ｓ）の、それぞれアルギニン（Ｒ）及びフェニルアラニン（Ｆ）による多重置換を表す。また、例えば「Ｅ４９２Ｔ／Ｎ５０３Ｄ」のように、スラッシュ（「／」）も同じ意味で用いる。これは加算記号（「＋」）と相互交換可能である。
欠失：アミノ酸の欠失は、元のアミノ酸、位置、＊、という順序で記載する。従って、従って、位置１９５のグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表される。多重欠失は加算記号（「＋」）で区切って、例えば「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」のように示す。
挿入：上述のように、挿入は、ある位置を占めるアミノ酸（「指名された（又は元の）アミノ酸」、「Ｘ」）のＮ側（「上流」、「Ｘ－１」）でもＣ側（「下流」、「Ｘ＋１」）でもよい。
元のアミノ酸（「Ｘ」）のＣ側（「下流」、「Ｘ＋１」）にアミノ酸が挿入される場合、元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されるアミノ酸、という順序で記載する。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と表される。複数アミノ酸の多重挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されるアミノ酸＃１、挿入されるアミノ酸＃２；等］という順序で示される。例えば、位置１９５のグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表される。このような場合、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基は、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対して下付文字を付して表す。よって、上の例では、以下の順序となる。
Figure 0007007261000003
元のアミノ酸（Ｘ）のＮ側（「上流」、「Ｘ－１」）にアミノ酸が挿入される場合、元のアミノ酸、位置、挿入されるアミノ酸、元のアミノ酸、という順序で記載する。従って、位置１９５のグリシン（Ｇ）の前へのリシン（Ｋ）の挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＬｙｓＧｌｙ」又は「Ｇ１９５ＫＧ」と表される。複数アミノ酸の多重挿入は、［元のアミノ酸、位置、挿入されるアミノ酸＃１、挿入されるアミノ酸＃２；等、元のアミノ酸］という順序で示される。例えば、位置１９５のグリシンの前へのリシン（Ｋ）及びアラニン（Ａ）の挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＬｙｓＡｌａＧｌｙ」又は「Ｇ１９５ＫＡＧ」と表される。このような場合、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基は、挿入される（１又は２以上の）アミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対して、下付文字及びダッシュ（’）を付して示す。よって、上の例では、以下の順序となる。
Figure 0007007261000004
多重改変：複数の改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）で区切って示す。例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、位置１７０のアルギニン及び位置１９５のグリシンの、それぞれチロシン及びグルタミン酸による置換を示す。
異なる改変：単一の位置に複数の異なる改変を導入できる場合、斯かる複数の異なる改変をコンマで区切って示す。例えば「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０のアルギニンがチロシン又はグルタミン酸で置換されることを示す。即ち、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、以下の変異体を示す。「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
コンジュゲーション能力：コンジュゲーション可能なシステインとは、コンジュゲーションパートナーとの間に、特にアルブミンではないコンジュゲーションパートナーとの間に、分子内結合を形成しうるシステイン残基である。コンジュゲーション可能なポリペプチド、即ちチオアルブミンは、コンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、コンジュゲーションパートナーと分子内結合を形成しうる。チオアルブミンは、高レベルのコンジュゲーション能力を有していてもいなくてもよい。例えば、コンジュゲーション可能なシステインを１つのみ、Ｃｙｓ－３４として有する配列番号２のアルブミンのコンジュゲーション能力と比較して、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％のコンジュゲーション能力を有していてもよい。コンジュゲーション能力は、所望の任意のコンジュゲーション可能な分子（コンジュゲーションパートナー）、例えば生物活性分子や蛍光色素との比較において決定することができる。その決定は、例えば質量スペクトル分析（mass spectrometry：ＭＳ）や、生物活性化合物の活性、例えばその蛍光等を定量化することにより行うことができる。アルブミンとビオチン又はHRPとのコンジュゲーション能力は、結果として生じるコンジュゲートの質量、及び／又は、コンジュゲートされた化合物の酵素活性をアッセイすることにより、決定することができる。蛍光標識及び細胞内取り込みによる決定法が、McGraw et al., (1987), The Journal of Cell Biology, 105, 207-214；及びPresley et al., (1993), The Journal of Cell Biology, 122, 1231-1241に記載されている。高いコンジュゲーション能力を有するチオアルブミンの利点は、チオアルブミンに対する分子の効率的なコンジュゲーションを可能にする、という点にある。コンジュゲーション能力は経時的に計測してもよい。好ましいチオアルブミンとしては、（ａ）最大のコンジュゲーションを即時に達成するものや、（ｂ）徐々に達成するものが挙げられる。特定のシステインのコンジュゲーション能力は、当業者に既知の方法により決定することができる。例えば、コンジュゲーション後にタンパク質を溶解し、ペプチドマッピングを実施して、特定のシステインにおけるコンジュゲーションの程度を決定すればよい。
生物活性剤又は生物活性化合物は、生存する生物、系、又は細胞と相互作用する能力を有する剤又は化合物である。例えば、生物学的剤又は化合物でもよく、化学的剤又は化合物でもよい。
リガンド結合：アルブミンのリガンド結合特性としては、陰イオン及び中性リガンド、例えば長鎖脂肪酸、ビリルビン、及び他の雑多なリガンドへの結合が含まれる。長鎖脂肪酸、オレイン酸（Ｃ１８：１）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、リノレイン酸（Ｃ１８：２）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）が、ＨＳＡに結合することが知られている。ＨＳＡ及びチオアルブミンのリガンド結合試験は、本目的への適格性を満たした等温滴定熱量測定法を用いて実施することができる。試料の前処理として、脱脂（Sogami, M. and J. F. Foster (1968). Biochemistry 7(6): 2172-82；本文献は参照により本明細書に組み込まれる）及チオールブロッキング（Sogami, M., H. A. Petersen, et al. (1969). Biochemistry 8(1): 49-58；本文献は参照により本明細書に組み込まれる）、並びにその後のゲル浸透クロマトグラフィーを実施することもできる。チオアルブミン及びＨＳＡと、例えばオクタン酸等との結合曲線を生成して比較し、機能的類似性を構築してもよい。コンジュゲートされたチオアルブミン及び／又はコンジュゲートされていないチオアルブミンの、ビリルビン及び／又は脂肪酸に対して、モル対モルの条件下で、ＨＳＡの受容体結合活性の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％又は５０％、６０％、７０％、少なくとも８０％、９０％、９５％、１００％、１０５％又はそれ以上の受容体結合活性を有する。
ＦｃＲｎ及びｓｈＦｃＲｎ：「ＦｃＲｎ」という語は、新生児Ｆｃ受容体（neonatal Fc receptor：ＦｃＲｎ）、特にヒト新生児Ｆｃ受容体を意味する。ｓｈＦｃＲｎはＦｃＲｎの可溶性組換携帯である。ｓｈＦｃＲｎは配列番号２６（主要組織適合性複合体クラスＩ様Ｆｃ受容体（major histocompatibility complex class I-like Fc receptor：ＦＣＧＲＴ）の切断型重鎖）及び配列番号２７（β－２－ミクログロブリン）のヘテロ二量体。即ち、配列番号２６及び２７が一緒になってｈＦｃＲｎを形成する。
コンジュゲート化及び／又は非コンジュゲート化チオアルブミンは、ＦｃＲｎに対する結合親和性が改変されていてもいなくてもよい。
チオアルブミン又はそのコンジュゲートのＦｃＲｎへの結合性は、親アルブミン又はそのコンジュゲートのＦｃＲｎへの結合性と比較して、より強くてもより弱くてもよい（が、強い方が好ましい）。
チオアルブミン又はそのコンジュゲートのＦｃＲｎ（例えばｓｈＦｃＲｎ）に対するＫＤは、ＨＳＡ又はそのコンジュゲートの対応するＫＤよりも低くてもよい。中でも、チオアルブミン又はコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．９×ＫＤ未満、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．５×ＫＤ未満、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．１×ＫＤ未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０５×ＫＤ未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０２×ＫＤ未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０１×ＫＤ未満、最も好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．００１×ＫＤ未満であることが好ましい（ここで×は倍数を表す。）。
チオアルブミンを含むコンジュゲートの場合、斯かるコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡを含む対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．９×ＫＤ未満、より好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．５×ＫＤ未満、より好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．１×ＫＤ未満、より一層好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０５×ＫＤ未満、より一層好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０２×ＫＤ未満、より一層好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０１×ＫＤ未満、最も好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．００１×ＫＤ未満であることが好ましい（ここで×は倍数を表す。）。ここで「対応するコンジュゲート」（corresponding conjugate）とは、チオアルブミン（即ちアルブミン変異体）の代わりにＨＳＡ（例えば配列番号２）を含むコンジュゲートを意味する。
チオアルブミン又はそのコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤは、対応するＨＳＡ又はそのコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤよりも高くてもよい。中でも、チオアルブミン又はコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて２×ＫＤ超、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて５×ＫＤ超、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて１０×ＫＤ超、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて２５×ＫＤ超、最も好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて５０×ＫＤ超であることが好ましい。チオアルブミン又はコンジュゲートはＦｃＲｎに対して全く結合しなくともよい。
チオアルブミンを含むコンジュゲートの場合、斯かるコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡを含む対応するコンジュゲートのＫＤに対して、対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて２×ＫＤ超、より好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて５×ＫＤ超、より好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて１０×ＫＤ超、より一層好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて２５×ＫＤ超、最も好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて５０×ＫＤ超であることが好ましい。ここで「対応するコンジュゲート」（corresponding conjugate）とは、チオアルブミン（即ちアルブミン変異体）の代わりにＨＳＡ（例えば配列番号２）を含むコンジュゲートを意味する。
ＫＤを決定及び／又は比較する場合、以下のパラメーターのうち１又は２以上（例えば数個）（そして好ましくは全て）を使用してもよい。
機器：Biacore 3000 instrument（GE Healthcare）。
フローセル：ＣＭ５センサーチップ。
ＦｃＲｎ：ヒトＦｃＲｎ、好ましくは可溶性ヒトＦｃＲｎ。任意によりβ－２－ミクログロブリンのＣ末端にタグが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（Glutathione S Transferase：ＧＳＴ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ）、最も好ましくはＨｉｓ、例えば６ヒスチジン残基が結合されていてもよい。
ＦｃＲｎの量：１２００～２５００ＲＵ。
カップリング化学： アミンカップリング化学（例えば使用機器のメーカーが提供するプロトコールに記載の通り）。
カップリング法：カップリングは、例えば１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２０μg／ｍＬのタンパク質溶液（ｐＨ５．０）（GE Healthcare）を注入して実施することができる。ランニングバッファー及び希釈バッファーとしては、例えばｐＨ５．５のリン酸緩衝剤（６７ｍＭリン酸緩衝剤、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％ Tween 20）を使用できる。表面の再生は、例えばｐＨ７．４のＨＢＳ－ＥＰ緩衝剤（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０）（Biacore AB）を注入して実施することができる。
試験分子（例えばＨＳＡ又は変異体）の注入量：２０～０．０３２μＭ。
注入流量：定速、例えば３０μＬ／ｍＬ。
注入温度：２５℃。
データ評価用ソフトウェア：BIAevaluation 4.1ソフトウェア（BIAcore AB）。
血漿中半減期：血漿中半減期は、インビボで適切な個人について決定するのが理想的である。しかし、動物やヒトの実験は時間及び費用を要する上に、必然的に倫理的な問題を伴うことから、インビトロアッセイにより血漿中半減期が延長されるか短縮されるかを決定することが望ましい。アルブミンのその受容体（ＦｃＲｎ）への結合性は血漿中半減期にとって重要であり、受容体結合と血漿中半減期との相関性は、アルブミンのその受容体への親和性が高いほど、血漿中半減期が長くなることが知られている。従って、本発明では、アルブミンのＦｃＲｎに対する親和性が高ければ、血漿中半減期が延長されたことを示す指標として扱い、アルブミンのその受容体に対する親和性が低ければ、血漿中半減期が短縮されたことを示す指標として扱うものとする。
アルブミンのその受容体ＦｃＲｎに対する結合は、親和性という語と、「より強い」（stronger）又は「より弱い」（weaker）という表現を用いて記載することができる。即ち、ある分子がＨＳＡと比較してより高いＦｃＲｎへの親和性を有する場合、当該分子はＨＳＡよりもＦｃＲｎに対してより強く結合するものと解され、ある分子がＨＳＡと比較してより低いＦｃＲｎへの親和性を有する場合、当該分子はＨＳＡよりもＦｃＲｎに対してより弱く結合するものと解される。「結合親和性」（binding affinity）という語の代わりに「結合係数」（binding coefficient）という語を使用してもよい。
「より長い血漿中半減期」又は「より短い血漿中半減期」、及び同様の表現は、対応する親又は参照又は対応アルブミン分子を基準としたものと解される。即ち、本発明の変異体アルブミンについて、より長い血漿中半減期という場合には、そこに記載の（１又は２以上の）改変を除いては同一の配列を有する対応アルブミンと比較して、当該変異体がより長い血漿中半減期を有するという意味である。
参照：参照（reference）とは、あるアルブミン変異体、融合、コンジュゲート、組成物、アソシエイト、ナノ粒子又はマイクロ粒子の比較対象となるアルブミン、融合、コンジュゲート、組成物、アソシエイト、ナノ粒子又はマイクロ粒子である。斯かる参照は、全長アルブミン（例えばＨＳＡ又はその天然アレル）又はその断片を含んでいてもよく、或いは全長アルブミン又はその断片からなるものでもよい。また、参照は、アルブミン変異体、融合、コンジュゲート、組成物、アソシエイト又はナノ粒子の比較対象となる「対応の」（corresponding）アルブミン、融合、コンジュゲート、組成物、アソシエイト又はナノ粒子のことを指す場合もある。参照は、ＨＳＡ（配列番号２）又はその断片、融合、コンジュゲート、アソシエイト、ナノ粒子又はマイクロ粒子を含んでいてもよく、或いはこれらからなるものでもよい。斯かる参照は、そのアルブミン部分を除いては、本発明に係る（「試験対象の」（being studied））ポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、組成物、アソシエイト、ナノ粒子又はマイクロ粒子と同一である。参照のアルブミン部分は、アルブミン（例えばＨＳＡ、配列番号２）又はその断片を含み、或いは当該アルブミン又はその断片からなることが好ましい。参照のアルブミン部分のアミノ酸配列の長さは、本発明に係る（「試験対象の」（being studied））ポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、組成物、アソシエイト、ナノ粒子又はマイクロ粒子のアルブミン部分のアミノ酸配列の長さと比較して、より長くてもより短くてもよいが、同程度（±１～１５アミノ酸）であることが好ましい。
アレル変異体：「アレル変異体」（allelic variant）という語は、同一の染色体座を示す遺伝子の２又はそれ以上の（数種の）多型の各々を意味する。アレル多様性は変異により天然に生じ、集団内において多型を生じる場合がある。遺伝子変異にはサイレント変異の場合（コードされるポリペプチドが変化しない場合）もあれば、コードするポリペプチドのアミノ酸配列に改変が生じる場合もある。ポリペプチドのアレル変異体とは、ある遺伝子のアレル変異体によりコードされるポリペプチドを意味する。ＨＳＡ（配列番号２）の多型については、Minchiotti et al. (2008). Hum Mutat 29(8): 1007-16及びhttp://www.uniprot.org/uniprot/P02768において議論されている。
コーディング配列：「コーディング配列」（coding sequence）という語は、その翻訳されたポリペプチド産物のアミノ酸配列を直接指定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は概ねオープンリーディングフレーム（open reading frame）により規定される。オープンリーディングフレームは通常ＡＴＧ開始コドン、或いはＧＴＧやＴＴＧ等の他の開始コドンから開始し、停止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡにより終止する。コーディング配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、又は組換ポリヌクレオチドの何れであってもよい。
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という語は、真核細胞から得られるスプライスされた成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写して調製されるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡに存在するイントロン配列を有さない。当初の一次ＲＮＡ転写物がｍＲＮＡの前駆体となり、これがスプライシングを含む一連の処理工程を受ける結果、スプライスされた成熟ｍＲＮＡが生成される。
核酸コンストラクト：「核酸コンストラクト」（nucleic acid construct）という語は、天然遺伝子から単離されてなる、或いは天然では存在し得ない核酸のセグメントを含むように改変されてなる、或いは合成されてなる、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味する。核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列を発現させるのに必要な調節配列を含む場合、「核酸コンストラクト」は「発現カセット」（expression cassette）と同義である。
調節配列：「調節配列」（control sequence）という語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを発現させるのに必要なあらゆる核酸配列を意味する。各調節配列は、当該変異体をコードするポリヌクレオチドに対して天然（即ち同一遺伝子由来）でも外来（即ち異なる遺伝子由来）でもよい。また、調節配列相互間が互いに天然でも外来でもよい。斯かる調節配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、調節配列はプロモータ並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。変異体をコードするポリヌクレオチドのコーディング領域と調節配列との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、調節配列にリンカーを付与してもよい。
作動式に連結された：「作動式に連結された」（operably linked）という語は、調節配列によってポリヌクレオチドのコーディング配列の発現が誘導されるように、調節配列がコーディング配列に対して適切な位置になるよう配置されてなる構成を意味する。
発現：「発現」（expression）という語は、変異体の産生に関与する任意の工程を含み、これらに限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む。チオアルブミンは、例えば酵母（例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）等、又はアスペルギルス属（Aspergillus）等）等の適切な発現系において、非修飾アルブミン（例えば配列番号２）の発現レベルに対して少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％のレベルで発現されてもよく、されなくてもよい。相対的な発現レベルは、例えばタンパク質の発現後にＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＧＰ－ＨＰＬＣ又はウエスタンブロッティングで定量化することにより、決定することができる。
発現ベクター：「発現ベクター」（expression vector）という語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、その発現のための調節配列と作動式に連結されてなる、直鎖又は環状のＤＮＡ分子を意味する。
宿主細胞：「宿主細胞」（host cell）という語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより形質転換（transformation）、トランスフェクション、トランスダクション等することが可能な任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という語には、複製時に生じた変異ゆえに親細胞とは異なるものとなった、親細胞の任意の子孫も含むものとする。
コンジュゲーション可能なポリペプチドＩ
本発明の第一の側面は、ヒトアルブミン、特に配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列の残基１～５８５、又はその断片と少なくとも６０％同一のアミノ酸配列を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチドであって；
配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８から選択される位置に等しい少なくとも１つの（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含み；
好ましくは、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向は、親ポリペプチド（例えば配列番号２のポリペプチド）が溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも７０％であり、より好ましくは、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、少なくとも９９又は１００％である、コンジュゲーション可能なポリペプチドに関する。親ポリペプチドは、本明細書に記載の１又は２以上のコンジュゲーション可能なＣｙｓ残基を含まないことが好ましい。親ポリペプチドは、本発明に記載の１又は２以上の変異を含まないことが好ましい。即ち、親ポリペプチドは、コンジュゲーション可能なポリペプチドに導入された１又は２以上のシステイン残基、及び存在する場合には、コンジュゲーション可能なポリペプチドに導入された１又は２以上の他の変異を除いては、コンジュゲーション可能なポリペプチドと同一であることが好ましい。
前記少なくとも１つの（例えば数個の）位置は、Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、及びＥ３５８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択されるのが適切である。
前記コンジュゲーション可能なポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．２、９９．４、９９．６、９９．８％の配列同一性を有することが好ましい。例えば、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドは、導入された１又は２以上のＣｙｓ残基の他に、配列番号２と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０（例えば数個の）他の変異を有していてもよい。或いは、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドは、導入された１又は２以上のＣｙｓ残基に加えて、配列番号２に対する他の変異が０であってもよい。
前記コンジュゲーション可能なポリペプチドは、その溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも７５％であると共に、Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｌ２８４、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８から選択される位置に等しい少なくとも１つの位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むことが好ましい。
前記ポリペプチドは組換ポリペプチドであることが好ましい。前記ポリペプチドは、単離及び／又は精製されたポリペプチドであることが好ましい。前記ポリペプチドは、合成されたものであり、及び／又は、天然では生じないものであることが好ましい。
上記の位置におけるコンジュゲーション可能なシステインは、アルブミンに対して以下の手法により形成されたものであってもよく、そうでなくてもよい。例えば、システインを単独で、或いは１又は２以上の（例えば数個の）更なる残基と共に、アルブミン配列の既存のアミノ酸残基を除去することなく挿入することにより形成されたものでもよい。或いは、１又は２以上の（例えば数個の）隣接するアミノ酸を、少なくとも１つの（例えば数個の）システインを含む、より数の多い残基で置換することにより、ポリペプチドの全長を増加させたものであってもよい。例えば、本明細書において特定したアルブミン残基に直接隣接する位置に、システイン残基を導入してもよい。システイン残基は単一のシステイン残基として導入してもよく、ポリペプチドの一部として導入してもよい。ポリペプチドは例えば２～５０アミノ酸長、好ましくは２、１０、２０、３０、又は４０アミノ酸長から、１０、２０、３０、４０又は５０アミノ酸長であってもよい。
適切には、前記ポリペプチドが、
ａ）配列番号２の残基Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１の何れかに等しい位置に対応する位置における、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換；及び／又は、
ｂ）配列番号２の残基Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１の何れかに等しい位置に対応するアミノ酸のＮ又はＣ側に隣接する位置への、システインの挿入
のうち１又は２以上（例えば数個）を含む。
中でも置換が好ましく、以下の選択される位置の開示は、具体的に制限なく置換を含むものとして解すべきである。
適切には、配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される位置に等しい２、３、４、５又はそれ以上の（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含む。適切には、前記２、３、４、５又はそれ以上の（例えば数個の）位置は、Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、及びＥ３５８から、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０及びＩ２７１から選択される。
配列番号１の位置Ｅ２９４に等しい位置にＣｙｓを含むポリペプチドの場合、斯かるポリペプチドは更に、Ｋ９３、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、又はＥ３８２のうち１又は２以上に等しい位置にもＣｙｓを含むことが好ましい。
本発明者等は、Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、及びＥ３８２から選択される位置においてシステインが置換されたＨＳＡの変異体について、その溶液中で単量体として存在する傾向が、ＨＳＡ配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも７０％であるという、有益な特性を有することを見出した。従って、選択される位置の何れか１つにシステインを導入することで、当該変異体が溶液中で二量体又はより高次の多量体を形成する傾向が低減される。この有益な作用は、選択された位置のうち２以上の位置にシステインが存在する変異体にも認められる。理論に束縛されることを意図するものではないが、本発明者等の推測によれば、本発明のポリペプチドが単量体化傾向を有するのは、システイン置換部位の周辺におけるポリペプチド鎖の柔軟性、システイン置換部位の表面への暴露によるものと考えられる。これは、本発明者等がタンパク質構造生物学における長年の経験に基づく創作能力を発揮し、システインで置換すべきＨＳＡ内の位置を吟味して選択したことを反映している。
アルブミン又はその変異体が二量体又はより高次の多量体ではなく、単量体として存在する傾向は、類似の条件の下、アルブミン又は変異体の溶液中における単量体、二量体及びより高次の多量体の定量値に基づいて決定することができる。
斯かる計測を行うのに適した技法としては、実施例に記載のゲル浸透高圧液体クロマトグラフィーが挙げられる。その結果は通常は「％単量体」として表され、その値は以下により算出される。
単量体アルブミンの質量×１００／（単量体アルブミンの質量＋二量体アルブミンの質量＋より高次の多量体の質量）
或いは、溶液中で非単量体、即ち、二量体及び／又はより高次の多量体を形成する傾向として表してもよい。「％非単量体」は１００％から％単量体を減算して算出される。
試料の試験は、振盪フラスコ又は１０Ｌバイオリアクターでの産生に続く精製直後（例えば精製後２４時間以内）に実施してもよく、或いは例えば２～８℃、例えば５℃において、最長１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、又は６ヶ月、又はこれらを含む期間に亘って保存した後に実施してもよい。試料の試験、及び任意によりその保存は、例えば１又は２以上の（例えば数種の）塩を含むｐＨ約７．０±０．５の溶液中で行うことができる。斯かる溶液は、例えば５０ｍＭ酢酸アンモニウム及び１０ｍＭオクタン酸ナトリウムを含む緩衝剤を含み、そのｐＨは例えば７．０であってもよく、そのポリペプチド濃度は好ましくは約０．２～約２．５ｍｇ／ｍＬであってもよい。前記溶液は、例えば２５ｍＭリン酸ナトリウム及び２１５ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝剤を含み、そのｐＨは例えば６．５であってもよく、そのポリペプチド濃度は好ましくは約５～約５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
所与のアルブミンの％単量体は、アルブミンの純度及び濃度に応じて変わる場合がある。振盪フラスコ培養により製造されたアルブミンは、通常は単回のAlbuPure（登録商標）（Prometic Life Sciences Inc.又はAlbumedix Ltd（旧名称Novozymes Biopharma UK Ltd））を用いたクロマトグラフィー工程により精製され、通常は濃度が約０．２～２．０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１±０．５ｍｇ／ｍＬであり、ＳＤＳ還元ＰＡＧＥによるタンパク質純度は＞９５％である。AlbuPure（登録商標）はアルブミン融合タンパク質の精製用に設計された高性能親和性捕捉吸着剤であり、塩基性マトリックスに結合された合成トリアジンリガンドを含む。これらの条件下におけるＨＳＡの％単量体は約８７％であり、２～８℃、例えば５℃で６ヶ月間の保存後には約８９％まで上昇した。１０Ｌバイオリアクター培養により製造されたアルブミンは、通常はAlbuPure（登録商標）クロマトグラフィー工程の後、イオン交換クロマトグラフィーにより精製され、次いで限外濾過された後、５０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製されるところ、ＳＤＳ還元ＰＡＧＥによるそのタンパク質純度は＞９９％となる。これらの条件下におけるＨＳＡの％単量体は約９４％であり、２～８℃で２ヶ月の保存及び２～８℃で６ヶ月の保存後も安定であった。従って、上述の典型的な振盪フラスコ産生及び精製の後に試験した場合、溶液中で単量体として存在する傾向がＨＳＡの少なくとも７０％である変異体は、精製直後の試料又は最長２ヶ月若しくは最長６ヶ月保存後の試料の何れについても、少なくとも６０％単量体、好ましくは少なくとも６９％単量体（４０％非単量体未満、好ましくは３１％非単量体未満）であると考えられる。溶液中で単量体として存在する傾向がＨＳＡの少なくとも８０％である変異体の場合、％単量体は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７９％単量体であり、％非単量体は ３０％未満、好ましくは２１％未満である。一方、上述のような典型的な１０Ｌバイオリアクター産生及び精製の後に試験した場合、溶液中で単量体として存在する傾向がＨＳＡの少なくとも７０％である変異体は、精製直後の試料又は最長２ヶ月保存後の試料の何れについても、少なくとも６５％単量体、好ましくは少なくとも６９％単量体であると考えられる。溶液中で単量体として存在する傾向がＨＳＡの少なくとも８０％である変異体の場合、％単量体は少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７９％である。斯かる傾向は０日目に、例えば変異体が製造されたその日に測定することが好ましい。しかし、その後に、例えば１、２、３、４、５、６、７日、又は２、３、４、５、６、７週間、或いは１又は２ヶ月間、例えば２～８℃、例えば５℃で保存した後に測定してもよい。また、最長７週間又は２ヶ月間の保存の間、％単量体が安定である、即ち、精製直後の試験と、例えば２～８℃、例えば５℃で２ヶ月間保存した後の試験との間で、％単量体が１０％ポイント超、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％ポイント超の減少を生じないことが適切である。中でも、精製直後の試験と、例えば２～８℃、例えば５℃で７ヶ月間保存した後の試験との間で、％単量体が５％ポイント超の減少を生じないことが好ましい。
本発明の変異体が溶液中で単量体として存在する傾向は、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％であってもよく、それ以外の値であってもよい。この傾向は精製直後に試験してもよく、例えば２～８℃、例えば５℃で最長６ヶ月間の保存後に試験してもよい。
前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向は、例えば、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも７週間の保存後、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも８週間の保存後、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも３ヶ月の保存後、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも４ヶ月の保存後、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも６ヶ月の保存後、又は約４０℃の温度で少なくとも３ヶ月の保存の後に測定することができる。中でも、前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向は、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも３ヶ月の保存後に測定することが最も好ましい。
前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向は、例えばポリペプチド濃度０．２～５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約５ｍｇ／ｍＬで測定することができる。
前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向は、そのｐＨが例えば約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、又は７．４から、約６．１、６．２、６．３、６．４、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４又は７．５まで、好ましくはｐＨ約７で測定することができる。
前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向は、例えば５０ｍＭ酢酸アンモニウム及び１０ｍＭオクタン酸ナトリウムを含むｐＨ７．０の緩衝剤中で、好ましくはポリペプチド濃度約０．５～約５ｍｇ／ｍＬで測定することができる。
前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向は、例えば２５ｍＭリン酸ナトリウム及び２１５ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ６．５の緩衝剤中で、好ましくはポリペプチド濃度約５～約５０ｍｇ／ｍＬで測定することができる。
前記コンジュゲーション可能なポリペプチドは、その保存に先立ち、例えばトリアジン（例えばAlbuPure（登録商標））クロマトグラフィーマトリックス又はＤＥ－ＦＦクロマトグラフィーマトリックス、より好ましくはトリアジン（例えばAlbuPure（登録商標））クロマトグラフィーマトリックス及びその後のＤＥ－ＦＦクロマトグラフィーマトリックスによって精製されてもよい。適切な方法は実施例１０に記載されている。
ポリペプチド試料保存庫は据置型（static）でもよい。ポリペプチド試料保存庫は鉛直型（vertical）でもよい。
上述のコンジュゲーション可能なシステインを２以上有する変異体は、斯かるシステインの数が１つ少ない点を除けば同一である変異体と比較して、その単量体として存在する傾向が低下していてもよい。例えば、置換Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ９３Ｃを有する変異体アルブミンは、何れか一方の置換のみを有する変異体アルブミンと比較して、その単量体として存在する傾向が低い。中でも、配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される２つの位置にコンジュゲーション可能なシステイン残基を含む変異体は、それら２つの位置のうち何れか一方の置換のみを有する他は同一である変異体アルブミンと比較して、その単量体として存在する傾向が少なくとも７５％であることが適切である。
中でも、配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、E２３０、I２７１、Ｅ３５８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される２つの位置にコンジュゲーション可能なシステイン残基を含む変異体は、それら２つの位置のうち何れか一方の置換のみを有する他は同一である変異体アルブミンと比較して、その単量体として存在する傾向が少なくとも７５％であることが適切である。
単量体である傾向は高い方が好ましい。例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％であることが好ましい。例えば、置換Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ９３Ｃを含むＨＳＡが溶液中で単量体として存在する傾向は、置換Ｋ９３Ｃを含むＨＳＡが溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも９０％であり、或いは、置換Ｅ２９４Ｃを含むＨＳＡが溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも８５％である。これらの結果は何れも実施例において、１０Ｌバイオリアクター調製物から精製された物質について、精製直後の試験、或いは２～８℃、例えば５℃で７週間又は２ヶ月間の保存後の試験で立証されている。また、同一の試料は６ヶ月間の保存後にも安定である。２以上のコンジュゲーション可能なシステインを有するアルブミン変異体は、既に少なくとも１つの（例えば数個の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を有する変異体に対して、更なるコンジュゲーション可能なシステイン残基を導入することにより調製することができる。更なるコンジュゲーション可能なシステイン残基を含む変異体が溶液中で単量体として存在する傾向は、当該更なるコンジュゲーション可能なシステイン残基を欠く参照アルブミンが溶液中で単量体として存在する傾向と比較して、少なくとも７５％であることが好ましい。
適切な変異体としては、配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１及びＥ３５８から選択される１又は２又はそれ以上の（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むものが挙げられる。複数位置の適切な組合せとしては、配列番号２の（ｉ）Ｋ９３＋Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、又はＥ３５８；（ii）Ｅ２９４＋Ｋ９３、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、又はＥ３５８；（iii）Ａ２２６＋Ｋ９３、Ｅ２９４、Ｅ２３０、Ｉ２７１、又はＥ３５８；（iv）Ｅ２３０＋Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｉ２７１、又はＥ３５８；（ｖ）Ｉ２７１＋Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、又はＥ３５８；（vi）Ｋ９３＋Ｅ２９４＋Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、又はＥ３５８が挙げられる。適切な変異体としては、配列番号２のＬ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｅ２３０、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、Ｌ３９８から選択される１又は２又はそれ以上の（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むものが挙げられる。複数位置の適切な組合せとしては、（１）Ｌ２４＋Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２）Ｆ４９＋Ｌ２４、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（３）Ｖ５４＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（４）Ｄ５６＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（５）Ｌ６６＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（６）Ａ９２＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（７）Ｑ９４＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（８）Ｅ９７＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（９）Ｈ１２８＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１０）Ｆ１５６＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１１）Ｅ２２７＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１２）Ｄ２３７＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｅ２２７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１３）Ｋ２４０＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１４）Ｄ２５９＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１５）Ｋ２６２＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１６）Ｎ２６７＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１７）Ｑ２６８＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１８）Ｌ２７５＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（１９）Ｅ２７７＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２０）Ｌ２８４＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２１）Ｅ３１１＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２２）Ｋ３１７＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２３）Ａ３２２＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２４）Ｅ３３３＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２５）Ｄ３４０＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｅ２３０、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２６）Ｅ３５４＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、
Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２７）Ｋ３５９＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ａ３６２、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２８）Ａ３６２＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ｅ３８２、又はＬ３９８；（２９）Ｅ３８２＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、又はＬ３９８；（３０）Ｌ３９８＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、又はＥ３８２；（３１）Ｋ９３＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２又はＬ３９８；（３２）Ｅ２９４＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２又はＬ３９８；（３３）Ａ２２６＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２又はＬ３９８；（３４）Ｅ２３０＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２又はＬ３９８；（３５）Ｉ２７１＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｅ３５８、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２又はＬ３９８；及び（３６）Ｅ３５８＋Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｋ９３、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ａ２２６、Ｅ２２７、Ｅ２３０、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｉ２７１、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ２９４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２又はＬ３９８が挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ９３に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２９４に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ２２６に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２３０に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＩ２７１に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３５８に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
特に好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ９３に等しい位置及び配列番号２のＥ２９４に等しい位置にそれぞれシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２４に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＦ４９に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＶ５４に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ５６に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ６６に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ９２に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＱ９４に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ９７に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＨ１２８に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＦ１５６に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２２７に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ２３７に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ２４０に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ２５９に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ２６２に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＮ２６７に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＱ２６８に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２７５に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２７７に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２８４に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３１１に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ３１７に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ３２２に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３３３に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ３４０に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３５４に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ３５９に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ３６２に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３８２に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ３９８に等しい位置にシステインを有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、にシステインを配列番号２のＫ９３に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
特に好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２９４に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ２２６に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２３０に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＩ２７１に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３５８に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ９３に等しい位置にシステインを、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＥ２９４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２４に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＦ４９に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＶ５４に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ５６に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ６６に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ９２に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＱ９４に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ９７に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＨ１２８に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＦ１５６に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２２７に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ２３７に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ２４０に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ２５９に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ２６２に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＮ２６７に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＱ２６８に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２７５に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２７７に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２８４に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３１１に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ３１７に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ３２２に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３３３に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ３４０に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３５４に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ３５９に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ３６２に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３８２に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ３９８に等しい位置にシステインを、及び、配列番号２のＣ３４に等しい位置にシステインを、それぞれ有するポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ９３に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
特に好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２９４に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ２２６に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２３０に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＩ２７１に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３５８に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ９３に等しい位置にシステインを有し、配列番号２のＥ２９４に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２４に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＦ４９に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＶ５４に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ５６に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ６６に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ９２に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＱ９４に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ９７に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＨ１２８に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＦ１５６に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２２７に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ２３７に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ２４０に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ２５９に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ２６２に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＮ２６７に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＱ２６８に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２７５に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ２７７に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ２８４に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３１１に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ３１７に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ３２２に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３３３に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＤ３４０に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３５４に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＫ３５９に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＡ３６２に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＥ３８２に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
好ましいポリペプチドとしては、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、配列番号２のＬ３９８に等しい位置にシステインを有し、且つ、配列番号２のＣ３４に等しい位置にはシステインを有さないポリペプチドが挙げられる。
配列番号２のＣ３４に等しい位置に「システインを有さない」態様は、例えばＣ３４をあるアミノ酸、例えば天然のアミノ酸、例えばＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹに置換することで得ることができる。斯かる置換はＣ３４Ｘと記載することができる。置換Ｃ３４Ａが好ましい。配列番号２のＣ３４に等しい位置に「システインを有さない」態様は、例えばこの位置のシステインを欠失させることによっても得ることができる。
チオアルブミンは、１又は２以上の（例えば数個の）天然遊離チオール基、例えばＨＳＡ（配列番号２）のシステイン－３４がシステイン以外のアミノ酸に改変されたポリペプチドを含んでいてもよく、いなくてもよい。例えば、システインは、比較的高い保存スコア（例えば図３に基づく計算で１、２又は３）を有するアミノ酸により、例えばアラニン又はセリンにより置換されてもよく、いなくてもよい。チオアルブミンは、１又は２以上の（例えば数個の）天然遊離チオール基、例えばＨＳＡ（配列番号２）のシステイン－３４が存在するポリペプチドを含んでいてもよく、いなくてもよい。即ち、上記態様の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチドは、配列番号２の位置３４に等しい位置に、コンジュゲーション可能なシステインを含んでいてもよい。或いは、配列番号２の位置３４に等しい位置に、コンジュゲーション可能なシステインを含んでいなくてもよい。
２又はそれ以上の（数個の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むポリペプチドの場合、斯かるポリペプチドが折り畳まれた際に、当該２以上のコンジュゲーション可能なシステイン残基が折り畳まれたタンパク質の表面に比較的均等に分布されていてもよく、いなくてもよい。ここで「折り畳まれた」（folded）という語には、例えばポリペプチド／タンパク質がその天然の立体配置へと、例えば最も熱力学的に安定な折り畳み立体配置へと折り畳まれることを含む。比較的均等に分布することの利点としては、２又はそれ以上の（数個の）部分をチオアルブミンにコンジュゲートする際に、斯かる２又はそれ以上の（数個の）コンジュゲートされる部分の間の立体障害を最小化し、又は立体障害をなくすことができるという点が挙げられる。これにより、チオアルブミンにコンジュゲートされる隣接部分（コンジュゲーションパートナー）間の立体障害等の問題による活性損失の可能性を最小化し、又は斯かる可能性をなくすことができるという利点がある。斯かる部分、例えば生物活性分子は、比較的嵩高い場合がある。
２又はそれ以上の（数個の）コンジュゲーション可能なシステインは、チオアルブミン分子の表面に、互いに可能な限り、例えば幾何学的に可能な限り、離れて分布することが好ましい。２又はそれ以上の（数個の）コンジュゲーション可能なシステイン間の距離は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、又は８０Åであることが好ましい。各コンジュゲーション可能なシステインは、分子内の他の１つ又は数個の、或いは他の全てのコンジュゲーション可能なシステインから、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、又は８０Åは離れていることが好ましい。２つのコンジュゲーション可能なシステイン間の距離は、例えばアルブミンのモデルに示されるような、折り畳まれたアルブミン分子の最長軸の少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５％、及び最も好ましくは１００％の距離であることが好ましい。例えば、タンパク質構造１ＡＯ６に示す配列番号２の最長軸は約８５Åである。従って、２又はそれ以上の（数個の）システイン残基は、少なくとも６５、７０、７５、又は最も好ましくは８０Å離れていることが好ましい。特に、各コンジュゲーション可能なシステイン残基は、折り畳まれたアルブミン分子の最長軸の長さの少なくとも８０、９０、又は９５％、及び最も好ましくは１００％の距離にあることが最も好ましい。
コンジュゲーション可能なシステインの側鎖は、相互に離れた向きに配位され、及び／又は、システインにコンジュゲートされた部分がアルブミン構造の中心から離れる向きとなるように配位されることが好ましい。これにより、コンジュゲートされた部分の間、及び／又は、アルブミン部分自体の間の相互作用を防止できるという利点がある。
アミノ酸配列を基に、例えばYasara（Krieger and Vriend, 2014, Bioinformatics 30(20) 2981-2982；及びhttp://www.yasara.org/に記載）等のソフトウェアを用いれば、候補アミノ酸残基を視覚的に検証することができる。
前記ポリペプチドは、配列番号２の残基Ｋ９３又はＥ２９４に等しい位置に対応する位置の一方又は両方に、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換を含むことが適切である。ＷＴ ＨＳＡ（配列番号２）において、Ｃ３４とＫ９３との間のＣα－Ｃα距離は２０．３Åであり、Ｃ３４とＥ２９４との間のＣα－Ｃα距離は３９．９Åであり、Ｋ９３とＥ２９４との間のＣα－Ｃα距離は４５．９Åである。
マレイミドコンジュゲーションは、コンジュゲーションパートナーをアルブミンにコンジュゲートする簡便な手段である。マレイミド－ポリエチレングリコール２－ビオチンとコンジュゲートを形成する能力は、マレイミド基を含む他のコンジュゲーションパートナーとコンジュゲートを形成する能力の指標になると考えられる。逆に、あるコンジュゲーション可能なポリペプチドが、マレイミド－ポリエチレングリコール２－ビオチンとコンジュゲートを形成する効率が低く、或いはコンジュゲートしない場合、そのポリペプチドが異なる化学基とコンジュゲートする能力に乏しいか、或いはコンジュゲートできないことの指標となる。マレイミドとのコンジュゲートによるチオエーテル結合は、制御下の加水分解に対する安定化の能力を有していてもよく、いなくてもよいが、コンジュゲートが保存又は使用時に反応性マレイミドコンジュゲーションパートナーを放出しないように、安定なコンジュゲートを形成することが好ましい。放出されたコンジュゲーションパートナーは、インビボで遭遇するチオール系の反応性種と、不所望のコンジュゲートを形成する可能性がある。
実施例に示すように、システイン３４に単一の遊離チオールを有する天然ＨＳＡが形成するコンジュゲートのうち、マレイミドコンジュゲーション及び制御下の加水分解に対して安定なコンジュゲートは約５０％である。これに対して、本発明のポリペプチドは、安定なコンジュゲートをより高い効率で形成することができる。特に、配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、及びＥ３５８に等しい位置から選択される位置に遊離チオール基を含むアルブミンは、実施例に示すように、安定なマレイミドコンジュゲートを高い効率で形成する。２又はそれ以上の（数個の）斯かるチオールを含むアルブミンも、安定なマレイミドコンジュゲートを形成することができる。
本発明のコンジュゲーション可能なポリペプチドは、マレイミド－ポリエチレングリコール２－ビオチンとコンジュゲート（マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチン）を、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のコンジュゲーション効率で形成する能力を有していてもよく、いなくてもよい。斯かるコンジュゲートの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％は、制御下の加水分解に対して安定であってもよく、なくてもよい。図４には、タンパク質の遊離チオールへのマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンのコンジュゲーションと、形成されたコンジュゲートに生じうる反応を示す。
コンジュゲーション効率の具体的な％は、アルブミン中の斯かる具体的な％の遊離チオール基が、適切な反応条件下でマレイミド部分と付加物を形成することを意味する。マレイミド基はｐＨ範囲６．５～７．５でチオールと反応し、チオエーテル結合を形成する一方で、このｐＨではアミンとの公差反応性はほとんど有さない。この反応には、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２という条件を使用するのが公的である。タンパク質の濃度は１～１０ｍｇ／ｍＬの範囲内とするのが理想的である。タンパク質濃度がこれよりも低いと、許容レベルの修飾を得るために、モル過剰の試薬を用いる必要が生じる場合がある（Hermanson, Greg T. (2008), Bioconjugate Techniques. Second Edition, Academic Press, San Diego, CA）。付加物の形成により、実施例に示すように、質量スペクトル分析にとって測定可能な質量増加が生じる。％コンジュゲーション効率は、アルブミンの全ての遊離チオールを基準とすると都合がよい。アルブミンが斯かる遊離チオールを２以上有する場合、各遊離チオールの％コンジュゲーション効率が異なる場合があるところ、当該効率は各遊離チオール個別について表してもよく、全ての遊離チオールについて纏めて表してもよい。即ち、あるアルブミンが２つの遊離チオールを有し、一方が５０％のコンジュゲーション効率を有し、他方が１００％のコンジュゲーション効率を有する場合、アルブミン全体のコンジュゲーション効率はこれら２つのコンジュゲーション効率の平均、すなわちこの場合は７５％となる。
制御下の加水分解に対する安定性の具体的な％は、図４に示すように、開環安定化を受けるチオール－マレイミド付加物の具体的な％、即ち、コンジュゲートのチオエーテル結合が維持されつつ、スクシンイミド環部分がコハク酸部分へと加水分解される％を表す。％安定性は各遊離チオール又はアルブミンについて個別に表してもよく、全ての遊離チオールについて纏めて表してもよい。制御下での加水分解は、例えばアルカリ性ｐＨ及び環境温度を超える温度で実施してもよい。適切には、付加物をｐＨ９．０及び３７℃で少なくとも１８時間、好ましくは２４時間、緩衝塩溶液中で、例えばリン酸緩衝食塩水中でインキュベートする。実施例に示すように、Ｈ２Ｏを添加してスクシンイミド部分をコハク酸部分に加水分解することで、質量スペクトル分析等により測定可能なコンジュゲートの質量増加を生じるという効果がある。コンジュゲーション効率が未完了の場合、％安定性の決定に際して考慮する必要がある。例えば、１つの遊離チオールを有するアルブミンの５０％がコンジュゲートを形成し、４０％が制御下の加水分解後にコンジュゲートされる場合、その安定性は８０％となる。これらの環境では、当初は５０％のアルブミンがコンジュゲートされておらず、惹いては遊離アルブミンの質量の指標となる。制御下の加水分解では質量は変化しない。当初コンジュゲートされていた５０％のアルブミンのうちの一部、即ち総アルブミンの４０％が、Ｈ２Ｏの添加によって質量が１８Ｄａに増加する。残るコンジュゲートされていたアルブミン、即ち総アルブミンの１０％は、加水分解を受けることなく、惹いては質量が変化しない。これらのアルブミンは依然としてコンジュゲートされているものの、図４に示すように逆マイケル経路により脱コンジュゲーションを受ける可能性があるため、保存又は使用時に不安定となりうる。これとは逆に、安定的に加水分解されたコンジュゲートは、保存又は使用時に安定である（Fontaine, S. et al, Bioconjugate Chem. 2015, 26, 145-152）。
本発明のポリペプチドのコンジュゲーション効率は、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は実質的に１００％であるのが適切である。本発明のポリペプチドの個々の遊離チオールのコンジュゲーション効率は、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は実質的に１００％であることが適切である。制御下の加水分解に対するポリペプチドコンジュゲートの適切な安定性は、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は実質的に１００％である。
実施例に示すように、システイン３４に単一の遊離チオールを有する天然ＨＳＡは、約９０％超がコンジュゲートを形成する。配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｖ５４、Ｈ１２８、Ｅ２２７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｑ２６８、Ｅ２７７、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｋ３５９、及びＡ３６２に等しい位置から選択される位置に遊離チオール基を含むアルブミンは、約９０％を超える効率でマレイミドコンジュゲートを形成し、Ｌ２４、Ｖ５４、Ｈ１２８、Ｅ２２７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｋ３５９、及びＡ３６２に等しい位置から選択される位置に遊離チオール基を含むアルブミンは、約９５％を超える効率でマレイミドコンジュゲートを形成する。
特定のポリペプチドコンジュゲートのチオール－エーテルコンジュゲート結合の制御下の加水分解に対する適切な安定性は、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は実質的に１００％である。
当該ポリペプチドは、例えば生物活性化合物や放射性医薬又は画像化剤等のコンジュゲーションパートナーが結合しうる更なるリンカーを、更に含んでいてもよく、いなくてもよい。例えば、リンカーは一次アミン、例えばリシンを含んでいてもよい。
コンジュゲーション可能なポリペプチドは、特にヒトにおいて、許容可能な免疫原性を有することが好ましい。斯かるコンジュゲーション可能なポリペプチドの免疫原性は、親アルブミン、例えばＷＴ ＨＳＡ（配列番号２）の免疫原性と同程度であるか、或いはより低いことがより好ましい。従って、（１又は２以上の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を提供するために加えられる（１又は２以上の）改変は、前記ポリペプチドの免疫原性を、親アルブミン、例えばＷＴ ＨＳＡの免疫原性と比較して、悪化させないことが好ましい。
好ましくは、（１又は２以上の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を提供するために加えられる（１又は２以上の）改変は、ヒトにおける前記ポリペプチドの免疫原性を、例えば野生型ＨＳＡ（配列番号２）の免疫原性と比較して悪化させないことが好ましい。
前記ポリペプチドの免疫原性は、Ｔ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープをスクリーニングすることにより決定又は予測できる。スクリーニングはインシリコでも、インビトロでも、エクスビボでもよい。例えば、前記ポリペプチドの免疫原性は、エクスビボＴ細胞活性化アッセイにより決定又は予測できる。Ｔ細胞活性化アッセイは、例えば増殖アッセイ、例えば［３Ｈ］－チミジン摂取を用いてＴ細胞応答を測定することを含んでいてもよい。前記ポリペプチドは、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて１０％未満の反応性、好ましくは８、６、４、又は２％未満の反応性、最も好ましくは０％の反応性を有することが好ましい。「反応性」（reactivity）とは陽性応答が観察されることを意味する。従って、１０％の反応性とは、ドナー試料の１０％に陽性応答が観察されることを意味する。
Ｔ細胞活性化アッセイは、サイトカイン分泌アッセイ、例えばＩＬ－２ ＥＬＩＳｐｏｔを用いてＴ細胞応答を測定することを含んでいてもよい。前記ポリペプチドは、サイトカイン分泌アッセイにおいて１０％未満の反応性、好ましくは８、６、４、又は２％未満の反応性、最も好ましくは０％の反応性を有することが好ましい。「反応性」（reactivity）とは陽性応答が観察されることを意味する。従って、１０％の反応性とは、ドナー試料の１０％に陽性応答が観察されることを意味する。
より好ましくは、コンジュゲーション可能なポリペプチドは、Ｔ細胞増殖アッセイ及びサイトカイン分泌アッセイ、例えばEpiScreen（登録商標）アッセイ（Abzena, Cambridge, UK）において、１０％未満の反応性を有する。
Ｔ細胞アッセイはＣＤ４＋ Ｔ細胞を含んでいてもよい。
Ｔ細胞アッセイでは、（ＨＬＡアロタイプに基づき）欧州及び北米民族を代表する５０名の健常ドナーのコホートに由来する末梢血単核細胞を使用してもよい。
前記ポリペプチドは、ヒトにおいて有害な抗体応答、例えば特異的抗体応答を刺激しないことが好ましい。
コンジュゲーション可能なポリペプチドを含むコンジュゲートの場合、斯かるコンジュゲートの免疫原性は、 前記コンジュゲーション可能なポリペプチドの代わりに親アルブミン、例えばＷＴ ＨＳＡ（配列番号２）を含む対応するコンジュゲートの免疫原性と比較して、同程度であるかより低いことが好ましい。従って、コンジュゲーション可能なポリペプチドについて説明した特性は、コンジュゲーション可能なポリペプチドを含むコンジュゲートにも当てはまる。しかし、「対照」（control）は親アルブミン、例えばＷＴ ＨＳＡでもよく、親アルブミン、例えばＷＴ ＨＳＡを含む対応するコンジュゲートであってもよい。
コンジュゲーション可能なポリペプチドII
本発明の第二の側面は、本発明の第一の側面に係るアミノ酸配列を含むコンジュゲーション可能なポリペプチドであって、更に、例えば前記ポリペプチドに少なくとも１つの（例えば数個の）更なるコンジュゲーション可能なシステインを付与する更なる修飾、又は前記ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性を改変する、又は前記ポリペプチドの血漿中半減期を変更する、配列番号２と比較して少なくとも１つの（例えば数個の）更なる修飾を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチドを提供する。
本発明の第二の側面によれば、本発明の第一の側面に関して定義したような好ましいコンジュゲーション可能なシステインを、アルブミン骨格における他の修飾と組合せ、具体的な用途に合わせてアルブミンを更に調整することが可能となる。
更なるコンジュゲーション可能なシステイン
少なくとも１つの（例えば数個の）更なる修飾は、ポリペプチドに対して少なくとも１つの（例えば数個の）更なるコンジュゲーション可能なシステインを付与するものであってもよく、なくてもよい。当該ポリペプチドは、合計２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のコンジュゲーション可能なシステイン残基を有していてもよく、いなくてもよい。前記ポリペプチドは、本発明の第一の側面に関して定義したような少なくとも１つの（例えば数個の）更なるコンジュゲーション可能なシステインを含んでいてもよく、いなくてもよい。
前記ポリペプチドは、配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される位置に等しい少なくとも１つの位置に対応する位置の他に、少なくとも１つの（例えば数個の）更なるコンジュゲーション可能なシステインを含んでいてもよく、いなくてもよい。適切なコンジュゲーション可能なシステインは、国際公開第２０１０／０９２１３５号に開示される（引用により本明細書に組み込まれる、特に図５及び６）。配列番号２のＤ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８から選択される位置に等しい少なくとも１つの（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステインを含むことが適切である。前記ポリペプチドは、（ａ）配列番号２の残基Ｄ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８の何れかに等しい位置に対応する位置における、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換；（ｂ）配列番号２の残基Ｄ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８の何れかに等しい位置に対応するアミノ酸のＮ又はＣ側に隣接する位置への、Ｃ３６９、Ｃ３６１、Ｃ９１、Ｃ１７７、Ｃ５６７、Ｃ３１６、Ｃ７５、Ｃ１６９、Ｃ１２４、及びＣ５５８にコンジュゲーション可能なシステインを生ずるようなシステインの挿入；並びに（ｃ）アルブミン配列のＮ末端残基のＮ側又はアルブミン配列のＣ末端残基のＣ側へのシステインの付加、のうち１又は２以上（例えば数個）を有することが適切である。組合せの例としては、（ａ）Ａ２＋Ｌ５８５、（ｂ）Ａ２＋Ａ３６４＋Ｄ５６２＋Ｌ５８５Ｃ、（ｃ）Ａ２及びアルブミンのＣ末端のＣ側に隣接する位置 （ｄ）Ｔ７９＋Ａ３６４；（ｅ）Ａ３６４＋Ｄ１；（ｆ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４；（ｇ）Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｄ１；（ｈ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ａ５０４；（ｉ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｌ５８５；（ｊ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｄ１；（ｋ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｌ５８５＋Ｄ１；（ｌ）Ｅ８６＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ａ５０４＋Ａ２；（ｍ）Ｓ２７０＋Ａ５８１；（ｎ）Ｓ２７０＋Ｄ１２９；（ｏ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２；（ｐ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｄ１２９；（ｑ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２＋Ｄ１２９；（ｒ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２＋Ｄ１２９＋Ｑ３９７；（ｓ）Ｃ３６９＋Ｃ１７７；（ｔ）Ａ３６４＋Ａ５８１；（ｕ）Ｔ７９＋Ａ３６４＋Ａ５８１；（ｖ）Ａ３６４＋Ａ５８１＋Ｄ１２９；（ｗ）Ａ３６４＋Ｃ１７７；（ｘ）Ｄ５６２＋Ｃ３６９；（ｙ）Ｄ１２９＋Ｃ３６９；（ｚ）Ａ５８１＋Ｃ３６９；又は（ａａ）Ｄ５６２＋Ｄ１２９＋Ｃ３６９の位置における、コンジュゲーション可能なシステインが挙げられる。
国際公開第２００９／１２６９２０号又は国際公開第２０１０／０５９３１５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示のような、更なる適切なシステイン残基を導入してもよい。具体的に、配列番号２のＳ５８、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｔ８３、Ｔ１２５、Ｔ２３６、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ｔ５０６及びＴ５０８に対応する１又は２以上の（例えば数個の）位置において、１又は２以上の（例えば数個の）表面暴露アミノ酸残基がシステイン残基に置換されていてもよい。
本発明の第一の側面との関係で留意すべきは、アルブミン変異体内のコンジュゲーション可能なシステイン残基の数を増加させることにより、溶液中で単量体として存在する傾向が低下する可能性があるという点である。本発明の第二の側面のコンジュゲーション可能なポリペプチドは、その溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも７０％であることが好ましく、任意により少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％であることが好ましい。この好適な態様は、第二の側面に関して定義されるように、前記ポリペプチドが更なるコンジュゲーション可能なシステインを含むか否かによらず適用される。それにもかかわらず、溶液中で単量体として存在する傾向がより低い場合でも、有用なコンジュゲーション可能なポリペプチドが提供される場合がある。本発明の第一の側面に関して定義されるようなコンジュゲーション可能なシステイン残基は、それら自体は非単量体の形成への寄与が比較的少ないものの、これらのうち１又は２以上（例えば数個）を、他の１又は２以上の（例えば数個の）コンジュゲーション可能なシステイン残基と組み合わせることで、従来技術から選択される同数のコンジュゲーション可能なシステイン残基を有する変異体と比較して、単量体％が増加した変異体が得られると期待される。
改変されたＦｃＲｎへの結合、及び／又は、改変された血漿中半減期を有するアルブミン変異体
少なくとも１つの（例えば数個の）更なる修飾は、アルブミン変異体のＦｃＲｎに対する結合親和性、及び／又は、血漿中半減期を変更するものであってもよく、なくてもよい。アルブミン変異体は、配列番号２に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．２、９９．４、９９．６、９９．８％の配列同一性を有することが好ましい。例えば、前記のアルブミン変異体は、導入された１又は２以上のＣｙｓ残基に加えて、配列番号２と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０（例えば数個の）他の変異を有していてもよい。或いは、前記のアルブミン変異体は、導入された１又は２以上のＣｙｓ残基に加えて、配列番号２と比較して他の変異を有さなくともよい。
チオアルブミン又はコンジュゲートは、親アルブミン又はそのコンジュゲートと比較して、より長い又はより短い血漿中半減期、好ましくはより長い血漿中半減期を有していてもよく、より強い又はより弱いＦｃＲｎへの結合性、好ましくはより強いＦｃＲｎへの結合性を有していてもよい。前記チオアルブミン又はコンジュゲートは、ＨＳＡ又はその対応するコンジュゲートと比較して、より長い血漿中半減期を有していることが好ましい。
或いは、このことは、チオアルブミン又はコンジュゲートのＦｃＲｎ（例えばｓｈＦｃＲｎ）に対するＫＤが、ＨＳＡ又はそのコンジュゲートの対応するＫＤと比較して、より低いと言い換えることもできる。チオアルブミン又はコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．９×ＫＤ未満、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．５×ＫＤ未満、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．１×ＫＤ未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０５×ＫＤ未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０２×ＫＤ未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０１×ＫＤ未満、最も好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．００１×ＫＤ未満であることが好ましい（ここで×は倍数を意味する）。
チオアルブミンを含むコンジュゲートの場合、斯かるコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤは、ＨＳＡを含む対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．９×ＫＤ未満、より好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．５×ＫＤ未満、より好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．１×ＫＤ未満、より一層好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０５×ＫＤ未満、より一層好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０２×ＫＤ未満、より一層好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．０１×ＫＤ未満、最も好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて０．００１×ＫＤ未満であることが好ましい（ここで×は倍数を意味する）。ここで「対応するコンジュゲート」とは、チオアルブミン（即ちアルブミン変異体）の代わりにＨＳＡ（例えば配列番号２）を含むコンジュゲートを意味する。
或いは、チオアルブミン又はコンジュゲートの血漿中半減期は、ＨＳＡ又はそのコンジュゲートの血漿中半減期と比べて、より短くてもよい。このことは、チオアルブミン又はコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤが、ＨＳＡ又はそのコンジュゲートのＦｃＲｎに対する対応するＫＤと比べて、より高いと言い換えることもできる。好ましくは、チオアルブミン又はコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて２×ＫＤ超、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて５×ＫＤ超、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて１０×ＫＤ超、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて２５×ＫＤ超、最も好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて５０×ＫＤ超であることが好ましい。チオアルブミン又はコンジュゲートは、ＦｃＲｎに対して全く結合しなくてもよい。
チオアルブミンを含むコンジュゲートの場合、斯かるコンジュゲートのＫＤは、ＨＳＡを含む対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて２×ＫＤ超、より好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて５×ＫＤ超、より好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて１０×ＫＤ超、より一層好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて２５×ＫＤ超、最も好ましくは対応するコンジュゲートのＦｃＲｎに対するＫＤと比べて５０×ＫＤ超であることが好ましい。ここで「対応するコンジュゲート」とは、チオアルブミン（即ちアルブミン変異体）の代わりにＨＳＡ（例えば配列番号２）を含むコンジュゲートを意味する。
チオアルブミン又はコンジュゲート、或いはそのアソシエイト、ナノ粒子、マイクロ粒子又はリポソームに由来する産物の半減期は、ユーザーの要請を満たすような結合親和性又は半減期を満たすように調整されていてもよい。
ＫＤを決定又は比較する際には、以下のパラメーターのうち１又は２以上（例えば数個）（好ましくは全て）を用いることができる。
機器：Biacore 3000 instrument （GE Healthcare）
フローセル：ＣＭ５センサーチップ
ＦｃＲｎ： ヒトＦｃＲｎ、好ましくは可溶性ヒトＦｃＲｎ。任意によりβ－２－ミクログロブリンのＣ末端にタグが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（Glutathione S Transferase：ＧＳＴ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ）、最も好ましくはＨｉｓ、例えば６ヒスチジン残基が結合されていてもよい。
ＦｃＲｎの量：１２００～２５００ＲＵ。
カップリング化学： アミンカップリング化学（例えば使用機器のメーカーが提供するプロトコールに記載の通り）。
カップリング法：カップリングは、例えば１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２０μg／ｍＬのタンパク質溶液（ｐＨ５．０）（GE Healthcare）を注入して実施することができる。ランニングバッファー及び希釈バッファーとしては、例えばｐＨ５．５のリン酸緩衝剤（６７ｍＭリン酸緩衝剤、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％ Tween 20）を使用できる。表面の再生は、例えばｐＨ７．４のＨＢＳ－ＥＰ緩衝剤（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０）（Biacore AB）を注入して実施することができる。
試験分子（例えばＨＳＡ又は変異体）の注入量：２０～０．０３２μＭ。
注入流量：定速、例えば３０μＬ／ｍＬ。
注入温度：２５℃。
データ評価用ソフトウェア：BIAevaluation 4.1ソフトウェア（BIAcore AB）。
アルブミンのドメインIIIは、ＦｃＲｎへの関与が最も強い。国際公開第２０１１／１２４７１８号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、コンジュゲーション可能なポリペプチドは、アルブミンドメインIII又はその変異体と、少なくとも１つの（例えば数個の）更なるアルブミンドメイン又はその断片、例えば第二のアルブミンドメインIII又はその変異体とを含み、或いはこれらからなるものであってもよく、なくてもよい。適切には、国際公開第２０１１／０５１４８９号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、前記ポリペプチドが、少なくとも１つの（例えば数個の）アルブミンドメインIII又は変異体又はその断片を含むか、或いはこれらからなり、当該少なくとも１つの（例えば数個の）アルブミンドメインIIIが、配列番号２の５７３、５００、５５０、４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、及び５８４から選択される位置に対応する位置に、１又は２以上の（例えば数個の）置換を有することが適切である。適切な置換としては、配列番号２のＫ５７３Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｃ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｋ５００Ｅ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｎ、Ｗ、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｖ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ４１７Ａ、Ｈ４４０Ａ、Ｈ４６４Ｑ、Ｅ４９２Ｇ、Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ、Ｅ４９５Ｑ，Ａ、Ｔ４９６Ａ、Ｄ４９４Ｅ＋Ｑ４１７Ｈ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｔ４９６Ａ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｖ４９３Ｐ、Ｐ４９９Ａ、Ｅ５０１Ａ，Ｑ、Ｎ５０３Ｈ，Ｋ、Ｈ５１０Ｑ、Ｈ５３５Ｑ、Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ、Ｋ５３８Ａ、Ｋ５４１Ｇ，Ｄ、Ｄ５５０Ｅ，Ｎ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｋ５７３Ｐ，Ａ、又はＥ４９２Ｇ／Ｎ５０３Ｈ／Ｋ５７３Ｐから選択される位置に対応する位置における１又は２以上の（例えば数個の）置換が挙げられる。
別の態様として、前記ポリペプチドは、国際公開第２０１４／０７２４８１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、配列番号２の位置（ａ）４９２及び５８０；（ｂ）４９２及び５７４；（ｃ）４９２及び５５０；（ｄ）５５０及び５７３；（ｅ）５５０及び５７４；（ｆ）５５０及び５８０に対応する位置から選択される２又はそれ以上の（数個の）位置に、改変を有していてもよい。
別の態様として、国際公開第２０１２／０５９４８６号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドは、（ｉ）ヒトアルブミン変異体である第一のアルブミンを含むＮ末端領域を含み、ここで前記第一のアルブミンのＮ末端は、前記ヒトアルブミン変異体のＣ末端の２～３０アミノ酸を除く全アミノ酸を含むと共に、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドは更に、（ii）マカクザルアルブミン、マウスアルブミン、ウサギアルブミン、ヒツジアルブミン、ヒトアルブミン、ヤギアルブミン、チンパンジーアルブミン、ハムスターアルブミン、モルモットアルブミン、ラットアルブミン、ウシアルブミン、ウマアルブミン、ロバアルブミン、イヌアルブミン、ニワトリアルブミン、又はブタアルブミン、又はその変異体から選択される、第二のアルブミンのＣ末端領域を含み、ここで前記第二のアルブミン又はアルブミン変異体のＣ末端は、前記第二のアルブミン又はアルブミン変異体のＣ末端の２～３０アミノ酸を含み、ここで前記ポリペプチドは、（ｉ）前記ヒトアルブミン変異体と比較して改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）前記ヒトアルブミン変異体と比較して改変されたＦｃＲｎへの結合親和性を有していてもよい。
別の態様として、国際公開第２０１３／１３５８９６号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、前記ポリペプチドは、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、１又は２以上の（例えば数個の）改変のドメインＩを有すると共に、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、１又は２以上の（例えば数個の）改変のドメインIIIを有し、ここで前記１又は２以上の（例えば数個の）改変によって、前記ポリペプチドは改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を有していてもよい。適切には、前記のドメインＩにおける改変は、配列番号２の位置７８～１２０の何れかに対応する位置、例えば位置７８～８８及び／又は１０５～１２０の何れかから選択され、前記のドメインIIIにおける改変は、配列番号２の位置４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、５７５の何れかに対応する位置から選択される。中でも、前記の配列番号２の位置７８～１２０又は４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、及び／又は５７５の何れかに対応する位置の改変が、置換であり、前記改変が、任意により、（ｉ）８３Ｎ、Ｋ又はＳ；（ii）１１１Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＥ；又は（iii）５７３Ｐ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、Ｉ又はＶから選択される置換であることが適切である。
別の態様として、国際公開第２０１５／０３６５７９号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列のドメインII内に、配列番号２の位置３４９、３４２、３８１、３４５、３８４、１９８、２０６、３４０、３４１、３４３、３４４、３５２、３８２、３４８、及び／又は、３８３に対応する位置からなる群より選択される位置に、１又は２以上の（例えば数個の）改変を含み、ここで前記１又は２以上の（例えば数個の）改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与してもよい。中でも、前記の位置３４９、３４２、３８１、３４５、３８４、１９８、２０６、３４０、３４１、３４３、３４４、３５２、３８２、３４８、及び／又は、３８３に対応する位置における改変が、置換であり、前記改変が、任意により、（ｉ）３４９Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ｐ、Ｋ又はＱ、好ましくはＦ；（ii）３４２Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、好ましくはＹ；（iii）３８１Ｇ又はＡ、好ましくはＧ；又は（iv）３４５Ｅ、Ｈ、Ｉ又はＱから選択される置換であることが適切である。
別の態様として、前記ポリペプチドは、配列番号２のＶ４１８、Ｔ４２０、Ｖ４２４、Ｅ５０５及びＶ５４７に対応する１又は２以上の（例えば数個の）位置に変異、例えば置換を含む、アルブミン又はその断片の変異ドメインIIIを含んでいてもよい。これらの変異は、国際公開第２０１３／０７５０６６号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。置換の位置は、Ｖ４１８、Ｔ４２０、Ｖ４２４、Ｅ５０５及びＶ５４７に対応する位置のうち、１つでも、２つでも、又はそれ以上（数個、例えば２、３、４、又は５）でもよい。例えば、Ｖ４１８Ｍ、Ｔ４２０Ａ、Ｖ４２４Ｉ、Ｅ５０５（Ｒ／Ｋ／Ｇ）及びＶ５４７Ａから選択される１又は２以上の（例えば数個の）置換であってもよい。特定の態様によれば、前記アルブミンは、置換Ｖ４１８Ｍ、Ｔ４２０Ａ及びＥ５０５Ｒ；又は、Ｖ４１８Ｍ、Ｔ４２０Ａ、Ｅ５０５Ｇ及びＶ５４７Ａを含む。前記アルブミンは、１又は２以上の（例えば数個の）更なる置換を、Ｎ４２９、Ｍ４４６、Ａ４４９、Ｔ４６７、及びＡ５５２から選択される位置；例えばＮ４２９Ｄ、Ｍ４４６Ｖ、Ａ４４９Ｖ、Ｔ４６７Ｍ、及びＡ５５２Ｔから選択される位置に含んでいてもよい。
別の態様として、前記変異体は、国際公開第２０１１／１０３０７６号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるような、ポリペプチドのＦｃＲｎ親和性及び血清半減期のうち一方又は両方を増加させる、１～１８のアミノ酸置換を含むアルブミンの変異ドメインIII又はその断片を含んでいてもよい。置換の位置は、例えば配列番号２の位置３８１、３８３、３９１、４０１、４０２、４０７、４１１、４１３、４１４、４１５、４１６、４２４、４２６、４３４、４４２、４４５、４４７、４５０、４５４、４５５、４５６、４５７、４５９、４６３、４９５、５０６、５０８、５０９、５１１、５１２、５１５、５１６、５１７、５１９、５２１、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５３１、５３５、５３８、５３９、５４１、５５７、５６１、５６６又は５６９に対応する位置のうち１又は２以上（例えば数個）であってもよい。適切な置換は、例えばＶ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１１Ｎ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｐ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、及びＡ５６９Ｐから選択される。例えば、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ及びＫ５５７Ｇから選択される。
前記変異体は、国際公開第２０１２／１１２１８８号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、配列番号２の以下の位置に対応する位置にアミノ酸置換を含む、アルブミンの変異ドメインIII又はその断片を含んでいてもよい。（ａ）残基３８３及び４１３；（ｂ）残基４０１及び５２３；（ｃ）残基４０７及び４４７；（ｄ）残基４０７及び４４７及び５３９；（ｅ）残基４０７及び５０９；（ｆ）残基４０７及び５２６；（ｇ）残基４１１及び５３５；（ｈ）残基４１４及び４５６；（ｉ）残基４１５及び５６９；（ｊ）残基４２６及び５２６；（ｋ）残基４４２及び４５０及び４５９；（ｌ）残基４６３及び５０８；（ｍ）残基５０８及び５１９及び５２５；（ｎ）残基５０９及び５２７；（ｏ）残基５２３及び５３８；（ｐ）残基５２６及び５５７；（ｑ）残基５４１及び５６１；（ｒ）残基４６３及び５２３；（ｓ）残基５０８及び５２３；（ｔ）残基５０８及び５２４；（ｕ）残基４６３、５０８及び５２３；（ｖ）残基４６３、５０８及び５２４；（ｗ）残基５０８、５２３及び５２４；（ｘ）残基４６３、５０８、５２３及び５２４；（ｙ）残基４６３及び５２４；（ｚ）残基５２３及び５２４；及び（ａａ）残基４６３、５２３、及び５２４。ここで、当該置換によって、ポリペプチドのＦｃＲｎ親和性及び血清半減期の一方又は両方が増加させる。適切な置換は、例えば（ａ）Ｌ４６３Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｓ又はＱ；（ｂ）Ｔ５０８Ｃ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｒ又はＳ；（ｃ）Ｉ５２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；（ｄ）Ｋ５２４Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｔ又はＶ；（ｅ）Ｌ４６３Ｆ又はＮ；（ｆ）Ｔ５０８Ｒ又はＳ；（ｇ）Ｉ５２３Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｋ又はＲ；及び（ｈ）Ｋ５２４Ｌから選択される。
前記変異体アルブミンは、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内における、配列番号２の位置Ｖ４１８、Ｔ４２０、Ｖ４２４、Ｅ５０５、Ｖ５４７、Ｋ５７３に対応する位置からなる群より選択される位置に、１又は２以上の（例えば数個の）改変を有していてもよい。ここで、当該１又は２以上の（数個の）改変により、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドは、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。
前記変異体アルブミンは、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、以下に対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の（例えば数個の）改変を含んでいてもよい。即ち、配列番号２の位置Ｖ３８１、好ましくはＶ３８１Ｎ又はＱ；Ｅ３８３、好ましくはＥ３８３Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｎ３９１、好ましくはＮ３９１Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｙ４０１ 好ましくはＹ４０１Ｄ又はＥ；Ｋ４０２、好ましくはＫ４０２Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｌ４０７、好ましくはＬ４０７Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、又はＹ；Ｙ４１１、好ましくはＹ４１１Ｑ、又はＮ；Ｋ４１３、好ましくはＫ４１３Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｋ４１４、好ましくはＫ４１４Ｓ又はＴ；Ｖ４１５Ｃ、好ましくはＶ４１５Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｑ４１６、好ましくはＱ４１６Ｈ又はＰ；Ｖ４２４、好ましくはＶ４２４Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、又はＱ；Ｖ４２６Ｄ、好ましくはＶ４２６Ｄ、Ｅ、Ｈ、又はＰ；Ｇ４３４、好ましくはＧ４３４Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｅ４４２、好ましくはＥ４４２Ｋ又はＲ；Ｒ４４５、好ましくはＲ４４５Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｐ４４７、好ましくはＰ４４７Ｓ又はＴ；Ｅ４５０、好ましくはＥ４５０Ｄ又はＥ；Ｓ４５４、好ましくはＳ４５４Ｃ、Ｍ又はＴ；Ｖ４５５、好ましくはＶ４５５Ｎ又はＱ；Ｖ４５６、好ましくはＶ４５６Ｎ又はＱ；Ｌ４５７、好ましくはＬ４５７Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｑ４５９、好ましくはＱ４５９Ｋ又はＲ；Ｌ４６３、好ましくはＬ４６３Ｎ又はＱ；Ｅ４９５、好ましくはＥ４９５Ｄ；Ｔ５０６、好ましくはＴ５０６Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５０８、好ましくはＴ５０８Ｋ、Ｒ、又はＳ；Ｆ５０９、好ましくはＦ５０９Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ又はＹ；Ａ５１１、好ましくはＡ５１１Ｆ、Ｗ、又はＹ；Ｄ５１２、好ましくはＤ５１２Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５１５、好ましくはＴ５１５Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｑ又はＳ；Ｌ５１６、好ましくはＬ５１６Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；Ｓ５１７、好ましくはＳ５１７Ｃ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｗ又はＹ；Ｋ５１９、好ましくはＫ５１９Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｒ５２１、好ましくはＲ５２１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｉ５２３、好ましくはＩ５２３Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ又はＹ；Ｋ５２４、好ましくはＫ５２４Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｋ５２５、好ましくはＫ５２５Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｑ５２６、好ましくはＱ５２６Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＹ；Ｔ５２７、好ましくはＴ５２７Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｅ５３１、好ましくはＥ５３１Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｈ５３５、好ましくはＨ５３５Ｄ、Ｅ又はＰ；Ｋ５３８、好ましくはＫ５３８Ｆ、Ｗ又はＹ；Ａ５３９、好ましくはＡ５３９Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｋ５４１、好ましくは、Ｋ５４１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｋ５５７、好ましくはＫ５５７Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ａ５６１、好ましくはＡ５６１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５６６、好ましくはＴ５６６Ｆ、Ｗ又はＹ；Ａ５６９、好ましくはＡ５６９Ｈ又はＰ。ここで、前記１又は２以上の（例えば数個の）改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する。
前記変異体アルブミンは、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内において、以下に対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の（例えば数個の）改変を含んでいてもよい。即ち、配列番号２の位置Ｖ５４７、好ましくはＶ４５７Ａ；Ｋ５７３、好ましくはＫ５７３Ｐ又はＹ；Ｉ５２３、好ましくはＩ５２３Ａ又はＧ、Ｔ５２７、好ましくはＴ５２７Ｍ、Ｋ５００、好ましくはＫ５００Ａ；又はＥ５０５、好ましくはＥ５０５Ｑ。ここで前記１又は２以上の（例えば数個の）改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する。
前記変異体アルブミンは、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、以下に対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の（例えば数個の）改変を含んでいてもよい。即ち、配列番号２の位置５７３、５２３、５２７又は５０５、好ましくはＫ５７３Ｙ；Ｉ５２３Ｇ；Ｉ５２３Ａ；Ｔ５２７Ｍ；Ｅ５０５Ｑ；又はＫ５７３Ｐ、例えばＫ５７３Ｙ及びＩ５２３Ｇ；Ｋ５７３Ｙ、Ｉ５２３Ｇ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｙ、Ｅ５０５Ｑ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｙ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ及びＩ５２３Ｇ；Ｋ５７３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ、Ｅ５０５Ｑ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ及びＴ５２７Ｍ；Ｖ５４７Ａ；Ｖ５４７Ａ及びＫ５７３Ｐ；Ｖ５４７Ａ、Ｅ５０５Ｑ、Ｋ５７３Ｐ及びＴ５２７Ｍ；又はＫ５００Ａ及びＨ５１０Ｑ。
他の変形例
本発明の第二の側面は他の変形例を包含する。例えば、斯かるポリペプチドは、グリコシル化を低下させる少なくとも１つの（例えば数個の）変異を含んでいてもよく、いなくてもよい。
融合ポリペプチド
本発明の第三の側面は、本発明の第一又は第二何れかの側面のコンジュゲーション可能なポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを提供する。
本発明のポリペプチドは、非アルブミンポリペプチド融合パートナーと融合してもよい。斯かる融合パートナーは、原則として如何なるポリペプチドであってもよいが、概して生物活性、治療、予防 （ワクチンを含む）、診断、画像化、又は他の有益な特性を有するポリペプチドであることが好ましい。斯かる特性を「医薬的に有益な特性」（pharmaceutically beneficial properties）という場合がある。アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドは本技術分野で公知である。斯かるアルブミン又はその断片と融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチドは、融合されていない状態の融合パートナーポリペプチド単独の場合と比較して、血漿中半減期が延長されることが分かった。
１又は２以上の（例えば数個の）生物活性、治療、予防（ワクチンを含む）、診断、画像化、又は他の有益なポリペプチドは、アルブミンのＮ末端やＣ末端に融合してもよく、アルブミン構造のループ内に挿入してもよく、或いはこれらの任意の組合せとしてもよい。また、融合ポリペプチドの種々の要素を隔離するリンカー配列を含んでもよく、含まなくてもよい。非限定的な例として、融合体としては、Ｎ’－パートナー－アルブミン－Ｃ’、Ｎ’－アルブミン－パートナー－Ｃ’、Ｎ’－アルブミン－パートナー－アルブミン－Ｃ’、Ｎ’－パートナー－アルブミン－パートナー－Ｃ’が挙げられる。ここで「パートナー」とは融合パートナーを意味する。
アルブミン又はその断片の融合体に関する教示は本技術分野で公知であり、当業者には明らかなように、斯かる教示を本発明にも適用できる。国際公開第２００１／７９２７１Ａ号（特に９頁及び／又は表１）、国際公開第２００３／５９９３４号（特に表１）、国際公開第０３／０６００７１号（特に表１）、及び国際公開第０１／０７９４８０号（特に表１）（各々それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）にも、アルブミン又はその断片に融合可能な、生物活性、治療、予防 （ワクチンを含む）、診断、画像化、又は他の有益なポリペプチドが挙げられており、これらの例も本発明に適用できる。
遺伝子的又は化学的に融合されたアルブミンを使用する利点としては、融合に寄与する分子の何れか又は全てが、融合されていない分子と比較して改善された特性を有しうるという点が挙げられる（Balan et al. (2006), Antivir Ther 11(1): 35-45）。また、アルブミン及びアルブミン粒子は、薬物及びプロドラッグを担持してその作用部位に送達する上でも重要な役割を有する（Kratz, F. (2008), Journal of Controlled Release, 132 (3), p.171-183）。融合及び粒子化技術によって、例えば半減期の延長等の薬物動態特性が改善され、結果として用量の改善に繋がる場合もあり、また、生物学的利用能の改善や、融合されたコンジュゲーションパートナー、例えば生物活性分子、放射性医薬又は画像化剤等を、不活性化から保護することも可能となる。
ポリペプチドを、１又は２以上の（例えば数個の）精製タグ、例えば（Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｐｒｏ）ｎ、アビジン／ストレプトアビジン／ストレプ－タグ、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、Ｈｉｓ－タグ等に融合してもよい。
本発明の第三の側面の更なる好適な特徴としては、本発明の第一及び第二の側面の好適な特徴が挙げられる。当業者であれば理解するように、本発明の任意の側面を、本発明の１又は２以上の他の側面と組み合わせてもよく、及び／又は、本発明の側面の１又は２以上の（例えば数個の）好適な特徴と組み合わせてもよく、及び／又は、本明細書に記載の他の開示と組み合わせてもよい。
ポリヌクレオチド
本発明の第四の側面は、本発明の第一、第二、又は第三の側面に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
斯かるポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドであってもよい。斯かるポリヌクレオチドは、ベクター（例えばプラスミド）及び／又は宿主細胞に含まれていてもよい。
斯かるポリヌクレオチドは、その発現元となる宿主に対してコドン最適化されていてもよく、いなくてもよい。配列番号１はＨＳＡ（配列番号２）の通常のコーディング配列を示す。配列番号２８はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）からの発現用にコドン最適化されたＨＳＡ（配列番号１）のコーディング配列を示す。配列番号１又は配列番号２８は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供するべく、変異形成されていてもよい。斯かるポリヌクレオチドは合成及び／又は組換によることが好ましい。斯かるポリヌクレオチドは単離されたポリヌクレオチドであることが好ましい。斯かるポリヌクレオチドはリーダー配列を有するＨＳＡであっても、リーダー配列を有さないＨＳＡであってもよい。例えば、斯かるポリヌクレオチドはＨＳＡと、ＨＳＡの天然のリーダー配列（配列番号３のアミノ酸１～２４）とをコードしていてもよく、ＨＳＡと融合リーダー配列（配列番号２９のアミノ酸１～２４）とをコードしていてもよい。
斯かるポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、斯かるコーディング配列に作動式に連結された１又は２以上の（例えば数個の）調節配列とを含む核酸コンストラクトとして提供されてもよい。この場合、斯かる調節配列は、適切な宿主細胞内で、その調節配列に適合した条件下で、発現を誘導することが好ましい。
ポリヌクレオチドは、変異体の発現を提供するべく、種々の手法で改変されていてもよい。ポリヌクレオチドを挿入する発現ベクターによっては、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドの改変を行うことが望ましく、或いはそれが必須の場合もある。組換ＤＮＡ法を利用したポリヌクレオチドの改変技術は本技術分野で周知である。
調節配列としては、プロモータ配列が挙げられる。プロモータ配列は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識される。プロモータ配列は、変異体の発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモータは、宿主細胞内で転写活性を示す核酸配列であれば、ミュータント、切断型、ハイブリッドプロモータ等を含むいかなるプロモータでもよく、また、コーディング宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
酵母宿主の場合、有用なプロモータとしては、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ-１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）プロテアーゼＡ（ＰＲＡ１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）プロテアーゼＢ（ＰＲＢ１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）翻訳伸長因子（translation elongation factor：ＴＥＦ１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）翻訳伸長因子（translation elongation factor：ＴＥＦ２）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase：ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（triose phosphate isomerase：ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼの各遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモータは、Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488に記載されている。
イネ及び哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はＨＥＫ等での使用に有用なプロモータは、当業者には周知である。イネ宿主の場合、有用なプロモータは、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子（cauliflower mosaic virus：ＣａＭＶ３５Ｓ）、トウモロコシ・アルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase：Ａｄｈ１）及びα－Ａｍｙ３から得ることができる。
ＣＨＯ又はＨＥＫ等の哺乳類宿主細胞の場合、有用なプロモータは、例えばサイトメガロウイルス（cytomegalovirus：ＣＭＶ）及びＣＡＧハイブリッドプロモータ（ＣＭＶ 初期エンハンサ要素及びニワトリβ－アクチンプロモータのハイブリッド）、サル空胞ウイルス４０（Simian vacuolating virus：ＳＶ４０）から得ることができる。
調節配列としては、適切な転写ターミネータ配列も挙げられる。これを認識すると、宿主細胞は転写を終了する。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’－末端に作動式に連結される。宿主細胞において機能しうる任意のターミネータを使用することができる。
酵母宿主細胞において好ましいターミネータは、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）シトクロムＣ（cytochrome C：ＣＹＣ１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase：ＡＤＨ１）、及びサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼの各遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータは、Romanos et al., 1992（同上）に記載されている。
イネ及び哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はＨＥＫ等での使用に有用なターミネータは、当業者には周知である。例えば、イネ宿主の場合、好ましいターミネータは、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼ（nopaline synthase：Ｎｏｓ）及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ３５Ｓ）から得ることができる。
調節配列としては、適切なリーダー配列も挙げられる。リーダー配列は、ｍＲＮＡの非翻訳領域であるが、宿主細胞による翻訳に重要な役割を果たす。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’－末端に作動式に連結される。宿主細胞で機能しうる任意のリーダー配列を使用できる。
酵母宿主細胞に適したリーダー配列は、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ-１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）３-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）α－因子、及びサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコール デヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド-３-リン酸 デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）から得ることができる。
調節配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。ポリアデニル化配列は、変異体コーディング配列の３’－末端に作動式に連結され、これが転写されると宿主細胞によって転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。宿主細胞で機能しうる任意のポリアデニル化配列を使用できる。
酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990に記載されている。
調節配列としては、シグナルペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、変異体のＮ末端に連結されるシグナルペプチドをコードし、変異体を細胞の分泌経路に誘導するものである。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端は、天然の状態において変異体をコードするコーディング領域のセグメントに翻訳リーディングフレーム内で連結されたシグナルペプチドコーディング領域を内在していてもよい。或いは、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング領域を含んでいてもよい。コーディング配列が天然状態ではシグナルペプチドコーディング領域を有していない場合には、外来のシグナルペプチドコーディング領域が必要となる場合がある。或いは、変異体の分泌を促進するために、天然のシグナルペプチドコーディング領域を、そのまま外来のシグナルペプチドコーディング領域で置換してもよい。しかし、発現された変異体を宿主細胞の分泌経路に誘導する任意のシグナルペプチドコーディング領域を使用することができる。
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）α－因子及びサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼの遺伝子から得ることができる。他の有用な シグナルペプチドコーディング配列は、上述のRomanos et al., 1992に記載されている。イネ及び哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はＨＥＫ等での使用に有用なシグナルペプチドは、当業者には周知である。
変異体のＮ末端にシグナルペプチド及びプロペプチド領域の双方が存在する場合、変異体のＮ末端側にプロペプチド領域が配置され、プロペプチド領域のＮ末端側にシグナルペプチド領域が配置される。
プラスミド
本発明の第五の側面は、本発明の第四の側面のポリヌクレオチドを含むプラスミドを提供する。プラスミドとしては、例えば２ミクロン系プラスミド、例えば国際公開第２００５／０６１７１９号、国際公開第２００５／０６１７１８号及び国際公開第２００６／０６７５１１号（何れも参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。プラスミドは、例えばシャペロンの過発現、特にＰＤＩの発現を通じて、そのシャペロン活性が強化されていることが好ましい。好ましいヘルパータンパク質としては、ＰＤＩ１、ＡＨＡ１、ＡＴＰ１１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＤＥＲ１、ＤＥＲ３、ＤＯＡ４、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＥＲＶ２、ＥＰＳ１、ＦＫＢ２、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＲＤ３、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＫＡＲ２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＣＪ１、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＢ１、ＳＳＢ２、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１、ＵＢＣ７、ＵＢＩ４及びＨＡＣ１、又は切断型イントロン欠失ＨＡＣ１が挙げられる（Valkonen et al. 2003, Applied Environ. Micro., 69, 2065）。斯かるヘルパータンパク質は、国際公開第２００５／０６１７１８号、国際公開第２００６／０６７５１１号及び国際公開第２００６／１３６８３１号（何れも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
宿主細胞
本発明の第六の側面は、本発明の第四の側面に係るポリヌクレオチド、及び／又は、本発明の第五の側面のプラスミドを含む発現系、例えば宿主細胞を提供する。斯かる宿主細胞は、哺乳類細胞、例えばヒト又はウシ細胞等、又は真菌細胞、例えば酵母細胞等であることが好ましい。或いは、斯かる宿主細胞は、細菌細胞、例えばバシルス（Bacillus）又は大腸菌（Escherichia coli）等、又はウイルス細胞、例えばバキュロウイルス（Baculovirus）等、又は植物細胞、例えばイネ、例えばオリザ・サティバ（Oryza sativa）等であってもよい。中でも、斯かる細胞としては、酵母細胞、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）（例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae））、ピチア（Pichia）、又はアスペルギルス（Aspergillus）細胞であることが最も好ましい。
コンジュゲート
本発明の第七の側面は、コンジュゲーションパートナー、例えば生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤等と、本発明の第一、第二、又は第三の側面に係るポリペプチドとを含むコンジュゲートを提供する。ここで、コンジュゲーションパートナーは、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、前記ポリペプチドに連結されてなる。斯かるコンジュゲーションパートナーとしては、生物活性、治療、診断又は画像化化合物、例えば本明細書に記載の化合物等が挙げられる。斯かるコンジュゲートは、２又はそれ以上の（数個の、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の）コンジュゲーションパートナーを有していてもよく、これらのコンジュゲーションパートナーは、互いに異なっていても、及び／又は、同じ化合物の複数コピーであってもよい。各コンジュゲーションパートナーは、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、前記ポリペプチドに連結されることが好ましい。しかし、コンジュゲーションパートナーは、他の手段により、例えば遺伝子的な融合や、非システインアミノ酸、例えばリシン等への共有結合により連結されてもよい。
関連する側面は、本発明に係るポリペプチドのチオアルブミン－コンジュゲートの産生のための使用を提供する。
コンジュゲーションパートナー
「コンジュゲーションパートナー」（conjugation partner）という語には、生物活性剤、画像化剤、診断薬、造影剤、放射性医薬、及び治療用化合物、例えば化学治療薬及び放射性医薬等が含まれる。本発明のチオアルブミンは、１又は２以上の（例えば数個の）コンジュゲーションパートナーとコンジュゲートされていてもよい。
画像形成剤、診断用化合物、造影剤、及び治療用化合物
診断薬、画像形成剤、及び生理的「造影」剤の使用は当技術分野で周知である。診断薬は、診断試験の一部として（すなわち、試験結果を評価するのに必要な装置及び手順と共に）用いられる任意の医薬製品である。診断薬は、生体内、生体外、または試験器具内で用いられてもよい。
ジストロフィー筋の損傷した筋肉繊維に蓄積するアルブミンの能力はよく説明されている。例えば、ガドリニウム－ＤＴＰＡ－アルブミンコンジュゲートを、例えば、磁気共鳴画像形成（ＭＲＩ）によりジストロフィー筋を視覚化及び監視するための診断及び治療を組み合わせた手段として、またジストロフィー筋に対して有効に標的するためのアルブミンに結合した推定治療薬を送達するために用いてもよい。(Amthor et al. (2004), Neuromuscular Disorders 14912: 791-796)。悪性腫瘍は、アルブミンの取り込み及び代謝の増加を示すことが多い。ガドリニウム－アルブミンコンジュゲートはまた、悪性腫瘍の画像形成を向上させるため、さらに薬物コンジュゲートアルブミンでの治療に高感度な腫瘍をＭＲＩで決定するために用いることが記載されている(Kiessling et al. (2002), Investigative Radiology 37(4): 93-198)。
現在の画像形成剤は、迅速に分解するものが多いが、持続性の長いものは毒性であることが多い。アルブミンコンジュゲートの使用は、特に画像形成剤の半減期を増加させるのに有益な場合があり、従って、画像形成が可能な期間を延ばす場合がある。国際公開第２００５／０８２４２３号（参照により本明細書に組み込む）には、画像形成のための蛍光物質に結合させた血清アルブミンの使用が記載されている。
本発明のチオアルブミンは、生体活性化合物、画像形成剤、診断薬、治療用化合物、及び造影剤から選択される２つ以上（数個）の分子に結合させてもよい。
腫瘍（及び筋肉変性）は、アルブミンの取り込みの増加を示す（ＥＰＲ：増強された透過および保持）。画像形成を向上させるため、また、腫瘍（或いは他の組織及び器官）がアルブミンコンジュゲート薬物に好適であるか否かを評価するためにアルブミンコンジュゲートを用いてもよい。
生体活性化合物
生体活性化合物は治療用または診断用化合物であってもよい。治療用化合物は、癌の化学療法に用いるための化学療法薬物であってもよい。治療用化合物は、細胞増殖阻害性または細胞毒性であってもよく、腫瘍阻害剤であってもよい。
生体活性化合物は、例えば、遊離チオール基を有するシステイン残基を含むポリペプチドなど、既に遊離チオール基を含んでいてもよい。或いは、生体活性化合物は、遊離チオール基を含むように変性されていてもよい。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を、遊離チオール基を有するシステイン残基を含むように変化させてもよく、或いは遊離チオール基を含むように生体活性化合物を化学的に誘導体化してもよい。
生体活性化合物は、ポリペプチド（タンパク質）、特に組み換えタンパク質医薬品であってもよい。生体活性化合物は、癌及びその他の関連する病気を治療するのに用いられる化学療法薬物または放射線治療薬物であってもよい。
本発明の遊離チオールを含むアルブミン変異タンパク質（チオアルブミン）は、本発明のアルブミン変異タンパク質が２個以上の遊離チオールを含む場合、当業者に周知の方法により、１個以上の遊離チオール基を介して少なくとも１種（例えば数種）の生体活性化合物に結合させてもよい。生体活性化合物としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（天然の、組み換え、或いは合成のいずれか）（Debinski, (2002) Cancer Investigation 20, 801-809, O'Keefe and Draper et al., (1985) JBC 260, 932-937, Xia et al., (2000) J. Pharmacology Experimental Therapeutics 295, 594-600, Kavimandan et al., (2006), Bioconjugate Chem. 17, 1376-1384, Humphries, et al., (1994) J. Tissue Culture Methods 16, 239-242, Wenning et al., (1998) Biotech. Bioeng. 57, 484-496, Yazdi and Murphy, (1994), Cancer Research 54, 6387-6394, Weaver and Laske (2003) J. Neuro-Oncology 65, 3-13, Widera et al., (2003) Pharmaceutical Research 20, 1231-1238, Daniels, T.R. et al. (2006) Clinical Immunology 121, 159-176、及びこれらに引用されている参考文献）；治療用及び診断用薬物または化合物（Mishra et al., (2006) J. 薬物 Targeting 14, 45-53, Lim and Shen, (2004) Pharmaceutical Research 21, 1985-1992, Fritzer et al., (1996) Biochemical Pharmacology 51, 489-493, Lubgan and Jozwiak (2002) Cell. Mol. Biol. Lett. 7, 98, Daniels, T.R. et al. (2006) Clinical Immunology 121, 159-176、及びこれらに引用されている参考文献）；高分子錯体（リポソーム、ウイルス、及びナノ粒子を含むがこれらに限定されない）（Mishra et al., (2006) J. 薬物 Targeting 14, 45-53, Daniels, T.R. et al. (2006) Clinical Immunology 121, 159-176 、及びこれらに引用されている参考文献）；核酸及び放射性核種（ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）を含む）、及びこれらの類縁体（Lee et al., (2005), Arch. Pharm. Res. 28, 722-729, Huang et al., (2007) FASEB J. 21, 1117-1125, Daniels, T.R. et al. (2006) Clinical Immunology 121, 159-176 、及びこれらに引用されている参考文献）、及び装置（Humphries, et al., (1994) J. Tissue Culture Methods 16, 239-242 、及びこれらに引用されている参考文献）。また、実体そのものを当業界に周知の方法で変性してもよい。
治療用化合物
治療用化合物としては、例えば、以下のものが挙げられる。４－１ＢＢリガンド、５－ヘリックス、ヒトＣ－Ｃケモカイン、ヒトＬ１０５ケモカイン、ヒトＬ１０５ケモカインであるｈｕＬ１０５＿３、γ－インターフェロンによって誘導されたモノカイン（ＭＩＧ）、部分ＣＸＣＲ４Ｂタンパク質、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、α１－抗トリプシン、ＡＣＲＰ－３０ホモログ、補体成分Ｃ１ｑ Ｃ、アデノイド発現ケモカイン（ＡＤＥＣ）、酸性線維芽細胞成長因子（acidic fibroblast growth factor：ａＦＧＦ）、線維芽細胞成長因子１（fibroblast growth factor：ＦＧＦ－１）、アンジオポエイチン成長因子（angiopoeitin growth factor：ＡＧＦ）、ＡＧＦタンパク質、アルブミン、エトポシド、アンジオスタチン、炭疽菌ワクチン、コラプシン特異抗体、アンチスタシン、抗ＴＧＦβ族抗体、抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＭ－１、ＡＣＲＰ－３０、ファモキシン、アポリポタンパク質種、アリールスルファターゼＢ、ｂ５７タンパク質、ＢＣＭＡ、β－トロンボグロブリンタンパク質（β－ＴＧ）、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、血液凝固因子、骨形態形成タンパク質（bone morphogenetic protein：ＢＭＰ）プロセシング酵素フーリン（Furin）、ＢＭＰ－１０、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１５、ＢＭＰ－１７、ＢＭＰ－１８、ＢＭＰ－２Ｂ、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、骨形態形成タンパク質－２、カルシトニン、カルパイン－１０ａ、カルパイン－１０ｂ、カルパイン－１０ｃ、ガンワクチン、カルボキシペプチダーゼ、Ｃ－Ｃケモカイン、ＭＣＰ２、ＣＣＲ５変異体、ＣＣＲ７、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ａモノクローナル抗体（monoclonal antibody: Ｍａｂ）、ＣＤ１３７、４－１ＢＢ受容体タンパク質、ＣＤ２０Ｍａｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ３３免疫毒素、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２Ｍａｂ、ケルベロス（Cerebus）タンパク質、ケモカインエオタキシン、ケモカインｈＩＬ－８、ケモカインｈＭＣＰ１、ケモカインｈＭＣＰ１ａ、ケモカインｈＭＣＰ１ｂ、ケモカインｈＭＣＰ２、ケモカインｈＭＣＰ３、ケモカインｈＳＤＦ１ｂ、ケモカインＭＣＰ－４、ケモカインＴＥＣＫ及びＴＥＣＫ変異体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ１全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ１０全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ３、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ８全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ９全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＰＦ４－４１４全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＰＦ４－４２６全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＰＦ４－Ｍ２全長及び成熟体、コレラワクチン、コンドロモジュリン様タンパク質、ｃ－ｋｉｔリガンド、ＳＣＦ、マスト細胞増殖因子、ＭＧＦ、線維肉腫由来幹細胞因子、ＣＮＴＦ及びその断片（例えば、ＣＮＴＦＡｘ１５｀（Ａｘｏｋｉｎｅ（商標）））、凝固因子（前駆体及び活性体）、コラーゲン、補体Ｃ５Ｍａｂ、結合組織活性化タンパク質－ＩＩＩ、ＣＴＡＡ１６．８８Ｍａｂ、ＣＴＡＰ－ＩＩＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＴＬＡ－８、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣケモカイン受容体３、シアノビリン－Ｎ、ダルベポエチン(エクソダス（exodus）、ｈｕＬ１０５＿７ともいう)、ＤＩＬ－４０、デオキシリボヌクレアーゼ、エクトジスプラシンＡ受容体（ectodysplastin A receptor：ＥＤＡＲ）、上皮成長因子（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦ）受容体Ｍａｂ、ＥＮＡ－７８、エンドスタチン、エオタキシン、上皮好中球活性化タンパク質－７８、エリトロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ＥＰＯＲ、エリトロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣物、ユートロピン（Eutropin）、エクソダス（Exodus）タンパク質、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、及び第ＸＩＩＩ因子、ＦＡＳリガンド阻害タンパク質（ＤｃＲ３）、ＦａｓＬ、ＦＧＦ、ＦＧＦ－１２、線維芽細胞増殖因子相同因子（ＦＧＦ）－１、ＦＧＦ－１５、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－３、ＩＮＴ－２、ＦＧＦ－４、ゲロニン、ＨＳＴ－１、ＨＢＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ヘパリン結合性分泌形質転換因子－２、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、グリア活性化因子、フィブリノゲン、ｆｌｔ－１、ｆｌｔ－３リガンド、卵胞刺激ホルモンαサブユニット、卵胞刺激ホルモンβサブユニット、フォリトロピン、フラクタルカイン、断片筋原線維タンパク質トロポニンI, 卵胞刺激ホルモン（follicle stimulating hormone：ＦＳＨ）、ガラクトシダーゼ、ガレクチン－４、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor：Ｇ－ＣＳＦ）、ＧＤＦ－１、遺伝子治療、グリオーマ由来増殖因子、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、グルコセレブロシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコデリン－Ａ、プロゲステロン関連子宮内膜タンパク質、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte/macrophage-colony stimulating factor：ＧＭ－ＣＳＦ）、ゴナドトロピン、顆粒球走化性タンパク質－２（granulocyte chemotactic protein-2：ＧＣＰ－２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子, 成長ホルモン、増殖関連オンコジーン－α（Growth related oncogene-α：ＧＲＯ－α）、増殖関連オンコジーン－β（ＧＲＯ－β）、増殖関連オンコジーン－γ（GRO-γ）、ヒトアポリポタンパク質（human apolipoprotein-4：hAPO-4）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１９（tumor necrosis factor receptor スーパーファミリー, member 19：TROY）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（human chronionic gonadotropin：ｈＣＧ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ワクチン、ＨＥＲ２受容体Ｍａｂ、ヒルジン、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶプロテアーゼ阻害ペプチド、ＨＩＶ－１プロテアーゼ阻害剤、ＨＰＶワクチン、ヒト６ＣＫｉｎｅタンパク質、ヒトＡｃｔ－２タンパク質、ヒト脂質生成阻害因子、ヒトＢ細胞刺激因子－２受容体、ヒトβ－ケモカインＨ１３０５（ＭＣＰ－２）、ヒトＣ－ＣケモカインＤＧＷＣＣ、ヒトＣＣケモカインＥＬＣタンパク質、ヒトＣＣ型ケモカインインターロイキンＣ、ヒトＣＣＣ３タンパク質、ヒトＣＣＦ１８ケモカイン、ヒトＣＣ型ケモカインタンパク質である二次リンパケモカイン（secondary lymphoid chemokine：ＳＬＣ）、ヒトケモカインβ－８短小型、ヒトケモカインＣ１０、ヒトケモカインＣＣ－２、ヒトケモカインＣＣ－３、ヒトケモカインＣＣＲ－２、ヒトケモカインＣｋβ－７、ヒトケモカインＥＮＡ－７８、ヒトケモカインエオタキシン、ヒトケモカインＧＲＯα、ヒトケモカインＧＲＯα、ヒトケモカインＧＲＯβ、ヒトケモカインＨＣＣ－１、ヒトケモカインＨＣＣ－１、ヒトケモカインＩ－３０９、ヒトケモカインＩＰ－１０、ヒトケモカインＬ１０５＿３、ヒトケモカインＬ１０５＿７、ヒトケモカインＭＩＧ、ヒトケモカインＭＩＧ－βタンパク質、ヒトケモカインＭＩＰ－１α、ヒトケモカインＭＩＰ１β、ヒトケモカインＭＩＰ－３α、ヒトケモカインＭＩＰ－３β、ヒトケモカインＰＦ４、ヒトケモカインタンパク質３３１Ｄ５、ヒトケモカインタンパク質６１１６４、ヒトケモカイン受容体ＣＸＣＲ３、ヒトケモカインＳＤＦ１α、ヒトケモカインＳＤＦ１β、ヒトケモカインＺＳＩＧ－３５、ヒトＣｈｒ１９Ｋｉｎｅタンパク質、ヒトＣＫβ－９、ヒトＣＸ３Ｃ １１１アミノ酸ケモカイン、ヒトＤＮＡＸインターロイキン－４０、ヒトＤＶｉｃ－１ Ｃ－Ｃケモカイン、ヒトＥＤＩＲＦ Ｉタンパク質配列、ヒトＥＤＩＲＦ IIタンパク質配列、好酸球ＣＣ型ケモカインエオタキシン、ヒト好酸球発現ケモカイン（eosinophil-expressed chemokine：ＥＥＣ）、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＣ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＩ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＣ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＩタンパク質、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＴ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＴ、ヒト胎児脾臓発現ケモカイン、ＦＳＥＣ、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte/macrophage-colony stimulating factor：ＧＭ－ＣＳＦ）受容体、ヒトｇｒｏ－αケモカイン、ヒトｇｒｏ－βケモカイン、ヒトｇｒｏ－γケモカイン、ヒトＩＬ－１６タンパク質、ヒトＩＬ－１ＲＤ１０タンパク質配列、ヒトＩＬ－１ＲＤ９、ヒトＩＬ－５受容体α鎖、ヒトＩＬ－６受容体、ヒトＩＬ－８受容体タンパク質ｈＩＬ８ＲＡ、ヒトＩＬ－８受容体タンパク質ｈＩＬ８ＲＢ、ヒトＩＬ－９受容体タンパク質、ヒトＩＬ－９受容体タンパク質変異体＃３、ヒトＩＬ－９受容体タンパク質変異体断片、ヒトＩＬ－９受容体タンパク質変異体断片＃３、ヒトインターロイキン１δ、ヒトインターロイキン１０、ヒトインターロイキン１８、ヒトインターロイキン１８誘導体、ヒトインターロイキン－１β前駆体、ヒトインターロイキン－１β前駆体、ヒトインターロイキン－１受容体補助タンパク質、ヒトインターロイキン－１受容体拮抗薬β、ヒトインターロイキン－１タイプ３受容体、ヒトインターロイキン－１０（前駆体）、ヒトインターロイキン－１１受容体、ヒトインターロイキン－１２ ４０ｋＤサブユニット、ヒトインターロイキン－１２ β－１受容体、ヒトインターロイキン－１２ β－２受容体、ヒトインターロイキン－１２ ｐ３５タンパク質、ヒトインターロイキン－１２ ｐ４０タンパク質、ヒトインターロイキン－１２受容体、ヒトインターロイキン－１３α受容体、ヒトインターロイキン－１３β受容体、ヒトインターロイキン－１５、クローンＰ１由来ヒトインターロイキン－１５受容体、ヒトインターロイキン－１７受容体、ヒトインターロイキン－１８タンパク質（ＩＬ－１８）、ヒトインターロイキン－３、ヒトインターロイキン－３受容体、ヒトインターロイキン－３変異体、ヒトインターロイキン－４受容体、ヒトインターロイキン－５、ヒトインターロイキン－６、ヒトインターロイキン－７、ヒトインターロイキン－７、ヒトインターロイキン－８（ＩＬ－８）、ヒト細胞内ＩＬ－１受容体拮抗薬、ヒトＩＰ－１０及びＨＩＶ－１ ｇｐ１２０超可変領域融合タンパク質、ヒトＩＰ－１０及びヒトＭｕｃ－１コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒト肝臓及び活性化調節ケモカイン（liver and activation regulated chemokine：ＬＡＲＣ）、ヒトＬｋｎ－１全長及び成熟体タンパク質、ヒト***関連ケモカイン（mammary associated chemokine：ＭＡＣＫ）タンパク質全長及び成熟体、ヒト成熟ケモカインＣｋβ－７、ヒト成熟ｇｒｏ－α、ヒト成熟ｇｒｏ－γポリペプチド（敗血症治療用）、ヒトＭＣＰ－３及びヒトＭｕｃ－１コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒトＭＩ１０タンパク質、ヒトＭＩ１Ａタンパク質、ヒト単球走化性因子ｈＭＣＰ－１、ヒト単球走化性因子ｈＭＣＰ－３、ヒト単球走化性前駆タンパク質（monocyte chemotactic proprotein：ＭＣＰＰ）配列、ヒトニューロタクチン（neurotactin）ケモカイン様ドメイン、ヒト非ＥＬＲ ＣＸＣケモカインＨ１７４、ヒト非ＥＬＲ ＣＸＣケモカインＩＰ１０、ヒト非ＥＬＲ ＣＸＣケモカインＭｉｇ、ヒトＰＡＩ－１変異体、ＩＬ－１６活性を有するヒトタンパク質、ＩＬ－１６活性を有するヒトタンパク質、ヒト二次リンパケモカイン（secondary lymphoid chemokine：ＳＬＣ）、ヒトＳＩＳＤタンパク質、ヒトＳＴＣＰ－１、ヒト間質細胞由来ケモカイン、ＳＤＦ－１、ヒトＴ細胞混合リンパ球反応性発現型ケモカイン（T cell mixed lymphocyte reaction expressed chemokine：ＴＭＥＣ）、ヒト胸腺及び活性化調節サイトカイン（thymus and activation regulated cytokine：ＴＡＲＣ）、ヒト胸腺発現型、ヒト腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：ＴＮＦ）－α、ヒトＴＮＦ－β（ＬＴ－α）、ヒトタイプＣＣケモカインエオタキシン３タンパク質配列、ヒトタイプＩＩインターロイキン－１受容体、ヒト野生型インターロイキン－４（ｈＩＬ－４）タンパク質、ヒトＺＣＨＥＭＯ－８タンパク質、ヒト化抗血管上皮成長因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）抗体及びその断
片、ヒト化抗血管上皮成長因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）抗体及びその断片、ヒアルロニダーゼ、インターロイキン１β転換酵素（interleukin-1 beta converting enzyme：ＩＣＥ）１０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ２０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ２２ｋＤサブユニット、イズロン酸－２－スルファターゼ、イズロニダーゼ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１阻害剤（ＩＬ－１ｉ）、ＩＬ－１成熟体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１１、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７受容体、ＩＬ－１９、ＩＬ－１ｉ断片、ＩＬ１－受容体拮抗薬、ＩＬ－２１（ＴＩＦ）、ＩＬ－３含有融合タンパク質、ＩＬ－３変異体タンパク質、ＩＬ－３変異体、ＩＬ－４、ＩＬ－４変異タンパク質、ＩＬ－４変異タンパク質Ｙ１２４Ｇ、ＩＬ－４変異タンパク質Ｙ１２４Ｘ、ＩＬ－５、ＩＬ－５変異タンパク質、Ｉｌ－５受容体、ＩＬ－６、Ｉｌ－６受容体、ＩＬ－７受容体クローン、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－９成熟タンパク質変異体（Ｍｅｔ１１７バージョン）、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン系分子またはそのいずれかの断片（例えば、Small Modular ImmunoPharmaceutical（商標）（「ＳＭＩＰ」）、ｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖ断片）、プラスミノーゲンを含むがこれに限定されない、インフルエンザワクチン、インヒビンα、インヒビンβ、インスリン、インスリン様成長因子、インテグリンＭａｂ、インタ－αトリプシン阻害剤、インタ－αトリプシン阻害剤、インターフェロンγ誘導性タンパク質（ＩＰ－１０）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα種及び亜種、インターフェロンβ種及び亜種、インターフェロンγ種及び亜種）、インターロイキン６、インターロイキン８（ＩＬ－８）受容体、インターロイキン８受容体Ｂ、インターロイキン－１α、インターロイキン－２受容体関連タンパク質ｐ４３、インターロイキン－３、インターロイキン－４変異タンパク質、インターロイキン－８（ＩＬ－８）タンパク質、インターロイキン－９、インターロイキン－９（ＩＬ－９）成熟タンパク質（Ｔｈｒ１１７バージョン）、インターロイキン（例えば、ＩＬ１０、ＩＬ１１、及びＩＬ２）、日本脳炎ワクチン、カリクレイン阻害剤、ケラチノサイト増殖因子、クニッツ（Kunitz）ドメインタンパク質（例えば、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、国際公開第０３／０６６８２４号に記載のもの、アルブミン融合の有無によらず）、ＬＡＣＩ、ラクトフェリン、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質ＩＩ、レプチン、肝臓発現型ケモカイン－１（ＬＶＥＣ－１）、肝臓発現型ケモカイン－２（ＬＶＥＣ－２）、ＬＴ－α、ＬＴ－β、黄体化ホルモン、ライム病（Lyme）ワクチン、リンホタクチン、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ（ｎ＋１）、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ－ｅｙｆｙ、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ－ｙｌ、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、マスピン、プロテアーゼ阻害剤５、ＭＣＰ－１受容体、ＭＣＰ－１ａ、ＭＣＰ－１ｂ、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４受容体、Ｍ－ＣＳＦ、メラノーマ阻害タンパク質、膜結合タンパク質、Ｍｅｔ１１７ヒトインターロイキン９、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、ＭＩＰ－γ、ＭＩＲＡＰ、修飾型ランテス（Modified Rantes）、モノクローナル抗体、ＭＰ５２、ミュータントインターロイキン６ Ｓ１７６Ｒ、筋原線維収縮性タンパク質トロポニンＩ、ナトリウム利尿ペプチド、神経増殖因子－β、神経増殖因子－β２、ニューロピリン（Neuropilin）－１、ニューロピリン－２、ニューロタクチン（Neurotアクチン）、ニューロトロフィン（Neurotrophin）－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－４ａ、ニューロトロフィン－４ｂ、ニューロトロフィン－４ｃ、ニューロトロフィン－４ｄ、好中球活性化ペプチド－２（ＮＡＰ－２）、ＮＯＧＯ－６６受容体、ＮＯＧＯ－Ａ、ＮＯＧＯ－Ｂ、ＮＯＧＯ－Ｃ、新規β－ケモカインであるＰＴＥＣ、Ｎ－末端変性ケモカインＧｒｏＨＥＫ／ｈＳＤＦ－１α、Ｎ－末端変性ケモカインＧｒｏＨＥＫ／ｈＳＤＦ－１β、Ｎ－末端変性ケモカインｍｅｔ－ｈＳＤＦ－１α、Ｎ－末端変性ケモカインｍｅｔ－ｈＳＤＦ－１β、ＯＰＧＬ、骨原性タンパク質－１（ＯＰ－１）、ＢＭＰ－７、骨原性タンパク質－２、ＯＸ４０、ＡＣＴ－４、ＯＸ４０Ｌ、オキシトシン（ニューロフィジンＩ）、副甲状腺ホルモン、パッチ型、パッチ型－２、ＰＤＧＦ－Ｄ、百日咳トキソイド、下垂体発現型ケモカイン（Pituitary expressed chemokine：ＰＧＥＣ）、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子－２、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－２（ＰＡＩ－２）、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ｂｖ－ｓｉｓ、血小板由来増殖因子前駆体Ａ、血小板由来増殖因子前駆体Ｂ、血小板Ｍａｂ、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、敗血症治療用ポリペプチド、プレプロアポリポタンパク質「ミラノ」変異体、プレプロアポリポタンパク質「パリ」変異体、プレトロンビン、霊長類ＣＣケモカイン「ＩＬＩＮＣＫ」、霊長類ＣＸＣケモカイン「ＩＢＩＣＫ」、プロインスリン、プロラクチン、プロラクチン２、プロサプチド、プロテアーゼ阻害ペプチド、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、プロウロキナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ８－６８、ＲＡＮＴＥＳ９－６８、ＲＡＮＴＥＳペプチド、ＲＡＮＴＥＳ受容体、組換えインターロイキン－１６、レジスチン（Resistin）、レストリクトシン、レトロウイルスプロテアーゼ阻害剤、リシン（ricin）、ロタウイルスワクチン、ＲＳＶ Ｍａｂ、サポリン、サルシン、分泌及び膜貫通ポリペプチド、血清コリンエストラーゼ、血清タンパク質（例えば、血液凝固因子）、溶解性ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質－３、溶解性ＶＥＧＦ受容体、幹細胞阻害因子、ブドウ球菌ワクチン、間質由来因子－１α、間質由来因子－１β、サブスタンスＰ（タキキニン）、Ｔ１２４９ペプチド、Ｔ２０ペプチド、Ｔ４エンドヌクレアーゼ、ＴＡＣＩ、胸腺及び活性化調節ケモカイン（Thymus and activation regulated chemokine：Ｔａｒｃ）、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、Ｔｈｒ１１７ヒトインターロイキン９、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボポエチン誘導体１、トロンボポエチン誘導体２、トロンボポエチン誘導体３、トロンボポエチン誘導体４、トロンボポエチン誘導体５、トロンボポエチン誘導体６、トロンボポエチン誘導体７、胸腺発現型ケモカイン（Thymus expressed chemokine：ＴＥＣＫ）、甲状腺刺激ホルモン、ダニ抗凝固ペプチド、Ｔｉｍ－１タンパク質、ＴＮＦ－α前駆体、ＴＮＦ－Ｒ、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＴＮＦ ｐ７５受容体、デス（Death）受容体、組織プラスミノーゲン活性化因子（tissue prasminogen activator：tPA）、トランスフェリン、形質転換増殖因子β，トロポニンペプチド、切断型単球走化性タンパク質２（６－７６）、切断型ＲＡＮＴＥＳタンパク質（３－６８）、腫瘍壊死因子、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、バソプレッシン（ニューロフィジンＩＩ）、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）Ｒ－３、ｆｌｔ－４、ＶＥＧＦ受容体、ＫＤＲ、ｆｌｋ－１、ＶＥＧＦ－１１０、ＶＥＧＦ－１２１、ＶＥＧＦ－１３８、ＶＥＧＦ－１４５、ＶＥＧＦ－１６２、ＶＥＧＦ－１６５、ＶＥＧＦ－１８２、ＶＥＧＦ－１８９、ＶＥＧＦ－２０６、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｘ、フォン・ヴィルブラント因子、野生型単球走化性タンパク質２、ＺＴＧＦ－β９。
化学療法薬物
化学療法薬物としては、例えば、以下のものが挙げられる。１３－シス－レチノイン酸、２－ＣｄＡ、２－クロロデオキシアデノシン、５－アザシチジン、５－フルオロウラシル、５－ＦＵ、６－メルカプトプリン、６－ＭＰ、６－ＴＧ、６－チオグアニン、アブラキサン（Abraxane）、Accutane（登録商標）、アクチノマイシン－Ｄ、Adriamycin（登録商標）、Adrucil（登録商標）、Agrylin（登録商標）、Ala-Cort（登録商標）、アルデスロイキン（Aldesleukin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ALIMTA、アリトレチノイン(Alitretinoin)、Alkaban-AQ（登録商標）、Alkeran（登録商標）、すべてのトランスレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン（Altretamine）、アメトプテリン（Amethopterin）、アミホスチン（Amifostine）、アミノグルテチミド、アナグレリド、Anandron（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、シタラビン（Ara-C）、Aranesp（登録商標）、Aredia（登録商標）、Arimidex（登録商標）、Aromasin（登録商標）、Arranon（登録商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、Avastin（登録商標）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ベキサロテン、BEXXAR（登録商標）、ビカルタミド（Bicalutamide）、BiCNU、Blenoxane（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、Busulfex（登録商標）、Ｃ２２５、ロイコボリンカルシウム、Campath（登録商標）、Camptosar（登録商標）、カンプトテシン－１１、カペシタビン、Carac（商標）、カルボプラチン、カルムスチン、カルムスチン・ウェファー、Casodex（登録商標）、ＣＣ－５０１３、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、Cerubidine（登録商標）、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボラム因子、クラドリビン、コルチゾン、Cosmegen（登録商標）、ＣＰＴ－１１、シクロホスファミド、Cytadren（登録商標）、シタラビン、シタラビンリポソーム（Cytarabine Liposomal）、Cytosar-U（登録商標）、Cytoxan（登録商標）、ダカルバジン、Dacogen（登録商標）、ダクチノマイシン、ダルベポエチンα、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、ダウノルビシンリポソーム（Daunorubicin Liposomal）、DaunoXome（登録商標）、Decadron、デシタビン、Delta-Cortef（登録商標）、Deltasone（登録商標）、デニロイキンジフチトクス、DepoCyt（商標）、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、Dexasone、デキスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、Diodex、ドセタキセル、Doxil（登録商標）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、ドキソルビシンリポソーム（Doxorubicin liposomal）、Droxia、DTIC、DTIC-Dome（登録商標）、Duralone（登録商標）、Efudex（登録商標）、Eligard（商標）、Ellence（商標）、Eloxatin（商標）、Elspar（登録商標）、Emcyt（登録商標）、エピルビシン、エポエチンα、Erbitux（商標）、エルロチニブ、エルウィニアＬ－アスパラギナーゼ、エストラムスチン、Ethyol、Etopophos（登録商標）、エトポシド、リン酸エトポシド、Eulexin（登録商標）、Evista（登録商標）、エキセメスタン、Fareston（登録商標）、Faslodex（登録商標）、Femara（登録商標）、フィルグラスチム、フロクスウリジン（Floxuridine）、Fludara（登録商標）、フルダラビン、Fluoroplex（登録商標）、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、FUDR（登録商標）、フルベストラント、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor：Ｇ－ＣＳＦ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、Gemzar（登録商標）、Gleevec（商標）、Gliadel（登録商標）ウェファー、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte/macrophage-colony stimulating factor：ＧＭ－ＣＳＦ）、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Halotestin（登録商標）、Herceptin（登録商標）、Hexadrol、Hexalen（登録商標）、ヘキサメチルメラミン、HMM、Hycamtin（登録商標）、Hydrea（登録商標）、Hydrocort Acetate（登録商標）、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム、ハイドロコートンリン酸塩、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、Idamycin（登録商標）、イダルビシン、Ifex（登録商標）、ＩＦＮ－α、イホスファミド、ＩＬ－１１、ＩＬ－２、メシル酸イマチニブ、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンα、インターフェロンα－２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン－２、インターロイキン－１１、イントロン A（登録商標）（インターフェロンα-２ｂ）、Iressa（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、Kidrolase（登録商標）、Lanacort（登録商標）、ラパチニブ、Ｌ－アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、Leukeran、Leukine（商標）、ロイプロリド、ロイロクリスチン（Leurocristine）、Leustatin（商標）、リポソームシタラビン（Ara-C）、Liquid Pred（登録商標）、ロムスチン、Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン、Lupron（登録商標）、Lupron Depot（登録商標）、Matulane（登録商標）、Maxidex、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、Medralone（登録商標）、Medrol（登録商標）、Megace（登録商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、Mesnex（商標）、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、Meticorten（登録商標）、マイトマイシン、マイトマイシン－Ｃ、ミトキサントロン、M-Prednisol（登録商標）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、Mustargen（登録商標）、ムスチン、Mutamycin（登録商標）、Myleran（登録商標）、Mylocel（商標）、Mylotarg（登録商標）、Navelbine（登録商標）、ネララビン、Neosar（登録商標）、Neulasta（商標）、Neumega（登録商標）、Neupogen（登録商標）、Nexavar（登録商標）、Nilandron（登録商標）、ニルタミド、Nipent（登録商標）、ナイトロジェンマスタード、Novaldex（登録商標）、Novantrone（登録商標）、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、Oncospar（登録商標）、Oncovin（登録商標）、Ontak（登録商標）、Onxal（商標）、オプレルベキン（Oprevelkin）、Orapred（登録商標）、Orasone（登録商標）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルタンパク質結合、パミドロネート、パニツムマブ、Panretin（登録商標）、Paraplatin（登録商標）、Pediapred（登録商標）、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ-イントロン（商標）、ＰＥＧ－Ｌ－アスパラギナーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、Platinol（登録商標）、Platinol-AQ（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、Prelone（登録商標）、プロカルバジン、PROCRIT（登録商標）、Proleukin（登録商標）、カルムスチンインプラントと共にプロリフェプロスパン２０、Purinethol（登録商標）、ラロキシフェン、Revlimid（登録商標）、Rheumatrex（登録商標）、Rituxan（登録商標）、リツキシマブ、Roferon-A（登録商標）（インターフェロンα－２ａ）、Rubex（登録商標）、塩酸ルビドマイシン、Sandostatin（登録商標）、Sandostatin LAR（登録商標）、サルグラモスチム、Solu-Cortef（登録商標）、Solu-Medrol（登録商標）、ソラフェニブ、SPRYCEL（商標）、ＳＴＩ－５７１、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、Sutent（登録商標）、タモキシフェン、Tarceva（登録商標）、Targretin（登録商標）、タキソール（登録商標）、Taxotere（登録商標）、Temodar（登録商標）、テモゾロミド、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、Thalomid（登録商標）、TheraCys（登録商標）、チオグアニン、Thioguanine Tabloid（登録商標）、チオホスホアミド、Thioplex（登録商標）、チオテパ、TICE（登録商標）、Toposar（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、Trexall（商標）、Trisenox（登録商標）、ＴＳＰＡ、TYKERB（登録商標）、ＶＣＲ、Vectibix（商標）、Velban（登録商標）、Velcade（登録商標）、VePesid（登録商標）、Vesanoid（登録商標）、Viadur（商標）、Vidaza（登録商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、Vincasar Pfs（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＭ－２６、ボリノスタット、ＶＰ－１６、Vumon（登録商標）、Xeloda（登録商標）、Zanosar（登録商標）、Zevalin（商標）、Zinecard（登録商標）、Zoladex（登録商標）、ゾレドロン酸、Zolinza、Zometa（登録商標）。
放射性医薬品
放射性医薬品としては、例えば、炭素１１、炭素１４、クロム５１、コバルト５７、コバルト５８、エルビウム１６９、フッ素１８、ガリウム６７、金１９８、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、鉄５９、クリプトン８１ｍ、窒素１３、酸素１５、リン３２、レニウム１８６、ルビジウム８２、サマリウム１５３、セレン７５、ストロンチウム８９、テクネチウム９９ｍ、タリウム２０１、トリチウム、キセノン１２７、キセノン１３３、イットリウム９０などが挙げられる。
画像形成剤
画像形成剤としては、例えば、ガドリニウム、マグネタイト、マンガン、テクネチウム、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｐ３２、ＴＩ２０１、イオパミドール、ＰＥＴ－ＦＤＧが挙げられる。
ポリヌクレオチドの調製
本発明の第八の側面は、ポリヌクレオチドを製造する方法であって、
（ａ）親アルブミン又はその断片をコードする核酸分子を提供し、
（ｂ）前記核酸分子の核酸配列を、ヒトアルブミン、特に配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列の残基１～５８５、又はその断片と少なくとも６０％同一であると共に、配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される位置に等しい少なくとも１つの（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチドをコードするように改変する
ことを含む、方法を提供する。
適切には、核酸配列の改変は、工程（ｂ）において提供される少なくとも１つの（例えば数個の）コンジュゲーション可能なシステインが、コードされるポリペプチド内に導入されるように、改変を導入することを含む。好ましい改変は、本発明の第一及び第二の側面に関して説明したとおりである。
親アルブミンは、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドに対して少なくとも７０％配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）低ストリンジェント条件の下で、（ｉ）配列番号２の配列をコードする成熟ポリペプチド、又は、（ii）（ｉ）の全長相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２の配列をコードする成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び／又は
（ｄ）配列番号２の成熟ポリペプチドの断片
を含み、或いはこれらからなることが好ましい。
親アルブミンは、配列番号２のＨＳＡポリペプチド配列又はその変異体又はその断片を含み、或いはこれらからなることが適切である。
変異ポリヌクレオチドは、当業者であれば、本技術分野で公知の任意の突然変異生成法、例えば部位特異的突然変異生成、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異生成、シャッフリング等を用いて調製することができる。
部位特異的突然変異生成は、親をコードするポリヌクレオチド内の１又は２以上の（例えば数個の）所定の部位に、１又は２以上の（例えば数個の）変異（改変）を生成する技術である。部位特異的突然変異生成は、インビトロにて、所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを実施することにより達成できる。また、部位特異的突然変異生成は、インビトロにおいて、カセット突然変異生成により達成できる。この場合、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内のある位置を制限酵素で切断し、 その後にポリヌクレオチド内に変異を含むオリゴヌクレオチドを連結する。通常は、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素として同じ酵素を用いることで、プラスミド及び挿入物を相互に連結することが可能となる。例えば、Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955；及びBarton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966等を参照のこと。
部位特異的突然変異生成は、インビボにおいても、本技術分野で公知の方法により達成できる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号；Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776；Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290；及びCalissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16が挙げられる。
本発明では任意の部位特異的突然変異生成法を使用できる。変異体を調製するのに使用可能なキットは多数市販されている。
合成遺伝子構築は、所望のポリペプチドをコードするよう設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を伴う。遺伝子合成は、数々の技術、例えばTian等（2004, Nature 432: 1050-1054）に記載の多重化マイクロチップ系技術や類似の技術を用いて実施できる。この場合、光プログラム可能なマイクロ流体チップ上でオリゴヌクレオチドの合成及び組み立てを行う。
単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は、挿入の作製及び試験は、既知の方法により突然変異生成、組換え、及び／又は、シャッフリングを行った後、それに伴うスクリーニング法を実施することで達成できる。例としては、Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号等に開示の方法が挙げられる。利用可能な他の方法としては、変異性（error-prone）ＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えばLowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号；国際公開第９２／０６２０４号等）、及び領域特異的突然変異生成（Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145；Ner et al., 1988, DNA 7: 127）等が挙げられる。
突然変異生成／シャッフリング法を、ハイスループット自動化スクリーニング法と組み合わせて、宿主細胞により発現されるクローン化突然変異形成ポリペプチドを検出してもよい（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。活性ポリペプチドをコードする突然変異形成ＤＮＡ分子の宿主細胞からの回収及び即時の配列決定は、本分野の標準的な方法で実施することができる。これらの方法により、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を、即時に決定することが可能となる。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、及び／又は、部位特異的突然変異生成、及び／又は、ランダム突然変異生成、及び／又は、シャッフリングの側面を組み合わせることにより実施することができる。半合成構築の典型的な例は、合成されたポリヌクレオチド断片を用いたプロセスと、ＰＣＲ技術とを組み合わせたプロセスである。即ち、遺伝子の所定の領域はデノボで構成し、他の領域は部位特異的突然変異生成プライマーを用いて増幅し、更に他の領域は変異性（error-prone）ＰＣＲ又は非変異性（non-error-prone）ＰＣＲ増幅による。その後、ポリヌクレオチドのサブ配列をシャッフルしてもよい。
ポリペプチドを製造する方法
本発明の第九の側面は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で、本発明に係る宿主細胞を培養し、
（ｂ）得られたポリペプチドを、前記宿主細胞、及び／又は、宿主細胞の成長培地から回収する
ことを含む、方法を提供する。
斯かる方法は、更に、
得られたポリペプチドの受容体結合能力、及び／又は、コンジュゲーション能力、及び／又は、溶液中で単量体として存在する傾向を決定すること、及び、
任意により、受容体結合能力、及び／又は、コンジュゲーション能力、及び／又は、所定の範囲の％単量体傾向を有するポリペプチド又は有さないポリペプチドを選択すること
を含んでいてもよく、いなくてもよい。
本発明の変異体は、当業者に周知の技術を用いて調製可能である。簡便な方法としては、親アルブミン又はその断片をコードする核酸分子をクローン化し、本発明の第八の側面の方法に係る核酸分子の配列を修正し、修正された核酸分子が適切な制御性遺伝子要素、例えばプロモータ、ターミネータ、活性化部位、リボゾーム結合部位等と作動式に連結された適切な遺伝子コンストラクトを調製し、斯かる遺伝子コンストラクトを適切な宿主生物内に導入し、形質転換された宿主生物を、変異体の発現を生じさせるような条件下で培養し、変異体を回収するという方法が挙げられる。これらの技術は何れも本技術分野で公知であり、平均的な研究者の技能であれば、本発明に係る具体的な変異体を調製するべく、適切な方法を設計することが可能である。
形質転換された宿主生物の培養中に、変異ポリペプチドが成長培地に分泌されるように、本発明の変異ポリペプチドにシグナル配列を連結してもよい。一般に、変異ポリペプチドが成長培地に分泌されると、回収及び精製が容易になるので有利である。また、本発明の第三の側面との関係で説明したように、ポリペプチドを融合ポリペプチドとして。国際公開第２００９／０１９３１４号（参照により組み込まれる）には、変異ポリペプチドを調製するための技術が開示されており、これらの技術を本発明に適用することも可能である。
アルブミンの組換タンパク質としての発現は、広範な宿主において首尾よく達成されてきた。例としては、真菌（限定されるものではないが、例としてアスペルギウス（Aspergillus）（国際公開第２００６／０６６５９５号）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）（Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975）、ピチア（Pichia）（Kobayashi 1998 Therapeutic Apheresis 2, 257-262）及びサッカロミセス（Saccharomyces）（Sleep 1990, Bio/technology 8, 42-46）等）、細菌（Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin. Immunol. 105, 279-285）、動物（Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276）、及び植物（限定されるものではないが、例としてジャガイモ及びタバコ（Sijmons 1990, Bio/technology 8, 217 and Farran 2002, Transgenic Research 11, 337-346）及びイネ、例えばオリザ・サティバ（Oryza sativa）等）、並びに哺乳類細胞、例えばＣＨＯ及びＨＥＫ等が挙げられる。本発明の変異ポリペプチドは、適切な宿主細胞において組換産生されることが好ましい。原則として、ポリペプチドを適切な量で生産する能力を有する任意の宿主細胞を使用することができ、平均的な研究者の技能であれば、本発明に適した宿主細胞を選択可能である。好ましい宿主生物としては、酵母が挙げられる。中でもサッカロミセス属（Saccharomycacae）から選択されるものが好ましく、より好ましくはサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
本発明の変異ポリペプチドの成長培地からの分離及び回収には、既知の分離技術、例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィー、及び親和性分離技術等を組み合わせてもちいることができる。平均的な研究者の技能であれば、斯かる既知の分離工程を適宜組み合わせて、本発明の変異体を精製することができる。本発明の変異体に適用可能な精製技術の例としては、国際公開第００／４４７７２号に開示のものを挙げることができる。
本発明の方法において、宿主細胞は、シャペロン活性が強化されたものであってもよく、なくてもよい。従って、本発明は、本発明のポリペプチド（又はタンパク質）を製造する方法であって、（ａ）上述の所望のタンパク質産物をコードするポリヌクレオチドを含む本発明の宿主細胞を提供し、（ｂ）斯かる宿主細胞を生育させ（例えば宿主細胞を培地中で培養し）、これにより所望のタンパク質産物を含む細胞培養物又は組換生物を生産することを含む方法を提供する。ここで、所望のタンパク質産物の発現レベルは、１又は２以上の（例えば数個の）ヘルパータンパク質を過剰発現するように遺伝子改変されていない他は同一の宿主細胞を、同一条件下で生育させる（例えば培養する）ことにより得られる、所望のタンパク質産物の産生レベルよりも。
宿主細胞を生育させる工程は、多細胞生物由来の宿主細胞を多細胞組換生物（例えば植物又は動物等）へと再成長させること、及び任意により、そこから１又は２以上の世代（例えば数世代）の子孫を産生することを含んでいてもよく、いなくてもよい。
チオアルブミンは、適切な発現系、例えば酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）等、又はアスペルギルス（Aspergillus）等）による非修飾アルブミン（例えば配列番号２）の発現レベルに対して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％のレベルで発現される能力を有していてもよく、いなくてもよい。相対的な発現レベルは、例えばタンパク質の発現後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ又はウエスタンブロッティングにて定量化することにより決定することができる。相対的な発現レベルの決定は、少なくとも１０リットルのスケールで行ってもよい。
斯かる方法は更に、培養された宿主細胞、組換生物又は培地から、こうして発現された所望のタンパク質産物を精製する工程を含んでいてもよく、いなくてもよい。
斯かる産生方法は、本発明のポリペプチドに対してコンジュゲーションパートナーを、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して連結することを含んでいてもよい。適切なコンジュゲーション法及びコンジュゲーションパートナーは、本明細書に記載したとおりである。
チオアルブミン又はチオアルブミンと他の１又は２以上のタンパク質との融合体を、Ｎ結合グリコシル化が低下した変異体として発現させることも可能である。即ち、ＨＳＡの場合、例えば遺伝子コーディング配列の破壊等により、タンパク質のＯ－グリコシル化に関与する１又は２以上の（例えば数個の）タンパク質マンノシルトランスフェラーゼが欠損された酵母を用いることが、特に有利である場合がある。組換発現されたタンパク質は、宿主細胞による不所望の翻訳後修飾を受ける場合がある。マンノシル化アルブミンはレクチンコンカナバリンＡに結合しうる。１又は２以上の（例えば数個の）ＰＭＴ遺伝子が欠損された酵母株を用いることにより、酵母により産生されるマンノシル化アルブミンの量を低減することが可能となる（国際公開第９４／０４６８７号）。これを達成する最も簡便な手法は、ゲノムに欠損を加えることにより、Ｐｍｔタンパク質の発現レベルが低減した酵母を用いることである。例えば、コーディング配列又は調節領域内に（或いは何れかのＰＭＴ遺伝子の発現を調節する他の遺伝子内に）、Ｐｍｔタンパク質の産生が殆ど又は全く生じなくなるような欠失、挿入又は転位を有していてもよく、いなくてもよい。或いは、酵母が抗Ｐｍｔ剤、例えば抗Ｐｍｔ抗体を産生するように、酵母を形質転換してもよい。或いは、何れかのＰＭＴ遺伝子の活性を阻害する化合物の存在下で、酵母を培養してもよい（Duffy et al, “Inhibition of protein mannosyltransferase 1 (PMT1) activity in the pathogenic yeast Candida albicans”, International Conference on Molecular Mechanisms of Fungal Cell Wall Biogenesis, 26-31 August 2001, Monte Verita, Switzerland, Poster Abstract P38）。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）以外の酵母、例えばピチア・パストリス（Pichia pastoris）又はクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）等を用いる場合には、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＰＭＴ遺伝子に相当する１又は２以上の（例えば数個の）遺伝子を破壊することが有益である。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）から単離されたＰＭＴ１（又は他のＰＭＴ遺伝子）の配列を用いて、他の真菌種における類似の酵素活性をコードする遺伝子を特定し、これを破壊してもよい。クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）のＰＭＴ１ホモログのクローニングは、国際公開第９４／０４６８７号に記載されている。
本発明の変異ポリペプチドは、治療上有益な化合物（予防上有益な化合物、例えばワクチン等を含む）を、これを必要とする動物又はヒトの個体に送達するために使用してもよい。斯かる治療上有益な化合物としては、これらに限定されるものではないが、診断に用いられる標識及び容易に検出可能な化合物、例えば種々の画像化技術；医薬活性化合物、例えば薬物、又は特異的結合部分、例えば抗体等が挙げられる。本発明の変異体は、更に２又はそれ以上の（数個の）異なる治療上有益な化合物、例えば抗体及び薬物を連結することにより、これを例えば所望の標的に特異的に結合させ、高濃度の連結された薬物を特定の標的に高濃度で送達することも可能である。
斯かる方法は更に、宿主細胞及び／又は宿主細胞成長培地から回収したポリペプチドを精製する工程を含んでいてもよい。斯かる精製工程は、任意により細胞固定化、細胞分離、及び／又は、細胞破壊を含んでいてもよいが、細胞固定化、分離、及び／又は破壊の工程とは異なる少なくとも１つの（例えば数個の）他の精製工程を常に含むことになる。
本発明のチオアルブミンの培地からの精製には、斯かるタンパク質を精製するのに有用であることが知られている任意の技術を使用することができる。同様に、細胞分離技術、例えば遠心分離、濾過（例えばクロスフロー濾過、膨張層クロマトグラフィー等）も、本技術分野では周知である。同様に、細胞破壊の方法として、例えばビーズミル処理、超音波処理、酵素暴露等も、本技術分野では周知である。
「少なくとも１つの（例えば数個の）他の精製工程」（at least one (e.g. several) other purification step）としては、タンパク質の精製に適した本技術分野で公知の任意の他の工程が挙げられる。例えば、組換発現されたアルブミンの回収のための精製技術としては、国際公開第９２／０４３６７号に開示の、マトリックス由来色素の除去；欧州特許第４６４５９０号の、酵母由来色材の除去；欧州特許第３１９０６７号の、アルカリ沈殿及びそれに続くアルブミンの親油性相への適用；並びに、国際公開第９６／３７５１５号、米国特許第５ ７２８ ５５３号、及び国際公開第００／４４７７２号に記載の、完全精製プロセスが挙げられる（これらは何れも参照により本明細書に組み込まれる）。適切な方法としては、硫酸ナトリウム又はエタノール沈殿、酸又は溶媒抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、濃度、希釈、ｐＨ調節、透析濾過、限外濾過、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ、伝導度調節等が挙げられる。
斯かるポリペプチドは、例えば商業的又は工業的に許容されるレベルの純度まで精製してもよい。商業的又は工業的に許容されるレベルの純度としては、他の物質（例えば１又は２以上の（例えば数個の）混入物質）のレベルが５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、又は０．０００００１％、最も好ましくは０％である、チオアルブミン及び／又はチオアルブミン－コンジュゲートを提供することが含まれる。
商業的又は工業的に許容されるレベルの純度は、比較的粗雑な精製法により、所望のタンパク質産物をその意図される目的に適した形態へと変化することで達成してもよい。商業的又は工業的に許容されるレベルの純度まで生成されたタンパク質調製物は、所望のタンパク質産物に加えて、例えば細胞培養要素、例えば宿主細胞又はその残屑を含む可能性がある。或いは、高分子量の要素（例えば宿主細胞又はその残屑）を（例えば濾過又は遠心分離等により）除去することにより、所望のタンパク質産物と、任意により、細胞培養プロセスに由来する機能的に許容可能なレベルの低分子量の混入物質とを含む組成物を取得してもよく、しなくてもよい。
斯かるタンパク質は、医薬的に許容可能なレベルの純度まで精製されていてもよく、いなくてもよい。タンパク質が医薬的に許容可能なレベルの純度を有するとは、そのタンパク質が実質的に発熱物質を含まず、その所望の目的に使用することができ、惹いてはタンパク質の活性と関連しない医薬作用を生じることなく、医薬的に有効な量で投与することが可能であることをいう。
斯かるチオアルブミン及び／又はチオアルブミン－コンジュゲートは、少なくとも１０-４ｇ・Ｌ-１、１０－３ｇ・Ｌ－１、０．０１ｇ・Ｌ－１、０．０２ｇ・Ｌ－１、０．０３ｇ・Ｌ－１、０．０４ｇ・Ｌ－１、０．０５ｇ・Ｌ－１、０．０６ｇ・Ｌ-１，０．０７ｇ・Ｌ－１、０．０８ｇ・Ｌ－１、０．０９ｇ・Ｌ－１、０．１ｇ・Ｌ－１、０．２ｇ・Ｌ－１、０．３ｇ・Ｌ－１、０．４ｇ・Ｌ－１、０．５ｇ・Ｌ－１、０．６ｇ・Ｌ－１、０．７ｇ・Ｌ－１、０．８ｇ・Ｌ－１、０．９ｇ・Ｌ－１、１ｇ・Ｌ－１、２ｇ・Ｌ－１、３ｇ・Ｌ－１、４ｇ・Ｌ－１、５ｇ・Ｌ－１、６ｇ・Ｌ－１、７ｇ・Ｌ－１、８ｇ・Ｌ－１、９ｇ・Ｌ－１、１０ｇ・Ｌ－１、１５ｇ・Ｌ－１、２０ｇ・Ｌ－１、２５ｇ・Ｌ－１、３０ｇ・Ｌ－１、４０ｇ・Ｌ－１、５０ｇ・Ｌ－１、６０ｇ・Ｌ－１、７０ｇ・Ｌ－１、８０ｇ・Ｌ－１、９０ｇ・Ｌ－１、１００ｇ・Ｌ－１、１５０ｇ・Ｌ－１、２００ｇ・Ｌ-１、２５０ｇ・Ｌ－１、３００ｇ・Ｌ－１、３５０ｇ・Ｌ－１、４００ｇ・Ｌ－１、５００ｇ・Ｌ－１、６００ｇ・Ｌ－１、７００ｇ・Ｌ－１、８００ｇ・Ｌ－１、９００ｇ・Ｌ－１、１０００ｇ・Ｌ－１の濃度で提供される。
本発明の方法は更に、精製された所望のタンパク質産物を、担体又は希釈剤と共に製剤化する工程、及び任意により、こうして製剤化されたタンパク質を、単位投与形態で提供する工程とを含んでいてもよい。
本発明の製法により得られた治療上有用なタンパク質を単独で投与することも可能ではあるが、１又は２以上の（例えば数個の）許容可能な担体又は希釈剤と共に、医薬製剤として提供することが好ましい。斯かる１又は２以上の担体又は希釈剤は、前記の所望のタンパク質と適合性を有するという意味で「許容可能」である。典型的には、斯かる担体又は希釈剤は水又は食塩水であり、これらは無菌且つ発熱物質不含有である。或いは、本発明の方法は更に、こうして精製された所望のタンパク質産物を凍結乾燥する工程をさらに含んでいてもよく、いなくてもよい。
チオアルブミンの製剤化は、“Protein Formulation and Delivery”, E. J. McNally (Ed.), published by Marcel Dekker Inc. New York 2000 and “Rational Design of Stable Protein Formulations - Theory and Practice”；J. F. Carpenter and M. C. Manning (Ed.) Pharmaceutical Biotechnology Vol 13. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York 2002, Yazdi and Murphy, (1994), Cancer Research 54, 6387-6394, Widera et al., (2003) Pharmaceutical Research 20, 1231-1238；Lee et al., (2005), Arch. Pharm. Res. 28, 722-729に記載の方策により行うことができる。製剤法の例は以下のとおりである。
方法その１：本発明の遊離チオール含有アルブミンムテイン又はコンジュゲートを精製した後、０．０１Ｍ～０．２５ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍ～０．１Ｍ リン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．０～８．０）中、４℃、－２０℃又は－８０℃で保存できる。
方法その２：本発明の遊離チオール含有アルブミンムテイン又はコンジュゲートを精製した後、０．０１Ｍ～０．２５ＭのＮａＣｌ及び１０～２０ｍｇ／Ｌのポリソルベート８０を含む０．０１Ｍ～０．１Ｍ リン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．０～８．０）中、４℃、－２０℃又は－８０℃で保存できる。
方法その３：本発明の遊離チオール含有アルブミンムテイン又はコンジュゲートを精製した後、０．０１Ｍ～０．２５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０～８．０）中、４℃、－２０℃又は－８０℃で保存できる。
方法その４：本発明の遊離チオール含有アルブミンムテイン又はコンジュゲートを精製した後、１０～２０ｍｇ／Ｌのポリソルベート８０を含む０．０１Ｍ～０．２５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０～８．０）中、４℃、－２０℃又は－８０℃で保存できる。
凍結乾燥製剤
方法その５：本発明の遊離チオール含有アルブミンムテイン又はコンジュゲートを精製した後、水に対して透析し、凍結乾燥し、４℃、－２０℃又は－８０℃で保存できる。
方法その６：本発明の遊離チオール含有アルブミンムテイン又はコンジュゲートを精製した後、０．０１Ｍ～０．２５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０～８．０）に対して透析し、凍結乾燥し、４℃、－２０℃又は－８０℃で保存できる。
コンジュゲーション方法
本発明の第十の側面は、本発明の第七の側面のコンジュゲートを製造する方法であって、本発明の第一、第二、又は第三の側面のポリペプチド、或いは本発明の第九の側面の方法により製造されたポリペプチドを、生物活性化合物に対して、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して連結する方法を提供する。連結はリンカーを介して行われる。
本発明のアルブミンムテイン（チオアルブミン）は、 can be 共有結合ly linked to １又は２以上の（例えば数個の）コンジュゲーションパートナー、例えば生物活性化合物に対して、本技術分野で公知の方法（例えばPierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USAにより提供されるもの；https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf）により、共有結合させることができる。斯かる方法には、これらに限定されるものではないが、コンジュゲーションパートナーの内部又は外部にチオール反応性基を導入又は遺伝子組換形成すること、例えばコンジュゲーションパートナーに存在する他の遊離チオールを導入又は遺伝子組換形成すること；又は、コンジュゲーションパートナーにピリジルジスルフィド基を導入又は遺伝子組換形成すること；又は、生物活性化合物にハロアセチル基を導入又は遺伝子組換形成すること、又は、コンジュゲーションパートナーにマレイミド基を導入又は遺伝子組換形成すること、又は、コンジュゲーションパートナーにチオスルフォネート基を導入又は遺伝子組換形成すること、又は、コンジュゲーションパートナーにビニルスルホン基を導入又は遺伝子組換形成すること等が挙げられる。例えば、これらに限定されるものではないが、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ、Pierce）、２－アミノ－２’－アミノエタンチオールスルフォネート（Pierce）、Ｎ－β－マレイミドプロピオン酸（ＢＭＰＡ、Pierce）、メチルメタンチオスルフォネート（ＭＭＴＳ、Pierce）、フルオレセイン－５－マレイミド（Pierce）、５－ヨードアセトアミド-フルオレセイン（５－ＩＡＦ、Pierce）、又はＮ－［６－７－アミノ－４－メチルクマリン－３－アセトアミド）ヘキシル］－３’－［２’－ピリジルジチオ］プロピオンアミド（ＡＭＣＡ－ＨＰＤＰ、Pierce）が挙げられる。
コンジュゲーションパートナーが少なくとも１つの（例えば数個の）チオール基を含む場合、コンジュゲーションパートナーを本発明のアルブミンムテインに対して、当分野で公知の方法により架橋してもよい。斯かる方法としては、例えば、これらに限定されるものではないが、酸化又は架橋試薬の使用が挙げられる。架橋試薬の例としては、これらに限定されるものではないが、１，４－ビス－マレイミジブタン（ＢＭＢ、Pierce）；１，４－ビス－マレイミジル－２，３－ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ、Pierce）；ビス－マレイミドヘキサン（ＢＭＨ、Pierce）、ビス－マレイミドエタン（ＢＭＯＥ、Pierce）；１，８－ビス－マレイミドトリエチレングリコール（ＢＭ［ＰＥＯ］３、Pierce）；１，１１－ビス－マレイミドテトラエチレングリコール（ＢＭ［ＰＥＯ］４、Pierce）；１，４－ジ－［３’－（２’－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ、Pierce）；ジチオ－ビス－マレイミドエタン（Ｄ（登録商標）Ｅ、Pierce）；１，６－ヘキサン－ビス－ビニルスルホン（ＨＢＶＳ、Pierce）、及びトリス－［２－マレイミドエチル］アミン（（登録商標）ＥＡ、Pierce）が挙げられる。
コンジュゲーションパートナーがチオール反応性基を含まない場合、本分野で公知の方法に従って、化学的修飾又は遺伝子組換により斯かる１又は２以上の（例えば数個の）基を導入してもよい（Chapman, A.P. (2002) Adv. Drug Deliv. Rev., 54 531-545: Humphreys, D.P. et al. Protein Engineering, Design & Selection vol. 20 no. 5 pp. 227-234, 2007）。これら２つの参考文献は抗体又は抗体断片内に組換え形成された遊離チオールにＰＥＧを架橋するための方法論を記載するものであるが、斯かる技術は本発明のアルブミンムテイン内に組換え形成された遊離チオールにコンジュゲーションパートナーを架橋する際にも利用することができる。或いは、例えば国際公開第２０００／６９９０２号に記載の、ConjuChem Inc.が開発したドラッグアフィニティーコンプレックス（drug affinity complex：ＤＡＣ（登録商標））技術（Montreal, Quebec, Canada, H2×3Y8）も利用することができる。ＤＡＣ（登録商標）コンストラクトは各々、３つの部分を有する。即ち、１）薬物要素（生物学的活性に関与する部分）；２）薬物要素に連結されるリンカー；及び３）リンカーの反対側の端部にある反応性化学基、通常はチオール選択的な弱求電子剤、最も有用な態様ではマレイミド、である。他の適用可能なコンジュゲーション法は、国際公開第２００７／０７１０６８号に記載されている。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
コンジュゲーションパートナーがチオール反応性基を含まないものの、１又は２以上の（例えば数個の）アミノ基を含む場合、本分野で公知の方法に従って、化学的修飾により１又は２以上の（例えば数個の）チオール反応性基を導入してもよい。斯かる手法の例としては、架橋試薬の使用が挙げられる。斯かる試薬としては、例えば、これらに限定されるものではないが、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＭＡＳ、Pierce）、Ｎ－［β－マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ、Pierce）、Ｎ－η－マレイミドカプロン酸（ＥＭＣＡ、Pierce）、Ｎ－［η－マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ、Pierce）、Ｎ－［η－マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＥＭＣＳ、Pierce）、Ｎ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ、Pierce）、Ｎ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢＳ、Pierce）、Ｎ－κ－マレイミドウンデカン酸（ＫＭＵＡ、Pierce）、Ｎ－［κ－マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＫＭＵＳ、Pierce）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ、Pierce）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢＳ、Pierce）、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオ－酢酸塩（ＳＡＴＡ、Pierce）、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ、Pierce）、スクシンイミジル３－［ブロモアセトアミド］プロピオネート（ＳＢＡＰ、Pierce）、Ｎ－スクシンイミジルヨード酢酸塩（ＳＩＡ、Pierce）、Ｎ－スクシンイミジル［４－ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ、Pierce）、スルホスクシンイミジル［４－ヨードアセチル］アミノベンゾエート（スルホ－ＳＩＡＢ、Pierce）、スクシンイミジル［４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ、Pierce）、スルホスクシンイミジル［４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ、Pierce）、スクシンイミジル－［４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシ－［６－アミドカプロエート（ＬＣ－ＳＭＣＣ、Pierce）、４－スクシンイミジルオキシカルボニル－メチル－α［２－ピリジルジチオ］トルエン（ＳＭＰＴ、Pierce）、スルホスクシンイミジル６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ＳＭＰＴ、Pierce）、スクシンイミジル４－［ｐ－マレイミドフェニル］－ブチレート（ＳＭＰＢ、Pierce）、スルホスクシンイミジル４－［ｐ－マレイミドフェニル］－ブチレート（スルホ－ＳＭＰＢ、Pierce）、スクシンイミジル－６－［（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ、Pierce）、Ｎ－スクシンイミジル３－［２－ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ、Pierce）、スクシンイミジル［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ、Pierce）、スルホスクシンイミジル［３’－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ、Pierce）及びＮ－スクシンイミジル－［４－ビニルスルホニル］ベンゾエート（ＳＶＳＢ、Pierce）等が挙げられる。Kavimandan et al., (2006), Bioconjugate Chem. 17, 1376-1384に記載のように、特定のアミン残基をブロックするのが好ましい場合もある。
適切なリンカーとしては、ブロモマレイミドリンカー、例えばモノブロモマレイミドリンカーが挙げられる。モノブロモマレイミドは、安定なコンジュゲートを構築可能な次世代のマレイミドであって、Smith et al Organic & Biomolecular Chemistry, (2015), 13, pages 7946-7949に記載されている。好ましいモノブロモマレイミドリンカーとしては、国際公開第２０１１／０１８６１１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
コンジュゲーションパートナーがチオール反応性基を含まないものの、１又は２以上の（例えば数個の）カルボニル（酸化炭水化物）基を有する場合、本分野で公知の方法に従って、化学的修飾により１又は２以上の（例えば数個の）チオール反応性基を導入してもよい。斯かる手法の例としては、架橋試薬の使用が挙げられる。斯かる試薬としては、例えば、これらに限定されるものではないが、（Ｎ－β－マレイミドプロピオン酸ヒドラジド（ＢＭＰＨ、Pierce）Ｎ－［η－マレイミドカプロン酸］ヒドラジド（ＥＭＣＨ、Pierce）、４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１カルボキシルヒドラジド・ＨＣｌ・１／２ジオキサン（ＭＭＣＣＨ、Pierce）、３－マレイミドフェニルボロン酸（ＭＰＢＨ、Pierce）、Ｎ－［κ－マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ、Pierce）及び３－［２－ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ、Pierce）等が挙げられる。
コンジュゲーションパートナーがチオール反応性基を含まないものの、１又は２以上の（例えば数個の）ヒドロキシル基を有する場合、本分野で公知の方法に従って、化学的修飾により１又は２以上の（例えば数個の）チオール反応性基を導入してもよい。斯かる手法の例としては、架橋試薬の使用が挙げられる。斯かる試薬としては、例えば、これらに限定されるものではないが、Ｎ－［ｐ－マレイミドフェニル］イソシアネート（ＰＭＰＩ、Pierce）が挙げられる。
アソシエイト
本発明の第十一の側面は、本発明の第七の側面のコンジュゲートと、生物活性、治療、予防、診断、画像化、又は他の有用な部分トを含むアソシエイトを提供する。
コンジュゲートを更に「アソシエイト」の形態にして用いてもよい。ここで「アソシエイト」（associates）という語は、アルブミンの変異体又はその断片のコンジュゲートと、当該コンジュゲートに非共有結合で結合又は連結された他の化合物とを含む化学物質を意味する意図である。斯かるアソシエイトの例としては、変異体アルブミンコンジュゲートと、アルブミンに疎水性相互作用で連結された脂質とからなるアソシエイトが挙げられる。斯かるアソシエイトは本技術分野では公知であり、周知の技術を用いて調製することができる。本発明に係るアソシエイトの好ましい例としては、変異体アルブミンコンジュゲートと、タキサン、タキソール、又はタキソール誘導体（例えばパクリタキセル）トを含むアソシエイトが挙げられる。アソシエイトの更なる例は、生物活性、治療、予防（ワクチンを含む）、診断、画像化、又は他の有用な部分を含む。
アソシエイトの調製方法は当業者には周知である。例えば、Hussain, R. and Siligardi, G. (2006), International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 12, NO: 3, pp. 311-315に記載の、ＨＳＡと脂質化合物との（連結による）製剤化が挙げられる。
ナノ粒子、マイクロ粒子又はリポソーム
本発明の第十二の側面は、本発明の第一、第二、又は第三の側面のポリペプチド、又は、本発明の第七の側面のコンジュゲート、又は、本発明の第十一の側面のアソシエイトを含む、ナノ粒子、マイクロ粒子、又はリポソームを提供する。
アルブミン及びアルブミン粒子は、薬物及びプロドラッグを担持して、その作用部位へと送達する上で重要な役割を有する（Kratz (2008), Journal of Controlled Release, 132 (3), p.171-183）。融合及び粒子化技術によって、薬物動態特性が改善され、例えば血漿中半減期が延長されることで、用量用法を改善することができる。また、生物学的利用能を向上させると共に、融合された生物活性分子を不活性化から保護することも可能となる。
分子をナノ粒子又はマイクロ粒子に組み込む技術は、本技術分野では公知である。本発明に係る変異体アルブミンコンジュゲート又はそのアソシエイトに適用可能な、ナノ粒子又はマイクロ粒子を調製するための好ましい方法は、国際公開第２００４／０７１５３６号又は国際公開第２００８／００７１４６号、或いはOner及びGroves（Pharmaceutical Research, Vol 10(9), 1993, pages 1387 to 1388）に記載されている。これらは参照により本明細書に組み込まれる。ナノ粒子の平均直径は、５～１０００ｎｍの範囲が好ましく、より好ましくは５、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は９９９ｎｍから、５、１０、２０、３０、４０、５０、８０、１００、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｎｍまでの範囲である。直径２００ｎｍ未満のマイクロ粒子、とりわけ１３０ｎｍ未満のマイクロ粒子は、０．２μｍ（ミクロン）フィルターで濾過することにより滅菌できるという利点がある。マイクロ粒子の平均直径は、１０００ｎｍ（１μｍ（ミクロン））～１００μｍ（ミクロン）の範囲が好ましく、より好ましくは１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｍ（ミクロン）から、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｍ（ミクロン）までの範囲である。
本発明のチオアルブミン（及び／又はそのコンジュゲートされた形態）は、ナノ粒子の産生に使用してもよく、及び／又は、ナノ粒子又はリポソーム内に包有させてもよい。
本発明のチオアルブミンは、ナノ粒子及び／又はリポソームと共に用いてもよく、及び／又は、ナノ粒子及び／又はリポソームに入れて用いてもよく、及び／又は、、ナノ粒子及び／又はリポソームとして用いてもよい。従来のコンジュゲーション方策の課題として、例えば生物活性剤・標的化リガンドのコンジュゲートのように、コンジュゲーションパートナーの薬理学的活性及び免疫活性の双方を維持することが挙げられる。タンパク質へのコンジュゲーションが可能なタンパク質標的化リガンド又は生物活性部分（コンジュゲーションパートナー）の数には上限値が存在する場合が多く、斯かる上限値を超えると標的化リガンドがその生物活性を維持できなくなる。本発明のアルブミンにコンジュゲートすることによって、コンジュゲーションパートナーの生物活性が低下しないことが好ましい。
生物活性化合物を捕捉するのにリポソーム及びナノ粒子を利用できる。これらは、例えば生物活性化合物等の薬物の送達性又は標的細胞による摂取を促進し、及び／又は、遊離した生物活性剤が非標的器官に及ぼす毒性を低減する機序を提供し、その結果として、治療指数の上昇、及び／又は、副作用の低減が可能となる。更に、一部の生物活性化合物（例えばタキサン等）を送達するのに必要な溶媒系製剤の多くは、毒性を伴うことから、患者に投与可能な最大用量は制限されてしまう。斯かる生物活性化合物にとっても、リポソーム及びナノ粒子による送達は利点を有する。溶媒系製剤に伴う毒性の一部を回避しつつ、生物活性化合物の投与量を増量することが可能となるからである（Hawkins et al (2008), Advanced Drug Delivery Reviews, 60, 8, p876-885）。
標的化リガンドをリポソーム及びナノ粒子に結合する方法は、本技術分野では公知であり（Nobs et al (2004), Journal of Pharmaceutical Sciences Vol 93 p1980-1992で総説されている）、本発明においても使用することができる。結合の手法は非共有結合でも共有結合でもよいが、共有結合は非共有結合よりも安定であることから、共有反応が好ましいと考えられる。タンパク質、ペプチド、又は薬物をリポソーム表面に共有結合又は非共有結合するための脂質は市販されている（例えばAvanti Polar Lipids Inc Alabaster, Alabama, USA）。主に３種類の官能性が挙げられる。即ち、ジスルフィド又はチオエーテル形成、アミド結合形成、又はビオチン／ストレプトアビジン結合によるコンジュゲーションである。本発明ではこれらの何れを使用することも可能である。
リポソームの表面にチオエーテル結合を介してリガンドを共有カップリングする方法は多数報告されているが、最も一般的なのは、マレイミドとチオール基との極めて効率的な反応を利用する方法である。本発明において、或いは本発明と共に使用できる、リポソームに一般的に付加される官能化された脂質アンカーの例としては、これらに限定されるものではないが、マレイミドを含有する基、例えばＮ－［４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチルアミド］－ＰＥ（Ｎ－ＭＰＢ］－ＰＥ）又はＮ－［４－（ｐ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－カルボキシアミド）（ＭＣＣ－ＰＥ）が挙げられる。これらは安定なチオエーテル結合を介して、標的化部分の簡便な共有カップリングを可能とする（Martin & Papahadjopoulos (1982), J. Biol. Chem. 257, 286-288）。
方法その７：本発明の遊離チオール含有アルブミンムテイン又はコンジュゲートを精製した後、ナノ粒子を調製するための既知の手法、例えば国際公開第２００４／０７１５３６A１号及び国際公開第２００８／００７１４６A１号に記載の手法（何れも参照により本明細書に組み込まれる）に従って、ナノ粒子に製剤化することができる。
同様に、ナノ粒子を形成するための材料、例えば、これらに限定されるものではないが、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、及びＣＯＯＨ－ＰＬＡ等は市販されており、ナノ粒子形成に関する既知の文献に従って、マレイミド又は他の既知の化学基で官能化することができる。これらの何れも、本発明において、或いは本発明と共に使用できる。
リガンドをリポソームに共有カップリングするための他の簡便な方法としては、２つのチオールをコンジュゲートしてジスルフィドを形成することが挙げられる。しかし、血清中の還元条件下では、１つの遊離チオール基を伴うより安定なコンジュゲーション化学が好ましい。（PDP-PE）等の化学基によれば、ジスルフィド結合による共有カップリングが可能となる。遊離チオール基又は官能化リンカーに対するリガンドを修飾を用いてもよい。本発明のチオアルブミンの利点の一つは、リガンドの修飾が不要であるという点にあるが、任意により本発明でもリガンド修飾を用いてもよい。
タンパク質内にチオール基が存在せず、或いはチオール基の数が十分ではなく、或いはチオール基の位置が適切でない場合も多い。即ち、１又は２以上のリガンドをリポソームにチオエーテル又はジスルフィド結合を介して共有カップリングする際に、殆どの場合はヘテロ二官能性架橋剤の使用が必要となる（コンジュゲーションに関して本明細書に記載した）。ヘテロ二官能性架橋剤の中には脱保護工程を要するものがあるが（例えばＳＰＤＰ及びＳＡＴＡ等）、本発明のチオアルブミンによれば斯かる追加の処理が不要となる。
或いは、本分野で公知の他の化学基により、チオアルブミンをリポソーム又はナノ粒子にコンジュゲートすることもできる。例えば、官能化脂質アンカーを、リガンドの一次アミンと反応するアミン又はカルボキシル官能基（例えばＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ等）の何れかと共に用いて、チオアルブミンをアミド結合で結合することもできる。一次アミンとリポソーム表面との直接架橋を用いてもよい。続いて、チオアルブミンの１又は２以上の（例えば数個の）遊離チオール基を、他のコンジュゲーションパートナーとのコンジュゲーションに用いることができる。
コンジュゲーション後にコンジュゲーションパートナー（例えば生物活性分子）の活性（例えば生物活性）が低下する場合がある。本発明に記載のチオアルブミンによれば、チオアルブミンに対するコンジュゲーションパートナーの位置及び／又は配向を調整し、コンジュゲーションパートナーの非コンジュゲート時の活性の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％を維持するようにしたコンジュゲート、ナノ粒子及び／又はリポソームを提供することで、この課題を解決することが可能となる。
ナノ粒子は、例えば、血管新生用途、抗血管新生用途、及びステント等の医療デバイスの被覆に使用できる。ナノ粒子は非密着結合等の標的化に有効であり、惹いては癌性腫瘍等の腫瘍の標的化に有用である。また、ナノ粒子は特に食細胞による呑食及び抗原提示の対象となりやすいことから、抗原を標的化して免疫応答を誘発するのにも有用である。本発明は、本発明に係るチオアルブミンのみからなるナノ粒子を提供する。ここで、本発明に係るチオアルブミンは、別の部分（コンジュゲーションパートナー）にコンジュゲートされていてもよく、いなくてもよい。また、本発明は、本発明に係るチオアルブミンと、１又は２以上の（例えば数個の）他のナノ粒子の成分とを含む、ナノ粒子を提供する。ここで、本発明に係るチオアルブミンは、別の部分（コンジュゲーションパートナー）にコンジュゲートされていてもよく、いなくてもよい。また、１又は２以上の（例えば数個の）他のナノ粒子の成分は、アルブミンと関連していても、いなくてもよい。好ましい態様によれば、本発明に係るチオアルブミンは、ポリペプチドの表面に位置するコンジュゲーション可能なシステイン残基を、少なくとも２つ含む。斯かるチオアルブミンは、ナノ粒子の調製に使用してもよく、ここで１又は２以上の（例えば数個の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を、ナノ粒子の形成に使用してもよく、１又は２以上の（例えば数個の）コンジュゲーション可能な残基を、生物活性分子等のコンジュゲーションパートナーへの連結に使用してもよい。
組成物
本発明の第十三の側面は、本発明に係るポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、アソシエイト、ナノ粒子、マイクロ粒子又はリポソームと、少なくとも１つの（例えば数個の）医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤とを含む組成物を提供する。
本明細書では、対応する製品との関係で、種々の製剤を記載している。
本発明の関連する側面は、医薬成分及び／又は医薬製品を作製する方法であって、本発明に係るチオアルブミンを作製し、任意により更なる分子をチオアルブミンにコンジュゲートし、任意により得られたコンジュゲートを医薬的に許容可能な希釈剤及び／又は担体と製剤化し、更に任意により得られた製品を単位投与形態にすることを含む方法を提供する。
医療用途
本発明の第十四の側面は、本発明に係る、及び／又は、本発明に係る方法により製造された、ポリペプチド、融合ポリペプチド、コンジュゲート、又はアソシエイト、ナノ粒子、マイクロ粒子又はリポソームの、疾患の処置、病気の処置及び／又は診断への使用を提供する。
本明細書では、対応する製品との関係で、種々の医療用途を記載している。
更に、一部の態様では、斯かるチオアルブミン又はコンジュゲートが、親又は参照アルブミン又はコンジュゲートと比較されて、ＦｃＲｎに対する結合親和性及び／又は血漿中半減期が改変されてなる。これにより、本発明に係るコンジュゲート、アソシエイト、ナノ粒子、マイクロ粒子又はリポソームのＦｃＲｎに対する結合親和性及び／又は血漿中半減期を、具体的な治療目的に応じて選択できるという利点が提供される。半減期が延長されると、参照分子又は組成物を使用する場合と比較して、投与の頻度又は用量を低減できる（惹いては副作用を低減できる）という利点がある。或いは、血漿中半減期を参照分子又は組成物よりも短くすると、参照分子又は組成物を使用する場合と比較して、より高い用量で投与できるという利点があり、更には参照分子又は組成物と比較して、投与した化合物が受容者からより迅速に排出されるという利点がある。
例えば、動物又はヒトの画像化目的で使用されるコンジュゲート、アソシエイト又は融合ポリペプチドにおいて、画像化部分の半減期は非常に短いのに対し、ＨＳＡを含むコンジュゲート又は融合ポリペプチドは画像化目的に必要とされるよりも遥かに長い血漿中半減期を有する場合、親又は参照アルブミン又はその断片よりも血漿中半減期が短い本発明の変異体アルブミン又はその断片を用いることで、画像化目的には十分長いが、投与対象患者から排出される上では十分に短い血漿中半減期を有するコンジュゲート又は融合ポリペプチドを提供することが可能となる。
他の例として、特定の症状を治療又は軽減するのに有効な治療用化合物を含むコンジュゲート、アソシエイト又は融合ポリペプチドを、斯かる処置を必要とする患者に投与する場合、親又は参照アルブミン又はその断片よりも血漿中半減期が長い変異体アルブミン又はその断片を用いて、血漿中半減期が延長されたアソシエイト又はコンジュゲート又は融合ポリペプチドを調製すれば、斯かる本発明のポリペプチドのアソシエイト又はコンジュゲート又は融合体は、親又は参照アルブミン又はそのアソシエイト又はその断片を使用する場合と比較して、必要となる投与の頻度がより少なく、又は必要となる用量がより低くなるため、ひいては副作用を低減することができるという利点が得られる。例えば、本発明は、個体の増殖性疾患を治療する方法であって、本発明に係るアソシエイトの有効量を当該個人に投与することを含み、ここで当該アソシエイトは、タキサン、タキソール、又はタキソール誘導体（例えばパクリタキセル等）を含む、方法を提供する。
半減期を延長するための使用
本発明の第十五の側面は、本発明のこれまでの任意の側面で定義されたポリペプチドを、分子の半減期、例えば生物活性剤、画像化剤、診断薬、造影剤、又は治療用化合物、例えば化学治療薬又は放射性医薬等の半減期の延長に使用することを提供する。好ましくは、当該分子単独の場合の半減期と比較して、半減期が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は少なくとも１００％延長される。中でも、当該分子単独の場合の半減期と比較して、半減期が少なくとも少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は少なくとも１４日間延長されることが好ましい。
例えば、分子の半減期の延長は、当該分子を本発明のこれまでの任意の側面により規定されたポリペプチドに対して、例えばコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して結合させ、当該分子を当該ポリペプチドに対して遺伝子組換えにより融合し、当該分子をポリペプチドと連結させ、及び／又は、本発明のこれまでの任意の側面に係る粒子に内包させることにより達成される。
本発明の態様
以下の連番を付したパラグラフを参照しながら本発明を更に説明する。
１．ヒトアルブミン、特に配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列の残基１～５８５、又はその断片と、少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチドであって；
配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される位置に等しい少なくとも１つの（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含み、
好ましくは、コンジュゲーション可能なポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の、少なくとも７０％である、コンジュゲーション可能なポリペプチド。
２．前記ポリペプチドが、
配列番号２の残基Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１の何れかに等しい位置に対応する位置における、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換；及び／又は
配列番号２の残基Ｋ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１の何れかに等しい位置に対応するアミノ酸のＮ又はＣ側に隣接する位置における、システインの挿入
のうち１又は２以上（例えば数個）を含む、パラグラフ１のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３．配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される位置に等しい２、３、４、５又はそれ以上の（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含む、パラグラフ１又は２のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４．前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％である、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５．前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも７週間の保存、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも８週間の保存、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも３ヶ月の保存、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも４ヶ月、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも６ヶ月の保存、又は約４０℃の温度で少なくとも３ヶ月の保存の後に測定される、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
６．前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、２～８℃、例えば５℃の温度で少なくとも３ヶ月の保存後に測定される、パラグラフ５のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
７．保存に先立ち、前記ポリペプチドがトリアジン（例えばAlbuPure（登録商標））クロマトグラフィーマトリックス又はＤＥ－ＦＦクロマトグラフィーマトリックスを用いて精製されてなる、パラグラフ５又は６のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
８．保存に先立ち、前記ポリペプチドがトリアジン（例えばAlbuPure（登録商標））クロマトグラフィーマトリックスを用いて、続いてＤＥ－ＦＦクロマトグラフィーマトリックスを用いて精製されてなる、パラグラフ５、６又は７の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
９．保存に先立ち、前記ポリペプチドが、トリアジン（例えばAlbuPure（登録商標））クロマトグラフィーマトリックス、それに続くＤＥ－ＦＦクロマトグラフィーマトリックス、更にその後のサイズ排除（例えばサイズ排除限界（Mr）約５×１０３～２．５×１０５の、例えばSephacryl S-200 HR）クロマトグラフィーを用いて精製される、パラグラフ５～８の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１０．前記保存が、０．５～５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド濃度を用いる、パラグラフ５～９の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１１．前記保存が、約５ｍｇ／ｍＬのポリペプチド濃度を用いる、パラグラフ５～１０の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１２．前記保存が、約６．０～約７．５のｐＨで行われる、パラグラフ５～１１の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１３．前記保存が、約７のｐＨで行われる、パラグラフ５～１２の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１４．前記保存が、５０ｍＭ 酢酸アンモニウム及び１０ｍＭ オクタン酸ナトリウムを含む、ｐＨ７．０の、好ましくはポリペプチド濃度約０．２～約２．５ｍｇ／ｍＬの緩衝剤を用いて行われる、パラグラフ５～１３の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１５．前記保存が、２５ｍＭのリン酸ナトリウム及び２１５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ６．５の、好ましくはポリペプチド濃度約５～約５０ｍｇ／ｍＬの緩衝剤を用いて行われる、パラグラフ５～１４の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１６．配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｌ２８４、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される位置に等しい少なくとも１つの（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むとともに、その溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも７５％である、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１７．前記アミノ酸配列が、ヒトアルブミン、特に配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列の残基１～５８５、又はその断片と少なくとも９５％同一であると共に、及び前記コンジュゲーション可能なポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の少なくとも８０％である、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１８．配列番号２の位置３４に等しい位置に、コンジュゲーション可能なシステインが存在する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
１９．配列番号２の位置３４に等しい位置に、コンジュゲーション可能なシステインが存在しない、パラグラフ１～１８の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２０．前記ポリペプチドが、２又はそれ以上の（数個の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むと共に、斯かるポリペプチドが折り畳まれた場合に、少なくとも１組のコンジュゲーション可能なシステイン残基の間に、少なくとも５Åの距離が存在する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２１．前記ポリペプチドが、配列番号２の残基Ｋ９３又はＥ２９４に等しい位置に対応する位置の一方又は両方に、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換を含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２２．少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のコンジュゲーション効率で、マレイミド－ポリエチレングリコール２－ビオチンとコンジュゲートを形成しうると共に、適切には前記コンジュゲートが、制御下の加水分解に対して９０％、好ましくは少なくとも９５％安定である、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２３．マレイミド－ポリエチレングリコール２－ビオチンとコンジュゲートを形成する能力が、リン酸緩衝化食塩水緩衝剤中、ｐＨ７．４で、環境温度で一晩インキュベートすることにより測定される、パラグラフ２２のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２４．前記安定性が、緩衝化塩溶液、例えばリン酸緩衝化食塩水中、ｐＨ９．０及び３７℃で少なくとも１８時間、好ましくは２４時間インキュベートすることにより測定される、パラグラフ２２又は２３のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２５．ヒトアルブミン（配列番号２）に対して少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチド、又はその断片であって、
配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される位置に等しい少なくとも１つの（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むと共に、
前記ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性を改変する、又は前記ポリペプチドの血漿中半減期を変更する、少なくとも１つの（例えば数個の）更なるコンジュゲーション可能なシステイン、又は少なくとも１つの（例えば数個の）修飾を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチド、又はその断片。
２６．前記少なくとも１つの（例えば数個の）更なる修飾が、パラグラフ１、２、３又は２１の何れかに規定される少なくとも１つの（例えば数個の）更なるコンジュゲーション可能なシステインを含む、パラグラフ２５のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２７．配列番号２のＤ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８から選択される位置に等しい少なくとも１つの（例えば数個の）位置に、コンジュゲーション可能なシステインを含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２８．前記ポリペプチドが、
配列番号２の残基Ｄ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８の何れかに等しい位置に対応する位置における、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換；及び／又は
配列番号２の残基Ｄ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８の何れかに等しい位置に対応するアミノ酸のＮ又はＣ側に隣接する位置における、システインの挿入；及び／又は
配列番号２のＣ３６９、Ｃ３６１、Ｃ９１、Ｃ１７７、Ｃ５６７、Ｃ３１６、Ｃ７５、Ｃ１６９、Ｃ１２４、及びＣ５５８の何れかに、コンジュゲーション可能なシステインを生成するような、Ｃ３６０、Ｃ３１６、Ｃ７５、Ｃ１６８、Ｃ５５８、Ｃ３６１、Ｃ９１、Ｃ１２４、Ｃ１６９、及びＣ５６７に対応する位置における、システインの欠失又は置換；及び／又は
アルブミン配列のＮ末端残基のＮ側又はアルブミン配列のＣ末端残基のＣ側へのシステインの付加
のうち１又は２以上（例えば数個）を含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
２９．前記ポリペプチドが、（ａ）Ａ２＋Ｌ５８５、（ｂ）Ａ２＋Ａ３６４＋Ｄ５６２＋Ｌ５８５Ｃ、（ｃ）Ａ２及びアルブミンのＣ末端のＣ側に隣接する位置 （ｄ）Ｔ７９＋Ａ３６４；（ｅ）Ａ３６４＋Ｄ１；（ｆ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４；（ｇ）Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｄ１；（ｈ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ａ５０４；（ｉ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｌ５８５；（ｊ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｄ１；（ｋ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｌ５８５＋Ｄ１；（ｌ）Ｅ８６＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ａ５０４＋Ａ２；（ｍ）Ｓ２７０＋Ａ５８１；（ｎ）Ｓ２７０＋Ｄ１２９；（ｏ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２；（ｐ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｄ１２９；（ｑ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２＋Ｄ１２９；（ｒ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２＋Ｄ１２９＋Ｑ３９７；（ｓ）Ｃ３６９＋Ｃ１７７；（ｔ）Ａ３６４＋Ａ５８１；（ｕ）Ｔ７９＋Ａ３６４＋Ａ５８１；（ｖ）Ａ３６４＋Ａ５８１＋Ｄ１２９；（ｗ）Ａ３６４＋Ｃ１７７；（ｘ）Ｄ５６２＋Ｃ３６９；（ｙ）Ｄ１２９＋Ｃ３６９；（ｚ）Ａ５８１＋Ｃ３６９；又は（ａａ）Ｄ５６２＋Ｄ１２９＋Ｃ３６９の何れかの位置に、コンジュゲーション可能なシステインを含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３０．アルブミンドメインIII又はその変異体と、少なくとも１つの（例えば数個の）更なるアルブミンドメイン又はその断片、例えば第二のアルブミンドメインIII又はその変異体とを含み、又はこれらからなる、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３１．少なくとも１つの（例えば数個の）アルブミンドメインIII又は変異体又はその断片を含み、又はこれらからなると共に、少なくとも１つの（例えば数個の）アルブミンドメインIIIが、配列番号２の５７３、５００、５５０、４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、及び５８４から選択される位置に対応する位置に、１又は２以上の（例えば数個の）置換を含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３２．前記配列番号２の位置に対応する位置に存在する１又は２以上の（例えば数個の）置換が、Ｋ５７３Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｃ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｋ５００Ｅ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｎ、Ｗ、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｖ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ４１７Ａ、Ｈ４４０Ａ、Ｈ４６４Ｑ、Ｅ４９２Ｇ、Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ、Ｅ４９５Ｑ，Ａ、Ｔ４９６Ａ、Ｄ４９４Ｅ＋Ｑ４１７Ｈ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｔ４９６Ａ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｖ４９３Ｐ、Ｐ４９９Ａ、Ｅ５０１Ａ，Ｑ、Ｎ５０３Ｈ，Ｋ、Ｈ５１０Ｑ、Ｈ５３５Ｑ、Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ、Ｋ５３８Ａ、Ｋ５４１Ｇ，Ｄ、Ｄ５５０Ｅ，Ｎ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｋ５７３Ｐ，Ａ、又はＥ４９２Ｇ／Ｎ５０３Ｈ／Ｋ５７３Ｐから選択される、パラグラフ３１のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３３．前記ポリペプチドが、配列番号２の位置（ａ）４９２及び５８０；（ｂ）４９２及び５７４；（ｃ）４９２及び５５０；（ｄ）５５０及び５７３；（ｅ）５５０及び５７４；（ｆ）５５０及び５８０に対応する位置から選択される２又はそれ以上の（例えば数個の）位置に改変を含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３４．前記ポリペプチドが、
（ｉ）前記ヒトアルブミン変異体のＣ末端の２～３０アミノ酸を除く全アミノ酸を含む、ヒトアルブミン変異体である第一のアルブミンを含むＮ末端領域；及び、
（ii）マカクザルアルブミン、マウスアルブミン、ウサギアルブミン、ヒツジアルブミン、ヒトアルブミン、ヤギアルブミン、チンパンジーアルブミン、ハムスターアルブミン、モルモットアルブミン、ラットアルブミン、ウシアルブミン、ウマアルブミン、ロバアルブミン、イヌアルブミン、ニワトリアルブミン、又はブタアルブミン、又はその変異体から選択される、第二のアルブミンのＣ末端領域を含み、
ここで、前記第二のアルブミン又はアルブミン変異体が、そのＣ末端に、前記第二のアルブミン又はアルブミン変異体のＣ末端の２～３０アミノ酸を含み、
ここで、前記ポリペプチドが、（ｉ）前記ヒトアルブミン変異体と比較して改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）前記ヒトアルブミン変異体と比較して改変されたＦｃＲｎへの結合親和性を含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３５．前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、１又は２以上の（例えば数個の）改変のドメインＩを含むと共に、及び配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、１又は２以上の（例えば数個の）改変のドメインIIIを含み、ここで１又は２以上の（例えば数個の）改変によって、前記ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性が改変されてなる、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３６．前記のドメインＩにおける改変が、配列番号２の位置７８～１２０の何れか、例えば位置７８～８８及び／又は１０５～１２０の何れかに対応する位置から選択されると共に、前記のドメインIIIにおける改変が、配列番号２の位置４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、又は５７５の何れかに対応する位置から選択される、パラグラフ３５のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３７．前記位置に対応する位置における改変が、配列番号２の７８～１２０又は４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、及び／又は、５７５から選択される置換であると共に、前記改変が、任意により、（ｉ）８３Ｎ、Ｋ又はＳ；（ii）１１１Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＥ；又は（iii）５７３Ｐ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、Ｉ又はＶから選択される置換である、パラグラフ３６のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３８．前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内で、配列番号２の位置３４９、３４２、３８１、３４５、３８４、１９８、２０６、３４０、３４１、３４３、３４４、３５２、３８２、３４８、及び／又は、３８３からなる群より選択される位置に対応する位置に、１又は２以上の（例えば数個の）改変のドメインIIを含み、ここで前記１又は２以上の（例えば数個の）改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
３９．前記の位置３４９、３４２、３８１、３４５、３８４、１９８、２０６、３４０、３４１、３４３、３４４、３５２、３８２、３４８、及び／又は、３８３に対応する位置における改変が、置換であり、前記改変が、任意により、（ｉ）３４９Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ｐ、Ｋ又はＱ、好ましくはＦ；（ii）３４２Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、好ましくはＹ；（iii）３８１Ｇ又はＡ、好ましくはＧ；又は（iv）３４５Ｅ、Ｈ、Ｉ又はＱから選択される置換である、パラグラフ３８のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４０．配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、配列番号２の位置Ｖ４１８、Ｔ４２０、Ｖ４２４、Ｅ５０５、Ｖ５４７、Ｋ５７３に対応する位置からなる群より選択される、１又は２以上の（例えば数個の）改変を含むと共に、前記１又は２以上の（例えば数個の）改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４１．前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、配列番号２の位置Ｖ３８１、好ましくはＶ３８１Ｎ又はＱ；Ｅ３８３、好ましくはＥ３８３Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｎ３９１、好ましくはＮ３９１Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｙ４０１ 好ましくはＹ４０１Ｄ又はＥ；Ｋ４０２、好ましくはＫ４０２Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｌ４０７、好ましくはＬ４０７Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、又はＹ；Ｙ４１１、好ましくはＹ４１１Ｑ、又はＮ；Ｋ４１３、好ましくはＫ４１３Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｋ４１４、好ましくはＫ４１４Ｓ又はＴ；Ｖ４１５Ｃ、好ましくはＶ４１５Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｑ４１６、好ましくはＱ４１６Ｈ又はＰ；Ｖ４２４、好ましくはＶ４２４Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、又はＱ；Ｖ４２６Ｄ、好ましくはＶ４２６Ｄ、Ｅ、Ｈ、又はＰ；Ｇ４３４、好ましくはＧ４３４Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｅ４４２、好ましくはＥ４４２Ｋ又はＲ；Ｒ４４５、好ましくはＲ４４５Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｐ４４７、好ましくはＰ４４７Ｓ又はＴ；Ｅ４５０、好ましくはＥ４５０Ｄ又はＥ；Ｓ４５４、好ましくはＳ４５４Ｃ、Ｍ又はＴ；Ｖ４５５、好ましくはＶ４５５Ｎ又はＱ；Ｖ４５６、好ましくはＶ４５６Ｎ又はＱ；Ｌ４５７、好ましくはＬ４５７Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｑ４５９、好ましくはＱ４５９Ｋ又はＲ；Ｌ４６３、好ましくはＬ４６３Ｎ又はＱ；Ｅ４９５、好ましくはＥ４９５Ｄ；Ｔ５０６、好ましくはＴ５０６Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５０８、好ましくはＴ５０８Ｋ、Ｒ、又はＳ；Ｆ５０９、好ましくはＦ５０９Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ又はＹ；Ａ５１１、好ましくはＡ５１１Ｆ、Ｗ、又はＹ；Ｄ５１２、好ましくはＤ５１２Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５１５、好ましくはＴ５１５Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｑ又はＳ；Ｌ５１６、好ましくはＬ５１６Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；Ｓ５１７、好ましくはＳ５１７Ｃ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｗ又はＹ；Ｋ５１９、好ましくはＫ５１９Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｒ５２１、好ましくはＲ５２１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｉ５２３、好ましくはＩ５２３Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ又はＹ；Ｋ５２４、好ましくはＫ５２４Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｋ５２５、好ましくはＫ５２５Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｑ５２６、好ましくはＱ５２６Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＹ；Ｔ５２７、好ましくはＴ５２７Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｅ５３１、好ましくはＥ５３１Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｈ５３５、好ましくはＨ５３５Ｄ、Ｅ又はＰ；Ｋ５３８、好ましくはＫ５３８Ｆ、Ｗ又はＹ；Ａ５３９、好ましくはＡ５３９Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｋ５４１、好ましくは、Ｋ５４１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｋ５５７、好ましくはＫ５５７Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ａ５６１、好ましくはＡ５６１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５６６、好ましくはＴ５６６Ｆ、Ｗ又はＹ；Ａ５６９、好ましくはＡ５６９Ｈ又はＰに対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の（例えば数個の）改変を含むと共に、前記１又は２以上の（例えば数個の）改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４２．前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、配列番号２の位置Ｖ５４７、好ましくはＶ４５７Ａ；Ｋ５７３、好ましくはＫ５７３Ｐ又はＹ；Ｉ５２３、好ましくはＩ５２３Ａ又はＧ、Ｔ５２７、好ましくはＴ５２７Ｍ、Ｋ５００、好ましくはＫ５００Ａ；又はＥ５０５、好ましくはＥ５０５Ｑに対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の（例えば数個の）改変を含むと共に、前記１又は２以上の（例えば数個の）改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４３．前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、配列番号２の位置５７３、５２３、５２７又は５０５、好ましくはＫ５７３Ｙ；Ｉ５２３Ｇ；Ｉ５２３Ａ；Ｔ５２７Ｍ；Ｅ５０５Ｑ；又はＫ５７３Ｐに対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の（例えば数個の）改変を含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４４．前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、位置Ｋ５７３Ｙ及びＩ５２３Ｇ；Ｋ５７３Ｙ、Ｉ５２３Ｇ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｙ、Ｅ５０５Ｑ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｙ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ及びＩ５２３Ｇ；Ｋ５７３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ、Ｅ５０５Ｑ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ及びＴ５２７Ｍ；Ｖ５４７Ａ；Ｖ５４７Ａ及びＫ５７３Ｐ；Ｖ５４７Ａ、Ｅ５０５Ｑ、Ｋ５７３Ｐ及びＴ５２７Ｍ；又はＫ５００Ａ及びＨ５１０Ｑに対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の（例えば数個の）改変を含む、パラグラフ４３のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４５．前記コンジュゲーション可能なポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の、少なくとも７０％、任意により少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％である、パラグラフ２５～４４の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４６．前記ポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．２、９９．４、９９．６、９９．８％の配列同一性を有する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４７．斯かるポリペプチドが折り畳まれた場合に、配列番号２のポリペプチドの天然のジスルフィド結合のうち、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、好ましくは１７個全てが存在する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４８．前記ポリペプチドが更に、生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤が結合可能な、更なるリンカーを含む、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
４９．（１又は２以上の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を形成する前記（１又は２以上の）改変によって得られるポリペプチドが、ヒトにおいて許容可能な免疫原性、好ましくは野生型ＨＳＡ（配列番号２）と同等またはそれ未満の免疫原性を有する、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５０．（１又は２以上の）コンジュゲーション可能なシステイン残基を形成する前記（１又は２以上の）改変が、野生型ＨＳＡ（配列番号２）の免疫原性と比較して、ヒトにおける前記ポリペプチドの免疫原性に悪影響を及ぼさない、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５１．前記ポリペプチドの免疫原性が、Ｔ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープのスクリーニングにより決定される、パラグラフ４９又は５０のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５２．前記ポリペプチドの免疫原性が、エクスビボＴ細胞活性化アッセイにより決定又は予測される、パラグラフ５０～５１の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５３．前記Ｔ細胞活性化アッセイが、増殖アッセイ、例えば［３Ｈ］－チミジン摂取を用いて、Ｔ細胞応答を測定することを含む、パラグラフ５２のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５４．前記ポリペプチドが、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、１０％未満の反応性、好ましくは８、６、４、又は２％未満の反応性、最も好ましくは０％の反応性を有する、パラグラフ５２又は５３のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５５．前記Ｔ細胞活性化アッセイが、サイトカイン分泌アッセイ、例えばＩＬ－２ ＥＬＩＳｐｏｔを用いて、Ｔ細胞応答を測定することを含む、パラグラフ５２～５４の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５６．前記ポリペプチドが、サイトカイン分泌アッセイにおいて、１０％未満の反応性、好ましくは８、６、４、又は２％未満の反応性、最も好ましくは０％の反応性を有する、パラグラフ５５のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５７．前記ポリペプチドが、Ｔ細胞増殖アッセイ及びサイトカイン分泌アッセイにおいて、１０％未満の反応性を有する、パラグラフ４９～５６の何れかのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５８．前記ポリペプチドが、ヒトにおいて有害な抗体応答を刺激しない、前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチド。
５９．前記何れかのパラグラフのコンジュゲーション可能なポリペプチドと、融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチド。
６０．パラグラフ１～５９の何れかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
６１．パラグラフ６０のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
６２．パラグラフ６０のポリヌクレオチド及び／又はパラグラフ６１のプラスミドを含む宿主細胞。
６３．酵母細胞、特にサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である、パラグラフ６２の宿主細胞
６４．生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤と、パラグラフ１～５９の何れかに係るポリペプチドとを含むコンジュゲートであって、前記の生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤が、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、前記ポリペプチドに連結されてなるコンジュゲート。
６５．１又は２以上の（例えば数個の）更なる生物活性化合物、放射性医薬、又は画像化剤を含むと共に、生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤の各々が、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、前記ポリペプチドに連結されてなる、パラグラフ６４のコンジュゲート。
６６．パラグラフ６０のポリヌクレオチドを製造する方法であって、
（ａ）親アルブミン又はその断片をコードする核酸分子を提供し
（ｂ）ヒトアルブミンと少なくとも７０％同一なコンジュゲーション可能なポリペプチド、特に配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列の残基１～５８５、又はその断片であって、配列番号２のＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｌ６６、Ａ９２、Ｑ９４、Ｅ９７、Ｈ１２８、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｄ２５９、Ｋ２６２、Ｎ２６７、Ｑ２６８、Ｌ２７５、Ｅ２７７、Ｌ２８４、Ｅ３１１、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｄ３４０、Ｅ３５４、Ｋ３５９、Ａ３６２、Ｅ３８２、及びＬ３９８、特にＫ９３、Ｅ２９４、Ａ２２６、Ｅ２３０、及びＩ２７１から選択される位置に等しい少なくとも１つの位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むポリペプチドをコードするように、前記核酸分子の核酸配列を修正する
ことを含む方法。
６７．パラグラフ１～５９の何れかのポリペプチドを製造する方法であって、
（ａ）パラグラフ６２又は６３の宿主細胞を前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で培養し、
（ｂ）得られたポリペプチドを、前記宿主細胞、及び／又は、宿主細胞の成長培地から回収する
ことを含む方法。
６８．宿主細胞のシャペロン活性が増強されてなる、パラグラフ６７の方法。
６９．工程（ｂ）で得られたポリペプチドを精製することを更に含む、パラグラフ６７又は６８の方法
７０．パラグラフ６４又は６５のコンジュゲートを製造する方法であって、パラグラフ１～５９の何れかのポリペプチド、又はパラグラフ６７～６９の何れかの方法により製造されるポリペプチドを、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、生物活性化合物、放射性医薬、又は画像化剤に連結することを含む方法。
７１．パラグラフ６４又は６５のコンジュゲートと、生物活性、治療、予防、診断、画像化、又は他の有用な部分とを含むアソシエイト
７２．パラグラフ１～５９の何れかのポリペプチド、パラグラフ６４又は６５のコンジュゲート、又は、パラグラフ７１のアソシエイトを含む、ナノ粒子又はマイクロ粒子又はリポソーム。
７２．パラグラフ６４又は６５のコンジュゲート、パラグラフ７１のアソシエイト、又はパラグラフ７２のナノ粒子又はマイクロ粒子又はリポソームと、少なくとも１つの（例えば数個の）医薬的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む組成物。
７３．前記の生物活性分子、放射性医薬又は画像化剤が、本明細書に記載のものから選択される、パラグラフ６４又は６５のコンジュゲート、パラグラフ７１のアソシエイト、パラグラフ７２のナノ粒子又はマイクロ粒子又はリポソーム、又はパラグラフ７３の組成物。
７４．疾患の処置、病気の処置、及び／又は、診断のための、パラグラフ６４、６５又は７４のコンジュゲート、又はパラグラフ７１のアソシエイト、パラグラフ７２のナノ粒子又はマイクロ粒子又はリポソーム。
７５．パラグラフ１～５９のいずれかに規定されるポリペプチドの、生物活性分子、放射性医薬又は画像化剤の半減期を延長するための使用。
７６．本発明は更に以下の実施例に記載されるが、これらは本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。
実施例１：変異体の調製
特異的ＨＳＡ変異体発現プラスミドの調製
実施例全体にわたり、Sambrook, J. and D.W. Russell, 2001 (Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y)に記載された一般の分子生物学技術を用いるいくつかの技術を用いて、ＨＳＡ変異体を発現させるための方法を行った。
方法１
変異原性フォーワードプライマー及び非変異原性リバースプライマーを用いて単一のアミノ酸変異（Ｋ９３Ｃ、Ａ２２６Ｃ、Ｅ２３０Ｃ、Ｉ２７１Ｃ、Ｅ２９４Ｃ、及びＥ３５８Ｃ）をｐＤＢ５１５５プラスミド（変異Ｃ３４Ａ ＨＳＡをコードする、配列番号３０）に導入した（表３）。プラスミドｐＤＢ５１０２に基づいてＣ３４Ａ変異体をコードするｐＤＢ５１５５を変異原性フォーワードプライマー及び非変異原性リバースプライマーを用いて調製した（表３）。ｐＤＢ５１０２はＷＯ２０１５／０３６５７９に記載されている。メチル化された鋳型ＤＮＡを以下のように調製した。約１．７μｇのプラスミドＤＮＡを、５μＬの１０×緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ：７．５、２５℃、New England Biolabs）、１μＬのｄａｍメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs）、１２．５μＬのｓ－アデノシルメチオニン（New England Biolabs、最終濃度：８０μＭ）、及び水と最終体積が５０μｌになるように混合して、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いで、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて反応混合物を製造者の指示に従って精製した。鋳型としてｄａｍ－メチル化ｐＤＢ５１０２、及びＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いたＰＣＲ反応に適切なプライマーを用いた（表４及び表５に記載）。プラスミドの増幅は、５μｌのＰＣＲ生成物を１％ＴＢＥアガロースゲルで分析して確認した。残りのＰＣＲ生成物に５μｌの緩衝液４（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ－アセタート、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ：７．９、２５℃、New England Biolabs）及び１μｌのＤｐｎＩ酵素を補充して、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて反応混合物を製造者の指示に従って精製した。１μｌの精製プラスミドを大腸菌１０－β細胞（New England Biolabs）に形質転換して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢプレート（５ｇ／Ｌの酵母菌抽出物、１０ｇ／Ｌのカゼイン由来ペプトン、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１２ｇ／Ｌの寒天（Millers LB agar, Merck Millipore））に播種した。Qiagen Plasmid Plus Kit（Qiagen、製造者の指示に従って）を用いてプラスミドを単離して、配列決定を行ってＨＳＡ配列内の所望の変異の存在及びプラスミドｐＤＢ５１５５を確認した。
メチル化ｐＤＢ５１５５鋳型ＤＮＡを以下のように調製した。約３．０μｇのプラスミドＤＮＡと、５μＬの１０×緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ：７．５、２５℃、New England Biolabs）、１μＬのｄａｍメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs）、１２．５μＬのｓ－アデノシルメチオニン（８０μM）（New England Biolabs、最終濃度：８０μM）、及び水を最終体積が５０μｌになるように混合して、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて反応混合物を製造者の指示に従って精製した。
鋳型としてｄａｍ－メチル化ｐＤＢ５１５５、及びＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いたＰＣＲ反応で適切なプライマーを用いた（表４及び表５に記載）。
Figure 0007007261000005
Figure 0007007261000006
Figure 0007007261000007
Figure 0007007261000008
Figure 0007007261000009
Figure 0007007261000010
プラスミドの増幅は、１％ＴＢＥアガロースゲルで５μｌのＰＣＲ生成物を分析して確認した。残りのＰＣＲ生成物に４μｌの緩衝液４（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ－アセタート、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ：７．９、２５℃、New England Biolabs）及び１μｌのＤｐｎＩ酵素を補充して、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、QIAquick 96 ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて、反応混合物を製造者の指示に従って精製した。２μｌの精製プラスミドをコンピテント（形質転換受容性のある）大腸菌ＤＨ５－α細胞に形質転換して、９６深型ウェルブロックにて５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１．２ｍＬのＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）バクテリアトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母菌抽出物、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）中で培養して、ＤＮＡ主鎖の切れ目を修復した。QiaPrep 96 turbo miniprepキット（Qiagen、製造者の指示に従って）を用いてプラスミドを単離した。表６にチオアルブミン構築物の詳細を示す。
以下の点を除いて、ＷＯ２０１５／０３６５７９（引用により本明細書に組み込む）の方法４に記載されたように、出芽酵母菌（S. cerevisiae）に形質転換するためにプラスミドＤＮＡを調製した。ギャップ付きベクター断片として、ＢａｍＨＩ部分に２個の塩基ＧＣを加えてＮｏｔＩ制限部位GCGGCCGC（追加した塩基を下線で表す）とした９７２１ｂｐのｐＤＢ３９３６由来断片の代わりに、９７２３ｂｐのｐＤＢ４１６４由来Ａｃｃ６５Ｉ－ＢａｍＨＩ断片を用いた。ｐＤＢ３９３６はＷＯ２０１１／１２４７１８（参照により本明細書に組み込む）に記載されている。また、ｐＤＢ３９３６と異なり、ｐＤＢ４１６４は、Ａｃｃ６５Ｉ部分とＢａｍＨＩ部分の間に、Ａｃｃ６５Ｉ及びＢａｍＨＩの消化によって実行され、ギャップ修復形質転換には用いられなかったアプラマイシン耐性選択可能マーカーを含む１３６８ｂｐの配列を含む。構築物の宿主株は、出芽酵母菌BXP10 cir0であった（ＷＯ２０１５／０３６７５９、参照により本明細書に組み込む）。この形質転換した細胞を選択寒天プレート（BMMD+CSM-LeuまたはBMMD）に単一コロニーとして培養し、そこから単離したコロニーのパッチを冷凍保存する酵母菌保存液及び分析用試料の調製のためにまた選択寒天プレートに載せた(patched out)。冷凍保存液は、BMMD+CSM-Leuを４８時間振とうしたフラスコ培地５ｍＬを同体積の４０％［ｗ／ｖ］トレハロースと混合して調製し、１ｍＬずつクライオバイアルに移して－８０℃で保存した。４８ウェルマイクロタイタープレートウェルに入れた０．５ｍＬのBMMDをパッチプレートから取った酵母菌と共に接種して、ＷＯ２０１５／０３６５７９、方法４（参照により本明細書に組み込む）に記載されているように振とうしながら３０℃で４日間培養した。振とうしたフラスコ培地をトレハロース保存液から接種した。ＷＯ２０１２／１５０３１９（参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、振とうしたフラスコからこれら変異体を精製した。
Ｌ２４Ｃ、Ｆ４９Ｃ、Ｖ５４Ｃ、Ｄ５６Ｃ、Ｌ６６Ｃ、Ａ９２Ｃ、Ｑ９４Ｃ、Ｅ９７Ｃ、Ｈ１２８Ｃ、Ｆ１５６Ｃ、Ｅ２２７Ｃ、Ｄ２３７Ｃ、Ｋ２４０Ｃ、Ｄ２５９Ｃ、Ｋ２６２Ｃ、Ｎ２６７Ｃ、Ｑ２６８Ｃ、Ｌ２７５Ｃ、Ｅ２７７Ｃ、Ｌ２８４Ｃ、Ｅ３１１Ｃ、Ｋ３１７Ｃ、Ａ３２２Ｃ、Ｅ３３３Ｃ、Ｄ３４０Ｃ、Ｅ３５４Ｃ、Ｋ３５９Ｃ、Ａ３６２Ｃ、Ｅ３８２Ｃ、及びＬ３９８Ｃ（全てＣ３４Ａ由来）の発現プラスミドは、上記の方法とはわずかに異なる方法で調製した。
変異原性フォーワードプライマー及び非変異原性リバースプライマーを用いて単一のアミノ酸変異をｐＤＢ５１５５プラスミド（変異Ｃ３４Ａ ＨＳＡをコードする、配列番号３０）に導入した（表３）。
メチル化鋳型ＤＮＡを以下のように調製した。約２．５μｇのプラスミドＤＮＡを、５μＬの１０×緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ：７．５、２５℃、New England Biolabs）、１μＬのｄａｍメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs）、１２．５μＬのｓ－アデノシルメチオニン（８０μＭ）（New England Biolabs、最終濃度：８０μＭ）、及び水と最終体積が５０μｌになるように混合して、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて、反応混合物を製造者の指示に従って精製した。
鋳型としてｄａｍ－メチル化ｐＤＢ５１５５及びＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いるＰＣＲ反応において、適切なプライマーを用いた（上記の表４及び表５に記載）。
プラスミドの増幅は、１％ＴＢＥアガロースゲルで５μｌのＰＣＲ生成物を分析して確認した。残りのＰＣＲ生成物に、４μｌの緩衝液４（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ－アセタート、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ：７．９、２５℃、New England Biolabs）及び１μｌのＤｐｎＩ酵素を補充して、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、QIAquick 96 ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて、反応混合物を製造者の指示に従って精製した。１μｌの精製プラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５－α細胞に形質転換して、９６深型ウェルブロックにて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１．２ｍＬのＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）バクテリアトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母菌抽出物、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）で培養してＤＮＡ主鎖の切れ目を修復した。QiaPrep 96 turbo miniprepキット（Qiagen、製造者の指示に従って）を用いてプラスミドを単離した。表６にチオアルブミン構築物の詳細を示す。
ＷＯ２０１５／０３６５７９の方法４（参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、プラスミドＤＮＡを出芽酵母菌に形質転換するために調製した。この構築物の宿主株は、出芽酵母菌ＤＹＢ７であった（Payne et al. (2008) Applied and Environmental Microbiology Vol 74(24):7759-7766）。ＷＯ２０１５／０３６５７９に記載の方法から分かれた酵母菌マイクロタイタープレート培養を行った。この培養では、同じ試料を２つ用意して形質転換を行い、最初の培養を２日間行った。５０μｌの４０％（ｗ／ｖ）トレハロースを含む新しいマイクロタイタープレートに５０μｌの培地を移して、２日間培養して保存液を調製した。この２日間培養した培地（５０μｌ）を４５０μＬのBMMD+CSM-leuを含む新しいマイクロタイタープレートに加えて、さらに４日間、（２００ｒｐｍ、Eppendorf Innova 44インキュベーション振とう器内の、湿度１００％の密封容器内で２．５ｃｍの軌道で）振とうしながら３０℃でインキュベートした。３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って培地の上澄みを採取し、３７５μｌの上澄みを新しい４８ウェルマイクロタイタープレートに移した。
発現プラスミド及び酵母菌保存液の調製
ＷＯ２０１１／０５１４８９及びＷＯ２０１２／１５０３１９ （参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、同体積の培地及びトレハロースを用いて４８時間保存法により発現プラスミドの調製及び出芽酵母菌の形質転換を行った。この構築物の宿主株は、出芽酵母菌BXP10 Cir0（ＷＯ２０１５／０３６７５９、参照により本明細書に組み込む）であった。特に断りがなければ、ＷＯ２０１２／１５０３１９に記載されているように、振とうしたフラスコから変異体を精製した。
得られたアルブミン変異体を表６にまとめて示す。
Figure 0007007261000011
実施例２ ＤＴＮＢインキュベートしたチオアルブミン変異体のチオールの決定
マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）培地を用いて、チオールアルブミン変異体の遊離チオール含有量を小規模で決定した。試験チオールアルブミン変異体はＣ３４Ａの置換を含んでおり、当然、天然アルブミンのチオール基を含んでいなかった。従って、これらのアルブミン変異体はそれぞれ、遊離チオールを１個のみ有すると予測された。
タンパク質の遊離チオールの数は、エルマン試薬を用いて分光光度分析で決定してもよい。エルマン試薬（５’５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ））は芳香族ジスルフィドで、チオール基と反応して、タンパク質のジスルフィド混合物と（タンパク質スルフヒドリル基１モルあたり）１モルの５－チオ２－ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を形成する。またこの反応では、溶液に放出された遊離ＴＮＢにより溶液が黄色になる。あるいは、ＤＴＮＢ試薬で処理したタンパク質試料の質量分光分析によりタンパク質の遊離チオールの数を決定してもよい。５－チオ２－ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）は、１９９Ｄａの分子量を有しており、従って、質量が１９７Ｄａ（ＴＮＢから試験タンパク質の遊離チオール基とのジスルフィド結合の形成時にＨ２が失われる）から増加することから、そのタンパク質試料に１個の遊離チオール基が存在することが分かる。
４μｌの緩衝液２（４ｍｇ／ｍＬのＤＴＮＢ、５００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ：７．０）を、９６ウェルＭＴＰ形式の試験タンパク質培養試料（２００μＬ）に加えた。調製液を周囲温度（２０±５℃）で２５分間インキュベートして、ＴＮＢで標識した。タンパク質の完全な質量を超高速液体クロマトグラフ質量分析（ＵＰＬＣ－ＭＳ）で決定した。Waters Acquityを用いて、BEH 50 × 2.1 mm ACQUITY BEH 1.7 μm 300Å C4 column及び緩衝液Ａ（０．１％ギ酸）及び緩衝液Ｂ（１００％アセトニトリル、０．１％ギ酸）の５分の分析溶離勾配で１０μＬの試料のＵＰＬＣ分離を行った。溶出したタンパク質を直接、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を介してBruker MicrOTOF II質量分析計に導入した。すべての機器制御及び試料テーブルをBioPharma Compass（商標）を用いて制御した。データ分析では、２．９～３．０分間、すべてのデータのタンパク質ピークの立ち上がりを手動で処理した。この処理は、０．０７６５Ｄａでのガウス平坦化アルゴリズム集合を用いたスペクトルの平坦化及び平坦性を０．８に設定したベースライン補正を含んでいた。最大エントロピーアルゴリズムを用いてピーク分離した完全な質量スペクトルを得た。すべての方法及びパラメータをBioPharma Compass（商標）内で設定した。
上記のチオアルブミン試料のチオール分析の結果を表７にまとめて示す。ＤＴＮＢインキュベーション時の質量１９７Ｄａの増加は、試料中のタンパク質に１つの遊離チオール基が存在することを示すと予測される。ＭＳによって実際に測定された１９７±１５Ｄａの質量の増加は、正確な質量を示していると解釈した。すべての変異体は、ＴＮＢ分子に結合していた。
Figure 0007007261000012
実施例３ チオアルブミン変異体の凝集スクリーニング
溶液中に単量体として残留する傾向について変異体を調べた。各変異体は、単一の遊離チオール基を有する。従って、これらの変異体を、同様に単一の遊離チオール基を有する野生型ＨＳＡを比較して調べた。
以下の変更点を除いて、ＷＯ２０１２／１５０３１９（参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、出芽酵母のフラスコ培地を振とうし、精製した。ＢＭＭＳ培地（１０ｍＬ）を出芽酵母と共に接種して、２００ｒｐｍで軌道振とうしながら３０℃で２日間培養した。各種培養の一部（５ｍＬ）を用いて、２×２００ｍＬのＢＭＭＳ培地を接種して、２００ｒｐｍで軌道振とうしながら３０℃で５日間培養した。０．２μｍの真空濾過膜（Nalgene Sterile Top Filter）で濾過して、細胞を採取し、精製のため上澄みを保持した。
単一工程のクロマトグラフ法の手順を用いて、チオアルブミン変異体から精製した材料を調製した。精製工程では、AlbuPure（登録商標）マトリックス（ProMetic BioSciences Ltd, Cambridge UK、またはAlbumedix Ltd（旧名Novozymes Biopharma UK Ltd））を充填したカラム（床容積：約２ｍＬ）を用いた。これを５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ：５．３）で平衡化して、マトリックス１ｍＬあたり約２０ｍｇのタンパク質に対して無溶媒の振とうフラスコ培地の上澄みを約５．５～６．５のｐＨで充填した。カラムを、それぞれ、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ：５．３）及び５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ：８．０）からなる溶液約１０カラム体積で洗浄した。５０ｍＭの酢酸アンモニウム、１０ｍＭのオクタン酸塩（ｐＨ：７．０）の溶液約１０カラム体積を用いて結合タンパク質を溶出した。AKTA Explorer system（GE Healthcare）を用いて、全体の流量を２４０ｃｍ／ｈとした。溶出液試料の体積は約２０ｍＬであった。溶出液試料の単量体濃度（％）をゲル透過高速液体クロマトグラフ法（ＧＰ－ＨＰＬＣ）により決定した。ＬＣ２０１０高速液体クロマトグラフシステム（島津）を用いて、島津ＶＰ７．３クライアントサーバーソフトウェアの制御下でＵＶ検出によりタンパク質の濃度を求めた。２５μＬを、６．０ｍｍ（内径）×４０ｍｍ（長さ）のTSK SWガードカラム（Tosoh Bioscience）を備えた７．８ｍｍ（内径）×３００ｍｍ（長さ）のＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Tosoh Bioscience）に注入した。１ｍＬ／分、運転時間１５分間で、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの硫酸ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（ｐＨ：７．０）を用いて試料をクロマトグラフ測定にかけた。試料を２８０ｎｍのＵＶで検出して、既知の濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）を有する標準組み換えヒトアルブミンに対するピーク面積により定量化した。
試料を再分析して、２～８℃で７週間保存した後の単量体の百分率の変化、及び２～８℃で６ヶ月保存した後の単量体の百分率の変化を決定した。単量体の百分率（丸括弧内）は、各試料について、同じ保存条件下で野生型の対照に対する値として求めた。これらの結果を表８Ａにまとめて示す。溶出液の最終濃度は０．６～１．２ｍｇ／ｍＬの範囲であり、精製後に回収されたタンパク質は１２～２４ｍｇであった。Ｔ＝０の場合、すべての変異体の単量体の百分率は、単量体の百分率が８７％である野生型対照と同じかそれ以上であった。これらの変異体は、単量体タンパク質の百分率を２～８℃で７週間に渡って保存する間、維持していた。少なくとも４種の変異体については、２～８℃で６ヶ月保存している間に凝集傾向を示す大きな証拠は観察されなかった。
Figure 0007007261000013
さらに、上の実施例３に記載した方法あるいはAgilent 1260イソクラティック（定組成）超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）装置を用いて、変異体を分析した。ＵＨＰＬＣ法の場合、実施例３に記載した移動相を用いて、０．５ｍＬ／分、運転時間５分間で４μＬを４．６ｍｍ（内径）×１５０ｍｍ（長さ）のBEH 200Å 1.7 μｍ column （Waters）に注入した。試料を２８０ｎｍのＵＶで検出して、既知の濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）を有する標準組み換えヒトアルブミンに対するピーク高さにより定量化した。
これらの試料を、２～８℃で８週間保存後、及び２～８℃で４ヶ月保存後に再分析して、単量体の百分率の変化を求めた。単量体の百分率（丸括弧内）は、各試料について、同じ保存条件下の野生型の対照に対する値として求めた。これらの結果を表８Ｂにまとめて示す。溶出液の最終濃度は、０．１～１．０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、精製に回収されたタンパク質は２～２０ｍｇであった。Ｔ＝０の場合、大部分の変異体の単量体百分率は、単量体百分率が８６％である野生型の対照の単量体百分率と同じかそれ以上であった。これらの変異体は、２～８℃で８週間に渡って保存する間、単量体タンパク質を維持していた。また、２～８℃で４ヶ月保存する間に凝集傾向を示す大きな証拠は観察されなかった。しかしながら、変異体Ｃ３４Ａ＋Ｌ６６Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｅ２７７Ｃ、及びＣ３４Ａ＋Ｅ３１１ＣはＴ＝０で単量体の百分率が比較的低く、その結果、凝集体を形成する傾向を有することが分かった。
Figure 0007007261000014
Figure 0007007261000015
実施例４ 結合効率及びチオアルブミン変異体の制御された加水分解
タンパク質に対して３．２倍のモル過剰のマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンを用いて、実施例３のチオアルブミン変異体をビオチン（Thermo Scientific, EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin）に結合させた。図４に反応スキームを示す。チオアルブミンAlbuPure（登録商標）溶出液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ：７．４）で希釈して、０．３ｍｇ／ｍＬ（４５．１５ｎｍｏｌ）の溶液を１０ｍＬ得た。これを以下の表９Ａに示すように結合させた。
チオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ａ２２６ＣのＭＳスペクトルから、一晩インキュベーションした後、マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンとの結合が起きなかったことが示された。これらの結果を表９Ａにまとめて示す。チオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ｅ２３０Ｃ及びＣ３４Ａ＋Ｉ２７１ＣのＭＳスペクトルから、一晩インキュベーションした後、結合が起きたことが示され、コンジュゲート種及び非コンジュゲート種のピークの相対的な高さを比べると、それぞれ、約７２％または７２％モノコンジュゲート（すなわち、同濃度のモノコンジュゲート）を得た。Ｃ３４Ａ＋Ｉ２７１ＣのＭＳスペクトルを図５Ａに示す。チオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３ＣのＭＳスペクトルを図５Ｂに示す。図５Ｂは、６６９０８Ｄａに単一の種を示しており、チオアルブミン変異体の正しい分子量及び単一のマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチン（＋５２５Ｄａ）の付加を示している。このことから、この変異体は、結合に利用可能な単一の遊離チオールを有することが確認された。チオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ｅ２９４Ｃ及びＣ３４Ａ＋Ｅ３５８Ｃについても同等の結果が得られた。
Figure 0007007261000016
さらに、変異体を分析し、その結果を表９Ｂに示す。試料Ｃ３４Ａ＋Ｌ６６Ｃ及びＣ３４Ａ＋Ｑ９４Ｃのタンパク質濃度は低く、従って、０．１５ｍｇ／ｍＬ（２２．５８ｎｍｏｌ）溶液を１０ｍＬ用いた。予め重量を量った２ｍｇのEZ-Link微細管２本のそれぞれに５×２００μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）を加えて、２ｍｇ／ｍＬビオチンの保存液を調製した。冷凍乾燥生成物の回収を最大にするためにバイアルを洗浄した。１ｍＬを２体積、蓋付きの７ｍＬの容器に入れた。ビオチン保存液から３８μＬ（１４４．５ｎｍｏｌ）を１０ｍＬのアルブミン試料に加えて、アルブミンに対して約３．２倍のモル過剰のビオチンを供給した。しかしながら、Ｃ３４Ａ＋Ｌ６６Ｃ及びＣ３４Ａ＋Ｑ９４Ｃ試料には、１９μＬのみビオチンを加えて、タンパク質に対して３．２倍過剰のマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンを維持した。試料を穏やかに混合して、周囲温度で一晩インキュベートした。インキュベーション後、１５分の分析溶離勾配及び約７分と１０分の間のタンパク質のピークの処理データを用いたこと以外は、試料を質量分析にかけて実施例２に記載した方法に従って結合後の完全なタンパク質の質量を決定した。ＭＳスペクトルの結果を表９Ｂにまとめて示す。この表から、チオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ｌ６６Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ａ９２Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｑ９４Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｄ２５９Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｌ２７５Ｃ、及びＣ３４Ａ＋Ｌ２８４Ｃは一晩インキュベーションした後にマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンと結合しなかったことが分かった。ＷＴ対照、及びチオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ｌ２４Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｖ５４Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｈ１２８Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｅ２２７Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｋ２４０Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｋ２６２Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｑ２６８Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｅ２７７Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｋ３１７Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ａ３２２Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｋ３５９Ｃ、及びＣ３４Ａ＋Ａ３６２ＣのＭＳスペクトルから、マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンとの結合が９０％以上であることが分かった。
Figure 0007007261000017
マレイミドコンジュゲート結合の安定性は、強固ではない。コハク酸イミドは、逆マイケル経路を介してマレイミド及び遊離チオールに戻ることができる（図４）。従って、非常に望ましくないが、放出されたマレイミドは、他のチオール反応性種と反応する場合があり、また、生体内で他の化合物と反応する場合がある。逆マイケル反応性を回避するため、コハク酸イミドは、コハク酸に加水分解されてもよく、これにより効果的にＨ２Ｏ（＋１８Ｄａ）を取り込んで、コンジュゲートをロックし、チオール安定性となる。加水分解によるチオール安定性の特性は望ましい。というのも、生体内の様々な環境で望ましくないチオール転換が起こらないことを確実にすると思われるからである。従って、ｐＨ及び温度を上げて、コハク酸イミドの制御された加水分解を行った。結合後、試料をVivaspin 20遠心濃縮器（Sartorius）に移して、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で平衡化した。試料を４，５００ｘｇで１５分間遠心分離し、体積を約２００μＬまで減らした。透析濾過カップをVivaspin 20の容器に取り付けて、次いで１５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：９．０）を充填した。試料を４，５００ｘｇで１５分間、２回目の遠心分離にかけた。さらに１５ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：９．０）を加えて、試料を３回目の遠心分離にかけて、確実にすべての遊離マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンが溶液から除去されるようにした。残りの保持液を除去して、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：９．０）で最終体積を１０ｍＬ（すなわち、損失がないと仮定して、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度）にした。制御された加水分解が起こるように、試料を３７℃で少なくとも２４時間インキュベートして、チオエーテルコンジュゲートの結合の安定性を決定した。結果を表１０にまとめて示す。
加水分解されたチオール安定性の野生型対照コンジュゲートの収率は５３％であり、これは加水分解時の競合する逆マイケル脱結合によるものと思われる（図６Ａ）。また、コンジュゲート質量の平均シフトは＋１４Ｄａであることが観察された。これは、部分的に加水分解が起こったことを示している。最も高い結合効率を有するチオアルブミン変異体は、制御された加水分解時のコンジュゲート安定性が向上していたことが明らかである。具体的には、この反応は、逆マイケル脱結合経路よりもコハク酸イミドの加水分解が優先する。Ｃ３４Ａ＋Ｅ２９４Ｃの例が図６Ｂに示されているが、ｐＨ９．０、３７℃でのインキュベーション後にコンジュゲートの損失がないことが示されている。チオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ、Ｃ３４Ａ＋Ｅ２９４Ｃ、及びＣ３４Ａ＋Ｅ３５８Ｃについて、同等の結果が得られており、制御された加水分解時に大きな損失が見られなかった。
Figure 0007007261000018
合わせた凝集の結果及び結合の結果を共に表１１にまとめて示す。変異体Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ及びＣ３４Ａ＋Ｅ２９４Ｃは、野生型アルブミンに比べて凝集図が向上しており、マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンとの結合割合が高かった。また、ｐＨ９．０、３７℃での制御された加水分解後のコンジュゲートの損失が最少であった。これらの変異体をさらなる評価のために選択した。
Figure 0007007261000019
実施例５：組み合わせ変異体
方法２
組み合わせ変異体（表１２）を作製して、突然変異Ｋ９３Ｃ及びＥ２９４Ｃの両方をＨＳＡ Ｃ３４Ａ突然変異と結合させたもの、及び結合させなかったものを作製した。つまり、個別の突然変異を含むプラスミドを調製して、制限酵素消化及びライゲーションにより突然変異を結合させた。
突然変異Ｋ９３ＣまたはＥ２９４Ｃに対応する方法１で作製した精製済みプラスミド（１μｌ）を大腸菌ＮＥＢ５－α（New England Biolabs）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢプレート（上述の通り）に播種した。Qiagen Plasmid Plus Kit（Qiagen、製造者の指示に従って）を用いて、プラスミドを単離して、配列を決定し、ＨＳＡ配列内に所望の突然変異が存在することを確認した。これらのプラスミドをｐＤＢ５６２３（Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ）及びｐＤＢ５６２４（Ｃ３４Ａ＋Ｅ２９４Ｃ）と名付けた。
ＮｈｅＩ制限部位及びＳｐｈＩ制限部位を用いてプラスミドｐＤＢ５６２４から断片を取り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）で精製した。この断片を、同じ酵素で消化したｐＤＢ５６２３にライゲートして構築物ｐＤＢ５６２５を作製した。ＳａｃＩＩ制限酵素及びＰｓｔＩ制限酵素でｐＤＢ５１０２を消化して作製した断片をｐＤＢ５６２３及びｐＤＢ５６２４に挿入して、ｐＤＢ５６２６及びｐＤＢ５６２７を構築した。ｐＤＢ５１０２は、ＷＯ２０１５／０３６５７９（参照により本明細書に組み込む）に記載されている。ライゲートしたプラスミドをすべて、大腸菌ＮＥＢ５－αに形質転換して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢプレート（上述の通り）に播種した。Qiagen Plasmid Plus Kit（Qiagen、製造者の指示に従って）を用いてプラスミドを単離して、配列を決定し、ＨＳＡ配列内に所望の突然変異が存在することを確認した。
ｐＤＢ５６２８を作製するため、ＳａｃＩＩ制限部位及びＰｓｔＩ制限部位を用いてプラスミドｐＤＢ５１０２から断片を取り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて精製した。この断片を、同じ酵素で消化したｐＤＢ５６２５にライゲートした。ライゲートしたプラスミドをすべて、大腸菌ＮＥＢ５－αに形質転換して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢプレートに播種した。Qiagen Plasmid Plus Kit（Qiagen、製造者の指示に従って）を用いてプラスミドを単離して、配列を決定しＨＳＡ配列内に所望の突然変異が存在することを確認した。
Figure 0007007261000020
発現プラスミド及び酵母菌保存液の作製
ＷＯ２０１２／１５０３１９に記載されたように、４８時間保存法（参照により本明細書に組み込む）により発現プラスミドの調製及び出芽酵母の形質転換を行った。構築物の宿主株は、出芽酵母BXP 10 Cir0（ＷＯ２０１５／０３６５７９、参照により本明細書に組み込む）であった。特に断りがなければ、ＷＯ２０１２／１５０３１９（参照により本明細書に組み込む）に記載されたように振とうフラスコからの変異体を精製した。
実施例６ チオアルブミン変異体の作製、精製、及び結合
１００ｍＬのＢＭＭＳ増殖培地（１．７ｇ／Ｌの酵母菌用窒素基材（アミノ酸または（ＮＨ４）２ＳＯ４を含まない）、Ｄｉｆｃｏ；６．０９ｇ／Ｌのクエン酸一水和物；２５．２７ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ；５．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；ｐＨ：６．５±０．２；スクロース、２０ｇ／Ｌまで添加）を含む個別の振とうフラスコに冷凍保存した酵母菌保存液をそれぞれ１ｍＬ播種した。振とうフラスコ内の細胞濃度が０．８～１．２ｍｇ／ｍＬになったら、細胞を振とうフラスコから発酵槽（作業容積：１０Ｌ、Sartorius Biostat C 10-3発酵槽）に移して、発酵槽で細胞播種濃度を１０ｍｇ／Ｌ以上（１０ｍｇ／Ｌ以上）にした。
高細胞密度（ＨＣＤ）流加培養発酵で酵母菌株のそれぞれを純粋培養してチオアルブミン変異体を作製した。この発酵の目的は、制御された供給速度での追加によりエタノール及び酢酸塩などの副生成物の形成を回避することで、最大バイオマス及び生産性を達成することであった。さらに、発酵法の詳細はＷＯ９６／３７５１５（参照により本明細書に組み込む）に記載されている。温度を３０℃、ｐＨを６．２にそれぞれ制御した。Sorvall RC 3C遠心分離器（DuPont）を用いた遠心分離により、培地の上澄みを採取して、材料をすぐに精製し、残りの材料を冷凍（－２０℃）して、次の精製のために解凍する前に保存した。実施例３に記載されたように、ＬＣ２０１０ ＨＰＬＣシステム（島津）を用いたＧＰ－ＨＰＬＣにより、島津ＶＰ７．３クライアントサーバーソフトウェアの制御下でＵＶ検出による最終生成物濃度を決定した。表１３は、各チオアルブミン変異体の収率（ｍｇ／ｍＬ（培地上澄み））を示している。すべての場合で１ｍｇ／ｍＬ（培地上澄み）超という高い生成物の滴定濃度が観察されたことが示されている。
Figure 0007007261000021
二段階クロマトグラフ工程により規模を拡大して変異体を精製した。それぞれ、約４カラム体積の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ：５．３）、１０カラム体積の５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ：８．０）、及び１０カラム体積の５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ：８．０）でカラムを洗浄したことを除き、実施例３で記載したように、AlbuPure（登録商標）クロマトグラフ法を用いて第一精製工程を行った。１～３カラム体積の５０ｍＭ酢酸アンモニウム、１０ｍＭオクタン酸ナトリウム（ｐＨ：７．０）を用いて結合タンパク質を溶出した。次いで、Evans et al. (2010), Protein Expression and Purification Volume 73, Issue 2, Pages 113-124に記載されているように陰イオン交換クロマトグラフ法（ＤＥ－ＦＦ）によるイオン交換クロマトグラフ法を用いてAlbuPure（登録商標）溶出液をさらに精製した。精製後、ＤＥ－ＦＦ溶出液試料を濃縮して、１０，０００分子量カットオフVivacell 100遠心濃縮器（Sartorius）を用いて限外ろ過／透析濾過により緩衝液を交換した。透析濾過の前に試料を２，０００ｘｇ、３０分間（複数回）遠心分離にかけて、１０体積の２５ｍＭリン酸ナトリウム、２１５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ：６．５）に対して１０ｍＬ以下まで体積を減らした。透析濾過後、試料濃度は、１２４～１７７ｍｇ／ｍＬの範囲であった。これらの試料を希釈して、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２１５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ：６．５）中で最終配合物濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。
遊離チオール含有量（遊離チオール数）に対して３．２倍のモル過剰のビオチンを用いたことを除き、実施例４に記載されたように、チオアルブミン変異体をマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンと結合させた。変異体によっては結合に利用可能な遊離チオール部分を複数有するので、表１４に突然変異あたりのすべてのビオチン結合に対する予測分子量をまとめて示す。２個または３個のチオール基を有する変異体は、それぞれ、２×５２５Ｄａ及び３×５２５Ｄａ（質量が）増加した。各ピーク種のピークの相対的な高さを用いて、標的コンジュゲートの百分率、すなわち、単一のビオチン標識チオアルブミン変異体、二重ビオチン標識チオアルブミン変異体、三重ビオチン標識チオアルブミン変異体の正しい百分率を算出した。Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ変異体は合計３個の遊離チオール残基を有していた。この変異体のＭＳスペクトルを図７Ａに示す。ＭＳスペクトルの単一のピーク種から明らかであるように、この変異体は、１モルのタンパク質あたり３モルのマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンを有していた。このことは、質量が１５７５Ｄａ（３×５２５Ｄａ）増加して６７９６８Ｄａとなったことによって示されている（表１５）。これらの試料を、制御された加水分解が起こるように３７℃、ｐＨ９で少なくとも２４時間インキュベートして、実施例４に記載されたようにチオエーテルコンジュゲート結合の安定性を決定した。これらの結果を表１５にまとめて示す。加水分解されたチオール安定性のＫ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃコンジュゲートの収率は、三重コンジュゲートが２０％であった。これは、加水分解時におけるＣ３４コンジュゲートの競合する逆マイケル脱結合のためである（図７Ｂ）。ここで主な種は、加水分解が二重コンジュゲート種に起こったことを示す６７４７６Ｄａの質量を有する加水分解されたチオール安定性の二重コンジュゲートであった。Ｃ３４位にシステインを含む変異体は、Ｃ３４Ａ突然変異を有する変異体と比べて、加水分解時の脱結合（deconjugation）が有意であったことが明らかになった。二重チオール変異体Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃでは、二重にコンジュゲートしたものが加水分解前は６２％、加水分解後は５６％であった。６６４４３Ｄａの質量を有するこのピーク種の観察から、Ｃ３４にシステインを含むＫ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃコンジュゲート（図７Ｂ）に比べて、加水分解が起こったがコンジュゲートの損失は最少であったこと確認された（図７Ｃ）。特筆すべきは、マレイミドリンカーを用いた場合、Ｋ９３Ｃ変異体及びＥ２９４Ｃ変異体のコンジュゲート安定性が向上していたことである。
Figure 0007007261000022
Figure 0007007261000023
実施例３に記載された方法を用いて、調製した試料についてＧＰＨＰＬＣにより２～８℃で６ヶ月間の安定性評価を行った。単量体の百分率（丸括弧内）は、各試料について、同じ保存条件下の野生型の対照に対する値として決定した。単量体の百分率の結果を表１６にまとめて示す。この表から、アルブミン変異体を５０ｍｇ／ｍＬで調製して、２～８℃で６ヶ月間保存した場合に凝集濃度は容認可能な範囲内であることが分かった。
Figure 0007007261000024
実施例７：改変ＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体
ＷＯ２０１１／０５１４８９（参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、Ｋ５７３Ｐ置換を有するＨＳＡは、野生型ＨＳＡよりもＦｃＲｎに高い親和性を有する。構築物を作製して、表１２に示す変異体の突然変異をプラスミドｐＤＢ４６７３由来のＨＳＡ Ｋ５７３Ｐ突然変異と結合させた。
方法３
ＰｓｔＩ制限部位及びＸｈｏＩ制限部位を用いてプラスミドｐＤＢ５６２３、５６２４、５６２５、５６２６、５６２７、及び５６２８から断片を切り取り、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて精製した。この断片を同じ酵素で消化したｐＤＢ４６７３にライゲートして、構築物ｐＤＢ５７０４、５７０７、５７１０、５７１３、５７１６、及び５７１９を作製した（表１７）。ライゲートしたプラスミドをすべて大腸菌ＮＥＢ５－α（New England Biolabs）に形質転換して、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢプレートに播種した。Qiagen Plasmid Plus Kit（Qiagen、製造者の指示に従って）を用いてプラスミドを単離して、配列を決定し、ＨＳＡ配列内に所望の突然変異が存在することを確認した。
Figure 0007007261000025
発現プラスミド及び酵母菌保存液の作製
ＷＯ２０１２／１５０３１９に記載されたように４８時間保存法（参照により本明細書に組み込む）によって発現プラスミドを調製して出芽酵母に形質転換した。構築物の宿主株は、出芽酵母BXP10 Cir0（ＷＯ２０１５／０３６５７９、参照により本明細書に組み込む）であった。特に断りがなければ、ＷＯ２０１２／１５０３１９（参照により本明細書に組み込む）に記載されているように振とうフラスコから変異体を精製した。
実施例８ 改変ＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体の凝集スクリーニング
実施例３に記載したように、出芽酵母を振とうフラスコで培養して精製した。単一工程AlbuPureクロマトグラフ法の手順を用いて、実施例３に記載したように６種の変異体から精製された材料を調製した。精製後、実施例４に記載したように、Vivaspin遠心分離濃縮器を用いて２０ｍＬの溶出液を２００μＬ未満に濃縮した。濃縮後、１０ｍＬの２５ｍＭリン酸ナトリウム、２１５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ：６．５）を加えて試料の緩衝液を交換し、上述のように試料を遠心分離にかけた。回収した最終体積は、７５μＬ～２００μＬであった。実施例３に記載したように、溶出液試料の単量体濃度及び百分率をゲル透過高速液体クロマトグラフ法（ＧＰ－ＨＰＬＣ）で決定した。結果を表１８にまとめて示す。生成物の最終濃度は４７～１５４ｍｇ／ｍＬの範囲であった。実施例４の典型的な野生型アルブミン対照は、単量体の百分率が１．１ｍｇ／ｍＬで８７％であった（表８Ａ）。分析したすべての変異体で、タンパク質濃度が有意に高い場合でも単量体の百分率は８７％以上であった。これは、すべての変異体において凝集傾向が最少であったことを示している。
Figure 0007007261000026
実施例９ 改変ＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体の結合効率及び制御された加水分解
実施例６で記載したように、チオアルブミン組み合わせ変異体（表１７）を３．２倍の過剰なマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンと結合させた。変異体によっては結合に利用可能な遊離チオール部分を複数有するので、突然変異あたりのすべてのビオチン結合の予測分子量を表１９にまとめて示す。
Figure 0007007261000027
２個または３個のチオール基を有する変異体の分子量は、それぞれ、２×５２５Ｄａ及び３×５２５Ｄａ増加した。各ピーク種のピークの相対的な高さを用いて、標的コンジュゲートの百分率、すなわち、単一ビオチン標識チオアルブミン変異体、二重ビオチン標識チオアルブミン変異体、または三重ビオチン標識チオアルブミン変異体の百分率を算出した。Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐ変異体は合計３個の遊離チオール残基（３つ目のチオールは天然Ｃｙｓ３４によって提供される）を有していた。この変異体のＭＳスペクトルを図８Ａに示す。ＭＳスペクトルの単一ピーク種から明らかであるように、この変異体は１モルのタンパク質あたり３モルのマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンと結合していた。このことは、質量が１５７５Ｄａ（３×５２５Ｄａ）増加して、６７９４０．８Ｄａとなったことから分かる。制御された加水分解を起こすように３７℃、ｐＨ９で少なくとも１８時間、試料をインキュベートして、実施例４に記載したようにチオエーテルコンジュゲート結合の安定性を決定した。結果を表２０にまとめて示す。
加水分解したチオール安定性のＫ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐコンジュゲートの収率は、三重コンジュゲートが２３％であった。これは、加水分解時のＣ３４コンジュゲートの競合する逆マイケル脱結合のためである（図８Ｂ）。ここで主な種は、この二重コンジュゲート種に加水分解が起こったことを示す６７４４７．３Ｄａの質量を有する加水分解されたチオール安定性の二重コンジュゲートであった。Ｃ３４位にシステインを含む変異体は、Ｃ３４Ａ突然変異を有する変異体に比べて、加水分解時の脱結合をより顕著に被ることが明らかになった。
Figure 0007007261000028
実施例１０ マレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンとの結合前及び結合後の改変ＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
実施例６に従って、表１２及び表１７に詳述したチオアルブミン組み合わせ変異体を流加培養発酵により作製して、精製した。精製後、試料を濃縮して、最終調製の前に１０，０００分子量カットオフCentramate Tangential Flow Filtration Membrane cassettes（PALL）を用いて緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、２１５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ：６．５）中２０ｍｇ／ｍＬで少なくとも７連続体積の２５ｍＭリン酸ナトリウム、２１５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ：６．５）に対して緩衝液を交換した。その後、サイズ排除クロマトグラフの工程（Sephacryl（登録商標）Ｓ２００、GE Healthcare）を行った。各試料について、２５ｍＬを２つのVivaspin ２０遠心分離濃縮器で等しくなるように分けて、４，５００ｘｇで２０分間、２回遠心分離を行い、合計体積を５ｍＬまで減らした。濃縮された材料を４８３ｍＬのＳ２００カラムに充填して、単量体ピークを集めて、ＳＰＲによるＦｃＲｎ結合分析のために９８％超の単量体タンパク質を生成した。精製後、溶出液を５ｍｇ／ｍＬ（±５％）に希釈した。各変異体のヒトＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性をマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンとの結合前及び結合後に決定した。実施例６に記載したように、変異体を３．２倍の過剰なマレイミド－ＰＥＧ２－ビオチンに結合させた。１５分の分析溶離勾配及び約７～１０分のタンパク質ピークの処理データを用いたことを除き、実施例２に記載したようにＭＳによって結合の百分率を決定した。結果を表２１に示す。この表から、すべての試料はチオール数によって結合の程度が異なっていたことが分かる。
Figure 0007007261000029
Biacore 3000装置（GE Healthcare）を用いてＳＰＲを行った。製造者（GE Healthcare）によって提供される試験規約に記載されているように、アミンカップリング化学を用いてＣＭ５センサーチップのフローセルを可溶性ヒトＦｃＲｎ（１２００－１６００ＲＵ）と結合させた。結合は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ：４．５）に５μｇ／ｍＬのタンパク質を注入して行った（GE Healthcare）。リン酸塩緩衝液（６７ｍＭのリン酸塩緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）（ｐＨ：５．５）を測定用緩衝液及び希釈用緩衝液として用いた。ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）（ｐＨ：７．４）（GE Healthcare）を注入して表面の再生を行った。固定後、チップを静置して、一定の流量（５μＬ／分）の測定用緩衝液で安定化した。測定用緩衝液を３回注入して、その後再生用緩衝液を３回注入して、チップ表面を調整した。これらの表面を、天然配列ＨＳＡ対照による活性について調べた。結合動力学を決定するため、２５℃、一定の流量（３０μＬ／分）でアルブミン変異体の連続希釈液（１０－０μＭ）を固定化された受容体に注いだ。すべての分析で、データをゼロ調整して、基準細胞を減じた。BIAevaluation 4.1ソフトウェア(BIAcore AB)を用いてデータを評価した。結合前及び結合後の結果を表２２及び表２３にそれぞれ示す。
ヒトＦｃＲｎについて選別したチオアルブミン変異体は、可逆性でｐＨに依存する形で受容体に結合していた。
野生型由来のチオアルブミン変異体（すなわち 、アミノ酸の改変のみが、導入によってコンジュゲーション可能なシステイン残基数に影響を及ぼす改変である）は、野生型の対照（配列番号２）に比べて、結合前及び結合後ともＦｃＲｎへの結合親和性が同程度の倍数だけ増加していた。Ｋ５７３Ｐ突然変異（ＦｃＲｎへのアルブミン変異体の親和性を増加させる）をも含むチオアルブミン変異体は、Ｋ５７３Ｐ対照（配列番号１４５）に比べて、結合前及び結合後でＦｃＲｎ親和性の増加を維持していた。これは、コンジュゲーション可能なシステイン残基及び結合相手を変化させてもＦｃＲｎへのアルブミン変異体の結合親和性に及ぼす観察されるような影響はなかったことを示している。
Figure 0007007261000030
Figure 0007007261000031
実施例１１ 改変ＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体の凝集分析
実施例１０で５ｍｇ／ｍＬで調製したチオアルブミン組み合わせ変異体が溶液中に単量体として残る傾向を分析した。実施例１０に記載した通り、また対照として含めた通り、ＷＴ ＨＳＡ、変異体Ｋ５７３Ｐ、及び変異体Ｃ３４Ａ＋Ｌ３０２Ｃを調製した。実施例２の方法と同様に、各変異体の遊離チオール含有量をＴ＝０で決定し、その後、５℃で３ヶ月間保存して、ＤＴＮＢ試薬で処理したタンパク質試料を質量分光分析にかけた。この例では、各変異体試料（８０μＬ）を９２０μＬの緩衝液１（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ：８．０）で希釈した。各変異体試料に、５０μＬの緩衝液２（４ｍｇ／ｍＬのＤＴＮＢ、５００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ：７．０）を加えた。この調製液を少なくとも２５分間周囲温度（２０±５℃）でインキュベートして、ＴＮＢで標識した。インキュベーション後、１５分の分析溶離勾配及びタンパク質ピークの約７～１０分の処理データを用いたことを除き、実施例２に記載した方法により試料を質量分析にかけて、結合後のタンパク質の完全な質量を決定した。結果をまとめて表２４Ａ及び表２４Ｂに示す。ＤＴＮＢインキュベーション時に質量が１９７Ｄａ増加したが、これは試料中のタンパク質に遊離チオール基が１個存在することを示す。３９４Ｄａ及び５９１Ｄａの増加は、それぞれ、２個及び３個の遊離チオール基を示している。すべての試料は、安定性試験の開始時に高濃度の遊離チオールを含んでおり、５℃で３ヶ月間保存後も大部分は高い遊離チオール濃度を維持していた。
Figure 0007007261000032
Figure 0007007261000033
試料を５℃及び４０℃で３ヶ月間保存し、実施例３で記載したようにＧＰＨＰＬＣにより様々な時点で凝集図を決定した。単量体の百分率（丸括弧内）は、各試料について、同じ保存条件下の野生型の対照に対する値として決定した。５℃及び４０℃の結果をそれぞれ、表２５及び表２６に示す。すべての変異体は、Ｔ＝０で９８％超の単量体を有していた。チオアルブミン変異体の大部分は、５℃で３ヶ月保存した後に９７％以上の単量体タンパク質の百分率を維持していた。分析した他の変異体に対して、変異体Ｃ３４Ａ＋Ｌ３０２Ｃはより凝集しやすい傾向を示した。また、大部分のチオアルブミン変異体は、２個または３個のチオール残基を含む場合でも、４０℃で３ヶ月間保存した後に８０％以上の単量体タンパク質の百分率を維持していたことが明らかになった。しかしながら、変異体Ｃ３４Ａ＋Ｌ３０２Ｃは、４０℃で３ヶ月保存後に単量体百分率が７３．２％となり、凝集しやすい傾向を示した。
Figure 0007007261000034
Figure 0007007261000035
実施例１２ 改変ＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体の蛍光プローブとの結合
実施例１０で５ｍｇ／ｍＬで調製し、２～８℃で６週間保存したチオアルブミン組み合わせ変異体を３倍過剰のAlexa Fluor（登録商標）４８８－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素（図９Ａ）又は５－カルボキシフルオレセイン－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素（図１０Ａ）（Almac Group Ltd.、英国、カスタム合成）を用いて結合させた。変異体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で希釈して、１ｍＬの溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１５．０５ｎｍｏｌ）を得た。１．６ｍｇの材料を１．６ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で戻してAlexa Fluor（登録商標）４８８－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素の１ｍｇ／ｍＬ保存液を調製した。このAlexa Fluor（登録商標）４８８－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素保存液から、５１．５μＬ（４５．１５ｎｍｏｌ）を単一のチオール変異体に加え、１０３μＬ（９０．３ｎｍｏｌ）色素保存液を二重チオール変異体に加え、１５４．５μＬ（１３５．３ｎｍｏｌ）色素保存液を三重チオール変異体に加えて、遊離チオール数に対して３倍過剰のAlexa Fluor（登録商標）４８８－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素を供給した。１．７ｍｇの材料を１．７ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び１．７ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で戻して、５－カルボキシフルオレセイン－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素の０．５ｍｇ／ｍＬ保存液を調製した。５－カルボキシフルオレセイン－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素保存液から、４４．３μＬ（４５．１５ｎｍｏｌ）を単一のチオール変異体に加え、８８．６μＬ（９０．３ｎｍｏｌ）の色素保存液を二重チオール変異体に加え、１３２．９μＬ（１３５．３ｎｍｏｌ）の色素保存液を三重チオール変異体に加えて、遊離チオール数に対して３倍過剰の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素を供給した。試料を穏やかに混ぜて、暗所の周囲温度で一晩インキュベートした。インキュベーション後に、１５分の分析溶離勾配及びタンパク質ピークの約７～１０分の処理データを用いたことを除き、実施例２に記載したＭＳ法により試料を質量分析により分析して、結合後のタンパク質の完全な質量を決定した。結果を表２７及び表２８にまとめて示す。
図９Ｂに示す改変ＦｃＲｎ結合変異体Ｋ５７３ＰのＭＳスペクトルは、６７４６８．５Ｄａにある単一種を示しており、Ｋ５７３Ｐ変異体にAlexa Fluor（登録商標）４８８－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素（＋１０５８Ｄａ）を１個付加したものの正しい分子量を示している。このことから、この変異体は、結合に利用可能なＣｙｓ３４に位置する遊離チオールを１個有していることが確認された。図９Ｃに示すチオアルブミン変異体Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐは、結合種のピークの相対的な高さを比較すると、一晩インキュベーションした後に結合が起こり、約４２％のジコンジュゲート種及び５８％のトリコンジュゲート種がそれぞれ得られたことを示している。主ピーク種は約３１７４Ｄａ（３×１０５８Ｄａ）増加して、６９５３６Ｄａとなったことが明らかになった。このことは、この変異体が結合に利用可能な遊離チオールを３個有していたことを示す。
図１０Ｂに示される改変ＦｃＲｎ結合変異体Ｋ５７３ＰのＭＳスペクトルは、６７３１０．６Ｄａにある単一種を示しており、Ｋ５７３Ｐ変異体に単一の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＥＧ４－Ｌｙｓ（モノブロモマレイミド）－ＮＨ２色素（＋９０１Ｄａ）が付加したものの正しい分子量を示している。図１０Ｃに示すチオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐは、結合種のピークの相対的な高さを比べると、一晩インキュベーションした後に結合が起こり、約９％のモノコンジュゲート種及び９１％のジコンジュゲート種が得られたことを示している。主ピーク種は約１８０２Ｄａ（２×９０１Ｄａ）増加して６８１２９．７Ｄａとなったことが明らかになった。これは、この変異体が結合に利用可能な遊離チオールを２個有していたことを示す。
Figure 0007007261000036
Figure 0007007261000037
実施例１３ 改変ＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体のパクリタキセルとの結合
実施例１０で５ｍｇ／ｍＬで調製して、２～８℃で３ヶ月間保存したチオアルブミン組み合わせ変異体を、図１１Ａに示すようにモノブロモマレイミド部位で活性化したエステル基を介して１．５倍過剰のパクリタキセルを用いて結合させ、分子モノブロモマレイミド－パクリタキセル（Almac Group Ltd.、英国、カスタム合成）を得た。変異体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で希釈して、１ｍＬの溶液（１ｍｇ／ｍＬ（１５．０５ｎｍｏｌ）を得た。６．６ｍｇの材料を３．３ｍＬのＤＭＳＯで戻してモノブロモマレイミド－パクリタキセルの２ｍｇ／ｍＬ保存液を調製した。モノブロモマレイミド－パクリタキセル保存液から、１２．２４μＬ（２２．５８ｎｍｏｌ）を単一のチオール変異体に加え、２４．４７μＬ（４５．１５ｎｍｏｌ）の保存液を二重チオール変異体に加え、３６．７１μＬ（６７．７３ｎｍｏｌ）の保存液を三重チオール変異体に加えて、遊離チオール数に対して３倍過剰のモノブロモマレイミド－パクリタキセルを供給した。試料を穏やかに混ぜて、周囲温度で一晩インキュベートした。インキュベーション後、試料を質量分析にかけて、１５分の分析溶離勾配及びタンパク質ピークの約７～１０分の処理データを用いたことを除き、実施例２に記載したＭＳ法により結合後のタンパク質の完全な質量を決定した。結果を表２９にまとめて示す。
図１１Ｂに示す改変ＦｃＲｎ結合変異体Ｋ５７３ＰのＭＳスペクトルは、タンパク質種のピークの相対的な高さを比較すると、一晩インキュベーションした後に結合が起こり、約７７％のモノコンジュゲート種と２３％の非コンジュゲート種がそれぞれ得られたことを示している。６７４１２．２Ｄａにある主ピーク種は約１００４Ｄａ増加したことが明らかになった。これはモノブロモマレイミド－パクリタキセルの単一の付加によるものである。図１１Ｃに示すチオアルブミン変異体Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３ＰのＭＳスペクトルは、結合種のピークの相対的な高さを比較すると、一晩インキュベーションした後に結合が起こり、約６％のモノコンジュゲート種、約６０％のジコンジュゲート種、及び３０％のトリコンジュゲート種がそれぞれ得られたことを示している。主ピーク種は約２００８Ｄａ（２×１００４Ｄａ）増加して、６８３６４．２Ｄａになったことが明らかになった。また６９３８３．７Ｄａの種は、３０１２Ｄａの三重付加を示している。
Figure 0007007261000038
実施例１４ 改変ＦｃＲｎ結合を有する組み合わせ変異体のエキセナチドペプチドとの結合
実施例１０で５ｍｇ／ｍＬで調製して２～８℃で３ヶ月間保存した組み合わせ変異体を、図１２Ａに示す１．５倍過剰のモノブロモマレイミド－ＰＥＧ２－エキセナチドペプチド（Almac Group Ltd.、英国、カスタム合成）を用いて結合させた。変異体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で希釈して、１ｍＬの溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１５．０５ｎｍｏｌ）を得た。５ｍｇの材料を１ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で戻してモノブロモマレイミド－ＰＥＧ２－エキセナチドペプチドの５ｍｇ／ｍＬ保存液を調製した。モノブロモマレイミド－ＰＥＧ２－エキセナチドペプチド保存液から、２１．１７μＬ（２２．５８ｎｍｏｌ）を単一のチオール変異体に加え、４２．３５μＬ（４５．１５ｎｍｏｌ）のペプチド保存液を二重チオール変異体に加え、６３．５２μＬ（６７．７３ｎｍｏｌ）のペプチド保存液を三重チオール変異体に加えて、遊離チオール数に対して３倍過剰のモノブロモマレイミド－ＰＥＧ２－エキセナチドペプチドを供給した。試料を穏やかに混ぜて、周囲温度で一晩インキュベートした。インキュベーション後、試料を質量分析にかけて、１５分の分析溶離勾配及びタンパク質ピークの約７～１０分の処理データを用いたことを除き、実施例２に記載したＭＳ法により結合後のタンパク質の完全な質量を決定した。結果を表３０にまとめて示す。
図１２Ｂに示す改変ＦｃＲｎ結合変異体Ｋ５７３ＰのＭＳスペクトルは、一晩インキュベーションした後に結合が起こり、タンパク質種のピークの相対的な高さを比べて、約３３％のモノコンジュゲート種及び６７％の非コンジュゲート種がそれぞれ得られたことを示している。６６４０９．２Ｄａにある主ピーク種は非コンジュゲートＫ５７３Ｐ変異体であることが明らかになった。第二の種は、モノブロモマレイミド－ＰＥＧ２－エキセナチドペプチドの単一の付加により約４６０９Ｄａ増加した。図１２Ｃに示すチオアルブミン変異体Ｃ３４Ａ＋Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３Ｐは、一晩インキュベーションした後に結合が起り、タンパク質種のピークの相対的な高さを比べて約３３％のジコンジュゲート種、約４５％のモノコンジュゲート種、及び約２２％の非コンジュゲート種がそれぞれ得られたことを示している。主ピーク種は約４６０９Ｄａ増加して７０９４１．７Ｄａになったことが明らかになった。また、７５５５７．３Ｄａの種は、モノブロモマレイミド－ＰＥＧ２－エキセナチドペプチドの二重結合を表す９２１８Ｄａの付加を示していた。
Figure 0007007261000039
実施例１５改変ＦｃＲｎ結合親和性を有する組み合わせ変異体のＦＬＡＧペプチドとの結合
実施例１０で５ｍｇ／ｍＬで調製して２～８℃で３ヶ月間保存したチオアルブミン組み合わせ変異体を図１３Ａに示す１．５倍過剰のマレイミド－プロピル－ＦＬＡＧペプチド（Peptide Protein Research Ltd.、英国、カスタム合成）を用いて結合させた。変異体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で希釈して、１ｍＬの溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１５．０５ｎｍｏｌ）を得た。５．４ｍｇの材料を５．４ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）で戻してマレイミド－プロピル－ＦＬＡＧペプチドの１ｍｇ／ｍＬ保存液を調製した。マレイミド－プロピル－ＦＬＡＧペプチド保存液から、２６．２８μＬ（２２．５８ｎｍｏｌ）を単一のチオール変異体に加え、５２．５６μＬ（４５．１５ｎｍｏｌ）のペプチド保存液を二重チオール変異体に加え、７８．８４μＬ（６７．７３ｎｍｏｌ）のペプチド保存液を三重チオール変異体に加えて、遊離チオール数に対して３倍過剰のマレイミド－プロピル－ＦＬＡＧペプチドを供給した。試料を穏やかに混ぜて、周囲温度で一晩インキュベートした。インキュベーション後、試料を質量分析にかけて、１５分の分析溶離勾配及びタンパク質ピークの約７～１０分の処理データを用いたことを除き、実施例２に記載したＭＳ法により結合後のタンパク質の完全な質量を決定した。結果を表３１にまとめて示す。
図１３Ｂに示す改変ＦｃＲｎ結合変異体Ｋ５７３ＰのＭＳスペクトルは、一晩インキュベーションした後に結合が起こり、タンパク質種のピークの相対的な高さを比べて約２９％のモノコンジュゲート種及び７１％の非コンジュゲート種がそれぞれ得られたことを示している。６６４０９．１Ｄａにある主ピーク種は非コンジュゲートＫ５７３Ｐ変異体であることを明らかになった。次に多いピーク種は、マレイミド－プロピル－ＦＬＡＧペプチドの単一の付加により約１１６４Ｄａ増加していた。図１３Ｃに示すチオアルブミン変異体Ｋ９３Ｃ＋Ｅ２９４Ｃ＋Ｋ５７３ＰのＭＳスペクトルは、一晩インキュベーションした後に結合が起こり、タンパク質種のピークの相対的な高さを比べて約２９％のトリコンジュゲート種、約５０％のジコンジュゲート種、約２０％のモノコンジュゲート種、及び約２％の非コンジュゲート種がそれぞれ得られたことを示している。主ピーク種は約２３２８Ｄａ増加して６８６８５．５Ｄａになったことが明らかになった。また、６９８５０．５Ｄａの種は、マレイミド－プロピル－ＦＬＡＧペプチドの三重結合を表す３４９２Ｄａの 付加を示している。
Figure 0007007261000040
実施例１６ EpiScreen（商標）経時変化Ｔ細胞アッセイを用いたチオアルブミン変異体の免疫原性評価
野生型アルブミン対照（配列番号２）と共に、実施例１０に記載したようにチオアルブミン変異体Ｋ９３Ｃ（配列番号１４２）及びＥ２９４Ｃ（配列番号１４３）を調製した。実施例１０に比べて、サイズ排除クロマトグラフの溶出液を４ｍｇ／ｍＬ（±５％）に希釈した。EpiScreen（商標）経時変化Ｔ細胞アッセイ（Abzena, Cambridge、英国）を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導する能力にすいてアルブミン試験試料を評価した。つまり、EpiScreen（商標）アッセイを以下のように行った。欧州集団及び北米集団（ＨＬＡアロタイプに基づく）を表す５０人の健康な提供者の集団由来の末梢血単核球を試験試料と共にインキュベートした。増殖アッセイ（［３Ｈ］－チミジンの取り込み）及びサイトカイン分泌アッセイ（ＩＬ－２ ＥＬＩＳｐｏｔ）を用いてＴ細胞応答を測定した。
増殖アッセイの肯定的応答の頻度はすべての試料で低く（０％～８％の範囲）、ＩＬ－２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでは肯定的応答は観察されなかった。このことは、３種の試料すべてで臨床免疫原性の危険性が低いことを暗示している。

Claims (55)

  1. ヒトアルブミン（配列番号２）に対して９０％以上同一のアミノ酸配列を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチド、又はその断片であって、
    配列番号２のＫ９３、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ２９４、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｑ２６８、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｋ３５９、Ａ３６２、及びＥ３８２から選択される位置に等しい１又は２以上の位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含み、
    コンジュゲーション可能なポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の７０％以上である、コンジュゲーション可能なポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドが、
    配列番号２の残基Ｋ９３、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ２９４、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｑ２６８、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｋ３５９、Ａ３６２、及びＥ３８２の何れかに等しい位置に対応する位置における、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換；及び／又は
    配列番号２の残基Ｋ９３、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ２９４、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｑ２６８、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｋ３５９、Ａ３６２、及びＥ３８２の何れかに等しい位置に対応するアミノ酸のＮ又はＣ側に隣接する位置における、システインの挿入
    のうち１又は２以上を含む、請求項１に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  3. 配列番号２のＫ９３、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ２９４、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｑ２６８、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｋ３５９、Ａ３６２、及びＥ３８２から選択される位置に等しい２、３、４、５又はそれ以上の位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含む、請求項１又は２に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  4. 前記ポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％である、請求項１～３の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  5. 配列番号２の位置３４に等しい位置に、コンジュゲーション可能なシステインが存在する、請求項１～４の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  6. 配列番号２の位置３４に等しい位置に、コンジュゲーション可能なシステインが存在しない、請求項１～４の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドが、２又はそれ以上のコンジュゲーション可能なシステイン残基を含むと共に、前記ポリペプチドが折り畳まれた場合に、前記のコンジュゲーション可能なシステイン残基のうち２つ以上の間に５Å以上の距離が存在する、請求項１～６の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチドが、配列番号２の残基Ｋ９３又はＥ２９４に等しい位置に対応する位置の一方又は両方に、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換を含む、請求項１～７の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  9. 前記ポリペプチドが、９５％以上のコンジュゲーション効率で、マレイミド－ポリエチレングリコール２－ビオチンとコンジュゲートを形成する能力を有する、請求項１～８の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  10. 前記マレイミド－ポリエチレングリコール２－ビオチンと形成されるコンジュゲートが、制御下の加水分解に対して９５％以上安定である、請求項９に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  11. ヒトアルブミン（配列番号２）に対して９０％以上同一のアミノ酸配列を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチド、又はその断片であって、
    配列番号２のＫ９３、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ２９４、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｑ２６８、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｋ３５９、Ａ３６２、及びＥ３８２から選択される位置に等しい１又は２以上の位置に、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含むと共に、
    配列番号２と比較して１又は２以上の更なる修飾を含む、コンジュゲーション可能なポリペプチド。
  12. 前記１又は２以上の更なる修飾が、請求項１、２、３、又は８に記載の１又は２以上の更なるコンジュゲーション可能なシステインを付加する修飾、前記ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性を変更する修飾、及び、前記ポリペプチドの血漿中半減期を変更する修飾から選択される１又は２以上の修飾である、請求項１１に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  13. 配列番号２のＤ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８から選択される位置に等しい１又は２以上の位置に、コンジュゲーション可能なシステインを含む、請求項１～１２の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  14. 前記ポリペプチドが、
    配列番号２の残基Ｄ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８の何れかに等しい位置に対応する位置における、システイン以外のアミノ酸からシステインへの置換；及び／又は
    配列番号２の残基Ｄ１、Ａ２、Ｈ３、Ｓ５、Ａ５５、Ｓ５８、Ｃ７５、Ｔ７６、Ｔ７９、Ｅ８２、Ｔ８３、Ｅ８６、Ｃ９１、Ｄ１２１、Ｖ１２２、Ｃ１２４、Ｔ１２５、Ｄ１２９、Ｃ１６９、Ｃ１７７、Ａ２２９、Ｔ２３６、Ｅ２６６、Ｄ２６９、Ｓ２７０、Ｓ２７３、Ｓ３０４、Ｋ３１３、Ｄ３１４、Ｃ３１６、Ｎ３１８、Ａ３２０、Ｃ３６１、Ａ３６４、Ｃ３６９、Ａ３７１、Ｎ３８６、Ｑ３９０、Ｑ３９７、Ｓ４３５、Ｔ４７８、Ｔ４９６、Ａ５０４、Ｅ５０５、Ｔ５０６、Ｔ５０８、Ｄ５４９、Ｃ５５８、Ｄ５６２、Ｃ５６７、Ａ５８１、Ｌ５８５、及びＡ５７８の何れかに等しい位置に対応するアミノ酸のＮ又はＣ側に隣接する位置へのシステインの挿入；及び／又は
    配列番号２のＣ３６９、Ｃ３６１、Ｃ９１、Ｃ１７７、Ｃ５６７、Ｃ３１６、Ｃ７５、Ｃ１６９、Ｃ１２４、及びＣ５５８のうち何れかにコンジュゲーション可能なシステインを生成するような、配列番号２のＣ３６０、Ｃ３１６、Ｃ７５、Ｃ１６８、Ｃ５５８、Ｃ３６１、Ｃ９１、Ｃ１２４、Ｃ１６９、及びＣ５６７のうち何れかに対応する位置におけるシステインの欠失又は置換；及び／又は
    アルブミン配列のＮ末端残基のＮ側又はアルブミン配列のＣ末端残基のＣ側へのシステインの付加
    のうち１又は２以上を含む、請求項１～１３の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  15. 前記ポリペプチドが、
    （ａ）Ａ２＋Ｌ５８５；（ｂ）Ａ２＋Ａ３６４＋Ｄ５６２＋Ｌ５８５Ｃ；（ｃ）Ａ２及びアルブミンのＣ末端のＣ側に隣接する位置；（ｄ）Ｔ７９＋Ａ３６４；（ｅ）Ａ３６４＋Ｄ１；（ｆ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４；（ｇ）Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｄ１；（ｈ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ａ５０４；（ｉ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｌ５８５；（ｊ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｄ１；（ｋ）Ｔ７９＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ｌ５８５＋Ｄ１；（ｌ）Ｅ８６＋Ｄ５６２＋Ａ３６４＋Ａ５０４＋Ａ２；（ｍ）Ｓ２７０＋Ａ５８１；（ｎ）Ｓ２７０＋Ｄ１２９；（ｏ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２；（ｐ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｄ１２９；（ｑ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２＋Ｄ１２９；（ｒ）Ｓ２７０＋Ａ５８１＋Ｅ８２＋Ｄ１２９＋Ｑ３９７；（ｓ）Ｃ３６９＋Ｃ１７７；（ｔ）Ａ３６４＋Ａ５８１；（ｕ）Ｔ７９＋Ａ３６４＋Ａ５８１；（ｖ）Ａ３６４＋Ａ５８１＋Ｄ１２９；（ｗ）Ａ３６４＋Ｃ１７７；（ｘ）Ｄ５６２＋Ｃ３６９；（ｙ）Ｄ１２９＋Ｃ３６９；（ｚ）Ａ５８１＋Ｃ３６９；又は（ａａ）Ｄ５６２＋Ｄ１２９＋Ｃ３６９
    の位置に、コンジュゲーション可能なシステインを含む、請求項１～１４の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  16. 前記ポリペプチドが、アルブミンドメインIII又はその変異体と、１又は２以上の更なるアルブミンドメイン又はその断片とを含むか、或いはこれらからなる、請求項１～１５の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  17. 前記１又は２以上の更なるアルブミンドメイン又はその断片が、第二のアルブミンドメインIII又はその変異体である、請求項１６に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  18. 前記ポリペプチドが、１又は２以上のアルブミンドメインIII又は変異体又はその断片を含むか、或いはこれらからなると共に、前記１又は２以上のアルブミンドメインIIIが、配列番号２の５７３、５００、５５０、４１７、４４０、４６４、４９０、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９９、５０１、５０３、５０４、５０５、５０６、５１０、５３５、５３６、５３７、５３８、５４０、５４１、５４２、５７４、５７５、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、及び５８４から選択される位置に対応する位置に、１又は２以上の置換を含む、請求項１～１６の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  19. 配列番号２の前記位置に対応する位置における１又は２以上の置換が、Ｋ５７３Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｍ、Ｃ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｌ、Ｄ、Ｋ５００Ｅ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｎ、Ｗ、Ｔ、Ｍ、Ｙ、Ｖ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｑ４１７Ａ、Ｈ４４０Ａ、Ｈ４６４Ｑ、Ｅ４９２Ｇ、Ｄ４９４Ｎ，Ｑ，Ａ、Ｅ４９５Ｑ，Ａ、Ｔ４９６Ａ、Ｄ４９４Ｅ＋Ｑ４１７Ｈ、Ｄ４９４Ｎ＋Ｔ４９６Ａ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｖ４９３Ｐ、Ｐ４９９Ａ、Ｅ５０１Ａ，Ｑ、Ｎ５０３Ｈ，Ｋ、Ｈ５１０Ｑ、Ｈ５３５Ｑ、Ｋ５３６Ａ、Ｐ５３７Ａ、Ｋ５３８Ａ、Ｋ５４１Ｇ，Ｄ、Ｄ５５０Ｅ，Ｎ、Ｅ４９２Ｇ＋Ｋ５７３Ｐ，Ａ、又はＥ４９２Ｇ／Ｎ５０３Ｈ／Ｋ５７３Ｐから選択される、請求項１８に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  20. 前記ポリペプチドが、配列番号２の位置（ａ）４９２及び５８０；（ｂ）４９２及び５７４；（ｃ）４９２及び５５０；（ｄ）５５０及び５７３；（ｅ）５５０及び５７４；並びに（ｆ）５５０及び５８０に対応する位置から選択される２以上の位置に改変を含む、請求項１～１９の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  21. 前記ポリペプチドが、（ｉ）第一のアルブミンを含むＮ末端領域と、（ii）第二のアルブミンのＣ末端領域とを含み、
    （ｉ）前記Ｎ末端領域の第一のアルブミンはヒトアルブミン変異体であり、ここで前記第一のアルブミンのＮ末端は、前記ヒトアルブミン変異体のＣ末端の２～３０アミノ酸を除く全アミノ酸を含み、
    （ii）前記第二のアルブミンのＣ末端領域は、マカクザルアルブミン、マウスアルブミン、ウサギアルブミン、ヒツジアルブミン、ヒトアルブミン、ヤギアルブミン、チンパンジーアルブミン、ハムスターアルブミン、モルモットアルブミン、ラットアルブミン、ウシアルブミン、ウマアルブミン、ロバアルブミン、イヌアルブミン、ニワトリアルブミン、又はブタアルブミン、又はその変異体から選択され、ここで前記第二のアルブミン又はアルブミン変異体のＣ末端は、前記第二のアルブミン又はアルブミン変異体のＣ末端の２～３０アミノ酸を含み、
    ここで前記ポリペプチドは、（ｉ）前記ヒトアルブミン変異体と比較して改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）前記ヒトアルブミン変異体と比較して改変されたＦｃＲｎへの結合親和性を有する、請求項１～１８の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  22. 前記ポリペプチドは、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列のドメインＩ内に、１又は２以上の改変を含むと共に、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列のドメインIII内に、１又は２以上の改変を含み、ここで前記１又は２以上の改変が、前記ポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合親和性が改変される、請求項１～２１の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  23. 前記のドメインＩにおける改変が、配列番号２の位置７８～１２０の何れかに対応する位置から、或いは、位置７８～８８及び／又は１０５～１２０の何れかから選択されると共に、前記のドメインIIIにおける改変が、配列番号２の位置４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、及び５７５の何れかに対応する位置から選択される、請求項２２に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  24. 前記の配列番号２の位置７８～１２０又は４２５、５０５、５１０、５１２、５２４、５２７、５３１、５３４、５６９、５７３、及び／又は５７５の何れかに対応する位置の改変が、（ｉ）８３Ｎ、Ｋ又はＳ；（ii）１１１Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｑ又はＥ；又は（iii）５７３Ｐ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、Ｉ又はＶから選択される置換である、請求項２３に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  25. 前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列のドメインII内に、配列番号２の位置３４９、３４２、３８１、３４５、３８４、１９８、２０６、３４０、３４１、３４３、３４４、３５２、３８２、３４８、及び／又は、３８３に対応する位置からなる群より選択される位置に、１又は２以上の改変を含み、ここで前記１又は２以上の改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する、請求項１～２４の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  26. 前記の位置３４９、３４２、３８１、３４５、３８４、１９８、２０６、３４０、３４１、３４３、３４４、３５２、３８２、３４８、及び／又は、３８３に対応する位置における改変が、（ｉ）３４９Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ｐ、Ｋ又はＱ；（ii）３４２Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｖ；（iii）３８１Ｇ又はＡ；又は（iv）３４５Ｅ、Ｈ、Ｉ又はＱから選択される置換である、請求項２５に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  27. 前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、配列番号２の位置Ｖ４１８、Ｔ４２０、Ｖ４２４、Ｅ５０５、Ｖ５４７、Ｋ５７３に対応する位置からなる群より選択される、１又は２以上の改変を含み、ここで前記１又は２以上の改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する、請求項１～２６の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  28. 前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、配列番号２の位置Ｖ３８１；Ｅ３８３；Ｎ３９１；Ｙ４０１；Ｋ４０２；Ｌ４０７；Ｙ４１１；Ｋ４１３；Ｋ４１４；Ｖ４１５Ｃ；Ｑ４１６；Ｖ４２４；Ｖ４２６Ｄ；Ｇ４３４；Ｅ４４２；Ｒ４４５；Ｐ４４７；Ｅ４５０；Ｓ４５４；Ｖ４５５；Ｖ４５６；Ｌ４５７；Ｑ４５９；Ｌ４６３；Ｅ４９５；Ｔ５０６；Ｔ５０８；Ｆ５０９；Ａ５１１；Ｄ５１２；Ｔ５１５；Ｌ５１６；Ｓ５１７；Ｋ５１９；Ｒ５２１；Ｉ５２３；Ｋ５２４；Ｋ５２５；Ｑ５２６；Ｔ５２７；Ｅ５３１；Ｈ５３５；Ｋ５３８；Ａ５３９；Ｋ５４１；Ｋ５５７；Ａ５６１；Ｔ５６６；Ａ５６９に対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の改変を含み、ここで前記１又は２以上の改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する、請求項１～２７の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  29. 前記１又は２以上の改変が、配列番号２のＶ３８１Ｎ又はＱ；Ｅ３８３Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｎ３９１Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｙ４０Ｙ４０１Ｄ又はＥ；Ｋ４０２Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｌ４０７Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、又はＹ；Ｙ４１１Ｑ、又はＮ；Ｋ４１３Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｋ４１４Ｓ又はＴ；Ｖ４１５Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｑ４１６Ｈ又はＰ；Ｖ４２４Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、又はＱ；Ｖ４２６Ｄ、Ｅ、Ｈ、又はＰ；Ｇ４３４Ｃ、Ｓ、又はＴ；Ｅ４４２Ｋ又はＲ；Ｒ４４５Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｐ４４７Ｓ又はＴ；Ｅ４５０Ｄ又はＥ；Ｓ４５４Ｃ、Ｍ又はＴ；Ｖ４５５Ｎ又はＱ；Ｖ４５６Ｎ又はＱ；Ｌ４５７Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｑ４５９Ｋ又はＲ；Ｌ４６３Ｎ又はＱ；Ｅ４９５Ｄ；Ｔ５０６Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５０８Ｋ、Ｒ、又はＳ；Ｆ５０９Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ又はＹ；Ａ５１１Ｆ、Ｗ、又はＹ；Ｄ５１２Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５１５Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｑ又はＳ；Ｌ５１６Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；Ｓ５１７Ｃ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｗ又はＹ；Ｋ５１９Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、又はＶ；Ｒ５２１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｉ５２３Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ又はＹ；Ｋ５２４Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｋ５２５Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｑ５２６Ｃ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＹ；Ｔ５２７Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｅ５３１Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｈ５３５Ｄ、Ｅ又はＰ；Ｋ５３８Ｆ、Ｗ又はＹ；Ａ５３９Ｉ、Ｌ又はＶ；Ｋ５４１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｋ５５７Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＶ；Ａ５６１Ｆ、Ｗ又はＹ；Ｔ５６６Ｆ、Ｗ又はＹ；Ａ５６９Ｈ又はＰからなる群より選択される１又は２以上の改変である、請求項２８に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  30. 前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、配列番号２の位置Ｖ５４７；Ｋ５７３；Ｉ５２３；Ｔ５２７；Ｋ５００；又はＥ５０５に対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の改変を含み、ここで前記１又は２以上の改変が、前記コンジュゲーション可能なポリペプチドに、（ｉ）改変された血漿中半減期、及び／又は、（ii）改変されたＦｃＲｎに対する結合親和性を付与する、請求項１～２９の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  31. 前記１又は２以上の改変が、配列番号２のＶ４５７Ａ；Ｋ５７３Ｐ又はＹ；Ｉ５２３Ａ又はＧ；Ｔ５２７Ｍ；Ｋ５００Ａ；又はＥ５０５Ｑからなる群より選択される１又は２以上の改変である、請求項３０に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  32. 前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、配列番号２の位置５７３、５２３、５２７又は５０５に対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の改変を含む、請求項１～３１の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  33. 前記１又は２以上の改変が、配列番号２のＫ５７３Ｙ；Ｉ５２３Ｇ；Ｉ５２３Ａ；Ｔ５２７Ｍ；Ｅ５０５Ｑ；又はＫ５７３Ｐからなる群より選択される１又は２以上の改変である、請求項３２に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  34. 前記ポリペプチドが、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列内に、位置Ｋ５７３Ｙ及びＩ５２３Ｇ；Ｋ５７３Ｙ、Ｉ５２３Ｇ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｙ、Ｅ５０５Ｑ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｙ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ及びＩ５２３Ｇ；Ｋ５７３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ、Ｅ５０５Ｑ及びＴ５２７Ｍ；Ｋ５７３Ｐ及びＴ５２７Ｍ；Ｖ５４７Ａ；Ｖ５４７Ａ及びＫ５７３Ｐ；Ｖ５４７Ａ、Ｅ５０５Ｑ、Ｋ５７３Ｐ及びＴ５２７Ｍ；又はＫ５００Ａ及びＨ５１０Ｑに対応する位置からなる群より選択される１又は２以上の改変を含む、請求項３２又は３３に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  35. 前記コンジュゲーション可能なポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向が、配列番号２のポリペプチドが溶液中で単量体として存在する傾向の７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％、９５％以上、又は１００％である、請求項１１～３４の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  36. 前記ポリペプチドが、配列番号２に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、又は９９．８％以上の配列同一性を有する、請求項１～３５の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  37. 前記ポリペプチドが折り畳まれた場合に、配列番号２のポリペプチドの天然のジスルフィド結合のうち１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、又は１７個全てが存在する、請求項１～３６の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  38. 前記ポリペプチドが更なるリンカーを更に含み、当該リンカーには生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤が結合していてもよい、請求項１～３７の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  39. 前記のコンジュゲーション可能なシステイン残基を付与する改変が、ヒトにおける前記ポリペプチドの免疫原性に悪影響を及ぼさない、請求項１～３８の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチド。
  40. 請求項１～３９の何れか一項に記載のコンジュゲーション可能なポリペプチドと、融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチド。
  41. 請求項１～３９の何れか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  42. 請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
  43. 請求項４１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は、請求項４２に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
  44. 酵母細胞、又は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
  45. （ｉ）生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤と、（ii）請求項１～４１の何れか一項に記載のポリペプチドとを含むコンジュゲートであって、前記の生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤が、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、前記ポリペプチドに連結されてなる、コンジュゲート。
  46. 前記コンジュゲートが更に、１又は２以上の更なる生物活性化合物、放射性医薬、又は画像化剤を含み、各生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤は、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、前記ポリペプチドに連結されてなる、請求項４５に記載のコンジュゲート。
  47. 請求項４１に記載のポリヌクレオチドを製造する方法であって、
    親アルブミン又はその断片をコードする核酸分子を提供し、
    前記核酸分子の核酸配列を、配列番号２の成熟ヒトアルブミンポリペプチド配列の残基１～５８５、又はその断片と９０％以上同一なコンジュゲーション可能なポリペプチドをコードするように改変することを含み、
    ここで配列番号２のＫ９３、Ｅ２３０、Ｉ２７１、Ｅ２９４、Ｅ３５８、Ｌ２４、Ｆ４９、Ｖ５４、Ｄ５６、Ｆ１５６、Ｅ２２７、Ｄ２３７、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｑ２６８、Ｋ３１７、Ａ３２２、Ｅ３３３、Ｋ３５９、Ａ３６２、及びＥ３８２から選択される位置に等しい１又は２以上の位置が、コンジュゲーション可能なシステイン残基を含む、方法。
  48. 請求項１～４０の何れか一項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
    （ａ）請求項４３又は４４に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で培養し、
    （ｂ）前記ポリペプチドを、前記宿主細胞、及び／又は、宿主細胞の成長培地から回収することを含む方法。
  49. 工程（ｂ）で得られたポリペプチドを更に精製することを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 請求項４５又は４６に記載のコンジュゲートを製造する方法であって、請求項１～４０の何れか一項に記載のポリペプチド、又は請求項４８又は４９に記載の方法により製造されたポリペプチドを、前記ポリペプチドのコンジュゲーション可能なシステイン残基を介して、生物活性化合物、放射性医薬又は画像化剤と連結することを含む方法。
  51. 請求項４５又は４６に記載のコンジュゲートと、生物活性、治療、予防、診断、画像化、又は他の有用な部分とを含むアソシエイト。
  52. 請求項１～４０の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項４５又は４６に記載のコンジュゲート、又は請求項５１に記載のアソシエイトを含む、ナノ粒子又はマイクロ粒子又はリポソーム。
  53. 請求項４５又は４６に記載のコンジュゲート、請求項５１に記載のアソシエイト、又は、請求項５２に記載のナノ粒子又はマイクロ粒子又はリポソームと１又は２以上の医薬的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む組成物。
  54. 前記の生物活性分子、放射性医薬、又は画像化剤が、
    （i）次から選択される治療用化合物：４－１ＢＢリガンド、５－ヘリックス、ヒトＣ－Ｃケモカイン、ヒトＬ１０５ケモカイン、ヒトＬ１０５ケモカインであるｈｕＬ１０５＿３、γ－インターフェロンによって誘導されたモノカイン（ＭＩＧ）、部分ＣＸＣＲ４Ｂタンパク質、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、α１－抗トリプシン、ＡＣＲＰ－３０ホモログ、補体成分Ｃ１ｑ Ｃ、アデノイド発現ケモカイン（ＡＤＥＣ）、酸性線維芽細胞成長因子（acidic fibroblast growth factor：ａＦＧＦ）、線維芽細胞成長因子１（fibroblast growth factor：ＦＧＦ－１）、アンジオポエイチン成長因子（angiopoeitin growth factor：ＡＧＦ）、ＡＧＦタンパク質、アルブミン、エトポシド、アンジオスタチン、炭疽菌ワクチン、コラプシン特異抗体、アンチスタシン、抗ＴＧＦβ族抗体、抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＭ－１、ＡＣＲＰ－３０、ファモキシン、アポリポタンパク質種、アリールスルファターゼＢ、ｂ５７タンパク質、ＢＣＭＡ、β－トロンボグロブリンタンパク質（β－ＴＧ）、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、血液凝固因子、骨形態形成タンパク質（bone morphogenetic protein：ＢＭＰ）プロセシング酵素フーリン（Furin）、ＢＭＰ－１０、ＢＭＰ－１２、ＢＭＰ－１５、ＢＭＰ－１７、ＢＭＰ－１８、ＢＭＰ－２Ｂ、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、骨形態形成タンパク質－２、カルシトニン、カルパイン－１０ａ、カルパイン－１０ｂ、カルパイン－１０ｃ、ガンワクチン、カルボキシペプチダーゼ、Ｃ－Ｃケモカイン、ＭＣＰ２、ＣＣＲ５変異体、ＣＣＲ７、ＣＣＲ７、ＣＤ１１ａモノクローナル抗体（monoclonal antibody: Ｍａｂ）、ＣＤ１３７、４－１ＢＢ受容体タンパク質、ＣＤ２０Ｍａｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ３３免疫毒素、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２Ｍａｂ、ケルベロス（Cerebus）タンパク質、ケモカインエオタキシン、ケモカインｈＩＬ－８、ケモカインｈＭＣＰ１、ケモカインｈＭＣＰ１ａ、ケモカインｈＭＣＰ１ｂ、ケモカインｈＭＣＰ２、ケモカインｈＭＣＰ３、ケモカインｈＳＤＦ１ｂ、ケモカインＭＣＰ－４、ケモカインＴＥＣＫ及びＴＥＣＫ変異体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ１全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ１０全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ３、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ８全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＩＬ－８Ｍ９全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＰＦ４－４１４全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＰＦ４－４２６全長及び成熟体、ケモカイン様タンパク質ＰＦ４－Ｍ２全長及び成熟体、コレラワクチン、コンドロモジュリン様タンパク質、ｃ－ｋｉｔリガンド、ＳＣＦ、マスト細胞増殖因子、ＭＧＦ、線維肉腫由来幹細胞因子、ＣＮＴＦ及びその断片、ＣＮＴＦＡｘ１５｀（Ａｘｏｋｉｎｅ(商標)））、凝固因子（前駆体及び活性体）、コラーゲン、補体Ｃ５Ｍａｂ、結合組織活性化タンパク質－ＩＩＩ、ＣＴＡＡ１６．８８Ｍａｂ、ＣＴＡＰ－ＩＩＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＴＬＡ－８、ＣＸＣ３、ＣＸＣケモカイン受容体３、シアノビリン－Ｎ、ダルベポエチン(エクソダス（exodus）、ｈｕＬ１０５＿７ともいう)、ＤＩＬ－４０、デオキシリボヌクレアーゼ、エクトジスプラシンＡ受容体（ectodysplastin A receptor：ＥＤＡＲ）、上皮成長因子（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦ）受容体Ｍａｂ、ＥＮＡ－７８、エンドスタチン、エオタキシン、上皮好中球活性化タンパク質－７８、エリトロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ＥＰＯＲ、エリトロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣物、ユートロピン（Eutropin）、エクソダス（Exodus）タンパク質、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、及び第ＸＩＩＩ因子、ＦＡＳリガンド阻害タンパク質（ＤｃＲ３）、ＦａｓＬ、ＦＧＦ、ＦＧＦ－１２、線維芽細胞増殖因子相同因子（ＦＧＦ）－１、ＦＧＦ－１５、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－３、ＩＮＴ－２、ＦＧＦ－４、ゲロニン、ＨＳＴ－１、ＨＢＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ヘパリン結合性分泌形質転換因子－２、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、グリア活性化因子、フィブリノゲン、ｆｌｔ－１、ｆｌｔ－３リガンド、卵胞刺激ホルモンαサブユニット、卵胞刺激ホルモンβサブユニット、フォリトロピン、フラクタルカイン、断片筋原線維タンパク質トロポニンI、卵胞刺激ホルモン（follicle stimulating hormone：ＦＳＨ）、ガラクトシダーゼ、ガレクチン－４、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor：Ｇ－ＣＳＦ）、ＧＤＦ－１、遺伝子治療、グリオーマ由来増殖因子、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、グルコセレブロシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコデリン－Ａ、プロゲステロン関連子宮内膜タンパク質、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte/macrophage-colony stimulating factor：ＧＭ－ＣＳＦ）、ゴナドトロピン、顆粒球走化性タンパク質－２（granulocyte chemotactic protein-2：ＧＣＰ－２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長ホルモン、増殖関連オンコジーン－α（Growth related oncogene-alpha：ＧＲＯ－α）、増殖関連オンコジーン－β（ＧＲＯ－β）、増殖関連オンコジーン－γ（GRO-γ）、ヒトアポリポタンパク質（human apolipoprotein-4：hAPO-4）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１９：ＴＲＯＹ（tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（human chronionic gonadotropin：ｈＣＧ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ワクチン、ＨＥＲ２受容体Ｍａｂ、ヒルジン、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶ阻害ペプチド、ＨＩＶプロテアーゼ阻害ペプチド、ＨＩＶ－１プロテアーゼ阻害剤、ＨＰＶワクチン、ヒト６ＣＫｉｎｅタンパク質、ヒトＡｃｔ－２タンパク質、ヒト脂質生成阻害因子、ヒトＢ細胞刺激因子－２受容体、ヒトβ－ケモカインＨ１３０５（ＭＣＰ－２）、ヒトＣ－ＣケモカインＤＧＷＣＣ、ヒトＣＣケモカインＥＬＣタンパク質、ヒトＣＣ型ケモカインインターロイキンＣ、ヒトＣＣＣ３タンパク質、ヒトＣＣＦ１８ケモカイン、ヒトＣＣ型ケモカインタンパク質である二次リンパケモカイン（secondary lymphoid chemokine：ＳＬＣ）、ヒトケモカインβ－８短小型、ヒトケモカインＣ１０、ヒトケモカインＣＣ－２、ヒトケモカインＣＣ－３、ヒトケモカインＣＣＲ－２、ヒトケモカインＣｋβ－７、ヒトケモカインＥＮＡ－７８、ヒトケモカインエオタキシン、ヒトケモカインＧＲＯα、ヒトケモカインＧＲＯα、ヒトケモカインＧＲＯβ、ヒトケモカインＨＣＣ－１、ヒトケモカインＨＣＣ－１、ヒトケモカインＩ－３０９、ヒトケモカインＩＰ－１０、ヒトケモカインＬ１０５＿３、ヒトケモカインＬ１０５＿７、ヒトケモカインＭＩＧ、ヒトケモカインＭＩＧ－βタンパク質、ヒトケモカインＭＩＰ－１α、ヒトケモカインＭＩＰ１β、ヒトケモカインＭＩＰ－３α、ヒトケモカインＭＩＰ－３β、ヒトケモカインＰＦ４、ヒトケモカインタンパク質３３１Ｄ５、ヒトケモカインタンパク質６１１６４、ヒトケモカイン受容体ＣＸＣＲ３、ヒトケモカインＳＤＦ１α、ヒトケモカインＳＤＦ１β、ヒトケモカインＺＳＩＧ－３５、ヒトＣｈｒ１９Ｋｉｎｅタンパク質、ヒトＣＫβ－９、ヒトＣＸ３Ｃ １１１アミノ酸ケモカイン、ヒトＤＮＡＸインターロイキン－４０、ヒトＤＶｉｃ－１ Ｃ－Ｃケモカイン、ヒトＥＤＩＲＦ Ｉタンパク質配列、ヒトＥＤＩＲＦ IIタンパク質配列、好酸球ＣＣ型ケモカインエオタキシン、ヒト好酸球発現ケモカイン（eosinophil-expressed chemokine：ＥＥＣ）、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＣ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＩ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＣ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＩタンパク質、ヒト速収縮骨格筋トロポニンサブユニットＴ、ヒト速収縮骨格筋トロポニンＴ、ヒト胎児脾臓発現ケモカイン、ＦＳＥＣ、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte/macrophage-colony stimulating factor：ＧＭ－ＣＳＦ）受容体、ヒトｇｒｏ－αケモカイン、ヒトｇｒｏ－βケモカイン、ヒトｇｒｏ－γケモカイン、ヒトＩＬ－１６タンパク質、ヒトＩＬ－１ＲＤ１０タンパク質配列、ヒトＩＬ－１ＲＤ９、ヒトＩＬ－５受容体α鎖、ヒトＩＬ－６受容体、ヒトＩＬ－８受容体タンパク質ｈＩＬ８ＲＡ、ヒトＩＬ－８受容体タンパク質ｈＩＬ８ＲＢ、ヒトＩＬ－９受容体タンパク質、ヒトＩＬ－９受容体タンパク質変異体＃３、ヒトＩＬ－９受容体タンパク質変異体断片、ヒトＩＬ－９受容体タンパク質変異体断片＃３、ヒトインターロイキン１δ、ヒトインターロイキン１０、ヒトインターロイキン１８、ヒトインターロイキン１８誘導体、ヒトインターロイキン－１β前駆体、ヒトインターロイキン－１β前駆体、ヒトインターロイキン－１受容体補助タンパク質、ヒトインターロイキン－１受容体拮抗薬β、ヒトインターロイキン－１タイプ３受容体、ヒトインターロイキン－１０（前駆体）、ヒトインターロイキン－１１受容体、ヒトインターロイキン－１２ ４０ｋＤサブユニット、ヒトインターロイキン－１２ β－１受容体、ヒトインターロイキン－１２ β－２受容体、ヒトインターロイキン－１２ ｐ３５タンパク質、ヒトインターロイキン－１２ ｐ４０タンパク質、ヒトインターロイキン－１２受容体、ヒトインターロイキン－１３α受容体、ヒトインターロイキン－１３β受容体、ヒトインターロイキン－１５、クローンＰ１由来ヒトインターロイキン－１５受容体、ヒトインターロイキン－１７受容体、ヒトインターロイキン－１８タンパク質（ＩＬ－１８）、ヒトインターロイキン－３、ヒトインターロイキン－３受容体、ヒトインターロイキン－３変異体、ヒトインターロイキン－４受容体、ヒトインターロイキン－５、ヒトインターロイキン－６、ヒトインターロイキン－７、ヒトインターロイキン－７、ヒトインターロイキン－８（ＩＬ－８）、ヒト細胞内ＩＬ－１受容体拮抗薬、ヒトＩＰ－１０及びＨＩＶ－１ ｇｐ１２０超可変領域融合タンパク質、ヒトＩＰ－１０及びヒトＭｕｃ－１コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒト肝臓及び活性化調節ケモカイン（liver and activation regulated chemokine：ＬＡＲＣ）、ヒトＬｋｎ－１全長及び成熟体タンパク質、ヒト***関連ケモカイン（mammary associated chemokine：ＭＡＣＫ）タンパク質全長及び成熟体、ヒト成熟ケモカインＣｋβ－７、ヒト成熟ｇｒｏ－α、ヒト成熟ｇｒｏ－γポリペプチド（敗血症治療用）、ヒトＭＣＰ－３及びヒトＭｕｃ－１コアエピトープ（ＶＮＴ）融合タンパク質、ヒトＭＩ１０タンパク質、ヒトＭＩ１Ａタンパク質、ヒト単球走化性因子ｈＭＣＰ－１、ヒト単球走化性因子ｈＭＣＰ－３、ヒト単球走化性前駆タンパク質（monocyte chemotactic proprotein：ＭＣＰＰ）配列、ヒトニューロタクチン（neurotactin）ケモカイン様ドメイン、ヒト非ＥＬＲ ＣＸＣケモカインＨ１７４、ヒト非ＥＬＲ ＣＸＣケモカインＩＰ１０、ヒト非ＥＬＲ ＣＸＣケモカインＭｉｇ、ヒトＰＡＩ－１変異体、ＩＬ－１６活性を有するヒトタンパク質、ＩＬ－１６活性を有するヒトタンパク質、ヒト二次リンパケモカイン（secondary lymphoid chemokine：ＳＬＣ）、ヒトＳＩＳＤタンパク質、ヒトＳＴＣＰ－１、ヒト間質細胞由来ケモカイン、ＳＤＦ－１、ヒトＴ細胞混合リンパ球反応性発現型ケモカイン（T cell mixed lymphocyte reaction expressed chemokine：ＴＭＥＣ）、ヒト胸腺及び活性化調節サイトカイン（thymus and activation regulated cytokine：ＴＡＲＣ）、ヒト胸腺発現型、ヒト腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：ＴＮＦ）－α、ヒトＴＮＦ－β（ＬＴ－α）、ヒトタイプＣＣケモカインエオタキシン３タンパク質配列、ヒトタイプＩＩインターロイキン－１受容体、ヒト野生型インターロイキン－４（ｈＩＬ－４）タンパク質、ヒトＺＣＨＥＭＯ－８タンパク質、ヒト化抗血管上皮成長因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）抗体及び
    その断片、ヒト化抗血管上皮成長因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）抗体及びその断片、ヒアルロニダーゼ、インターロイキン１β転換酵素（interleukin-1 beta converting enzyme：ＩＣＥ）１０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ２０ｋＤサブユニット、ＩＣＥ２２ｋＤサブユニット、イズロン酸－２－スルファターゼ、イズロニダーゼ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１阻害剤（ＩＬ－１ｉ）、ＩＬ－１成熟体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１１、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７受容体、受容体、ＩＬ－１９、ＩＬ－１ｉ断片、ＩＬ１－受容体拮抗薬、ＩＬ－２１（ＴＩＦ）、ＩＬ－３含有融合タンパク質、ＩＬ－３変異体タンパク質、ＩＬ－３変異体、ＩＬ－４、ＩＬ－４変異タンパク質、ＩＬ－４変異タンパク質Ｙ１２４Ｇ、ＩＬ－４変異タンパク質Ｙ１２４Ｘ、ＩＬ－５、ＩＬ－５変異タンパク質、Ｉｌ－５受容体、ＩＬ－６、Ｉｌ－６受容体、ＩＬ－７受容体クローン、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－９成熟タンパク質変異体（Ｍｅｔ１１７バージョン）、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン系分子またはそのいずれかの断片、Small Modular ImmunoPharmaceutical(商標)（「ＳＭＩＰ」）、ｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖ断片）、プラスミノーゲンを含むがこれに限定されない、インフルエンザワクチン、インヒビンα、インヒビンβ、インスリン、インスリン様成長因子、インテグリンＭａｂ、インタ－αトリプシン阻害剤、インタ－αトリプシン阻害剤、インターフェロンγ誘導性タンパク質（ＩＰ－１０）、インターフェロン、インターフェロンα種及び亜種、インターフェロンβ種及び亜種、インターフェロンγ種及び亜種）、インターロイキン６、インターロイキン８（ＩＬ－８）受容体、インターロイキン８受容体Ｂ、インターロイキン－１α、インターロイキン－２受容体関連タンパク質ｐ４３、インターロイキン－３、インターロイキン－４変異タンパク質、インターロイキン－８（ＩＬ－８）タンパク質、インターロイキン－９、インターロイキン－９（ＩＬ－９）成熟タンパク質（Ｔｈｒ１１７バージョン）、インターロイキン、ＩＬ１０、ＩＬ１１、及びＩＬ２）、日本脳炎ワクチン、カリクレイン阻害剤、ケラチノサイト増殖因子、クニッツ（Kunitz）ドメインタンパク質、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、ＬＡＣＩ、ラクトフェリン、潜在型ＴＧＦ－β結合タンパク質ＩＩ、レプチン、肝臓発現型ケモカイン－１（ＬＶＥＣ－１）、肝臓発現型ケモカイン－２（ＬＶＥＣ－２）、ＬＴ－α、ＬＴ－β、黄体化ホルモン、ライム病（Lyme）ワクチン、リンホタクチン、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ（ｎ＋１）、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ－ｅｙｆｙ、マクロファージ由来ケモカインアナログＭＤＣ－ｙｌ、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、マスピン、プロテアーゼ阻害剤５、ＭＣＰ－１受容体、ＭＣＰ－１ａ、ＭＣＰ－１ｂ、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４受容体、Ｍ－ＣＳＦ、メラノーマ阻害タンパク質、膜結合タンパク質、Ｍｅｔ１１７ヒトインターロイキン９、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、ＭＩＰ－γ、ＭＩＲＡＰ、修飾型ランテス（Modified Rantes）、モノクローナル抗体、ＭＰ５２、ミュータントインターロイキン６ Ｓ１７６Ｒ、筋原線維収縮性タンパク質トロポニンＩ、ナトリウム利尿ペプチド、神経増殖因子－β、神経増殖因子－β２、ニューロピリン（Neuropilin）－１、ニューロピリン－２、ニューロタクチン（Neurotactin）、ニューロトロフィン（Neurotrophin）－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－４ａ、ニューロトロフィン－４ｂ、ニューロトロフィン－４ｃ、ニューロトロフィン－４ｄ、好中球活性化ペプチド－２（ＮＡＰ－２）、ＮＯＧＯ－６６受容体、ＮＯＧＯ－Ａ、ＮＯＧＯ－Ｂ、ＮＯＧＯ－Ｃ、新規β－ケモカインであるＰＴＥＣ、Ｎ末端変性ケモカインＧｒｏＨＥＫ／ｈＳＤＦ－１α、Ｎ末端変性ケモカインＧｒｏＨＥＫ／ｈＳＤＦ－１β、Ｎ末端変性ケモカインｍｅｔ－ｈＳＤＦ－１α、Ｎ末端変性ケモカインｍｅｔ－ｈＳＤＦ－１β、ＯＰＧＬ、骨原性タンパク質－１（ＯＰ－１）、ＢＭＰ－７、骨原性タンパク質－２、ＯＸ４０、ＡＣＴ－４、ＯＸ４０Ｌ、オキシトシン（ニューロフィジンＩ）、副甲状腺ホルモン、パッチ型、パッチ型－２、ＰＤＧＦ－Ｄ、百日咳トキソイド、下垂体発現型ケモカイン（Pituitary expressed chemokine：ＰＧＥＣ）、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子－２、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－２（ＰＡＩ－２）、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ｂｖ－ｓｉｓ、血小板由来増殖因子前駆体Ａ、血小板由来増殖因子前駆体Ｂ、血小板Ｍａｂ、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、敗血症治療用ポリペプチド、プレプロアポリポタンパク質「ミラノ」変異体、プレプロアポリポタンパク質「パリ」変異体、プレトロンビン、霊長類ＣＣケモカイン「ＩＬＩＮＣＫ」、霊長類ＣＸＣケモカイン「ＩＢＩＣＫ」、プロインスリン、プロラクチン、プロラクチン２、プロサプチド、プロテアーゼ阻害ペプチド、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、プロウロキナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ８－６８、ＲＡＮＴＥＳ９－６８、ＲＡＮＴＥＳペプチド、ＲＡＮＴＥＳ受容体、組換えインターロイキン－１６、レジスチン（Resistin）、レストリクトシン、レトロウイルスプロテアーゼ阻害剤、リシン（ricin）、ロタウイルスワクチン、ＲＳＶ Ｍａｂ、サポリン、サルシン、分泌及び膜貫通ポリペプチド、血清コリンエストラーゼ、血清タンパク質、血液凝固因子、溶解性ＢＭＰ受容体キナーゼタンパク質－３、溶解性ＶＥＧＦ受容体、幹細胞阻害因子、ブドウ球菌ワクチン、間質由来因子－１α、間質由来因子－１β、サブスタンスＰ（タキキニン）、Ｔ１２４９ペプチド、Ｔ２０ペプチド、Ｔ４エンドヌクレアーゼ、ＴＡＣＩ、胸腺及び活性化調節ケモカイン（Thymus and activation regulated chemokine：Ｔａｒｃ）、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、Ｔｈｒ１１７ヒトインターロイキン９、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボポエチン誘導体１、トロンボポエチン誘導体２、トロンボポエチン誘導体３、トロンボポエチン誘導体４、トロンボポエチン誘導体５、トロンボポエチン誘導体６、トロンボポエチン誘導体７、胸腺発現型ケモカイン（Thymus expressed chemokine：ＴＥＣＫ）、甲状腺刺激ホルモン、ダニ抗凝固ペプチド、Ｔｉｍ－１タンパク質、ＴＮＦ－α前駆体、ＴＮＦ－Ｒ、ＴＮＦ－ＲＩＩ、ＴＮＦ ｐ７５受容体、デス（Death）受容体、組織プラスミノーゲン活性化因子（tissue prasminogen activator：tPA）、トランスフェリン、形質転換増殖因子β，トロポニンペプチド、切断型単球走化性タンパク質２（６－７６）、切断型ＲＡＮＴＥＳタンパク質（３－６８）、腫瘍壊死因子、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、バソプレッシン（ニューロフィジンＩＩ）、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）Ｒ－３、ｆｌｔ－４、ＶＥＧＦ受容体、ＫＤＲ、ｆｌｋ－１、ＶＥＧＦ－１１０、ＶＥＧＦ－１２１、ＶＥＧＦ－１３８、ＶＥＧＦ－１４５、ＶＥＧＦ－１６２、ＶＥＧＦ－１６５、ＶＥＧＦ－１８２、ＶＥＧＦ－１８９、ＶＥＧＦ－２０６、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｘ、フォン・ヴィルブラント因子、野生型単球走化性タンパク質２、ＺＴＧＦ－β９；
    （ii）次から選択される化学療法薬物：１３－シス－レチノイン酸、２－ＣｄＡ、２－クロロデオキシアデノシン、５－アザシチジン、５－フルオロウラシル、５－ＦＵ、６－メルカプトプリン、６－ＭＰ、６－ＴＧ、６－チオグアニン、アブラキサン（Abraxane）、Accutane(登録商標)、アクチノマイシン－Ｄ、Adriamycin(登録商標)、Adrucil(登録商標)、Agrylin(登録商標)、Ala-Cort(登録商標)、アルデスロイキン（Aldesleukin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ALIMTA、アリトレチノイン(Alitretinoin)、Alkaban-AQ(登録商標)、Alkeran(登録商標)、すべてのトランスレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン（Altretamine）、アメトプテリン（Amethopterin）、アミホスチン（Amifostine）、アミノグルテチミド、アナグレリド、Anandron(登録商標)、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、シタラビン（Ara-C）、Aranesp(登録商標)、Aredia(登録商標)、Arimidex(登録商標)、Aromasin(登録商標)、Arranon(登録商標)、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、Avastin(登録商標)、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ベキサロテン、BEXXAR(登録商標)、ビカルタミド（Bicalutamide）、BiCNU、Blenoxane(登録商標)、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、Busulfex(登録商標)、Ｃ２２５、ロイコボリンカルシウム、Campath(登録商標)、Camptosar(登録商標)、カンプトテシン－１１、カペシタビン、Carac(商標)、カルボプラチン、カルムスチン、カルムスチン・ウェファー、Casodex(登録商標)、ＣＣ－５０１３、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、Cerubidine(登録商標)、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボラム因子、クラドリビン、コルチゾン、Cosmegen(登録商標)、ＣＰＴ－１１、シクロホスファミド、Cytadren(登録商標)、シタラビン、シタラビンリポソーム（Cytarabine Liposomal）、Cytosar-U(登録商標)、Cytoxan(登録商標)、ダカルバジン、Dacogen(登録商標)、ダクチノマイシン、ダルベポエチンα、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、ダウノルビシンリポソーム（Daunorubicin Liposomal）、DaunoXome(登録商標)、Decadron、デシタビン、Delta-Cortef(登録商標)、Deltasone(登録商標)、デニロイキンジフチトクス、DepoCyt(商標)、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、Dexasone、デキスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、Diodex、ドセタキセル、Doxil(登録商標)、ドキソルビシン（Doxorubicin）、ドキソルビシンリポソーム（Doxorubicin liposomal）、Droxia(商標)、DTIC、DTIC-Dome(登録商標)、Duralone(登録商標)、Efudex(登録商標)、Eligard(商標)、Ellence(商標)、Eloxatin(商標)、Elspar(登録商標)、Emcyt(登録商標)、エピルビシン、エポエチンα、Erbitux(商標)、エルロチニブ、エルウィニアＬ－アスパラギナーゼ、エストラムスチン、Ethyol、Etopophos(登録商標)、エトポシド、リン酸エトポシド、Eulexin(登録商標)、Evista(登録商標)、エキセメスタン、Fareston(登録商標)、Faslodex(登録商標)、Femara(登録商標)、フィルグラスチム、フロクスウリジン（Floxuridine）、Fludara(登録商標)、フルダラビン、Fluoroplex(登録商標)、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、FUDR(登録商標)、フルベストラント、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor：Ｇ－ＣＳＦ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、Gemzar(登録商標)、Gleevec(商標)、Gliadel(登録商標)ウェファー、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte/macrophage-colony stimulating factor：ＧＭ－ＣＳＦ）、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Halotestin(登録商標)、Herceptin(登録商標)、Hexadrol、Hexalen(登録商標)、ヘキサメチルメラミン、HMM、Hycamtin(登録商標)、Hydrea(登録商標)、Hydrocort Acetate(登録商標)、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム、ハイドロコートンリン酸塩、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、Idamycin(登録商標)、イダルビシン、Ifex(登録商標)、ＩＦＮ－α、イホスファミド、ＩＬ－１１、ＩＬ－２、メシル酸イマチニブ、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンα、インターフェロンα－２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン－２、インターロイキン－１１、Intron A(登録商標)（インターフェロンα-２ｂ）、Iressa(登録商標)、イリノテカン、イソトレチノイン、Kidrolase(登録商標)、Lanacort(登録商標)、ラパチニブ、Ｌ－アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、Leukeran、Leukine(商標)、ロイプロリド、ロイロクリスチン（Leurocristine）、Leustatin(商標)、リポソームシタラビン（Ara-C）、Liquid Pred(登録商標)、ロムスチン、Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン、Lupron(登録商標)、Lupron Depot(登録商標)、Matulane(登録商標)、Maxidex、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、Medralone(登録商標)、Medrol(登録商標)、Megace(登録商標)、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、Mesnex(商標)、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、Meticorten(登録商標)、マイトマイシン、マイトマイシン－Ｃ、ミトキサントロン、M-Prednisol(登録商標)、ＭＴＣ、ＭＴＸ、Mustargen(登録商標)、ムスチン、Mutamycin(登録商標)、Myleran(登録商標)、Mylocel(商標)、Mylotarg(登録商標)、Navelbine(登録商標)、ネララビン、Neosar(登録商標)、Neulasta(商標)、Neumega(登録商標)、Neupogen(登録商標)、Nexavar(登録商標)、Nilandron(登録商標)、ニルタミド、Nipent(登録商標)、ナイトロジェンマスタード、Novaldex(登録商標)、Novantrone(登録商標)、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、Oncospar(登録商標)、Oncovin(登録商標)、Ontak(登録商標)、Onxal(商標)、オプレルベキン（Oprevelkin）、Orapred(登録商標)、Orasone(登録商標)、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルタンパク質結合、パミドロネート、パニツムマブ、Panretin(登録商標)、Paraplatin(登録商標)、Pediapred(登録商標)、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、PEG-INTRON(商標)、ＰＥＧ－Ｌ－アスパラギナーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、Platinol(登録商標)、Platinol-AQ(登録商標)、プレドニゾロン、プレドニゾン、Prelone(登録商標)、プロカルバジン、PROCRIT(登録商標)、Proleukin(登録商標)、カルムスチンインプラントと共にプロリフェプロスパン２０、Purinethol(登録商標)、ラロキシフェン、Revlimid(登録商標)、Rheumatrex(登録商標)、Rituxan(登録商標)、リツキシマブ、Roferon-A(登録商標)（インターフェロンα－２ａ）、Rubex(登録商標)、塩酸ルビドマイシン、Sandostatin(登録商標)、Sandostatin LAR(登録商標)、サルグラモスチム、Solu-Cortef(登録商標)、Solu-Medrol(登録商標)、ソラフェニブ、SPRYCEL(商標)、ＳＴＩ－５７１、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、Sutent(登録商標)、タモキシフェン、Tarceva(登録商標)、Targretin(登録商標)、Taxol(登録商標)、Taxotere(登録商標)、Temodar(登録商標)、テモゾロミド、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、Thalomid(登録商標)、TheraCys(登録商標)、チオグアニン、Thioguanine Tabloid(登録商標)、チオホスホアミド、Thioplex(登録商標)、チオテパ、TICE(登録商標)、Toposar(登録商標)、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、Trexall(商標)、Trisenox(登録商標)、ＴＳＰＡ、TYKERB(登録商標)、ＶＣＲ、Vectibix(商標)、Velban(登録商標)、Velcade(登録商標)、VePesid(登録商標)、Vesanoid(登録商標)、Viadur(商標)、Vidaza(登録商標)、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、Vincasar Pfs(登録商標)、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＭ－２６、ボリノスタット、ＶＰ－１６、Vumon(登録商標)、Xeloda(登録商標)、Zanosar(登録商標)、Zevalin(商標)、Zinecard(登録商標)、Zoladex(登録商標)、ゾレドロン酸、Zolinza、Zometa(登録商標)；
    （iii）次から選択される放射性医薬：炭素１１、炭素１４、クロム５１、コバルト５７、コバルト５８、エルビウム１６９、フッ素１８、ガリウム６７、金１９８、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、鉄５９、クリプトン８１ｍ、窒素１３、酸素１５、リン３２、レニウム１８６、ルビジウム８２、サマリウム１５３、セレン７５、ストロンチウム８９、テクネチウム９９ｍ、タリウム２０１、トリチウム、キセノン１２７、キセノン１３３、イットリウム９０；及び
    （iv）次から選択される画像化剤：ガドリニウム、マグネタイト、マンガン、テクネチウム、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｐ３２、ＴＩ２０１、イオパミドール、ＰＥＴ－ＦＤＧ；
    から選択される、請求項４５又は４６のコンジュゲート、請求項５１のアソシエイト、請求項５２のナノ粒子又はマイクロ粒子又はリポソーム、又は請求項５３の組成物。
  55. 疾患の処置、病気の処置、及び／又は、診断のための、請求項４５、４６又は５４に記載のコンジュゲート、又は請求項５１に記載のアソシエイト、請求項５２に記載のナノ粒子又はマイクロ粒子又はリポソーム。
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