JP7002329B2 - 膜濾過を用いた、液体の微生物学的調査のためのペトリディッシュおよび方法 - Google Patents

Description

本発明は、フィルターをとりわけ簡便に導入することができる、媒体(medium)で充填されたペトリディッシュ、ならびに該ペトリディッシュにおけるフィルターの濾過およびインキュベーションを用いた、特に液体の微生物学的調査のための方法に関する。

細菌、糸状菌および酵母は、例えば、飲料、水または化粧品などの液体の品質および特性維持をネガティブに損なうことができる。この種類の微生物は、原料中に、空気中に、または加工の間の表面にも見出され得る。

それゆえ、典型的には、生産の間でさえ、一方ではコンタミネーションを防ぐこと、他方では重要なポイントにおける定期的なサンプリングおよび試験により、起こり得るコンタミネーションを発見することが試みられている。組織的に行われるサンプリングおよび分析のプログラムは、製造者が、それが大きな問題に発展する前に、供給源におけるコンタミネーションを発見し、除去することを可能にする。

濾過されるべき液体の微生物学的分析は、典型的に、調査されるはずの液体を流すフィルターを使用して行われる。濾過後、フィルターは、取り出され、例えば、フィルターが、数日間インキュベーター中で上昇した温度において保管される、アガーディッシュ中に設置される。アガーは、液体から濾別されたいずれの微生物にも、増殖を刺激する栄養を提供し、したがって、微生物は繁殖することができ、決定または計数することが可能となる。

この既知の方法の主な困難性は、通常、極めて慎重を期するフィルターの取り扱いにある。これらは、典型的に、ピンセットを使用してつかまれ、ペトリディッシュの媒体の上に配置される。フィルターおよびペトリディッシュの媒体は、取り扱いの間、損傷を受けたり、変形をさせてはならない。

特に、多数のサンプルが平行して調査される実験室にとってのさらなる問題は、個々のペトリディッシュのスペース要求である。一般的に、調査されるフィルターよりも著しく大きい直径を有するペトリディッシュが使用されている。これは、さもなければフィルターを、ディッシュの縁をはるかに下回って位置する媒体の上に設置することができないので、必要である。例えば、６０ｍｍ以上の直径を有するペトリディッシュは、４７ｍｍの直径を有するフィルターのために用いられる。大きいペトリディッシュの使用は、ペトリディッシュおよびそれに位置する媒体のための材料のより大きい消費、特に、ディッシュのインキュベーションの間の調査する実験室のより大きいスペース要求を意味する。

本発明の目的は、それゆえ、ペトリディッシュ上に設置する間のフィルターの取り扱いを簡便化し、加えて、可能な限りスペースを節約するディッシュを提供することであった。

数十年間知られており、多くの、いくつかの場合においては複雑なデバイスを用いて行われている方法を、実質的に、完全に、または好ましくは、縁まで媒体で充填されているペトリディッシュを用いることにより、相当に簡便化することができることが見出されている。この方式において、フィルターを、ペトリディッシュの縁に妨害されることなく、媒体上に設置および配置することができる。取り扱いは、早くなり、フィルターまたは媒体へのダメージは減る。さらに、ペトリディッシュの直径を、実質的に、フィルターの直径まで、低減させることができるので、その結果、スペースおよび媒体を節約することができる。

本発明は、それゆえ、少なくともディッシュの縁より１ｍｍ下までであるが、多くともディッシュの縁まで、媒体で充填されているディッシュ、およびディッシュを閉じる蓋を含むペトリディッシュに関する。

好ましい態様において、ディッシュは、完全に、すなわち、縁まで媒体で充填されている。

別の好ましい態様において、媒体は、アガー媒体である。

別の態様において、ディッシュおよび蓋は、円形である。

好ましい態様において、蓋が、ディッシュを閉じるために、ディッシュの上でひっくり返すことができるように、蓋は、ディッシュの外径よりも少なくともわずかに大きい内径を有する。

別の好ましい態様において、蓋の底は、ディッシュの縁に載らない。この目的のために、蓋の底が、ディッシュの縁に直接載らないという効果を有する１以上のデバイスは、好ましくは、ディッシュの壁または蓋に位置する。

一態様において、蓋の底が載ることは、ディッシュの縁上に取り付けられた、蓋が載る少なくとも３の突出部により防がれる。

別の態様において、蓋の縁が載るホルダーは、例えば、ビード(bead)の形態において、または密閉デバイスの形態において、ディッシュの壁（内側、または好ましくは外側）に備え付けられている。

本発明はまた、以下の方法のステップ：
ａ）フィルターに通す液体または気体の濾過
ｂ）本発明によるペトリディッシュの媒体へのフィルターの適用
ｃ）蓋を用いたペトリディッシュの密閉
ｄ）ステップｃ）からのペトリディッシュのインキュベーション
ｅ）微生物増殖の評価
により特徴付けられる、液体または気体中の微生物の決定のための方法に関する。

好ましい態様において、液体は、濾過される。
好ましい態様において、フィルターおよびペトリディッシュは、円形形状である。
好ましい態様において、ペトリディッシュの内径は、フィルターの直径よりも２
フィルターは、好ましくは、０．２と０．４５μｍとの間の排除限界を有する。

フィルターは、好ましくは、主として酢酸セルロースおよび／または硝酸セルロースからなる。
本発明はまた、フィルター上の微生物の決定のための、本発明によるペトリディッシュの使用に関する。この目的のために、フィルターは、ペトリディッシュの媒体上に設置され、インキュベートされ、そしてその後、微生物が評価される。

図１は、本発明によるペトリディッシュのディッシュの２つの可能な態様を示す。蓋はいずれの場合においても示されない。

本発明にしたがって、ペトリディッシュは、特に、微小生物、細胞培養物、細菌等の培養のための、例えば、栄養溶液または固体培地(solid culture media)を意味する、栄養媒体の収容のための容器である。容器は、ディッシュ、およびディッシュを密閉する蓋を含む。蓋がディッシュの周りに、またはディッシュの中に係合してもよいことは、この点において指摘されるべきである。結果として、ディッシュおよび蓋は、非常に一般的に、互いに係合する部分を意味し、多かれ少なかれ封鎖スペースを形成する。簡便化のために、ディッシュおよび蓋なる用語は、以後用いられる。

ディッシュおよび蓋のそれぞれは、好ましくは円形の領域の形態において、底（ディッシュ底および蓋底）、および好ましくは、円形の環の形態において、底から突き出る壁（ディッシュ壁および蓋壁）を含む。壁の上端は、縁と呼ばれる。ディッシュを閉じるために、１つの壁が他方の上で反転（または逆に）され得るように、壁の１つ、好ましくは蓋壁は、他の壁、好ましくは、ディッシュ壁の外径よりも少なくともわずかに大きい内径を有する。

ペトリディッシュは、したがって、典型的に、好ましくは重なる蓋を含む、平たく、円形で、通常、透明なガラスの、またはプラスチックのディッシュである。この種類のディッシュは、通常、生物学または化学において用いられる。これは、微生物ともよばれる微小生物の培養のために役立ち、細胞培養を確率するために用いられる。

一般的な容器に関連して、ペトリディッシュの意味における容器が知られている独国特許出願公開第44 06 725 A1号が、例の方式により単に参照されてもよい。蓋は、容器を密閉するのに役立つ。蓋は、一般的に、ディッシュの上で、またはディッシュ壁の上で、ひっくり返される。

本発明の意味における媒体は、様々な微生物が特異的に増殖することができる、あるいは特定の微生物が特異的に増殖することができる、固体の栄養媒体または培地である。媒体の基本的な組成は、通常、主な構成要素である水、各微生物に用られ得るエネルギー源、例えば有機化合物、およびそれに要求される栄養（有機または無機炭素の、窒素の、硫黄の、およびホスファートの供給源、ならびに他の必須の栄養）からなる。従属栄養生物のための栄養媒体中の栄養は、通常、炭水化物（「糖類」）、タンパク質の加水分解物（ペプトン）および任意に脂肪酸である。加えて、無機塩は、微生物に例えば、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、硫酸塩、および微量元素などの必須のイオンを提供する。

加えて、以下：
－染料またはその前駆体（顕微鏡染料、色素生成基質）
－アガーまたはゼラチンなどのゲル化剤（凝固剤）
－阻害剤（例えば、抗生物質）および望ましくない微小生物の増殖を防ぐための選択剤（例えば、酵母／糸状菌培地のためのクロラムフェニコール）
－例えばｐＨなどの変化を指し示すのみならず、特定の代謝産物または代謝活性を指し示すための指示薬
－ｐＨを安定化するための緩衝物質
－ホルモンなどの増殖因子、ビタミンなど
もまた存在しててもよい。

好ましいのは、本発明にしたがって、アガーをベースとした媒体、すなわち、アガーを含む媒体である。

微生物の決定のための媒体は、当業者に知られている。好適な媒体の例は、例えば、Microbiology Manual 2000, Merck KGaA, Germanyに見出すことができる。

以下の表は、例として、それらを用いて決定されるいくつかの媒体および微生物を示す。

本発明の意味におけるフィルターは、糸状菌類、酵母または細菌などの微生物の回収のために好適である全てのフィルターである。これらは、ペーパーフィルターまたは例えば、プラスチックから作られた膜フィルターであり得る。例えば、ＰＶＤＦから作られたフィルターは、好適である。セルロース混合エステルをベースとしたフィルターは、特に好ましい。これらは、少なくとも酢酸セルロースおよび／または硝酸セルロースを含むフィルターである。フィルターの孔径は、単離される微生物のサイズに依存する。典型的な排除サイズは、０．２～０．４５μｍである。これは、フィルターが、０．２～０．４５μｍの間の孔径を有することを意味する。

典型的に、３０と８０ｍｍとの間、好ましくは４０と５０ｍｍとの間の直径を有するフィルターが使用される。
本発明による方法において使用のために好適である例示的なフィルターは、Merck Millipore, Germany製のEZ-PAK（登録商標）膜である。これは、０．４５μｍの孔径を有するセルロースエステルをベースとしたく膜フィルターである。

少なくともディッシュの縁より１ｍｍ下までであるが、多くともディッシュの縁まで、媒体で充填されている、本発明によるペトリディッシュは、フィルターの分析を著しく簡便化することが見出された。一方で、ディッシュの媒体上に慎重を期するフィルターを配置することを、著しく簡便化する。他方で、ディッシュの直径は、フィルターの直径に適合させることができる。特に、多数のサンプルが平行して調査される実験室において、個々のペトリディッシュが占めるスペースは、可能な限り小さくされるべきである。本発明は、縁まで充填されているペトリディッシュ上へのフィルターの設置が、ディッシュの奥底へのフィルターの設置よりも著しく簡便であるので、フィルターの直径に関連してより小さいペトリディッシュを採用する可能性をここで提供する。

ディッシュは、典型的に、少なくともディッシュの縁より１ｍｍ下までであるが、多くともディッシュの縁まで、媒体で充填されている。ディッシュは、好ましくは、厳密に縁まで、すなわち、完全に媒体で充填されている。

媒体充填の高さは、ペトリディッシュの壁高に起因する。壁高は、本明細書において、ペトリディッシュの内側の壁高を意味する。これは、ペトリディッシュの底の厚さにより、ディッシュの外側の壁高とは異なる。少なくとも３ｍｍ媒体の高さが生じるように、ペトリディッシュの内側の壁高は、少なくとも３ｍｍであるべきである。媒体の高さは、好ましくは、３～７ｍｍである。３～８ｍｍの好ましい壁高は、したがって、ペトリディッシュのために生じる。ペトリディッシュの壁高の選択は、媒体の消費に影響を与え得る。

媒体は、好ましくはアガー媒体である。
好ましい態様において、ディッシュおよび蓋は円形であり、そして蓋がディッシュを閉じるために、ディッシュの上でひっくり返すことができるように、蓋は、ディッシュの外径よりも少なくともわずかに大きい内径を有する。

典型的に所望される好気的インキュベーションを容易にするために、かつフィルターと蓋との接触を防ぐために、ディッシュおよび蓋は、好ましくは、蓋底がディッシュの縁に直接載らないような方式で設計される。これは、様々な方式において達成することができる。例えば、ディッシュの縁は、蓋が載る、少なくとも３つの突出部を有し得る。結果として、蓋は、突出部にもよるが安定的な様式で載り、ディッシュの実際の縁から分離している。この種類の態様は、図１Ａに概略的に示される。図は、４つの突出部がその縁の上部に存在する円形ディッシュを示す。４つの突出部の１つは、よりよい理解のために、図において番号「１」が印付けされる。蓋が、ここで、かかるディッシュ上に設置される場合、突出部は、蓋底とディッシュの縁との間に分離を生じさせる。

さらなる態様において、ディッシュの壁は、蓋の縁が載る、内側もしくは外側のビード、または１以上のホルダーなどのデバイスを有し得る。蓋壁の高さが、ここでビードまたはホルダーの上のディッシュの壁の高さよりも高い場合、蓋の底は、ディッシュの縁に載らない。

一態様において、ビードは、縁が係合する外側の円形状のくぼみのように設計される。この種類の態様は、図１Ｂに概略的に描かれる。図は、壁（２）および底（３）からなるディッシュの断面を示す。環状様式において全体の壁の周りを巡るビード（４）は、壁（２）の外側に位置する。蓋は、そのようにして形成されるくぼみまたはチャネル（５）において係合することができる。蓋の壁が今、相応に高く選択される場合、蓋底は、ディッシュの縁に載らない。

別の態様において、外側のホルダーは、蓋底とディッシュ縁との分離を容易にするのみならず、加えて、蓋をロックする作用も有する。この目的のために、ホルダーを、例えば、外に突出するスナップイン突起、フランジ、糸状部、種々の係合手段の組み合わせなどのように設計され得る。この種類の密閉可能なペトリディッシュは、例えば、国際公開第2008/141597号から知られている。

本発明はまた、
以下の方法のステップ：
ａ）フィルターによる液体または気体の濾過
ｂ）本発明によるペトリディッシュの媒体へのフィルターの適用
ｃ）蓋を用いたペトリディッシュの密閉
ｄ）ステップｃ）からの密閉したペトリディッシュのインキュベーション
ｅ）微生物増殖の評価
により特徴付けられる、液体または気体中の微生物の決定のための方法に関する。

濾過およびその後のペトリディッシュ中でのフィルターのインキュベーションによる、液体または気体サンプルの調査のための一般的な方法は、当業者に知られている。本明細書において液体は、特に、水、飲料、液体食品または液体化粧品である。最も調査される気体は、例えば、医薬、または飲料および／もしくは食品生産における空気である。

方法は、典型的に、以下のように行われる。

１．フィルターおよびペトリディッシュの調製
本発明したがって、少なくとも縁より１ｍｍ下まで、多くとも縁まで、媒体で充填されている、ペトリディッシュが提供される。
好ましい態様において、フィルターおよびペトリディッシュは、円形形状である。
好ましい態様において、ペトリディッシュの内部の直径は、フィルターの直径よりも２～１０ｍｍ、好ましくは１～８ｍｍ大きい。この方式において、最小の直径を有するペトリディッシュを使用することが可能である。４７ｍｍの直径を有するフィルターのために、例えば５５ｍｍの直径を有するペトリディッシュは、したがって好適である。
ペトリディッシュおよびフィルターのさらに必要な、かつ好ましい特性は、既に上に記載されている。

２．フィルターは、液体または気体の濾過のために、漏斗または別のデバイスに導入される。
この種類のデバイスは、当業者に知られている。液体の濾過のためのデバイスの例は、国際公開第2008113443号およびそれに引用される文献に見出される。
典型的に、５０と５００ｍｌとの間、好ましくは１００と２５０ｍｌとの間の液体が、フィルターを通過する。微生物は、フィルターに付着してとどまる。

３．濾過デバイスからのフィルターの取り出し。
その後の微生物の決定の間、起こり得る、元の液体の影響の干渉を排除するために、任意で、フィルターを、濾過デバイスから取り出される前にリンスすることができる。

４．ペトリディッシュへのフィルターの導入。
フィルターは、典型的に、滅菌されたピンセットを使用して、開けられたペトリディッシュの媒体上に設置される。ディッシュは、その後、蓋を用いて密閉される。

５．密閉されたペトリディッシュはインキュベートされる。
この目的のために、ペトリディッシュは、典型的に、インキュベーター中に設置される。インキュベーション時間およびインキュベーション温度は、種々の微生物種によって異なる。インキュベーション時間は、典型的に、１２と４８時間との間である。温度は、典型的に、約３６℃である。色素生成大腸菌群アガー上のE. coli／大腸菌群について、インキュベーション時間は、例えば、好ましくは、約３６℃において、１８と２４時間との間である。当業者は、温度およびインキュベーション時間を、決定される各微生物に適合させることができる。

６．微生物増殖の評価
インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、評価することができる。これは、視覚により、または好適な装置を用いることにより、行うことができる。評価のための方法は、当業者に知られている。微生物増殖の評価は、形成された微生物コロニーを計測することにより、および／またはさらなる特徴の評価により行うことができる。アガー上に形成されたコロニーの計測は、典型的に行われる。例えば、２０コロニーがアガー上に形成される場合、２０の微生物がサンプルから濾過されたことが推測される。採用されるサンプル体積に依存して、体積単位あたりの微生物カウントは、それから計算することができる。さらなる特徴の評価は、例えば、ｐＨの変化または色素生成基質の代謝による色変化の決定を含む。さらなる特徴の評価はまた、しかしながら、例えばＰＣＲまたは抗体をベースとした試験などのさらなる試験を用いた、１以上の微生物の単離、およびその同定を意味する。

本発明は、したがって、濾過を用いた液体または気体中の微生物の決定の著しい改善を提供する。ペトリディッシュの媒体充填レベルの単なる増加は、取り扱いを著しく簡便化する。加えて、フィルターに関連したペトリディッシュのサイズを、低減することができる。

図に従って上で説明される例示的な態様は、特許請求の範囲の教示を例示的に説明するためにのみ役割を果たし、これを例示的な態様に限定しない。さらなる注釈がない場合においても、当業者は、最も広い範囲で上の記載を利用することができるであろうことが想定される。

上記および下記に引用される全ての出願、特許および刊行物、特に、対応出願である２０１４年８月１４日に提出された欧州特許出願公開第14002840.8号の完全な開示内容は、参照の方式により本出願に組み込まれる。

Claims (6)

1. 以下のステップ：
   ａ）液体または気体をフィルターに通して濾過するステップ、
   ｂ）媒体が充填されているペトリディッシュの媒体上へステップa)からのフィルターを適用するステップであって、媒体は、ペトリディッシュの縁より少なくとも１ｍｍ下から多くともディッシュの縁まで充填されている、ステップ、
   ｃ）蓋をすることによりステップｂ）からのペトリディッシュを密閉するステップであって、ペトリディッシュは蓋底が縁に直接載らない、ステップ、
   ｄ）ステップｃ）からのペトリディッシュをインキュベーションするステップ、および
   ｅ）ステップｄ）により増殖した微生物を評価するステップ、
   により特徴付けられる、液体または気体中の微生物の決定のための方法。
2. フィルターおよびペトリディッシュが、円形形状であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ペトリディッシュの内径が、フィルターの直径よりも２～１０ｍｍ大きいことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. フィルターが、０．２と０．４５μｍとの間の排除限界を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. フィルターが、セルロース混合エステルからなることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 請求項１に記載の微生物の決定のための方法のためのペトリディッシュおよび蓋の使用であって、ペトリディッシュは縁より少なくとも１ｍｍ下から多くともディッシュの縁まで媒体が充填されており、ペトリディッシュは蓋底が縁に直接載らない構造である、使用。

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