JP7002037B2 - 急性呼吸器感染症を診断および処置するための方法 - Google Patents
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関連出願
この出願は、２０１５年７月１日に出願された米国仮特許出願第６２／１８７，６８３号および２０１５年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／２５７，４０６号の恩恵を主張し、それらの米国仮特許出願の開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
この出願は、２０１５年７月１日に出願された米国仮特許出願第６２／１８７，６８３号および２０１５年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／２５７，４０６号の恩恵を主張し、それらの米国仮特許出願の開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
連邦政府の財政的支援の説明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）により授与された連邦助成金番号Ｕ０１ＡＩ０６６５６９、Ｐ２０ＲＲ０１６４８０、およびＨＨＳＮ２６６２００４０００６４Ｃ、ならびにＤｅｆｅｎｓｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ Ａｇｅｎｃｙ（ＤＡＲＰＡ）により授与された連邦助成金番号Ｎ６６００１－０７－Ｃ－２０２４およびＮ６６００１－０９－Ｃ－２０８２による政府援助でなされた。米国政府はこの発明に対する一定の権利を有する。
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）により授与された連邦助成金番号Ｕ０１ＡＩ０６６５６９、Ｐ２０ＲＲ０１６４８０、およびＨＨＳＮ２６６２００４０００６４Ｃ、ならびにＤｅｆｅｎｓｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ Ａｇｅｎｃｙ（ＤＡＲＰＡ）により授与された連邦助成金番号Ｎ６６００１－０７－Ｃ－２０２４およびＮ６６００１－０９－Ｃ－２０８２による政府援助でなされた。米国政府はこの発明に対する一定の権利を有する。
急性呼吸器感染症は、救急治療の情況でよく見られ、世界中でかなりの死亡率、罹患率、および経済的損失を生じている。気道感染症または急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）は、２０１１年において、いかなる他の原因よりも多い、世界中で３２０万人の死亡をもたらし、および１億６４００万年の障害調整生命年が失われた（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．， ２０１３ａ， ２０１３ｂ）。２０１２年において、世界中での死因の第４位は、下気道感染症であり、支持療法があまり利用できない低・中所得国において、下気道感染症は、死因の第１位である（ＷＨＯ ｆａｃｔｓｈｅｅｔ， ａｃｃｅｓｓｅｄ Ａｕｇｕｓｔ ２２， ２０１４）。これらの疾病はまた、先進国においても問題である。米国において、２０１０年、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）は、肺炎およびインフルエンザのみで、米国人口において１００，０００人あたり１５．１人の死亡をもたらしたと決定した。高齢者および５歳未満の子どもは特に、ＡＲＩによる予後不良になりやすい。例えば、２０１０年において、肺炎は、５歳以下の子どもにおいて世界中で全死亡の１８．３％（すなわち、ほとんど１４０万人の死亡）を占めた。
肺炎および他の下気道感染症は、主としてウイルス、細菌、またはより少ない頻度で真菌である多くの異なる病原体のせいであり得る。ウイルス病原体の中で、インフルエンザは、罹患した個体の数、季節によって異なる重症度、ならびにはるかにより高い罹患率および死亡率をもたらす新しい菌株（例えば、鳥インフルエンザ）についての絶えず存在する心配に基づいて、最も悪名高いものの一つである。しかしながら、ウイルス病原体の中で、インフルエンザは、重大なヒト疾患を引き起こす、数あるもののうちの１つに過ぎない。呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、冬の間の先進国における子どもの入院の原因の第１位である。２００５年の５歳未満の子どもにおいて、世界中でＲＳＶ感染症の約３３００万の新しい症例が報告されており、３４０万が入院するほどの重症であった。このウイルス感染症だけで、毎年、６６，０００～１９９，０００人の子どもが命を失うと見積もられる。そして、米国だけで、６５歳を超える集団において、毎年、約１０，０００件の死がＲＳＶ感染症に関連づけられる。既知のウイルス病原体に加えて、新規および新興の感染症は、いつでも現れ得、数日間または数週間内で全世界的に広がることを歴史は示している。最近の例には、ＳＡＲＳコロナウイルスが含まれ、それは、２００３～２００４年に出現した時、１０％の死亡率を示した。つい最近には、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルスが、中東において今にも爆発しそうな状態を継続し、それによる死亡率は３０％となっている。これらの感染症のどちらも呼吸器症状を示し、最初は、いかなる他のＡＲＩとも区別不能であり得る。
ウイルス感染は、ＡＲＩの大部分を引き起こすが、細菌性病因もまた、特に下気道感染症の関連において、顕著である。細菌性ＡＲＩの具体的な原因は、地理的に、および臨床状況により異なるが、それらには、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ肺炎（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が含まれる。これらの病原体の同定は、培養中のそれらの増殖を頼りにし、典型的には、数日間を要し、かつ感染性物質の検出についての感度に限界がある。試験するのに十分な試料を得ることは困難である：市中肺炎を有する１６６９人の患者の研究において、たった１４％の患者だけが、陽性培養を生じる「良質」痰試料を提供することができた（Ｇａｒｃｉａ－Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。臨床医はこれらの試験の限界に気付いているために不安に駆られ、その結果として、抗細菌治療が、細菌感染のいかなる確認もなしに頻繁に処方される。
ＡＲＩの病因を迅速に診断することができることは、個々の患者についての処置の最適化、大流行を同定しかつ追跡する疫学的サーベイランス、および抗菌耐性の上昇気流を食い止めるための抗菌剤の適切な使用の指導という複数のレベルで広範囲に及ぶ社会的重要性をもつ、緊急の世界的問題である。早期かつ適切な抗菌治療が重篤な感染症を有する患者において予後を改善することは十分確立されている。これは、一部分、抗菌治療の過剰利用に押しやる。急性呼吸器病を有する外来患者の最高７３％が抗生物質を処方され、それは、この設定において成人に処方される全抗生物質のおよそ４０％を占める。しかしながら、これらの患者のほんの少数のみが抗細菌処置を必要とすると推定されている（Ｃａｎｔｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｃｌｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｊａｎ；２４（１）：１７０－８２）。同様の傾向は、救急科において観察される。ウイルス病原体の存在が微生物学的に確認されていたとしても、同時の細菌感染の可能性を排除するものではない。結果として、抗細菌剤が、しばしば、「万が一に備えて」処方される。このスパイラルに陥る経験主義は、抗菌耐性の上昇気流に寄与し（Ｇｏｕｌｄ， ２００９； Ｋｉｍ ＆ Ｇａｌｌｉｓ， １９８９）、それ自体、より高い死亡率、入院期間、およびヘルスケアの費用を伴う（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ ２００６， Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， Ｊａｎ １５；４２ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ８２－９）。加えて、抗生物質の不適切な使用は、薬物に関係した有害作用および他の合併症、例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢をもたらし得る（Ｚａａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。
急性呼吸器感染症は、感染によって引き起こされない疾病を含む多くの異なる疾病に共通している非特異的症状（例えば、発熱または咳）により特徴づけられることが多い。ＡＲＩについての既存の診断法は、多くの点で不十分である。通常の微生物学的試験は、乏しい感度および特異度、遅いターンアラウンドタイムにより、または試験の複雑さにより制限されている（Ｚａａｓ ｅｔ ａｌ． ２０１４， Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０（１０）：５７９－８８）。特定のウイルス病原体を検出する現在の試験、例えば、多重ＰＣＲに基づいたアッセイの１つの限界は、緊急性または汎発性ウイルス株を検出できないことである。インフルエンザパンデミックは、集団が自然抵抗力をもたない新しいウイルスが広がった時に起こる。インフルエンザパンデミックは、壊滅的になる場合が多い。例えば、１９１８～１９１９年、スペイン風邪では、世界の人口の約２０％～４０％を冒し、約５千万人の人が死亡した；１９５７～１９５８年、アジア風邪は、約２００万人の人が死亡した；１９６８～１９６９年、香港風邪は約１００万人の人が死亡した；そして、２００９～２０１０年、およそ４３００万～８９００万人の人が豚インフルエンザに罹り、８，８７０～１８，３００件の関連死を生じたとＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌは見積もっている。これらの新しい菌株の出現は、それらを検出するように設計されていない既存の診断法にとっての難題となっている。感染の確認が、数日間、必要とし、かつ州保健衛生局またはＣＤＣなどの専門化した試験センターで行われただけだった２００９年のインフルエンザパンデミック中、これは特に明らかであった（Ｋｕｍａｒ ＆ Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ２０１２， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２５（２）：３４４－６１）。西アフリカにおけるエボラウイルス疾患の大流行は、現在、同じような難題を突きつけている。さらに、感染性疾患の将来的な大流行が避けられないため、この問題に直面し続けるだろう公算が大きい。
特定のウイルスまたは細菌についての試験のパラダイムを用いる診断法のさらなる限界は、病原性微生物が検出され得る場合でさえも、これは、患者の症状が、その検出された病原体によるものであるという証明ではないということである。微生物は、コロニー形成として知られた、個体の正常な細菌叢の一部として存在し得、またはそれは、試験された試料（例えば、鼻腔スワブまたは洗浄液）の夾雑により検出され得る。ウイルスおよび細菌を検出するものを含む最近承認された多重ＰＣＲアッセイは、高感度を提供するが、これらの試験は、ウイルスの無症状性保因と真の感染を区別しない。例えば、ＡＲＩにおいて、特に子どもにおいては、高率の無症状性ウイルス排出がある（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４９（７）：２６３１－２６３６）。同様に、１つの病原体が検出されたとしても、疾病は、利用可能な、または実施できる試験がなかった第２の病原体による可能性がある。
報告では、ウイルス性ＡＲＩを健康な対照から区別する宿主遺伝子発現プロファイルが記載されている（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１１ ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７（８）： ｅ１００２２３４； Ｍｅｊｉａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３； Ｔｈａｃｈ ｅｔ ａｌ． ２００５ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：５８８－５９５； Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３； Ａ． Ｋ． Ｚａａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３； Ａ． Ｋ． Ｚａａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。しかしながら、これらの中のほとんどが、健康に対するウイルス感染または健康に対する細菌感染の検出より、より臨床的に意味ある区別である、細菌性ＡＲＩからのウイルス性ＡＲＩの区別を行わない（Ｈｕ， Ｙｕ， Ｃｒｏｓｂｙ， ＆ Ｓｔｏｒｃｈ， ２０１３； Ｐａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｒａｍｉｌｏ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。
このように、現在の診断方法は、細菌感染およびウイルス感染、ならびに非感染性原因から生じる症状の間を区別する能力、または細菌とウイルスの同時感染を同定する能力には限界がある。
本開示は、一つには、呼吸器症状の病因の決定のための現行方法の限界の多くを克服する分子診断試験を提供する。その試験は、共発現した遺伝子またはシグネチャのパターンを測定および分析することにより感染性物質に対する宿主の応答を検出する。これらの遺伝子発現シグネチャは、急性呼吸器感染症と一致している症状を示すヒトもしくは動物、または（例えば、流行性または地域性疾患の大流行中）急性呼吸器感染症を発症するリスクがある（例えば、前駆症状性）ヒトもしくは動物における血液試料において測定され得る。本明細書に教示されているような宿主応答の測定は、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性病因の間を区別し、細菌とウイルスの同時感染から生じるＡＲＩも検出し得る。
この多成分試験は、前例のない精度および臨床適応性を以て機能し、ヘルスケア提供者が宿主（対象または患者）の応答を用いて、感染性物質の性質を病原体クラスのレベルまで確実に決定し、またはそれらだけでは特異的ではない症状を示す個々の患者において症状の感染性原因を排除することを可能にする。いくつかの実施形態において、その結果は、呼吸器ウイルスまたは細菌の種について感知しない（すなわち、ウイルスと細菌とを区別するが、ウイルスまたは細菌の特定の属間または種間を区別しない）。これは、特定の病原体に対するプローブまたは試薬を含み、それゆえに、それらの特定の病原体のみを検出することに限定される現行の試験に優る利点を提供する。
本開示の一態様は、対象における急性呼吸器症状が、細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、シグネチャと呼ばれる定義済みの遺伝子セットの発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジー（すなわち、プラットフォーム）について遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する細菌分類子、ウイルス分類子、および／または非感染性疾病分類子へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を定義済み閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、ならびに（ｆ）前記出力を用いて、前記試料を提供した患者が細菌起源、ウイルス起源の感染を有するか、または非感染性疾病、もしくはこれらの状態のいくつかの組合せを有するかを決定するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
本開示の別の態様は、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）が、細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セットの発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジー（すなわち、プラットフォーム）について遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値を有する分類子へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を定義済み閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料が細菌に対して陰性である場合には、ウイルス分類子および非感染性分類子だけを用いて、ステップ（ｄ）を繰り返すステップ、ならびに（ｇ）前記試料をウイルス性病因または非感染性疾病であると分類するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
本開示の別の態様は、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）が、細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セットの発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジー（すなわち、プラットフォーム）について遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値を有する分類子へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を定義済み閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料がウイルスに対して陰性である場合には、細菌分類子および非感染性分類子だけを用いて、ステップ（ｄ）を繰り返すステップ、ならびに（ｇ）前記試料を細菌性病因または非感染性疾病であると分類するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
本開示の別の態様は、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）が、細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セットの発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジー（すなわち、プラットフォーム）について遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値を有する分類子へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を定義済み閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料が非感染性疾病に対して陰性である場合には、ウイルス分類子および細菌分類子だけを用いて、ステップ（ｄ）を繰り返すステップ、ならびに（ｇ）前記試料をウイルス性病因または細菌性病因であると分類するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
本開示のさらに別の態様は、対象において病因が不明である急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）を処置する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セット（例えば、１つ、２つ、もしくは３つ、またはそれ超のシグネチャ）の発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジー（すなわち、プラットフォーム）について遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値を有する細菌分類子、ウイルス分類子、および非感染性疾病分類子へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を定義済み閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料を、細菌性病因、ウイルス性病因、または非感染性疾病であると分類するステップ、ならびに（ｇ）ステップ（ｅ）によって同定されているように適切な処置レジメンを前記対象へ施すステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｇ）は、ＡＲＩの病因が細菌であると決定された場合、抗細菌治療を施すことを含む。他の実施形態において、ステップ（ｇ）は、ＡＲＩの病因がウイルスであると決定された場合、抗ウイルス治療を施すことを含む。
別の態様は、細菌性、ウイルス性、および／または非感染性から選択される急性呼吸器病を患っており、またはそのリスクがある対象においてワクチンまたは薬物に対する応答をモニターする方法であって、前記対象の宿主応答を決定するステップを含み、前記決定ステップが、本明細書に教示されているような方法により行われる、方法である。いくつかの実施形態において、前記薬物は抗細菌薬または抗ウイルス薬である。
前記態様のいくつかの実施形態において、前記方法は、ＡＲＩの病因の確率を示すスコアを対象に割り当てる報告を作成するステップをさらに含む。
細菌性、ウイルス性、および／または非感染性から選択される対象における急性呼吸器病の病因を決定するためのシステムであって、少なくとも１つのプロセッサ；対象由来の生物学的試料を受けるように構成された試料入力回路；前記少なくとも１つのプロセッサに連結され、かつ前記生物学的試料の遺伝子発現レベルを決定するように構成された試料分析回路；前記少なくとも１つのプロセッサに連結された入力／出力回路；前記少なくとも１つのプロセッサに連結され、かつデータ、パラメータ、および／または分類子を記憶するように構成された記憶回路；ならびに、前記プロセッサに連結され、かつ前記少なくとも１つのプロセッサにより実行された時、前記少なくとも１つのプロセッサに動作を実施させる、メモリ中に具現されたコンピュータ可読プログラムコードを含むメモリのうち（それらの組合せを含む）の１つまたは複数を含み、前記動作が、前記生物学的試料における定義済みの遺伝子セット（すなわち、シグネチャ）の遺伝子発現レベルの測定を、前記試料分析回路を介して制御／実施すること；前記遺伝子発現レベルを正規化して、正規化遺伝子発現値を生じること；定義済みの遺伝子セットの遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（すなわち、係数）を含む細菌性急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子を前記記憶回路から取り出すこと；細菌性急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子から選択される１つまたは複数の急性呼吸器病分類子へ前記正規化遺伝子発現値を入力すること；前記分類子に基づいた、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病の１つまたは複数についての病因確率を計算すること；ならびに、前記対象における急性呼吸器病が細菌起源か、ウイルス起源か、非感染性起源か、またはそれらのいくつかの組合せかの決定の出力を、前記入力／出力回路を介して制御することを含む、システムがさらに提供される。
いくつかの実施形態において、システムは、遺伝子発現の定量的または半定量的検出をＡＲＩの病因の累積スコアまたは確率へ変換するコンピュータ可読コードを含む。
いくつかの実施形態において、システムは、アレイプラットフォーム、サーマルサイクラープラットフォーム（例えば、多重化および／またはリアルタイムＰＣＲプラットフォーム）、ハイブリダイゼーションおよびマルチシグナルコード化（例えば、蛍光）検出器プラットフォーム、核酸質量分析プラットフォーム、核酸シーケンシングプラットフォーム、またはそれらの組合せを含む。
前記態様のいくつかの実施形態において、定義済みの遺伝子セットは、少なくとも３個の遺伝子シグネチャを含む。
前記態様のいくつかの実施形態において、生物学的試料は、末梢血、痰、鼻咽頭スワブ、鼻咽頭洗浄液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、およびそれらの組合せからなる群から選択される試料を含む。
前記態様のいくつかの実施形態において、細菌分類子は、表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊにおいて細菌分類子の一部として列挙された遺伝子（例えば、前記遺伝子または遺伝子転写産物と相同なオリゴヌクレオチドプローブで、測定可能）のうちの５個、１０個、２０個、３０個、または５０個から８０個、１００個、１５０個、または２００個までの発現レベルを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス分類子は、表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊにおいてウイルス分類子の一部として列挙された遺伝子（例えば、前記遺伝子または遺伝子転写産物と相同なオリゴヌクレオチドプローブで、測定可能）のうちの５個、１０個、２０個、３０個、または５０個から８０個、１００個、１５０個、または２００個までの発現レベルを含む。いくつかの実施形態において、非感染性疾病分類子は、表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊにおいて非感染性疾病分類子の一部として列挙された遺伝子（例えば、前記遺伝子または遺伝子転写産物と相同なオリゴヌクレオチドプローブで、測定可能）のうちの５個、１０個、２０個、３０個、または５０個から８０個、１００個、１５０個、または２００個までの発現レベルを含む。
（ａ）生物学的試料からｍＲＮＡを抽出するための手段；（ｂ）表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊからの５個、１０個、２０個、３０個、または５０個から８０個、１００個、１５０個、または２００個までの遺伝子からの転写産物と相同な領域を有する複数の合成オリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のアレイを作製するための手段；ならびに（ｃ）使用説明書を含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）の病因を決定するためのキットもまた提供される。
本開示の別の態様は、急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子を評価するためにキットを使用する方法であって、（ａ）表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊからの５個、１０個、２０個、３０個、または５０個から８０個、１００個、１５０個、または２００個までの遺伝子と相同な領域を有する複数の合成オリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のアレイを作製するステップ；（ｂ）正規化遺伝子と相同な領域を有するオリゴヌクレオチドを前記アレイに加えるステップ；（ｃ）急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）を患っている対象から生物学的試料を得るステップ；（ｄ）前記試料からＲＮＡを単離して、トランスクリプトームを作製するステップ；（ｅ）（例えば、遺伝子発現のレベルと比例した蛍光または電流を測定することなどにより）前記アレイ上の前記トランスクリプトームを測定するステップ；（ｆ）前記トランスクリプトームの測定値を正規化遺伝子に対して正規化し、分類子を実行するために正規化測定値をコンピュータへ電子的に転送するステップ；（ｇ）報告を作成するステップ、および任意で、（ｈ）前記結果に基づいた適切な処置を施すステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも２つの関連した臨床的属性を含む既知のデータセットに対してＡＲＩ分類子を外部検証するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、データセットは、ＧＳＥ６２６９、ＧＳＥ４２０２６、ＧＳＥ４０３９６、ＧＳＥ２０３４６、ＧＳＥ４２８３４、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
本開示のさらに別の態様は、本明細書に開示および例証されている全てを提供する。
不明の病因の対象での急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）についての処置の方法における、本明細書に教示されているようなＡＲＩ分類子の使用もまた提供される。
本開示の前述の態様および他の特徴は、本明細書において、添付の図面に関連して示された以下の記載で説明される。
本開示の原理の理解を促進することを目的として、今、好ましい実施形態が参照され、それを記載するために特殊言語が用いられる。そうとは言え、本開示の範囲の限定がそれらにより意図されるわけではなく、本明細書に例証されているような本開示のそのような変化およびさらなる改変が、当業者に通常、思い浮かぶように、企図されることは理解されるだろう。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法的対象の１つまたは１つより多いもの（すなわち、少なくとも１つ）を指すように本明細書で用いられる。例として、「１つの要素」は、少なくとも１つの要素を意味し、１つより多い要素を含み得る。
他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。
本開示は、急性呼吸器感染症を引き起こす病原体曝露に応答した、血液中の遺伝子、タンパク質、および代謝産物発現の変化が、高度の精度で、対象におけるＡＲＩの病因を同定し、かつ特徴づけるために用いられ得ることを提供する。
定義
本明細書で用いられる場合、用語「急性呼吸器感染症」または「ＡＲＩ」は、しばしば細菌性またはウイルス性病原体による、上気道または下気道の感染と一致した症状および／または身体的所見（例えば、咳、喘鳴、発熱、咽喉痛、うっ血などの症状；心拍数の上昇、呼吸数の上昇、異常な白血球数、低い動脈血二酸化炭素分圧（ＰａＣＯ２）などの身体的所見）を示し、かつ数時間～数日間にわたって症状の急速な進行によって特徴づけられる感染症または疾病を指す。ＡＲＩは、主に、上気道（ＵＲＩ）、下気道（ＬＲＩ）、またはその２つの組合せについてであり得る。ＡＲＩは、気道の範囲を超える感染の広がりにより、または免疫応答により誘導されたコラテラルダメージにより全身作用を生じ得る。前者の例は、血流へ広がっている黄色ブドウ球菌肺炎を含み、心内膜炎（心臓弁の感染）、化膿性関節炎（関節感染）、または骨髄炎（骨感染）を含む感染の二次部位を生じ得る。後者の例は、急性呼吸促迫症候群および呼吸不全をもたらすインフルエンザ肺炎を含む。
本明細書で用いられる場合、用語「急性呼吸器感染症」または「ＡＲＩ」は、しばしば細菌性またはウイルス性病原体による、上気道または下気道の感染と一致した症状および／または身体的所見（例えば、咳、喘鳴、発熱、咽喉痛、うっ血などの症状；心拍数の上昇、呼吸数の上昇、異常な白血球数、低い動脈血二酸化炭素分圧（ＰａＣＯ２）などの身体的所見）を示し、かつ数時間～数日間にわたって症状の急速な進行によって特徴づけられる感染症または疾病を指す。ＡＲＩは、主に、上気道（ＵＲＩ）、下気道（ＬＲＩ）、またはその２つの組合せについてであり得る。ＡＲＩは、気道の範囲を超える感染の広がりにより、または免疫応答により誘導されたコラテラルダメージにより全身作用を生じ得る。前者の例は、血流へ広がっている黄色ブドウ球菌肺炎を含み、心内膜炎（心臓弁の感染）、化膿性関節炎（関節感染）、または骨髄炎（骨感染）を含む感染の二次部位を生じ得る。後者の例は、急性呼吸促迫症候群および呼吸不全をもたらすインフルエンザ肺炎を含む。
本明細書で用いられる場合、用語「シグネチャ」は、特定の組合せが、特定された生物学的状態の存在または非存在を表す、１セットの生物学的分析物および前記分析物の測定可能な量を指す。これらのシグネチャは、既知の状態を有する（例えば、確認された呼吸器細菌感染、呼吸器ウイルス感染を有する、または非感染性疾病を患っている）複数の対象において発見されており、関心対象となる１つまたは複数のカテゴリーまたは結果を（個々に、または合同で）識別する。生物学的マーカーとしても知られたこれらの測定可能な分析物は、遺伝子発現レベル、タンパク質もしくはペプチドレベル、または代謝産物レベルであり得る（しかし、それらに限定されない）。Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅらの米国特許公開第２０１５／０２２７６８１号；Ｅｄｅｎらの米国特許公開第２０１６／０１５３９９３号もまた参照。
本明細書に開示されているようないくつかの実施形態において、「シグネチャ」は、発現レベルが、本明細書に教示されているような分類子へ取り込まれた場合、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病などの状態を識別する、遺伝子の特定の組合せである。例えば、下記の表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および表１４Ａから１４Ｊを参照。いくつかの実施形態において、シグネチャは、呼吸器ウイルスもしくは細菌の種について感知しない（すなわち、ウイルスと細菌とを区別するが、それは、ウイルスまたは細菌の特定の属間または種間を区別しない）、および／または非感染性疾病の特定の原因について感知しない。
本明細書で用いられる場合、用語「分類子（classifier）」および「予測子（predictor）」は交換可能に用いられ、カテゴリーへ割り当てることを目的として、所定の観察結果または個々の患者についてスコアを生じるように、シグネチャの値（例えば、定義された遺伝子セットについての遺伝子発現レベル）および各シグネチャ成分についての決定済みの係数（または重み）を用いる数学関数を指す。分類子は、線形および／または確率的であり得る。スコアが、一連の係数により重み付けられたシグネチャ値の合計の関数である場合には、分類子は線形である。さらに、シグネチャ値の関数が確率を生じる場合には、分類子は確率的であり、０から１．０の間（または０％から１００％の間）の値が、それぞれ、対象または観察結果が特定のカテゴリーに属し、または特定の結果を生じだろう見込みを数量化する。プロビット回帰分析およびロジスティック回帰分析は、確率を生じさせるために、それぞれ、プロビット関数およびロジスティックリンク関数を用いる確率的線形分類子の例である。
本明細書で教示されているような分類子は、「訓練」として知られた手順によって得ることができ、その手順は、既知のカテゴリーメンバーシップ（例えば、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および／または非感染性疾病）に関する観察結果を含有するデータセットを用いる。図１参照。具体的には、訓練は、最適なシグネチャに加えて、所定のシグネチャの各成分（例えば、遺伝子発現レベル成分）についての最適な係数（すなわち、重み）を見出すことを目指し、最適な結果は、最高の達成可能な分類精度によって決定される。
「分類」は、急性呼吸器症状を患っており、またはそれらのリスクがある対象を１つまたは複数のカテゴリーまたは結果（例えば、患者が病原体に感染している、または感染していない、別のカテゴリー化は、患者がウイルスに感染し、および／または細菌に感染していることであり得る）に割り当てる方法を指す。図３参照。場合によっては、対象は、１つより多いカテゴリーに分類され得る（例えば、細菌とウイルスの同時感染の場合）。結果またはカテゴリーは、分類子によって提供されたスコアの値によって決定され、その値は、カットオフ値または閾値、信頼水準または限界と比較され得る。他のシナリオにおいて、特定のカテゴリーに属する確率が示され得る（例えば、分類子が確率を報告する場合）。
本明細書で用いられる場合、遺伝子発現レベルと共に用いられる時の用語「示す（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ）」とは、遺伝子発現レベルが、代替の生物学的状態（例えば、細菌性ＡＲＩまたはウイルス性ＡＲＩ）または対照における発現レベルと比較して、上方制御もしくは下方制御され、変更され、または変化していることを意味する。タンパク質レベルと共に用いられる時の用語「示す」は、タンパク質レベルが、標準タンパク質レベルまたは代替の生物学的状態におけるレベルと比較して、高く、もしくは低く、増加もしくは減少し、変更され、または変化していることを意味する。
用語「対象」および「患者」は、交換可能に用いられ、検査、研究、または処置されることになっている任意の動物を指す。本開示が任意の特定の型の対象に限定されることは意図されない。本発明のいくつかの実施形態において、ヒトは好ましい対象であるが、他の実施形態においては、非ヒト動物が好ましい対象であり、それには、マウス、サル、クロアシイタチ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、イヌ、ネコ、ウマ、および爬虫類が含まれるが、それらに限定されない。ある特定の実施形態において、対象は、ＡＲＩを患っており、またはＡＲＩ様症状を示している。
本明細書で用いられる場合、「プラットフォーム」または「テクノロジー」は、本開示に従って、シグネチャ、例えば、遺伝子発現レベルを測定するために用いられ得る機器（例えば、器械および関連部品、コンピュータ、本明細書に教示されているような１つまたは複数のデータベースを含むコンピュータ可読媒体、試薬など）を指す。プラットフォームの例には、アレイプラットフォーム、サーマルサイクラープラットフォーム（例えば、多重化および／またはリアルタイムＰＣＲプラットフォーム）、核酸シーケンシングプラットフォーム、ハイブリダイゼーションおよびマルチシグナルコード化（例えば、蛍光）検出器プラットフォームなど、核酸質量分析プラットフォーム、磁気共鳴プラットフォーム、およびそれらの組合せが含まれるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、プラットフォームは、遺伝子発現レベルを半定量的に測定するように構成され、すなわち、別個または絶対的な発現において測定するのではなく、発現レベルは、推定値として、および／またはお互い、もしくは特定されたマーカー（例えば、別の「標準」または「参照」遺伝子の発現）と比べて測定される。
いくつかの実施形態において、半定量的測定には、シグネチャ内の遺伝子の推定または相対的発現レベルを提供するために、特定されたｍＲＮＡを示すシグナルが検出されるまでＰＣＲサイクルを実施し、検出まで必要とされるＰＣＲサイクルの数を用いる「リアルタイムＰＣＲ」が含まれる。
リアルタイムＰＣＲプラットフォームには、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（ＴＬＤＡ）が含まれ、そのＴＬＤＡにおいて、試料が、リアルタイムＰＣＲが実施されるウェルのコレクションを有するアレイカード上で、多重化逆転写、続いてリアルタイムＰＣＲを受ける。Ｋｏｄａｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４９（６）：２１７５－２１８２参照。リアルタイムＰＣＲプラットフォームにはまた、例えば、Ｂｉｏｃａｒｔｉｓ Ｉｄｙｌｌａ（商標）の試料調製から結果までのテクノロジーが含まれ、そのテクノロジーにおいて、細胞が溶解され、ＤＮＡ／ＲＮＡが抽出され、リアルタイムＰＣＲが実施され、結果が検出される。
磁気共鳴プラットフォームには、例えば、Ｔ２ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｔ２磁気共鳴（Ｔ２ＭＲ（登録商標））テクノロジーが含まれ、そのテクノロジーにおいて、分子標的が、生物学的試料において、精製の必要性なしに同定され得る。
用語「アレイ」、「マイクロアレイ」、および「マイクロアレイ」は交換可能であり、支持体上に提示されたヌクレオチド配列のコレクションの配置を指す。任意の型のアレイが、本明細書に提供された方法において利用することができる。例えば、アレイは、スライドガラスなどの固体支持体（固相アレイ）、またはニトロセルロース膜などの半流動性支持体上にあり得る。アレイはまた、ビーズ上に提示され得、すなわち、ビーズアレイであり得る。これらのビーズは、典型的には、微視的であり、例えば、ポリスチレンで作製され得る。アレイはまた、ナノ粒子上に提示され得、そのナノ粒子は、例えば、特に金であるが、銀、パラジウム、またはプラチナでも作製され得る。例えば、金ナノ粒子プローブテクノロジーを用いるＮａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｖｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）システムを参照。磁気ナノ粒子もまた用いられ得る。他の例には、核磁気共鳴マイクロコイルが含まれる。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）などのヌクレオチド類似体など）であり得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡよりむしろスプライスされた、または成熟ＲＮＡ種の遺伝子発現を検出するためにエクソン／イントロン境界に及ぶ。ヌクレオチド配列はまた、遺伝子由来の部分配列、プライマー、全遺伝子配列、非コード配列、コード配列、公表された配列、既知の配列、または新規の配列であり得る。アレイは、追加として、タンパク質または代謝産物を特異的に結合する、抗体、ペプチド、タンパク質、組織、細胞、化学物質、糖質などの他の化合物を含み得る。
アレイプラットフォームには、例えば、上記で言及されたＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（ＴＬＤＡ）、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）マイクロアレイプラットフォームが含まれる。
ハイブリダイゼーションおよびマルチシグナルコード化検出器プラットフォームには、例えば、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）テクノロジー（（例えば、関心対象となる遺伝子発現転写産物に対応する）標的特異的プローブに付着した色コード化バーコードのハイブリダイゼーションが検出される）、およびＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）テクノロジー（マイクロスフェアビーズが、色コード化され、かつ検出用の標的（例えば、遺伝子発現転写産物）特異的プローブでコーティングされている）、およびＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＢｅａｄＡｒｒａｙ（マイクロビーズが光ファイバー束または平面シリカスライド上へ集められ、かつ検出用の標的（例えば、遺伝子発現転写産物）特異的プローブでコーティングされている）が含まれる。
核酸質量分析プラットフォームには、例えば、Ｉｂｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｌｅｘ－ＩＤ（登録商標）検出器が含まれ、その検出器において、ＤＮＡ質量分析法が、質量プロファイルを用いて増幅ＤＮＡを検出するのに用いられている。
サーマルサイクラープラットフォームには、例えば、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）多重ＰＣＲシステム（未処理の試料から核酸を抽出および精製し、ネステッド多重ＰＣＲを実施する）、およびＲａｉｎＤｒｏｐデジタルＰＣＲシステム（マイクロ流体チップを用いる液滴に基づいたＰＣＲプラットフォームである）が含まれる。
用語「コンピュータ可読媒体」は、情報（例えば、データおよび命令）を記憶し、コンピュータプロセッサへ供給するための任意のデバイスまたはシステムを指す。コンピュータ可読媒体の例には、ＤＶＤ、ＣＤ、ハードディスクドライブ、磁気テープ、ならびにネットワーク上でのストリーミングメディアおよびアプリケーション（例えば、スマートフォンおよびタブレットに見出されるもの）のためのサーバーが含まれるが、それらに限定されない。様々な実施形態において、データ構造および方法を含む本発明の態様は、コンピュータ可読媒体に記憶され得る。プロセシングおよびデータもまた、多数のデバイス型で実行され得、そのデバイス型には、デスクトップおよびラップトップコンピュータ、タブレット、スマートフォンなどが含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、用語「生物学的試料」は、本明細書に提供された方法において用いることができる遺伝物質を含有する、対象から採取され得る任意の試料を含む。例えば、生物学的試料は、末梢血試料を含み得る。用語「末梢血試料」は、循環系において循環する血液、または身体のその系から採取された血液の試料を指す。他の試料は、上気道から採取されたものを含み得、それには、痰、鼻咽頭スワブ、および鼻咽頭洗浄液が含まれるが、それらに限定されない。生物学的試料はまた、下気道から採取された試料を含み得、それには、気管支肺胞洗浄液および気管内吸引物が含まれるが、それらに限定されない。生物学的試料はまた、それらの任意の組合せを含み得る。
用語「遺伝物質」は、生物体の細胞の核またはミトコンドリアにおける遺伝情報を保存するために用いられる物質を指す。遺伝物質の例には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡが含まれるが、それらに限定されない。
用語「複数の核酸オリゴマー」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る、２つ以上の核酸オリゴマーを指す。
本明細書で用いられる場合、用語「処置する」、「処置」、および「処置すること」は、１つまたは複数の治療の施与に起因する、疾患または障害または１つもしくは複数の症状の重症度、持続期間、および／または進行の低下または改善を指す。そのような用語は、ウイルスもしくは細菌の複製の低下、またはウイルスもしくは細菌の対象における他の器官もしくは組織への、もしくは他の対象への伝播の低下を指す。処置はまた、アレルギー処置、喘息処置などの非感染性疾病に起因するＡＲＩについての治療を含み得る。
用語「有効量」は、対象において生理学的効果を発揮するのに十分である治療剤の量を指す。用語「応答性」は、対象における遺伝子の遺伝子発現レベルの、前記対象がウイルスもしくは細菌に感染し、または非感染性疾病を患っていることに応答した、ウイルス、細菌に感染しておらず、もしくは非感染性疾病を患っていない対象、または対照の対象における前記遺伝子の遺伝子発現レベルとの比較における変化を指す。
用語「適切な処置レジメン」は、特定の疾患または障害を処置するのに必要とされるケアの標準を指す。そのようなレジメンが、疾患状態において治癒的効果を生じる能力がある治療剤を対象に投与する行為を必要とする場合が多い。例えば、菌血症を有する対象を処置するための治療剤は、抗生物質であり、それには、ペニシリン、セファロスポリン、フルオロキノロン、テトラサイクリン、マクロライド、およびアミノグリコシドが含まれるが、それらに限定されない。ウイルス性呼吸器感染症を有する対象を処置するための治療剤には、オセルタミビル、ＲＮＡｉ抗ウイルス剤、吸入リバビリン、モノクローナル抗体レスピガム、ザナミビル、およびノイラミニダーゼブロッキング剤が含まれるが、それらに限定されない。本発明は、まだ利用できない抗ウイルス剤または抗生物質での処置を決定するための本発明の方法の使用を企図する。適切な処置レジメンにはまた、非感染性疾病に起因するＡＲＩについての処置が含まれ、その処置は、例えば、非限定的に、抗ヒスタミン剤、うっ血除去薬、抗コリン性点鼻薬、ロイコトリエン阻害剤、マスト細胞阻害剤、ステロイド性点鼻薬などの投与を含むアレルギー処置；および、非限定的に、吸入コルチコステロイド、ロイコトリエン修飾薬、長時間作用性β作動薬、混合吸入器（例えば、フルチカゾン－サルメテロール；ブデソニド－ホルモテロール；モメタゾン－ホルモテロールなど）、テオフィリン、短時間作用性β作動薬、イプラトロピウム、経口および静脈内コルチコステロイド、オマリズマブなどを含む喘息処置などである。
そのようなレジメンは、疾患状態に関連した症状の低下を生じる能力がある治療剤を対象に投与する行為を必要とする場合が多い。そのような治療剤の例には、ＮＳＡＩＤＳ、アセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤、β作動薬、鎮咳剤、または疾患過程に付随した症状を低下させる他の薬物が含まれるが、それらに限定されない。
分類子を作製する方法（訓練）
本開示は、対象における急性呼吸器病の病因を決定する方法に用いられる分類子を作製する方法（訓練１０とも呼ばれる）を提供する。対象におけるＡＲＩの病因を高度の精度で同定し、かつ特徴づけるために用いることができる、遺伝子発現に基づいた分類子が開発されている。
本開示は、対象における急性呼吸器病の病因を決定する方法に用いられる分類子を作製する方法（訓練１０とも呼ばれる）を提供する。対象におけるＡＲＩの病因を高度の精度で同定し、かつ特徴づけるために用いることができる、遺伝子発現に基づいた分類子が開発されている。
このゆえに、図１に示されているように、本開示の一態様は、急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子を作製する方法であって、（ｉ）細菌性、ウイルス性、または非感染性急性呼吸器感染症を患っている複数の対象から生物学的試料（例えば、末梢血試料）を得るステップ１００；（ｉｉ）任意で、前記試料からＲＮＡ（例えば、トランスクリプトームを作製するための全ＲＮＡ）を単離するステップ（１０５、図１に示されず）；（ｉｉｉ）複数の遺伝子（すなわち、前記ＲＮＡにおいて発現した遺伝子の一部または全部）の遺伝子発現レベルを測定するステップ１１０；（ｉｖ）前記遺伝子発現レベルを正規化するステップ１２０；および（ｖ）前記結果に基づいて、細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、または非感染性疾病分類子を作製するステップ１３０を含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
いくつかの実施形態において、試料は、収集後精製されない。いくつかの実施形態において、試料は、細胞の溶解の前または後に、外来性材料を除去するために精製され得る。いくつかの実施形態において、試料は、細胞溶解および細胞材料の取り出し、核酸の単離、ならびに／またはグロビンもしくはリボソームＲＮＡなどの大量の転写産物の低減を以て精製される。
いくつかの実施形態において、遺伝子発現レベルを測定することは、前記トランスクリプトームを用いて１つまたは複数のマイクロアレイを作製するステップ；複数のプライマーを用いて前記トランスクリプトームを測定するステップ；バッチ差を分析し、補正するステップを含み得る。
いくつかの実施形態において、方法は、作製された分類子についての最終遺伝子標的リスト、関連した重み（Ｗｎ）、および閾値を１つまたは複数のデータベースへアップロードするステップ１４０をさらに含む。
前記分類子を作製する例は図２に詳述されている。図２に示されているように、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病を包含する患者のコホートからの生物学的試料は、各状態（すなわち、細菌性急性呼吸器感染症、ウイルス性急性呼吸器感染症、または非感染性原因の疾病）についての遺伝子発現に基づいた分類子を開発するために用いられる。具体的には、細菌性ＡＲＩ分類子は、ウイルス性ＡＲＩかまたは非感染性疾病のいずれかに対して細菌性ＡＲＩを有するものを確実に同定するために獲得される。ウイルス性ＡＲＩ分類子は、細菌性ＡＲＩまたは非感染性疾病（ＮＩ）に対してウイルス性ＡＲＩを有するものを確実に同定するために獲得される。非感染性疾病分類子は、細菌性およびウイルス性ＡＲＩ分類子特異度を向上させるために作製される。次に、細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子についてのシグネチャが（例えば、スパースロジスティック回帰モデルを適用することにより）作製される。
その後、これらの３つの分類子は、必要に応じて、最大メンバーシップ確率がクラスラベルを指定する一対多スキームに従うことにより「ＡＲＩ分類子」と名付けられた単一の分類子へ統合され得る。図５もまた参照。統合ＡＲＩ分類子は、いくつかの実施形態において、それが導かれた同じ集団における一個抜き交差検証を用いて検証され得、および／または、いくつかの実施形態において、既知の病因の疾病を患っている対象由来の試料の公的に利用可能なヒト遺伝子発現データセットを用いて検証され得る。例えば、検証は、公的に利用可能なヒト遺伝子発現データセット（例えば、ＧＳＥ６２６９、ＧＳＥ４２０２６、ＧＳＥ４０３９６、ＧＳＥ２０３４６、および／またはＧＳＥ４２８３４）を用いて実施され得、そのデータセットは、それらが少なくとも２つの臨床群（細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病）を含むという条件で選択されている。
分類子は、既知の病因の疾病、すなわち、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病を患っている対象由来の試料の標準セットにおいて検証され得る。
本明細書に記載された訓練のための方法論は、当業者により、異なる遺伝子発現検出（例えば、ｍＲＮＡ検出および定量化）プラットフォームへ容易に書き換えられ得る。
本開示の方法およびアッセイは、遺伝子発現に基づいて、例えば、ＲＮＡの直接的測定、誘導された材料（例えば、ｃＤＮＡ）の測定、およびＲＮＡ産物（例えば、コード化タンパク質またはペプチド）の測定を通してであり得る。遺伝子発現を抽出およびスクリーニングする任意の方法が用いられ得、本開示の範囲内である。
いくつかの実施形態において、測定は、試料におけるｍＲＮＡの検出および定量化（例えば、半定量化）を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子発現レベルは、１つまたは複数の標準遺伝子レベルに対して調整される（「正規化」）。当技術分野において知られているように、正規化は、（例えば、発現した遺伝子の）量または相対的量を与えるプラットフォームに固有の技術的変動性を除去するために行われる。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの検出および定量化は、まず、逆転写および／または増幅ステップ、例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＲなどのＲＴ－ＰＣＲを含み得る。いくつかの実施形態において、検出および定量化は、生物学的試料に存在し、またはそれから精製された非増幅ｍＲＮＡ分子に基づき得る。ＲＮＡ分子の直接的検出および測定は、典型的には、相補性プライマーおよび／または標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む。そのような方法には、伝統的なノーザンブロッティングおよび表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）（それは、遺伝子特異的プローブを有するプラズモン活性金属構造の表面に曝された試料にレーザーを照射し、それが散乱させるにつれての光周波数の変化を測定することを含む）が含まれる。
同様に、ｃＤＮＡなどのＲＮＡ誘導体の検出は、典型的には、相補性プライマーおよび／または標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む。これには、高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイ（例えば、固体マクロアレイおよびビーズアレイ）または関連したプローブ－ハイブリダイゼーション方法、ならびに特定のＲＮＡ分子の相対的および絶対的定量化のためのリアルタイム、デジタル、およびエンドポイントＰＣＲ方法を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた増幅および検出が含まれ得る。
追加として、シーケンシングに基づいた方法が、ＲＮＡまたはＲＮＡ由来材料レベルを検出および定量化するために用いることができる。ＲＮＡに適用される場合、シーケンシング方法は、ＲＮＡｓｅｑと呼ばれ、試料由来のＲＮＡ分子に関する定性的情報（試料中のＲＮＡ、またはそれの同族ｃＤＮＡの配列または存在／非存在）と定量的情報（コピー数）の両方を提供する。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １０（１）：５７－６３参照。別の配列に基づいた方法である、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）は、ＲＮＡ分子の発現レベルを測定するための代理としてｃＤＮＡ「タグ」を用いる。
さらに、ｍＲＮＡ検出および定量化のための専売のプラットフォームの使用もまた、本開示の方法を履行するために用いられ得る。これらの例は、ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＩＮＣ．により開発されたＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｅｘｉｎｇ（商標）に組み入れられているＰｉｘｅｌ（商標）システム、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現システム；Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のｍＲＮＡ－Ｓｅｑ、Ｔａｇ－Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）テクノロジー、およびＶｅｒａＣｏｄｅ、ＰｒｉｍｅｒａＤｘ社のＩＣＥＰｌｅｘシステム、ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０多重アッセイである。
例として、対象由来の全血からのＲＮＡは、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）などのＲＮＡ保存試薬を用いて収集することができる。ＲＮＡは、標準ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）またはＶｅｒｓａｇｅｎｅ（商標）（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）ＲＮＡ抽出プロトコールを用いて抽出することができる。Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ（商標）キットは、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）ＲＮＡチューブからより多い収量のより高い品質のＲＮＡを生じる。ＲＮＡ抽出後、全血グロビン低減のためにＧＬＯＢＩＮＣＩｅａｒ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）を用いることができる。（この方法は、グロビンｍＲＮＡを結合するためにビーズ－オリゴヌクレオチド構築物を用い、本発明者らの実験において、本発明者らは、グロビンｍＲＮＡの９０％より多くを除去することができる。）テクノロジーによって、大量かつ関心対象外の転写産物の除去は、マイクロアレイプラットフォームに関してなど、アッセイの感度を増加させ得る。
ＲＮＡの品質は、いくつかの手段により評価することができる。例えば、ＲＮＡ品質は、抽出後すぐに、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて評価することができる。この分析は、ＲＮＡ品質の定量的測定値としてＲＮＡ完全性数（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）（ＲＩＮ）を提供する。また、グロビン低減後、試料は、グロビン低減標準と比較することができる。加えて、スケーリング因子およびバックグラウンドは、マイクロアレイとのハイブリダイゼーション後に評価することができる。
リアルタイムＰＣＲは、全血試料から遺伝子発現を迅速に同定するために用いられ得る。例えば、単離されたＲＮＡは、逆転写され、その後、増幅され、生じるｄｓＤＮＡの間に挿入される非特異的蛍光色素、またはプローブのそれの相補性ＤＮＡ標的とのハイブリダイゼーション後のみ検出を可能にする蛍光レポーターで標識された配列特異的ＤＮＡプローブを用いてリアルタイムで検出され得る。
このゆえに、本明細書に開示された方法に従ってプラットフォームにより用いられ得るｍＲＮＡ定量化および検出の多くの方法があることは理解されているはずである。
発現レベルは、典型的には、当業者により日常的に実践される方法を用いて、特定のプラットフォームに応じて、検出および定量化後、正規化される。
プラットフォームに適切な、ｍＲＮＡ検出および定量化、ならびにマッチド正規化の方法論に関して、それは単に、訓練方法のために注意深く選択され、かつ判定された患者試料を用いるかどうかである。例えば、下に記載されたコホートは、プラットフォームについての分類子において３つのシグネチャにおける遺伝子と共に用いられ得る適切な重み付け値（係数）を導くために用いられた。これらの対象－試料はまた、異なるｍＲＮＡ検出および定量化プラットフォームを用いて実行される試験についての係数およびカットオフを導くために用いることができた。
いくつかの実施形態において、分類子の個々のカテゴリー（すなわち、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、非感染性疾病）は、様々なそのようなそれの原因を包括するコホートから形成される。例えば、細菌性ＡＲＩ分類子は、複数の細菌の属および／または種からの細菌感染を有するコホートから得られ、ウイルス性ＡＲＩ分類子は、複数のウイルスの属および／または種からのウイルス感染を有するコホートから得られ、非感染性疾病分類子は、複数の非感染性原因による非感染性疾病を有するコホートから得られる。例えば、表９Ａ、９Ｂ参照。このようにして、得られたそれぞれの分類子は、根底にある細菌、ウイルス、および非感染性の原因について感知しない。いくつかの実施形態において、コホートにおける非感染性病因を有する対象の一部または全部は、呼吸器感染症と一致した症状を有する。
いくつかの実施形態において、シグネチャは、選択された患者試料セットを用いる訓練過程中に表現型を分離するそれらの能力によるモデルによって遺伝子セットが同定される、スパース線形分類として知られた、教師ありの統計的アプローチを用いて得ることができる。訓練の結果は、その３つの比較のための遺伝子シグネチャおよび分類係数である。シグネチャおよび係数が合わせて、分類子または予測子を提供する。訓練はまた、閾値またはカットオフ値を確立するために用いられ得る。閾値またはカットオフ値は、試験性能、例えば、試験感度および特異度を変化させるために調整することができる。例えば、細菌性ＡＲＩについての閾値は、必要に応じて、細菌感染についての試験の感度を増加させるために意図的に下げられ得る。
いくつかの実施形態において、分類子作製は、（ｉ）それぞれの正規化遺伝子発現値についての重みを割り当て、各遺伝子についての重みおよび発現値を分類子（例えば、線形回帰分類子）方程式へ入力し、複数の対象のそれぞれについての結果に対してスコアを決定するステップ、その後、（ｉｉ）複数の対象にわたって各結果についての分類の精度を決定するステップ、および、その後、（ｉｉｉ）分類の精度が最適化されるまで重みを調整するステップを、繰り返して含む。非ゼロ重みを有する遺伝子がそれぞれの分類子に含まれる。
いくつかの実施形態において、分類子は、線形回帰分類子であり、前記作製は、リンク関数を用いて前記分類子のスコアを確率へ変換するステップを含む。当技術分野において知られているように、リンク関数は、モデルの標的／出力（例えば、細菌感染の確率）と線形モデルの系統的成分（この場合、予測子を含む説明変数の組合せ）の間のリンクを特定する。それは、どのように、応答の期待値が説明変数の線形予測子に関連しているかを示す。
分類の方法
本開示は、患者が有する呼吸器病が、細菌感染よるのか、ウイルス感染によるのか、または非感染性原因によるのかを決定するための方法をさらに提供する。この決定を行うための方法は、本明細書に教示されているように得られた分類子の使用に頼る。その方法は、ａ）定義済みの遺伝子セット（すなわち、その３つのシグネチャの１つまたは複数について）の発現レベルを測定するステップ；ｂ）前記測定を行うために用いられたテクノロジーについて遺伝子発現レベルを正規化するステップ；ｃ）それらの値を取り出し、それらを、各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する細菌分類子、ウイルス分類子、および／または非感染性疾病分類子（すなわち、予測子）へ入力するステップ；ｄ）定義済みの閾値、カットオフ値、感染の見込みを示す信頼区間または値の範囲と分類子の出力を比較するステップ；および任意で、ｅ）分類子の結果を一緒に報告するステップを含み得る。
本開示は、患者が有する呼吸器病が、細菌感染よるのか、ウイルス感染によるのか、または非感染性原因によるのかを決定するための方法をさらに提供する。この決定を行うための方法は、本明細書に教示されているように得られた分類子の使用に頼る。その方法は、ａ）定義済みの遺伝子セット（すなわち、その３つのシグネチャの１つまたは複数について）の発現レベルを測定するステップ；ｂ）前記測定を行うために用いられたテクノロジーについて遺伝子発現レベルを正規化するステップ；ｃ）それらの値を取り出し、それらを、各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する細菌分類子、ウイルス分類子、および／または非感染性疾病分類子（すなわち、予測子）へ入力するステップ；ｄ）定義済みの閾値、カットオフ値、感染の見込みを示す信頼区間または値の範囲と分類子の出力を比較するステップ；および任意で、ｅ）分類子の結果を一緒に報告するステップを含み得る。
そのような方法の単純な概観は図３に提供されている。この表示において、３つの遺伝子シグネチャのそれぞれが、異なるＡＲＩ病因（細菌性またはウイルス性）、または感染していないが疾病の状態（ＮＩ）に対する患者の宿主応答の情報を与える。これらのシグネチャは、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または感染していないが疾病の状態である３つの臨床状態のうちの１つに応答して、一貫し、かつ協調した発現レベルの増加または減少を生じる遺伝子転写産物の群である。これらのシグネチャは、注意深く判定された、関心対象となる状態を有する患者試料群を用いて、導かれる（訓練１０）。
図３に関して、患者から生物学的試料（例えば、血液試料）を得た後、いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡが抽出される。ｍＲＮＡ（または各ｍＲＮＡの確定した領域）が、シグネチャにおける遺伝子の全部または部分集合について定量化される。定量化に用いられる機器に依存して、ｍＲＮＡは、最初に試料から精製されなければならない場合がある。
シグネチャは、臨床状態の反映であり、その他の２つの可能性の少なくとも１つと比べて定義される。例えば、細菌性ＡＲＩシグネチャは、細菌性ＡＲＩを有する患者と細菌性ＡＲＩをもたない患者（ウイルス性ＡＲＩ、またはこの適用に属する場合、非感染性疾病を有する患者を含む）を区別する１群のバイオマーカー（本明細書では、遺伝子ｍＲＮＡ転写産物により表される）として同定される。ウイルス性ＡＲＩシグネチャは、ウイルス性ＡＲＩを有する患者とウイルス性ＡＲＩをもたない患者（細菌性ＡＲＩか非感染性疾病のいずれかを有する患者を含む）を区別する１群のバイオマーカーにより定義される。非感染性疾病シグネチャは、非感染性病因を有する患者を、細菌性またはウイルス性のいずれかのＡＲＩを有する患者に対して区別する１群のバイオマーカーにより定義される。
シグネチャの各遺伝子（例えば、表１０Ａから表１０Ｆの第１列）の正規化発現レベルは、分類子に用いられる説明的または独立的な変数または特徴である。例として、分類子は、プロビット回帰式としての一般形を有し得る：
Ｐ（ｈａｖｉｎｇ条件）＝Φ（β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋ …＋βｄＸｄ）（式１）
式中、条件は細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病である；Φ（．）はプロビット（またはロジスティックなど）リンク関数である；｛β１，β２，…，βｄ｝は、訓練中に得られる係数（例えば、表１０Ａから表１０Ｆからの第２列、第３列、および第４列）である（係数はまた、本明細書で「重み」として｛ｗ１，ｗ２，…，ｗｄ｝と表され得る）；｛Ｘ１，Ｘ２，…，Ｘｄ｝は、シグネチャの正規化遺伝子発現レベルである；ならびに、ｄはシグネチャのサイズ（すなわち、遺伝子の数）である。
Ｐ（ｈａｖｉｎｇ条件）＝Φ（β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋ …＋βｄＸｄ）（式１）
式中、条件は細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病である；Φ（．）はプロビット（またはロジスティックなど）リンク関数である；｛β１，β２，…，βｄ｝は、訓練中に得られる係数（例えば、表１０Ａから表１０Ｆからの第２列、第３列、および第４列）である（係数はまた、本明細書で「重み」として｛ｗ１，ｗ２，…，ｗｄ｝と表され得る）；｛Ｘ１，Ｘ２，…，Ｘｄ｝は、シグネチャの正規化遺伝子発現レベルである；ならびに、ｄはシグネチャのサイズ（すなわち、遺伝子の数）である。
当業者により理解されているように、各説明変数についての係数の値は、プロビット回帰モデルに用いられる遺伝子または遺伝子の部分集合の発現を測定するために用いられるテクノロジープラットフォームごとに変化する。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａ ２．０マイクロアレイにより測定される遺伝子発現について、分類子アルゴリズムにおける特徴のそれぞれについての係数は表１０Ａから表１０Ｆに示されている。
各分類子の感度、特異度、および全体的な精度は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、分類についての閾値を変化させることにより最適化され得る。
本開示の別の態様は、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）が細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セットの発現レベル（すなわち、３つのシグネチャ）を評価することにより決定するステップ、ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジーについて遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、ｄ）前記正規化値を、各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する細菌分類子、ウイルス分類子、および非感染性疾病分類子（すなわち、予測子）へ入力するステップ、ｅ）前記分類子の出力を定義済み閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、ならびにｅ）前記試料を細菌性病因、ウイルス性病因、または非感染性疾病であると分類するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＡＲＩの病因の確率を示すスコアを患者に割り当てる報告を作成するステップをさらに含む。
訓練中、訓練試料セットを用いて開発される分類子は、新しい個体を診断する（「分類」）ための予測を目的として適用される。各対象または患者について、生物学的試料が採取され、訓練中に見出されたシグネチャにより特定された遺伝子のそれぞれの、試料における正規化発現レベル（すなわち、相対的ｍＲＮＡ発現量）が、分類子についての入力である。分類子はまた、各遺伝子について訓練中に発見された重み付け係数を用いる。出力として、分類子は、３つの確率値を計算するために用いられる。各確率値は、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病である３つの考えられる臨床状態の見込みを決定するために用いられ得る。
いくつかの実施形態において、分類子のそれぞれの結果、すなわち、新しい対象または患者が細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病を有する確率が報告される。最終的な形において、対応する係数を有する３つのシグネチャが、個々の患者に適用されて、３つの確率値、すなわち、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病を有する確率を得る。いくつかの実施形態において、これらの値は、分類がなされる信頼度を示す参照範囲と比べて報告され得る。いくつかの実施形態において、分類子の出力は、閾値と比較されて、例えば、分類子スコアまたは確率が、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病の１つまたは複数の存在を示す閾値を超える場合、「陽性」と報告し得る。分類子スコアまたは確率が、閾値に達することができない場合には、その結果は、そのそれぞれの条件について「陰性」と報告される。任意で、細菌性およびウイルス性ＡＲＩについての値だけが報告され、その報告は、疾病を患っているが、感染していないことの見込みに関しては言及しない。
１つのプラットフォームで得られた分類子が別のプラットフォームで最適な性能を示さない可能性があることは留意されるべきである。これは、プローブの***雑、またはプラットフォームに特有の他の技術的問題のせいであり得る。したがって、１つのプラットフォームからの本明細書に教示されているようなシグネチャを別のプラットフォームに適応させるための方法もまた本明細書に記載される。
例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームから得られたシグネチャは、前記シグネチャにおける遺伝子および／またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームについての前記シグネチャにおける遺伝子と相関した代わりの遺伝子について、対応するＴＬＤＡプローブの使用により、ＴＬＤＡプラットフォームに適応され得る。表１は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブおよびそれらが測定する遺伝子、加えて、技術的理由のためにＴＬＤＡプラットフォーム上で良く機能し得ないか、または同族ＴＬＤＡプローブが存在しないＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブを置き換えるためかのいずれかで遺伝子プローブについての置き換えとして導入される「置き換え遺伝子」のリストを示す。これらの置き換えは、高度に相関した遺伝子を示し得、または同じ遺伝子転写産物における異なる位置と結合するプローブであり得る。汎ウイルス遺伝子プローブなどの追加の遺伝子が含まれ得る。表１に示された重みは、マイクロアレイプラットフォーム上で実行された分類子について計算された重みである。推定されていない重みは、表において「ＮＡ」により示される（下記の実施例４は、これらの分類子のＴＬＤＡプラットフォームへの完成した書き換えを提供する）。ＴＬＤＡについての参照プローブ（すなわち、正規化遺伝子、例えば、ＴＲＡＰ１、ＰＰＩＢ、ＧＡＰＤＨ、および１８Ｓ）もまた、重みおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットＩＤ（これらは分類子の部分ではない）についての列において「ＮＡ」と示される。必ずしもＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットに対応するとは限らない追加の遺伝子プローブもまた、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットＩＤ列において「ＮＡ」と示される。
ＴＬＤＡプラットフォームについてのこのシグネチャ例のさらなる考察は、下記の実施例３および４に提供されている。
ＡＲＩの病因を決定するこの方法は、他の試験と組み合わせられ得る。例えば、患者がウイルス性ＡＲＩを有すると決定された場合には、フォローアップ試験は、インフルエンザＡまたはＢを直接的に検出することができるかどうか、またはそのような感染を示す宿主応答を検出することができるかどうかを決定することであり得る。同様に、細菌性ＡＲＩの結果へのフォローアップ試験は、グラム陽性またはグラム陰性細菌を直接的に検出することができるかどうか、またはそのような感染を示す宿主応答を検出できるかどうかを決定することであり得る。いくつかの実施形態において、分類子を用いて感染のクラスを決定するための、およびまた、病原体特異的プローブまたは検出方法を用いて特定の病原体について試験するための同時的試験が実施され得る。例えば、Ｅｌｅｙらの米国特許公開第２０１５／０２８４７８０号（活動性結核を検出するための方法）；Ｔｓａｌｉｋらの米国特許公開第２０１４／０３２３３９１号（細菌感染の分類のための方法）を参照。
対象におけるＡＲＩの二次分類を決定する方法
本開示はまた、二次分類スキームを用いて対象を分類する方法を提供する。したがって、本発明の別の態様は、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）が、細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セット（すなわち、３つのシグネチャ）の発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジーについて、必要に応じて、遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する分類子（すなわち、予測子）へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を、定義済みの閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料が細菌に対して陰性である場合には、ウイルス分類子および非感染性分類子だけを用いて、ステップ（ｄ）を繰り返すステップ、ならびに（ｇ）前記試料をウイルス性病因または非感染性疾病であると分類するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
本開示はまた、二次分類スキームを用いて対象を分類する方法を提供する。したがって、本発明の別の態様は、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）が、細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セット（すなわち、３つのシグネチャ）の発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジーについて、必要に応じて、遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する分類子（すなわち、予測子）へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を、定義済みの閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料が細菌に対して陰性である場合には、ウイルス分類子および非感染性分類子だけを用いて、ステップ（ｄ）を繰り返すステップ、ならびに（ｇ）前記試料をウイルス性病因または非感染性疾病であると分類するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
本開示の別の態様は、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）が、細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セット（すなわち、３つのシグネチャ）の発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジーについて、遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する分類子（すなわち、予測子）へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を、定義済みの閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料がウイルスに対して陰性である場合には、細菌分類子および非感染性分類子だけを用いて、ステップ（ｄ）を繰り返すステップ、ならびに（ｇ）前記試料を細菌性病因または非感染性疾病であると分類するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
本開示のさらに別の態様は、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）が、細菌起源か、ウイルス起源か、または非感染性起源かを決定するための方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セット（すなわち、３つのシグネチャ）の発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられたテクノロジーについて、遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する分類子（すなわち、予測子）へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を、定義済みの閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料が非感染性疾病に対して陰性である場合には、ウイルス分類子および細菌分類子だけを用いて、ステップ（ｄ）を繰り返すステップ、ならびに（ｇ）前記試料をウイルス性病因または細菌性病因であると分類するステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
いくつかの実施形態において、方法は、ＡＲＩの病因の確率を示すスコアを患者に割り当てる報告を作成するステップをさらに含む。
二次分類スキームを用いて患者の状態を分類することは、図４に示されている。この例において、細菌性ＡＲＩ分類子は、細菌性ＡＲＩを有する患者を、細菌性ＡＲＩを有しない患者（代わりに、ウイルス性ＡＲＩまたは非感染性病因であり得る）から区別する。その後、二次分類を、非細菌性ＡＲＩを有する患者に課して、ウイルス性ＡＲＩと非感染性疾病との間をさらに識別することができる。一次および二次分類の同じ過程はまた、ウイルス性ＡＲＩ分類子に適用することができ、その場合、ウイルス感染を有しないと決定された患者が、その後、細菌性ＡＲＩまたは非感染性病因を有すると二次的に分類される。同様に、非感染性疾病分類子を一次試験として適用することにより、患者がそのような非感染性疾病を有するか、または代わりに感染性原因の症状を有するかが決定される。二次分類ステップは、その感染性が細菌性病原体によるか、またはウイルス性病原体によるかを決定する。
前記３つの一次分類および３つの二次分類からの結果は、当業者により様々な技術によって合計されて（例えば、総和、数、または平均）、提供者についての実用的な報告を作成することができる。いくつかの実施形態において、この二次レベルの分類に用いられる遺伝子は、表５Ａから表５Ｑに提示された遺伝子の一部または全部であり得る。
そのような例において、上記の３つの分類子（細菌分類子、ウイルス分類子、および非感染性疾病分類子）は、第１レベルの分類を実施するために用いられる。その後、非細菌性感染を有する患者について、二次分類子が、ウイルス性ＡＲＩを、非感染性疾病を有するものから区別するように定義される（図４、左パネル）。同様に、非ウイルス性感染を有する患者について、ウイルス性を非感染性疾病から区別するための新しい分類子が用いられ（図４、中央パネル）、第１ステップにおいて非感染性疾病を有するとは分類されていない患者について、ウイルス性ＡＲＩと細菌性ＡＲＩを区別するための新しい分類子が用いられる（図４、右パネル）。
この２段方法において、９つの確率が生じ得、それらの確率は、いくつかの方法で統合され得る。それぞれが、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病の確率を有する３つの予測セットを調和させる方法として、２つのストラテジーが本明細書に記載されている。例えば、最高の予測平均確率：細菌性ＡＲＩについての全ての予測確率の平均値が求められ、ウイルス性ＡＲＩの全ての予測確率も、および非感染性疾病の全ての予測確率も同様である。最も高い平均確率が診断を表す。
最多の予測数：各条件の予測確率を平均する代わりに、その患者試料について特定の診断（すなわち、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病）が予測される回数が係数される。最良のシナリオは、３つの分類スキームが同じ回答を示す（例えば、スキーム１について細菌性ＡＲＩ、スキーム２について細菌性ＡＲＩ、およびスキーム３について細菌性ＡＲＩ）場合である。最悪の場合は、各スキームが異なる診断を指定し、３方式同点を生じることである。
前に記載された患者試料の訓練セットを用いた、段１分離の結果は、例えば、表２（列に提示された臨床的分類；行に提示された診断試験予測）に提示されたものと同様であり得た。
最高の予測平均確率ストラテジーを用いる段２分類後、結果は表３（列に提示された臨床的分類；行に提示された診断試験予測）と同様であり得る。
最多の予測数ストラテジーを用いる段２分類後、結果は表４（列に提示された臨床的分類；行に提示された診断試験予測）に類似し得る。
例えば、上記のように、および／または表５Ａから表５Ｑに要約されているように、分類を達成することができる。表５Ａから表５Ｑは、異なる診断質問に解答する３つの別々の分類ストラテジーにおける遺伝子メンバーシップを要約する。３つの複雑な分類子を集合的に含む合計２７０個のプローブがある。第１は、下記の実施例１に提示されたものと同じであるＢＶＳ（細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、ＳＩＲＳ）と呼ばれる。これらのプローブは、表１０Ａから表１０Ｆに提示されたものと同じであり、表１０Ａから表１０Ｆは、分類に用いられるプローブ／遺伝子重みを提供する。それらはまた、表１１に提示された遺伝子にも対応する。
第２は、２層または２段として２Ｌと呼ばれる。これは、図４に提示された階層的スキームである。
第３は、ＢＶＳと類似するが、（同様に実施例１に記載された）健康な対照の集団もまた含む、１段分類スキーム、ＢＶＳＨである。この群は、非感染について不十分な対照であることが示されているが、健康からの識別が臨床的に重要であり得る使用事例がある。例えば、これは、回復期と相関するシグネチャの連続的測定を含み得る。それはまた、感染性物質に曝されており、無症状性に対する前駆症状性である患者を識別するために用いられ得る。ＢＶＳＨスキームにおいて、訓練コホートにおいて４つの群、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、ＳＩＲＳ（非感染性疾病）を有する群、および健康な群が表される。これらの４つの群は、各クラスを全ての他の可能性から区別する４つの別々のシグネチャを作製するために用いられる。
表５Ａから表５Ｑ凡例：
プローブ＝ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブＩＤ
ＢＶＳ＝細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病（呼吸器症状を有する）を有する患者において訓練された３つの分類子モデル。１は、このプローブがこの３つの分類子モデルに含まれることを表す。０は、そのプローブがこの分類スキームにおいて存在しないことを表す。
ＢＶＳ－ＢＯ＝ＢＶＳ分類スキームの一部として細菌性ＡＲＩ分類子に含まれる遺伝子またはプローブ。この分類子は、細菌性ＡＲＩを有する患者を他の病因（ウイルス性ＡＲＩまたは１０）から特異的に識別する。
ＢＶＳ－ＶＯ＝この列が、ウイルス性ＡＲＩ分類子に含まれる遺伝子を同定することを除いて、ＢＶＳ－ＢＯについてと同様。この分類子はウイルス性ＡＲＩを有する患者を他の病因（細菌性ＡＲＩまたは非感染性疾病）から特異的に識別する。
ＢＶＳ－ＳＯ＝この列が、非感染性疾病分類子に含まれる遺伝子を同定することを除いて、ＢＶＳ－ＢＯまたはＢＶＳ－ＶＯについてと同様。この分類子は非感染性疾病を有する患者を他の病因（細菌性またはウイルス性ＡＲＩ）から特異的に識別する。
２Ｌは、２段の階層的分類スキームを指す。この列における１は、特定されたプローブまたは遺伝子がその分類タスクに含まれたことを示す。この２段分類スキームはそれ自体、３つの別個の段階的なタスクで構成される。１段目は、一対他を適用し、一は細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病であり得る。所定の対象が、「他」カテゴリーに入る場合には、残りの可能性の間を区別する２段目の分類が起こる。２Ｌ－ＳＯは、所定の対象が非感染性疾病を有するかどうかに関して決定するモデルについての１段目、その後、可能性として細菌性ＡＲＩとウイルス性ＡＲＩとの間を識別するＳＬ－ＢＶが続く。これらの列における１は、その遺伝子またはプローブがその特定された分類モデルに含まれることを示す。２Ｌ－ＢＯおよび２Ｌ－ＶＳは、別の２段分類スキームを構成する。２Ｌ－ＶＯおよび２Ｌ－ＳＢは、２段分類スキームにおける第３のモデルを含む。
最後に、ＢＶＳＨは、訓練コホートに健康な個体を含み、したがって、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病と比較した健康な状態についての分類子を含む１レベル分類スキームを指す。濃い灰色のＢＶＳＨ列は、この分類スキームに含まれる任意の遺伝子またはプローブを同定する。このスキームはそれ自体、これらの列において「１」で示されたそれらのそれぞれのプローブ／遺伝子組成を有するＢＶＳＨ－ＢＯ、ＢＶＳＨ－ＶＯ、ＢＶＳＨ－ＳＯ、およびＢＶＳＨ－ＨＯで構成される。
プローブ＝ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブＩＤ
ＢＶＳ＝細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病（呼吸器症状を有する）を有する患者において訓練された３つの分類子モデル。１は、このプローブがこの３つの分類子モデルに含まれることを表す。０は、そのプローブがこの分類スキームにおいて存在しないことを表す。
ＢＶＳ－ＢＯ＝ＢＶＳ分類スキームの一部として細菌性ＡＲＩ分類子に含まれる遺伝子またはプローブ。この分類子は、細菌性ＡＲＩを有する患者を他の病因（ウイルス性ＡＲＩまたは１０）から特異的に識別する。
ＢＶＳ－ＶＯ＝この列が、ウイルス性ＡＲＩ分類子に含まれる遺伝子を同定することを除いて、ＢＶＳ－ＢＯについてと同様。この分類子はウイルス性ＡＲＩを有する患者を他の病因（細菌性ＡＲＩまたは非感染性疾病）から特異的に識別する。
ＢＶＳ－ＳＯ＝この列が、非感染性疾病分類子に含まれる遺伝子を同定することを除いて、ＢＶＳ－ＢＯまたはＢＶＳ－ＶＯについてと同様。この分類子は非感染性疾病を有する患者を他の病因（細菌性またはウイルス性ＡＲＩ）から特異的に識別する。
２Ｌは、２段の階層的分類スキームを指す。この列における１は、特定されたプローブまたは遺伝子がその分類タスクに含まれたことを示す。この２段分類スキームはそれ自体、３つの別個の段階的なタスクで構成される。１段目は、一対他を適用し、一は細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病であり得る。所定の対象が、「他」カテゴリーに入る場合には、残りの可能性の間を区別する２段目の分類が起こる。２Ｌ－ＳＯは、所定の対象が非感染性疾病を有するかどうかに関して決定するモデルについての１段目、その後、可能性として細菌性ＡＲＩとウイルス性ＡＲＩとの間を識別するＳＬ－ＢＶが続く。これらの列における１は、その遺伝子またはプローブがその特定された分類モデルに含まれることを示す。２Ｌ－ＢＯおよび２Ｌ－ＶＳは、別の２段分類スキームを構成する。２Ｌ－ＶＯおよび２Ｌ－ＳＢは、２段分類スキームにおける第３のモデルを含む。
最後に、ＢＶＳＨは、訓練コホートに健康な個体を含み、したがって、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病と比較した健康な状態についての分類子を含む１レベル分類スキームを指す。濃い灰色のＢＶＳＨ列は、この分類スキームに含まれる任意の遺伝子またはプローブを同定する。このスキームはそれ自体、これらの列において「１」で示されたそれらのそれぞれのプローブ／遺伝子組成を有するＢＶＳＨ－ＢＯ、ＢＶＳＨ－ＶＯ、ＢＶＳＨ－ＳＯ、およびＢＶＳＨ－ＨＯで構成される。
表５Ａから表５Ｑは、必要とされるタスクに従って構築されるウイルス分類子、細菌分類子、および非感染性疾病分類子についての遺伝子セットのメンバーの使用の概要を提供する。「１」は、分類子におけるその遺伝子のメンバーシップを示す。
ＡＲＩを有する対象を処置する方法
本開示の別の態様は、対象において病因が不明である急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）を処置する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セット（例えば、１つ、２つ、もしくは３つ、またはそれ超のシグネチャ）の発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられるテクノロジーについて、必要に応じて、遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する細菌分類子、ウイルス分類子、および非感染性疾病分類子（すなわち、予測子）へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を、定義済みの閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料を、細菌性病因、ウイルス性病因、または非感染性疾病であると分類するステップ、ならびに（ｇ）ステップ（ｆ）によって同定されているように適切な処置レジメンを前記対象へ施すステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
本開示の別の態様は、対象において病因が不明である急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）を処置する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得るステップ、（ｂ）生物学的試料から対象の遺伝子発現プロファイルを、定義済みの遺伝子セット（例えば、１つ、２つ、もしくは３つ、またはそれ超のシグネチャ）の発現レベルを評価することにより決定するステップ、（ｃ）前記測定を行うために用いられるテクノロジーについて、必要に応じて、遺伝子発現レベルを正規化して、正規化値を生じるステップ、（ｄ）各シグネチャにおける遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値（係数）を有する細菌分類子、ウイルス分類子、および非感染性疾病分類子（すなわち、予測子）へ前記正規化値を入力するステップ、（ｅ）前記分類子の出力を、定義済みの閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲と比較するステップ、（ｆ）前記試料を、細菌性病因、ウイルス性病因、または非感染性疾病であると分類するステップ、ならびに（ｇ）ステップ（ｆ）によって同定されているように適切な処置レジメンを前記対象へ施すステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｇ）は、ＡＲＩの病因が細菌性であると決定される場合、抗細菌治療を施すことを含む。他の実施形態において、ステップ（ｇ）は、ＡＲＩの病因がウイルス性であると決定される場合、抗ウイルス治療を施すことを含む。
対象のＡＲＩの病因が決定された後、彼女は、処置、例えば、ＡＲＩがウイルス性であると決定された場合には抗ウイルス治療を受け得、および／または彼女は、感染の経過の間、彼女の家に隔離され得る。あるいは、ＡＲＩが細菌性であると決定された場合には、細菌治療レジメンが施され得る（例えば、抗生物質の投与）。非感染性疾病として分類された対象は、帰宅させられ得、またはさらなる診断および処置（例えば、アレルギー、喘息など）のために診察され得る。
しかしながら、検査室は、ＡＲＩの病因を同定すること、および適切な処置の施与を目的として、分類子の遺伝子発現レベルを医師に伝え得ることが企図されるため、末梢血試料を実施した人は、比較を行う必要はない。追加として、医師は、患者を診察した後、末梢血試料を採取し、その試料を分類子についてアッセイし、代理業者に患者の病因学的状態を医師に報告するように、代理業者に命令することが企図される。医師はＡＲＩの病因を得るとすぐに、医師は、適切な処置および／または隔離を命令することができる。
本明細書に提供された方法は、患者を正しく処置し、抗生物質の不適切な使用を減らすために疾病の病因を診断するために効果的に用いることができる。さらに、本明細書に提供された方法は、様々な他の用途を有し、その用途には、（１）病原体に曝されており、かつ今にも起こりそうだが、症候性ではない疾病を有する個体を検出するための宿主に基づいた試験（例えば、集団を通しての疾患の自然伝播のシナリオにおいて、しかし、バイオテロリズムの場合においても）、（２）臨床試験設定においてか、または免疫の集団モニタリングのためのいずれかで、ワクチンまたは薬物に対する応答をモニターするための宿主に基づいた試験、（３）配置前の、差し迫った疾病についてのスクリーニングのための宿主に基づいた試験（例えば、軍隊配置、またはクルーズ船への乗船などの民間人のシナリオにおいて）、および（４）家畜のＡＲＩ（例えば、鳥インフルエンザおよび他のパンデミックの可能性があるウイルス）についてのスクリーニングのための宿主に基づいた試験が含まれるが、それらに限定されない。
本開示の別の態様は、（ａ）生物学的試料を抽出するための手段；（ｂ）本明細書に教示されているような１群の遺伝子転写産物と相同な領域を有する複数の合成オリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のアレイを作製するための手段；ならびに（ｃ）使用説明書を含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる、対象における急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）の病因を決定するためのキットを提供する。
本開示のさらに別の態様は、急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子を評価するためにキットを使用する方法であって、（ａ）本明細書に教示されているような１群の遺伝子転写産物と相同な領域を有する複数の合成オリゴヌクレオチドからなる１つまたは複数のアレイを作製するステップ；（ｂ）正規化遺伝子と相同な領域を有するオリゴヌクレオチドを前記アレイに加えるステップ；（ｃ）急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）を患っている対象から生物学的試料を得るステップ；（ｄ）前記試料からＲＮＡを単離して、トランスクリプトームを作製するステップ；（ｅ）前記アレイ上の前記トランスクリプトームを測定するステップ；（ｆ）前記トランスクリプトームの測定値を正規化遺伝子に対して正規化し、分類子アルゴリズムを実行するために正規化測定値をコンピュータへ電子的に転送するステップ；（ｇ）報告を作成するステップ、および任意で、（ｈ）前記結果に基づいた適切な処置を施すステップを含み、それらからなり、またはそれらから本質的になる方法を提供する。
分類システム
図１１に関して、分類システムおよび／またはコンピュータプログラム製造物１１００は、本明細書に記載された様々な実施形態に従って、プラットフォームにおいて、またはそれにより、用いられ得る。分類システムおよび／またはコンピュータプログラム製造物１１００は、ソフトウェア、ファームウェア、および／またはハードウェアの任意の適切な組合せを用いてデータを受け取り、転送し、処理し、および記憶するように動作可能であり、かつスタンドアロンであり得、ならびに／またはインターネットとして知られたグローバル通信ネットワークの全部もしくは一部を含む、任意の通常の公共および／もしくは民間の、実および／もしくは仮想の、有線および／もしくは無線のネットワークにより相互接続され得る、１つまたは複数の企業、アプリケーション、パーソナル、普及、および／または埋め込み型のコンピュータシステムとして具現され得、様々な型の有形的表現の、非一過性コンピュータ可読媒体を含み得る。
図１１に関して、分類システムおよび／またはコンピュータプログラム製造物１１００は、本明細書に記載された様々な実施形態に従って、プラットフォームにおいて、またはそれにより、用いられ得る。分類システムおよび／またはコンピュータプログラム製造物１１００は、ソフトウェア、ファームウェア、および／またはハードウェアの任意の適切な組合せを用いてデータを受け取り、転送し、処理し、および記憶するように動作可能であり、かつスタンドアロンであり得、ならびに／またはインターネットとして知られたグローバル通信ネットワークの全部もしくは一部を含む、任意の通常の公共および／もしくは民間の、実および／もしくは仮想の、有線および／もしくは無線のネットワークにより相互接続され得る、１つまたは複数の企業、アプリケーション、パーソナル、普及、および／または埋め込み型のコンピュータシステムとして具現され得、様々な型の有形的表現の、非一過性コンピュータ可読媒体を含み得る。
図１１に示されているように、分類システム１１００は、１つもしくは複数のオペレーティングシステムおよび／または１つもしくは複数のアプリケーションが走る１つまたは複数の中央処理装置（ＣＰＵ）を含むプロセッササブシステム１１４０を含み得る。１つのプロセッサ１１４０が示されているが、複数のプロセッサ１１４０が存在し得、それらは、電気的に相互接続されているか、または独立しているかのいずれかであり得ることは、理解されているだろう。プロセッサ１１４０は、メモリ１１５０などのメモリ装置からコンピュータプログラムコードを実行して、本明細書に記載された動作および方法の少なくとも一部を実施するように構成され、任意の通常の、または特殊目的のプロセッサであり得、そのプロセッサには、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特殊用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、およびマルチコアプロセッサが含まれるが、それらに限定されない。
メモリサブシステム１１５０は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭ）もしくはフラッシュメモリ、および／または任意の他の固体メモリ装置などのメモリ装置の階層を含み得る。
記憶回路１１７０もまた提供され得、それには、例えば、携帯用コンピュータディスケット、ハードディスク、携帯用コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤＲＯＭ）、光学式記憶装置、磁気記憶装置、および／または任意の他の種類のディスクもしくはテープに基づいた記憶サブシステムが含まれ得る。記憶回路１１７０は、分類システム１１００についてのデータ／パラメータ／分類子の不揮発性記憶を提供し得る。記憶回路１１７０は、ディスクドライブおよび／またはネットワーク記憶コンポーネントを含み得る。記憶回路１１７０は、プロセッサ１１４０により、実行され得るコードおよび／またはアクセスされ得るデータを記憶するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、記憶回路１１７０は、シグネチャ、重み、閾値などの分類システム１１１０に用いられるデータ／パラメータ／分類子へのアクセスを提供するデータベースを記憶し得る。１つまたは複数のコンピュータ可読媒体の任意の組合せが、記憶回路１１７０によって利用され得る。コンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読信号媒体またはコンピュータ可読記憶媒体であり得る。コンピュータ可読記憶媒体は、例えば、電子、磁気、光学、電磁気、赤外線、または半導体のシステム、機器、もしくは装置、または前述の任意の適切な組合せであり得るが、それらに限定されない。コンピュータ可読記憶媒体のより具体的な例（包括的ではないリスト）には、携帯用コンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、携帯用コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、光学式記憶装置、磁気記憶装置、または前述の任意の適切な組合せが含まれる。本明細書で用いられる場合、コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行システム、機器、または装置により、またはそれらと接続して、使用されるプログラムを含有または記憶することができる任意の有形的表現媒体であり得る。
入力／出力回路１１６０には、ディスプレイ、ならびに／またはキーボード、タッチスクリーン、および／もしくはポインティングデバイスなどのユーザー入力装置が含まれ得る。入力／出力回路１１６０に付属した装置は、分類システム１１００のユーザーによりプロセッサ１１４０へ情報を供給するために用いられ得る。入力／出力回路１１６０に付属した装置には、ネットワーキングまたは通信制御装置、入力装置（キーボード、マウス、タッチスクリーンなど）、および出力装置（プリンターまたはディスプレイ）が含まれ得る。入力／出力回路１１６０はまた、ディスプレイおよび／またはプリンターなどの装置へのインターフェイスを提供し得、分類システム１１００の動作の結果が、分類システム１１００のユーザーへ提供されるようにそれらの装置へ伝達され得る。
任意のアップデート回路１１８０は、分類システム１１００のアップデートを提供するためのインターフェイスとして含まれ得る。アップデートは、メモリ１１５０および／または記憶回路１１７０に記憶されている、プロセッサ１１４０により実行されるコードのアップデートを含み得る。アップデート回路１１８０を介して提供されるアップデートはまた、シグネチャ、重み、閾値などの分類システム１１００についての情報を維持するデータベースおよび／または他のデータ記憶形式に関連した記憶回路１１７０の部分のアップデートを含み得る。
分類システム１１００の試料入力回路１１１０は、上文に記載されているようなプラットフォームが、分析されるべき生物学的試料を受けるためのインターフェイスを提供し得る。試料入力回路１１１０は、分類システム１１００へユーザーによって供給される生物学的試料を受け、かつ処理されるべき分類システム１１００および／またはプラットフォーム内の生物学的試料を輸送する、機械要素および電気素子を含み得る。試料入力回路１１１０は、試料および／または試験注文書の同定のためのバーコード付与容器を同定するバーコードリーダーを含み得る。試料処理回路１１２０は、自動分析のために生物学的試料を調製するために、分類システム１１００および／またはプラットフォーム内の生物学的試料をさらに処理し得る。試料分析回路１１３０は、処理された生物学的試料を自動的に分析し得る。試料分析回路１１３０は、分類システム１１００に供給された生物学的試料に関して、例えば、定義済みの遺伝子セットの遺伝子発現レベルを測定するのに用いられ得る。試料分析回路１１３０はまた、遺伝子発現レベルを正規化することにより正規化遺伝子発現値を生じ得る。試料分析回路１１３０は、記憶回路１１７０から、細菌性急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子を取り出し得、これらの分類子は、定義済みの遺伝子セットの遺伝子それぞれについての定義済み重み付け値（すなわち、係数）を含む。試料分析回路１１３０は、細菌性急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子から選択された１つまたは複数の急性呼吸器病分類子へ正規化遺伝子発現値を入力し得る。試料分析回路１１３０は、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病の１つまたは複数についての病因確率を前記分類子に基づいて計算し、対象における急性呼吸器病が細菌起源か、ウイルス起源か、非感染性起源か、またはそれらのいくつかの組合せかの決定の出力を、入力／出力回路１１６０を介して制御し得る。
試料入力回路１１１０、試料処理回路１１２０、試料分析回路１１３０、入力／出力回路１１６０、記憶回路１１７０、および／またはアップデート回路１１８０は、少なくとも部分的に分類システム１１００の１つまたは複数のプロセッサ１１４０の制御下で実行し得る。本明細書に用いられる場合、プロセッサ１１４０の「制御下」で実行するとは、試料入力回路１１１０、試料処理回路１１２０、試料分析回路１１３０、入力／出力回路１１６０、記憶回路１１７０、および／またはアップデート回路１１８０により実施される動作が、少なくとも部分的に、プロセッサ１１４０により実行および／または命令され得るが、それらのコンポーネントの動作の少なくとも一部が、独立して電気的または機械的に自動化されることを排除しないことを意味する。プロセッサ１１４０は、コンピュータプログラムコードの実行によって、本明細書に記載されているように分類システム１１００の動作を制御し得る。
本開示の態様について動作を行うためのコンピュータプログラムコードは、オブジェクト指向プログラム言語、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｓｃａｌａ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｅｉｆｆｅｌ、ＪＡＤＥ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、ＶＢ．ＮＥＴ、Ｐｙｔｈｏｎなど、従来の手続き型プログラミング言語、例えば、「Ｃ」プログラミング言語、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ ２００３、Ｐｅｒｌ、ＣＯＢＯＬ ２００２、ＰＨＰ、ＡＢＡＰ、ダイナミックプログラミング言語、例えば、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｒｕｂｙ ａｎｄ Ｇｒｏｏｖｙ、または他のプログラミング言語を含む、１つまたは複数のプログラミング言語の任意の組合せで書かれ得る。プログラムコードは、完全に分類システム１１００上で、一部分は分類システム１１００上で、スタンドアロンソフトウェアパッケージとして、一部分は分類システム１１００上で、かつ一部はリモートコンピュータ上で、または完全にリモートコンピュータもしくはサーバー上で、実行され得る。後者の状況において、リモートコンピュータは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）もしくは広域ネットワーク（ＷＡＮ）を含む任意の型のネットワークを通して分類システム１１００に接続され得、またはその接続は、（例えば、インターネットサービスプロバイダを用いるインターネットを通して）外部コンピュータへ、もしくはクラウドコンピュータ環境において行われ得、もしくはＳｏｆｔｗａｒｅ ａｓ ａ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＳａａＳ）などのサービスとして提供され得る。
いくつかの実施形態において、システムは、遺伝子発現の定量的または半定量的検出を、ＡＲＩの病因の累積スコアまたは確率へ変換することができるコンピュータ可読コードを含む。
いくつかの実施形態において、システムは、ユーザーが、試験されるべき生物学的試料を単に挿入するだけで、その後しばらくして（好ましくは、わずかな時間、例えば、３０分間もしくは４５分間、または１時間、２時間、もしくは３時間、最高８時間、１２時間、２４時間、もしくは４８時間まで）、システムからの結果出力を受けることができるように、コンポーネントが統合された、試料調製から結果までのシステムである。
本発明が、その適用において、以下の説明に示された、または以下の図面に示された、構築の詳細またはコンポーネントの配置に限定されないことは理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、かつ様々な様式で実施または実行することができる。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他に指示がない限り、その範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に言及する、簡潔な方法としての役割を果たすことを単に意図するものであり、各別個の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されているかのように、本明細書へ組み入れられている。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書において他に指示がなく、または別なふうに文脈によって明らかに否定されない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に提供されたありとあらゆる例、または例示的な言葉（例えば、「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をより良く明らかにすることを単に意図するものであり、別なふうに主張されない限り、本発明の範囲への限定を提示するものではない。本明細書におけるいかなる言葉も、任意の主張されていない要素を本発明の実施に必須として示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書に列挙されたいかなる数の範囲も、下限値から上限値までの全ての値を含むことも理解されている。例えば、濃度範囲が、１％～５０％と述べられている場合には、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値が、この明細書において明白に数え上げられることが意図される。これらは、具体的に意図されるものの例に過ぎず、最低値から最高値の間（それらの値を含む）の数値の全ての可能な組合せが、この出願において明白に述べられているとみなされるべきである。
以下の実施例は、例証となるのみであり、範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例１］
宿主遺伝子発現分類子は急性呼吸器病の病因を診断する
細菌性またはウイルス性病原体による急性呼吸器感染症は、病院にかかる最も多く見られる理由の一つである。現在の病原体に基づいた診断アプローチは、信頼性がなく、または時宜にかなったものではなく、したがって、ほとんどの患者は、不適切な抗生物質を受けている。宿主応答バイオマーカーは、抗菌剤使用を指図するための代替の診断アプローチを提供する。
宿主遺伝子発現分類子は急性呼吸器病の病因を診断する
細菌性またはウイルス性病原体による急性呼吸器感染症は、病院にかかる最も多く見られる理由の一つである。現在の病原体に基づいた診断アプローチは、信頼性がなく、または時宜にかなったものではなく、したがって、ほとんどの患者は、不適切な抗生物質を受けている。宿主応答バイオマーカーは、抗菌剤使用を指図するための代替の診断アプローチを提供する。
本発明者らは、救急治療設定において宿主遺伝子発現パターンが疾病の感染性原因を非感染性原因から識別するかどうかを問うた。急性呼吸器感染症を有する者の中で、本発明者らは、感染性疾病が、ウイルス性病原体によるのかまたは細菌性病原体によるのかを決定した。
発見の根拠となった試料は、４つの三次医療病院救急科および学生保健医療施設において行われた観察的コホート研究から引き出された。４４人の健康な対照および市中発症急性呼吸器感染症または非感染性疾病を有する２７３人の患者を、疑わしい敗血症を有する患者のより大きいコホート（ＣＡＰＳＯＤ研究）から選択した。平均年齢は４５歳であり、参加者の４５％が男性であった。さらなる人口学的情報は、参照により本明細書に組み入れられているＴｓａｌｉｋら、（２０１６） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３２２）：１－９の表１に見出され得る。
臨床表現型を、手作業のカルテ審査により判定した。呼吸器ウイルス病原体についての日常的な微生物学的試験および多重ＰＣＲを実施した。末梢全血遺伝子発現を、マイクロアレイを用いて測定した。スパースロジスティック回帰を用いて、細菌性対ウイルス性対非感染性疾病の分類子を開発した。３２８人の個体を含む、５つの独立的に導き出されたデータセットを、検証のために用いた。
遺伝子発現に基づいた分類子を、細菌性急性呼吸器感染症（７１個のプローブ）、ウイルス性急性呼吸器感染症（３３個のプローブ）、または非感染性病因（２６個のプローブ）について開発した。２７３人の患者にその３つの分類子を適用し、クラス割当を最高の予測確率によって決定した。全体的な精度は８７％（２３８／２７３が臨床判定と一致した）であり、それは、プロカルシトニン（７８％、ｐ＜０．０３）、および細菌性対ウイルス感染症の３つの公表された分類子（７８～８３％）より正確であった。本明細書で開発された分類子は、５つの公的に利用可能なデータセットにおいて外部検証された（ＡＵＣ ０．９０～０．９９）。本発明者らは、宿主遺伝子発現に基づいた試験の分類精度を、細菌性もしくはウイルス性急性呼吸器感染症または非感染性疾病を含む、プロカルシトニンおよび臨床的に判定された診断と比較した。
感染に対する宿主の末梢血遺伝子発現応答は、すでに使用されている診断に補完的な診断ストラテジーを提供する８。このストラテジーは、ウイルス性ＡＲＩ８～１３および細菌性ＡＲＩ１１，１４に対する宿主応答を特徴づけることに成功している。これらの進歩にも関わらず、患者のケアの設定におけるそれらの診断としての使用が、いくつかの問題によって妨げられている。宿主に基づいた分子シグネチャの開発において重要な考慮すべき問題は、それらが、意図された使用集団において開発されることである１５。しかしながら、ほとんど全ての公表された遺伝子発現に基づいたＡＲＩ分類子は、対照として健康な個体を使用し、かつ小さい、または均一の集団に焦点を合わせており、したがって、患者が区別されていない症状を示す救急治療設定において用いるのに最適化されていない。さらに、遺伝子発現分類子を同定するために用いられる統計的方法は、クラスタリング、一変量試験、または経路関連に基づいて重複性遺伝子を含む場合が多い。これらのストラテジーは、関連した生態を同定するが、診断能を最大限に引き出していない。本明細書に例示されているような代替法は、関連していない経路からの遺伝子を組み合わせて、より情報を与える分類子を作製することである。
方法
分類子誘導コホート
研究は、関連する機関審査委員会により承認され、ヘルシンキ宣言に従った。全ての被験者またはそれらの法的に認可された代表者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。
分類子誘導コホート
研究は、関連する機関審査委員会により承認され、ヘルシンキ宣言に従った。全ての被験者またはそれらの法的に認可された代表者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。
市中肺炎および敗血症アウトカム診断研究（臨床試験識別番号ＮＣＴ００２５８８６９）の一環として、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＤＵＭＣ；Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）の救急科、Ｄｕｒｈａｍ ＶＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＤＶＡＭＣ；Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）、またはＨｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）において、市中発症の疑いのある感染症を有する患者を登録した１６～１９。市中肺炎および敗血症研究の一環として、ＵＮＣヘルスケア救急科（ＵＮＣ；Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ、ＮＣ）を通して、追加の患者を登録した。既知または疑いのある感染症を有する場合、および２つ以上の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）診断基準を示す場合には、患者は適格であった２０。ＡＲＩ症例は、救急医学科（ＳＷＧ、ＥＢＱ）または感染疾患（ＥＬＴ）の医師によって判定される場合の上気道または下気道症状を有する患者を含んだ。判定は、登録から少なくとも２８日後で、かつ以前に公表された診断基準を用いた任意の遺伝子発現に基づいたカテゴリー化の前に、実施された遡及的な手作業でのカルテ審査に基づいた１７。これらの判定を裏付けるために用いられた情報の全体は、それらの評価時点において臨床医には入手できなかったであろう。咽頭炎を有する４人および肺炎を有する６６人を含む、微生物学的に確認された細菌性ＡＲＩを有する７０人の患者が同定された。微生物学的病因は、血液または呼吸器試料の通常の培養、尿中抗原試験（連鎖球菌またはレジオネラ）を用いて、または血清学的試験（マイコプラズマ）で決定された。ウイルス性ＡＲＩを有する患者（ｎ＝１１５）は、ウイルス性病因の同定および適合する症状に基づいて確認された。加えて、同じ判定方法を用いての確定のウイルス性ＡＲＩを有する、ＤＡＲＰＡ健康疾患予測研究の一環としてのＤｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおける４８人の学生が含まれた。ウイルス性病因同定について臨床試験は、ＲｅｓＰｌｅｘ ＩＩ ｖ２．０ウイルスＰＣＲ多重アッセイ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により補強された。このパネルは、インフルエンザＡ型およびＢ型、アデノウイルス（Ｂ、Ｅ）、パラインフルエンザ１～４型、呼吸器多核体ウイルスＡ型およびＢ型、ヒトメタニューモウイルス、ヒトライノウイルス、コロナウイルス（２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ１）、コクサッキー／エコーウイルス、およびボカウイルスを検出する。判定で、登録された患者の一部が、非感染性疾病を有すると決定された（ｎ＝８８）（表９Ａ、９Ｂ）。代わりの診断が確立され、かつ任意の日常的に指示される微生物学的試験の結果が感染性病因を支持できなかった場合のみ、「非感染性疾病」の決定がなされた。最後に、症状がない健康なボランティアの中から健康な対照（ｎ＝４４；中央値年齢３０歳；範囲２３～５９歳）が、アスピリンの血小板機能への効果に関する研究の一環として登録され、遺伝子発現分析を、アスピリン曝露前の時点において実施した２１。
プロカルシトニン測定
研究中の異なる時期に濃度を測定し、結果として、有効性に基づいて、異なるプラットフォームを利用した。いくつかの血清測定を、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ ２０１０アナライザ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌａｖａｌ、Ｃａｎａｄａ）において電気化学発光イムノアッセイにより行った。追加の血清測定を、ｍｉｎｉＶＩＤＡＳイムノアッセイ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ、ＵＳＡ）を用いて行った。血清が入手できない場合、Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ ＰＣＴ感受性ＫＲＹＰＴＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｏｒｔａｇｅ ＭＩ、ＵＳＡ）を用いる免疫蛍光により血漿－ＥＤＴＡにおいてＰｈａｄｉａ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって測定が行われた。いくつかのペアの血清と血漿試料について反復試験を実施し、濃度における等価が明らかにされた。したがって、全てのプロカルシトニン測定を、試験プラットフォームを問わず、等価的に処理した。
研究中の異なる時期に濃度を測定し、結果として、有効性に基づいて、異なるプラットフォームを利用した。いくつかの血清測定を、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ ２０１０アナライザ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌａｖａｌ、Ｃａｎａｄａ）において電気化学発光イムノアッセイにより行った。追加の血清測定を、ｍｉｎｉＶＩＤＡＳイムノアッセイ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ、ＵＳＡ）を用いて行った。血清が入手できない場合、Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ ＰＣＴ感受性ＫＲＹＰＴＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｏｒｔａｇｅ ＭＩ、ＵＳＡ）を用いる免疫蛍光により血漿－ＥＤＴＡにおいてＰｈａｄｉａ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって測定が行われた。いくつかのペアの血清と血漿試料について反復試験を実施し、濃度における等価が明らかにされた。したがって、全てのプロカルシトニン測定を、試験プラットフォームを問わず、等価的に処理した。
マイクロアレイ作製
最初の臨床所見において、患者を登録し、試料を分析のために収集した。判定を上記のように実施した後、明らかな臨床表現型を有する３１７人の対象を、遺伝子発現分析のために選択した。全ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて製造会社のプロトコールに従い、ヒト血液から抽出した。ＲＮＡの量および品質を、それぞれ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて評価した。マイクロアレイをＲＭＡ正規化した。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集を、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）において、ＧｅｎｅＣｈｉｐヒトゲノムＵ１３３Ａ ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術マニュアルに従い、実施した。
最初の臨床所見において、患者を登録し、試料を分析のために収集した。判定を上記のように実施した後、明らかな臨床表現型を有する３１７人の対象を、遺伝子発現分析のために選択した。全ＲＮＡを、ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて製造会社のプロトコールに従い、ヒト血液から抽出した。ＲＮＡの量および品質を、それぞれ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて評価した。マイクロアレイをＲＭＡ正規化した。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集を、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）において、ＧｅｎｅＣｈｉｐヒトゲノムＵ１３３Ａ ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術マニュアルに従い、実施した。
統計的分析
３１７人の対象（２７３人の疾病患者および４４人の健康なボランティア）のトランスクリプトームを、７個の重複試料と共に、２つのマイクロアレイバッチにおいて測定した（ＧＳＥ６３９９０）。探索的主成分分析および階層的クラスタ分析により、実質的なバッチ差が明らかにされた。これらを、ベイジアン固定効果モデルを用いて、プローブに関する平均バッチ効果をまず、推定し、かつ除去することにより補正した。次に、本発明者らは、７個の重複試料を用いて、ロバスト線形回帰モデルをＨｕｂｅｒ損失関数にフィッティングさせ、それを用いて、残りの発現値を調整した。
３１７人の対象（２７３人の疾病患者および４４人の健康なボランティア）のトランスクリプトームを、７個の重複試料と共に、２つのマイクロアレイバッチにおいて測定した（ＧＳＥ６３９９０）。探索的主成分分析および階層的クラスタ分析により、実質的なバッチ差が明らかにされた。これらを、ベイジアン固定効果モデルを用いて、プローブに関する平均バッチ効果をまず、推定し、かつ除去することにより補正した。次に、本発明者らは、７個の重複試料を用いて、ロバスト線形回帰モデルをＨｕｂｅｒ損失関数にフィッティングさせ、それを用いて、残りの発現値を調整した。
スパースロジスティック回帰などのスパース分類方法は、過剰フィッティングリスクを低下させながら、同時に分類および変数選択を実施する２１。したがって、一変量検定またはスパース因子モデルなどの別個の遺伝子選択ストラテジーは不必要である。ここで、スパースロジスティック回帰モデルを、バッチ補正後、最大分散を有するプローブの４０％を用いて二項タスクのそれぞれへ別々にフィッティングさせた２２。具体的には、本発明者らは、入れ子式交差検証と共に二項尤度を有するＬａｓｓｏ正則化された一般化線形モデルを用いて、正則化パラメータについて選択した。コードは、Ｇｌｍｎｅｔツールボックスを用いてＭａｔｌａｂで書かれた。これは、細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子を生み出した。各二項分類子がクラスメンバーシップ確率（例えば、細菌性ＡＲＩ分類子の場合における、ウイルス性か非感染性のいずれかに対する細菌性の確率）を推定するとの条件で、本発明者らは、最大のメンバーシップ確率がクラスラベルを割り当てる一対多スキームに従うことにより、その３つの分類子を（ＡＲＩ分類子と名付けられた）単一の決定モデルへ統合することができる２１。分類能測定基準は、二項結果についての受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）および三項結果についての混同行列を含んだ２３。
検証
ＡＲＩ分類子を、それが導かれた同じ集団において、一個抜き交差検証を用いて検証した。３２８人の個体からの公的に入手可能なヒト遺伝子発現データセット（ＧＳＥ６２６９、ＧＳＥ４２０２６、ＧＳＥ４０３９６、ＧＳＥ２０３４６、およびＧＳＥ４２８３４）を用いて、独立した外部検証を行った。データセットは、それらが少なくとも２つの臨床群（細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病）を含んだ場合に選択された。異なるマイクロアレイプラットフォームにわたってプローブを整合させるために、各ＡＲＩ分類子プローブを、遺伝子記号に変換し、それらを用いて、対応する標的マイクロアレイプローブを同定した。
ＡＲＩ分類子を、それが導かれた同じ集団において、一個抜き交差検証を用いて検証した。３２８人の個体からの公的に入手可能なヒト遺伝子発現データセット（ＧＳＥ６２６９、ＧＳＥ４２０２６、ＧＳＥ４０３９６、ＧＳＥ２０３４６、およびＧＳＥ４２８３４）を用いて、独立した外部検証を行った。データセットは、それらが少なくとも２つの臨床群（細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病）を含んだ場合に選択された。異なるマイクロアレイプラットフォームにわたってプローブを整合させるために、各ＡＲＩ分類子プローブを、遺伝子記号に変換し、それらを用いて、対応する標的マイクロアレイプローブを同定した。
結果
細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子
臨床状態間を区別する宿主遺伝子発現に基づいた分類子を作製することにおいて、全ての関連した臨床表現型が、モデル訓練過程中に表されるべきである。これは、特異度を付与し、モデルがこれらの含まれた臨床群に適用されることを可能にするが、モデル訓練に存在しなかった臨床表現型への適用は可能にならない１５。ＡＲＩ診断についての標的集団は、ウイルス性病因および細菌性病因を有する患者を含むだけでなく、別の可能性 － 細菌性ＡＲＩもウイルス性ＡＲＩも有さない患者からも区別しなければならない。歴史的にみて、健康な個体は、感染していない対照群としての役割を果たしてきた。しかしながら、これは、類似した臨床症状を示し得る非感染性疾病を有する患者がどのように分類されるかという点を考慮できておらず、診断ミスの潜在源となる。本発明者らの知る限りでは、ＡＲＩ遺伝子発現に基づいた分類子が、それの導出において疾病の感染していない対照を含むものはない。したがって、本発明者らは、市中発症のウイルス性ＡＲＩ（ｎ＝１１５）、細菌性ＡＲＩ（ｎ＝７０）、または非感染性疾病（ｎ＝８８）を有する、最初の臨床所見時点における大きい不均一な患者集団を登録した（表９Ａ、９Ｂ）。本発明者らはまた、ＡＲＩ分類子開発のための最も適切な対照集団を定義するために健康な成人対照コホート（ｎ＝４４）を含めた。
細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子
臨床状態間を区別する宿主遺伝子発現に基づいた分類子を作製することにおいて、全ての関連した臨床表現型が、モデル訓練過程中に表されるべきである。これは、特異度を付与し、モデルがこれらの含まれた臨床群に適用されることを可能にするが、モデル訓練に存在しなかった臨床表現型への適用は可能にならない１５。ＡＲＩ診断についての標的集団は、ウイルス性病因および細菌性病因を有する患者を含むだけでなく、別の可能性 － 細菌性ＡＲＩもウイルス性ＡＲＩも有さない患者からも区別しなければならない。歴史的にみて、健康な個体は、感染していない対照群としての役割を果たしてきた。しかしながら、これは、類似した臨床症状を示し得る非感染性疾病を有する患者がどのように分類されるかという点を考慮できておらず、診断ミスの潜在源となる。本発明者らの知る限りでは、ＡＲＩ遺伝子発現に基づいた分類子が、それの導出において疾病の感染していない対照を含むものはない。したがって、本発明者らは、市中発症のウイルス性ＡＲＩ（ｎ＝１１５）、細菌性ＡＲＩ（ｎ＝７０）、または非感染性疾病（ｎ＝８８）を有する、最初の臨床所見時点における大きい不均一な患者集団を登録した（表９Ａ、９Ｂ）。本発明者らはまた、ＡＲＩ分類子開発のための最も適切な対照集団を定義するために健康な成人対照コホート（ｎ＝４４）を含めた。
本発明者らは、まず、対照として健康な個体を用いて導かれた遺伝子発現分類子が、非感染性疾病を有する患者を正確に分類できるかどうかを決定した。細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩを有する患者、および健康な対照からのアレイデータを用いて、これらの条件についての遺伝子発現分類子を作製した。一個抜き交差検証により、９０％の総合精度として、細菌性ＡＲＩ（ＡＵＣ ０．９６）、ウイルス性ＡＲＩ（ＡＵＣ ０．９５）、および健康（ＡＵＣ １．０）対象間の非常に精度の高い識別が明らかにされた（図７）。しかしながら、分類子が、疾病を患っているが感染していない（ｉｌｌ－ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ）患者に適用された場合、４８／８８が細菌性、３５／８８がウイルス性、および５／８８が健康と同定された。これは、健康な個体が、バイオマーカー発見過程において非感染性疾病を有する患者の代用とはならないことを浮かび上がらせた。
結果的に、本発明者らは、健康な対照よりむしろ非感染性疾病の対照を用いて、ＡＲＩ分類子を再び導き出した。具体的には、これらの３つの群からのアレイデータを用いて、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病に対する宿主応答の３つの遺伝子発現分類子を作製した（図５）。具体的には、細菌性ＡＲＩ分類子は、ウイルス性ＡＲＩまたは非感染性疾病のいずれに対しても細菌性ＡＲＩを有する者を明白に同定する仕事が課された。ウイルス性ＡＲＩ分類子は、細菌性ＡＲＩまたは非感染性疾病に対してウイルス性ＡＲＩを有する者を明白に同定する仕事が課された。非感染性疾病分類子は、全てのそのような症例の十分な表示を必要とする全ての非感染性疾病を明白に同定するという意図では作製されなかった。
むしろ、それは、代替カテゴリーとして作製され、それゆえに、細菌性ＡＲＩもウイルス性ＡＲＩも有しない患者が割り当てられ得る。さらに本発明者らは、健康な人々はそのような分類タスクの標的である可能性は低いことから、そのような疾病を患っているが感染していない患者が、より臨床的に関連した対照であると仮定した。
線形サポートベクターマシン、教師有り因子モデル、スパース多項ロジスティック回帰、エラスティックネット（ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ）、Ｋ近傍法、およびランダムフォレストである、６つの総計的ストラテジーを利用して、これらの遺伝子発現分類子を作製した。全ては同じように機能したが、スパースロジスティック回帰は最も少ない数の分類子遺伝子を必要とし、わずかな差で、他のストラテジーより機能が優れていた（データ未呈示）。本発明者らはまた、３つの別個の二項分類子を作製したストラテジーを、所定の対象を３つの臨床カテゴリーの１つに同時に割り当てる単一の多項分類子と比較した。この後者のアプローチは、より多くの遺伝子を必要とし、かつ精度がより低かった。結果的に、本発明者らは、スパースロジスティック回帰モデルを適用して、７１個、３３個、および２６個のプローブシグネチャをそれぞれ含有する、細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子を定義した。プローブおよび分類子重みは表１０Ａから１０Ｆに示されている。
臨床意思決定は、まれに二項からなり、複数の診断可能性の同時的区別を必要とする。本発明者らは、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病の確率を割り当てるために一個抜き交差検証を用いて、まとめてＡＲＩ分類子と定義された、全ての３つの分類子を適用した（図６）。これらの条件は、相互排他的ではない。例えば、細菌性ＡＲＩの存在によって、同時的なウイルス性ＡＲＩまたは非感染性疾患が妨げられることはない。さらに、割り当てられた確率は、患者の遺伝子発現応答が、その条件の正準シグネチャにマッチする程度を表す。各シグネチャは、その他のものとは無関係に、意図的に機能するため、確率は、１つに合計することは予定されない。分類を単純化するために、最も高い予測確率が、クラス割当を決定した。全体的な分類精度は、８７％（２３８／２７３が、判定された表現型と一致した）であった。
細菌性ＡＲＩは、５８／７０（８３％）の患者において同定され、細菌感染を有しない１７９／１９１（９４％）を除外した。ウイルス性ＡＲＩは、９０％（１０４／１１５）で同定され、症例の９２％（１４５／１５８）で除外した。非感染性疾病分類子を用いて、感染は、症例の８６％（７６／８８）で除外された。有病率が、感染型、患者特性、または場所を含む多数の理由によって異なり得ることを考慮して、全ての３つの分類子の陽性的中率および陰性的中率について感度分析を実施した（図８）。細菌分類とウイルス分類の両方について、的中率は、ＡＲＩについて典型的に見出されるものを含む広範な有病率推定にわたって高水準に留まった。
何らかの年齢の効果があるかどうかを決定するために、本発明者らは、分類スキームにおける変数としてそれを含めた。これは、結果として２つの追加の正分類を生じたが、これはおそらく、ウイルス性ＡＲＩコホートにおける若い人々が大きな比率を占めていたためである。しかしながら、本発明者らは、年齢による、正しく分類された対象と間違って分類された対象の統計的に有意な差を観察しなかった（ウィルコクソン順位和ｐ＝０．１７）。
本発明者らは、この性能を、細菌感染に特異的な広く用いられているバイオマーカーであるプロカルシトニンと比較した。プロカルシトニン濃度を、試料が入手可能である２３８人の対象について決定し、このサブグループについてＡＲＩ分類子性能と比較した。０．２５μｇ／Ｌより高いプロカルシトニン濃度は、患者を、細菌性ＡＲＩを有すると割り当て、一方、０．２５μｇ／Ｌ以下の値は、患者を、ウイルス性ＡＲＩか非感染性疾病のいずれかであり得る非細菌性と割り当てた。プロカルシトニンは、ＡＲＩ分類子を用いての２０４／２３８（８６％）と比較して、２３８人の患者のうち１８６人（７８％）を正しく分類した（ｐ＝０．０３）。しかしながら、その２つのストラテジーについての精度は、分類タスクによって異なった。例えば、ウイルス性ＡＲＩを細菌性ＡＲＩから識別することにおいて性能は類似した。プロカルシトニンは、ＡＲＩ分類子についての１４０／１５５と比較して、１３６／１５５（ＡＵＣ ０．８９）を正しく分類した（イェーツ補正を有するマクネマーの検定を用いて、ｐ値＝０．６５）。しかしながら、ＡＲＩ分類子は、細菌性ＡＲＩを非感染性疾病から識別すること［１０５／１２４対７９／１２４（ＡＵＣ ０．７２）；ｐ値＜０．００１］、ならびに細菌性ＡＲＩをウイルス性および非感染性病因を含む全ての他の病因から識別すること［２１５／２３８対１８６／２３８（ＡＵＣ ０．８２）；ｐ値＝０．０２］において、プロカルシトニンより有意に優れていた。
本発明者らは次に、ＡＲＩ分類子を、細菌感染対ウイルス感染の３つの公表された遺伝子発現分類子（それぞれは、感染していない疾病対照を含まずに導かれた）と比較した。これらは、インフルエンザまたは細菌性敗血症を有する子どもから導かれた３５プローブの分類子（Ｒａｍｉｌｏ）１１；熱性ウイルス性疾病または細菌感染を有する子どもから導かれた３３ブローブの分類子（Ｈｕ）１４；および市中肺炎またはインフルエンザを有する成人ＩＣＵ患者から導かれた２９プローブの分類子（Ｐａｒｎｅｌｌ）１２を含んだ。本発明者らは、ウイルス性または細菌感染を有する患者のみを用いて作製された分類子が、疾病を患っているが、感染していない患者を含む臨床的に関連した集団に適用された場合、うまく機能しないだろうと仮説を立てた。具体的には、細菌感染もウイルス感染ももたない個体に関して示すと、以前に公表された分類子は、その個体を第３の別のカテゴリーに正確に割り当てることができないだろう。したがって、本発明者らは、導かれた分類子、加えて公表された分類子を本発明者らの２７３人の患者コホートに適用した。細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病の間の識別は、その導かれたＡＲＩ分類子に関してより優れていた（イェーツ補正を有するマクネマーの検定、Ｒａｍｉｌｏに対してｐ＝０．００２；Ｐａｒｎｅｌｌに対してｐ＝０．０００１；およびＨｕに対してｐ＝０．０８）（表７）２４，２５。これは、ＡＲＩの場合、非感染性疾病を含むはずである、意図された使用集団を代表するコホートにおいて遺伝子発現分類子を導くことの重要性を浮き彫りにしている１５。
不一致の分類
ＡＲＩ分類子性能をより良く理解するために、本発明者らは、３５個の不一致の症例を個々に再検討した。９個の判定された細菌感染はウイルス性と分類され、３個が非感染性疾病と分類された。４個のウイルス感染は細菌性と分類され、７個が非感染性と分類された。８個の非感染性症例は、細菌性と分類され、４個がウイルス性と分類された。本発明者らは、不一致の症例の間での一貫したパターンを観察しなかったが、顕著な例が、典型的ではない細菌感染に含まれた。血清学的変換に基づいたＭ．ニューモニエを有する１人の患者、およびレジオネラ肺炎を有する３人の患者のうちの１人は、ウイルス性ＡＲＩと分類された。自己免疫疾患または炎症性疾患による非感染性疾病を有する６人の患者のうち、スチル病を有すると判定された１人のみが、細菌感染を有すると分類された。参照により本明細書に組み入れられている、Ｔｓａｌｉｋら、（２０１６） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３２２）：１－９のｅＴａｂｌｅ ３もまた参照されたい。
ＡＲＩ分類子性能をより良く理解するために、本発明者らは、３５個の不一致の症例を個々に再検討した。９個の判定された細菌感染はウイルス性と分類され、３個が非感染性疾病と分類された。４個のウイルス感染は細菌性と分類され、７個が非感染性と分類された。８個の非感染性症例は、細菌性と分類され、４個がウイルス性と分類された。本発明者らは、不一致の症例の間での一貫したパターンを観察しなかったが、顕著な例が、典型的ではない細菌感染に含まれた。血清学的変換に基づいたＭ．ニューモニエを有する１人の患者、およびレジオネラ肺炎を有する３人の患者のうちの１人は、ウイルス性ＡＲＩと分類された。自己免疫疾患または炎症性疾患による非感染性疾病を有する６人の患者のうち、スチル病を有すると判定された１人のみが、細菌感染を有すると分類された。参照により本明細書に組み入れられている、Ｔｓａｌｉｋら、（２０１６） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３２２）：１－９のｅＴａｂｌｅ ３もまた参照されたい。
外部検証
高次元の遺伝子発現データから分類子を作製することは、過剰フィッティングを生じ得る。したがって、本発明者らは、５つの入手可能なデータセット（ＧＳＥ６２６９、ＧＳＥ４２０２６、ＧＳＥ４０３９６、ＧＳＥ２０３４６、およびＧＳＥ４２８３４）において代表される３２８人の個体からの遺伝子発現データを用いてインシリコでＡＲＩ分類子を検証した。これらは、それらが、年齢、地域的分布、および疾病重症度の点で異なる、少なくとも２つの関連した臨床群を含むことから選択された（表８）。ＡＲＩ分類子を、細菌性ＡＲＩおよびウイルス性ＡＲＩを有する４つのデータセットへ適用すると、ＡＵＣは、０．９０～０．９９の範囲であった。最後に、ＧＳＥ４２８３４は細菌性肺炎（ｎ＝１９）、肺癌（ｎ＝１６）、およびサルコイドーシス（ｎ＝６８）を有する患者を含んだ。全体的な分類精度は、０．９９のＡＵＣに対応する９６％（９９／１０３）であった。ＧＳＥ４２８３４は、処置前および処置後の細菌性肺炎を有する５人の対象を含んだ。５個全てが、細菌感染の処置依存性消散を示した。参照により本明細書に組み入れられている、Ｔｓａｌｉｋら、（２０１６） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３２２）：１－９のｅＦｉｇｕｒｅｓ ３－８もまた参照されたい。
高次元の遺伝子発現データから分類子を作製することは、過剰フィッティングを生じ得る。したがって、本発明者らは、５つの入手可能なデータセット（ＧＳＥ６２６９、ＧＳＥ４２０２６、ＧＳＥ４０３９６、ＧＳＥ２０３４６、およびＧＳＥ４２８３４）において代表される３２８人の個体からの遺伝子発現データを用いてインシリコでＡＲＩ分類子を検証した。これらは、それらが、年齢、地域的分布、および疾病重症度の点で異なる、少なくとも２つの関連した臨床群を含むことから選択された（表８）。ＡＲＩ分類子を、細菌性ＡＲＩおよびウイルス性ＡＲＩを有する４つのデータセットへ適用すると、ＡＵＣは、０．９０～０．９９の範囲であった。最後に、ＧＳＥ４２８３４は細菌性肺炎（ｎ＝１９）、肺癌（ｎ＝１６）、およびサルコイドーシス（ｎ＝６８）を有する患者を含んだ。全体的な分類精度は、０．９９のＡＵＣに対応する９６％（９９／１０３）であった。ＧＳＥ４２８３４は、処置前および処置後の細菌性肺炎を有する５人の対象を含んだ。５個全てが、細菌感染の処置依存性消散を示した。参照により本明細書に組み入れられている、Ｔｓａｌｉｋら、（２０１６） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３２２）：１－９のｅＦｉｇｕｒｅｓ ３－８もまた参照されたい。
生物学的経路
分類子を生じたスパースロジスティック回帰モデルは、追加の診断価値がない場合には、所定の経路からの遺伝子の選択を不利にする。結果的に、通常の遺伝子エンリッチメント経路分析は、実施するのに適切ではない。さらに、そのような通常の遺伝子エンリッチメント分析が記載されている９，１２，１４，２８，２９。代わりに、全ての分類子遺伝子について文献レビューを実施した（表１１）。細菌分類子、ウイルス分類子、および非感染性疾病分類子の間での重複は、図９に示されている。
分類子を生じたスパースロジスティック回帰モデルは、追加の診断価値がない場合には、所定の経路からの遺伝子の選択を不利にする。結果的に、通常の遺伝子エンリッチメント経路分析は、実施するのに適切ではない。さらに、そのような通常の遺伝子エンリッチメント分析が記載されている９，１２，１４，２８，２９。代わりに、全ての分類子遺伝子について文献レビューを実施した（表１１）。細菌分類子、ウイルス分類子、および非感染性疾病分類子の間での重複は、図９に示されている。
ウイルス分類子は、インターフェロン応答、Ｔ細胞シグナル伝達、およびＲＮＡプロセシングなどの既知の抗ウイルス応答カテゴリーを含んだ。ウイルス分類子は、核輸送に関与し、ウイルス性タンパク質およびゲノムの輸送のためにウイルスにより選出される、ＫＰＮＢ１などのＲＮＡプロセシング経路を最もよく表している２６，２７。それの下方制御は、それが宿主応答において抗ウイルスの役割を果たし得ることを示唆している。
細菌分類子は、最も幅広い細胞過程、特に、細胞周期制御、細胞増殖、および分化を包含した。細菌分類子は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞シグナル伝達において重要な遺伝子を含んだ。細菌分類子に固有なのは、敗血症関連代謝摂動と一致した、酸化ストレス、ならびに脂肪酸およびアミノ酸代謝に関与する遺伝子であった２８。
臨床適応性の概要
本発明者らは、宿主遺伝子発現変化が、原因病原体クラスに非常に特異的であり、かつ呼吸器病の一般的な病因を識別するために用いられ得ることを決定した。これは、不適切な抗生物質使用および新たに生じる抗生物質耐性を食い止めるための新規な診断プラットフォームとして遺伝子発現分類子を開発し、利用する機会を生み出す。スパースロジスティック回帰を用いて、本発明者らは、急性呼吸器症状を有する患者において細菌性病因とウイルス性病因を正確に区別する宿主遺伝子発現プロファイルを開発した（外部検証ＡＵＣ ０．９０～０．９９）。非感染性疾病対照群を用いてＡＲＩ分類子を導くことは、幅広い有病率推定にわたって高い陰性的中率をもたらした。
本発明者らは、宿主遺伝子発現変化が、原因病原体クラスに非常に特異的であり、かつ呼吸器病の一般的な病因を識別するために用いられ得ることを決定した。これは、不適切な抗生物質使用および新たに生じる抗生物質耐性を食い止めるための新規な診断プラットフォームとして遺伝子発現分類子を開発し、利用する機会を生み出す。スパースロジスティック回帰を用いて、本発明者らは、急性呼吸器症状を有する患者において細菌性病因とウイルス性病因を正確に区別する宿主遺伝子発現プロファイルを開発した（外部検証ＡＵＣ ０．９０～０．９９）。非感染性疾病対照群を用いてＡＲＩ分類子を導くことは、幅広い有病率推定にわたって高い陰性的中率をもたらした。
気道感染症は、２０１１年において、いかなる他の原因よりも多い、世界中で３２０万人の死亡をもたらし、１億６４００万年の障害調整生命年が失われた１，２。症例の大部分がウイルス性病因であるにも関わらず、急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）を有する米国における外来患者の７３％が抗生物質を処方され、この設定において処方された全抗生物質の４１％を占める３，４。ウイルス病原体が微生物学的に確認されている場合でさえも、これは、同時の細菌感染の可能性を排除するものではなく、「万が一に備えて」の抗菌剤の処方につながる。この経験主義が、抗菌耐性を生じさせ５，６、それは、国家安全保障の優先事項として認識されている７。この実施例に提供された有望な測定規準法は、処置を最適化し、かつ抗生物質耐性の出現を軽減する臨床的にすぐに実施できる結果を与える機会をもたらす。
いくつかの研究は、ＡＲＩについての宿主応答診断を開発することにおいて注目すべき取り組みとなった。これは、呼吸器ウイルス８，１０～１２，１４、ＩＣＵ集団における細菌性病因１２，３０、および結核３１～３３に対する応答を含む。典型的には、これらは、健康な状態と比較しての宿主応答プロファイルを定義し、宿主生態の価値ある洞察を提供する１６，３４，３５。しかしながら、これらの遺伝子リストは、診断適用に関して準最適であるが、それは、その診断の構成要素である遺伝子発現プロファイルが、試験が適用されるだろう集団を代表していないからである１５。健康な個体は、急性呼吸器の疾病を示しておらず、したがって、彼らは、本明細書で報告された宿主応答診断開発から排除される。
細菌感染およびウイルス感染を有する患者を含むことは、これらの２つの状態の間の区別を可能にするが、非感染性疾病を分類する方法に取り組んでいない。患者が、症状を共有し得る感染性病因および非感染性病因を示すため、この表現型を含むことは重要である。すなわち、症状は、医師に、高度の診断確実性を提供しない可能性がある。ＡＲＩ症状についての３つの最も可能性が高い状態を含むことの必要性を独自によく理解している本アプローチは、そのような試験が最も窮乏している区別されていない臨床集団へ適用することができる。
生じた少数の不一致の分類は、分類の誤りかまたは臨床表現型検査の誤りかのいずれかから生じた可能性がある。臨床表現型検査の誤りは、現在の微生物学的診断の限界により原因病原体を同定することができないことから生じ得る。あるいは、いくつかの非感染性疾患過程が、まだ発見されていない機構により、実際、感染関連であり得る。不一致の症例は、病原体型、症候群、または患者特性などの統一変数により明確には説明されなかった。それゆえに、本明細書に提示された遺伝子発現分類子は、患者特異的変数（例えば、処置、併存症、疾病の期間）、試験特異的変数（例えば、試料処理、アッセイ条件、ＲＮＡ品質および収量）、またはまだ今のところ同定されていない変数を含む他の因子によって影響を及ぼされる可能性がある。
［実施例２］
細菌性病原体およびウイルス性病原体の同定により定義された同時感染を有する患者における分類能
年齢が分類精度に有意には影響を及ぼさないことを決定したことに加えて、本発明者らは、疾病の重症度またはＳＩＲＳの病因が分類に影響するかどうかを評価した。ウイルス性ＡＲＩを有する患者は、より低い入院率によって証明されているように、あまり疾病を患わない傾向があった。様々なコホートにおいて、入院を、疾患重症度のマーカーとして用い、それの分類能への影響を評価した。この試験により、差がないことが明らかにされた（フィッシャー直接検定 １のｐ値）。加えて、ＳＩＲＳ対照コホートは、呼吸器病因を有する対象と非呼吸器病因を有する対象の両方を含んだ。本発明者らは、呼吸器ＳＩＲＳを有する対象対非呼吸器ＳＩＲＳを有する対象において分類が異なるかどうかを評価し、それは異ならないことを決定した（フィッシャー直接検定 ０．１３０５のｐ値）。
細菌性病原体およびウイルス性病原体の同定により定義された同時感染を有する患者における分類能
年齢が分類精度に有意には影響を及ぼさないことを決定したことに加えて、本発明者らは、疾病の重症度またはＳＩＲＳの病因が分類に影響するかどうかを評価した。ウイルス性ＡＲＩを有する患者は、より低い入院率によって証明されているように、あまり疾病を患わない傾向があった。様々なコホートにおいて、入院を、疾患重症度のマーカーとして用い、それの分類能への影響を評価した。この試験により、差がないことが明らかにされた（フィッシャー直接検定 １のｐ値）。加えて、ＳＩＲＳ対照コホートは、呼吸器病因を有する対象と非呼吸器病因を有する対象の両方を含んだ。本発明者らは、呼吸器ＳＩＲＳを有する対象対非呼吸器ＳＩＲＳを有する対象において分類が異なるかどうかを評価し、それは異ならないことを決定した（フィッシャー直接検定 ０．１３０５のｐ値）。
ＡＲＩを有する幾人かの患者は、しばしば同時感染と呼ばれる、細菌性病原体とウイルス性病原体の両方が同定される。しかしながら、宿主がそのような状況においてどのように応答するかは明らかではない。疾病は、患者の臨床経過における異なる時点において、細菌、ウイルス、両方、またはどちらでもないものにより操縦され得る。したがって、本発明者らは、細菌性ＡＲＩ分類子およびウイルス性ＡＲＩ分類子が、細菌とウイルスの同時感染を含む集団においてどのように機能するかを決定した。ＧＳＥ６０２４４は、細菌性肺炎（ｎ＝２２）、ウイルス性気道感染症（ｎ＝７１）、および細菌性／ウイルス性同時同定（ｎ＝２５）を含んだ。同時同定群は、細菌性またはウイルス性疾患の見込みに関するさらなる下位カテゴリー化を行うことなく、細菌性とウイルス性の両方の病原体の存在により定義された。本発明者らは、細菌またはウイルス感染を有するＧＳＥ６０２４４における対象において分類子を訓練し、その後、同時同定を有する対象において検証した（図１０）。宿主応答は、０．５の確率閾値を上回る陽性とみなされた。本発明者らは、全ての４つの可能なカテゴリーを観察した。２５人の対象のうちの６人は、陽性細菌性シグネチャを有し、１４／２５はウイルス性応答を有し、３／２５は陽性細菌性およびウイルス性シグネチャを有し、２／２５はいずれも示さなかった。
医師が直面する重要な臨床決定は、抗細菌剤を処方するかどうかである。より単純な診断ストラテジーは、細菌性ＡＲＩ分類子からの結果に従っての細菌性ＡＲＩの確率へのみ焦点を合わせ得る。しかしながら、ウイルス性または非感染性の別の可能性についての情報を提供することは価値がある。例えば、代替診断の確率が高いと、細菌性ＡＲＩの確率が低い患者において抗細菌剤を差し控えることに関しより大きな自信を持つことができる。さらに、完全な診断報告は、単一の分類子が見逃すだろう同時発生的疾病を同定することができる。本発明者らは、細菌とウイルスの同時同定を含む集団において検証した場合、これを観察した。これらの患者は、より一般的には、「同時感染した」と呼ばれる。感染を生じるために、病原体、宿主、およびその２つの間での不適応な相互作用が存在しているに違いない。細菌性病原体およびウイルス性病原体を単に同定することは、同時感染を含意するべきではない。本発明者らは、細菌／ウイルスの同時同定の証拠を有する試験された２５人の対象における真の感染状態を知ることができないが、宿主応答分類子は、複数の宿主応答状態の存在を示唆している。図１０は、感染状態の情報を与える図であり、ＡＲＩの病因を診断するために臨床医によって用いられ得る。
参考文献
［実施例３］
ＴＬＤＡプラットフォームにおいて企図された細菌／ウイルス／ＳＩＲＳアッセイ
本発明者らは、３８４ウェルのＴａｑＭａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プラットフォームにおけるカスタムの多分析物定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）アッセイを開発しようとしている。ＴＬＤＡカードは、データ正規化のための複数の内在性対照ＲＮＡ標的（プライマー／プローブセット）と共に、各ウェルにおいて分類子における遺伝子ｍＲＮＡ転写産物に特異的な１つまたは複数のＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用いて製造される。各患者試料について、精製された全ＲＮＡは、ｃＤＮＡへ逆転写され、マスターウェルへロードされ、マイクロ流体チャネルを通しての遠心分離により各アッセイウェルへ分配される。ＴａｑＭａｎ加水分解プローブは、増幅ラウンドごとの相補性標的配列とのハイブリダイゼーション中に二重標識プローブを切断し、その結果として、蛍光シグナル発生を生じる、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に依存する。この様式において、「リアルタイム」での蓄積されたＰＣＲ産物の定量的検出が可能である。指数関数的増幅および検出の間、蛍光シグナルが検出閾値を超える時点のＰＣＲサイクルの数が、ＲＴ－ＰＣＲ計器についての市販のソフトウェアにより決定される場合の閾値サイクル（Ｃｔ）または定量化サイクル（Ｃｑ）である。遺伝子発現を定量化するために、標的ＲＮＡについてのＣｔが、内在性正規化ＲＮＡ（または複数の正規化ＲＮＡの相乗平均）のＣｔから引き算され、それにより、試料内の各ＲＮＡ標的についてのδＣｔ値が与えられ、それは、入力試料ＲＮＡまたはｃＤＮＡの量または品質の変動について正規化された標的ＲＮＡの相対的発現を示す。
ＴＬＤＡプラットフォームにおいて企図された細菌／ウイルス／ＳＩＲＳアッセイ
本発明者らは、３８４ウェルのＴａｑＭａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プラットフォームにおけるカスタムの多分析物定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）アッセイを開発しようとしている。ＴＬＤＡカードは、データ正規化のための複数の内在性対照ＲＮＡ標的（プライマー／プローブセット）と共に、各ウェルにおいて分類子における遺伝子ｍＲＮＡ転写産物に特異的な１つまたは複数のＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用いて製造される。各患者試料について、精製された全ＲＮＡは、ｃＤＮＡへ逆転写され、マスターウェルへロードされ、マイクロ流体チャネルを通しての遠心分離により各アッセイウェルへ分配される。ＴａｑＭａｎ加水分解プローブは、増幅ラウンドごとの相補性標的配列とのハイブリダイゼーション中に二重標識プローブを切断し、その結果として、蛍光シグナル発生を生じる、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に依存する。この様式において、「リアルタイム」での蓄積されたＰＣＲ産物の定量的検出が可能である。指数関数的増幅および検出の間、蛍光シグナルが検出閾値を超える時点のＰＣＲサイクルの数が、ＲＴ－ＰＣＲ計器についての市販のソフトウェアにより決定される場合の閾値サイクル（Ｃｔ）または定量化サイクル（Ｃｑ）である。遺伝子発現を定量化するために、標的ＲＮＡについてのＣｔが、内在性正規化ＲＮＡ（または複数の正規化ＲＮＡの相乗平均）のＣｔから引き算され、それにより、試料内の各ＲＮＡ標的についてのδＣｔ値が与えられ、それは、入力試料ＲＮＡまたはｃＤＮＡの量または品質の変動について正規化された標的ＲＮＡの相対的発現を示す。
定量化された遺伝子シグネチャについてのデータは、その後、コンピュータを用い、上記のプロビット分類子（方程式１）に従って処理され、ここに再生される。シグネチャの各遺伝子の正規化遺伝子発現レベルは、分類子に用いられる説明変数または独立変数または特徴量であり、この実施例において、分類子の一般的な型は、以下のプロビット回帰式である：
Ｐ（ｈａｖｉｎｇ条件）＝Φ（β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋…＋βｄＸｄ）（方程式１）
式中、条件は、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病であり；Φ（．）はプロビットリンク関数であり；｛β１，β２，…，βｄ｝は訓練中に得られた係数であり；｛Ｘ１，Ｘ２，…，Ｘｄ｝はシグネチャの正規化遺伝子発現値であり；ｄはシグネチャのサイズ（遺伝子の数）である。各説明変数についての係数の値は、プロビット回帰モデルに用いられる遺伝子または遺伝子の部分集合の発現を測定するために用いられるテクノロジープラットフォームに特異的である。コンピュータプログラムは、スコアまたは確率を計算し、そのスコアを閾値と比較する。各分類子の感度、特異度、および全体的な精度は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて分類についての閾値を変化させることにより最適化される。
Ｐ（ｈａｖｉｎｇ条件）＝Φ（β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋…＋βｄＸｄ）（方程式１）
式中、条件は、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病であり；Φ（．）はプロビットリンク関数であり；｛β１，β２，…，βｄ｝は訓練中に得られた係数であり；｛Ｘ１，Ｘ２，…，Ｘｄ｝はシグネチャの正規化遺伝子発現値であり；ｄはシグネチャのサイズ（遺伝子の数）である。各説明変数についての係数の値は、プロビット回帰モデルに用いられる遺伝子または遺伝子の部分集合の発現を測定するために用いられるテクノロジープラットフォームに特異的である。コンピュータプログラムは、スコアまたは確率を計算し、そのスコアを閾値と比較する。各分類子の感度、特異度、および全体的な精度は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて分類についての閾値を変化させることにより最適化される。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームからのシグネチャ（Ａｆｆｙシグネチャ）および他の供給源からのシグネチャに基づいたＴＬＤＡプラットフォームについての遺伝子の予備リストが下記の表１２に提供されている。それぞれの分類子についてのＴＬＤＡプラットフォームについて適切な重みは、その後、下記の実施例４に記載されているように決定された。
［実施例４］
ＴＬＤＡプラットフォームにおいて企図された、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定される遺伝子発現を用いた細菌／ウイルス／ＳＩＲＳ分類
宿主応答－ＡＲＩ（ＨＲ－ＡＲＩ）試験を構成する３つのシグネチャの遺伝子を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）社製のカスタムＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイカードへ移行した。これらの遺伝子シグネチャの発現を、３８４ウェルＴａｑＭａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ；Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）プラットフォームにおいてカスタムの多分析物定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイを用いて測定した。ＴＬＤＡカードは、ＲＮＡロード量について正規化するために、およびプレート間の変動性について調節するために用いられる複数の内在性対照ＲＮＡ標的（ＴＲＡＰ１、ＰＰＩＢ、ＧＡＰＤＨ、ＦＰＧＳ、ＤＥＣＲ１、および１８Ｓ）と共に、ウェルあたり１つまたは複数のＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用いて設計および製造され、それぞれのプライマー／プローブセットが、ＡＲＩシグネチャにおける特異的なＲＮＡ転写産物を表す。実際には、正規化手順のための試料にわたって最小の変動係数を有する（利用可能な５つのうちの）２つの参照遺伝子を選択し、３３％より大きい欠測値（定量限界より下）を有するプライマー／プローブセットを捨てた。（もしあれば）残りの欠測値を１＋ｍａｘ（Ｃｑ）（ＣｑはＲＴ－ｑＰＣＲについての定量サイクルである）に設定する。その後、正規化発現値を、任意の所定のプライマー／プローブセットについての観察されたＣｑ値を引いた選択された参照の平均として計算した。Ｈｅｌｌｅｍａｎｓら、（２００７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２００７；８（２）：Ｒ１９参照。
ＴＬＤＡプラットフォームにおいて企図された、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定される遺伝子発現を用いた細菌／ウイルス／ＳＩＲＳ分類
宿主応答－ＡＲＩ（ＨＲ－ＡＲＩ）試験を構成する３つのシグネチャの遺伝子を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）社製のカスタムＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイカードへ移行した。これらの遺伝子シグネチャの発現を、３８４ウェルＴａｑＭａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ；Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）プラットフォームにおいてカスタムの多分析物定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイを用いて測定した。ＴＬＤＡカードは、ＲＮＡロード量について正規化するために、およびプレート間の変動性について調節するために用いられる複数の内在性対照ＲＮＡ標的（ＴＲＡＰ１、ＰＰＩＢ、ＧＡＰＤＨ、ＦＰＧＳ、ＤＥＣＲ１、および１８Ｓ）と共に、ウェルあたり１つまたは複数のＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用いて設計および製造され、それぞれのプライマー／プローブセットが、ＡＲＩシグネチャにおける特異的なＲＮＡ転写産物を表す。実際には、正規化手順のための試料にわたって最小の変動係数を有する（利用可能な５つのうちの）２つの参照遺伝子を選択し、３３％より大きい欠測値（定量限界より下）を有するプライマー／プローブセットを捨てた。（もしあれば）残りの欠測値を１＋ｍａｘ（Ｃｑ）（ＣｑはＲＴ－ｑＰＣＲについての定量サイクルである）に設定する。その後、正規化発現値を、任意の所定のプライマー／プローブセットについての観察されたＣｑ値を引いた選択された参照の平均として計算した。Ｈｅｌｌｅｍａｎｓら、（２００７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２００７；８（２）：Ｒ１９参照。
試料あたり合計１７４個の固有のプライマー／プローブセットをアッセイした。これらのプライマー／プローブのうち、１４４個のプライマー／プローブセットは、３つのＡＲＩ遺伝子シグネチャの１３２個の前に記載されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（マイクロアレイ）プローブを表す遺伝子標的（すなわち、細菌遺伝子発現シグネチャ、ウイルス遺伝子発現シグネチャ、および非感染性遺伝子発現シグネチャにおける遺伝子）を測定し、６個のプローブセットは、参照遺伝子用であり、本発明者らは、追加として、以前に発見された汎ウイルス遺伝子シグネチャからの２４個のプローブセットをアッセイした。米国特許第８，８２１，８７６号；Ｚａａｓら、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ （２００９） ６（３）：２０７－２１７参照。さらに、「置き換え」遺伝子用のいくつかのプライマー／プローブセット（これらの遺伝子発現は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘシグネチャからのいくつかの遺伝子の発現と相関している）を訓練のために加えた。いくつかの遺伝子は置き換えられているが、それは、ＴＬＤＡプローブを用いて実施された場合、これらの遺伝子についてのＲＴ－ｑＰＣＲアッセイがうまく機能しなかったからである。
各試料について、全ＲＮＡをＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）から精製し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、製造会社の推奨されたプロトコールに従ってｃＤＮＡへ逆転写した。マスターウェルあたり各試料についての標準量のｃＤＮＡをロードし、マイクロ流体チャネルを通しての遠心分離を介して、各ＴａｑＭａｎアッセイウェルへ分配した。ＴａｑＭａｎ加水分解プローブは、増幅ラウンドごとの相補性標的配列とのハイブリダイゼーション中に二重標識プローブを切断し、その結果として、蛍光シグナル発生を生じる、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に依存する。蛍光の定量的検出は、「リアルタイム」で、蓄積されたＰＣＲ産物を示す。指数関数的増幅および検出の間、蛍光シグナルが検出閾値を超える時点のＰＣＲサイクルの数が、ＲＴ－ＰＣＲ計器についての市販のソフトウェアにより決定される場合の閾値サイクル（Ｃｔ）または定量化サイクル（Ｃｑ）である。
試料／コホート選択：
ＩＲＢ承認されたプロトコールの下、本発明者らは、急性呼吸器病を有する救急科を受診した患者を登録した（下記表１３参照）。このコホートにおける患者は、参照により本明細書に組み入れられているＴｓａｌｉｋら、（２０１６） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３２２）：１－９の表１に報告された患者の部分集合である。これらの患者についての臨床および他の試験データの遡及的な臨床的判定により、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病である３つの割当のうちの１つが導かれる。
ＩＲＢ承認されたプロトコールの下、本発明者らは、急性呼吸器病を有する救急科を受診した患者を登録した（下記表１３参照）。このコホートにおける患者は、参照により本明細書に組み入れられているＴｓａｌｉｋら、（２０１６） Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３２２）：１－９の表１に報告された患者の部分集合である。これらの患者についての臨床および他の試験データの遡及的な臨床的判定により、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病である３つの割当のうちの１つが導かれる。
データ分析方法：
データ前処理段階中、本発明者らは、試料およびプレートにわたる最小の変動係数を有する（利用可能な５つのうちの）少なくとも２つの参照遺伝子標的の部分集合を選択する。本発明者らは、３３％より多い欠測値を有する標的（定量限界より下の１７個の標的）を、これらの値が任意の特定のクラス、例えば、細菌性ＡＲＩにおいて大きな比率を占める場合のみ、捨てた。次に、本発明者らは、残りの欠測値を１＋ｍａｘ（Ｃｑ）に設定し、その後、前に選択された参照組合せを用いて全標的について発現値を正規化した。特に、本発明者らは、正規化発現値を、任意の所定の標的のＣｑ値を引いた選択された参照（ＤＥＣＲ１およびＰＰＩＢ）の平均として計算した。
データ前処理段階中、本発明者らは、試料およびプレートにわたる最小の変動係数を有する（利用可能な５つのうちの）少なくとも２つの参照遺伝子標的の部分集合を選択する。本発明者らは、３３％より多い欠測値を有する標的（定量限界より下の１７個の標的）を、これらの値が任意の特定のクラス、例えば、細菌性ＡＲＩにおいて大きな比率を占める場合のみ、捨てた。次に、本発明者らは、残りの欠測値を１＋ｍａｘ（Ｃｑ）に設定し、その後、前に選択された参照組合せを用いて全標的について発現値を正規化した。特に、本発明者らは、正規化発現値を、任意の所定の標的のＣｑ値を引いた選択された参照（ＤＥＣＲ１およびＰＰＩＢ）の平均として計算した。
いったんデータが正規化されたならば、本発明者らは、スパースロジスティック回帰モデルをそのデータにフィッティングさせることにより分類モデルを構築するように進める（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、（２０１０） Ｊ． Ｓｔａｔ． Ｓｏｆｔｗ． ３３， １－２２）。このモデルは、対象が特定のクラスに属する確率を、正規化遺伝子標的の加重和として推定する。具体的には、本発明者らは、ｐ（対象がクラスに属する）＝σ（ｗ１ｘ１＋… ＋ｗｐｘｐ）と書き、式中、σはロジスティック関数であり、ｗ１， …，ｗｐはフィッティング手順中に推定された分類重みであり、ｘ１， …，ｘｐは正規化発現値を含有するｐ個の遺伝子標的を表す。
アレイに基づいた分類子と同様に、本発明者らは、（１）細菌性ＡＲＩ対ウイルス性ＡＲＩおよび非感染性疾病；（２）ウイルス性ＡＲＩ対細菌性ＡＲＩおよび非感染性疾病；ならびに（３）非感染性疾病対細菌性およびウイルス性ＡＲＩの３つの二項分類子を構築する。その３つの分類子をフィッティングした後、本発明者らは、ｐ（細菌性ＡＲＩ）、ｐ（ウイルス性ＡＲＩ）、およびｐ（非感染性疾病）についての推定値を得る。分類子のそれぞれについての閾値は、対称費用関数を用いて受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線から選択される（予想される感度および特異度はほぼ等しい）（Ｆａｗｃｅｔｔ （２００６） Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎ Ｌｅｔｔ ２７：８６１－８７４）。結果として、対象は、ｐ（細菌性ＡＲＩ）＞ｔｂ（ｔｂは細菌性ＡＲＩ分類子の閾値である）ならば、細菌性ＡＲＩと予測される。同様に、本発明者らは、ウイルス性ＡＲＩ分類子および非感染性疾病分類子についての閾値、それぞれ、ｔｖおよびｔｎを選択する。必要に応じて、最も可能性が高い条件、すなわち、最も大きい確率を有する条件（具体的には、本発明者らはａｒｇｍａｘ｛ｐ（細菌性ＡＲＩ），ｐ（ウイルス性ＡＲＩ），ｐ（非感染性疾病）｝と書く）を選択することにより統合予測を行うことができる。
結果：
マイクロアレイにより発見されたゲノム分類子のＴＬＤＡプラットフォームへの最初の変換中、本発明者らは、マイクロアレイによってもアッセイされている３２個の試料をアッセイした。このグループは、ＡＲＩ分類子を構成する遺伝子転写産物のＴＬＤＡに基づいたＲＴ－ｑＰＣＲ測定が、遺伝子転写産物のマイクロアレイに基づいた測定について得られた結果を再現し、したがって、患者を細菌性ＡＲＩもしくはウイルス性ＡＲＩを有すると分類し、または非感染性疾病を有すると分類するための妥当な方法論であることを確認する役割を果たす。本発明者らは、ＴＬＤＡプラットフォームとマイクロアレイプラットフォームの両方において試験された３２個の試料から、それらの対応する分類子を用いて評価された場合、８４．４％の一致があり、それは、３２人の対象のうちの２７人が、マイクロアレイに基づいた分類モデルとＴＬＤＡに基づいた分類モデルの両方において同じ統合予測を示したことを意味することがわかった。
マイクロアレイにより発見されたゲノム分類子のＴＬＤＡプラットフォームへの最初の変換中、本発明者らは、マイクロアレイによってもアッセイされている３２個の試料をアッセイした。このグループは、ＡＲＩ分類子を構成する遺伝子転写産物のＴＬＤＡに基づいたＲＴ－ｑＰＣＲ測定が、遺伝子転写産物のマイクロアレイに基づいた測定について得られた結果を再現し、したがって、患者を細菌性ＡＲＩもしくはウイルス性ＡＲＩを有すると分類し、または非感染性疾病を有すると分類するための妥当な方法論であることを確認する役割を果たす。本発明者らは、ＴＬＤＡプラットフォームとマイクロアレイプラットフォームの両方において試験された３２個の試料から、それらの対応する分類子を用いて評価された場合、８４．４％の一致があり、それは、３２人の対象のうちの２７人が、マイクロアレイに基づいた分類モデルとＴＬＤＡに基づいた分類モデルの両方において同じ統合予測を示したことを意味することがわかった。
マイクロアレイに基づいた分類とＴＬＤＡに基づいた分類との間の一致を実証した後、本発明者らは、ＡＲＩ状態の臨床判定を有したが、前に特徴づけられた遺伝子発現パターンを示さない患者からの追加の６３個の試料を、ＴＬＤＡに基づいた分類を用いて試験した。したがって、合計で９５個の試料が、ＴＬＤＡに基づいた分類試験を用いて評価された。９５個の試料からのこのデータセットにより、ＴＬＤＡに基づいたＲＴ－ｑＰＣＲプラットフォームがどのように新しい患者を分類するかを、参照標準として臨床判定のみを用いて評価することが可能になった。この実験において、本発明者らは、７７／９５個の正しく分類された試料に対応する８１．１％の全体的な精度を観察した。より具体的には、そのモデルは、それぞれ、８０％（３０個のうち２４個が正しい）、７７．４％（３１個のうち２４個が正しい）、および８５．３％（３４個のうち２９個が正しい）の細菌性ＡＲＩ精度、ウイルス性ＡＲＩ精度、および非感染性疾病精度を生じた。個々の分類子の性能に関して、本発明者らは、細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子、それぞれについて、０．９２、０．８６、および０．９１のＲＯＣ曲線下面積を観察した。本発明者らが分類子のいずれについても検証データセットを用いてカウントせず、それでもなお、本発明者らが分類能（精度およびＲＯＣ曲線下面積）の不偏推定値を欲するならば、本発明者らは、一個抜き交差検証された性能測定規準法を報告している。
分類子のそれぞれ（細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病）についての重みおよび閾値は、下に示された表１４Ａから１４Ｊに示されている。この表は、１７４個の遺伝子標的の代わりに１５１個の遺伝子標的を列挙していることに留意されたい。それは、上で記載されているように、参照遺伝子が前処理段階において除去され、欠測値があった１７個の標的も同様に除去されたからである。これらの１７個の標的もまた、前処理段階中に除去された。
汎ウイルスシグネチャ遺伝子が除去された場合には、ＡＵＣ、精度、および一致の値のパーセントにわたってせいぜい５％のわずかな性能の減少が見られる。
要約：
複合宿主応答ＡＲＩ分類子は、ウイルス性ＡＲＩに対する細菌性ＡＲＩ、非感染性疾病に対する細菌性ＡＲＩの診断である遺伝子発現シグネチャ、および数学的分類フレームワークで構成される。数学的分類子は、対象が細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病を有することの３つの別々の確率を提供する。各場合において、カットオフまたは閾値が特定され得、その閾値より上の値が、患者がその状態を有すると決定する。加えて、閾値を改変して、試験の感度および特異度を変化させ得る。
複合宿主応答ＡＲＩ分類子は、ウイルス性ＡＲＩに対する細菌性ＡＲＩ、非感染性疾病に対する細菌性ＡＲＩの診断である遺伝子発現シグネチャ、および数学的分類フレームワークで構成される。数学的分類子は、対象が細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、または非感染性疾病を有することの３つの別々の確率を提供する。各場合において、カットオフまたは閾値が特定され得、その閾値より上の値が、患者がその状態を有すると決定する。加えて、閾値を改変して、試験の感度および特異度を変化させ得る。
これらの遺伝子発現レベルの測定は、様々な技術的プラットフォームにおいて起こり得る。ここで、本発明者らは、ＴＬＤＡに基づいたＲＴ－ｑＰＣＲプラットフォームを用いたこれらのシグネチャの測定を記載する。さらに、ＡＲＩ病因確率を決定する数学的フレームワークは、転写産物測定方法を順応させるためのプラットフォーム特異的訓練（すなわち、プラットフォーム特異的重み、ｗ１， …，ｗｐを確立すること）によりプラットフォームに適応する。類似した直接的方法論が、遺伝子シグネチャを他の遺伝子発現プラットフォームへ変換し、その後、関連した分類子を訓練するように実施することができる。この実施例はまた、ＡＲＩの病因のＴＬＤＡに基づいた分類とマイクロアレイに基づいた分類との間の優れた一致を実証している。最後に、本発明者らは、急性呼吸器病を有する新しい患者を診断するためのＴＬＤＡに基づいたＲＴ－ｑＰＣＲプラットフォームおよび関連した数学的分類子の使用を示す。
この明細書で言及されたいかなる特許または刊行物も当業者のレベルを示す。これらの特許および刊行物は、あたかも各個々の刊行物が参照により組み入れられていることを具体的かつ個々に示されているかのように、同じ程度で参照により本明細書に組み入れられている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
本発明を、対象物を実行し、かつ言及された目的および利点、加えてそれに固有のものを得るように十分適応させることは、当業者は容易に認識しているだろう。本明細書に記載された本開示は、現在、好ましい実施形態を表し、例示的であり、かつ本発明の範囲への限定として意図するものではない。その変化および他の使用が、当業者に思い浮かぶだろうし、それらは、特許請求の範囲によって定義されているような本発明の精神の内に包含される。
Claims (29)
- プラットフォームについての急性呼吸器病分類子を作製するための方法であって、前記分類子が、前記プラットフォームについての細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子を含み、前記方法が、
（ａ）細菌性急性呼吸器感染症を患っていることがわかっている複数の対象から得た生物学的試料を準備するステップ、
（ｂ）ウイルス性急性呼吸器感染症を患っていることがわかっている複数の対象から得た生物学的試料を準備するステップ、
（ｃ）非感染性疾病を患っていることがわかっている複数の対象から得た生物学的試料を準備するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）からの前記生物学的試料のそれぞれにおいて複数の遺伝子（例えば、全ての発現した遺伝子もしくはトランスクリプトーム、またはその部分集合）の遺伝子発現レベルを前記プラットフォームにおいて測定するステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた遺伝子発現レベルを正規化して、正規化遺伝子発現値を生じるステップ、ならびに
（ｆ）前記正規化遺伝子発現値に基づいて前記プラットフォームについての細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子を作製するステップ
を含み、それにより、前記プラットフォームについての前記急性呼吸器病分類子を作製する方法。 - 前記測定ステップが、前記試料から細胞を精製するステップ、前記試料の細胞を破壊するステップ、および前記試料からＲＮＡを単離するステップのうちの１つまたは複数を含み、またはそれらに先行される、請求項１に記載の方法。
- 前記測定ステップが、半定量的ＰＣＲおよび／または核酸プローブハイブリダイゼーションを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記プラットフォームが、アレイプラットフォーム、サーマルサイクラープラットフォーム（例えば、多重化および／またはリアルタイムＰＣＲプラットフォーム）、ハイブリダイゼーションおよびマルチシグナルコード化（例えば、蛍光）検出器プラットフォーム、核酸質量分析プラットフォーム、核酸シーケンシングプラットフォーム、またはそれらの組合せを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記作製ステップが、前記プラットフォームについての前記細菌性ＡＲＩ分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子を提供するために
（ｉ）各正規化遺伝子発現値についての重みを割り当て、各遺伝子についての重みおよび発現値を分類子（例えば、線形回帰分類子）方程式へ入力し、前記複数の対象のそれぞれについての結果に対してスコアを決定するステップ、その後
（ｉｉ）前記複数の対にわたって各結果についての分類の精度を決定するステップ、および、その後
（ｉｉｉ）分類の精度が最適化されるまで重みを調整するステップ
を繰り返して含み、非ゼロ重みを有する遺伝子がそれぞれの分類子に含まれる、請求項１に記載の方法。 - 前記分類子が線形回帰分類子であり、前記作製ステップが、前記分類子のスコアを確率へ変換することを含む、請求項５に記載の方法。
- 前記ＡＲＩ分類子を、少なくとも２つの関連した臨床的属性を含む既知のデータセット
に対して検証するステップをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。 - 前記細菌性ＡＲＩ分類子が、表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊにおいてウイルス性ＡＲＩ分類子の一部として列挙された遺伝子（例えば、前記遺伝子と相同なオリゴヌクレオチドプローブで、測定可能）のうちの５個、１０個、２０個、３０個、または５０個から８０個、１００個、１５０個、または２００個までの発現レベルを含む、請求項１～７のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウイルス性ＡＲＩ分類子が、表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊにおいてウイルス性ＡＲＩ分類子の一部として列挙された遺伝子（例えば、前記遺伝子と相同なオリゴヌクレオチドプローブで、測定可能）のうちの５個、１０個、２０個、３０個、または５０個から８０個、１００個、１５０個、または２００個までの発現レベルを含む、請求項１～８のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非感染性疾病分類子が、表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊにおいて非感染性疾病分類子の一部として列挙された遺伝子（例えば、前記遺伝子と相同なオリゴヌクレオチドプローブで、測定可能）のうちの５個、１０個、２０個、３０個、または５０個から８０個、１００個、１５０個、または２００個までの発現レベルを含む、請求項１～９のいずれか1項に記載の方法。
- 細菌性、ウイルス性、および／または非感染性から選択される急性呼吸器病の病因を、それを患っており、またはそれのリスクがある対象において決定するための方法であって、
（ａ）前記対象から得た生物学的試料を準備するステップ、
（ｂ）前記生物学的試料における定義済みの遺伝子セットの遺伝子発現レベルをプラットフォーム上で測定するステップ
（ｃ）前記遺伝子発現レベルを正規化して、正規化遺伝子発現値を生じるステップ
（ｄ）細菌性急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子から選択される１つまたは複数の急性呼吸器病分類子へ前記正規化遺伝子発現値を入力するステップであって、前記分類子が、プラットフォームについての前記定義済みの遺伝子セットの遺伝子のそれぞれについての定義済み重み付け値を含み、前記細菌性急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子が、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法によって得られる、ステップ、ならびに
（ｅ）前記正規化遺伝子発現値および前記分類子に基づいて細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病の１つまたは複数についての病因確率を計算するステップ
を含み、それにより、前記対象における前記急性呼吸器病が細菌起源か、ウイルス起源か、非感染性起源か、またはそれらのいくつかの組合せかを決定する方法。 - （ｆ）前記確率を、定義済みの閾値、カットオフ値、または感染の見込みを示す値の範囲（例えば、信頼区間）と比較するステップ
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。 - 前記対象が急性呼吸器病症状を患っている、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
- 前記対象が、細菌感染またはウイルス感染を有するのではないかと疑われる、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が細菌性ＡＲＩの見込みを示さない場合には、ウイルス分類子および／または非感染分類子のみを用いてステップ（ｄ）および（ｅ）を繰り返して、前記対象における
急性呼吸器病がウイルス起源か、非感染性起源か、またはその組合せかを決定するステップをさらに含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。 - 前記試料がウイルス性ＡＲＩの見込みを示さない場合には、細菌分類子および／または非感染分類子のみを用いてステップ（ｄ）および（ｅ）を繰り返して、前記対象における急性呼吸器病が細菌起源か、非感染性起源か、またはその組合せかを決定するステップをさらに含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が非感染性疾病の見込みを示さない場合には、細菌分類子および／またはウイルス分類子のみを用いてステップ（ｄ）および（ｅ）を繰り返して、前記対象における急性呼吸器病が細菌起源か、ウイルス起源か、またはその組合せかを決定するステップをさらに含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記急性呼吸器病の前記病因の確率を示すスコアを前記対象に割り当てる報告を作成するステップをさらに含む、請求項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記定義済みの遺伝子セットが３０個から２００個までの遺伝子を含む、請求項１１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記定義済みの遺伝子セットが、表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊに列挙された３０個から２００個までの遺伝子を含む、請求項１１～１９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、末梢血、痰、鼻咽頭スワブ、鼻咽頭洗浄液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１～２０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生物学的試料が末梢血試料である、請求項１１～２０のいずれか１項に記載の方法。
- 細菌性、ウイルス性、および／または非感染性から選択される急性呼吸器病を患っており、またはそのリスクがある対象においてワクチンまたは薬物に対する応答をモニターする方法であって、前記対象の宿主応答を決定するステップを含み、前記決定ステップが請求項１１～２２のいずれか１項に記載の方法によって行われる、方法。
- 薬物が抗細菌薬または抗ウイルス薬である、請求項２３に記載の方法。
- 細菌性、ウイルス性、および／または非感染性から選択される対象における急性呼吸器病の病因を決定するためのシステムであって、
少なくとも１つのプロセッサ；
前記対象由来の生物学的試料を受けるように構成された試料入力回路；
前記少なくとも１つのプロセッサに連結され、かつ前記生物学的試料の遺伝子発現レベルを決定するように構成された試料分析回路；
前記少なくとも１つのプロセッサに連結された入力／出力回路；
前記少なくとも１つのプロセッサに連結され、かつデータ、パラメータ、および／または分類子を記憶するように構成された記憶回路；ならびに
前記プロセッサに連結され、かつ前記少なくとも１つのプロセッサにより実行された時、前記少なくとも１つのプロセッサに動作を実施させる、メモリ中に具現されたコンピュータ可読プログラムコードを含むメモリ
を含み、前記動作が、
前記生物学的試料における定義済みの遺伝子セットの遺伝子発現レベルの測定を、前記試料分析回路を介して制御／実施すること；
前記遺伝子発現レベルを正規化して、正規化遺伝子発現値を生じること；
前記定義済みの遺伝子セットの遺伝子のそれぞれについての定義済みの重み付け値を含む細菌性急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子、ウイルス性ＡＲＩ分類子、および非感染性疾病分類子を前記記憶回路から取り出すこと；
前記細菌性急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）分類子、前記ウイルス性ＡＲＩ分類子、および前記非感染性疾病分類子から選択される１つまたは複数の急性呼吸器病分類子へ前記正規化遺伝子発現値を入力すること；
前記分類子に基づいた、細菌性ＡＲＩ、ウイルス性ＡＲＩ、および非感染性疾病の１つまたは複数についての病因確率を計算すること；ならびに
前記対象における前記急性呼吸器病が細菌起源か、ウイルス起源か、非感染性起源か、またはそれらのいくつかの組合せかの決定の出力を、前記入力／出力回路を介して制御すること
を含む、システム。 - 前記システムが、遺伝子発現の定量的または半定量的検出を前記ＡＲＩの前記病因の累積スコアまたは確率へ変換するためのコンピュータ可読コードを含む、請求項２５に記載のシステム。
- 前記システムがアレイプラットフォーム、サーマルサイクラープラットフォーム（例えば、多重化および／またはリアルタイムＰＣＲプラットフォーム）、ハイブリダイゼーションおよびマルチシグナルコード化（例えば、蛍光）検出器プラットフォーム、核酸質量分析プラットフォーム、核酸シーケンシングプラットフォーム、またはそれらの組合せを含む、請求項２５または請求項２６に記載のシステム。
- 前記定義済みの遺伝子セットが３０個から２００個までの遺伝子を含む、請求項２５～２７のいずれか１項に記載のシステム。
- 前記定義済みの遺伝子セットが、表１Ａから表１Ｄ、表５Ａから表５Ｑ、表１０Ａから表１０Ｆ、表１１、および／または表１４Ａから１４Ｊに列挙された３０個から２００個までの遺伝子を含む、請求項２５～２７のいずれか１項に記載のシステム。
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