JP6996714B2 - N-サクシニル-ヒドロキシ-d-アミノ酸及び/又はヒドロキシ-d-アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
N-サクシニル-ヒドロキシ-L-アミノ酸にN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程(A)を含む、N-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸を製造する方法。項2.
N-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸がN-サクシニル-3-ヒドロキシ-D-アミノ酸及び/又はN-サクシニル-4-ヒドロキシ-D-アミノ酸である、項1に記載の方法。
項3.
N-サクシニル-ヒドロキシ-L-アミノ酸にN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程(A)、及び
工程(A)で得られたN-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸にD-サクシニラーゼを作用させる工程(B)
を含む、ヒドロキシ-D-アミノ酸を製造する方法。
項4.
N-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸がN-サクシニル-3-ヒドロキシ-D-アミノ酸及び/又はN-サクシニル-4-ヒドロキシ-D-アミノ酸である、項3に記載の方法。
項5.
N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス(Geobacillus)属、又はクロロフレクサス(Chloroflexus)属に属する微生物由来である、項1~4のいずれかに記載の方法。
項6.D-サクシニラーゼがクプリアビダス(Cupriavidus)属、又はラルストニア(Ralstonia)属に属する微生物由来である、項3~5のいずれかに記載の方法。
Burkholderia ambifaria AMMD(DSM16078)株由来のヒドロキシラーゼ(SadA)遺伝子(配列番号1)の全長を増幅させるために配列番号4及び5に示す塩基配列を有するプライマーを合成した。次に、Burkholderia ambifaria AMMD(DSM16078)株を液体培養で培養し、得られた菌体からゲノム抽出キットにより、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAを鋳型にDNAポリメラーゼKOD-Plus(東洋紡製)及び上記プライマーを用いてPCRを行った。増幅されたDNA断片をプラスミドpQE80LのBamHI認識部位とHindIII認識部位の間に挿入し、発現ベクターpBaSadAを構築した。この発現ベクターpBaSadAで大腸菌(E.coli)JM109を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン100mg/Lを含む液体LB培地で28℃で振盪培養し、OD(660nm)の値が、0.8に達した際、最終濃度1mMとなるようにIPTGを培地に添加した。その後も、28℃にて振盪培養し、培養開始から20時間後に集菌した。
50μl(終濃度50mM)のBis-Tris/HCl buffer(pH6.5)、15μl(終濃度15mM)の2-オキソグルタル酸、10μl(終濃度10mM)のアスコルビン酸、50μl(終濃度5mM)のFeSO4/7H2O、100μl(終濃度10mM)のN-サクシニル-L-ロイシン、及び765μlの滅菌蒸留水を混和し、この溶液に参考例1に記載の方法で調製した集菌液を生理食塩水で洗浄した菌体懸濁液10μlを加え、30℃で反応を開始させ、適当な時間で反応を停止させた。この反応で生成したコハク酸をコハク酸定量キット(Roche/R-Biopharm社製)により、定量し、酵素活性を算出した。酵素活性は、2-オキソグルタル酸からコハク酸が1分間に1μmol生成された場合を1unit(U)と定義した。
特許5246639に記載のBacillus thuringiensis 2-e-2株由来のヒドロキシラーゼ(IDO)(配列番号2)の全長を増幅させるために配列番号6及び7の塩基配列を有するプライマーを合成した。次にBacillus thuringiensis 2-e-2株を液体培養で培養し、得られた菌体からゲノム抽出キットにより、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAを鋳型にDNAポリメラーゼKOD-Plus(東洋紡製)及び上記プライマーを用いたPCRを行った。増幅されたDNA断片をプラスミドpQE80LのBamHI認識部位とHindIII認識部位の間に挿入し、発現ベクターpBtIDOを構築した。この発現ベクターpBtIDOで大腸菌(E.coli)JM109を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン100mg/Lを含む液体LB培地で28℃で振盪培養し、OD(660nm)の値が、0.8に達した際、最終濃度1mMとなるようにIPTGを添加した。その後も、28℃にて振盪培養し、培養開始から20時間後に集菌した。
100μl(終濃度100mM)のHEPES buffer(pH7.0)、5μl(終濃度5mM)の2-オキソグルタル酸、5μl(終濃度5mM)のアスコルビン酸、50μl(終濃度5mM)のFeSO4/7H2O、50μl(終濃度5mM)のL-イソロイシン、及び780μlの滅菌蒸留水を混和し、この溶液に参考例3に記載の方法で調製した集菌液を生理食塩水で洗浄した菌体懸濁液10μlを加え、30℃で反応を開始させ、適当な時間で反応を停止させた。この反応で生成した4-ヒドロキシイソロイシンをHPLCにより、定量し、酵素活性を算出した。酵素活性は、2-オキソグルタル酸からコハク酸が1分間に1μmol生成された場合を1unit(U)と定義した。
特開2007-82534に記載の方法で、Chloroflexus aurantiacus由来のNSARの発現ベクターpCaNSARを構築した。pCaNSARを用い、大腸菌(E.coli)JM109を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン100mg/Lを含む液体LB培地を用いて、28℃で振盪培養し、OD(660nm)の値が、0.8に達した際、最終濃度1mMとなるようにIPTGを添加した。その後も、28℃にて振盪培養し、培養開始から20時間後に集菌した。
特開2008-061642に記載の方法で、Geobacillus stearothermophilus由来のNSARの発現ベクターpGsNSARを構築した。pCaNSARを用い、大腸菌(E.coli)JM109を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン100mg/Lを含む液体LB培地を用いて、28℃で振盪培養し、OD(660nm)の値が、0.8に達した際、最終濃度1mMとなるようにIPTGを添加した。その後も、28℃にて振盪培養し、培養開始から20時間後に集菌した。
100μl(終濃度10mM)の基質となるN-サクシニル-L-フェニルアラニン溶液(基質)を100μl(終濃度10mM)、10μl(終濃度1mM)の塩化コバルト水溶液を10μl(終濃度1mM)、100μl(終濃度25mM)のTris-HCl(0.25M/pH7.5)を100μl(終濃度25mM)、及び740μlの滅菌蒸留水を740μlを混和し、この反応液に適当な濃度のN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液50μlを加えて30℃で反応を行い、煮沸処理により、反応を停止させた。生成したN-サクシニル-D-フェニルアラニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量し、酵素活性を算出した。酵素活性はN-サクシニル-L-フェニルアラニンからN-サクシニル-D-フェニルアラニンが1分間に1μmole生成された場合を1unit(U)と定義した。
特許5806664に記載のCupriavidus sp.P4-10-C株由来のD-サクシニラーゼ遺伝子(配列番号3)の全長を増幅させるために配列番号8及び9の塩基配列を有するプライマーを合成した。次にCupriavidus sp.P4-10-C株を液体培地で培養し、特許5806664に記載の方法で、抽出されたゲノムDNAを鋳型にDNAポリメラーゼKOD-Plus(東洋紡製)及び上記プライマーを用いてPCRを行った。増幅されたDNA断片をプラスミドpBluescriptのNdeI認識部位とBamHI認識部位の間に挿入し、発現ベクターpCsDSAを構築した。さらに常法に従い、部位特異的変異を導入し、182位のロイシン残基がグルタミン酸残基に置換されたpCsDSA(L182E)を取得した。pCsDSA(L182E)を用い、大腸菌(E.coli)JM109を形質転換した。得られた組換え大腸菌をアンピシリン100mg/Lを含む液体LB培地で培養し、OD(660nm)の値が、0.8に達した際、最終濃度1mMとなるようにIPTGを添加した。その後も、28℃にて振盪培養し、培養開始から20時間後に集菌した。菌体を遠心分離により、回収した。
D-アミノ酸オキシダーゼ法を利用した酵素法により測定した。
<試薬>
14mM N-サクシニル-D-バリン
2.5(U/mL) ペルオキシダーゼ(東洋紡製PEO-302)
1.5mM 4-アミノアンチピリン(第一化学薬品製)
2.4mM TOOS(同人化学研究所製)
6.0(U/mL) D-アミノ酸オキシダーゼ(バイオザイム製DOX2)
を含む25mMリン酸緩衝溶液を反応試薬とする。
<測定条件>
反応試薬3.0mLを37℃で5分間予備加温する。酵素溶液0.1mLを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で、555nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検は、酵素溶液の代わりに酵素を溶解する溶液を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従ってD-サクシニラーゼ活性を求める。ここでD-サクシニラーゼ活性における1単位(U)とは、上記条件下で1分間に1マイクロモルのD-アミノ酸を生成する酵素量として定義する。
活性(U/mL)=
{(ΔODTEST-ΔODBLANK)×3.1×希釈倍率}/{31.0×1/2×0.1×1.0}
なお、式中の3.1は反応試薬+酵素溶液の液量(mL)、31.0は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)、1/2は酵素反応で生成したH2O2の1分子から形成するQuinoneimine色素が1/2分子であることによる係数、0.1は酵素溶液の液量(mL)、1.0はセルの光路長(cm)を示す。
参考例8と同様にして得られたDSAを発現した菌体(培養液100ml分)及び参考例5と同様にして得られたChloroflexus aurantiacus由来のNSARを発現した菌体(培養液100ml分)を反応液10ml(25mM HEPES buffer(pH7.0)、1mM CoCl2、15mM N-サクシニル-(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン)に懸濁し、28℃又は37℃、20時間、反応させた。また、NSARに関しては、参考例5に記載のChloroflexus aurantiacus由来のNSARの代わりに、参考例6と同様にして得られたGeobacillus stearothermophilus由来のNSARを発現した菌体(培養液100ml分)を使った評価も実施した。
カラム:XBridge C18 5μm(2.1×150mm、ウォーターズ社製)溶離液A:酢酸アンモニウム(10mmol/L、pH5)
溶離液B:メタノール(0~15min(20→60%)、15~15.1min(20%→80%)、15.1~20min(20%)
流速:0.3ml/min
温度:30℃
検出:紫外吸収(254nm)
L-イソロイシン(6.5g)を100mlの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に調整した。5gの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、TLCプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥することでN-サクシニル-L-イソロイシンの2ナトリウム塩を13g得た。次いで、参考例1と同様にして得られたSadAを発現した菌体(培養液100ml分)を反応液10ml(50mM Bis-Tris/HCl buffer(pH6.5)、45mM 2-オキソグルタル酸、10mM アスコルビン酸、0.5mM FeSO4/7H2O、30mM N-サクシニル-L-イソロイシン)に懸濁し、30℃、20時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度1mMとなるようにCoCl2を添加し、参考例5と同様にして得られたNSARを発現した菌体(培養液100ml分)及び参考例8と同様にして得られたDSA(L182E)を発現した菌体(培養液100ml分)を懸濁し、30℃、20時間、反応させた。
カラム:XBridge C18 5μm(2.1×150mm、ウォーターズ社製)溶離液A:酢酸アンモニウム(10mmol/L、pH5)
溶離液B:メタノール(0~15min(20→60%)、15~15.1min(20%→80%)、15.1~20min(20%)
流速:0.3ml/min
温度:30℃
検出:質量分析計(ポジティブイオンモード)
L-ロイシン(6.5g)を100mlの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に調整した。5gの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、TLCプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥することでN-サクシニル-L-ロイシン13gを得た。次いで、
参考例1と同様にして得られたSadAを発現した菌体(培養液100ml分)を反応液10ml(50mM Bis-Tris/HCl buffer(pH6.5)、45mM 2-オキソグルタル酸、10mM アスコルビン酸、0.5mM FeSO4/7H2O、30mM N-サクシニル-L-ロイシン)に懸濁し、30℃、20時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度1mMとなるようにCoCl2を添加し、参考例5と同様にして得られたNSARを発現した菌体(培養液100ml分)及び参考例8と同様にして得られたDSA(L182E)を発現した菌体(培養液100ml分)を懸濁し、30℃、20時間、反応させた。
カラム:XBridge C18 5μm(2.1×150mm、ウォーターズ社製)溶離液A:酢酸アンモニウム(10mmol/L、pH5)
溶離液B:メタノール(0~15min(20→60%)、15~15.1min(20%→80%)、15.1~20min(20%)
流速:0.3ml/min
温度:30℃
検出:質量分析計(ポジティブイオンモード)
L-バリン(5.8g)を100mlの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に調整した。5gの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、TLCプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥する事でN-サクシニル-L-バリン12gを得た。次いで、参考例1と同様にして得られたSadAを発現した菌体(培養液100ml分)を反応液10ml(50mM Bis-Tris/HCl buffer(pH6.5)、45mM 2-オキソグルタル酸、10mM アスコルビン酸、0.5mM FeSO4/7H2O、30mM N-サクシニル-L-バリン)に懸濁し、30℃、20時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度1mMとなるようにCoCl2を添加し、参考例5と同様にして得られたNSARを発現した菌体(培養液100ml分)及び参考例8と同様にして得られたDSA(L182E)を発現した菌体(培養液100ml分)を懸濁し、30℃、20時間、反応させた。
カラム:XBridge C18 5μm(2.1×150mm、ウォーターズ社製)溶離液A:酢酸アンモニウム(10mmol/L、pH5)
溶離液B:メタノール(0~15min(20→60%)、15~15.1min(20%→80%)、15.1~20min(20%)
流速:0.3ml/min
温度:30℃
検出:質量分析計(ポジティブイオンモード)
L-ノルロイシン(6.5g)を100mlの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に調整した。5gの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、TLCプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥する事でN-サクシニル-L-ノルロイシン13gを得た。次いで、参考例1と同様にして得られたSadAを発現した菌体(培養液100ml分)を反応液10ml(50mM Bis-Tris/HCl buffer(pH6.5)、45mM 2-オキソグルタル酸、10mM アスコルビン酸、0.5mM FeSO4/7H2O、30mM N-サクシニル-L-ノルロイシン)に懸濁し、30℃、20時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度1mMとなるようにCoCl2を添加し、参考例5と同様にして得られたNSARを発現した菌体(培養液100ml分)及び参考例8と同様にして得られたDSA(L182E)を発現した菌体(培養液100ml分)を懸濁し、30℃、20時間、反応させた。
カラム:XBridge C18 5μm(2.1×150mm、ウォーターズ社製)溶離液A:酢酸アンモニウム(10mmol/L、pH5)
溶離液B:メタノール(0~15min(20→60%)、15~15.1min(20%→80%)、15.1~20min(20%)
流速:0.3ml/min
温度:30℃
検出:質量分析計(ポジティブイオンモード)
L-ノルバリン(5.8g)を100mlの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に調整した。5gの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、TLCプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥する事でN-サクシニル-L-ノルバリン12gを得た。次いで、参考例1と同様にして得られたSadAを発現した菌体(培養液100ml分)を反応液10ml(50mM Bis-Tris/HCl buffer(pH6.5)、45mM 2-オキソグルタル酸、10mM アスコルビン酸、0.5mM FeSO4/7H2O、30mM N-サクシニル-L-ノルバリン)に懸濁し、30℃、20時間、反応させた。続いて、反応液に最終濃度1mMとなるようにCoCl2を添加し、参考例5と同様にして得られたNSARを発現した菌体(培養液100ml分)及び参考例8と同様にして得られたDSA(L182E)を発現した菌体(培養液100ml分)を懸濁し、30℃、20時間、反応させた。
カラム:XBridge C18 5μm(2.1×150mm、ウォーターズ社製)溶離液A:酢酸アンモニウム(10mmol/L、pH5)
溶離液B:メタノール(0~15min(20→60%)、15~15.1min(20%→80%)、15.1~20min(20%)
流速:0.3ml/min
温度:30℃
検出:質量分析計(ポジティブイオンモード)
参考例3と同様にして得られたIDOを発現した菌体(培養液100ml分)を反応液10ml(50mM Bis-Tris/HCl buffer(pH6.0)、45mM 2-オキソグルタル酸、10mM アスコルビン酸、0.5mM FeSO4/7H2O、30mM L-イソロイシン)に懸濁し、25℃、20時間、反応させた。反応液のpHを2に調整した後、遠心分離により上清を回収した。上清を強酸性陽イオン交換樹脂(DOWEX 50W×8)に加えた後、蒸留水で3回洗浄し、1M NH4OHで溶出した。さらに溶出液を強塩基性陰イオン交換樹脂(DOWEX 1×8)に加えた後、蒸留水で3回洗浄し、1M CH3COOHで溶出した。溶出液をNH4OHで中和後、凍結乾燥し、(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシンを得た。
(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン(7.3g)を100mlの水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に調整した。5.6gの無水コハク酸を添加し、水酸化ナトリウム溶液でpH8~9に保ちながら完全に溶解させた。さらに少量の無水コハク酸を同様に添加し、TLCプレート上でのニンヒドリン発色がなくなるまでこの操作を繰り返した。塩酸溶液で中和後、凍結乾燥する事でN-サクシニル-(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン14.6gを得た。続いて参考例5と同様にして得られたNSARを発現した菌体(培養液100ml分)及び参考例8と同様にして得られたDSA(L182E)を発現した菌体(培養液100ml分)を反応液10ml(25mM HEPES buffer(pH7.0)、1mM CoCl2、30mM N-サクシニル-(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシイソロイシン)となるよう懸濁し、30℃、20時間、反応させた。
カラム:XBridge C18 5μm(2.1×150mm、ウォーターズ社製)溶離液A:酢酸アンモニウム(10mmol/L、pH5)
溶離液B:メタノール(0~15min(20→60%)、15~15.1min(20%→80%)、15.1~20min(20%)
流速:0.3ml/min
温度:30℃
検出:質量分析計(ポジティブイオンモード)、蛍光検出器(励起波長250nm、検出波長395nm)
Claims (5)
- N-サクシニル-ヒドロキシ-L-アミノ酸にN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程(A)を含む、N-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸を製造するであって、
N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス(Geobacillus)属、又はクロロフレクサス(Chloroflexus)属に属する微生物由来であり、
N-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸を構成するアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、バリン又はノルバリンである、
方法。 - N-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸がN-サクシニル-3-ヒドロキシ-D-アミノ酸及び/又はN-サクシニル-4-ヒドロキシ-D-アミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- N-サクシニル-ヒドロキシ-L-アミノ酸にN-サクシニルアミノ酸ラセマーゼを作用させる工程(A)、及び
工程(A)で得られたN-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸にD-サクシニラーゼを作用させる工程(B)
を含み、
N-サクシニルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス(Geobacillus)属、又はクロロフレクサス(Chloroflexus)属に属する微生物由来であり、
N-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸を構成するアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、バリン又はノルバリンである、
ヒドロキシ-D-アミノ酸を製造する方法。 - N-サクシニル-ヒドロキシ-D-アミノ酸がN-サクシニル-3-ヒドロキシ-D-アミノ酸及び/又はN-サクシニル-4-ヒドロキシ-D-アミノ酸である、請求項3に記載の方法。
- D-サクシニラーゼがクプリアビダス(Cupriavidus)属、又はラルストニア(Ralstonia)属に属する微生物由来である、請求項3又は4に記載の方法。
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