JP6991095B2 - ウイルスベクター精製における拡張可能な製造プラットフォームおよび遺伝子治療における使用のための高純度ウイルスベクター - Google Patents
ウイルスベクター精製における拡張可能な製造プラットフォームおよび遺伝子治療における使用のための高純度ウイルスベクター Download PDFInfo
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Description
この出願は、２０１０年１月２８日出願の米国仮出願第６１／２９９，１８４に対して
優先権の利益を主張するものであり、その全体は本明細書に参照により組み込まれる。
優先権の利益を主張するものであり、その全体は本明細書に参照により組み込まれる。
アメリカ合衆国法典第２０２条（ｃ）の規定により、本発明は、国立衛生研究所によっ
て与えられた許諾番号ＨＨＳＮ２６８２００７４８２０３Ｃのもとに政府支援によりつく
られたものであると承認される。アメリカ政府は本発明における権利を有する。
て与えられた許諾番号ＨＨＳＮ２６８２００７４８２０３Ｃのもとに政府支援によりつく
られたものであると承認される。アメリカ政府は本発明における権利を有する。
本発明は良好な製造実践およびウイルスベクター精製の分野に関するものである。より
具体的には、組成物および方法は、遺伝子治療プロトコルにおいて使用するための高純度
組換えＡＡＶの調製を容易にする。
具体的には、組成物および方法は、遺伝子治療プロトコルにおいて使用するための高純度
組換えＡＡＶの調製を容易にする。
いくつかの刊行物および特許文献は、本発明が関係する最先端の技術を記載するために
、本明細書の全体にわたって引用される。これらの各引用は、参照により本明細書に完全
に組み込まれる。
、本明細書の全体にわたって引用される。これらの各引用は、参照により本明細書に完全
に組み込まれる。
遺伝子送達は、後天性および遺伝性疾患の治療において有望な方法である。遺伝子導入
目的の多くのウイルスベース系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースシステムも含め
て、記載がされていた。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー－ＤＮＡ依存
パルボウイルスである。ＡＡＶは、発生のための増殖感染のために、例えばアデノウイル
ス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアのような無関係なヘルパーウイルスによる同時
感染を必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下において、ＡＡＶはそのゲノムを宿主細
胞染色体に挿入することによって、潜在的な状態を決める。ヘルパーウイルスによる続発
性感染は、インテグレートしたウイルスゲノムを救出し、そして、それから、感染性子孫
ウイルスを生成するために、複製することができる。
目的の多くのウイルスベース系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースシステムも含め
て、記載がされていた。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー－ＤＮＡ依存
パルボウイルスである。ＡＡＶは、発生のための増殖感染のために、例えばアデノウイル
ス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアのような無関係なヘルパーウイルスによる同時
感染を必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下において、ＡＡＶはそのゲノムを宿主細
胞染色体に挿入することによって、潜在的な状態を決める。ヘルパーウイルスによる続発
性感染は、インテグレートしたウイルスゲノムを救出し、そして、それから、感染性子孫
ウイルスを生成するために、複製することができる。
ＡＡＶは広い宿主域を有し、適当なヘルパーウイルスの存在において任意の種から複製
することが可能である。例えば、ヒトＡＡＶはイヌアデノウイルスによって同時感染した
イヌ細胞において複製できる。ＡＡＶは任意のヒトまたは動物疾患と関連するものではな
く、および、統合に応じて宿主細胞の生物学的特性を変更するように見えない。ＡＡＶの
概説には、例えばＢｅｒｎｓ ａｎｄ Ｂｏｈｅｎｚｋｙ （１９８７） Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎ
ｃ．） ３２：２４３－３０７を参照。
することが可能である。例えば、ヒトＡＡＶはイヌアデノウイルスによって同時感染した
イヌ細胞において複製できる。ＡＡＶは任意のヒトまたは動物疾患と関連するものではな
く、および、統合に応じて宿主細胞の生物学的特性を変更するように見えない。ＡＡＶの
概説には、例えばＢｅｒｎｓ ａｎｄ Ｂｏｈｅｎｚｋｙ （１９８７） Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎ
ｃ．） ３２：２４３－３０７を参照。
感染性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子の構成は、記載がされている。例えば、
米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号、国際公開第９２／０１
０７０号（１９９２年１月２３日刊行）および国際公開第９３／０３７６９号（１９９３
年３月４日刊行）、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８－３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｖ
ａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３－５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（
１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９；およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１を参照。
米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号、国際公開第９２／０１
０７０号（１９９２年１月２３日刊行）および国際公開第９３／０３７６９号（１９９３
年３月４日刊行）、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８－３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｖ
ａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３－５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（
１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９；およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１を参照。
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムの内側部分を全体的あるいは部分的に削除することに
より、およびＩＴＲｓ間にある対象となるＤＮＡ配列を挿入することにより、対象の非相
同ヌクレオチド配列（例えば、治療タンパク質をコードする選択された遺伝子、アンチセ
ンス核酸分子、リボザイム、ｍｉＲＮＡなど）を運搬するよう設計されることができる。
ＩＴＲｓは、対象の非相同ヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶの複製およびパッケージング
が可能なこのようなベクターにおいて機能的なままである。非相同ヌクレオチド配列は、
特定の状況下での患者の標的細胞において駆動性遺伝子発現が可能なプロモーター配列に
典型的には結合している。ポリアデニル化部位のような終止信号は、ベクターに含まれる
こともできる。
より、およびＩＴＲｓ間にある対象となるＤＮＡ配列を挿入することにより、対象の非相
同ヌクレオチド配列（例えば、治療タンパク質をコードする選択された遺伝子、アンチセ
ンス核酸分子、リボザイム、ｍｉＲＮＡなど）を運搬するよう設計されることができる。
ＩＴＲｓは、対象の非相同ヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶの複製およびパッケージング
が可能なこのようなベクターにおいて機能的なままである。非相同ヌクレオチド配列は、
特定の状況下での患者の標的細胞において駆動性遺伝子発現が可能なプロモーター配列に
典型的には結合している。ポリアデニル化部位のような終止信号は、ベクターに含まれる
こともできる。
ウイルスベクターの免疫原性の完全なる除去が現実的な目的ではない場合、ヒト遺伝子
治療のために調製されたＡＡＶベクターの最小免疫原性が非常に望ましい。本発明の目的
は、この目的を達成する組成物および方法を提供することにある。
治療のために調製されたＡＡＶベクターの最小免疫原性が非常に望ましい。本発明の目的
は、この目的を達成する組成物および方法を提供することにある。
本発明によって、ＡＡＶベクター粒子、空のカプシド、および宿主細胞不純物を有する
ＡＡＶ調製物から、治療タンパク質またはそれらのフラグメントをコードする形質導入遺
伝子を有する真正（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）ＡＡＶベクター粒子を精製するための方法、そ
れによって提供される実質的にＡＡＶ空のカプシドを含まないＡＡＶ産物が提供される。
例示的な精製スキームは、ＡＡＶによって形質導入された細胞を採取する工程、接線流ろ
過を介して細胞を濃縮する工程、および、溶解物にするために顕微溶液化によって細胞を
溶解化する工程を有する。溶解物はその後ろ過され、浄化される。浄化に続いて、ＡＡＶ
粒子はイオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製され、および、随意に、接線流
ろ過によってさらに濃縮される。生成された溶出液はその後、等密度勾配で階層化され、
超遠心分離にかけられて、ウイルス粒子を含む層が収集され、接線流ろ過でバッファー交
換にかけられる。精製されたＡＡＶ粒子はその後、界面活性剤によって製剤化され、およ
び、結果として生じた製剤は、任意の残留不純物を除去するためにろ過され、その結果、
高純度なＡＡＶ産物が生成される。そこにおいて前記真正ＡＡＶベクター粒子は、前記Ａ
ＡＶ産物中に少なくとも９５％の量で、好適には９８％以上の量で存在する。
ＡＡＶ調製物から、治療タンパク質またはそれらのフラグメントをコードする形質導入遺
伝子を有する真正（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）ＡＡＶベクター粒子を精製するための方法、そ
れによって提供される実質的にＡＡＶ空のカプシドを含まないＡＡＶ産物が提供される。
例示的な精製スキームは、ＡＡＶによって形質導入された細胞を採取する工程、接線流ろ
過を介して細胞を濃縮する工程、および、溶解物にするために顕微溶液化によって細胞を
溶解化する工程を有する。溶解物はその後ろ過され、浄化される。浄化に続いて、ＡＡＶ
粒子はイオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製され、および、随意に、接線流
ろ過によってさらに濃縮される。生成された溶出液はその後、等密度勾配で階層化され、
超遠心分離にかけられて、ウイルス粒子を含む層が収集され、接線流ろ過でバッファー交
換にかけられる。精製されたＡＡＶ粒子はその後、界面活性剤によって製剤化され、およ
び、結果として生じた製剤は、任意の残留不純物を除去するためにろ過され、その結果、
高純度なＡＡＶ産物が生成される。そこにおいて前記真正ＡＡＶベクター粒子は、前記Ａ
ＡＶ産物中に少なくとも９５％の量で、好適には９８％以上の量で存在する。
好適な実施形態において、ＡＡＶ産物は、ＡＡＶ粒子を１ｍＬあたり１０１５粒子の濃
度で有し、より好適には粒子は１ｍＬあたり１０１６粒子の濃度で存在し、最も好適には
、粒子は１ｍＬあたり１０１７粒子の濃度で存在する。
度で有し、より好適には粒子は１ｍＬあたり１０１６粒子の濃度で存在し、最も好適には
、粒子は１ｍＬあたり１０１７粒子の濃度で存在する。
高純度ＡＡＶベクターは、これに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、Ａ
ＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含む様々な血清型でもよい。
ＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含む様々な血清型でもよい。
さらに他の実施形態において、薬学的に許容な担体において上記の方法を用いて精製さ
れたＡＡＶ粒子を有するＡＡＶベクター製剤は開示される。
れたＡＡＶ粒子を有するＡＡＶベクター製剤は開示される。
本発明の精製されたＡＡＶ粒子は、所望の遺伝子産物をコードする非相同核酸を有する
。このような遺伝子産物は、これに限定されないが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍ
ｉＲＮＡ、リボザイムなどを含む。他の遺伝子産物は、代謝の先天的異常の修正に有用な
ホルモン、成長受容体、リガンドおよびタンパク質を含む。特定の好適な実施形態におい
て、ベクターは、ＲＰＥ６５、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子からなる群から選択され
るタンパク質をコードする。
。このような遺伝子産物は、これに限定されないが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍ
ｉＲＮＡ、リボザイムなどを含む。他の遺伝子産物は、代謝の先天的異常の修正に有用な
ホルモン、成長受容体、リガンドおよびタンパク質を含む。特定の好適な実施形態におい
て、ベクターは、ＲＰＥ６５、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子からなる群から選択され
るタンパク質をコードする。
本発明は、現在の「業界標準」の拡張可能なＡＡＶベクター精製プロセスから区別され
る以下の２つの特有な特徴、１）ベクター関連不純物の効果的な除去を含む高ベクター純
度を提供する異なるＡＡＶ血清型／カプシド経に対の精製において使用できるモジュール
・プラットフォーム、および、２）重要な超遠心分離工程に予想外の拡張可能性を与える
プロセス工程（カラムクロマトグラフィー、続いて接線流ろ過、続いて勾配超遠心分離の
重要な「核心的な」順番を含む）の特有な順序を含むＡＡＶベクター精製プラットフォー
ムを提供するものである。
る以下の２つの特有な特徴、１）ベクター関連不純物の効果的な除去を含む高ベクター純
度を提供する異なるＡＡＶ血清型／カプシド経に対の精製において使用できるモジュール
・プラットフォーム、および、２）重要な超遠心分離工程に予想外の拡張可能性を与える
プロセス工程（カラムクロマトグラフィー、続いて接線流ろ過、続いて勾配超遠心分離の
重要な「核心的な」順番を含む）の特有な順序を含むＡＡＶベクター精製プラットフォー
ムを提供するものである。
ＡＡＶベクター生成および精製方法の最適化は、ベクター生成物がその遺伝子ペイロー
ドを標的細胞に効果的に送達できることを確実にし、および、有害な免疫応答の活性化に
おける可能性を最小化する。ベクター関連不純物は、予想されるヒト受容体に関して、非
自己であり、免疫賦活性であるので、ヒト非経口製品の精製の間にそれらは最小化または
除去されなければならない。細胞培養におけるベクター生成の間、ベクター関連不純物は
真正ベクターよりもかなり大量に典型的には生成され、ベクター関連不純物が構造におい
て類似しているため、精製の間、ベクターから分離することは困難である。ベクター生成
後の粗細胞収集において、ベクター関連不純物は一般的にはバイオ合成されたＡＡＶ粒子
の全量の５０％以上、典型的には８０％までを示し、８０％以上を示すこともある。ＡＡ
Ｖベクターを生成するために現在まで開発された細胞培養システムの各々を使用すること
が認められた。ヒト疾患を治療するための製品として組換えＡＡＶを精製する製造プロセ
スの開発は、以下の目的：１）一貫したベクター純度、効力および安全性；２）製造プロ
セスの拡張可能性；および３）製造の受けいれられる費用、を達成しなければならない。
現在の「業界標準」拡張可能なＡＡＶベクター精製プロセスは、上記にリストした第一の
目的（一貫したベクター純度、効力および安全性）を達成するために重要である、ベクタ
ー関連不純物の除去を十分には達成しない。さらに、現在の業界標準の拡張可能な精製プ
ロセスを使用すると、ベクター関連不純物が十分に除去できないのは、次のことによる：
１）ワクチン（免疫応答は典型的には回避されるよりもむしろ引き起こされる）以外の適
用のための組換えＡＡＶのようなウイルス製品の精製プロセスの開発は比較的未発達であ
る；２）ＡＡＶベクターのための拡張可能な精製プロセスの開発に関係する多くのグルー
プはベクター関連不純物の高濃度に対して認識がなく、および／またはこのような不純物
がベクター免疫原性の臨床的に顕著な増大に貢献しないであろうと仮定した；および３）
拡張可能なプロセス工程において生体分子の生成を達成するために典型的に利用される物
理化学的特徴（例えば、粒子サイズおよび粒子表面の分子トポロジーおよび電荷分布）に
関して、これらのＡＡＶ粒子がお互いに密接に似ているので、ベクター関連不純物から真
正ベクターを分離するために拡張可能な精製プロセスを開発することは技術的に挑戦的で
ある。
ドを標的細胞に効果的に送達できることを確実にし、および、有害な免疫応答の活性化に
おける可能性を最小化する。ベクター関連不純物は、予想されるヒト受容体に関して、非
自己であり、免疫賦活性であるので、ヒト非経口製品の精製の間にそれらは最小化または
除去されなければならない。細胞培養におけるベクター生成の間、ベクター関連不純物は
真正ベクターよりもかなり大量に典型的には生成され、ベクター関連不純物が構造におい
て類似しているため、精製の間、ベクターから分離することは困難である。ベクター生成
後の粗細胞収集において、ベクター関連不純物は一般的にはバイオ合成されたＡＡＶ粒子
の全量の５０％以上、典型的には８０％までを示し、８０％以上を示すこともある。ＡＡ
Ｖベクターを生成するために現在まで開発された細胞培養システムの各々を使用すること
が認められた。ヒト疾患を治療するための製品として組換えＡＡＶを精製する製造プロセ
スの開発は、以下の目的：１）一貫したベクター純度、効力および安全性；２）製造プロ
セスの拡張可能性；および３）製造の受けいれられる費用、を達成しなければならない。
現在の「業界標準」拡張可能なＡＡＶベクター精製プロセスは、上記にリストした第一の
目的（一貫したベクター純度、効力および安全性）を達成するために重要である、ベクタ
ー関連不純物の除去を十分には達成しない。さらに、現在の業界標準の拡張可能な精製プ
ロセスを使用すると、ベクター関連不純物が十分に除去できないのは、次のことによる：
１）ワクチン（免疫応答は典型的には回避されるよりもむしろ引き起こされる）以外の適
用のための組換えＡＡＶのようなウイルス製品の精製プロセスの開発は比較的未発達であ
る；２）ＡＡＶベクターのための拡張可能な精製プロセスの開発に関係する多くのグルー
プはベクター関連不純物の高濃度に対して認識がなく、および／またはこのような不純物
がベクター免疫原性の臨床的に顕著な増大に貢献しないであろうと仮定した；および３）
拡張可能なプロセス工程において生体分子の生成を達成するために典型的に利用される物
理化学的特徴（例えば、粒子サイズおよび粒子表面の分子トポロジーおよび電荷分布）に
関して、これらのＡＡＶ粒子がお互いに密接に似ているので、ベクター関連不純物から真
正ベクターを分離するために拡張可能な精製プロセスを開発することは技術的に挑戦的で
ある。
以下の定義は、本発明の実践を容易にするために提供される。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイル
ス、ウイルス粒子などのような、適切な制御要素と関連する場合に複製でき、細胞間に遺
伝子配列を移すことができる、任意の遺伝要素を意味する。したがって、この用語は、ウ
イルスベクターと同様にクローニングおよび発現ビヒクルを含む。
ス、ウイルス粒子などのような、適切な制御要素と関連する場合に複製でき、細胞間に遺
伝子配列を移すことができる、任意の遺伝要素を意味する。したがって、この用語は、ウ
イルスベクターと同様にクローニングおよび発現ビヒクルを含む。
「ＡＡＶベクター」は、これに限定されないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３
、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８を含むアデノ随伴
ウイルスから送達されたベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、好適にはｒｅｐおよび
／またはｃａｐ遺伝子を全体または部分において欠損されるＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以
上を有することができるが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を維持することができる。機能的Ｉ
ＴＲ配列はＡＡＶウイルス粒子の救助、複製、およびパッケージングにおいて必要である
。したがって、ＡＡＶベクターは本明細書において、ウイルスの複製およびパッケージン
グ（例えば、機能的ＩＴＲｓ）のためのｃｉｓで必要とされるこれらの配列を少なくとも
含むと定義される。ＩＴＲｓは野生型ヌクレオチド配列を必要とせず、および、配列が救
助、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失ま
たは置換によって変えられることがある。また、「ＡＡＶベクター」はベクター核酸を標
的細胞の核に送達するための効果的なビヒクルを提供するタンパク質殻またはカプシドを
意味する。
、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８を含むアデノ随伴
ウイルスから送達されたベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、好適にはｒｅｐおよび
／またはｃａｐ遺伝子を全体または部分において欠損されるＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以
上を有することができるが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を維持することができる。機能的Ｉ
ＴＲ配列はＡＡＶウイルス粒子の救助、複製、およびパッケージングにおいて必要である
。したがって、ＡＡＶベクターは本明細書において、ウイルスの複製およびパッケージン
グ（例えば、機能的ＩＴＲｓ）のためのｃｉｓで必要とされるこれらの配列を少なくとも
含むと定義される。ＩＴＲｓは野生型ヌクレオチド配列を必要とせず、および、配列が救
助、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失ま
たは置換によって変えられることがある。また、「ＡＡＶベクター」はベクター核酸を標
的細胞の核に送達するための効果的なビヒクルを提供するタンパク質殻またはカプシドを
意味する。
「ＡＡＶヘルパー機能」は、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現されることができ
るＡＡＶ由来コード配列、生産的ＡＡＶ複製のためのトランスにおける機能を意味する。
したがって、ＡＡＶヘルパー機能は主となるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ
ｓ）であるｒｅｐおよびｃａｐの両方を含む。Ｒｅｐ発現産物は、特に、認識、ＤＮＡ複
製のＡＡＶ起点の結合および切断、ＤＮＡヘリカーゼ活性、およびＡＡＶ（または他の非
相同）プロモーターからの転写の調節を含む様々な機能を有する。Ｃａｐ発現産物は必要
なパッケージング機能を提供する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターから失われた
トランスにおいてＡＡＶ機能を補完するために本明細書において使用される。
るＡＡＶ由来コード配列、生産的ＡＡＶ複製のためのトランスにおける機能を意味する。
したがって、ＡＡＶヘルパー機能は主となるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ
ｓ）であるｒｅｐおよびｃａｐの両方を含む。Ｒｅｐ発現産物は、特に、認識、ＤＮＡ複
製のＡＡＶ起点の結合および切断、ＤＮＡヘリカーゼ活性、およびＡＡＶ（または他の非
相同）プロモーターからの転写の調節を含む様々な機能を有する。Ｃａｐ発現産物は必要
なパッケージング機能を提供する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターから失われた
トランスにおいてＡＡＶ機能を補完するために本明細書において使用される。
用語「ＡＡＶヘルパーコンストラクト」は、対象のヌクレオチド配列の送達のための形
質導入ベクターを生成するのに使用されるＡＡＶベクターから削除されたＡＡＶ機能を提
供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を一般的に意味する。ＡＡＶヘルパーコンストラ
クトは、ＡＡＶ複製において必要な失われたＡＡＶ機能を補完するためにＡＡＶ ｒｅｐ
および／またはｃａｐ遺伝子の一時的発現を提供するのに一般的に使用される。しかしな
がら、ヘルパーコンストラクトはＡＡＶ ＩＴＲｓが欠けており、および、それ自身で複
製することもパッケージすることもできない。ＡＡＶヘルパーコンストラクトはプラスミ
ド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはウイルス粒子の形をとること
ができる。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物両方をコードする一般的なプラスミドｐＡＡＶ／
ＡｄおよびＰＩＭ２９＋４５のようなＡＡＶヘルパーコンストラクトの多くは記載されて
いる。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．
６３：３８２２－３８２８； ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６－２９４５を参照。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産
物をコードする多くの他のベクターは、記載されている。例えば、米国特許第５，１３９
，９４１号および第６，３７６，２３７号を参照。
質導入ベクターを生成するのに使用されるＡＡＶベクターから削除されたＡＡＶ機能を提
供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を一般的に意味する。ＡＡＶヘルパーコンストラ
クトは、ＡＡＶ複製において必要な失われたＡＡＶ機能を補完するためにＡＡＶ ｒｅｐ
および／またはｃａｐ遺伝子の一時的発現を提供するのに一般的に使用される。しかしな
がら、ヘルパーコンストラクトはＡＡＶ ＩＴＲｓが欠けており、および、それ自身で複
製することもパッケージすることもできない。ＡＡＶヘルパーコンストラクトはプラスミ
ド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはウイルス粒子の形をとること
ができる。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物両方をコードする一般的なプラスミドｐＡＡＶ／
ＡｄおよびＰＩＭ２９＋４５のようなＡＡＶヘルパーコンストラクトの多くは記載されて
いる。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．
６３：３８２２－３８２８； ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６－２９４５を参照。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産
物をコードする多くの他のベクターは、記載されている。例えば、米国特許第５，１３９
，９４１号および第６，３７６，２３７号を参照。
用語「ベクター関連不純物」は、真正組換えＡＡＶ粒子以外の全てのタイプのＡＡＶ粒
子を意味する。ベクター関連不純物は、空のＡＡＶカプシド（「空の」または「空の粒子
」および目的のベクターゲノム以外のポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶ粒子とも称され
る（「ＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物」または「ＡＡＶカプシドに包まれたＤＮＡ
不純物」とも称される）。
子を意味する。ベクター関連不純物は、空のＡＡＶカプシド（「空の」または「空の粒子
」および目的のベクターゲノム以外のポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶ粒子とも称され
る（「ＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物」または「ＡＡＶカプシドに包まれたＤＮＡ
不純物」とも称される）。
用語「補助機能」は、ＡＡＶがその複製において依存する非ＡＡＶ由来のウイルスおよ
び／または細胞機能を意味する。したがって、この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写、発生段階
依存的なＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、お
よびＡＡＶカプシドアセンブリに含まれる部分を含むＡＡＶ複製において必要とされるタ
ンパク質およびＲＮＡを捕捉する。ウイルスベース補助機能は、アデノウイルス、ヘルペ
スウイルス（単純ヘルペスウイルス タイプ－１以外）およびワクシニアウイルスなどの
ような既知のヘルパーウイルスの任意から派生されることができる。
び／または細胞機能を意味する。したがって、この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写、発生段階
依存的なＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、お
よびＡＡＶカプシドアセンブリに含まれる部分を含むＡＡＶ複製において必要とされるタ
ンパク質およびＲＮＡを捕捉する。ウイルスベース補助機能は、アデノウイルス、ヘルペ
スウイルス（単純ヘルペスウイルス タイプ－１以外）およびワクシニアウイルスなどの
ような既知のヘルパーウイルスの任意から派生されることができる。
用語「補助機能ベクター」は、補助機能を提供する核酸配列を含む核酸分子を一般的に
意味する。補助機能ベクターは適当な宿主細胞内にトランスフェクションされ、そこにお
いて、ベクターは、その後、宿主細胞内のＡＡＶウイルス粒子産物を支持することができ
る。例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルス粒子のような
自然において存在するウイルス粒子感染はこの用語からはっきりと除外される。したがっ
て、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、またはコスミドの形
態であることができる。特に、アデノウイルス遺伝子の完全な補体は補助機能において必
要とされないことが示されている。例えば、ＤＮＡ複製および後期遺伝子合成ができない
アデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製において許容状態を示した。Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．
，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ
，（１９７１） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７．同様に、Ｅ２ＢおよびＥ３領域内の
変異はＡＡＶ複製を支持することを示し、補助機能の提供においてＥ２ＢおよびＥ３領域
はほぼ確実に含まれないことを示す。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５．しかしながら、Ｅ１領域において欠損のある、または
、Ｅ４領域を削除されたアデノウイルスはＡＡＶ複製を支持することができない。したが
って、Ｅ１ＡおよびＥ４領域は、ＡＡＶ複製において直接的あるいは間接的に必要である
ようである。Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．
４１：８６８； Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１９２５； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，
（１９８３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５． Ｏｔｈｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚｅｄ Ａｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎｃｌｕｄｅ： Ｅ１Ｂ （Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅ
ｔ ａｌ． （１９８２）， ｓｕｐｒａ； Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ． （１９８１）
， ｓｕｐｒａ； Ｏｓｔｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１０４：５０２）； Ｅ２Ａ （Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｊ．
Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ２９：２３９； Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， （１９７
６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １７：１４０； Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８０
） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ３５：６６５； Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２９２７； Ｍｙｅｒｓ
ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５６：５６７）；
Ｅ２Ｂ （Ｃａｒｔｅｒ， Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌ
ｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， ｉｎ Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖ
ｏｖｉｒｕｓｅｓ （Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．， １９９０））； Ｅ３ （Ｃａ
ｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３）， ｓｕｐｒａ）； ａｎｄ Ｅ４ （Ｃａｒｔ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）， ｓｕｐｒａ； Ｃａｒｔｅｒ （１９９５））．Ｅ
１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスによって提供された補助機能の研究が矛盾
した結果を有するにもかかわらず（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｊ
． Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６－２１０）、最近、ＡＡＶウイルス粒子産物において、Ｅ
１Ｂ１９ｋではなく、Ｅ１Ｂ５５ｋが必要とされると報告された。加えて、国際公開公報
ＷＯ ９７／１７４５８およびＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８－９４５は、様々なＡｄ遺伝子をコードする補助
機能ベクターを記載している。特に好適な補助機能ベクターはアデノウイルスＶＡ ＲＮ
Ａコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２
ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、およびアデノウイルスＥ１Ｂ５５ｋ
コード領域を有する。このようなベクターは国際公開第０１／８３７９７号に記載されて
いる。
意味する。補助機能ベクターは適当な宿主細胞内にトランスフェクションされ、そこにお
いて、ベクターは、その後、宿主細胞内のＡＡＶウイルス粒子産物を支持することができ
る。例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルス粒子のような
自然において存在するウイルス粒子感染はこの用語からはっきりと除外される。したがっ
て、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、またはコスミドの形
態であることができる。特に、アデノウイルス遺伝子の完全な補体は補助機能において必
要とされないことが示されている。例えば、ＤＮＡ複製および後期遺伝子合成ができない
アデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製において許容状態を示した。Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．
，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ
，（１９７１） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７．同様に、Ｅ２ＢおよびＥ３領域内の
変異はＡＡＶ複製を支持することを示し、補助機能の提供においてＥ２ＢおよびＥ３領域
はほぼ確実に含まれないことを示す。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５．しかしながら、Ｅ１領域において欠損のある、または
、Ｅ４領域を削除されたアデノウイルスはＡＡＶ複製を支持することができない。したが
って、Ｅ１ＡおよびＥ４領域は、ＡＡＶ複製において直接的あるいは間接的に必要である
ようである。Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．
４１：８６８； Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１９２５； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，
（１９８３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５． Ｏｔｈｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚｅｄ Ａｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎｃｌｕｄｅ： Ｅ１Ｂ （Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅ
ｔ ａｌ． （１９８２）， ｓｕｐｒａ； Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ． （１９８１）
， ｓｕｐｒａ； Ｏｓｔｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１０４：５０２）； Ｅ２Ａ （Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｊ．
Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ２９：２３９； Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， （１９７
６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １７：１４０； Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８０
） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ３５：６６５； Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２９２７； Ｍｙｅｒｓ
ｅｔ ａｌ．， （１９８１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５６：５６７）；
Ｅ２Ｂ （Ｃａｒｔｅｒ， Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌ
ｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， ｉｎ Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖ
ｏｖｉｒｕｓｅｓ （Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．， １９９０））； Ｅ３ （Ｃａ
ｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３）， ｓｕｐｒａ）； ａｎｄ Ｅ４ （Ｃａｒｔ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）， ｓｕｐｒａ； Ｃａｒｔｅｒ （１９９５））．Ｅ
１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスによって提供された補助機能の研究が矛盾
した結果を有するにもかかわらず（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｊ
． Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６－２１０）、最近、ＡＡＶウイルス粒子産物において、Ｅ
１Ｂ１９ｋではなく、Ｅ１Ｂ５５ｋが必要とされると報告された。加えて、国際公開公報
ＷＯ ９７／１７４５８およびＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８－９４５は、様々なＡｄ遺伝子をコードする補助
機能ベクターを記載している。特に好適な補助機能ベクターはアデノウイルスＶＡ ＲＮ
Ａコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２
ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、およびアデノウイルスＥ１Ｂ５５ｋ
コード領域を有する。このようなベクターは国際公開第０１／８３７９７号に記載されて
いる。
「組換えウイルス」は、例えば、非相同核酸コンストラクトの粒子への付加または挿入
によって通常改変されたウイルスを意味する。
によって通常改変されたウイルスを意味する。
「ＡＡＶウイルス粒子」は、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶカプシドタン
パク膜と関連した、リニア、一本鎖ＡＡＶ核酸遺伝子を有する）のような完全なウイルス
粒子を意味する。この点について、例えば、「センス」または「アンチセンス」らせん構
造のような相補的センスのどちらか一方の一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、任意の一つのＡＡＶ
ウイルス粒子内にパッケージされることができ、両方のらせん構造は等しく感染性である
。
パク膜と関連した、リニア、一本鎖ＡＡＶ核酸遺伝子を有する）のような完全なウイルス
粒子を意味する。この点について、例えば、「センス」または「アンチセンス」らせん構
造のような相補的センスのどちらか一方の一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、任意の一つのＡＡＶ
ウイルス粒子内にパッケージされることができ、両方のらせん構造は等しく感染性である
。
用語「組換えＡＡＶウイルス粒子」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」、「ＡＡＶベクター粒
子」、「完全なカプシド」および「完全な粒子」は、感染性、ＡＡＶタンパク質殻を含み
、ＡＡＶ ＩＴＲｓによって両側に隣接された対象の非相同核酸配列をカプシド形成する
複製欠損ウイルスとして本明細書で定義される。ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶベクタ
ー、ＡＡＶヘルパー機能およびそこに導入された補助機能を特定する配列を有する適当な
宿主細胞においてつくられる。このように、宿主細胞は、ＡＡＶベクター（対象の組換え
ヌクレオチド配列を含む）を次世代遺伝子送達のために感染性組換えウイルス粒子内にパ
ッキングするために必要とされたＡＡＶポリペプチドをコードできるようにされる。
子」、「完全なカプシド」および「完全な粒子」は、感染性、ＡＡＶタンパク質殻を含み
、ＡＡＶ ＩＴＲｓによって両側に隣接された対象の非相同核酸配列をカプシド形成する
複製欠損ウイルスとして本明細書で定義される。ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶベクタ
ー、ＡＡＶヘルパー機能およびそこに導入された補助機能を特定する配列を有する適当な
宿主細胞においてつくられる。このように、宿主細胞は、ＡＡＶベクター（対象の組換え
ヌクレオチド配列を含む）を次世代遺伝子送達のために感染性組換えウイルス粒子内にパ
ッキングするために必要とされたＡＡＶポリペプチドをコードできるようにされる。
用語「空のカプシド」および「空の粒子」は、ＡＡＶタンパク質殻を含むが、全体また
は部分において、ＡＡＶ ＩＴＲ（ｓ）によって両側に位置する対象の非相同ヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドコンストラクトが欠損するＡＡＶ粒子を意味するもので
ある。したがって、空のカプシドは対象の遺伝子を宿主細胞内に移動する機能はない。
は部分において、ＡＡＶ ＩＴＲ（ｓ）によって両側に位置する対象の非相同ヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドコンストラクトが欠損するＡＡＶ粒子を意味するもので
ある。したがって、空のカプシドは対象の遺伝子を宿主細胞内に移動する機能はない。
「宿主細胞」は、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞を意味し、
ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶベクタープラスミド、補助機能ベクター、または
他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用されることができる、または、でき
た。当該用語は、トランスフェクションされたもとの細胞の子孫を含む。したがって、本
明細書で使用される「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列によってトランスフェクションされ
た細胞を意味する。自然か、偶然か、または意図的な変異によって、単一の親細胞の子孫
は、形態において、または、ゲノムにおいて完全に同一である必要はなく、または、もと
の親細胞と完全にＤＮＡ相補的である必要なないことは理解されている。
ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶベクタープラスミド、補助機能ベクター、または
他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用されることができる、または、でき
た。当該用語は、トランスフェクションされたもとの細胞の子孫を含む。したがって、本
明細書で使用される「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列によってトランスフェクションされ
た細胞を意味する。自然か、偶然か、または意図的な変異によって、単一の親細胞の子孫
は、形態において、または、ゲノムにおいて完全に同一である必要はなく、または、もと
の親細胞と完全にＤＮＡ相補的である必要なないことは理解されている。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを意味するのであ
り、および、外来ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときに、細胞は「トランスフェクション
」した。トランスフェクション技術の多くは当業者において一般的に知られている。例え
ば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２ ：４５６
， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．
（１９８６） Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ａｎｄ Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｇｅｎｅ
１３：１９７を参照。このような技術は、１つ以上の外来ＤＮＡ部分を適当な宿主細胞
内に導入するのに用いられることができる。
り、および、外来ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときに、細胞は「トランスフェクション
」した。トランスフェクション技術の多くは当業者において一般的に知られている。例え
ば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２ ：４５６
， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．
（１９８６） Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ａｎｄ Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｇｅｎｅ
１３：１９７を参照。このような技術は、１つ以上の外来ＤＮＡ部分を適当な宿主細胞
内に導入するのに用いられることができる。
本明細書で使用されているように、用語「細胞株」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連続的または
持続的に成長または分割することができる細胞の集団を意味する。しばしば、細胞株は、
単一の原種細胞に由来するクローン集団である。自発的な、または誘導された変化が、上
記のクローン集団の貯蔵または移動の間に核型において生じることがあるのは当業者にお
いてさらに知られている。したがって、関連される細胞株に由来する細胞は正確に祖先の
細胞または培養組織と同一でなくてもよく、関連される細胞株はこの種の変異体を含む。
持続的に成長または分割することができる細胞の集団を意味する。しばしば、細胞株は、
単一の原種細胞に由来するクローン集団である。自発的な、または誘導された変化が、上
記のクローン集団の貯蔵または移動の間に核型において生じることがあるのは当業者にお
いてさらに知られている。したがって、関連される細胞株に由来する細胞は正確に祖先の
細胞または培養組織と同一でなくてもよく、関連される細胞株はこの種の変異体を含む。
ＡＡＶベクター粒子（包装されたゲノム）を有するｒＡＡＶウイルス粒子の貯蔵物また
は調製物は、貯蔵物中に存在するウイルス粒子の少なくとも約５０％～９９％またはそれ
以上が包装されたゲノム（つまりＡＡＶベクター粒子）である場合、「実質的に」ＡＡＶ
空のカプシドを含まない。好適には、ＡＡＶベクターは、貯蔵物中のウイルス粒子の少な
くとも約７５重量％から８５重量％、より好適には約９０重量％を有し、さらにより好適
には、貯蔵物中のウイルス粒子の少なくとも約９５重量％、または９９重量％でさえ有し
、または、これらの範囲の間の任意の整数を有する。したがって、空のカプシドを有する
結果として生じる貯蔵物の約４０％から約１％またはそれ以下、好適には約２５％から約
１５％またはそれ以下、より好適には約１０％またはそれ以下、さらにより好適には約５
％から約１％またはそれ以下である場合、貯蔵物は実質的にＡＡＶ空のカプシドを含まな
い。
は調製物は、貯蔵物中に存在するウイルス粒子の少なくとも約５０％～９９％またはそれ
以上が包装されたゲノム（つまりＡＡＶベクター粒子）である場合、「実質的に」ＡＡＶ
空のカプシドを含まない。好適には、ＡＡＶベクターは、貯蔵物中のウイルス粒子の少な
くとも約７５重量％から８５重量％、より好適には約９０重量％を有し、さらにより好適
には、貯蔵物中のウイルス粒子の少なくとも約９５重量％、または９９重量％でさえ有し
、または、これらの範囲の間の任意の整数を有する。したがって、空のカプシドを有する
結果として生じる貯蔵物の約４０％から約１％またはそれ以下、好適には約２５％から約
１５％またはそれ以下、より好適には約１０％またはそれ以下、さらにより好適には約５
％から約１％またはそれ以下である場合、貯蔵物は実質的にＡＡＶ空のカプシドを含まな
い。
ＡＡＶベクター粒子（パッケージされたゲノム）を有するｒＡＡＶウイルス粒子の貯蔵
物または調製物は、貯蔵物に存在するウイルス粒子の少なくとも約９０～９９％以上が真
正ゲノム（つまりＡＡＶベクターゲノム）を有するｒＡＡＶウイルス粒子である場合、「
ＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物」を「実質的に含まない」。好適には、ＡＡＶベク
ター粒子は、貯蔵物に存在するウイルス粒子の少なくとも約９５％から９８％、さらに好
適には９９％、よりさらに好適には貯蔵物に存在するウイルス粒子の少なくとも約９９重
量％以上またはその範囲の任意の整数を有する。したがって、結果として生じる貯蔵物の
約１０％から約１％以下、好適には約２％以下、さらに好適には約１％以下、よりさらに
好適には約０．５％以下がＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物を有する場合、貯蔵物は
ＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物を実質的に含まない。
物または調製物は、貯蔵物に存在するウイルス粒子の少なくとも約９０～９９％以上が真
正ゲノム（つまりＡＡＶベクターゲノム）を有するｒＡＡＶウイルス粒子である場合、「
ＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物」を「実質的に含まない」。好適には、ＡＡＶベク
ター粒子は、貯蔵物に存在するウイルス粒子の少なくとも約９５％から９８％、さらに好
適には９９％、よりさらに好適には貯蔵物に存在するウイルス粒子の少なくとも約９９重
量％以上またはその範囲の任意の整数を有する。したがって、結果として生じる貯蔵物の
約１０％から約１％以下、好適には約２％以下、さらに好適には約１％以下、よりさらに
好適には約０．５％以下がＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物を有する場合、貯蔵物は
ＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物を実質的に含まない。
「核酸」配列はＤＮＡまたはＲＮＡ配列を意味する。用語は、例えば、これに限定され
るわけではないが、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、
アジリジニルシトシン、偽イソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシ
ル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－
２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボ
キシメチルアミノメチルウラシル－ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペテニルア
デニン、１－メチルアデニン、１－メチル偽ウラシル、１－メチルグアニン、１－メチル
イノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－
メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５
－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ
－Ｄ－マンノシルクエオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシ
ウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸
メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、偽ウラシル、クエオ
シン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオ
ウラシル、５－メチルウラシル、Ｂウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル
－５－オキシ酢酸、偽ウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、および２，６－ジアミ
ノプリンのようなＤＮＡおよびＲＮＡの任意の既知の塩基類似体を含む配列を捕捉する。
るわけではないが、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、
アジリジニルシトシン、偽イソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシ
ル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－
２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボ
キシメチルアミノメチルウラシル－ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペテニルア
デニン、１－メチルアデニン、１－メチル偽ウラシル、１－メチルグアニン、１－メチル
イノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－
メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５
－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ
－Ｄ－マンノシルクエオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシ
ウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸
メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、偽ウラシル、クエオ
シン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオ
ウラシル、５－メチルウラシル、Ｂウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル
－５－オキシ酢酸、偽ウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、および２，６－ジアミ
ノプリンのようなＤＮＡおよびＲＮＡの任意の既知の塩基類似体を含む配列を捕捉する。
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適当な調節配
列の制御のもとに配置されると、ｉｎ ｖｉｖｏのポリペプチド内で転写され（ＤＮＡの
場合）、および、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、
５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより
定義される。転写終止配列は、コード配列の３’に位置することがある。
列の制御のもとに配置されると、ｉｎ ｖｉｖｏのポリペプチド内で転写され（ＤＮＡの
場合）、および、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、
５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより
定義される。転写終止配列は、コード配列の３’に位置することがある。
用語ＤＮＡ「制御配列」は、受容細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳のた
めに集合的に提供される、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、
上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー
などを集合的に意味する。選択されたコード配列が適当な宿主細胞において、複製、転写
および翻訳される限り、これらの制御配列の全てが存在することが常に必要なわけではな
い。
めに集合的に提供される、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、
上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー
などを集合的に意味する。選択されたコード配列が適当な宿主細胞において、複製、転写
および翻訳される限り、これらの制御配列の全てが存在することが常に必要なわけではな
い。
用語「プロモーター」は、ＤＮＡ調節配列を有するヌクレオチド領域を通常意味するも
のとして本明細書で使用されており、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼを結合することお
よび下流（３’－方向）コード配列の転写を開始することができる遺伝子由来のものであ
る。転写プロモーターは、「誘導プロモーター」（使用可能な状態でプロモーターに結合
されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘
導された場合）「抑制プロモーター」（使用可能な状態で結合されたポリヌクレオチド配
列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって融合された場合）および「構成
的プロモーター」を含むことができる。
のとして本明細書で使用されており、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼを結合することお
よび下流（３’－方向）コード配列の転写を開始することができる遺伝子由来のものであ
る。転写プロモーターは、「誘導プロモーター」（使用可能な状態でプロモーターに結合
されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘
導された場合）「抑制プロモーター」（使用可能な状態で結合されたポリヌクレオチド配
列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって融合された場合）および「構成
的プロモーター」を含むことができる。
「使用可能な状態で結合された」とは、記載されている構成要素がそれらの通常の機能
を実行するために構成される要素の配置を意味するものである。したがって、コード配列
に使用可能な状態で結合された制御配列はコード配列の発現をもたらすことができる。そ
れらがその発現を導くように機能する限り、制御配列はコード配列に隣接する必要はない
。したがって、例えば、介在翻訳されていないが、転写された配列はプロモーター配列お
よびコード配列との間に存在することが可能であり、プロモーター配列はコード配列に「
使用可能な状態で結合された」とみなすことができる。
を実行するために構成される要素の配置を意味するものである。したがって、コード配列
に使用可能な状態で結合された制御配列はコード配列の発現をもたらすことができる。そ
れらがその発現を導くように機能する限り、制御配列はコード配列に隣接する必要はない
。したがって、例えば、介在翻訳されていないが、転写された配列はプロモーター配列お
よびコード配列との間に存在することが可能であり、プロモーター配列はコード配列に「
使用可能な状態で結合された」とみなすことができる。
本願の全体にわたって特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置を記載す
る目的において、例えば、特定のヌクレオチド配列が他の配列と比較して「上流」、「下
流」、「３’」または「５’」に位置すると記載される場合、それが従来技術において関
連されるＤＮＡ分子の「センス」または「コード」らせん構造においての配列の位置であ
ることは理解されるものである。
る目的において、例えば、特定のヌクレオチド配列が他の配列と比較して「上流」、「下
流」、「３’」または「５’」に位置すると記載される場合、それが従来技術において関
連されるＤＮＡ分子の「センス」または「コード」らせん構造においての配列の位置であ
ることは理解されるものである。
例えばコード配列および制御配列のような核酸配列に関連する用語「非相同」は、通常
の結合をされていない、および／または特定の細胞と通常関連のない配列を意味する。し
たがって、核酸コンストラクトまたはベクターの「非相同」領域は、自然の他の核酸分子
と関連して発見されない他の核酸内またはその核酸にとりつけられた核酸のセグメントで
ある。例えば、核酸コンストラクトの非相同領域は自然のコード配列と関連して発見され
ない配列によって隣接されたコード配列を含むことができる。非相同コード領域の他の例
は、コード配列そのものが自然では発見されない（つまり、自然の遺伝子と異なるコドン
を有する合成配列）コンストラクトである。同様に、細胞に通常存在しないコンストラク
トによって形質転換された細胞はこの発明の目的を達成するために非相同であるとみなさ
れる。対立遺伝子変異または自然発生的変異は、本明細書において使用されるような非相
同ＤＮＡを引き起こさない。
の結合をされていない、および／または特定の細胞と通常関連のない配列を意味する。し
たがって、核酸コンストラクトまたはベクターの「非相同」領域は、自然の他の核酸分子
と関連して発見されない他の核酸内またはその核酸にとりつけられた核酸のセグメントで
ある。例えば、核酸コンストラクトの非相同領域は自然のコード配列と関連して発見され
ない配列によって隣接されたコード配列を含むことができる。非相同コード領域の他の例
は、コード配列そのものが自然では発見されない（つまり、自然の遺伝子と異なるコドン
を有する合成配列）コンストラクトである。同様に、細胞に通常存在しないコンストラク
トによって形質転換された細胞はこの発明の目的を達成するために非相同であるとみなさ
れる。対立遺伝子変異または自然発生的変異は、本明細書において使用されるような非相
同ＤＮＡを引き起こさない。
非相同核酸を有する導入遺伝子は、多くの有用な産物をコードすることができる。これ
らは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、およびｍｉＲＮＡを例えば含むことができる。あ
るいは、導入遺伝子は、これに限定されないが、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン
（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホ
ルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー
刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成
長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）
、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦβ、アク
チビン、インヒビン、または任意の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ（ＢＭＰｓ）
１～１５を含む形質転換増殖因子βスーパーファミリーの任意の１つ、成長因子のヘレグ
リン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの任意の１つ、
神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィンＮＴ－３
およびＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（
ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマホリン／コラプシンのファミリーの任意の
１つ、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン
、ソニックヘッジホッグおよびチロシン水酸化酵素を含むホルモンおよび成長および分化
因子をコードすることができる。
らは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、およびｍｉＲＮＡを例えば含むことができる。あ
るいは、導入遺伝子は、これに限定されないが、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン
（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホ
ルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー
刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成
長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）
、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦβ、アク
チビン、インヒビン、または任意の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ（ＢＭＰｓ）
１～１５を含む形質転換増殖因子βスーパーファミリーの任意の１つ、成長因子のヘレグ
リン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの任意の１つ、
神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィンＮＴ－３
およびＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（
ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマホリン／コラプシンのファミリーの任意の
１つ、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン
、ソニックヘッジホッグおよびチロシン水酸化酵素を含むホルモンおよび成長および分化
因子をコードすることができる。
他の有用な導入遺伝子産物は、これに限定されないが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ１からＩＬ－１７）、単球走化性タンパク質、白血病抑制
因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよ
びβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドの
ようなサイトカインおよびリンホカインを含む免疫系を調節するタンパク質を含む。免疫
系によってつくられる遺伝子産物は、本発明においても有用である。これらは、これに限
定されないが、改変された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子と同様に、免疫グロブリンＩ
ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本
鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラ
スＩＩ ＭＨＣ分子を含む。有用な遺伝子産物はまた、補体調節タンパク質、膜補因子タ
ンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような
調節タンパク質を含む。
インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ１からＩＬ－１７）、単球走化性タンパク質、白血病抑制
因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよ
びβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドの
ようなサイトカインおよびリンホカインを含む免疫系を調節するタンパク質を含む。免疫
系によってつくられる遺伝子産物は、本発明においても有用である。これらは、これに限
定されないが、改変された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子と同様に、免疫グロブリンＩ
ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本
鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラ
スＩＩ ＭＨＣ分子を含む。有用な遺伝子産物はまた、補体調節タンパク質、膜補因子タ
ンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような
調節タンパク質を含む。
他の有用な遺伝子産物は、代謝の先天的異常における修正ができるものを含む。このよ
うな導入遺伝子は、例えば、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチン・トランスカルバミラ
ーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、アルギニノコハク酸分解酵素、アルギナーゼ、フマ
リルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニン水酸化酵素、アルファ－１ アンチトリプ
シン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノゲン・デアミナーゼ、第Ｖ因子、
第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンβ合成酵素、側鎖ケト酸デカルボキシラー
ゼ、アルブミン、イソバレリルＣｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ
、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、ベータ－
グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキ
ナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症
膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）配列およびジストロフィンｃＤＮＡ配列をコード
することができる。
うな導入遺伝子は、例えば、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチン・トランスカルバミラ
ーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、アルギニノコハク酸分解酵素、アルギナーゼ、フマ
リルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニン水酸化酵素、アルファ－１ アンチトリプ
シン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノゲン・デアミナーゼ、第Ｖ因子、
第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンβ合成酵素、側鎖ケト酸デカルボキシラー
ゼ、アルブミン、イソバレリルＣｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ
、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、ベータ－
グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキ
ナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症
膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）配列およびジストロフィンｃＤＮＡ配列をコード
することができる。
「分離された」が、ヌクレオチド配列について言及する場合、同タイプの他の生体高分
子が実質的に存在しない中で、示された分子が存在することを意味する。したがって、「
特定のポリペプチドをコードする分離された核酸分子」は、目的のポリペプチドをコード
しない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を意味する。しかしながら、当該分子は
組成物の基本的な性質に有害な影響を及ばさない付加的な塩基または部分を含むことがで
きる。
子が実質的に存在しない中で、示された分子が存在することを意味する。したがって、「
特定のポリペプチドをコードする分離された核酸分子」は、目的のポリペプチドをコード
しない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を意味する。しかしながら、当該分子は
組成物の基本的な性質に有害な影響を及ばさない付加的な塩基または部分を含むことがで
きる。
本発明は、ＡＡＶウイルス粒子の精製された貯蔵物内に含まれたＡＡＶベクター関連不純
物（例えば空のカプシドおよびＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物）を、そこに含まれ
ているＡＡＶベクター粒子の最小限の減少で、その数を減らす、または、除去することを
含む。本発明の方法は、ｒＡＡＶウイルス粒子の生成におけるプロセスに関係なく使用さ
れることができる。
物（例えば空のカプシドおよびＡＡＶカプシドに包まれた核酸不純物）を、そこに含まれ
ているＡＡＶベクター粒子の最小限の減少で、その数を減らす、または、除去することを
含む。本発明の方法は、ｒＡＡＶウイルス粒子の生成におけるプロセスに関係なく使用さ
れることができる。
ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するための当業者においてよく知られているいくつかの方
法がある：例えば、ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイル
スまたはワクシニアウイルス）の一つによる重感染と併せたベクターおよびＡＡＶヘルパ
ー配列を使用するトランスフェクション、または組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー
ベクター、アクセサリー機能ベクターによるトランスフェクション。ｒＡＡＶウイルス粒
子を生成するための方法の詳細な記述は、米国特許第６，００１，６５０号および第６，
００４，７９７号を参照、これらの両文献はその全体において参照により本明細書に組み
込まれている。
法がある：例えば、ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイル
スまたはワクシニアウイルス）の一つによる重感染と併せたベクターおよびＡＡＶヘルパ
ー配列を使用するトランスフェクション、または組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー
ベクター、アクセサリー機能ベクターによるトランスフェクション。ｒＡＡＶウイルス粒
子を生成するための方法の詳細な記述は、米国特許第６，００１，６５０号および第６，
００４，７９７号を参照、これらの両文献はその全体において参照により本明細書に組み
込まれている。
ｒＡＡＶウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）の精製
組換えＡＡＶの複製（すなわち細胞培養システムにおけるベクターの生成）に続いて、
ｒＡＡＶウイルス粒子は、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ密度勾配等のような種々
の従来の精製方法を用いて宿主細胞から精製出来る。例えば、陰イオン交換カラム、アフ
ィニティーカラム、および／または陽イオン交換カラム上の精製のような複数のカラム精
製工程を使用することが出来る。例えば、国際公開第ＷＯ ０２／１２４５５を参照。補
助機能を表現するために感染を使用する場合には、残留ヘルパーウイルスは、既知の方法
を用いて、不活性化出来る。例えば、アデノウイルスは約６０℃の温度で、例えば、２０
分あるいはそれ以上加熱することによって不活性化出来る。ヘルパーアデノウイルスは熱
に不安定であるが、ＡＡＶは、熱に非常に安定あるので、この処置は効果的に前記ヘルパ
ーウイルスだけを不活性化する。
組換えＡＡＶの複製（すなわち細胞培養システムにおけるベクターの生成）に続いて、
ｒＡＡＶウイルス粒子は、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ密度勾配等のような種々
の従来の精製方法を用いて宿主細胞から精製出来る。例えば、陰イオン交換カラム、アフ
ィニティーカラム、および／または陽イオン交換カラム上の精製のような複数のカラム精
製工程を使用することが出来る。例えば、国際公開第ＷＯ ０２／１２４５５を参照。補
助機能を表現するために感染を使用する場合には、残留ヘルパーウイルスは、既知の方法
を用いて、不活性化出来る。例えば、アデノウイルスは約６０℃の温度で、例えば、２０
分あるいはそれ以上加熱することによって不活性化出来る。ヘルパーアデノウイルスは熱
に不安定であるが、ＡＡＶは、熱に非常に安定あるので、この処置は効果的に前記ヘルパ
ーウイルスだけを不活性化する。
任意の数のレポーター遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターを用いて感染力価を決定出来
る。例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、緑色蛍光タ
ンパク質、またはルシフェラーゼを使用し得る。形質移入された宿主細胞を収集後、微溶
液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などの大規模生産に適した技術を用いて形
質移入した宿主細胞を破壊することによって可溶化液（ｌｙｓａｔｅ）を形成する。該可
溶化液は、次いで濾過し（例えば、０．４５μｍのフィルターを通して）、本明細書に記
載のようなカラムクロマトグラフィー法を用いて精製する。任意のＡＡＶベクターの感染
力価を決定する他の手法も報告されている。例えば、Ｚｈｅｎ ｅｔ ａｌ．"Ａｎ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓ
ｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖ
ｅｎｔｓ．"Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００４）１５：７０９－７１５参照。清
澄化した可溶化液は、カラムクロマトグラフィー法を用いて、一つ或いはそれ以上の精製
工程を経て、ＡＡＶ粒子（真正ベクター及びベクター関連不純物を含む）を精製する。好
ましい方法では、前記ＡＡＶ粒子は、陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラ
フィーを採用した１つ或いはそれ以上の逐次工程を用いて精製する。本発明の特に好まし
い方法では、ｒＡＡＶ調製物は、容易に拡張可能な方法により、粗細胞可溶化液を得るよ
う、形質移入した細胞を溶解化することによって得られる。当該粗細胞可溶化液は、次い
で濾過、遠心分離、などの当該技術分野で既知の技術によって清澄化し、細胞破片を除去
し、清澄化細胞溶液を得ることが出来る。前記粗細胞可溶化液或いは清澄細胞可溶化液は
、ＡＡＶ粒子（真正ＡＡＶベクター、ＡＡＶ空のカプシド、およびＡＡＶベクター関連不
純物）と一連の非ＡＡＶベクター関連不純物、例えば、前記感染宿主細胞由来の可溶性細
胞成分の、両方を含む。これらは、望ましくない細胞タンパク質、脂質、および／または
核酸、細胞培養の培地成分（例えば、ウシ血清）を含み得る。前記可溶化液は、第１陽イ
オン交換カラムにかける。当該第１陽イオン交換カラムは、さらに細胞可溶化液調製物中
に存在する細胞や他の諸成分からＡＡＶ粒子を分離するよう作動する。細胞可溶化液の初
期精製を実施する方法は既知である。一代表的な方法は、米国特許第６、５９３、１２３
号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
る。例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、緑色蛍光タ
ンパク質、またはルシフェラーゼを使用し得る。形質移入された宿主細胞を収集後、微溶
液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などの大規模生産に適した技術を用いて形
質移入した宿主細胞を破壊することによって可溶化液（ｌｙｓａｔｅ）を形成する。該可
溶化液は、次いで濾過し（例えば、０．４５μｍのフィルターを通して）、本明細書に記
載のようなカラムクロマトグラフィー法を用いて精製する。任意のＡＡＶベクターの感染
力価を決定する他の手法も報告されている。例えば、Ｚｈｅｎ ｅｔ ａｌ．"Ａｎ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓ
ｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖ
ｅｎｔｓ．"Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００４）１５：７０９－７１５参照。清
澄化した可溶化液は、カラムクロマトグラフィー法を用いて、一つ或いはそれ以上の精製
工程を経て、ＡＡＶ粒子（真正ベクター及びベクター関連不純物を含む）を精製する。好
ましい方法では、前記ＡＡＶ粒子は、陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラ
フィーを採用した１つ或いはそれ以上の逐次工程を用いて精製する。本発明の特に好まし
い方法では、ｒＡＡＶ調製物は、容易に拡張可能な方法により、粗細胞可溶化液を得るよ
う、形質移入した細胞を溶解化することによって得られる。当該粗細胞可溶化液は、次い
で濾過、遠心分離、などの当該技術分野で既知の技術によって清澄化し、細胞破片を除去
し、清澄化細胞溶液を得ることが出来る。前記粗細胞可溶化液或いは清澄細胞可溶化液は
、ＡＡＶ粒子（真正ＡＡＶベクター、ＡＡＶ空のカプシド、およびＡＡＶベクター関連不
純物）と一連の非ＡＡＶベクター関連不純物、例えば、前記感染宿主細胞由来の可溶性細
胞成分の、両方を含む。これらは、望ましくない細胞タンパク質、脂質、および／または
核酸、細胞培養の培地成分（例えば、ウシ血清）を含み得る。前記可溶化液は、第１陽イ
オン交換カラムにかける。当該第１陽イオン交換カラムは、さらに細胞可溶化液調製物中
に存在する細胞や他の諸成分からＡＡＶ粒子を分離するよう作動する。細胞可溶化液の初
期精製を実施する方法は既知である。一代表的な方法は、米国特許第６、５９３、１２３
号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
カラムクロマトグラフィーを使用すれば、細胞培養における組換えＡＡＶベクターの生
成後の粗収集物に存在する他の大抵の不純物からＡＡＶ粒子を効率的に精製出来る。例え
ば、順次に不純物からＡＡＶ粒子を逐次分離するために，１つ或いはそれ以上のイオン交
換クロマトグラフィーの工程が使用出来る。陰イオンと陽イオン交換クロマトグラフィー
樹脂及び他の型のクロマトグラフィー樹脂が、様々な組み合わせで、目的とする特定のＡ
ＡＶ血清型に応じて最適な、種々の組み合わせで使用出来る。次の組換えＡＡＶ血清型の
精製のための単一クロマトグラフィー工程で、次のクロマトグラフィー樹脂が使用出来る
。
成後の粗収集物に存在する他の大抵の不純物からＡＡＶ粒子を効率的に精製出来る。例え
ば、順次に不純物からＡＡＶ粒子を逐次分離するために，１つ或いはそれ以上のイオン交
換クロマトグラフィーの工程が使用出来る。陰イオンと陽イオン交換クロマトグラフィー
樹脂及び他の型のクロマトグラフィー樹脂が、様々な組み合わせで、目的とする特定のＡ
ＡＶ血清型に応じて最適な、種々の組み合わせで使用出来る。次の組換えＡＡＶ血清型の
精製のための単一クロマトグラフィー工程で、次のクロマトグラフィー樹脂が使用出来る
。
幾つかの場合では、２つあるいはそれ以上の逐次クロマトグラフィー工程は、より高い
ＡＡＶ粒子の純度を達成するためと、疾患を治療するのにヒト被験者で使用するための、
組換えＡＡＶを製造目的の要件である、外来ウイルス汚染物質の除去を確保するためとに
有益であり得る。逐次クロマトグラフィー工程は、異なった組換えＡＡＶ血清型用に最適
化した、種々の順序で逐次実施する、異なる樹脂を使用出来る。例えば、２つの逐次クロ
マトグラフィー工程によって達成するベクター粒子の精製には、次の形式を採用すること
が出来る。
ＡＡＶ粒子の純度を達成するためと、疾患を治療するのにヒト被験者で使用するための、
組換えＡＡＶを製造目的の要件である、外来ウイルス汚染物質の除去を確保するためとに
有益であり得る。逐次クロマトグラフィー工程は、異なった組換えＡＡＶ血清型用に最適
化した、種々の順序で逐次実施する、異なる樹脂を使用出来る。例えば、２つの逐次クロ
マトグラフィー工程によって達成するベクター粒子の精製には、次の形式を採用すること
が出来る。
前記第一陽イオン交換カラムと第２陽イオン交換カラムの両方に適した陽イオン交換体
は、使用する際、当該分野で公知の広範囲の多様な材料を含む。特に好ましいのは広いｐ
Ｈ範囲に亘ってｒＡＡＶウイルス粒子と結合出来る強陽イオン交換体である。例えば、カ
ルボキシメチル化及びスルホン化陽イオン交換マトリックスは、本明細書で使用するのに
特に有用である。有用なマトリックス材料は、繊維状、ミクロ粒状（ｍｉｃｒｏｇｒａｎ
ｕｌａｒ）、及び数珠状マトリックスのようなセルロースマトリックス；アガロース、デ
キストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカおよびポリエーテル
マトリックス、並びに複合材料を含むが、これらに限定されない。本明細書で特に好まし
いのは、機能的リガンドＲ－ＳＯ３ －を含むマトリックス、好ましくはスルホプロピルま
たはスルホエチル樹脂である。代表的なマトリックスは、ＰＯＲＯＳ ＨＳ、ＰＯＲＯＳ
ＳＰ、ＰＯＲＯＳ Ｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙから入手出来るすべて強陽イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ ＣＭ（
、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
から入手出来る弱陽イオン交換体）、ＴＯＳＯＨＡＡＳ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ５５
０ＣとＭＥＲＣＫ ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭＤＳＯ３－６５０（ｍ）、並びにＳＯＵＲ
ＣＥ １５Ｓ，ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｓ，ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＳＰ ＦＦ，ＳＥＰＨＡＲ
ＯＳＥ ＳＰ ＸＬ（すべてＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージ
ー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入手出来る）を含むが、これらに限定されない。
は、使用する際、当該分野で公知の広範囲の多様な材料を含む。特に好ましいのは広いｐ
Ｈ範囲に亘ってｒＡＡＶウイルス粒子と結合出来る強陽イオン交換体である。例えば、カ
ルボキシメチル化及びスルホン化陽イオン交換マトリックスは、本明細書で使用するのに
特に有用である。有用なマトリックス材料は、繊維状、ミクロ粒状（ｍｉｃｒｏｇｒａｎ
ｕｌａｒ）、及び数珠状マトリックスのようなセルロースマトリックス；アガロース、デ
キストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカおよびポリエーテル
マトリックス、並びに複合材料を含むが、これらに限定されない。本明細書で特に好まし
いのは、機能的リガンドＲ－ＳＯ３ －を含むマトリックス、好ましくはスルホプロピルま
たはスルホエチル樹脂である。代表的なマトリックスは、ＰＯＲＯＳ ＨＳ、ＰＯＲＯＳ
ＳＰ、ＰＯＲＯＳ Ｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙから入手出来るすべて強陽イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ ＣＭ（
、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
から入手出来る弱陽イオン交換体）、ＴＯＳＯＨＡＡＳ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ５５
０ＣとＭＥＲＣＫ ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭＤＳＯ３－６５０（ｍ）、並びにＳＯＵＲ
ＣＥ １５Ｓ，ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｓ，ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＳＰ ＦＦ，ＳＥＰＨＡＲ
ＯＳＥ ＳＰ ＸＬ（すべてＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージ
ー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入手出来る）を含むが、これらに限定されない。
下記のすべてのカラムクロマトグラフィーのプロトコルでは、カラムは、適切な緩衝液
で当技術分野で公知の標準プロトコルを使用して調製することが出来る。ついで、試料を
添加する。使用した第１陽イオン交換カラムでは、条件として、すべてのＡＡＶ粒子はカ
ラム樹脂に結合し、その後一緒に溶出されるが、前記細胞可溶化液中に存在する他の細胞
成分及び破片からは分離されるようになっている。例えば、ＡＡＶ粒子は適切なイオン強
度の緩衝液を用いて溶出される。適切な緩衝液は、例えば１０～５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、好ましくは１５～４０、例えば２０、２５、３０、３５、４０ｍＭ等のリン酸ナトリ
ウム塩であって、ＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩を１００～７００ｍＭ、例えば２００～
４００ｍＭ、例えば、２００、３００、３２５、３５０、３７０、３８０、４００、等、
またはこれらの範囲内で任意の濃度を含有する。当該緩衝液のｐＨは、約３～約９．５、
例えば４～８、さらに、ｐＨ４、４．５、５、５．５、６、等、またはこれらの範囲内で
任意のｐＨであり得る。当該画分は、収集され、その後、陰イオン交換カラムおよび／ま
たは第２陽イオン交換カラムのいずれかで分離条件下操作出来る。
で当技術分野で公知の標準プロトコルを使用して調製することが出来る。ついで、試料を
添加する。使用した第１陽イオン交換カラムでは、条件として、すべてのＡＡＶ粒子はカ
ラム樹脂に結合し、その後一緒に溶出されるが、前記細胞可溶化液中に存在する他の細胞
成分及び破片からは分離されるようになっている。例えば、ＡＡＶ粒子は適切なイオン強
度の緩衝液を用いて溶出される。適切な緩衝液は、例えば１０～５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、好ましくは１５～４０、例えば２０、２５、３０、３５、４０ｍＭ等のリン酸ナトリ
ウム塩であって、ＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩を１００～７００ｍＭ、例えば２００～
４００ｍＭ、例えば、２００、３００、３２５、３５０、３７０、３８０、４００、等、
またはこれらの範囲内で任意の濃度を含有する。当該緩衝液のｐＨは、約３～約９．５、
例えば４～８、さらに、ｐＨ４、４．５、５、５．５、６、等、またはこれらの範囲内で
任意のｐＨであり得る。当該画分は、収集され、その後、陰イオン交換カラムおよび／ま
たは第２陽イオン交換カラムのいずれかで分離条件下操作出来る。
若し第２陽イオン交換カラムが、さらに後の工程でＡＡＶ粒子を精製するために使用さ
れる場合は、２種の溶出緩衝液として、１つの低塩緩衝液と１つの高塩緩衝液とを使用出
来る。具体的には、さらなる不純物が、適切な緩衝液を用いて、ｐＨ約６～ｐＨ１２、好
ましくはｐＨ７～ｐＨ１０，さらに好ましくはｐＨ７．５～ｐＨ９．５、例えば、ｐＨ７
．５、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、９．０、９．１、９．２、９
．３、９．４、９．５、または述べた範囲の間の任意のｐＨでＡＡＶ粒子から分離される
。適切な緩衝液は、当技術分野でよく知られており、限定されないが、以下の緩衝液イオ
ン：酢酸；マロン酸、ＭＥＳ、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ等を有する緩衝液を
含む。試料を溶出するためには、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニア、または硫酸塩、ギ
酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、および／またはリン酸塩を含む任意の他の塩を使用して該開
始緩衝液のイオン強度を高める。本発明の一実施形態では、前記カラムは、先ず低塩濃度
、例えば、１０～２００ｍＭの酢酸アンモニウムを用い、２５、３０、３５、４０、４５
、５０、５５、６０、６５～１００ｍＭまたはこれらの範囲内で任意の濃度で処置する。
この処置の結果、該カラム樹脂からＡＡＶベクター粒子が溶出する。その後、該カラムは
、より高い塩濃度で処理され、ＡＡＶ空カプシドを溶出する。第２緩衝液として使用する
一例は、１００～８００ｍＭ濃度、好ましくは５００～７００ｍＭ、さらに５００、５５
０、６００、６５０、７００、８００ｍＭまたはこれらの記述範囲内で任意の濃度の酢酸
アンモニウムである。これらの条件を使用すると、前記ＡＡＶベクター粒子は初期の分画
中に溶出し、空の粒子は後期に溶出する。
れる場合は、２種の溶出緩衝液として、１つの低塩緩衝液と１つの高塩緩衝液とを使用出
来る。具体的には、さらなる不純物が、適切な緩衝液を用いて、ｐＨ約６～ｐＨ１２、好
ましくはｐＨ７～ｐＨ１０，さらに好ましくはｐＨ７．５～ｐＨ９．５、例えば、ｐＨ７
．５、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、９．０、９．１、９．２、９
．３、９．４、９．５、または述べた範囲の間の任意のｐＨでＡＡＶ粒子から分離される
。適切な緩衝液は、当技術分野でよく知られており、限定されないが、以下の緩衝液イオ
ン：酢酸；マロン酸、ＭＥＳ、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ等を有する緩衝液を
含む。試料を溶出するためには、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニア、または硫酸塩、ギ
酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、および／またはリン酸塩を含む任意の他の塩を使用して該開
始緩衝液のイオン強度を高める。本発明の一実施形態では、前記カラムは、先ず低塩濃度
、例えば、１０～２００ｍＭの酢酸アンモニウムを用い、２５、３０、３５、４０、４５
、５０、５５、６０、６５～１００ｍＭまたはこれらの範囲内で任意の濃度で処置する。
この処置の結果、該カラム樹脂からＡＡＶベクター粒子が溶出する。その後、該カラムは
、より高い塩濃度で処理され、ＡＡＶ空カプシドを溶出する。第２緩衝液として使用する
一例は、１００～８００ｍＭ濃度、好ましくは５００～７００ｍＭ、さらに５００、５５
０、６００、６５０、７００、８００ｍＭまたはこれらの記述範囲内で任意の濃度の酢酸
アンモニウムである。これらの条件を使用すると、前記ＡＡＶベクター粒子は初期の分画
中に溶出し、空の粒子は後期に溶出する。
上記で説明したように、本発明の別の方法では、前記第１陽イオン交換カラムからの調
製物は、第２陽イオン交換カラムの代わりか、またはその追加のいずれかとして陰イオン
交換カラムに添加される。陰イオン交換カラムが、前記第２陽イオン交換カラムに加えて
使用される場合には、第２陽イオン交換カラムの以前または以後のどちらかで使用出来る
。また、第２陰イオン交換カラムは、前記陰イオン交換カラムの以後に使用出来る。本発
明での使用に適した陰イオン交換体は多く知られており、以下を含むがこれらに限定され
ない：ＭＡＣＲＯ ＰＲＥＰ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州 Ｈｅｒｃｕｌｅｓ
から入手出来る強陰イオン交換体）、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォ
ルニア州 Ｈｅｒｃｕｌｅｓから入手出来る強陰イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ５０ＨＱ（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙか
ら入手出来る強陰イオン交換体）； ＰＯＲＯＳ５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，カリフォルニア州 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙから入手出来る弱陰イオン交換体
）ＰＯＲＯＳ５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州 Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙから入手出来る弱陰イオン交換体０、ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入
手出来る強陰イオン交換体）；ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入手出来る弱陰イオン
交換体）、及びＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュ
ージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入手出来る強陰イオン交換体）。
製物は、第２陽イオン交換カラムの代わりか、またはその追加のいずれかとして陰イオン
交換カラムに添加される。陰イオン交換カラムが、前記第２陽イオン交換カラムに加えて
使用される場合には、第２陽イオン交換カラムの以前または以後のどちらかで使用出来る
。また、第２陰イオン交換カラムは、前記陰イオン交換カラムの以後に使用出来る。本発
明での使用に適した陰イオン交換体は多く知られており、以下を含むがこれらに限定され
ない：ＭＡＣＲＯ ＰＲＥＰ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州 Ｈｅｒｃｕｌｅｓ
から入手出来る強陰イオン交換体）、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォ
ルニア州 Ｈｅｒｃｕｌｅｓから入手出来る強陰イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ５０ＨＱ（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙか
ら入手出来る強陰イオン交換体）； ＰＯＲＯＳ５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，カリフォルニア州 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙから入手出来る弱陰イオン交換体
）ＰＯＲＯＳ５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州 Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙから入手出来る弱陰イオン交換体０、ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入
手出来る強陰イオン交換体）；ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入手出来る弱陰イオン
交換体）、及びＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュ
ージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙから入手出来る強陰イオン交換体）。
当該陰イオン交換カラムは、先ず、標準緩衝液を使用して、製造元の仕様に従って、平
衡化される。例えば、前記カラムは、例えば、５～５０ｍＭ、好ましくは７～２０ｍＭ、
例として１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化出来る。次いで試料を添加し、１つ
の低塩緩衝液と１つの高塩緩衝液の２種の溶出緩衝液を使用する。それぞれ低塩及び高塩
洗浄に続いて画分を収集し、タンパク質は、当該画分中に、２６０ｎｍと２８０ｎｍでの
ＵＶ吸収をモニターするなどの標準技術を用いて、検出する。陰イオン交換体を使用する
と、低塩溶出液からのタンパク質のピークは、ＡＡＶの空カプシドを含み、高塩画分は、
ＡＡＶベクター粒子を含む。
衡化される。例えば、前記カラムは、例えば、５～５０ｍＭ、好ましくは７～２０ｍＭ、
例として１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化出来る。次いで試料を添加し、１つ
の低塩緩衝液と１つの高塩緩衝液の２種の溶出緩衝液を使用する。それぞれ低塩及び高塩
洗浄に続いて画分を収集し、タンパク質は、当該画分中に、２６０ｎｍと２８０ｎｍでの
ＵＶ吸収をモニターするなどの標準技術を用いて、検出する。陰イオン交換体を使用する
と、低塩溶出液からのタンパク質のピークは、ＡＡＶの空カプシドを含み、高塩画分は、
ＡＡＶベクター粒子を含む。
具体的には、該陰イオン交換カラム上で、ＡＡＶ粒子は、適切な緩衝液を用いて，ｐＨ
約５～ｐＨ１２、好ましくはｐＨ６～ｐＨ１０，さらに好ましくは、ｐＨ７～ｐＨ９．５
例えば、７．１、７．２、７．３、７．４～８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、
８．５～９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、或いは前記した範囲の間の
任意のｐＨで、さらに精製することが出来る。前記陰イオン交換カラムでの使用に適切な
緩衝液は、当技術分野において周知であり、一般に陽イオン性又は両性イオン性である。
係る緩衝液は、以下の緩衝液イオンを含むが限定されない：Ｎ－メチルピペラジン；ピペ
ラジン；ビス－トリス；ビス－トリスプロパン；トリエタノールアミン；トリス；Ｎ－メ
チルジエタノールアミン；１，３－ジアミノプロパン；エタノールアミン；酢酸など。試
料を溶出するためには、開始緩衝液のイオン強度を、適切なｐＨにおいて、ＮａＣｌ、Ｋ
ＣＬ，硫酸塩、蟻酸塩又は酢酸塩のような塩を使用して高める。
約５～ｐＨ１２、好ましくはｐＨ６～ｐＨ１０，さらに好ましくは、ｐＨ７～ｐＨ９．５
例えば、７．１、７．２、７．３、７．４～８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、
８．５～９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、或いは前記した範囲の間の
任意のｐＨで、さらに精製することが出来る。前記陰イオン交換カラムでの使用に適切な
緩衝液は、当技術分野において周知であり、一般に陽イオン性又は両性イオン性である。
係る緩衝液は、以下の緩衝液イオンを含むが限定されない：Ｎ－メチルピペラジン；ピペ
ラジン；ビス－トリス；ビス－トリスプロパン；トリエタノールアミン；トリス；Ｎ－メ
チルジエタノールアミン；１，３－ジアミノプロパン；エタノールアミン；酢酸など。試
料を溶出するためには、開始緩衝液のイオン強度を、適切なｐＨにおいて、ＮａＣｌ、Ｋ
ＣＬ，硫酸塩、蟻酸塩又は酢酸塩のような塩を使用して高める。
本発明の一実施形態では、前記陰イオン交換カラムは、まず、低塩濃度、例えば１０～
１００ｍＭＮａＣｌであって、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０
、６５～１００ｍＭなど、またはこれらの範囲内で任意の濃度で処理される。初期処理後
、不純物を溶出するために、次いで当該カラムは、より高塩濃度、例えばより高いＮａＣ
ｌ濃度で、或いはより高いイオン強度の別の緩衝液で処理される。第２緩衝液として使用
する一例は、１００～３００ｍＭ、好ましくは、１２５～２００ｍＭ、例えば１２５、１
３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ、またはこれら記
述の範囲内で任意の濃度を有する酢酸ナトリウム緩衝液またはトリス－基剤緩衝液である
。さらなる不純物がカラムから溶出された後、前記ＡＡＶ粒子は、より高濃度の塩を使用
して回収出来る。該溶出緩衝液として使用するための一例は、１０ｍＭトリス緩衝液であ
って、１００～５００ｍＭの範囲、好ましくは１３０～３００ｍＭ、例えば１３０、１５
０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭ濃度またはこれらの
記述の範囲内で任意の濃度の酢酸ナトリウムである。
１００ｍＭＮａＣｌであって、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０
、６５～１００ｍＭなど、またはこれらの範囲内で任意の濃度で処理される。初期処理後
、不純物を溶出するために、次いで当該カラムは、より高塩濃度、例えばより高いＮａＣ
ｌ濃度で、或いはより高いイオン強度の別の緩衝液で処理される。第２緩衝液として使用
する一例は、１００～３００ｍＭ、好ましくは、１２５～２００ｍＭ、例えば１２５、１
３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ、またはこれら記
述の範囲内で任意の濃度を有する酢酸ナトリウム緩衝液またはトリス－基剤緩衝液である
。さらなる不純物がカラムから溶出された後、前記ＡＡＶ粒子は、より高濃度の塩を使用
して回収出来る。該溶出緩衝液として使用するための一例は、１０ｍＭトリス緩衝液であ
って、１００～５００ｍＭの範囲、好ましくは１３０～３００ｍＭ、例えば１３０、１５
０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭ濃度またはこれらの
記述の範囲内で任意の濃度の酢酸ナトリウムである。
陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の使用と、使用樹脂（すなわち、
強または弱イオン交換体）の性質と、塩濃度、使用緩衝液、およびｐＨの状態とは、ＡＡ
Ｖカプシド変異型（つまり、ＡＡＶカプシド血清型または偽型）によって異なる。既知の
ＡＡＶカプシド変異体は、すべて、サイズや形状のような特徴を共用するが、分子トポロ
ジーと表面電荷分布の細かい点で異なる。したがって、すべてのカプシド変異体は、イオ
ン交換クロマトグラフィーによる精製に適していると想定され、関連する方法は、クロマ
トグラフィー樹脂および緩衝液の選別実験を用いて系統的に決定することが出来るが、効
率的なＡＡＶ粒子の精製を達成するためには、各ＡＡＶカプシド変異体向けに異なった条
件が必要になる。係る条件は当業者にとって容易に明白である。
強または弱イオン交換体）の性質と、塩濃度、使用緩衝液、およびｐＨの状態とは、ＡＡ
Ｖカプシド変異型（つまり、ＡＡＶカプシド血清型または偽型）によって異なる。既知の
ＡＡＶカプシド変異体は、すべて、サイズや形状のような特徴を共用するが、分子トポロ
ジーと表面電荷分布の細かい点で異なる。したがって、すべてのカプシド変異体は、イオ
ン交換クロマトグラフィーによる精製に適していると想定され、関連する方法は、クロマ
トグラフィー樹脂および緩衝液の選別実験を用いて系統的に決定することが出来るが、効
率的なＡＡＶ粒子の精製を達成するためには、各ＡＡＶカプシド変異体向けに異なった条
件が必要になる。係る条件は当業者にとって容易に明白である。
カラムクロマトグラフィー工程は、効率的に共通の分子形状と類似した電荷分布とを共
有する分子種を、異なった分子形状及び電荷分布を有する他の種（例えば不純物）から離
れて精製するのに適している。産生細胞培養系で形成される組換えＡＡＶベクターの場合
には、粗生合成収集物について知られている特徴は、多種類のＡＡＶ粒子がその中に存在
していることである。これらの多様な粒子は、真正ＡＡＶベクター（すなわち、内部に目
的とするＤＮＡ断片を含むベクターカプシド）；空のカプシド（すなわち、内部に何も無
いベクターカプシド）；および他のベクター関連不純物（他の（目的としない）ＤＮＡ部
分を内部に有するベクターカプシド）を含む。これらの多様なＡＡＶ粒子（すなわち、真
正ベクターとベクター関連不純物）の他に、他のタイプの不純物（例えば、宿主細胞のタ
ンパク質、脂質および／または核酸および／または細胞培養培地成分）が多量存在する。
カラムクロマトグラフィーは、望ましくない不純物からＡＡＶ粒子を精製するのに特によ
く適している。勾配超遠心分離は、多量の物質を用いて実施するのが困難であるが、大抵
のＡＡＶ関連不純物を、目的とするＡＡＶベクターから、これら個々の粒子の密度の違い
に基づいて分離するのによく適している。勾配超遠心分離は、今日まで一般に拡張不能と
考えられ、したがって、これまで大規模な製造プロセスでの使用に適した製造プロセス工
程ではないとされてきた。勾配超遠心分離工程は、拡張不能であるというこの認識は、一
つには当該技術において、比較的少量の組換えＡＡＶを回収するのに、比較的大量の物質
を処理するという必要条件によるものである。しかし、すでに上記のように一つまたはそ
れ以上のカラムクロマトグラフィー工程によって精製されたＡＡＶ粒子は、例えば，１０
０ｋＤａ分子量カットオフに対応する公称孔径を有する中空糸膜を用いて接線流ろ過によ
り、効率的に高濃度に濃縮することが出来るので、精製ベクター粒子を含む溶液約４００
ｍｌを扱える標準的超遠心分離操作一回で大量のベクターを調製出来る。例えば、１０％
の真正ＡＡＶベクター（従って、空のカプシドのような９０％ベクター関連不純物）を含
む、クロマトグラフィーで精製したＡＡＶ粒子は、ｍＬ当たり１０１４粒子（ｍＬ当たり
１０１３ＡＡＶベクター粒子及び関連ベクター不純物ｍＬ当たり９×１０１３粒子を含有
）にまで濃縮することが出来るし、また、一回の超遠心分離操作で処理することができ、
例えば、バッチあたり約４００ｍｌは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ５０ Ｒｏｔｏｒを使用し
た結果、約４×１０１５の真正ＡＡＶベクター粒子（１０１３ｖｇ／ｍＬ×４００ｍＬ
＝ ４×１０１５ｖｇ）を生ずる。このＡＡＶベクター収率は多くの臨床応用に多くの投
与量を提供するのに十分であって、ＡＡＶベクター関連不純物の大部分からＡＡＶベクタ
ー粒子の効率的な分離を達成する。より高い投与量を必要とする臨床応用には、１０％の
真正ＡＡＶベクターを含む精製ＡＡＶ粒子は接線流ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏ
ｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）でｍＬ当たり１０１５粒子に濃縮することが出来る
し、次いで一回の超遠心分離操作で処理して、約４×１０１６ベクターゲノム（真正ＡＡ
Ｖベクター）にすることが出来る。さらにより多量の投与量を必要とする臨床応用には、
１０％の真正ＡＡＶベクターを含む精製ＡＡＶ粒子はＴＦＦでｍＬ当たり１０１６粒子に
濃縮することが出来るし、次いで一回の超遠心分離操作で処理して、約４×１０１７ベク
ターゲノム（真正ＡＡＶベクター）にすることが出来る。精製ＡＡＶ粒子をｍＬ当たり１
０１６粒子に濃縮することは実現可能である。これはミリリットル当たり約１００ミリグ
ラムの質量濃度であって、例えばモノクローナル抗体のような他の精製生体分子について
達成することが出来る濃度に対応する。係る高濃度は、凝集のような望ましくない安定性
の問題を回避するために調剤に適切な注意が必要である（Ｗｒｉｇｈｔら、２００５）。
カラムクロマトグラフィーによる、清澄宿主細胞溶解物からＡＡＶ粒子の精製と、接線流
ろ過のような既知の拡張可能な製造工程による精製ＡＡＶ粒子の濃縮（必要な場合）との
この新しい組み合わせは、等密度勾配超遠心分離と組み合わせれば、多量の高度に精製し
た 組換えＡＡＶベクターを提供する。勾配超遠心分離の使用は、より高度の柔軟性（例
えば、様々なＡＡＶ血清型由来のベクターへの適用）と純度（例えば、ベクター関連不純
物の効率的な除去）を提供するが、これらは対費用効果及びヒトへの臨床応用での長期的
効果に就いての重大な考慮事項である。効率的なカラムクロマトグラフィーと接線流ろ過
の組み合わせは、両方とも容易に拡張可能で、バイオ医薬品業界標準の製造工程であり、
続く密度勾配超遠心工程を拡張可能にする。これらの工程の新規な組み合わせは、上記の
ように実施すれば、適応性、拡張可能性があり、すべてのＡＡＶカプシド変異体に一般的
に適用可能な精製構築基盤（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を提供し、大幅に遺伝子導入効率を向上
し、ヒト被験者への遺伝子治療向けの投与後の宿主の免疫応答を制限する効力の可能性を
最小限にするために十分に高い純度（一般的な不純物及びベクター関連不純物が無いこと
）を決定的に提供する。
有する分子種を、異なった分子形状及び電荷分布を有する他の種（例えば不純物）から離
れて精製するのに適している。産生細胞培養系で形成される組換えＡＡＶベクターの場合
には、粗生合成収集物について知られている特徴は、多種類のＡＡＶ粒子がその中に存在
していることである。これらの多様な粒子は、真正ＡＡＶベクター（すなわち、内部に目
的とするＤＮＡ断片を含むベクターカプシド）；空のカプシド（すなわち、内部に何も無
いベクターカプシド）；および他のベクター関連不純物（他の（目的としない）ＤＮＡ部
分を内部に有するベクターカプシド）を含む。これらの多様なＡＡＶ粒子（すなわち、真
正ベクターとベクター関連不純物）の他に、他のタイプの不純物（例えば、宿主細胞のタ
ンパク質、脂質および／または核酸および／または細胞培養培地成分）が多量存在する。
カラムクロマトグラフィーは、望ましくない不純物からＡＡＶ粒子を精製するのに特によ
く適している。勾配超遠心分離は、多量の物質を用いて実施するのが困難であるが、大抵
のＡＡＶ関連不純物を、目的とするＡＡＶベクターから、これら個々の粒子の密度の違い
に基づいて分離するのによく適している。勾配超遠心分離は、今日まで一般に拡張不能と
考えられ、したがって、これまで大規模な製造プロセスでの使用に適した製造プロセス工
程ではないとされてきた。勾配超遠心分離工程は、拡張不能であるというこの認識は、一
つには当該技術において、比較的少量の組換えＡＡＶを回収するのに、比較的大量の物質
を処理するという必要条件によるものである。しかし、すでに上記のように一つまたはそ
れ以上のカラムクロマトグラフィー工程によって精製されたＡＡＶ粒子は、例えば，１０
０ｋＤａ分子量カットオフに対応する公称孔径を有する中空糸膜を用いて接線流ろ過によ
り、効率的に高濃度に濃縮することが出来るので、精製ベクター粒子を含む溶液約４００
ｍｌを扱える標準的超遠心分離操作一回で大量のベクターを調製出来る。例えば、１０％
の真正ＡＡＶベクター（従って、空のカプシドのような９０％ベクター関連不純物）を含
む、クロマトグラフィーで精製したＡＡＶ粒子は、ｍＬ当たり１０１４粒子（ｍＬ当たり
１０１３ＡＡＶベクター粒子及び関連ベクター不純物ｍＬ当たり９×１０１３粒子を含有
）にまで濃縮することが出来るし、また、一回の超遠心分離操作で処理することができ、
例えば、バッチあたり約４００ｍｌは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ５０ Ｒｏｔｏｒを使用し
た結果、約４×１０１５の真正ＡＡＶベクター粒子（１０１３ｖｇ／ｍＬ×４００ｍＬ
＝ ４×１０１５ｖｇ）を生ずる。このＡＡＶベクター収率は多くの臨床応用に多くの投
与量を提供するのに十分であって、ＡＡＶベクター関連不純物の大部分からＡＡＶベクタ
ー粒子の効率的な分離を達成する。より高い投与量を必要とする臨床応用には、１０％の
真正ＡＡＶベクターを含む精製ＡＡＶ粒子は接線流ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏ
ｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）でｍＬ当たり１０１５粒子に濃縮することが出来る
し、次いで一回の超遠心分離操作で処理して、約４×１０１６ベクターゲノム（真正ＡＡ
Ｖベクター）にすることが出来る。さらにより多量の投与量を必要とする臨床応用には、
１０％の真正ＡＡＶベクターを含む精製ＡＡＶ粒子はＴＦＦでｍＬ当たり１０１６粒子に
濃縮することが出来るし、次いで一回の超遠心分離操作で処理して、約４×１０１７ベク
ターゲノム（真正ＡＡＶベクター）にすることが出来る。精製ＡＡＶ粒子をｍＬ当たり１
０１６粒子に濃縮することは実現可能である。これはミリリットル当たり約１００ミリグ
ラムの質量濃度であって、例えばモノクローナル抗体のような他の精製生体分子について
達成することが出来る濃度に対応する。係る高濃度は、凝集のような望ましくない安定性
の問題を回避するために調剤に適切な注意が必要である（Ｗｒｉｇｈｔら、２００５）。
カラムクロマトグラフィーによる、清澄宿主細胞溶解物からＡＡＶ粒子の精製と、接線流
ろ過のような既知の拡張可能な製造工程による精製ＡＡＶ粒子の濃縮（必要な場合）との
この新しい組み合わせは、等密度勾配超遠心分離と組み合わせれば、多量の高度に精製し
た 組換えＡＡＶベクターを提供する。勾配超遠心分離の使用は、より高度の柔軟性（例
えば、様々なＡＡＶ血清型由来のベクターへの適用）と純度（例えば、ベクター関連不純
物の効率的な除去）を提供するが、これらは対費用効果及びヒトへの臨床応用での長期的
効果に就いての重大な考慮事項である。効率的なカラムクロマトグラフィーと接線流ろ過
の組み合わせは、両方とも容易に拡張可能で、バイオ医薬品業界標準の製造工程であり、
続く密度勾配超遠心工程を拡張可能にする。これらの工程の新規な組み合わせは、上記の
ように実施すれば、適応性、拡張可能性があり、すべてのＡＡＶカプシド変異体に一般的
に適用可能な精製構築基盤（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を提供し、大幅に遺伝子導入効率を向上
し、ヒト被験者への遺伝子治療向けの投与後の宿主の免疫応答を制限する効力の可能性を
最小限にするために十分に高い純度（一般的な不純物及びベクター関連不純物が無いこと
）を決定的に提供する。
空のカプシドとパッケージされたゲノムを有するＡＡＶベクター粒子とをアッセイする
方法は当該分野で知られている。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１
９９９）６：１３２２～１３３０；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒ．（２００３
）７：１２２～１２８参照。変性したカプシドをテストするためには、該方法は、処理し
たＡＡＶストックを、３種のカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲル、例えば、当該
緩衝液中に３～８％のトリス－酢酸を含有する勾配ゲルから成る、ＳＤＳ－ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供し、次いで、試料物質が分離するまで前記ゲルを操作し、前記ゲ
ルをナイロンまたはニトロセルロース、好ましくはナイロン膜にブロットすることを含む
。抗ＡＡＶカプシド抗体は、その後、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体
、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体を、変性カプシドタンパク質に結
合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９
２８１－９２９３）。次いで、二次抗体を用いるが、このものは一次抗体に結合し、一次
抗体との結合を検出するための手段を含んでいて、より好ましくは、それに共有結合で結
合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体であり、最も好ましくは、西洋ワサビ（ｈｏｒｓ
ｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼに共有結合で連結したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体であ
る。結合を検出する方法を使用して、半定量的に前記一次および二次抗体間の結合を求め
るが、好ましくは、放射性同位元素の放射能、電磁放射、或いは比色変化を検出可能な検
出法であり、最も好ましくは、化学発光検出キットである。
方法は当該分野で知られている。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１
９９９）６：１３２２～１３３０；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒ．（２００３
）７：１２２～１２８参照。変性したカプシドをテストするためには、該方法は、処理し
たＡＡＶストックを、３種のカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲル、例えば、当該
緩衝液中に３～８％のトリス－酢酸を含有する勾配ゲルから成る、ＳＤＳ－ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供し、次いで、試料物質が分離するまで前記ゲルを操作し、前記ゲ
ルをナイロンまたはニトロセルロース、好ましくはナイロン膜にブロットすることを含む
。抗ＡＡＶカプシド抗体は、その後、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体
、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体を、変性カプシドタンパク質に結
合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９
２８１－９２９３）。次いで、二次抗体を用いるが、このものは一次抗体に結合し、一次
抗体との結合を検出するための手段を含んでいて、より好ましくは、それに共有結合で結
合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体であり、最も好ましくは、西洋ワサビ（ｈｏｒｓ
ｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼに共有結合で連結したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体であ
る。結合を検出する方法を使用して、半定量的に前記一次および二次抗体間の結合を求め
るが、好ましくは、放射性同位元素の放射能、電磁放射、或いは比色変化を検出可能な検
出法であり、最も好ましくは、化学発光検出キットである。
感染力価をテストするには、その方法は、約１００，０００の宿主細胞、好ましくはヒ
ト由来のもの、最も好ましくは、ＨｅＬａ細胞を、組織培養処理した，プレートに、好ま
しくは２４ウェル組織培養処理したプレートに、播種することを含み、約２４時間インキ
ュベートし、その後、アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス－２血清型、および処
理したｒＡＡＶストックが前記宿主細胞に添加される。前記宿主細胞、アデノウイルス、
およびｒＡＡＶストックはすべて、２４時間インキュベートし、その後、該宿主細胞は、
好ましくは、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドとで固定し、ｒＡＡＶが発現した導
入遺伝子を検出する適切な薬剤で染色する；例えば、ｒＡＡＶ－ＬａｃＺでは、Ｘ－ｇａ
ｌを染色剤として想定している。他のレポーター遺伝子に対する他の薬剤は、当技術分野
で既知である。任意の導入遺伝子を含むベクターの感染力価を決定するためのより一般的
な方法も当該分野で知られている。例えば、次を参照：Ｚｈｅｎら，"Ａｎ Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖ
ｉｒｕｓ （ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆ
ｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔ
ｓ"Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． （２００４） １５：７０９－７１５。
ト由来のもの、最も好ましくは、ＨｅＬａ細胞を、組織培養処理した，プレートに、好ま
しくは２４ウェル組織培養処理したプレートに、播種することを含み、約２４時間インキ
ュベートし、その後、アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス－２血清型、および処
理したｒＡＡＶストックが前記宿主細胞に添加される。前記宿主細胞、アデノウイルス、
およびｒＡＡＶストックはすべて、２４時間インキュベートし、その後、該宿主細胞は、
好ましくは、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドとで固定し、ｒＡＡＶが発現した導
入遺伝子を検出する適切な薬剤で染色する；例えば、ｒＡＡＶ－ＬａｃＺでは、Ｘ－ｇａ
ｌを染色剤として想定している。他のレポーター遺伝子に対する他の薬剤は、当技術分野
で既知である。任意の導入遺伝子を含むベクターの感染力価を決定するためのより一般的
な方法も当該分野で知られている。例えば、次を参照：Ｚｈｅｎら，"Ａｎ Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖ
ｉｒｕｓ （ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆ
ｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔ
ｓ"Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． （２００４） １５：７０９－７１５。
ウイルスベースのベクターは、非ウイルス性の方法に比して、標的細胞へ高度の遺伝子
送達効率をもたらすので、治療的遺伝子導入に大きな利点を提供する。しかし、ウイルス
ベースのベクター使用時の特有のリスクは、免疫毒性の可能性である。すべてのウイルス
抗原は、異なるタイプと種々の重症度の免疫応答を引き起こすことが知られている。例え
ば、これらに接触するヒトでは、係る抗原とこれらの抗原随伴細胞は、抗体および細胞傷
害性Ｔリンパ球のような免疫エフェクター機能の対象になる。既知のウイルスの中では、
ＡＡＶは、免疫原性が最も少ないものの一つであって、高度の免疫毒性の可能性が最低で
あるので、遺伝子導入ベクターの投与に関聯して認められている利点を提供する。しかし
、ＡＡＶカプシドタンパク質は、猶望ましくない免疫応答を引き起こし得るウイルス抗原
の発生源であることを意味する。ＡＡＶベクターを受領するヒト被験体中のＡＡＶカプシ
ド蛋白質によって引き起こされる免疫毒性の重症度は、投与ＡＡＶカプシドタンパク質の
量に比例すると仮定するのが妥当である。したがって、ＡＡＶカプシドのより高い投与量
は、高度の免疫毒性のリスクが高いと相関出来る。ヒト被験者投与用の係るベクターの最
も安全な使用を確保するためには、ベクターゲノムの有効な投与量に関連するＡＡＶカプ
シドタンパク質の量を最小限にすべきである。通常の細胞培養ベクターの産生物中に生成
するＡＡＶ粒子の通常５０～９０％を占め、９０％以上を占め得る、ベクター関連不純物
、特にＡＡＶ空のカプシドを効率的に削除する、ＡＡＶベクター精製法は、ヒト投与受領
者の免疫毒性のリスクを大幅に減少させる。ベクター関連不純物を実質的に含まない組換
えＡＡＶベクター（すなわち、実質的に空のカプシドを含まないベクター）を２×１０１
２ｖｇ／ｋｇ（総体重）投与（肝投与）されたヒト受領者は、ベクター投与後約３週間で
開始した肝酵素上昇で示すように、明らかな、わずかの、自己限定的な免疫毒性を経験し
たことが報告されている（Ｍａｎｎｏら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）
。評価は、この軽度で一過性免疫毒性の性状は、ＡＡＶカプシド由来のペプチドを発現す
る肝細胞を除去した、ＡＡＶカプシド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導であ
ったことを支持した（Ｍａｎｎｏら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）。若
し同じベクターゲノム投与量（２×１０１２ｖｇ／ｋｇ）の組換えＡＡＶを、実質的にベ
クター関連不純物（例えば、ベクター調製物中のＡＡＶ粒子の約８０％が空のカプシドで
あった）を除去しなかった方法を用いて調製した場合、係る調製物は、著しく高い肝酵素
が示すように、遙かに深刻な免疫毒性と関係付け得るであろう。
送達効率をもたらすので、治療的遺伝子導入に大きな利点を提供する。しかし、ウイルス
ベースのベクター使用時の特有のリスクは、免疫毒性の可能性である。すべてのウイルス
抗原は、異なるタイプと種々の重症度の免疫応答を引き起こすことが知られている。例え
ば、これらに接触するヒトでは、係る抗原とこれらの抗原随伴細胞は、抗体および細胞傷
害性Ｔリンパ球のような免疫エフェクター機能の対象になる。既知のウイルスの中では、
ＡＡＶは、免疫原性が最も少ないものの一つであって、高度の免疫毒性の可能性が最低で
あるので、遺伝子導入ベクターの投与に関聯して認められている利点を提供する。しかし
、ＡＡＶカプシドタンパク質は、猶望ましくない免疫応答を引き起こし得るウイルス抗原
の発生源であることを意味する。ＡＡＶベクターを受領するヒト被験体中のＡＡＶカプシ
ド蛋白質によって引き起こされる免疫毒性の重症度は、投与ＡＡＶカプシドタンパク質の
量に比例すると仮定するのが妥当である。したがって、ＡＡＶカプシドのより高い投与量
は、高度の免疫毒性のリスクが高いと相関出来る。ヒト被験者投与用の係るベクターの最
も安全な使用を確保するためには、ベクターゲノムの有効な投与量に関連するＡＡＶカプ
シドタンパク質の量を最小限にすべきである。通常の細胞培養ベクターの産生物中に生成
するＡＡＶ粒子の通常５０～９０％を占め、９０％以上を占め得る、ベクター関連不純物
、特にＡＡＶ空のカプシドを効率的に削除する、ＡＡＶベクター精製法は、ヒト投与受領
者の免疫毒性のリスクを大幅に減少させる。ベクター関連不純物を実質的に含まない組換
えＡＡＶベクター（すなわち、実質的に空のカプシドを含まないベクター）を２×１０１
２ｖｇ／ｋｇ（総体重）投与（肝投与）されたヒト受領者は、ベクター投与後約３週間で
開始した肝酵素上昇で示すように、明らかな、わずかの、自己限定的な免疫毒性を経験し
たことが報告されている（Ｍａｎｎｏら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）
。評価は、この軽度で一過性免疫毒性の性状は、ＡＡＶカプシド由来のペプチドを発現す
る肝細胞を除去した、ＡＡＶカプシド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導であ
ったことを支持した（Ｍａｎｎｏら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）。若
し同じベクターゲノム投与量（２×１０１２ｖｇ／ｋｇ）の組換えＡＡＶを、実質的にベ
クター関連不純物（例えば、ベクター調製物中のＡＡＶ粒子の約８０％が空のカプシドで
あった）を除去しなかった方法を用いて調製した場合、係る調製物は、著しく高い肝酵素
が示すように、遙かに深刻な免疫毒性と関係付け得るであろう。
本明細書に記載の前記精製方法は、拡張可能な方法でベクター関連不純物（例えば、空
のカプシドなど）の効率的な除去によって安全面の向上した特性を有するベクターを提供
する、即ち費用対効果の高い方法でＡＡＶベクターの大量の調製が今可能である。
のカプシドなど）の効率的な除去によって安全面の向上した特性を有するベクターを提供
する、即ち費用対効果の高い方法でＡＡＶベクターの大量の調製が今可能である。
以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態を説明するために提供される。実施例はど
のような方法でも本発明を限定するものではない。
のような方法でも本発明を限定するものではない。
このプロセスは、６種の一般的で臨床的に有望なＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、
ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９）のＡＡＶベクター用に拡大された。この精
製プロセスは、すべてではないが、大抵のＡＡＶ血清型とカプシド変異体に基づくベクタ
ーの精製に適用可能と思われる。各血清型またはカプシド変異体について、カラムクロマ
トグラフィーの詳細内容は異なる（すなわちクロマトグラフィー樹脂の個々の特性（ｉｄ
ｅｎｔｉｔｙ）および特定ＡＡＶ粒子精製条件）。以下の表は、ＡＡＶ血清型に対応する
ＡＡＶ粒子の精製を成功裏に達成させるのに使用された樹脂を提供する。
ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９）のＡＡＶベクター用に拡大された。この精
製プロセスは、すべてではないが、大抵のＡＡＶ血清型とカプシド変異体に基づくベクタ
ーの精製に適用可能と思われる。各血清型またはカプシド変異体について、カラムクロマ
トグラフィーの詳細内容は異なる（すなわちクロマトグラフィー樹脂の個々の特性（ｉｄ
ｅｎｔｉｔｙ）および特定ＡＡＶ粒子精製条件）。以下の表は、ＡＡＶ血清型に対応する
ＡＡＶ粒子の精製を成功裏に達成させるのに使用された樹脂を提供する。
効率的なＡＡＶ粒子の捕獲と、大抵の非ベクター不純物の除去と（即ち、ＡＡＶ粒子が
樹脂に結合したままである条件下で不純物を洗い流すこと）、次いでＡＡＶ粒子の溶出と
を、達成するための条件は、確実に定義することが出来る。該クロマトグラフィー工程か
ら回収後、精製ＡＡＶ粒子（すなわち、真正ＡＡＶベクター、空のカプシド、および他の
ベクター関連不純物）は、イオン強度を高くした緩衝液（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，
（２００５） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）、或いは粒子の凝集を防止する必要に応じて他
の緩衝液の条件を使用して、接線流濾過により、通常ミリリットル当たり１×１０１２～
１×１０１６ＡＡＶ粒子の範囲の濃度（ミリリットルあたりほぼ０．１～１００ミリグラ
ムに相当応する）になるように濃縮することが出来る。次に、実験室規模の塩化セシウム
勾配超遠心工程を、例えば、それぞれ約４０ｍＬ含有する遠心管１２本を含むＴ１５０
Ｒｏｔｏｒを使用して、実施する。この工程は、真正ＡＡＶベクターを効果的に大抵のベ
クター関連及びその他の非ベクター関連残留不純物から分離する。このプロセスの工程の
組み合わせと順序では、以下の重要な主要部の順序：１）カラムクロマトグラフィー；２
）接線流ろ過による濃縮（ベクター含有カラム溶出液の量を減らすために、必要に応じて
使用）；及び３）勾配超遠心分離を含んでいて、ベクターの拡張可能、効率的で、直交性
（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）精製が達成される。この順序で構成されて、１×１０１５を超
える高度に精製されたＡＡＶベクターが、実験室規模の超遠心分離操作一回で、通常的に
ベクター関連不純物から分離される。
樹脂に結合したままである条件下で不純物を洗い流すこと）、次いでＡＡＶ粒子の溶出と
を、達成するための条件は、確実に定義することが出来る。該クロマトグラフィー工程か
ら回収後、精製ＡＡＶ粒子（すなわち、真正ＡＡＶベクター、空のカプシド、および他の
ベクター関連不純物）は、イオン強度を高くした緩衝液（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，
（２００５） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）、或いは粒子の凝集を防止する必要に応じて他
の緩衝液の条件を使用して、接線流濾過により、通常ミリリットル当たり１×１０１２～
１×１０１６ＡＡＶ粒子の範囲の濃度（ミリリットルあたりほぼ０．１～１００ミリグラ
ムに相当応する）になるように濃縮することが出来る。次に、実験室規模の塩化セシウム
勾配超遠心工程を、例えば、それぞれ約４０ｍＬ含有する遠心管１２本を含むＴ１５０
Ｒｏｔｏｒを使用して、実施する。この工程は、真正ＡＡＶベクターを効果的に大抵のベ
クター関連及びその他の非ベクター関連残留不純物から分離する。このプロセスの工程の
組み合わせと順序では、以下の重要な主要部の順序：１）カラムクロマトグラフィー；２
）接線流ろ過による濃縮（ベクター含有カラム溶出液の量を減らすために、必要に応じて
使用）；及び３）勾配超遠心分離を含んでいて、ベクターの拡張可能、効率的で、直交性
（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）精製が達成される。この順序で構成されて、１×１０１５を超
える高度に精製されたＡＡＶベクターが、実験室規模の超遠心分離操作一回で、通常的に
ベクター関連不純物から分離される。
真正ＡＡＶベクターと大部分のベクター関連不純物との密度差と併せて、塩化セシウム
での合理的なタンパク質濃度の負荷に基づいて、我々は、４×１０１６ＡＡＶベクターを
効率的に、実験室規模の超遠心分離操作一回でベクター関連不純物から分離することがで
き、また大規模な遠心分離装置を使用すれば操作一回当たり少なくとも１０倍量分離され
ることを予測する。本明細書中で使用する場合、語句「真正ＡＡＶベクター」は、標的細
胞を感染させることが出来る、目的とする導入遺伝子を含むベクターを指す。この語句は
、空のベクターおよび完全な挿入を欠くベクター、或いは宿主細胞の核酸を含むベクター
を除外する。したがって、遠心分離工程は、拡張可能であって、ヒトの病気を治療するた
めの多くの予測可能なＡＡＶベクター製品の商業規模の製造に限定はない。実験室規模の
超遠心分離（すなわち、カラムで精製したＡＡＶ粒子約４００ｍＬ）及びカラムで精製し
たＡＡＶ粒子を接線流ろ過によって、ミリリットル当たり１×１０１５個のＡＡＶ粒子（
ミリリットルあたり１×１０１４真正ＡＡＶベクターを含有）の濃度に濃縮することを仮
定すると、以下の投与数量が調製出来るはずである：１）眼に投与して失明を治療するた
めの導入遺伝子を発現する１×１０１１ＡＡＶベクターの投与量を仮定すると、１回の勾
配操作で最大４００、０００投与量生成出来る；２）パーキンソン病のために中枢神経系
（ＣＮＳ）に投与する導入遺伝子を発現する、１×１０１２ＡＡＶベクターの投与量を仮
定すると、１回の勾配操作で最大４０，０００投与量生成出来る；３）血友病のために肝
臓に投与する導入遺伝子を発現する、１×１０１４ＡＡＶベクターの投与量を仮定すると
、１回の勾配操作で最大４００投与量生成出来る。我々は、前記勾配超遠心分離工程前に
、ＡＡＶ粒子をさらに１０倍（ｍＬ当たり１０１６ＡＡＶ粒子に到達－約１００ｍｇ／ｍ
Ｌに相当するが、これは、モノクローナル抗体などの他の生体分子では日常的に達成して
いる生物学物質の濃度に対応する）濃縮出来るはずであって、またこの高いが合理的に達
成可能な濃度は、各標準超遠心操作（バッチあたり約４００ｍｌの処理することが出来る
）からの真正ベクターを１０倍高い収率で生じ、即ち、４×１０１７ベクターゲノムまで
到達するであろうと予測している。さらに、より大規模な超遠心分離機は、合理的に少な
くとも１０倍高い濃縮ＡＡＶ粒子をプロセスし、少なくとも４×１０１８ベクターのゲノ
ム（すなわち４×１０１８の高度に精製した真正ＡＡＶベクター）を生ずると想定され、
後者は血友病Ｂのヒト被験者当たり１×１０１４ベクターの４０，０００投与量に相当す
る。これらの計算は、前記塩化セシウム超遠心工程を本明細書に記載の新規精製構築基盤
（ｐｌａｔｆｏｒｍ）で実施した場合、ＡＡＶベクターの製造に予想されるすべての要件
を満たせるよう直ちに拡張出来ることを示している。少なくとも現在既存のバイオプロセ
ス産業の、勾配超遠心はその拡張が可能ではないという考え方によれば、予期しないこと
であるが、当該新規バイオプロセスの工程（および重要なことは、諸工程実行の順序）は
、勾配超遠心工程がＡＡＶベクターの精製における律速工程ではないことを示している。
での合理的なタンパク質濃度の負荷に基づいて、我々は、４×１０１６ＡＡＶベクターを
効率的に、実験室規模の超遠心分離操作一回でベクター関連不純物から分離することがで
き、また大規模な遠心分離装置を使用すれば操作一回当たり少なくとも１０倍量分離され
ることを予測する。本明細書中で使用する場合、語句「真正ＡＡＶベクター」は、標的細
胞を感染させることが出来る、目的とする導入遺伝子を含むベクターを指す。この語句は
、空のベクターおよび完全な挿入を欠くベクター、或いは宿主細胞の核酸を含むベクター
を除外する。したがって、遠心分離工程は、拡張可能であって、ヒトの病気を治療するた
めの多くの予測可能なＡＡＶベクター製品の商業規模の製造に限定はない。実験室規模の
超遠心分離（すなわち、カラムで精製したＡＡＶ粒子約４００ｍＬ）及びカラムで精製し
たＡＡＶ粒子を接線流ろ過によって、ミリリットル当たり１×１０１５個のＡＡＶ粒子（
ミリリットルあたり１×１０１４真正ＡＡＶベクターを含有）の濃度に濃縮することを仮
定すると、以下の投与数量が調製出来るはずである：１）眼に投与して失明を治療するた
めの導入遺伝子を発現する１×１０１１ＡＡＶベクターの投与量を仮定すると、１回の勾
配操作で最大４００、０００投与量生成出来る；２）パーキンソン病のために中枢神経系
（ＣＮＳ）に投与する導入遺伝子を発現する、１×１０１２ＡＡＶベクターの投与量を仮
定すると、１回の勾配操作で最大４０，０００投与量生成出来る；３）血友病のために肝
臓に投与する導入遺伝子を発現する、１×１０１４ＡＡＶベクターの投与量を仮定すると
、１回の勾配操作で最大４００投与量生成出来る。我々は、前記勾配超遠心分離工程前に
、ＡＡＶ粒子をさらに１０倍（ｍＬ当たり１０１６ＡＡＶ粒子に到達－約１００ｍｇ／ｍ
Ｌに相当するが、これは、モノクローナル抗体などの他の生体分子では日常的に達成して
いる生物学物質の濃度に対応する）濃縮出来るはずであって、またこの高いが合理的に達
成可能な濃度は、各標準超遠心操作（バッチあたり約４００ｍｌの処理することが出来る
）からの真正ベクターを１０倍高い収率で生じ、即ち、４×１０１７ベクターゲノムまで
到達するであろうと予測している。さらに、より大規模な超遠心分離機は、合理的に少な
くとも１０倍高い濃縮ＡＡＶ粒子をプロセスし、少なくとも４×１０１８ベクターのゲノ
ム（すなわち４×１０１８の高度に精製した真正ＡＡＶベクター）を生ずると想定され、
後者は血友病Ｂのヒト被験者当たり１×１０１４ベクターの４０，０００投与量に相当す
る。これらの計算は、前記塩化セシウム超遠心工程を本明細書に記載の新規精製構築基盤
（ｐｌａｔｆｏｒｍ）で実施した場合、ＡＡＶベクターの製造に予想されるすべての要件
を満たせるよう直ちに拡張出来ることを示している。少なくとも現在既存のバイオプロセ
ス産業の、勾配超遠心はその拡張が可能ではないという考え方によれば、予期しないこと
であるが、当該新規バイオプロセスの工程（および重要なことは、諸工程実行の順序）は
、勾配超遠心工程がＡＡＶベクターの精製における律速工程ではないことを示している。
我々の精製工程の一つの利点は、現在使用中の「業界標準」の拡張可能なＡＡＶベクタ
ーの精製プロセスに比べて、効率的に製品関連の不純物を除去するように設計した工程を
包含することによってより高純度を達成する能力である。図１及び図２参照。ＡＡＶカプ
シド特異的な免疫応答の臨床的意義は、Ｍａｎｎｏらによる研究で示されており（２００
６：Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ）、又，多量の不要な過剰のカプシド抗原（例えばＡＡＶ空の
カプシド）および潜在的に免疫賦活性ＡＡＶカプシド形成核酸、すなわちベクター関連不
純物の存在が科学文献に記載されている：（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍ
ｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ（ａｂｓｔｒａｃｔ）； Ｃｈａｄｅｕｆら （２００５）Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（２００５）
Ｒｅｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣＨＭＰ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｅｘｐｅｒ
ｔ Ｇｒｏｕｐ Ｍｅｅｔｉｎｇ； Ｈａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒａｐｙ）。翻訳研究と臨床製品開発のための大規模で、組換えＡＡＶを生成、精
製する他のグループからのデータは，図３（Ｈａｕｃｋら、（２００９） ＭｏｌＴｈｅ
ｒａｐｙから）に提供されている。
ーの精製プロセスに比べて、効率的に製品関連の不純物を除去するように設計した工程を
包含することによってより高純度を達成する能力である。図１及び図２参照。ＡＡＶカプ
シド特異的な免疫応答の臨床的意義は、Ｍａｎｎｏらによる研究で示されており（２００
６：Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ）、又，多量の不要な過剰のカプシド抗原（例えばＡＡＶ空の
カプシド）および潜在的に免疫賦活性ＡＡＶカプシド形成核酸、すなわちベクター関連不
純物の存在が科学文献に記載されている：（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍ
ｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ（ａｂｓｔｒａｃｔ）； Ｃｈａｄｅｕｆら （２００５）Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（２００５）
Ｒｅｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣＨＭＰ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｅｘｐｅｒ
ｔ Ｇｒｏｕｐ Ｍｅｅｔｉｎｇ； Ｈａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒａｐｙ）。翻訳研究と臨床製品開発のための大規模で、組換えＡＡＶを生成、精
製する他のグループからのデータは，図３（Ｈａｕｃｋら、（２００９） ＭｏｌＴｈｅ
ｒａｐｙから）に提供されている。
本方法を使用して精製したＡＡＶベクター（ＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５）は、患者に投与
され、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障（Ｌｅｂｅｒ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ａｍａｃｕｒｏｓ
ｉｓ）の臨床試験では長期的な有効性を示した（Ｍａｇｕｉｒｅ ら （２００８） Ｎ
Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）。特に、他のグループが使用した、ベクター関連不純物を除去
しない製造プロセスで精製した類似のＡＡＶ２－ＲＰＥ６５ベクターは、より高い投与量
で投与した場合でも、効果が有意により弱い証拠を示した （Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅら
（２００８） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、及び Ｈａｕｓｗｉｒｔｈら （２００８）
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）。
され、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障（Ｌｅｂｅｒ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ａｍａｃｕｒｏｓ
ｉｓ）の臨床試験では長期的な有効性を示した（Ｍａｇｕｉｒｅ ら （２００８） Ｎ
Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）。特に、他のグループが使用した、ベクター関連不純物を除去
しない製造プロセスで精製した類似のＡＡＶ２－ＲＰＥ６５ベクターは、より高い投与量
で投与した場合でも、効果が有意により弱い証拠を示した （Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅら
（２００８） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、及び Ｈａｕｓｗｉｒｔｈら （２００８）
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）。
以下の表１は、このデータの要約を提供する。
前記ＡＡＶ２ベクターである、ＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２は、翻訳開始部位で遺伝子
操作した修飾Ｋｏｚａｋ配列を有する１．６ｋｂヒトＲＰＥ６５ ｃＤＮＡ４－６を含有
する。当該ｃＤＮＡは、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御
下にある。ＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５（具体的にはＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２）は、本明
細書に報告したベクター精製方法を使用して、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで適切な現行の優良製造規則（ｃＧＭＰ）を使用して
製造した。特に、ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５は、ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入によって
生成した。収集した細胞と細胞培養上清は、１００ｋＤａ分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｗｅｉｇｈｔ）カットオフ中空繊維膜を用いる、接線流ろ過により濃縮した。濃縮された
収集物は、３回微流動化して細胞を溶解し、ＡＡＶ粒子を放出させた。細胞可溶化液を濾
過し、（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ０．２ミクロン・フィルターカートリッジを使用して）、
当該清澄細胞可溶化液をＰｏｒｏｓ５０ＨＳＳ樹脂を用いた陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーにかけた。詳細には、該清澄細胞溶解液は、約２００ｍＭＮａＣｌの塩濃度の
中性緩衝食塩水で樹脂に添加し、５ｍＭ ｓａｒｃｏｓｙｌ（界面活性剤）を含む中性緩
衝食塩水を用い、１００ｍＭＮａＣｌの塩濃度で洗浄し（即ち、該樹脂を、結合したＡＡ
Ｖ粒子ではなくて、不純物を除去する溶液に接触させ）、さらに中性緩衝化生理食塩で洗
浄し、残留ｓａｒｃｏｓｙｌを除去し、１００単位／ｍＬ濃度のヌクレアーゼ（Ｂｅｎｏ
ｚｏｎａｓｅ）を含む中性緩衝塩溶液中でインキュベートし、消化して、核酸不純物を除
去し、さらに中性緩衝食塩水で洗浄して残留ヌクレアーゼを除去した。最後に、約４００
ｍＭＮａＣｌの塩濃度で中性緩衝生理食塩水を用いて、十分に高度のイオン強度を与え、
ＡＡＶ粒子の結合をクロマトグラフィー樹脂から破壊して、ＡＡＶ粒子を溶出した。陽イ
オン交換クロマトグラフィーカラムから溶出した前記精製ＡＡＶ粒子は、高純度塩化セシ
ウムで補充し、約１．３５グラム／ｍＬの密度に相当する最終濃度にし、０．２μ滅菌膜
を通してろ過し、次いで、実験室規模のＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇ
ｅで固定アングルローターを使用し，５０，０００ｒｐｍで等密度超遠心分離を行った。
遠心分離後、滅菌注射針及び注射器を使用してＡＡＶ２－ＲＰＥ６５に対応する可視バン
ドを各遠心管から回収した。ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５に対応する、収集したバンドは、合併
して１００ｋＤａ分子量カットオフ中空繊維を使用して接線流ろ過によって透析ろ過（ｄ
ｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）して、前記ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５ベクター含有溶液から塩化
セシウムを除去した。次いで、該ベクターを約１８０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナト
リウム、及び０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（また、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １
８８としても知られている）、ｐＨ７．３に調剤した。これらのベクターは、適切に希釈
し、ヒトＲＰＥ６５遺伝子の完全な形態を欠如しているヒト被験者（したがって、失明の
一形態であるＬｅｂｅｒ先天性黒内障に罹患）に投与した。これらのベクターを受けたヒ
ト被験者が得た利点は、Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００８，２００９）及びＳｉ
ｍｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．によって報告されている。別の二つのチームが同時にＡＡ
Ｖ２－ＲＰＥ６５（すなわちヒトＲＰＥ６５遺伝子を含む組換えＡＡＶ２ベクター）の臨
床試験を行い、それらの研究の結果が報告されている。これら別チームは、カラムクロマ
トグラフィーを利用したが、勾配超遠心工程を欠いた精製法によって自分達のＡＡＶ２－
ＲＰＥ６５ベクターを精製していた。Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）が
要約したように、本明細書に報告した方法（すなわち、カラムクロマトグラフィーと勾配
超遠心分離の両者を、該勾配超遠心分離を拡張可能にする方式で組み合わせた工程による
構築基盤（ｐｌａｔｆｏｒｍ）ＡＡＶベクター精製法）を用いて調製したＡＡＶ２－ＲＰ
Ｅ６５を低投与量（前記別２チームがヒトに投与した投与量よりも約４～７倍低い）でヒ
ト被験者に投与したが、それでも最良の結果をもたらした。特に、視力で最高の有意な改
善（３のうち３、表１を参照）は、Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）によって
認められた。対照的に、Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ（３のうち０）とＨａｕｓｗ
ｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ（３のうち０）は両者共に治療した被験者の中でいずれでも視力に
有意な改善を報告していなかた。他の因子がこれらの臨床試験で観察された違いに貢献し
ているかもしれないが、Ｍａｇｕｉｒｅらが報告した試験に使用したＡＡＶ２－ＲＰＥ６
５精製法は、観察された優れた効果の原因である重要な因子だったことは明らかである。
操作した修飾Ｋｏｚａｋ配列を有する１．６ｋｂヒトＲＰＥ６５ ｃＤＮＡ４－６を含有
する。当該ｃＤＮＡは、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御
下にある。ＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５（具体的にはＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２）は、本明
細書に報告したベクター精製方法を使用して、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで適切な現行の優良製造規則（ｃＧＭＰ）を使用して
製造した。特に、ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５は、ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入によって
生成した。収集した細胞と細胞培養上清は、１００ｋＤａ分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｗｅｉｇｈｔ）カットオフ中空繊維膜を用いる、接線流ろ過により濃縮した。濃縮された
収集物は、３回微流動化して細胞を溶解し、ＡＡＶ粒子を放出させた。細胞可溶化液を濾
過し、（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ０．２ミクロン・フィルターカートリッジを使用して）、
当該清澄細胞可溶化液をＰｏｒｏｓ５０ＨＳＳ樹脂を用いた陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーにかけた。詳細には、該清澄細胞溶解液は、約２００ｍＭＮａＣｌの塩濃度の
中性緩衝食塩水で樹脂に添加し、５ｍＭ ｓａｒｃｏｓｙｌ（界面活性剤）を含む中性緩
衝食塩水を用い、１００ｍＭＮａＣｌの塩濃度で洗浄し（即ち、該樹脂を、結合したＡＡ
Ｖ粒子ではなくて、不純物を除去する溶液に接触させ）、さらに中性緩衝化生理食塩で洗
浄し、残留ｓａｒｃｏｓｙｌを除去し、１００単位／ｍＬ濃度のヌクレアーゼ（Ｂｅｎｏ
ｚｏｎａｓｅ）を含む中性緩衝塩溶液中でインキュベートし、消化して、核酸不純物を除
去し、さらに中性緩衝食塩水で洗浄して残留ヌクレアーゼを除去した。最後に、約４００
ｍＭＮａＣｌの塩濃度で中性緩衝生理食塩水を用いて、十分に高度のイオン強度を与え、
ＡＡＶ粒子の結合をクロマトグラフィー樹脂から破壊して、ＡＡＶ粒子を溶出した。陽イ
オン交換クロマトグラフィーカラムから溶出した前記精製ＡＡＶ粒子は、高純度塩化セシ
ウムで補充し、約１．３５グラム／ｍＬの密度に相当する最終濃度にし、０．２μ滅菌膜
を通してろ過し、次いで、実験室規模のＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇ
ｅで固定アングルローターを使用し，５０，０００ｒｐｍで等密度超遠心分離を行った。
遠心分離後、滅菌注射針及び注射器を使用してＡＡＶ２－ＲＰＥ６５に対応する可視バン
ドを各遠心管から回収した。ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５に対応する、収集したバンドは、合併
して１００ｋＤａ分子量カットオフ中空繊維を使用して接線流ろ過によって透析ろ過（ｄ
ｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）して、前記ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５ベクター含有溶液から塩化
セシウムを除去した。次いで、該ベクターを約１８０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナト
リウム、及び０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（また、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １
８８としても知られている）、ｐＨ７．３に調剤した。これらのベクターは、適切に希釈
し、ヒトＲＰＥ６５遺伝子の完全な形態を欠如しているヒト被験者（したがって、失明の
一形態であるＬｅｂｅｒ先天性黒内障に罹患）に投与した。これらのベクターを受けたヒ
ト被験者が得た利点は、Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００８，２００９）及びＳｉ
ｍｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．によって報告されている。別の二つのチームが同時にＡＡ
Ｖ２－ＲＰＥ６５（すなわちヒトＲＰＥ６５遺伝子を含む組換えＡＡＶ２ベクター）の臨
床試験を行い、それらの研究の結果が報告されている。これら別チームは、カラムクロマ
トグラフィーを利用したが、勾配超遠心工程を欠いた精製法によって自分達のＡＡＶ２－
ＲＰＥ６５ベクターを精製していた。Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）が
要約したように、本明細書に報告した方法（すなわち、カラムクロマトグラフィーと勾配
超遠心分離の両者を、該勾配超遠心分離を拡張可能にする方式で組み合わせた工程による
構築基盤（ｐｌａｔｆｏｒｍ）ＡＡＶベクター精製法）を用いて調製したＡＡＶ２－ＲＰ
Ｅ６５を低投与量（前記別２チームがヒトに投与した投与量よりも約４～７倍低い）でヒ
ト被験者に投与したが、それでも最良の結果をもたらした。特に、視力で最高の有意な改
善（３のうち３、表１を参照）は、Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）によって
認められた。対照的に、Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ（３のうち０）とＨａｕｓｗ
ｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ（３のうち０）は両者共に治療した被験者の中でいずれでも視力に
有意な改善を報告していなかた。他の因子がこれらの臨床試験で観察された違いに貢献し
ているかもしれないが、Ｍａｇｕｉｒｅらが報告した試験に使用したＡＡＶ２－ＲＰＥ６
５精製法は、観察された優れた効果の原因である重要な因子だったことは明らかである。
本研究で用いたベクターは二つのメカニズムで標的細胞への送達を最適化するように修
正された。１）ベクターが注射器具に結び付くのを防ぐために、最終製剤に界面活性剤を
添加すること、これは、送達されるベクターが比較的低投与量であることから、重要な考
慮事項であり、２）ベクター関連不純物の除去は、標的細胞に取り込まれたベクター粒子
はすべて、ＲＰＥ６５発現をもたらす可能性を有することを保証する。空のカプシドの除
去工程無しで精製された標準的なベクター調製物は、一般的に８０％以上、空のカプシド
であるが、一方これらの研究で使用された調製物は、９５％以上完全カプシドである。
正された。１）ベクターが注射器具に結び付くのを防ぐために、最終製剤に界面活性剤を
添加すること、これは、送達されるベクターが比較的低投与量であることから、重要な考
慮事項であり、２）ベクター関連不純物の除去は、標的細胞に取り込まれたベクター粒子
はすべて、ＲＰＥ６５発現をもたらす可能性を有することを保証する。空のカプシドの除
去工程無しで精製された標準的なベクター調製物は、一般的に８０％以上、空のカプシド
であるが、一方これらの研究で使用された調製物は、９５％以上完全カプシドである。
上述したように、網膜下注射でＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２を受けたＬＣＡ２患者３人
は皆網膜機能の改善の証拠を示した。客観的な生理学的検査による瞳孔の光反射の改善は
、主観的な心理物理指標に改善した値を随伴していた。検査は６週間で視力の向上を示し
、その後より緩やかな速度での改善があった。眼振の減少は、我々が以前に犬の研究で報
告した該減少と同様に、患者２の左眼（未注射）の改善した視力の原因である可能性があ
る。注射を受けた目の改善は、検査－再検査のばらつきの限界を超えて、機能的に重要で
あると考えられる程度であった。
は皆網膜機能の改善の証拠を示した。客観的な生理学的検査による瞳孔の光反射の改善は
、主観的な心理物理指標に改善した値を随伴していた。検査は６週間で視力の向上を示し
、その後より緩やかな速度での改善があった。眼振の減少は、我々が以前に犬の研究で報
告した該減少と同様に、患者２の左眼（未注射）の改善した視力の原因である可能性があ
る。注射を受けた目の改善は、検査－再検査のばらつきの限界を超えて、機能的に重要で
あると考えられる程度であった。
ＡＡＶベクターへの接触によって誘発される明白な局所または全身の不利な事象は認めら
れなかった。網膜下注入２週間後患者の右眼で発現した黄斑円孔は、炎症や急性網膜毒性
の兆候は認められなかったので、ＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２投与に関連するとは思われ
なかった。それは手術自体の直接的な結果であった可能性があるが、我々は、黄斑円孔の
手術で刺激された既存の膜の収縮によって引き起こされたと仮定する。黄斑円孔の発現は
、我々の患者のそれに類似した中心視力の低下患者における網膜機能に影響を及ぼすこと
が予想されないのに対し、それが網膜変性の程度が低い患者の視力に重大な影響を与える
可能性がある。
れなかった。網膜下注入２週間後患者の右眼で発現した黄斑円孔は、炎症や急性網膜毒性
の兆候は認められなかったので、ＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２投与に関連するとは思われ
なかった。それは手術自体の直接的な結果であった可能性があるが、我々は、黄斑円孔の
手術で刺激された既存の膜の収縮によって引き起こされたと仮定する。黄斑円孔の発現は
、我々の患者のそれに類似した中心視力の低下患者における網膜機能に影響を及ぼすこと
が予想されないのに対し、それが網膜変性の程度が低い患者の視力に重大な影響を与える
可能性がある。
患者への臨床的利点は、患者１のＬＣＡ２の実験的な治療から６ヶ月間持続している。
投与する製剤から空のカプシドを除去する、本明細書に記載の前記改良精製プロセスは、
明らかに、この臨床的利点に貢献したのである。
投与する製剤から空のカプシドを除去する、本明細書に記載の前記改良精製プロセスは、
明らかに、この臨床的利点に貢献したのである。
本発明を詳細に、そして具体例を参照して説明してきたが、様々な変更および修飾が本
発明の精神範囲から逸脱することなくなし得ることは当業者に明らかであろう。
発明の精神範囲から逸脱することなくなし得ることは当業者に明らかであろう。
Claims (17)
- 高度に精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター製剤を製造するための製造方法であって、前記製造方法は、
（ａ）組換えＡＡＶベクター粒子を含む細胞及び細胞上清を採取する工程と、
（ｂ）工程（ａ）において採取した前記細胞及び細胞上清を接線流ろ過を用いて濃縮して濃縮採集物を作成する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）において作成した前記濃縮採集物を顕微溶液化によって前記細胞を溶解して溶解物を作成する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において作成した溶解物を濾過して浄化された溶解物を作成する工程と、
（ｅ）イオン交換カラムクロマトグラフィーによって工程（ｄ）において作成した浄化された溶解物を精製して、組換えＡＡＶベクター粒子を含むカラム溶出液を作成し、さらに、任意に、接線流ろ過によって前記カラム溶出液を濃縮して濃縮されたカラム溶出液を作成する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）において作成したカラム溶出液又は濃縮されたカラム溶出液と塩化セシウムとを混合して混合物を作成し、さらに、当該混合物を１回の密度勾配超遠心分離にかけて、空カプシドＡＡＶベクター粒子及び他のＡＡＶベクター関連不純物から真正（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）ＡＡＶベクター粒子を実質的に分離する工程と、
（ｇ）工程ｆ）に続いてウイルス粒子を回収し、さらに、接線流ろ過によって同一の緩衝液交換を受けさせる工程と、
（ｈ）界面活性剤と共に工程（ｇ）において作成した真正ＡＡＶベクター粒子を製剤化してＡＡＶベクター製剤を作成する工程と、
（ｉ）工程（ｈ）において作成したＡＡＶベクター製剤を濾過して、前記高度に精製されたＡＡＶベクター製剤中のＡＡＶベクター粒子の少なくとも９０％が真正ＡＡＶベクター粒子である、高度に精製されたＡＡＶベクター製剤を作成する工程と、
を有する製造方法。 - 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記真正ＡＡＶベクター粒子は、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、工程ｉ）の前記真正ＡＡＶベクター粒子は、１ｍＬあたり１０15粒子の濃度で存在する、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、工程ｉ）の前記真正ＡＡＶベクター粒子は１ｍＬあたり１０16粒子の濃度で存在する、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記真正ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶに由来する、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記真正ＡＡＶベクター粒子は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される核酸をコードする導入遺伝子を含む、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記真正ＡＡＶベクター粒子は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィンＮＴ－３およびＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞成長因子、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、およびチロシン水酸化酵素からなる群から選択される遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記真正ＡＡＶベクター粒子は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１からＩＬ－１７）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子産物をコードする導入遺伝子である、方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記真正ＡＡＶベクター粒子は、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチン・トランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、アルギニノコハク酸分解酵素、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニン水酸化酵素、アルファ－１ アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノゲン・デアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンβ合成酵素、側鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルＣｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）配列、ジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択された、代謝の先天的異常の修正に有用なタンパク質をコードする核酸を有する導入遺伝子を含む、製造方法。
- 請求項９記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記遺伝子産物は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子である、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、工程（ｆ）中に空のカプシド画分を回収する工程を含む、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記空のカプシドが、工程（ｉ）の濾過物中に１０重量％以下の量で存在する、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、
前記真正ＡＡＶベクター粒子が、工程（ｉ）の濾過物中に９５重量％以下の量で存在する、製造方法。 - 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、前記空のカプシドが、工程（ｉ）の濾過物中に５重量％以下の量で存在する、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、工程（ｅ）におけるカラム溶出液が、接線流ろ過によって前記カラム溶出液を濃縮されて、濃縮されたカラム溶出液を生成する、製造方法。
- 請求項１記載の高度に精製されたＡＡＶベクター製剤の製造方法において、工程（ｃ）において作成した溶解物にヌクレアーゼを加える工程をさらに含む、製造方法。
- 高度に精製されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター製剤を製造するための製造方法であって、前記製造方法は、
（ａ）組換えＡＡＶベクター粒子を含む細胞及び細胞上清を採取する工程と、
（ｂ）工程（ａ）において採取した前記細胞及び細胞上清を接線流ろ過を用いて濃縮して濃縮採集物を作成する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）において作成した前記濃縮採集物を顕微溶液化によって前記細胞を溶解して溶解物を作成する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において作成した溶解物を濾過して浄化された溶解物を作成する工程と、
（ｅ）イオン交換カラムクロマトグラフィーによって工程（ｄ）において作成した浄化された溶解物を精製して、組換えＡＡＶベクター粒子を含むカラム溶出液を作成し、さらに、任意に、接線流ろ過によって前記カラム溶出液を濃縮して濃縮されたカラム溶出液を作成する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）において作成したカラム溶出液又は濃縮されたカラム溶出液と塩化セシウムとを混合して混合物を作成する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）の混合物を１回の勾配超遠心分離にかけて、空カプシドＡＡＶベクター粒子及び他のＡＡＶベクター関連不純物から、真正（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）ＡＡＶベクター粒子を実質的に分離する工程と、
（ｈ）工程（ｇ）において分離された真正ＡＡＶベクター粒子を回収し、前記回収した真正ＡＡＶベクター粒子を接線流ろ過による緩衝液交換に供する工程と、
（ｉ）界面活性剤と共に、工程（ｈ）において作成した真正ＡＡＶベクター粒子を製剤化して、ＡＡＶベクター製剤を作成する工程と、
（ｊ）工程（ｉ）において作成したＡＡＶベクター製剤を濾過して、高度に精製されたＡＡＶベクター製剤を作成する工程であって、前記高度に精製されたＡＡＶベクター製剤中のＡＡＶベクター粒子の少なくとも９０％が真正ＡＡＶベクター粒子であり、かつ、前記真正ＡＡＶベクター粒子が、高度に精製されたＡＡＶベクター製剤中に１ｍＬあたり１０15粒子の濃度で存在する工程と、を有する方法。
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| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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| C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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| C13 | Notice of reasons for refusal |
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| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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| A521 | Request for written amendment filed |
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| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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| C23 | Notice of termination of proceedings |
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| C03 | Trial/appeal decision taken |
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| C30A | Notification sent |
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| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
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