JP6990176B2 - Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs - Google Patents

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Description

本出願は、２０１５年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２３７，４６２号、２０１６年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１７，２６８号、２０１６年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１７，２７１号、２０１６年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１７，３６６号、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８３８５号、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，３８６号、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，３８８号、および２０１６年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３５０，１４９号の利益を主張する。上記参照特許出願の全体の内容は、本明細書に参照による組み込まれる。 This application is filed on October 5, 2015, US provisional patent application No. 62 / 237,462, and on April 1, 2016, US provisional patent application No. 62 / 317,268, 2016. US provisional patent application No. 62 / 317,271 filed on April 1, 2016, US provisional patent application No. 62 / 317,366 filed on April 1, 2016, filed on May 18, 2016. US Provisional Patent Application No. 62/338385 filed, US Provisional Patent Application No. 62 / 338,386 filed on May 18, 2016, US Provisional Patent Application No. 62 filed on May 18, 2016. Claims the interests of / 338,388, and US Provisional Patent Application No. 62 / 350,149 filed June 14, 2016. The entire contents of the reference patent application are incorporated herein by reference.

組換え抗体、サイトカイン、および増殖因子などの生物学的薬剤は、多種多様な疾患の処置において有効であることが示されており、今や、ＦＤＡは、多数のこのような薬剤を、ヒトにおける使用のために承認している（総説については、Ｋｉｎｃｈ， Ｍ．Ｓ．（２０１５年）、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ、２０巻：３９３～３９８頁を参照されたい）。ＦＤＡにより承認された生物学的薬剤の圧倒的大部分は、タンパク質ベースの薬剤である。より近年になって、メッセンジャーＲＮＡベースの薬剤が、破壊的な治療モダリティーとして開発されている。感染性疾患ワクチンおよび腫瘍ワクチンの両方を含む、有効なｍＲＮＡベースのワクチンについては、いくつかの例が報告されている（それぞれの総説については、Ｍａｒｃ Ｍ．Ａ．ら（２０１５年）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｓｅｐ、１２巻：１～１５頁；およびＳａｈｉｎ， Ｕ．ら（２０１４年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１３巻：７５９～７８０頁を参照されたい）。より近年には、ｍＲＮＡベースの薬剤の使用が、例えば、目的の治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ構築物を使用する治療目的で追求されている。 Biological agents such as recombinant antibodies, cytokines, and growth factors have been shown to be effective in the treatment of a wide variety of diseases, and the FDA has now used a number of such agents in humans. (See Kinch, MS (2015), Drug Discov. Today, Vol. 20, pp. 393-398 for a review). The overwhelming majority of FDA-approved biological drugs are protein-based drugs. More recently, messenger RNA-based drugs have been developed as a destructive therapeutic modality. Several examples of effective mRNA-based vaccines, including both infectious disease vaccines and tumor vaccines, have been reported (for a review of each, Marc MA et al. (2015), Expert Opin. See Drug Dev. Sep, Vol. 12, pp. 1-15; and Sahin, U. et al. (2014), Nature Reviews Drug Discovery, Vol. 13, pp. 759-780). More recently, the use of mRNA-based agents has been pursued, for example, for therapeutic purposes using mRNA constructs encoding therapeutic proteins of interest.

Ｍａｒｃ Ｍ．Ａ．ら（２０１５年）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｓｅｐ、１２巻：１～１５頁Marc M. A. Et al. (2015), Expert Opin Drug Deliv. Sep, Volume 12, pp. 15-15 びＳａｈｉｎ， Ｕ．ら（２０１４年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１３巻：７５９～７８０頁And Sahin, U.S. Et al. (2014), Nature Reviews Drug Discovery, Vol. 13, pp. 759-780.

したがって、ｍＲＮＡベースの治療剤など、被験体におけるｍＲＮＡベースの薬剤の使用のための、新たな手法および方法、特に、被験体におけるｍＲＮＡベースの薬剤の安全性および／または治療効能に関して、有利な特性をもたらす方法が必要とされている。
本発明は、被験体へと投与されるｍＲＮＡベースの薬剤を伴う使用のための方法であって、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ｍＲＮＡベースの薬剤の使用に有利な特色をもたらす方法を提供する。今や、驚くべきことに、非ヒト霊長動物への、目的のタンパク質をコードする、ｍＲＮＡベースの薬剤の投与は、動物における、望ましくない免疫応答の発達をもたらしうるが、この場合、動物において、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質に対する抗体が検出されうることが発見されている。動物には、タンパク質治療薬ではなく、ｍＲＮＡ構築物を投与したので、これは、予測されない結果であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける標的組織内の、目的のタンパク質の局所的産生が、コードされるタンパク質生成物に対する応答をもたらすことも予測されなかった。非ヒト霊長動物において観察された応答はまた、他の関与性の動物モデル系においても研究されており、当技術分野で認知される抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答であって、組換えタンパク質治療薬の分野、および低分子治療薬の分野のいずれにおいてもなお見られるＡＤＡ応答に類似する。古典的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答は、例えば、それに対して方向づけられた抗体を発生させうる、組換えタンパク質治療薬の全身投与に対する応答であると一般に理解されている点で、当業者には、用語法の認識可能な区別は明らかである。ｍＲＮＡ治療薬の分野では、本明細書で記載される動物研究において観察される抗体応答は、ｍＲＮＡベースの薬物自体に対する応答ではない。逆に、抗体応答は、ｍＲＮＡ薬によりコードされるタンパク質生成物に対する応答である。当業者は、このような現象を、抗タンパク質抗体（ＡＰＡ）と称しうるが、薬理学的に類似する効果のために、本出願では、抗薬物抗体（ＡＤＡ）について当技術分野で認知されている用語法を活用する。 Therefore, advantageous properties with respect to new techniques and methods for the use of mRNA-based agents in subjects, such as mRNA-based therapeutic agents, in particular with respect to the safety and / or therapeutic efficacy of mRNA-based agents in subjects. There is a need for a way to bring about.
The present invention provides a method for use with an mRNA-based agent administered to a subject, which provides an advantageous feature for the use of the mRNA-based agent in vivo. Now, surprisingly, administration of an mRNA-based agent encoding a protein of interest to a non-human primate can result in the development of an undesired immune response in the animal, in which case the mRNA. It has been discovered that antibodies against the protein encoded by can be detected. This is an unpredictable result, as the animals were administered mRNA constructs rather than protein therapeutics, with respect to the protein product encoded by the local production of the protein of interest in the target tissue in vivo. It was also not expected to bring about a response. The response observed in non-human primates has also been studied in other involved animal model systems and is an anti-drug antibody (ADA) response recognized in the art and is a recombinant protein therapeutic agent. Similar to the ADA response still found in both the field of small molecule therapeutics and the field of small molecule therapeutics. A person skilled in the art will appreciate that a classical anti-drug antibody (ADA) response is, for example, a response to systemic administration of a recombinant protein therapeutic agent capable of producing an antibody directed against it. The recognizable distinction between terminology is clear. In the field of mRNA therapeutics, the antibody response observed in the animal studies described herein is not a response to the mRNA-based drug itself. Conversely, an antibody response is a response to a protein product encoded by an mRNA drug. Those skilled in the art may refer to such phenomena as anti-protein antibodies (APAs), but due to their pharmacologically similar effects, anti-drug antibodies (ADA) are recognized in the art in this application. Take advantage of existing terminology.

注目すべきことに、今や、ｍＲＮＡ構築物への、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位の組入れが、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＤＡ応答の劇的な阻害を結果としてもたらすこともまた、発見されている。したがって、本開示は、抗薬物抗体応答を低減または阻害するための方法であって、目的のタンパク質を、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードする方法を提示する。例示的な態様では、本開示は、抗薬物抗体応答を低減または阻害するための方法であって、目的のタンパク質を、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、例えば、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によりコードし、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位をさらに含む方法を提示する。本開示の方法では、被験体に、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、目的のポリペプチドをコードし、少なくとも１つの免疫細胞発現ｍｉＲに対する結合部位を含むｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを投与する。例示的な実施形態では、ｍｉＲ結合部位は、免疫細胞内（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞の免疫細胞内）で、夥多に、または優先的に発現するｍｉＲに対するものである。例示的な実施形態では、ｍｉＲ結合部位を、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）内（例えば、３’ＵＴＲ内、５’ＵＴＲ内、または３’ＵＴＲ内および５’ＵＴＲ内の両方）に組み入れる。こうして、本開示の方法では、抗薬物抗体応答を、目的のタンパク質のアミノ酸配列を変更する必要性を伴わずに、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の組入れによる翻訳の抑圧に由来する、可能な成分を伴うｍＲＮＡによる転写後調節を介して低減または阻害する。 Notably, now in conventional immune cells to mRNA constructs, or in any cell that expresses TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines (eg, peripheral). Incorporation of at least one microRNA (miR) binding site to miR expressed (in immune cells of lymphoid organs and / or splenocytes and / or endothelial cells) results in dramatic inhibition of ADA response in vivo. Bringing as is also discovered. Accordingly, the present disclosure is a method for reducing or inhibiting an anti-drug antibody response, wherein the protein of interest is expressed in conventional immune cells or in TLR7 and / or TLR8 and is an pro-inflammatory cytokine and /. Alternatively, at least one micro for miR expressed in any cell that secretes chemokine (eg, in spleen cells, eg, in immune cells of peripheral lymphoid organs such as spleen myeloid cells and / or endothelial cells). A method of encoding by a messenger RNA (mRNA) containing an RNA (miR) binding site is presented. In an exemplary embodiment, the disclosure is a method for reducing or inhibiting an antidrug antibody response, wherein the protein of interest is a messenger RNA (mRNA) containing one or more modified nucleobases, eg, a modified messenger. Encoded by RNA (mmRNA), the mRNA, eg, mmRNA, expresses TLR7 and / or TLR8 in conventional immune cells, or in any cell that secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines (eg,). , For example, a method comprising at least one microRNA (miR) binding site for miR expressed (in immune cells of peripheral lymphoid organs such as spleen myeloid cells and / or endothelial cells). do. In the methods of the present disclosure, a subject is encoded with the polypeptide of interest so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject and a binding site for at least one immune cell expression miR. Administer the mRNA containing, eg, m mRNA. In an exemplary embodiment, the miR binding site is for miR that is abundantly or preferentially expressed within immune cells (eg, within immune cells of peripheral lymphoid organs and / or splenocytes). In an exemplary embodiment, the miR binding site is located within the untranslated region (UTR) of the mRNA encoding the protein of interest, eg, within the untranslated region (UTR) (eg, within 3'UTR, or within 3'UTR, and within 3'UTR. Incorporate into both in 5'UTR). Thus, in the methods of the present disclosure, possible components of the anti-drug antibody response are derived from the suppression of translation by the incorporation of at least one miR binding site without the need to alter the amino acid sequence of the protein of interest. It is reduced or inhibited through post-transcriptional regulation by the accompanying mRNA.

一実施形態では、免疫細胞内で発現する少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。別の実施形態では、免疫細胞内で発現する少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位などのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。したがって、本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、例えば、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／または少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号２６に示される配列を含む。 In one embodiment, the at least one miR expressed in the immune cell is the miR-142-3p microRNA binding site. In another embodiment, at least one miR expressed in an immune cell is a miR-126 microRNA binding site, such as a miR-126-3p binding site. Accordingly, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response in a subject by providing the subject with a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest, eg, a modified messenger RNA (mRNA). The mRNA, eg, mRNA, comprises at least one miR-142-3p microRNA binding site and / or at least so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject, including the step of administration. We present a method comprising one miR-126 microRNA binding site, wherein the mRNA, eg, mRNA, comprises one or more modified nucleobases. In one embodiment, the miR-142-3p microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 3. In one embodiment, the miR-126 binding site is a miR-126-3p binding site. In one embodiment, the miR-126-3p microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 26.

他の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択されるｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。本明細書では、番号で言及されるｍｉＲは、同じｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来する、２つの成熟マイクロＲＮＡの一方（例えば、３ｐマイクロＲＮＡまたは５ｐマイクロＲＮＡ）を指す場合がある。本明細書では、番号で言及される全てのｍｉＲは、配列１つ当たり３ｐアームおよび５ｐアームの両方を含むことを意図する。 In other embodiments, mRNA, eg, mRNA, is derived from miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, and miR-27. Contains at least one microRNA binding site for miR selected from the group. As used herein, the miR referred to by number may refer to one of two mature microRNAs (eg, 3p microRNA or 5p microRNA) derived from opposite arms of the same pre-miRNA. As used herein, all miRs referred to by number are intended to include both 3p and 5p arms per sequence.

別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。多様な実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、１つ～４つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１４２－５ｐを含む）、ｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐおよびｍｉＲ－１４６－５ｐを含む）、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐおよびｍｉＲ－１２６－５ｐを含む）、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、およびこれらの組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものでありうる。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、およびｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、およびｍｉＲ－１４６、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐ）に対する結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１２６（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐ）に対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６、およびｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、およびｍｉＲ－１４６、またはｍｉＲ－１２６およびｍｉＲ－１４２に対する結合部位を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位およびｍｉＲ－１２６結合部位を含む。 In another embodiment, the mRNA, eg, mRNA, comprises at least two miR binding sites for microRNA expressed in immune cells. In various embodiments, mRNA, eg, mRNA, comprises 1 to 4, 1, 2, 3, or 4 miR binding sites for microRNA expressed in immune cells. These miR binding sites include miR-142 (including miR-142-3p and miR-142-5p), miR-146 (including miR-146-3p and miR-146-5p), miR-155, miR. Micro selected from the group consisting of -126 (including miR-126-3p and miR-126-5p), miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, and combinations thereof. It can be for RNA. In another embodiment, the mRNA, eg, mRNA, comprises at least two miR binding sites for microRNA expressed in immune cells, in which case one of the miR binding sites is miR-142-3p. For. In various embodiments, mRNA, eg, m mRNA, is miR-142-3p and miR-155, miR-142-3p, and miR-146, or miR-142-3p and miR-126 (eg, miR-). Includes a binding site for 126-3p). In another embodiment, the mRNA, eg, mRNA, comprises at least two miR binding sites for microRNA expressed in the immune cell, in which case one of the miR binding sites is miR-126 (eg, miR-126). , MiR-126-3p). In various embodiments, mRNA, eg, mRNA, comprises a binding site for miR-126 and miR-155, miR-126, and miR-146, or miR-126 and miR-142. In one embodiment, mRNA, eg, mRNA, comprises a miR-142-3p binding site and a miR-126 binding site.

一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。多様な実施形態では、３’ＵＴＲは、免疫細胞内で発現する、好ましくは免疫細胞内（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞の免疫細胞内）で、夥多に、または優先的に発現するｍｉＲに対する、１つ～４つ、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。他の実施形態では、３’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位、または免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、１つのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対するものである。別の実施形態では、３’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、または免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、１つのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に対するものである。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６結合部位）は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１～１００ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６結合部位）は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位）は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置される。 In one embodiment, the mRNA, eg, the mRNA, comprises at least one microRNA binding site for the 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, miR expressed in immune cells 3. Includes'UTR, and 3'tailing regions of linked nucleosides. In various embodiments, the 3'UTR is expressed within immune cells, preferably within immune cells (eg, within the immune cells of peripheral lymphoid organs and / or splenocytes), in abundance or preferentially. It comprises one to four, at least one, two, three, or four microRNA binding sites for the expressed miR. In another embodiment, the 3'UTR comprises at least one miR-142-3p microRNA binding site, or at least two miR binding sites for miR expressed in immune cells, in this case one miR binding site. The site is for miR-142-3p. In another embodiment, the 3'UTR comprises at least one miR-126 microRNA binding site, or at least two miR binding sites for miR expressed in immune cells, in which case one miR binding site. , MiR-126. In one embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and contains at least one microRNA binding site (eg, miR-142-3p binding site and / or miR-126 binding). The site) is located within 1-100 nucleotides of 3'UTR after the stop codon. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and contains at least one microRNA binding site (eg, miR-142-3p binding site and / or miR-126). The binding site) is located within 30-50 nucleotides of the 3'UTR after the stop codon. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and contains at least one microRNA binding site (eg, miR-142-3p microRNA binding site and / or miR). -126 microRNA binding sites) are located within at least 50 nucleotides of 3'UTR after the stop codon.

別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、コード領域に対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。 In another embodiment, mRNA, eg, mRNA, comprises 5'UTRs and 3'UTRs that are heterologous to the coding region.

別の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、全修飾する。他の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、本明細書でさらに記載される、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む。 In another embodiment, the chemically modified mRNA, eg, m mRNA, is totally modified. In other embodiments, the chemically modified mRNA, eg, m mRNA, comprises one or more modified nucleosides further described herein.

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。 In some embodiments, the mRNA comprises a pseudouridine (ψ). In some embodiments, the mRNA comprises pseudouridine (ψ) and 5-methylcytidine (m 5C ). In some embodiments, the mRNA comprises 1-methylseudouridine (m 1 ψ). In some embodiments, the mRNA comprises 1-methylseudouridine (m 1 ψ) and 5-methylcytidine (m 5 C). In some embodiments, the mRNA comprises 2-thiouridine (s 2 U). In some embodiments, the mRNA comprises 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5C ). In some embodiments, the mRNA comprises 5-methoxyuridine (mo 5 U). In some embodiments, the mRNA comprises 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5-methylcytidine (m 5 C). In some embodiments, the mRNA comprises 2'-O-methyluridine. In some embodiments, the mRNA comprises 2'-O-methyluridine and 5-methylcytidine (m 5C ). In some embodiments, the mRNA comprises N6-methyladenosine ( m6A ). In some embodiments, the mRNA comprises N6-methyladenosine ( m6A ) and 5 -methylcytidine (m5C).

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、または２’－Ｏ－メチルウリジンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobases are pseudouridine (ψ), N1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcytosine, 2-thio-1-methyl. -1-Deasapseudouridine, 2-thio-1-methylseudouridine, 2-thio-5-azaudouridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2-thiopseudouridine, 4-methoxy-2 -Thiopseudouridine, 4-methoxypseudouridine, 4-thio-1-methylseudouridine, 4-thiopseudouridine, 5-azauridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, or 2'-O-methylseudouridine. .. In some embodiments, the mRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、またはα－チオアデノシンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobases are 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudouridine (ψ), α. -Thioguanosine, or α-thioadenosine. In some embodiments, the mRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、リポソームである。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む。一実施形態では、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである。 In one embodiment, mRNA, eg, mRNA, is encapsulated in lipid nanoparticles and administered intravenously. In one embodiment, the lipid nanoparticles are liposomes. In one embodiment, the lipid nanoparticles include cationic lipids and / or ionized lipids. In one embodiment, the cationic lipid and / or the ionized lipid is DLin-KC2-DMA or DLin-MC3-DMA.

一実施形態では、目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である。本明細書では、目的のポリペプチドのさらなる例について記載する。 In one embodiment, the polypeptide of interest is a Therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion protein. Further examples of the polypeptide of interest are described herein.

一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する。別の実施形態では、注入は、静脈内注入である。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により、少なくとも４週間にわたり投与する。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、腫瘍内投与する。本明細書では、適する投与量レジメンについてさらに記載する。 In one embodiment, mRNA, eg mRNA, is administered by weekly infusion. In another embodiment, the infusion is an intravenous infusion. In another embodiment, mRNA, eg mRNA, is administered by infusion once a week for at least 4 weeks. In another embodiment, mRNA, eg mRNA, is administered intratumorally. Further described herein are suitable dosage regimens.

別の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／または少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。 In another embodiment, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an antidrug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject, encapsulated in the LNP to the subject. , A step of intravenous administration of a first dose of mRNA encoding an mRNA of interest, eg, modified mRNA (m mRNA), wherein the mRNA, eg, mRNA, is at least one miR-142-3p microRNA binding site. And / or with a step comprising at least one miR-126 microRNA binding site, wherein the mRNA, eg, mRNA, comprises one or more modified nucleobases; reducing the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. Alternatively, the subject is presented with a method comprising intravenously administering to the subject a second dose of mRNA encapsulated in LNP, eg, mRNA.

別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の抗薬物抗体のレベルが低下したら、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法を提示する。 In another aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject.
(I) A step of intravenously administering to a subject a first dose of mRNA encoding a polypeptide of interest, eg, modified mRNA (m mRNA), encapsulated in LNP, the mRNA, eg, mRNA. Contains at least one microRNA binding site for miR expressed in immune cells (eg, miR-142-3p microRNA binding site and / or miR-126 microRNA binding site), and mRNA, eg, mRNA. With steps containing one or more modified nucleobases;
(Ii) With the step of detecting the level of anti-drug antibody in the sample derived from the subject;
(Iii) When the level of anti-drug antibody in the sample is reduced, the mRNA encapsulated in the LNP, eg, to the subject so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. , A method comprising the step of intravenously administering a second dose of mRNA is presented.

別の態様では、本開示は、被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、例えば、修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における血球数の減少（血球減少症）である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における自己免疫である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における補体媒介作用である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における造血の減少である。他の実施形態では、薬物関連毒性は、例えば、腎毒性または肝毒性でありうる。 In another aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting drug-related toxicity in a subject, the messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest to the subject, eg, modified messenger RNA (mRNA). ) Is administered, and the mRNA, eg, mRNA, binds to at least one microRNA to miR expressed in immune cells so as to reduce or inhibit drug-related toxicity to the polypeptide of interest in the subject. A method comprising a site (eg, a miR-142-3p microRNA binding site and / or a miR-126 microRNA binding site) and where the mRNA, eg, mmRNA, comprises one or more modified nucleobases is presented. In one embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is a decrease in blood cell count (cytopenia) in the subject. In one embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is autoimmunity in the subject. In one embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is complement-mediated action in the subject. In one embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is a reduction in hematopoiesis in the subject. In other embodiments, the drug-related toxicity can be, for example, nephrotoxicity or hepatotoxicity.

加えて、今やさらに、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位などの結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れが、ｍＲＮＡが投与される被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化、サイトカインの分泌）を低減または阻害することも発見されている。さらに、この少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れが、ｍＲＮＡが投与される、脂質を含む化合物または組成物の、血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）を、低減または阻害しうることも発見されている。さらに、この少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の成長および／もしくは活性化を低減もしくは阻害することも可能であり、かつ／または、Ｂ細胞による、ｍＲＮＡが投与される、脂質を含む化合物または組成物に対するＩｇＭの産生であって、例えば、Ｂ細胞による、脂質を含む化合物または組成物のリン脂質成分（例えば、ホスファチジルコリン）に対するＩｇＭの産生など、ＩｇＭの産生も低減もしくは阻害しうる。 In addition, now further, in conventional immune cells, or in any cell that expresses TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines (eg, spleen cells, eg, spleen bone marrow). At least one binding site for microRNA (miR) expressed (in immune cells of peripheral lymphoid organs such as lineage cells and / or endothelial cells), miR-126 binding site and / or miR-142 binding. It was also found that incorporation of binding sites, such as sites, into mRNA reduces or inhibits unwanted immune cell activation (eg, B cell activation, cytokine secretion) in subjects to whom the mRNA is administered. Has been done. In addition, the incorporation of this at least one miR binding site into the mRNA may reduce or inhibit the acceleration of blood clearance (ABC) of the lipid-containing compound or composition to which the mRNA is administered. Has been discovered. In addition, incorporation of this at least one miR binding site into the mRNA can also reduce or inhibit the growth and / or activation of plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and / or B cells. Is the production of IgM for a lipid-containing compound or composition to which the mRNA is administered, such as, for example, the production of IgM by a B cell for a phospholipid component (eg, phosphatidylcholine) of the lipid-containing compound or composition. , IgM production can also be reduced or inhibited.

したがって、一態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するための方法であって、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であり、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位を含む、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含む方法を提示する。別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを投与された被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するための方法であって、被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、脾臓細胞、例えば、脾臓の骨髄系細胞、および／または内皮細胞など、末梢リンパ系器官の免疫細胞内で）発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であり、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位を含む、目的のポリペプチドをコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含む方法を提示する。ＲＮＡは、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、化学修飾ｍＲＮＡ（本明細書では、ｍｍＲＮＡと称する）などのｍＲＮＡでありうる。ｍｍＲＮＡは、全修飾する（すなわち、ｍｍＲＮＡ内の、特定の種類の、全てのヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を修飾する）こともでき、部分修飾することもできる（すなわち、ｍＲＮＡ内の、特定の種類の、ヌクレオチドまたはヌクレオ塩基の一部を修飾するか、または修飾ヌクレオ塩基および非修飾ヌクレオ塩基の連なりを含有するキメラｍＲＮＡとしうる）。 Accordingly, in one aspect, the present disclosure is a method for reducing or inhibiting the activation of unwanted immune cells in a subject administered with RNA encoding the polypeptide of interest, eg, mRNA. To reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells in the body, the subject is expressed in conventional RNA cells or in TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines. At least one binding to microRNA (miR) expressed in any cell (eg, in spleen cells, eg, spleen myeloid cells, and / or immune cells of peripheral lymphoid organs, such as endothelial cells). An RNA encoding a polypeptide of interest, eg, an mRNA, eg, a chemically modified messenger RNA (m mRNA), which is a site and comprises a binding site such as a miR-126 microRNA binding site and / or a miR-142 microRNA binding site. Presents a method comprising the step of administering. In another aspect, the present disclosure is a method for reducing or inhibiting the production of unwanted cytokines in an RNA encoded by a polypeptide of interest, eg, mRNA, in a subject. To reduce or inhibit the production of unwanted cytokines, into conventional immune cells, or into any cell that expresses TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines. At least one binding site for microRNA (miR) expressed in (eg, in immune cells of peripheral lymphoid organs such as spleen cells, eg, myeloid cells of the spleen, and / or endothelial cells), and miR. Steps to administer an RNA encoding an RNA of interest, eg, an mRNA, eg, a chemically modified messenger RNA (m mRNA), comprising a binding site such as -126 microRNA binding site and / or miR-142 microRNA binding site. Present a method to include. RNA can be mRNA such as chemically modified mRNA (referred to herein as m mRNA), which comprises one or more modified nucleoside bases. The mRNA can be fully modified (ie, modify all nucleotides or nucleobases of a particular type within the mRNA) or partially modified (ie, of a particular type within the mRNA). It can be a chimeric mRNA that modifies a portion of a nucleotide or nucleobase, or contains a sequence of modified nucleobases and unmodified nucleobases).

一実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害および／またはサイトカイン産生を、対照ＲＮＡ、例えば、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位を欠くｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの投与と比較して決定する。一実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも１０％減少させる。別の実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも２５％減少させる。さらに別の実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも５０％減少させる。さらに別の実施形態では、免疫細胞の活性化を、ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチド（例えば、治療用タンパク質）の発現の、対応する減少を伴わずに減少させる。 In one embodiment, the reduction or inhibition of unwanted immune cell activation and / or cytokine production is at least one binding site for a control RNA, eg, a microRNA (miR) expressed in an immune cell. Determined in comparison to administration of miR-126 microRNA binding sites and / or mRNAs lacking binding sites such as miR-142 microRNA binding sites, such as mmRNA. In one embodiment, the activation of immune cells is reduced by at least 10%. In another embodiment, the activation of immune cells is reduced by at least 25%. In yet another embodiment, the activation of immune cells is reduced by at least 50%. In yet another embodiment, the activation of immune cells is reduced without a corresponding reduction in the expression of the polypeptide of interest encoded by the mRNA (eg, a Therapeutic protein).

一実施形態では、免疫細胞の活性化は、リンパ球の活性化である。一実施形態では、リンパ球の活性化は、Ｂ細胞の活性化である。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する。別の実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、血清中または全脾臓細胞によるサイトカインの分泌により決定する。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、血清中または全脾臓細胞による、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の分泌により決定する。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、血清中または全脾臓細胞による、ＩＬ－６の分泌により決定する。一実施形態では、サイトカイン産生の低減または阻害を、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生の低減または阻害により決定する。別の実施形態では、サイトカイン産生の低減または阻害を、インターロイキン６（ＩＬ－６）の産生の低減または阻害により決定する。 In one embodiment, the activation of immune cells is the activation of lymphocytes. In one embodiment, lymphocyte activation is B cell activation. In one embodiment, B cell activation is determined by the frequency of CD19 + CD86 + CD69 + B cells. In another embodiment, B cell activation is determined, for example, by the secretion of cytokines by serum or whole spleen cells. In one embodiment, B cell activation is performed by, for example, interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNF-α), or interferon gamma (IFN-γ), either in serum or by whole spleen cells. Determined by secretion. In one embodiment, B cell activation is determined, for example, by the secretion of IL-6 by serum or whole spleen cells. In one embodiment, the reduction or inhibition of cytokine production is determined by reducing or inhibiting the production of interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNF-α), or interferon gamma (IFN-γ). In another embodiment, the reduction or inhibition of cytokine production is determined by the reduction or inhibition of interleukin 6 (IL-6) production.

別の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。 In another embodiment, the present disclosure accelerates blood clearance in subjects repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of reducing or inhibiting, comprising administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), in the subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so that the acceleration of blood clearance is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleos. A method containing a base is presented.

一部の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。 In some embodiments, the present disclosure accelerates blood clearance in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of reducing or inhibiting the step of intravenously administering to a subject a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), wherein the chemically modified mRNA is an immune cell. Steps that include at least one microRNA binding site for microRNA expressed within, and the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleobases; to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject. Presents a method comprising intravenously administering to a subject a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP.

一部の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。 In some embodiments, the present disclosure comprises polyethylene glycol (PEG) in a subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNP) and repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest. A method of reducing or inhibiting the production of recognized IgM molecules, comprising administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). Chemically modified mRNAs contain at least one microRNA binding site for microRNA expressed in immune cells to reduce or inhibit the production of PEG-recognizing IgM molecules in subjects after repeated doses. A method is presented in which the modified mRNA comprises one or more modified nucleobases.

さらなる実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。 In a further embodiment, the disclosure reduces or reduces activation of B1a cells in subjects repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of inhibition comprising administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), comprising B1a in the subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so that the activation of the cell is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleobases. Present a method to include.

一部の実施形態では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。 In some embodiments, the present disclosure is plasmacytoid dendritic cells in a subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNP) and repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest. A method of reducing or inhibiting the activation of a subject, comprising administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the activation of plasmacytoid dendritic cells in the subject. Presents a method comprising one or more modified nucleobases.

さらなる実施形態では、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、ＬＮＰは、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。一部の実施形態では、ＩｇＭ分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識する。 In a further embodiment, LNP does not activate B cells and / or LNP so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject during one or more subsequent doses. Does not induce the production of IgM molecules capable of binding to. In some embodiments, the IgM molecule recognizes polyethylene glycol (PEG).

一部の実施形態では、血中クリアランスの加速化の低減または阻害を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。さらなる実施形態では、血中クリアランスの加速化を、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する低下または阻害を伴わずに低減または阻害する。 In some embodiments, the reduction or inhibition of accelerated blood clearance is compared to control administration of chemically modified mRNAs that lack at least one microRNA binding site encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). decide. In a further embodiment, the acceleration of blood clearance is reduced or inhibited without corresponding reduction or inhibition of the expression of the polypeptide of interest encoded by the chemically modified mRNA.

一部の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、２週間未満である。他の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、１週間未満である。 In some embodiments, the interval between two consecutive doses is less than two weeks. In other embodiments, the interval between two consecutive doses is less than one week.

一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ－１２６（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐ）マイクロＲＮＡ結合部位、またはｍｉＲ－１４２（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ）マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つの結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位）は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１～１００ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位であって、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位などの結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つの結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位）は、３’ＵＴＲ内のどこか（例えば、終止コドンの後の、最初の１００ヌクレオチド後方）に配置される。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、オープンリーディングフレームに対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。 In one embodiment, the mRNA, eg, mRNA, is at least one binding site to a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding a polypeptide of interest, a microRNA (miR) expressed in an immune cell. There are 3'UTRs containing binding sites such as miR-126 (eg, miR-126-3p) microRNA binding sites, or miR-142 (eg, miR-142-3p) microRNA binding sites, and linked. Contains the 3'tailing region of RNA. In one embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and at least one binding site (eg, miR-142-3p binding) to the microRNA expressed in the immune cell. The site and / or the miR-126-3p binding site) is located within 1-100 nucleotides of 3'UTR after the stop codon. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and is at least one binding site for microRNA (miR) expressed in immune cells, miR. Binding sites such as the -126 microRNA binding site and / or the miR-142 microRNA binding site are located within 30-50 nucleotides of 3'UTR after the stop codon. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and is at least one binding site for microRNA (miR) expressed in immune cells, miR. Binding sites such as the -126 microRNA binding site and / or the miR-142 microRNA binding site are located within at least 50 nucleotides of 3'UTR after the stop codon. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and contains at least one binding site (eg, miR-142-3p) for microRNA expressed in immune cells. The binding site and / or the miR-126-3p binding site) is located somewhere within the 3'UTR (eg, after the first 100 nucleotides after the stop codon). In another embodiment, mRNA, eg, mRNA, comprises 5'UTRs and 3'UTRs that are heterologous to open reading frames.

多様な実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、１つ～４つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ－１２６結合部位である。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、この場合、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ－１２６結合部位である。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６結合部位と、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐ）結合部位およびｍｉＲ－１４２（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ）結合部位を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも３つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、この場合、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ－１２６結合部位である。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６結合部位、ｍｉＲ－１４２（例えば、ｍｉＲ＿１４２－３ｐ）結合部位、ならびにｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択されるｍｉＲに対する、第３のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６結合部位、ｍｉＲ－１４２（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ）結合部位、およびｍｉＲ－１５５結合部位を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、およびｍｉＲ－１５５結合部位を含む。本明細書では、番号で言及されるｍｉＲは、同じｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来する、２つの成熟マイクロＲＮＡの一方（例えば、３ｐマイクロＲＮＡまたは５ｐマイクロＲＮＡ）を指す場合がある。本明細書では、番号で言及される全てのｍｉＲは、配列１つ当たり３ｐアームおよび５ｐアームの両方を含むことを意図する。 In various embodiments, mRNA, eg, mRNA, comprises 1 to 4, 1, 2, 3, or 4 miR binding sites for microRNA expressed in immune cells, in this case. At least one of the miR binding sites is the miR-126 binding site. In one embodiment, an mRNA, eg, an mRNA, comprises at least two microRNA binding sites for microRNAs expressed in immune cells, in which case at least one of the microRNA binding sites is miR-126. It is a binding site. In one embodiment, the mRNA, eg, mRNA, is the miR-126 binding site and miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16. , MiR-21, miR-223, miR-24, and a second microRNA binding site for miR selected from the group consisting of miR-27. In another embodiment, the mRNA, eg, m mRNA, comprises a miR-126 (eg, miR-126-3p) binding site and a miR-142 (eg, miR-142-3p) binding site. In one embodiment, an mRNA, eg, an mRNA, comprises at least three microRNA binding sites for microRNAs expressed in immune cells, in which case at least one of the microRNA binding sites is miR-126. It is a binding site. In one embodiment, the mRNA, eg, mRNA, is a miR-126 binding site, a miR-142 (eg, miR_142-3p) binding site, and miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-. Contains a third microRNA binding site for miR selected from the group consisting of 16, miR-21, miR-223, miR-24, and miR-27. In another embodiment, mRNA, eg, mRNA, comprises a miR-126 binding site, a miR-142 (eg, miR-142-3p) binding site, and a miR-155 binding site. In one embodiment, an mRNA, eg, an mRNA, comprises at least four microRNA binding sites for microRNA expressed in an immune cell. In another embodiment, the mRNA, eg, m mRNA, comprises a miR-126 binding site, a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, and a miR-155 binding site. As used herein, the miR referred to by number may refer to one of two mature microRNAs (eg, 3p microRNA or 5p microRNA) derived from opposite arms of the same pre-miRNA. As used herein, all miRs referred to by number are intended to include both 3p and 5p arms per sequence.

一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位は、配列番号２６に示される配列を含む。 In one embodiment, the miR-126-3p binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 26.

一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、配列番号３に示される配列を含む。 In one embodiment, the miR-142-3p binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

一実施形態では、ｍｉＲ－１５５結合部位は、配列番号３５に示される配列を含む。 In one embodiment, the miR-155 binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 35.

一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、骨髄系細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、形質細胞様樹状細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、マクロファージ内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。 In some embodiments, the microRNA binding site binds to microRNA expressed within myeloid cells. In other embodiments, the microRNA binding site binds to microRNA expressed within plasmacytoid dendritic cells. In yet another embodiment, the microRNA binding site binds to microRNA expressed within macrophages.

別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、特定の化学修飾のために全修飾する。本明細書では、適する化学修飾の種類についてさらに記載する。他の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、１もしくは複数の修飾ヌクレオチド、または本明細書でさらに記載されるヌクレオ塩基を含む。 In another embodiment, the mRNA, eg, mRNA, is fully modified for a particular chemical modification. Further described herein are the types of suitable chemical modifications. In other embodiments, mRNA, eg, mRNA, comprises one or more modified nucleotides, or nucleobases further described herein.

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。 In some embodiments, the mRNA comprises a pseudouridine (ψ). In some embodiments, the mRNA comprises pseudouridine (ψ) and 5-methylcytidine (m 5C ). In some embodiments, the mRNA comprises 1-methylseudouridine (m 1 ψ). In some embodiments, the mRNA comprises 1-methylseudouridine (m 1 ψ) and 5-methylcytidine (m 5 C). In some embodiments, the mRNA comprises 2-thiouridine (s 2 U). In some embodiments, the mRNA comprises 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5C ). In some embodiments, the mRNA comprises 5-methoxyuridine (mo 5 U). In some embodiments, the mRNA comprises 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5-methylcytidine (m 5 C). In some embodiments, the mRNA comprises 2'-O-methyluridine. In some embodiments, the mRNA comprises 2'-O-methyluridine and 5-methylcytidine (m 5C ). In some embodiments, the mRNA comprises N6-methyladenosine ( m6A ). In some embodiments, the mRNA comprises N6-methyladenosine ( m6A ) and 5 -methylcytidine (m5C).

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、または２’－Ｏ－メチルウリジンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobases are pseudouridine (ψ), N1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcytosine, 2-thio-1-methyl. -1-Deasapseudouridine, 2-thio-1-methylseudouridine, 2-thio-5-azaudouridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2-thiopseudouridine, 4-methoxy-2 -Thiopseudouridine, 4-methoxypseudouridine, 4-thio-1-methylseudouridine, 4-thiopseudouridine, 5-azauridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, or 2'-O-methylseudouridine. .. In some embodiments, the mRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、またはα－チオアデノシンである。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobases are 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudouridine (ψ), α. -Thioguanosine, or α-thioadenosine. In some embodiments, the mRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、リポソームである。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む。一実施形態では、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである。 In one embodiment, mRNA, eg, mRNA, is encapsulated in lipid nanoparticles and administered intravenously. In one embodiment, the lipid nanoparticles are liposomes. In one embodiment, the lipid nanoparticles include cationic lipids and / or ionized lipids. In one embodiment, the cationic lipid and / or the ionized lipid is DLin-KC2-DMA or DLin-MC3-DMA.

一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする。多様な実施形態では、目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である。本明細書では、目的のポリペプチドのさらなる例について記載する。 In one embodiment, the mRNA, eg, mRNA, encodes the polypeptide of interest. In various embodiments, the polypeptide of interest is a Therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion protein. Further examples of the polypeptide of interest are described herein.

一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する。別の実施形態では、注入は、静脈内注入である。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により、少なくとも４週間にわたり投与する。別の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、腫瘍内投与する。本明細書では、適する投与量レジメンについてさらに記載する。 In one embodiment, mRNA, eg mRNA, is administered by weekly infusion. In another embodiment, the infusion is an intravenous infusion. In another embodiment, mRNA, eg mRNA, is administered by infusion once a week for at least 4 weeks. In another embodiment, mRNA, eg mRNA, is administered intratumorally. Further described herein are suitable dosage regimens.

別の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化）および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／または少なくとも１つのｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位など、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。 In another embodiment, the disclosure discloses unwanted immune cell activation (eg, B cell activation) and / or desirable in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest. A method of reducing or inhibiting the production of cytokines that is not present to a subject intravenously with a first dose of mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in LNP, eg, modified mRNA (m mRNA). A step of internal administration, wherein the mRNA, eg, mRNA, is expressed against a microRNA (miR) expressed in immune cells, such as a miR-126 microRNA binding site and / or at least one miR-142 microRNA binding site. With a step that comprises at least one binding site and the mRNA, eg, mRNA, comprises one or more modified nucleobases; reducing or / or reducing unwanted immune cell activation and / or unwanted cytokine production in the subject. To inhibit, the subject is presented with a method comprising intravenously administering to the subject a second dose of mRNA encapsulated in LNP, eg, mRNA.

別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、被験体へと反復投与した後における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化）、および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、例えば、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／または少なくとも１つのｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位など、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、少なくとも１つの結合部位を含み、
ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の免疫細胞の活性化のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の免疫細胞の活性化のレベルが低下したら、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法を提示する。 In another aspect, the present disclosure discloses unwanted immune cell activation (eg, B cell activation) after repeated administration of a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest to a subject. And / or a method of reducing or inhibiting the production of unwanted cytokines.
(I) A step of intravenously administering to a subject a first dose of mRNA encoding the polypeptide of interest, eg, modified mRNA (m mRNA), encapsulated in LNP, wherein the mRNA, eg, eg, is administered. The mmRNA comprises at least one binding site for microRNA (miR) expressed in immune cells, such as the miR-126 microRNA binding site and / or at least one miR-142 microRNA binding site.
With a step in which the mRNA, eg, mRNA, comprises one or more modified nucleobases;
(Ii) With the step of detecting the level of activation of immune cells in a sample derived from a subject;
(Iii) Once the level of immune cell activation in the sample has decreased, the subject is directed to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells and / or the production of unwanted cytokines in the subject. A method comprising the step of intravenously administering a second dose of mRNA encapsulated in LNP, eg, m mRNA, is presented.

さらに別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、マイクロＲＮＡが、造血系免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する細胞内で発現するｍｉＲ結合部位を含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、造血系免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞などのリンパ系細胞である。一部の態様では、造血系免疫細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、または血小板などの骨髄系細胞である。一部の態様では、造血系免疫細胞は、造血前駆細胞である。一部の態様では、ＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する細胞は、内皮細胞である。 In yet another embodiment, the disclosure is a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, comprising at least two different microRNA (miR) binding sites, wherein the microRNA is intracellular in a hematopoietic immune cell. , Or an mRNA comprising a miR binding site expressed intracellularly that expresses TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines, and contains one or more modified nucleosides. In some embodiments, the hematopoietic immune cells are lymphoid cells such as T cells, B cells, or NK cells. In some embodiments, the hematopoietic immune cells are myeloid cells such as monocytes, macrophages, neutrophils, basophils, eosinophils, erythrocytes, dendritic cells, megakaryocytes, or platelets. In some embodiments, the hematopoietic immune cells are hematopoietic progenitor cells. In some embodiments, the cell that expresses TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines is an endothelial cell.

本開示の一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、マイクロＲＮＡは、同じ目的の細胞型内または異なる目的の細胞型内で夥多である。一部の態様では マイクロＲＮＡは、複数の目的の細胞型内で夥多である。 In some aspects of the disclosure, the mRNA comprises at least two different microRNA binding sites, and the microRNA is abundant within the same or different cell types of interest. In some embodiments, microRNAs are abundant within multiple cell types of interest.

一部の態様では、本開示は、造血系免疫細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。 In some embodiments, the present disclosure relates to at least one first microRNA binding site of abundant microRNAs within hematopoietic immune cells and abundant microRNAs within endothelial cells. Presenting an mRNA comprising 2 microRNA binding sites and containing one or more modified nucleobases.

一部の態様では、本開示は、Ｂ細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。 In some embodiments, the present disclosure discloses at least one second of abundant microRNAs in B cells, at least one first microRNA binding site and abundant microRNAs in endothelial cells. MRNAs containing microRNA binding sites and one or more modified nucleobases are presented.

一部の態様では、本開示は、形質細胞様樹状細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。 In some embodiments, the present disclosure discloses at least one of abundant microRNAs in plasmacytoid dendritic cells, at least one first microRNA binding site, and abundant microRNAs in endothelial cells. Presenting an mRNA comprising one second microRNA binding site and containing one or more modified nucleobases.

本開示の一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピー（２つ、３つ、４つのコピー）と、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の２つのコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の１つのコピーとを含む。 In some aspects of the present disclosure, an mRNA contains multiple copies of a first microRNA binding site (two, three, four copies) and at least one copy of a second microRNA binding site. include. In some embodiments, the mRNA comprises two copies of the first microRNA binding site and one copy of the second microRNA binding site.

一部の態様では、本開示は、例えば、同じマイクロＲＮＡの３ｐアームおよび５ｐアームに対する、マイクロＲＮＡ結合部位など、同じマイクロＲＮＡに対する、第１のマイクロＲＮＡ結合部位および第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍｍＲＮＡを提示する。 In some embodiments, the present disclosure comprises a first microRNA binding site and a second microRNA binding site for the same microRNA, eg, microRNA binding sites for the 3p and 5p arms of the same microRNA. Present the containing mMRNA.

本開示の一部の態様は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、およびｍｉＲ－２６ａからなる群から選択され、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、およびｍｉＲ－１５５からなる群から選択される。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号２６に明示されるものなどのｍｉＲ－１２６結合部位である。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３に明示されるものなどのｍｉＲ－１４２結合部位である。 A portion of the disclosure is a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, comprising at least two different microRNA (miR) binding sites, wherein the microRNAs are miR-126, miR-. Selected from the group consisting of 142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, and miR-26a, 1 Alternatively, an mRNA containing multiple modified nucleoside bases is presented. In some embodiments, the microRNA is selected from the group consisting of miR126-3p, miR-142-3p, miR-142-5p, and miR-155. In some embodiments, the at least one microRNA binding site is a miR-126 binding site, such as that specified in SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the at least one microRNA binding site is a miR-142 binding site, such as that specified in SEQ ID NO: 3.

さらに他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６結合部位であり、第２のマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものであり、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。 In yet another aspect, the present disclosure is a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, comprising at least two different microRNA (miR) binding sites, one microRNA binding site being miR. -126 binding sites, the second microRNA binding sites are miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR- For microRNAs selected from the group consisting of 21, miR-223, miR-24, and miR-27, an mRNA containing one or more modified nucleobases is presented.

他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ内または３’ＵＴＲ内に、配列番号２６に明示される単一のｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、配列番号３に明示される単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位とを含む。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、それぞれ、配列番号３および配列番号５１に明示されるものなど、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位とを含む。 In another aspect, the present disclosure comprises a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, comprising a miR-126-3p binding site and a miR-142-3p binding site. An mRNA containing a modified nucleoside is presented. In some embodiments, the mmRNA is within the 5'UTR or 3'UTR with a single miR-126-3p binding site specified in SEQ ID NO: 26 and a single miR-specified in SEQ ID NO: 3. Includes 142-3p binding site. In some embodiments, the m mRNA comprises at least one miR-142-3p binding site and at least one miR-142-5p binding site, such as those specified in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 51, respectively. ..

さらに他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも３つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１２６結合部位であり、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。 In yet another aspect, the present disclosure is a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, comprising at least three different microRNA binding sites, wherein at least one of the microRNA binding sites is miR. At the -126 binding site, the mRNA presents an mRNA containing one or more modified nucleosides.

一部の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも３つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１４２結合部位であり、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。 In some embodiments, the present disclosure is a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, comprising at least three different microRNA binding sites, wherein at least one of the microRNA binding sites is miR. At the -142 binding site, the mRNA presents an mRNA containing one or more modified nucleosides.

さらに他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐと、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対する第３のマイクロＲＮＡ結合部位とを含み、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１５５結合部位（例えば、配列表に明示される１５５－５ｐ結合部位）とを含む。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１５５結合部位とを含む。 In yet another aspect, the present disclosure is a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, wherein at least one miR-126-3p binding site, at least one miR-142-3p, and miR. A third microRNA for a microRNA selected from the group consisting of -146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, and miR-27. An mRNA containing a binding site and containing one or more modified nucleosides is presented. In some embodiments, the m mRNA is manifested in at least one miR-126-3p binding site, at least one miR-142-3p binding site and at least one miR-155 binding site (eg, in the sequence listing). 155-5p binding site). In some embodiments, the mmRNA comprises at least one miR-126-3p binding site, at least one miR-142-3p binding site, at least one miR-142-5p binding site, and at least one miR-. Includes 155 binding sites.

先行する態様および関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含み、マイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、または５’ＵＴＲ内および３’ＵＴＲ内の両方に配置したｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、マイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、マイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、マイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内および３’ＵＴＲ内の両方に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の終止コドンと直に隣接する３’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の終止コドンの７０～８０塩基下流の３’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに直に先行する５’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに１５～２０ヌクレオチド先行する５’ＵＴＲ内に配置する。一部の態様では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに７０～８０ヌクレオチド先行する５’ＵＴＲ内に配置する。 In any of the preceding and related embodiments, the present disclosure discloses a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding a polypeptide of interest, a 3'UTR, and a 3'tailing of the linked nucleoside. It presents an mMRNA that comprises a region and has microRNA binding sites located within the 5'UTR, 3'UTR, or both within the 5'UTR and 3'UTR of the mmRNA. In some embodiments, the microRNA binding site is placed within the 3'UTR of the mRNA. In some embodiments, the microRNA binding site is placed within the 5'UTR of the mRNA. In some embodiments, the microRNA binding site is placed both within the 5'UTR and within the 3'UTR of the mRNA. In some embodiments, at least one microRNA binding site is placed within the 3'UTR directly adjacent to the stop codon in the coding region of the mMRNA. In some embodiments, the at least one microRNA binding site is located within the 3'UTR 70-80 bases downstream of the stop codon of the encoding region of the mMRNA. In some embodiments, at least one microRNA binding site is placed within the 5'UTR directly preceding the start codon of the cDNA region of the mMRNA. In some embodiments, at least one microRNA binding site is placed within the 5'UTR, which precedes the start codon of the coding region of the mMRNA by 15-20 nucleotides. In some embodiments, at least one microRNA binding site is placed within the 5'UTR, which precedes the start codon of the coding region of the mMRNA by 70-80 nucleotides.

一部の態様では、本開示は、５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、またはこれらの両方の中に、互いと直に隣接して位置するか、または５ヌクレオチド未満、５～１０、１０～１５、もしくは１５～２０ヌクレオチドのスペーサーを伴って位置する、同じマイクロＲＮＡ結合部位または異なるマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含むｍｍＲＮＡを提示する。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ内に配置される、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、この場合、第１のマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンと直に隣接して位置し、第２のマイクロＲＮＡ結合部位および第３のマイクロＲＮＡ結合部位は、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の３０～４０塩基下流に位置する。一部の態様では、ｍｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ内に配置される、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の２つのコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の１つのコピーとを含み、この場合、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の第１のコピーは、終止コドンと直に隣接して位置し、第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の第１のコピーの３０～４０塩基下流に位置し、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の第２のコピーは、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の３０～４０塩基下流に位置する。 In some embodiments, the present disclosure is located in the 5'UTR, in the 3'UTR, or both, directly adjacent to each other, or less than 5 nucleotides, 5-10, 10-. MRNAs containing multiple copies of the same microRNA binding site or different microRNA binding sites, located with a spacer of 15, or 15-20 nucleotides, are presented. In some embodiments, the mRNA comprises multiple copies of the same microRNA binding site located within the 3'UTR, in which case the first microRNA binding site is directly adjacent to the termination codon. The second microRNA binding site and the third microRNA binding site are located 30-40 bases downstream of the first microRNA binding site. In some embodiments, the mMRNA comprises two copies of the first microRNA binding site and one copy of the second microRNA binding site located within the 3'UTR, in this case the first. The first copy of one microRNA binding site is located immediately adjacent to the termination codon and the second microRNA binding site is 30-40 bases of the first copy of the first microRNA binding site. Located downstream, the second copy of the first microRNA binding site is located 30-40 bases downstream of the second microRNA binding site.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、ｍｍＲＮＡが全修飾された修飾ｍＲＮＡを提示する。 In either of the above embodiments or related embodiments, the present disclosure presents a modified mRNA in which the m mRNA is fully modified.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、またはＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含むｍｍＲＮＡを提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure discloses pseudouridine (ψ), pseudouridine (ψ) and 5-methylcytidine (m5C), 1-methylpseudouridine (m 1 ψ),. 1-Methylseudouridine (m 1 ψ) and 5-methylcytidine (m 5 C), 2-thiouridine (s 2 U), 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5 C), 5-methoxyuridine (mo) 5 U), 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5-methylcytidine (m 5 C), 2'-O-methyl uridine, 2'-O-methyl uridine and 5-methylcytidine (m 5 C), N6-methyladenosine ( m6A ), or mmRNA containing N6-methyladenosine ( m6A ) and 5 -methylcytidine (m5C) is presented.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、もしくは２’－Ｏ－メチルウリジン、またはこれらの組合せを含むｍｍＲＮＡを提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure discloses pseudouridine (ψ), N1-methylseudouridine (m 1 ψ), 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcitosin, 2-thio-1-methyl-1-deazapseudouridine, 2-thio-1-methylseudouridine, 2-thio-5-azauridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2-thiopseudouridine Uridine, 4-methoxy-2-thiopseudouridine, 4-methoxypseudouridine, 4-thio-1-methylseudouridine, 4-thiopseudouridine, 5-azauridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, or 2' -O-Methyluridine, or an mMr containing a combination thereof, is presented.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、もしくはα－チオアデノシン、またはこれらの組合せを含むｍｍＲＮＡを提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure discloses 1-methylseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C),. Presenting an mmRNA containing pseudouridine (ψ), α-thioguanosine, or α-thioadenosine, or a combination thereof.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、目的のポリペプチドをコードするｍｍＲＮＡであって、目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質であるｍｍＲＮＡを提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure is an mmRNA encoding a polypeptide of interest, wherein the polypeptide of interest is a Therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion. The protein mmRNA is presented.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、本明細書で記載される修飾ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提示する。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、リポソームを含む。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む。一部の態様では、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである。 In either of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure presents lipid nanoparticles comprising the modified mRNA described herein. In some embodiments, the lipid nanoparticles comprise liposomes. In some embodiments, the lipid nanoparticles include cationic lipids and / or ionized lipids. In some embodiments, the cationic lipid and / or the ionized lipid is DLin-KC2-DMA or DLin-MC3-DMA.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure comprises mmRNAs or lipid nanoparticles described herein with pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients. To present a pharmaceutical composition comprising.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、それを必要とする被験体における、抗薬物抗体応答の低減もしくは阻害、または薬物関連毒性の阻害における使用のための、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または医薬組成物を提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure is intended for use in reducing or inhibiting an anti-drug antibody response or inhibiting drug-related toxicity in a subject in need thereof. Presented are mmRNAs, lipid nanoparticles, or pharmaceutical compositions described herein.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、それを必要とする被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化の低減もしくは阻害、または望ましくないサイトカインの産生の低減もしくは阻害における使用のための、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または医薬組成物を提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure reduces or inhibits the activation of unwanted immune cells, or reduces or inhibits the production of unwanted cytokines in a subject in need thereof. Presented herein are mRNAs, lipid nanoparticles, or pharmaceutical compositions for use in.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、それを必要とする被験体における、血中クリアランスの加速化の低減または阻害における使用のための、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または医薬組成物を提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure is described herein for use in reducing or inhibiting the acceleration of blood clearance in a subject in need thereof. , MmRNA, lipid nanoparticles, or pharmaceutical compositions are presented.

前出の態様または関連する態様のうちのいずれかでは、本開示は、それを必要とする被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生の低減または阻害における使用のための、本明細書で記載される、ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子、または医薬組成物を提示する。 In any of the aforementioned embodiments or related embodiments, the present disclosure is for use in reducing or inhibiting the production of polyethylene glycol (PEG) -recognizing IgM molecules in subjects in need thereof. Presented herein is an mRNA, lipid nanoparticle, or pharmaceutical composition described herein.

本開示の多様な実施形態についての詳細を、下記の記載に明示する。本開示の他の特色、目的、および利点は、記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、前記被験体における、前記目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
（項目２）
前記ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ｍｍＲＮＡが、５’ＵＴＲ、前記目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、（ｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を含む３’ＵＴＲ、ならびに連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記ｍｍＲＮＡが、コード領域に対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ｍｍＲＮＡを、全修飾する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記ｍｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ ２ Ｕ）、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ ６ Ａ）、またはＮ６－メチルアデノシン（ｍ ６ Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記ｍｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、もしくは２’－Ｏ－メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記ｍｍＲＮＡが、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、もしくはα－チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
脂質ナノ粒子が、リポソームである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記カチオン性脂質および／またはイオン化脂質が、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ｍｍＲＮＡが、配列番号３に示される配列を含む、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ｍｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ｍｍＲＮＡが、配列番号２６に示される配列を含む、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ｍｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６結合部位と、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ｍｍＲＮＡ構築物が、ｍｉＲ－１２６結合部位およびｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
ｍｍＲＮＡ構築物が、３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
ｍｍＲＮＡ構築物が、３つのｍｉＲ－１２６結合部位を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記目的のポリペプチドをコードする、前記コドン最適化オープンリーディングフレームが、終止コドンを含み、前記（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を、前記終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチドの中に配置する、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記目的のポリペプチドをコードする、前記コドン最適化オープンリーディングフレームが、終止コドンを含み、前記（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を、前記終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置する、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を、前記ｍｍＲＮＡ構築物の５’ＵＴＲ内に配置する、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
前記被験体における、前記目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
（項目２７）
目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであって、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）前記被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の抗薬物抗体の前記レベルが低下したら、前記被験体における、前記目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
（項目２８）
被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、前記被験体における、前記目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
（項目２９）
目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、前記目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、前記被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
（項目３０）
望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害を、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害が、リンパ球の活性化の低減または阻害である、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記リンパ球の活性化の低減または阻害が、Ｂ細胞の活性化の低減または阻害である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
Ｂ細胞の活性化の低減または阻害を、ＣＤ１９ ＋ ＣＤ８６ ＋ ＣＤ６９ ＋ Ｂ細胞の頻度により決定する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害が、サイトカイン産生の低減または阻害を引き起こす、項目２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
免疫細胞の活性化を、前記化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、前記目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる、項目２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、前記目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、前記被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
（項目３７）
望ましくないサイトカインの産生の低減または阻害を、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記サイトカインの産生の低減または阻害が、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生の低減または阻害である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記サイトカインの産生の低減または阻害が、インターロイキン６（ＩＬ－６）の産生の低減または阻害である、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
サイトカインの産生を、前記化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、前記目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる、項目３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記化学修飾ｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する、項目２９から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記化学修飾ｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、５’ＵＴＲ、前記目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、項目２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、前記オープンリーディングフレームに対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ｍＲＮＡを、全修飾する、項目２９から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ ２ Ｕ）、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ ６ Ａ）、またはＮ６－メチルアデノシン（ｍ ６ Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）を含む、項目２９から４５のいずれかに記載の方法。
（項目４７）
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、もしくは２’－Ｏ－メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む、項目２９から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ｍＲＮＡが、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、もしくはα－チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、項目２９から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、骨髄系細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、項目２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、形質細胞様樹状細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、項目２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、マクロファージ内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、項目２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、項目２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号２６に示される配列を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位である、項目２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記ｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号３に示される配列を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１５５マイクロＲＮＡ結合部位である、項目２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記ｍｉＲ－１５５マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号３５に示される配列を含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である、項目２９から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、項目２９から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６結合部位と、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６結合部位およびｍｉＲ－１４２結合部位を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記脂質ナノ粒子が、リポソームである、項目４１に記載の方法。
（項目６４）
前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、項目４１に記載の方法。
（項目６５）
前記カチオン性脂質および／またはイオン化脂質が、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
前記被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
（項目６７）
目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の、被験体への反復投与後の前記被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、
前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）前記被験体に由来する試料中の免疫細胞の活性化のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の免疫細胞の活性化の前記レベルが低下したら、前記被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
（項目６８）
前記望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害が、Ｂ細胞の活性化の低減または阻害である、項目６６または６７に記載の方法。
（項目６９）
前記望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害が、サイトカインの産生の低減または阻害を引き起こす、項目６６または６７に記載の方法。
（項目７０）
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、前記目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の前記被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
（項目７１）
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、ステップと；
前記被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
（項目７２）
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、前記目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／または前記ＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、項目７０から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
血中クリアランスの加速化の低減または阻害を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する、項目７０から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
血中クリアランスの加速化を、前記化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、前記目的のポリペプチドの発現の、対応する低下または阻害を伴わずに低減または阻害する、項目７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
２回にわたる連続投与の間の間隔が、２週間未満である、項目７０から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
２回にわたる連続投与の間の間隔が、１週間未満である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、前記目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の前記被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、方法。
（項目７８）
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、前記被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、前記化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
前記被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、前記被験体へと、ＬＮＰ内に封入された前記化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法。
（項目７９）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、５’ＵＴＲ、前記目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、前記少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、項目７０から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、前記オープンリーディングフレームに対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記ｍＲＮＡを、全修飾する、項目７０から８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ ２ Ｕ）、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ ６ Ａ）、またはＮ６－メチルアデノシン（ｍ ６ Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）を含む、項目７０から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、もしくは２’－Ｏ－メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む、項目７０から８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記ｍＲＮＡが、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、もしくはα－チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、項目７０から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、骨髄系細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、項目７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位である、項目７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記ｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号３に示される配列を含む、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、形質細胞様樹状細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、項目７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、項目７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号２６に示される配列を含む、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、マクロファージ内で発現するマイクロＲＮＡに結合する、項目７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１５５マイクロＲＮＡ結合部位である、項目７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記ｍｉＲ－１５５マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号３５に示される配列を含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である、項目７０から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、項目７０から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６結合部位と、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記化学修飾ｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６結合部位およびｍｉＲ－１４２結合部位を含む、項目９６に記載の方法。
（項目９９）
前記脂質ナノ粒子が、リポソームである、項目７０から９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、項目７０から９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記カチオン性脂質および／またはイオン化脂質が、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、前記ｍｍＲＮＡが、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡが、造血系免疫細胞内で、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現し、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する細胞内で発現され、前記ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、ｍｍＲＮＡ。
（項目１０３）
前記造血系免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞などのリンパ系細胞である、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１０４）
前記造血系免疫細胞が、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、または血小板などの骨髄系細胞である、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１０５）
前記造血系免疫細胞が、造血前駆細胞である、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１０６）
前記ＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現し、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する細胞が、内皮細胞である、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１０７）
前記マイクロＲＮＡが、同じ目的の細胞型内または異なる目的の細胞型内で夥多である、項目１０２から１０６のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１０８）
前記マイクロＲＮＡが、複数の目的の細胞型内で夥多である、項目１０２から１０６のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１０９）
前記ｍｍＲＮＡが、造血系免疫細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位および、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１０）
前記ｍｍＲＮＡが、Ｂ細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１１）
前記ｍｍＲＮＡが、形質細胞様樹状細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位と、内皮細胞内で夥多なマイクロＲＮＡの、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１２）
第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む、項目１０２から１１１のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１３）
前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の２つのコピーを含む、項目１１２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１４）
同じマイクロＲＮＡの第１のマイクロＲＮＡ結合部位および第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む、項目１０２から１１１のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１５）
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、同じマイクロＲＮＡの３ｐアームおよび５ｐアームのものである、項目１１４に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１６）
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、およびｍｉＲ－２６ａからなる群から選択される、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１７）
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、およびｍｉＲ－１５５からなる群から選択される、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１８）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６結合部位である、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１１９）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２結合部位である、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２０）
１つのマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２６結合部位であり、前記第２のマイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２１）
少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位とを含む、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２２）
少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位とを含む、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２３）
少なくとも３つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１２６結合部位である、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２４）
少なくとも３つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１４２結合部位である、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２５）
少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐと、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対する第３のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２６）
少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１５５結合部位とを含む、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２７）
少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１５５結合部位とを含む、項目１０２に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２８）
前記マイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡの前記５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、または前記５’ＵＴＲ内および３’ＵＴＲ内の両方に配置した、先行する項目のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１２９）
前記マイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡの前記３’ＵＴＲ内に配置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３０）
前記マイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡの前記５’ＵＴＲ内に配置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３１）
前記マイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡの前記５’ＵＴＲ内および３’ＵＴＲ内の両方に配置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３２）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の終止コドンと直に隣接する前記３’ＵＴＲ内に配置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３３）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の終止コドンの７０～８０塩基下流の前記３’ＵＴＲ内に配置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３４）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに直に先行する前記５’ＵＴＲ内に配置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３５）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに１５～２０ヌクレオチド先行する前記５’ＵＴＲ内に配置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３６）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、前記ｍｍＲＮＡのコード領域の開始コドンに７０～８０ヌクレオチド先行する前記５’ＵＴＲ内に配置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３７）
互いと直に隣接するか、または５ヌクレオチド未満、５～１０、１０～１５、もしくは１５～２０ヌクレオチドのスペーサーを伴って位置する、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含む、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３８）
前記３’ＵＴＲ内に配置された、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位が、終止コドンと直に隣接して位置し、前記第２のマイクロＲＮＡ結合部位および第３のマイクロＲＮＡ結合部位が、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の３０～４０塩基下流に位置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１３９）
前記３’ＵＴＲ内に配置された、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の２つのコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の１つのコピーとを含み、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の前記第１のコピーが、終止コドンと直に隣接して位置し、前記第２のマイクロＲＮＡ結合部位が、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の前記第１のコピーの３０～４０塩基下流に位置し、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の前記第２のコピーが、前記第２のマイクロＲＮＡ結合部位の３０～４０塩基下流に位置する、項目１２８に記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１４０）
前記ｍｍＲＮＡが全修飾された、先行する項目のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１４１）
シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ ２ Ｕ）、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ ６ Ａ）、またはＮ６－メチルアデノシン（ｍ ６ Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）を含む、先行する項目のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１４２）
シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、もしくは２’－Ｏ－メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む、先行する項目のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１４３）
１－メチルシュードウリジン（ｍ １ ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ ５ Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ ５ Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、もしくはα－チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、先行する項目のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１４４）
前記目的のポリペプチドが、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である、先行する項目のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
（項目１４５）
先行する項目のいずれかに記載のｍｍＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子。
（項目１４６）
リポソームを含む、項目１４５に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４７）
カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、項目１４５に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４８）
前記カチオン性脂質および／またはイオン化脂質が、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである、項目１４７に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４９）
項目１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、または項目１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目１５０）
抗薬物抗体応答の低減もしくは阻害、または薬物関連毒性の阻害を必要とする被験体における、抗薬物抗体応答の低減もしくは阻害、または薬物関連毒性の阻害における使用のための、項目１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、項目１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または項目１４９に記載の医薬組成物。
（項目１５１）
望ましくない免疫細胞の活性化の低減もしくは阻害、または望ましくないサイトカインの産生の低減もしくは阻害を必要とする被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化の低減もしくは阻害、または望ましくないサイトカインの産生の低減もしくは阻害における使用のための、項目１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、項目１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または項目１４９に記載の医薬組成物。
（項目１５２）
血中クリアランスの加速化の低減または阻害を必要とする被験体における、血中クリアランスの加速化の低減または阻害における使用のための、項目１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、項目１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または項目１４９に記載の医薬組成物。
（項目１５３）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生の低減または阻害を必要とする被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生の低減または阻害における使用のための、項目１０２から１４４のいずれか一項に記載のｍｍＲＮＡ、項目１４５から１４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、または項目１４９に記載の医薬組成物。 Details of the various embodiments of the present disclosure are set forth in the description below. Other features, purposes, and advantages of the present disclosure will be apparent from the description and drawings, as well as the claims.
The present invention provides, for example, the following items.
(Item 1)
A method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response in a subject comprising administering to the subject a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, said objective in said subject. The mMRNAs are (i) at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-126 binding site; or (i) so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide. iii) A method comprising at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site, wherein the mRNA comprises one or more modified nucleobases.
(Item 2)
The method according to item 1, wherein the mRNA is encapsulated in lipid nanoparticles and administered intravenously.
(Item 3)
The method according to item 2, wherein the mMRNA is administered by infusion once a week.
(Item 4)
The mmRNA is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, (i) the at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) the at least one miR-. 126 binding sites; or (iii) preceding 3'UTRs comprising the at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site, as well as the 3'tailing region of the linked nucleoside. The method described in any of the items to be performed.
(Item 5)
The method according to any of the preceding items, comprising 5'UTR and 3'UTR, wherein the mmRNA is heterologous to the coding region.
(Item 6)
The method according to any of the preceding items, which completely modifies the mmRNA.
(Item 7)
The mmRNAs are pseudopseudouridine (ψ), pseudouridine (ψ) and 5-methylcytidine (m5C), 1-methylpseudouridine (m1 ψ ) , 1 -methylpseudouridine (m1 ψ) and 5-methylcytidine. ( M 5 C), 2-thiouridine (s 2 U), 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5 C), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5 -Methylcytidine (m 5 C), 2'-O-methyl uridine, 2'-O-methyl uridine and 5-methylcytidine (m 5 C), N6-methyl adenosine (m 6 A), or N6-methyl adenosine The method according to any of the preceding items, comprising (m 6 A) and 5-methylcytidine (m 5 C).
(Item 8)
Pseudouridine (ψ), N1-methylpseudouridine (m1 ψ), 2 -thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcitosine, 2-thio-1-methyl-1-deazasudouridine, 2-thio-1-methylseudouridine, 2-thio-5-azauridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2-thiopseudouridine, 4-methoxy-2-thiopseudouridine, 4-methoxy Preceding, including pseudouridine, 4-thio-1-methylpseudouridine, 4-thiopseudouridine, 5-azauridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, or 2'-O-methyluridine, or a combination thereof. The method described in any of the items.
(Item 9)
The mmRNA is 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudo-pseudouridine (ψ), α-thioguanosine, or α-thio. The method according to any of the preceding items, including adenosine, or a combination thereof.
(Item 10)
The method according to any of the preceding items, wherein the polypeptide of interest is a Therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion protein.
(Item 11)
The method according to any of the preceding items, wherein the lipid nanoparticles are liposomes.
(Item 12)
The method according to any of the preceding items, wherein the lipid nanoparticles comprises a cationic lipid and / or an ionized lipid.
(Item 13)
12. The method of item 12, wherein the cationic lipid and / or ionized lipid is DLin-KC2-DMA or DLin-MC3-DMA.
(Item 14)
The method according to any one of items 1 to 13, wherein the mRNA comprises at least one miR-142-3p microRNA binding site comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
(Item 15)
The item according to any one of items 1 to 13, wherein the mRNA contains at least two microRNA binding sites, and at least one of the microRNA binding sites is a miR-142-3p microRNA binding site. Method.
(Item 16)
The mRNA is the binding site of miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223. , MiR-24, and the method of item 15, comprising a second microRNA binding site for miR selected from the group consisting of miR-27.
(Item 17)
The method according to any one of items 1 to 13, wherein the mRNA comprises at least one miR-126 microRNA binding site comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
(Item 18)
The method according to any one of items 1 to 13, wherein the mRNA comprises at least two microRNA binding sites and at least one of the microRNA binding sites is a miR-126 microRNA binding site.
(Item 19)
The mRNA is the binding site of miR-126 and miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223. The method of item 18, comprising a second microRNA binding site for miR, selected from the group consisting of, miR-24, and miR-27.
(Item 20)
The method according to any one of items 1 to 13, wherein the mmRNA construct comprises a miR-126 binding site and a miR-142-3p binding site.
(Item 21)
The method according to any one of items 1 to 13, wherein the mmRNA construct comprises three miR-142-3p binding sites.
(Item 22)
The method according to any one of items 1 to 13, wherein the mmRNA construct comprises three miR-126 binding sites.
(Item 23)
The codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon, wherein (i) at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-126 binding. Sites; or (iii) at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site are placed within 30-50 nucleotides of 3'UTR after the stop codon. The method according to any one of items 1 to 13.
(Item 24)
The codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon, wherein (i) at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-126 binding. Site; or (iii) place at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site within at least 50 nucleotides of 3'UTR after the stop codon, item. The method according to any one of 1 to 13.
(Item 25)
(I) at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-126 binding site; or (iii) at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR. The method of any one of items 1 to 13, wherein the -126 binding site is placed within the 5'UTR of the mRNA construct.
(Item 26)
A method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response of a polypeptide of interest after repeated administration to a subject, the modification encoding the polypeptide of interest encapsulated in the LNP to said subject. A step of intravenous administration of a first dose of mRNA (mRNA), wherein the mRNA is (i) at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-126 binding site; Or (iii) with a step comprising at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site, wherein the mRNA comprises one or more modified nucleobases;
A step of intravenously administering to the subject a second dose of the mmRNA encapsulated in LNP so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in said subject.
How to include.
(Item 27)
A method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject.
(I) The step of intravenously administering to the subject a first dose of a modified mRNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in LNP, wherein the mRNA is (i). At least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-126 binding site; or (iii) at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site And the step in which the mRNA comprises one or more modified nucleobases;
(Ii) With the step of detecting the level of the anti-drug antibody in the sample derived from the subject;
(Iii) When the level of the anti-drug antibody in the sample is reduced, the subject is encapsulated in the LNP so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. With the step of intravenously administering a second dose of the above-mentioned mMV.
How to include.
(Item 28)
A method of reducing or inhibiting drug-related toxicity in a subject comprising administering to the subject a modified messenger RNA (mmRNA) encoding a polypeptide of interest, wherein the subject is of the purpose. To reduce or inhibit drug-related toxicity to a polypeptide, the mRNA is (i) at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-126 binding site; or (iii). A method comprising at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site, wherein the mRNA comprises one or more modified nucleobases.
(Item 29)
A method of reducing or inhibiting unwanted immune cell activation in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest, wherein the polypeptide of interest is encoded into the subject. The chemically modified mRNA comprises at least one against the microRNA expressed in the immune cells such that it comprises the step of administering the chemically modified mRNA to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells in the subject. A method comprising a microRNA binding site, wherein the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases.
(Item 30)
29. The method of item 29, wherein the reduction or inhibition of undesired activation of immune cells is determined in comparison to control administration of a chemically modified mRNA lacking at least one microRNA binding site.
(Item 31)
29. The method of item 29, wherein the reduction or inhibition of the undesired activation of immune cells is the reduction or inhibition of the activation of lymphocytes.
(Item 32)
31. The method of item 31, wherein the reduction or inhibition of lymphocyte activation is reduction or inhibition of B cell activation.
(Item 33)
32. The method of item 32, wherein the reduction or inhibition of B cell activation is determined by the frequency of CD19 + CD86 + CD69 + B cells.
(Item 34)
The method according to any one of items 29 to 33, wherein the reduction or inhibition of the undesired activation of immune cells causes the reduction or inhibition of cytokine production.
(Item 35)
29. The method of any one of items 29-34, wherein the activation of immune cells is reduced without a corresponding reduction in the expression of the polypeptide of interest encoded by the chemically modified mRNA.
(Item 36)
A method of reducing or inhibiting the production of unwanted cytokines in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest, the chemistry encoding the polypeptide of interest to the subject. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell such that it comprises the step of administering the modified mRNA and reduces or inhibits the production of unwanted cytokines in the subject. The method comprising, wherein the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases.
(Item 37)
36. The method of item 36, wherein the reduction or inhibition of the production of unwanted cytokines is determined in comparison to a control dose of the chemically modified mRNA lacking at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in the immune cell. ..
(Item 38)
36, wherein the reduction or inhibition of cytokine production is reduction or inhibition of production of interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNF-α), or interferon gamma (IFN-γ). the method of.
(Item 39)
36. The method of item 36, wherein the reduction or inhibition of cytokine production is the reduction or inhibition of interleukin 6 (IL-6) production.
(Item 40)
36-39. The method of any one of items 36-39, wherein the production of cytokines is reduced without a corresponding reduction in the expression of the polypeptide of interest encoded by the chemically modified mRNA.
(Item 41)
The method according to any one of items 29 to 40, wherein the chemically modified mRNA is encapsulated in lipid nanoparticles and administered intravenously.
(Item 42)
41. The method of item 41, wherein the chemically modified mRNA is administered by infusion once a week.
(Item 43)
The chemically modified mRNA is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, a 3'UTR containing said at least one microRNA binding site, and a 3'tailing region of the nucleoside linked. The method according to any one of items 29 to 42, comprising.
(Item 44)
43. The method of item 43, wherein the chemically modified mRNA comprises 5'UTRs and 3'UTRs that are heterologous to the open reading frame.
(Item 45)
The method according to any one of items 29 to 44, wherein the mRNA is completely modified.
(Item 46)
The mRNAs are pseudopseudouridine (ψ), pseudouridine (ψ) and 5-methylcytidine (m5C), 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 1-methylpseudouridine (m 1 ψ) and 5-methylcytidine. ( M 5 C), 2-thiouridine (s 2 U), 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5 C), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5 -Methylcytidine (m 5 C), 2'-O-methyl uridine, 2'-O-methyl uridine and 5-methylcytidine (m 5 C), N6-methyl adenosine (m 6 A), or N6-methyl adenosine 28. The method of any of items 29-45, comprising (m 6 A) and 5-methylcytidine (m 5 C).
(Item 47)
Pseudouridine (ψ), N1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcitosin, 2-thio-1-methyl-1-deazasudouridine, 2-thio-1-methylseudouridine, 2-thio-5-azauridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2-thiopseudouridine, 4-methoxy-2-thiopseudouridine, 4-methoxy Item 29, comprising pseudopseudouridine, 4-thio-1-methylpseudouridine, 4-thiopseudouridine, 5-azauridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, or 2'-O-methyluridine, or a combination thereof. The method according to any one of 46 to 46.
(Item 48)
The mRNA is 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudo-pseudouridine (ψ), α-thioguanosine, or α-thio. The method of any one of items 29-47, comprising adenosine, or a combination thereof.
(Item 49)
The method according to any one of items 29 to 48, wherein the microRNA binding site binds to microRNA expressed in myeloid cells.
(Item 50)
The method according to any one of items 29 to 48, wherein the microRNA binding site binds to microRNA expressed in plasmacytoid dendritic cells.
(Item 51)
The method according to any one of items 29 to 48, wherein the microRNA binding site binds to microRNA expressed in macrophages.
(Item 52)
The method according to any one of items 29 to 48, wherein the microRNA binding site is a miR-126 microRNA binding site.
(Item 53)
52. The method of item 52, wherein the miR-126 microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
(Item 54)
The method according to any one of items 29 to 48, wherein the microRNA binding site is a miR-142 microRNA binding site.
(Item 55)
54. The method of item 54, wherein the miR-142 microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
(Item 56)
The method according to any one of items 29 to 48, wherein the microRNA binding site is a miR-155 microRNA binding site.
(Item 57)
56. The method of item 56, wherein the miR-155 microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 35.
(Item 58)
28. The method of any one of items 29-57, wherein the polypeptide of interest is a Therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion protein.
(Item 59)
28. The method of any one of items 29-58, wherein the chemically modified mRNA comprises at least two microRNA binding sites.
(Item 60)
59. The method of item 59, wherein at least one of the microRNA binding sites is a miR-126 microRNA binding site.
(Item 61)
The chemically modified mRNA contains the miR-126 binding site, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR-21, miR. -22. The method of item 60, comprising a second microRNA binding site for miR selected from the group consisting of 223, miR-24, and miR-27.
(Item 62)
60. The method of item 60, wherein the chemically modified mRNA comprises a miR-126 binding site and a miR-142 binding site.
(Item 63)
41. The method of item 41, wherein the lipid nanoparticles are liposomes.
(Item 64)
41. The method of item 41, wherein the lipid nanoparticles comprise a cationic lipid and / or an ionized lipid.
(Item 65)
64. The method of item 64, wherein the cationic lipid and / or the ionized lipid is DLin-KC2-DMA or DLin-MC3-DMA.
(Item 66)
A method of reducing or inhibiting unwanted immune cell activation in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest, in the lipid nanoparticles (LNP) to the subject. A first dose of a chemically modified mRNA encapsulated in is intravenously administered, wherein the chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for microRNA expressed in an immune cell, said chemical. With a step in which the modified mRNA contains one or more modified nucleosides;
A step of intravenously administering to the subject a second dose of the chemically modified mRNA encapsulated in LNP so as to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells in the subject.
How to include.
(Item 67)
A method of reducing or inhibiting unwanted immune cell activation in a subject after repeated administration of the messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest to the subject.
(I) A step of intravenously administering to the subject a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), wherein the chemically modified mRNA is expressed in immune cells. Contains at least one microRNA binding site for microRNA
With a step in which the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleosides;
(Ii) A step of detecting the level of activation of immune cells in a sample derived from said subject;
(Iii) When the level of immune cell activation in the sample is reduced, the subject is encapsulated in LNP to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells in the subject. A second dose of the chemically modified mRNA is administered intravenously.
How to include.
(Item 68)
66 or 67. The method of item 66 or 67, wherein the reduction or inhibition of unwanted immune cell activation is reduction or inhibition of B cell activation.
(Item 69)
66 or 67. The method of item 66 or 67, wherein the reduction or inhibition of the undesired activation of immune cells causes a reduction or inhibition of cytokine production.
(Item 70)
A method for reducing or inhibiting the acceleration of blood clearance in a subject who has been repeatedly administered a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). The subject comprises the step of administering to the subject a chemically modified mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) to accelerate blood clearance in the subject after repeated doses. A method in which the chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for microRNA expressed in an immune cell and the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleosides so as to reduce or inhibit it. ..
(Item 71)
A method for reducing or inhibiting the acceleration of blood clearance in a subject to which a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP) has been administered. A step of intravenously administering to the body a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), wherein the chemically modified mRNA is at least relative to microRNA expressed in immune cells. With a step comprising one microRNA binding site, wherein the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases;
A step of intravenously administering to the subject a second dose of the chemically modified mRNA encapsulated in LNP so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject.
How to include.
(Item 72)
The mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) does not activate B cells and / or induce the production of IgM molecules capable of binding to the LNP. , The method according to any one of items 70 to 71.
(Item 73)
From item 70, the reduction or inhibition of accelerated blood clearance is determined in comparison to control administration of the chemically modified mRNA lacking at least one microRNA binding site encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). The method according to any one of 72.
(Item 74)
Item 70-73, wherein the acceleration of blood clearance is reduced or inhibited without corresponding reduction or inhibition of the expression of the polypeptide of interest encoded by the chemically modified mRNA. The method described.
(Item 75)
The method according to any one of items 70 to 74, wherein the interval between two consecutive doses is less than 2 weeks.
(Item 76)
The method of item 75, wherein the interval between two consecutive doses is less than one week.
(Item 77)
Reduces or inhibits the production of IgM molecules that recognize polyethylene glycol (PEG) in subjects repeatedly administered messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). The method comprises the step of administering to the subject a chemically modified mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), in the subject after repeated administration. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so that the production of the IgM molecule that recognizes PEG is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA is 1 or A method comprising multiple modified nucleobases.
(Item 78)
A method for reducing or inhibiting the production of IgM molecules that recognize polyethylene glycol (PEG) in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). It is a step of intravenously administering to the subject a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), wherein the chemically modified mRNA is expressed in immune cells. With a step comprising at least one microRNA binding site for the microRNA to be added, wherein the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases;
A step of intravenously administering to the subject a second dose of the chemically modified mRNA encapsulated in LNP so as to reduce or inhibit the production of PEG-recognizing IgM molecules in the subject.
How to include.
(Item 79)
The chemically modified mRNA is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, a 3'UTR containing said at least one microRNA binding site, and a 3'tailing region of the nucleoside linked. The method according to any one of items 70 to 78, comprising.
(Item 80)
79. The method of item 79, wherein the chemically modified mRNA comprises 5'UTRs and 3'UTRs that are heterologous to the open reading frame.
(Item 81)
The method according to any one of items 70 to 80, wherein the mRNA is completely modified.
(Item 82)
The mRNAs are pseudopseudouridine (ψ), pseudouridine (ψ) and 5-methylcytidine (m5C), 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 1-methylpseudouridine (m 1 ψ) and 5-methylcytidine. ( M 5 C), 2-thiouridine (s 2 U), 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5 C), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5 -Methylcytidine (m 5 C), 2'-O-methyl uridine, 2'-O-methyl uridine and 5-methylcytidine (m 5 C), N6-methyl adenosine (m 6 A), or N6-methyl adenosine The method according to any one of items 70 to 81, comprising (m 6 A) and 5-methylcytidine (m 5 C).
(Item 83)
Pseudouridine (ψ), N1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcitosin, 2-thio-1-methyl-1-deazasudouridine, 2-thio-1-methylseudouridine, 2-thio-5-azauridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2-thiopseudouridine, 4-methoxy-2-thiopseudouridine, 4-methoxy Item 70, comprising pseudopseudouridine, 4-thio-1-methylpseudouridine, 4-thiopseudouridine, 5-azauridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, or 2'-O-methyluridine, or a combination thereof. The method according to any one of 82 to 82.
(Item 84)
The mRNA is 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudo-pseudouridine (ψ), α-thioguanosine, or α-thio. The method of any one of items 70-83, comprising adenosine, or a combination thereof.
(Item 85)
The method according to any one of items 70 to 84, wherein the microRNA binding site binds to microRNA expressed in myeloid cells.
(Item 86)
The method according to any one of items 70 to 84, wherein the microRNA binding site is a miR-142 microRNA binding site.
(Item 87)
86. The method of item 86, wherein the miR-142 microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
(Item 88)
The method according to any one of items 70 to 84, wherein the microRNA binding site binds to microRNA expressed in plasmacytoid dendritic cells.
(Item 89)
The method according to any one of items 70 to 84, wherein the microRNA binding site is a miR-126 microRNA binding site.
(Item 90)
89. The method of item 89, wherein the miR-126 microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
(Item 91)
The method according to any one of items 70 to 84, wherein the microRNA binding site binds to microRNA expressed in macrophages.
(Item 92)
The method according to any one of items 70 to 84, wherein the microRNA binding site is a miR-155 microRNA binding site.
(Item 93)
92. The method of item 92, wherein the miR-155 microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 35.
(Item 94)
The method according to any one of items 70 to 93, wherein the polypeptide of interest is a Therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion protein.
(Item 95)
The method of any one of items 70-94, wherein the chemically modified mRNA comprises at least two microRNA binding sites.
(Item 96)
95. The method of item 95, wherein at least one of the microRNA binding sites is a miR-126 microRNA binding site.
(Item 97)
The chemically modified mRNA contains the miR-126 binding site, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR-21, miR. -22. The method of item 96, comprising a second microRNA binding site for miR selected from the group consisting of 223, miR-24, and miR-27.
(Item 98)
96. The method of item 96, wherein the chemically modified mRNA comprises a miR-126 binding site and a miR-142 binding site.
(Item 99)
The method according to any one of items 70 to 98, wherein the lipid nanoparticles are liposomes.
(Item 100)
The method according to any one of items 70 to 98, wherein the lipid nanoparticles contain a cationic lipid and / or an ionized lipid.
(Item 101)
100. The method of item 100, wherein the cationic lipid and / or the ionized lipid is DLin-KC2-DMA or DLin-MC3-DMA.
(Item 102)
A modified messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest, wherein the mRNA comprises at least two different microRNA (miR) binding sites, and the microRNA is in hematopoietic immune cells or in TLR7 and / Or an mRNA that expresses TLR8 and is expressed intracellularly that secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokine, wherein the mRNA comprises one or more modified nucleoside bases.
(Item 103)
Item 10. The mmRNA according to item 102, wherein the hematopoietic immune cells are lymphoid cells such as T cells, B cells, or NK cells.
(Item 104)
10. The mmRNA of item 102, wherein the hematopoietic immune cells are myeloid cells such as monocytes, macrophages, neutrophils, basophils, eosinophils, erythrocytes, dendritic cells, megakaryocytes, or platelets.
(Item 105)
The mmRNA according to item 102, wherein the hematopoietic immune cell is a hematopoietic progenitor cell.
(Item 106)
10. The mmRNA of item 102, wherein the cell expressing TLR7 and / or TLR8 and secreting pro-inflammatory cytokines and / or chemokines is an endothelial cell.
(Item 107)
The mRNA according to any one of items 102 to 106, wherein the microRNA is abundant within a cell type of the same purpose or within a cell type of a different purpose.
(Item 108)
The mRNA according to any one of items 102 to 106, wherein the microRNA is abundant within a plurality of cell types of interest.
(Item 109)
The mRNA comprises at least one first microRNA binding site of abundant microRNAs in hematopoietic immune cells and at least one second microRNA binding site of abundant microRNAs in endothelial cells. , Item 102.
(Item 110)
The mRNA comprises at least one first microRNA binding site of abundant microRNAs in B cells and at least one second microRNA binding site of abundant microRNAs in endothelial cells. , Item 102.
(Item 111)
The mRNA is at least one second microRNA of at least one first microRNA binding site of abundant microRNAs in plasmacytoid dendritic cells and abundant microRNAs in endothelial cells. 102. The mmRNA of item 102, comprising a binding site.
(Item 112)
The mRNA according to any one of items 102 to 111, comprising a plurality of copies of a first microRNA binding site and at least one copy of a second microRNA binding site.
(Item 113)
The mRNA of item 112, comprising two copies of the first microRNA binding site.
(Item 114)
The mRNA according to any one of items 102 to 111, comprising a first microRNA binding site and a second microRNA binding site of the same microRNA.
(Item 115)
The mRNA according to item 114, wherein the microRNA binding site is that of the same microRNA, 3p arm and 5p arm.
(Item 116)
The microRNAs are miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, and The mmRNA according to item 102, selected from the group consisting of miR-26a.
(Item 117)
The mRNA according to item 102, wherein the microRNA is selected from the group consisting of miR126-3p, miR-142-3p, miR-142-5p, and miR-155.
(Item 118)
The mRNA according to item 102, wherein the at least one microRNA binding site is the miR-126 binding site.
(Item 119)
The mRNA according to item 102, wherein the at least one microRNA binding site is the miR-142 binding site.
(Item 120)
One microRNA binding site is the miR-126 binding site, and the second microRNA binding site is miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, The mRNA according to item 102, which is for a microRNA selected from the group consisting of miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, and miR-27.
(Item 121)
102. The mmRNA of item 102, comprising at least one miR-126-3p binding site and at least one miR-142-3p binding site.
(Item 122)
102. The mmRNA of item 102, comprising at least one miR-142-3p binding site and at least one miR-142-5p binding site.
(Item 123)
The mRNA according to item 102, which comprises at least three different microRNA binding sites, wherein at least one of the microRNA binding sites is a miR-126 binding site.
(Item 124)
The mRNA according to item 102, which comprises at least three different microRNA binding sites, wherein at least one of the microRNA binding sites is a miR-142 binding site.
(Item 125)
At least one miR-126-3p binding site, at least one miR-142-3p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, The mRNA according to item 102, comprising a third microRNA binding site for microRNA selected from the group consisting of miR-24, and miR-27.
(Item 126)
102. The mmRNA of item 102, comprising at least one miR-126-3p binding site, at least one miR-142-3p binding site, and at least one miR-155 binding site.
(Item 127)
Item 102 comprising at least one miR-126-3p binding site, at least one miR-142-3p binding site, at least one miR-142-5p binding site, and at least one miR-155 binding site. The mmRNA described in.
(Item 128)
The mRNA according to any of the preceding items, wherein the microRNA binding site is located within the 5'UTR, 3'UTR, or both within the 5'UTR and 3'UTR of the mRNA.
(Item 129)
138. The mRNA of item 128, wherein the microRNA binding site is located within the 3'UTR of the mRNA.
(Item 130)
138. The mRNA of item 128, wherein the microRNA binding site is located within the 5'UTR of the mRNA.
(Item 131)
138. The mRNA of item 128, wherein the microRNA binding site is located both in the 5'UTR and in the 3'UTR of the mRNA.
(Item 132)
138. The mRNA of item 128, wherein the at least one microRNA binding site is located within the 3'UTR immediately adjacent to the stop codon in the coding region of the mRNA.
(Item 133)
138. The mRNA of item 128, wherein the at least one microRNA binding site is located within the 3'UTR 70-80 bases downstream of the stop codon in the coding region of the mRNA.
(Item 134)
138. The mRNA of item 128, wherein the at least one microRNA binding site is located within the 5'UTR directly preceding the start codon of the coding region of the mRNA.
(Item 135)
138. The mRNA of item 128, wherein the at least one microRNA binding site is located within the 5'UTR, which precedes the initiation codon of the coding region of the mRNA by 15-20 nucleotides.
(Item 136)
138. The mRNA of item 128, wherein the at least one microRNA binding site is located within the 5'UTR that precedes the start codon of the coding region of the mRNA by 70-80 nucleotides.
(Item 137)
Included in Item 128, which comprises multiple copies of the same microRNA binding site that are directly adjacent to each other or located with spacers of less than 5 nucleotides, 5-10, 10-15, or 15-20 nucleotides. MmRNA.
(Item 138)
Containing multiple copies of the same microRNA binding site located within the 3'UTR, the first microRNA binding site is located immediately adjacent to the termination codon and the second microRNA binding site. 138. The mRNA of item 128, wherein the site and the third microRNA binding site are located 30-40 bases downstream of the first microRNA binding site.
(Item 139)
The first of the first microRNA binding sites, comprising two copies of the first microRNA binding site and one copy of the second microRNA binding site located within the 3'UTR. The copy of is located immediately adjacent to the termination codon and the second microRNA binding site is located 30-40 bases downstream of the first copy of the first microRNA binding site. 138. The mRNA of item 128, wherein the second copy of the first microRNA binding site is located 30-40 bases downstream of the second microRNA binding site.
(Item 140)
The mmRNA according to any of the preceding items, wherein the mmRNA is fully modified.
(Item 141)
Pseudouridine (ψ), pseudouridine (ψ) and 5-methylcytidine (m5C), 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 1-methylpseudouridine (m 1 ψ) and 5 - methylcytidine (m 5C ) ), 2-thiouridine (s 2 U), 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5 C), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5-methylcytidine ( m 5 C), 2'-O-methyluridine, 2'-O-methyluridine and 5-methylcytidine (m 5 C), N6-methyladenosine ( m6A ), or N6-methyladenosine ( m6A ) ) And 5-methylcytidine (m 5C ), according to any of the preceding items.
(Item 142)
Pseudouridine (ψ), N1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcytosine, 2-thio-1-methyl-1-deazasudouridine, 2-thio- 1-methylseudouridine, 2-thio-5-azauridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2-thiopseudouridine, 4-methoxy-2-thiopseudouridine, 4-methoxypseudouridine, 4 -One of the preceding items, including thio-1-methylseudouridine, 4-thiopseudouridine, 5-azauridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, or 2'-O-methylseudouridine, or a combination thereof. The mmRNA described in.
(Item 143)
1-Methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudopseudouridine (ψ), α-thioguanosine, or α-thioadenosine, or these. The mmRNA according to any of the preceding items, including the combination of.
(Item 144)
The mmRNA according to any of the preceding items, wherein the polypeptide of interest is a Therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion protein.
(Item 145)
Lipid nanoparticles comprising the mmRNA described in any of the preceding items.
(Item 146)
145. The lipid nanoparticles of item 145, comprising liposomes.
(Item 147)
145. The lipid nanoparticles of item 145, comprising cationic lipids and / or ionized lipids.
(Item 148)
147. The lipid nanoparticle according to Item 147, wherein the cationic lipid and / or the ionized lipid is DLin-KC2-DMA or DLin-MC3-DMA.
(Item 149)
The mmRNA according to any one of items 102 to 144, or the lipid nanoparticles according to any one of items 145 to 148, and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient. Pharmaceutical composition.
(Item 150)
Any of items 102-144 for use in reducing or inhibiting an anti-drug antibody response, or inhibiting drug-related toxicity in a subject in need of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response, or inhibiting drug-related toxicity. The mmRNA according to item 1, the lipid nanoparticle according to any one of items 145 to 148, or the pharmaceutical composition according to item 149.
(Item 151)
Reduction or inhibition of unwanted immune cell activation, or reduction or inhibition of unwanted immune cell activation, or reduction of unwanted cytokine production in subjects requiring reduction or inhibition of unwanted cytokine production Alternatively, the mRNA according to any one of items 102 to 144, the lipid nanoparticles according to any one of items 145 to 148, or the pharmaceutical composition according to item 149 for use in inhibition.
(Item 152)
145. The mmRNA of any one of items 102 to 144 for use in reducing or inhibiting the acceleration of blood clearance in a subject in need of reducing or inhibiting the acceleration of blood clearance. The lipid nanoparticles according to any one of 148 to 148, or the pharmaceutical composition according to item 149.
(Item 153)
Items 102 to 144 for use in reducing or inhibiting the production of polyethylene glycol (PEG) -recognizing IgM molecules in subjects in need of reducing or inhibiting the production of polyethylene glycol (PEG) -recognizing IgM molecules. The mmethylene according to any one of the above items, the lipid nanoparticles according to any one of items 145 to 148, or the pharmaceutical composition according to the item 149.

図１は、表示の用量の、ｈＥＰＯをコードする（しかし、ｍｉＲ結合部位を欠く）ｍｍＲＮＡ、または陽性対照としての組換えｈＥＰＯタンパク質で処置されたカニクイザルにおける、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質のレベルであって、表示の処置日における注入の６時間後におけるレベルを示す棒グラフである。FIG. 1 shows the levels of human erythropoietin (hEPO) protein in cynomolgus monkeys treated with the indicated doses of mmRNA encoding hEPO (but lacking the miR binding site) or recombinant hEPO protein as a positive control. It is a bar graph showing the level 6 hours after the infusion on the indicated treatment day.

図２は、３’ＵＴＲ内にｍｉＲ部位の挿入を伴わないｍＲＮＡ構築物、および３’ＵＴＲ内にｍｉＲ部位を挿入したｍＲＮＡ構築物についての概略図である。FIG. 2 is a schematic diagram of an mRNA construct without the insertion of a miR site in the 3'UTR and an mRNA construct with a miR site inserted in the 3'UTR.

図３は、ＰＢＳ、またはｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかもしくは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたカニクイザルにおける抗ｈＥＰＯ抗体レベルを比較するグラフである。抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答について陽性の動物が指し示される。FIG. 3 is a cynomolgus monkey treated with 0.2 mg / kg mmRNA, which is an mmRNA encoding PBS, or hEPO, lacking or containing a miR-142-3p binding site in the 3'UTR of the construct. It is a graph which compares the anti-hEPO antibody level in. Animals that are positive for anti-drug antibody (ADA) response are pointed to.

図４Ａ～Ｃは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．０５ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおけるタンパク質の発現レベル（図４Ａ）、Ｂ細胞の頻度（図４Ｂ）、および活性化Ｂ細胞の頻度（図４Ｃ）を示すグラフである。4A-C show the mmRNA encoding hEPO with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. Protein expression levels in mice treated with 0.05 mg / kg mm mRNA, which are deficient or contained within (FIG. 4A), frequency of B cells (FIG. 4B), and frequency of activated B cells (FIG. 4C). It is a graph which shows.

図５Ａ～Ｂは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇ（図５Ａ）または１ｍｇ／ｋｇ（図５Ｂ）のｍｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスについて、タンパク質の発現レベルを示すグラフである。5A-B are m mRNAs encoding hEPO, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. FIG. 6 is a graph showing protein expression levels for mice treated with a single dose of 0.2 mg / kg (FIG. 5A) or 1 mg / kg (FIG. 5B) m mRNA, which is lacking or contained within.

図６Ａ～Ｂは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇ（図６Ａ）または１ｍｇ／ｋｇ（図６Ｂ）のｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスについて、タンパク質の発現レベルを示すグラフである。6A-B are m mRNAs encoding hEPO, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. FIG. 6 is a graph showing protein expression levels for mice treated with two doses of 0.2 mg / kg (FIG. 6A) or 1 mg / kg (FIG. 6B) m mRNA, which is lacking or contained within.

図７は、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、表示の用量（０．２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ）のｍｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスの、Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 7 is an m mRNA encoding hEPO with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. A graph showing the frequency of B cells in mice treated with a single dose of the indicated dose (0.2 mg / kg, or 1 mg / kg) of mmRNA, which is lacking or contained, is presented.

図８は、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、表示の用量（０．２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ）のｍｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスの、活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 8 is an m mRNA encoding hEPO with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. A graph showing the frequency of activated B cells in mice treated with a single dose of the indicated dose (0.2 mg / kg, or 1 mg / kg) of mmRNA, which is lacking or contained, is presented.

図９は、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、表示の投与量（０．２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ）のｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスの、Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 9 is an m mRNA encoding hEPO with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. A graph showing the frequency of B cells in mice treated with two doses of the indicated dose (0.2 mg / kg, or 1 mg / kg) of mmRNA, which is lacking or contained, is presented.

図１０は、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、表示の投与量（０．２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ）のｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスの、活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 10 is an m mRNA encoding hEPO with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. A graph showing the frequency of activated B cells in mice treated with two doses of the indicated dose (0.2 mg / kg, or 1 mg / kg) of mmRNA, which is lacking or contained, is presented.

図１１Ａ～Ｂは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇ（図１１Ａ）または１ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｂ）のｍｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスにおけるＩＬ－６レベルを示すグラフである。11A-B are m mRNAs encoding hEPO, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. FIG. 6 is a graph showing IL-6 levels in mice treated with a single dose of 0.2 mg / kg (FIG. 11A) or 1 mg / kg (FIG. 11B) m mRNA lacking or contained within.

図１２Ａ～Ｂは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇ（図１２Ａ）または１ｍｇ／ｋｇ（図１２Ｂ）のｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスにおけるＩＬ－６レベルを示すグラフである。12A-B are m mRNAs encoding hEPO, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. FIG. 6 is a graph showing IL-6 levels in mice treated with two doses of 0.2 mg / kg (FIG. 12A) or 1 mg / kg (FIG. 12B) m mRNA, which is lacking or contained within.

図１３Ａ～Ｃは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスにおける、ＩＬ－６レベル（図１３Ａ）、ＴＮＦ－αレベル（図１３Ｂ）、およびＩＦＮ－γレベル（図１３Ｃ）を示すグラフである。13A-C are m mRNAs encoding hEPO, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. IL-6 levels (FIG. 13A), TNF-α levels (FIG. 13B), and IFN-γ levels in mice treated with two doses of 0.2 mg / kg mRNA lacking or containing within. It is a graph which shows (FIG. 13C).

図１４Ａ～Ｃは、ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、１ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡの２回の投与で処置されたマウスにおける、ＩＬ－６レベル（図１４Ａ）、ＴＮＦ－αレベル（図１４Ｂ）、およびＩＦＮ－γレベル（図１４Ｃ）を示すグラフである。14A-C are m mRNAs encoding hEPO, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. IL-6 levels (FIG. 14A), TNF-α levels (FIG. 14B), and IFN-γ levels (FIG. 14B) in mice treated with two doses of 1 mg / kg mRNA lacking or containing within. It is a graph which shows 14C).

図１５Ａ～Ｂは、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、１週間（図１５Ａ）または２週間（図１５Ｂ）にわたり処置されたマウスにおける全身の発光により測定される、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の発現レベルを示すグラフである。FIGS. 15A-B are m mRNAs encoding Luc, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. Expression of luciferase (Luc) as measured by systemic luminescence in mice treated for 1 week (FIG. 15A) or 2 weeks (FIG. 15B) with 0.2 mg / kg mRNA lacking or contained within. It is a graph which shows a level.

図１６は、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける全Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 16 is an m mRNA encoding Luc, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. A graph showing the frequency of total B cells in mice treated with 0.2 mg / kg mm mRNA, which is deficient or contained, is presented.

図１７は、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 17 is an m mRNA encoding Luc, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. A graph showing the frequency of activated B cells in mice treated with 0.2 mg / kg mm mRNA, which is deficient or contained, is presented.

図１８Ａ～Ｃは、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ－６レベル（図１８Ａ）、ＴＮＦ－αレベル（図１８Ｂ）、およびＩＦＮ－γレベル（図１８Ｃ）を示すグラフである。FIGS. 18A-C are m mRNAs encoding Luc, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. IL-6 levels (FIG. 18A), TNF-α levels (FIG. 18B), and IFN-γ levels secreted in mice treated with 0.2 mg / kg mRNA, which are deficient or contained within (FIG. 18A). It is a graph which shows 18C). 図１８Ａ～Ｃは、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ－６レベル（図１８Ａ）、ＴＮＦ－αレベル（図１８Ｂ）、およびＩＦＮ－γレベル（図１８Ｃ）を示すグラフである。FIGS. 18A-C are m mRNAs encoding Luc, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. IL-6 levels (FIG. 18A), TNF-α levels (FIG. 18B), and IFN-γ levels secreted in mice treated with 0.2 mg / kg mRNA, which are deficient or contained within (FIG. 18A). It is a graph which shows 18C).

図１９Ａ～Ｂは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、１週間（図１９Ａ）または２週間（図１９Ｂ）にわたり処置されたマウスの、血清中のＥＰＯの発現レベルを示すグラフである。19A-B are m mRNAs encoding EPO, lacking a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies or combinations thereof. It is a graph showing the expression level of EPO in serum of mice treated with 0.2 mg / kg mm forg for 1 week (FIG. 19A) or 2 weeks (FIG. 19B) containing, or containing.

図２０は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、１週間にわたり処置されたマウスにおける全Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 20 is an EPO-encoding mm mRNA that lacks or lacks a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies or combinations thereof. A graph showing the frequency of total B cells in mice treated for 1 week with 0.2 mg / kg m mRNA contained is presented.

図２１は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、１週間にわたり処置されたマウスにおける活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 21 is an EPO-encoding mm mRNA that lacks or lacks a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies or combinations thereof. A graph showing the frequency of activated B cells in mice treated for 1 week with 0.2 mg / kg m mRNA contained is presented.

図２２は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおける全Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 22 is an EPO-encoding mm mRNA that lacks or lacks a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies or combinations thereof. A graph showing the frequency of total B cells in mice treated for 2 weeks with 0.2 mg / kg m mRNA contained is presented.

図２３は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおける活性化Ｂ細胞の頻度を示すグラフを提示する。FIG. 23 is an EPO-encoding mm mRNA that lacks or lacks a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies or combinations thereof. A graph showing the frequency of activated B cells in mice treated for 2 weeks with 0.2 mg / kg m mRNA contained is presented.

図２４Ａ～Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ－６レベル（図２４Ａ）、ＴＮＦ－αレベル（図２４Ｂ）、およびＩＦＮ－γレベル（図２４Ｃ）を示すグラフである。24A-C are m mRNAs encoding EPO, lacking a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies or combinations thereof. IL-6 levels (FIG. 24A), TNF-α levels (FIG. 24B), and IFN-γ levels (FIG. 24B), which are secreted in mice treated for 2 weeks with 0.2 mg / kg mRNA, which contains, or contains. It is a graph which shows FIG. 24C). 図２４Ａ～Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ－６レベル（図２４Ａ）、ＴＮＦ－αレベル（図２４Ｂ）、およびＩＦＮ－γレベル（図２４Ｃ）を示すグラフである。24A-C are m mRNAs encoding EPO, lacking a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies or combinations thereof. IL-6 levels (FIG. 24A), TNF-α levels (FIG. 24B), and IFN-γ levels (FIG. 24B), which are secreted in mice treated for 2 weeks with 0.2 mg / kg mRNA, which contains, or contains. It is a graph which shows FIG. 24C). 図２４Ａ～Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、またはこれらの複数のコピーもしくは組合せを欠くか、または含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、２週間にわたり処置されたマウスにおいて分泌される、ＩＬ－６レベル（図２４Ａ）、ＴＮＦ－αレベル（図２４Ｂ）、およびＩＦＮ－γレベル（図２４Ｃ）を示すグラフである。24A-C are m mRNAs encoding EPO, lacking a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies or combinations thereof. IL-6 levels (FIG. 24A), TNF-α levels (FIG. 24B), and IFN-γ levels (FIG. 24B), which are secreted in mice treated for 2 weeks with 0.2 mg / kg mRNA, which contains, or contains. It is a graph which shows FIG. 24C).

図２５Ａ～Ｂは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位またはｍｉＲ－１４２、およびｍｉＲ－１２６結合部位を欠くか、または含有するｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける脾臓ＣＤ１９＋Ｂ細胞中のＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率（図２５Ａ）およびＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞内のＣＤ２７の発現レベル（図２５Ｂ）を示すグラフである。25A-B are mice encoding EPOs that are treated with mmRNAs that lack or contain the miR-142 binding site, miR-126 binding site or miR-142, and miR-126 binding site. FIG. 2 is a graph showing the percentage of CD27 + CD19 + B cells in spleen CD19 + B cells (FIG. 25A) and the expression level of CD27 + CD19 + B cells in CD27 + CD19 + B cells (FIG. 25B).

図２６Ａ～Ｂは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位またはｍｉＲ－１４２、およびｍｉＲ－１２６結合部位を欠くか、または含有するｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける脾臓細胞中の全ＣＤ１１ｃ＋細胞の頻度（図２６Ａ）および活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞）の百分率（図２６Ｂ）を示すグラフである。26A-B are m mRNAs encoding EPO, mice treated with mmRNAs lacking or containing miR-142 binding sites, miR-126 binding sites or miR-142, and miR-126 binding sites. FIG. 6 is a graph showing the frequency of total CD11c + cells in spleen cells (FIG. 26A) and the percentage of activated dendritic cells (CD11c + CD70 + CD86 + cells) (FIG. 26B).

図２７は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位またはｍｉＲ－１４２、およびｍｉＲ－１２６結合部位を欠くか、または含有するｍｍＲＮＡで処置されたマウスから単離された形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の存在下における、ナイーブＢ細胞の成長レベルを示すグラフを提示する。FIG. 27 is an EPO-encoding mm mRNA from a mouse treated with an mmRNA that lacks or contains a miR-142 binding site, a miR-126 binding site or a miR-142, and a miR-126 binding site. A graph showing the growth level of naive B cells in the presence of isolated plasmacytoid dendritic cells (pDC) is presented.

図２８Ａ～Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位またはｍｉＲ－１４２、およびｍｉＲ－１２６結合部位を欠くか、または含有する、２回の投与（図２８Ａ）、３回の投与（図２８Ｂ）、または４回の投与（図２８Ｃ）のｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける、血清抗ＰＥＧ ＩｇＭ抗体のレベルを示すグラフである。28A-C are two doses of m mRNA encoding EPO, lacking or containing a miR-142 binding site, a miR-126 binding site or a miR-142, and a miR-126 binding site ( FIG. 28A) is a graph showing serum anti-PEG IgM antibody levels in mice treated with mmRNAs in 3 doses (FIG. 28B) or 4 doses (FIG. 28C). 図２８Ａ～Ｃは、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位またはｍｉＲ－１４２、およびｍｉＲ－１２６結合部位を欠くか、または含有する、２回の投与（図２８Ａ）、３回の投与（図２８Ｂ）、または４回の投与（図２８Ｃ）のｍｍＲＮＡで処置されたマウスにおける、血清抗ＰＥＧ ＩｇＭ抗体のレベルを示すグラフである。28A-C are two doses of m mRNA encoding EPO, lacking or containing a miR-142 binding site, a miR-126 binding site or a miR-142, and a miR-126 binding site ( FIG. 28A) is a graph showing serum anti-PEG IgM antibody levels in mice treated with mmRNAs in 3 doses (FIG. 28B) or 4 doses (FIG. 28C).

図２９は、ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、６週間にわたり処置されたマウスの、血清中のＥＰＯの発現レベルを示すグラフを提示する。FIG. 29 is an EPO-encoding mm mRNA with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. A graph showing the expression level of EPO in serum of mice treated for 6 weeks with 0.2 mg / kg mRNA lacking or containing is presented.

図３０は、ＬｕｃをコードするｍｍＲＮＡであって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲ内に欠くかまたは含有する、０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで、５週間にわたり処置されたマウスの、血清中のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の発現レベルを示すグラフを提示する。FIG. 30 is an m mRNA encoding Luc, with both the miR-142-3p binding site, the miR-126 binding site, or the miR-142-3p and miR-126 binding sites in the 3'UTR of the construct. A graph showing serum luciferase (Luc) expression levels in mice treated for 5 weeks with 0.2 mg / kg mRNA lacking or containing is presented.

図３１Ａ～Ｄは、７．５ｎｇ（図３１Ａ）、１５ｎｇ（図３１Ｂ）、５０ｎｇ（図３１Ｃ）または１００ｎｇ（図３１Ｄ）の用量の、ＬＮＰ内の、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ構築物と、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ構築物との等モル混合物であって、ｍＲＮＡ構築物が、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、１Ｘ ｍｉＲ－１２２結合部位もしくは３Ｘ ｍｉＲ－１２２結合部位を含有するか、またはｅＧＦＰ配列およびＬｕｃ配列と類似する配列を伴う推定ｍＲＮＡ（対照）を含有する、等モル混合物をトランスフェクトされた初代肝細胞内の、ｅＧＦＰの発現レベルを示すグラフである。31A-D show the Luc mRNA constructs and eGFP mRNA constructs in LNP at doses of 7.5 ng (FIG. 31A), 15 ng (FIG. 31B), 50 ng (FIG. 31C) or 100 ng (FIG. 31D), etc. A molar mixture in which the mRNA construct does not contain a recognizable miR site (control), contains a 1X miR-122 binding site or a 3X miR-122 binding site, or is similar to the eGFP and Luc sequences. FIG. 6 is a graph showing the expression level of eGFP in primary hepatocytes transfected with an equimolar mixture containing putative mRNA (control) with sequence.

図３２Ａ～Ｄは、７．５ｎｇ（図３２Ａ）、１５ｎｇ（図３２Ｂ）、５０ｎｇ（図３２Ｃ）または１００ｎｇ（図３２Ｄ）の用量の、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、１Ｘ ｍｉＲ－１２２結合部位もしくは３Ｘ ｍｉＲ－１２２結合部位を含有するか、またはカスパーゼ様配列を伴う推定ｍＲＮＡであって、開始コドンを伴わない推定ｍＲＮＡ（対照）を含有する、カスパーゼｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトされた初代肝細胞の、コンフルエント相パーセント（カスパーゼ媒介毒性の尺度としての）を示すグラフである。32A-D do not contain recognizable miR sites (control) at doses of 7.5 ng (FIG. 32A), 15 ng (FIG. 32B), 50 ng (FIG. 32C) or 100 ng (FIG. 32D) or 1X miR. A caspase mRNA construct containing a -122 binding site or a 3X miR-122 binding site or a presumed mRNA with a caspase-like sequence and no start codon (control) was transfected. It is a graph which shows the confluent phase percent (as a measure of caspase-mediated toxicity) of primary hepatocytes.

図３３は、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、１Ｘ ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含有するか、または３Ｘ ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含有するｍＲＮＡ構築物を投与されたカニクイザルにおける、ｈＥＰＯの発現レベルを示すグラフを提示する。FIG. 33 shows cynomolgus monkeys receiving an mRNA construct that does not contain a recognizable miR site (control), contains a 1X miR-142-3p binding site, or contains a 3X miR-142-3p binding site. , A graph showing the expression level of hEPO is presented.

図３４は、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、３’ＵＴＲ内のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位（１Ｘまたは３Ｘ）、５’ＵＴＲ内のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位（Ｐ１、Ｐ２またはＰ３に挿入された）、または３’ＵＴＲ内および５’ＵＴＲ内の両方におけるｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含有するｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７細胞内の、ｅＧＦＰの発現レベルを示す棒グラフを提示する。FIG. 34 does not contain a recognizable miR site (control) or has a miR-142-3p binding site (1X or 3X) in the 3'UTR and a miR-142-3p binding site in the 5'UTR (P1, Levels of expression of eGFP in RAW264.7 cells transfected with an mRNA construct containing a miR-142-3p binding site (inserted into P2 or P3), or both in 3'UTRs and 5'UTRs. A bar graph showing is presented.

図３５は、認識可能なｍｉＲ部位を含有しない（対照）か、３’ＵＴＲ内のｍｉＲ－１２２結合部位（１Ｘまたは３Ｘ）、５’ＵＴＲ内のｍｉＲ－１２２結合部位（Ｐ１、Ｐ２またはＰ３に挿入された）、または３’ＵＴＲ内および５’ＵＴＲ内の両方におけるｍｉＲ－１２２結合部位を含有するｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトされた初代肝細胞内の、ｈＥＰＯの発現レベルを示す棒グラフを提示する。FIG. 35 does not contain a recognizable miR site (control) or has a miR-122 binding site (1X or 3X) in the 3'UTR and a miR-122 binding site (P1, P2 or P3) in the 5'UTR. A bar graph showing the expression level of hEPO in primary hepatocytes transfected with an mRNA construct containing the miR-122 binding site in both the inserted) or in the 3'UTR and 5'UTR is presented.

タンパク質ベースの治療薬の臨床的使用と関連する１つの課題は、患者の免疫系が治療剤に対する抗体を発生させる、望ましくない抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答の発達である（総説については、例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍ， Ｍ．（２００６年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．、３巻：１５１～１５６頁；Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ， Ａ．Ｓ．およびＳｃｏｔｔ， Ｄ．Ｗ．（２００７年）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻：４８２～４９０頁；Ｎｅｃｈａｎｓｋｙ， Ａ．およびＫｉｒｃｈｅｉｓ， Ｒ．（２０１０年）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ． Ｄｉｓｃｏｖ．、５巻：１０６７～１０７９頁を参照されたい）。ＡＤＡ応答の発達は、組換え抗体による生物学的薬剤および抗体以外の生物学的薬剤のいずれについても報告されている（例えば、Ｂｒｉｃｋｅｌｍａｉｅｒ， Ｍ．ら（１９９９年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２２７巻：１２１～１３５頁；Ｒｕｆ， Ｐ．ら（２０１０年）、Ｂｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６９巻：６１７～６２５頁；Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ， Ｍ．ら（２０１３年）、Ｍｕｌｔ． Ｓｃｌｅｒ．、１９巻：７５７～７６４頁を参照されたい）。ＡＤＡ応答は、治療剤の効果に干渉するかまたはこれを中和し、これにより、薬物動態および効能に影響を及ぼしうる。中和抗体（ＮＡＢ）は一般に、中和しない結合抗体（ＢＡＢ）より重要であるが、いずれも、臨床的帰結をもたらしうる。 One challenge associated with the clinical use of protein-based therapeutics is the development of unwanted anti-drug antibody (ADA) responses in which the patient's immune system develops antibodies against the therapeutic agent (for review, eg, eg, Subramanyama, M. (2006), J. Immunotoxicol., Vol. 3, pp. 151-156; De Groot, AS and Scott, D.W. (2007), Trends Immunol., Vol. 28: 482- 490 pages; See Chansky, A. and Kircheis, R. (2010), Expert Opin. Drug. Discov., Volume 5, pp. 1067-1079). The development of ADA responses has been reported for both biologics with recombinant antibodies and non-antibody biologics (eg, Brickelmaier, M. et al. (1999), J. Immunol., Methods, et al. Vol. 227: pp. 121-135; Ruf, P. et al. (2010), Br. J. Clin. Pharmacol., Vol. 69: pp. 617-625; Lundkvist, M. et al. (2013), Multi. Volume 19: pp. 757-764). The ADA response can interfere with or neutralize the efficacy of the therapeutic agent, thereby affecting its pharmacokinetics and efficacy. Neutralizing antibodies (NABs) are generally more important than non-neutralizing binding antibodies (BABs), but both can have clinical consequences.

さらに、アレルギー反応、補体の活性化、および他の有害事象も、ＡＤＡの発達と関連し、これにより、薬物の安全性に影響を及ぼすことが多い。したがって、ＡＤＡは、生物学的薬剤を、長期にわたる処置のために使用する能力における重要な因子である。 In addition, allergic reactions, complement activation, and other adverse events are also associated with the development of ADA, which often affects drug safety. Therefore, ADA is an important factor in the ability of biological agents to be used for long-term treatment.

修飾ｍＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の、治療剤としての使用は、タンパク質ベースの治療薬に対する、魅力的な代替法をもたらす。ｍＲＮＡ治療薬は、タンパク質ベースの治療技術を上回る、例えば、コードされるタンパク質特徴に対する忠実度（タンパク質は、身体自身の翻訳装置により産生されるため）、高感度で微調整可能な薬物動態プロファイル（タンパク質発現は、一過性とすることが可能であることから、一部の治療法では、薬物動態および投与を良好に制御するのに好適でありうる）、優れた安全性プロファイル（多様なワクチン臨床試験において明らかにされている）、核への移動を必要としない細胞質内の機能性であって、ｍＲＮＡ投与のほぼ直後において、タンパク質翻訳を結果としてもたらすことから、ゲノムへの組入れの危険性を排するほか、製造の容易さであり、例えば、ｍＲＮＡを、多様で一般的な、ｉｎ ｖｉｔｒｏ過程、例えば、生物を必要としない、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写反応により産生する容易さももたらす機能性を含む、いくつかの利点をもたらす。さらに、ｍＲＮＡは、例えば、ワクチン適用において、セルフアジュバンティング特性を有するようにデザインすることもでき、例えば、治療適用において、免疫原性の活性化を回避するようにデザインすることもできる。しかし今や、特に、ｍＲＮＡの投与が、コードされるタンパク質の、免疫細胞内、例えば、脾臓内の発現を、直接的または間接的にもたらす場合に、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与はまた、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質に対する抗薬物抗体応答の発達ももたらしうることが発見されている。しかし、驚くべきことに、免疫細胞内（例えば、末梢リンパ系器官の免疫細胞内および／または脾細胞内）で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位の、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への組込みが、ｍＲＮＡを、被験体に投与する場合における、目的のタンパク質に対する抗薬物抗体応答を低減しうることも裏付けられている。 The therapeutic use of modified mRNAs, such as mRNA (m mRNA), provides an attractive alternative to protein-based therapeutic agents. mRNA therapeutics surpass protein-based therapeutic techniques, eg, fidelity to encoded protein features (because the protein is produced by the body's own translation device), sensitive and fine-tunable pharmacokinetic profile (because the protein is produced by the body's own translation device). Since protein expression can be transient, some treatments may be suitable for good control of pharmacokinetics and administration), excellent safety profile (various vaccines). Risk of incorporation into the genome, as it is an intracellular functionality that does not require translocation to the nucleus (as evidenced in clinical trials) and results in protein translation almost immediately after mRNA administration. In addition to the elimination of proteins, it also includes functionality that provides ease of production, eg, mRNA by diverse and general in vitro processes, eg, organism-free, transcriptional reactions in vivo. , Brings some advantages. In addition, mRNA can be designed, for example, to have self-adjuvant properties in vaccine applications and, for example, to avoid immunogenic activation in therapeutic applications. But now, especially when administration of mRNA directly or indirectly results in the expression of the encoded protein in immune cells, eg, in the spleen, administration of mRNA encoding the protein of interest also also. It has been discovered that it can also lead to the development of anti-drug antibody responses to proteins encoded by mRNA. However, surprisingly, the protein of interest at the site of at least one microRNA (miRNA) binding to miR expressed in immune cells (eg, in immune cells and / or splenic cells of peripheral lymphoid organs). It is also supported that integration into the encoding mRNA (mRNA) can reduce the anti-drug antibody response to the protein of interest when the mRNA is administered to a subject.

したがって、本開示は、特に、脾臓など、免疫系組織内の転写後調節により、目的のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害するための方法を提示する。本開示はまた、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位の、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）への組込みにより、被験体における薬物関連毒性を低減する方法も提示する。本開示の方法で使用される好ましいマイクロＲＮＡ結合部位は、免疫細胞内（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞の免疫細胞内）で、夥多に、または優先的に発現するｍｉＲに結合するマイクロＲＮＡ結合部位である。特に好ましいマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対するものである。別の特に好ましいマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に対するものである。 Accordingly, the present disclosure presents methods for reducing or inhibiting an anti-drug antibody (ADA) response to a protein of interest, in particular by post-transcriptional regulation within immune system tissues such as the spleen. The present disclosure also exhibits drug-related toxicity in a subject by integration of at least one microRNA (miRNA) binding site into an mRNA encoding a protein of interest (eg, mRNA) for miR expressed in immune cells. It also presents ways to reduce it. Preferred microRNA binding sites used in the methods of the present disclosure are abundantly or preferentially expressed miRs within immune cells (eg, within immune cells of peripheral lymphoid organs and / or splenocytes). It is a microRNA binding site. A particularly preferred microRNA binding site is for miR-142-3p. Another particularly preferred microRNA binding site is for miR-126.

実施例１で記載される通り、カニクイザルに、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするｍｍＲＮＡ構築物を投与するｉｎ ｖｉｖｏ研究は、動物におけるｈＥＰＯレベルが、時間経過にわたり低下するという観察をもたらした。さらに、網状赤血球減少症および骨髄における造血の低減もまた観察された。これらの結果は、動物において抗薬物抗体が発生する可能性を示唆し、これは、血清についてのＥＬＩＳＡ解析により確認された。いかなる形でも理論に束縛されないが、研究において使用されるｍＲＮＡ送達系（脂質ナノ粒子であるＬＮＰを使用する）による先行見聞は、ｍＲＮＡが、主に、肝臓に分布するが、また、脾臓にも分布し、したがって、この分布は、ｍＲＮＡによりコードされる、制作されるタンパク質に対する免疫の強化をもたらしうることを裏付けた。ここでもまた、理論または機構に束縛されないが、脾臓内でなされる、コードされるタンパク質（血流を介する直接的な送達による、脾臓へのＬＮＰ分布に基づき送達されるか、または特化した抗原提示細胞を介して間接的に送達された）の発現は、適切なエピトープ（すなわち、目的のタンパク質に由来する）の、Ｔ細胞への提示を介する、Ｔ細胞依存性の抗体産生をもたらしうる可能性がある。 In vivo studies of administering to cynomolgus monkeys an mMV construct encoding human erythropoietin (hEPO), as described in Example 1, resulted in the observation that hEPO levels in animals decline over time. In addition, reticulocytopenia and reduced hematopoiesis in the bone marrow were also observed. These results suggest that anti-drug antibodies may develop in animals, which was confirmed by ELISA analysis of sera. Although not bound by theory in any way, the prior observations by the mRNA delivery system used in the study (using the lipid nanoparticles LNP) indicate that mRNA is predominantly distributed in the liver, but also in the spleen. It was distributed, thus supporting that this distribution could result in enhanced immunity to the protein produced, encoded by mRNA. Again, without being bound by theory or mechanism, the encoded protein (delivered based on LNP distribution to the spleen by direct delivery through the bloodstream, or a specialized antigen) made within the spleen. Expression of (delivered indirectly via presenting cells) can result in T cell-dependent antibody production via presentation of the appropriate epitope (ie, derived from the protein of interest) to T cells. There is sex.

これに取り組むため、実施例２で記載される通り、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対する、少なくとも１つの結合部位）を含む、さらなるｍＲＮＡ構築物をデザインした。ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ｍｉＲ含有ｍＲＮＡ構築物の投与は、レシピエント動物におけるＡＤＡ応答の発達の著明な低減をもたらした。 To address this, as described in Example 2, at least one microRNA (miRNA) binding site for miR expressed in immune cells (eg, at least one binding site for miR-142-3p). Further mRNA constructs were designed, including. Administration of miR-containing mRNA constructs in vivo resulted in a marked reduction in the development of ADA responses in recipient animals.

当技術分野におけるタンパク質ベースの治療薬の臨床的使用と関連する別の課題は、治療用タンパク質に対する、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化）の発達であって、免疫媒介性副作用をもたらす発現である。しかし、今や、例えば、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与であって、特に、ｍＲＮＡの投与が、コードされるタンパク質の、免疫細胞、例えば、脾細胞内の発現を直接的にまたは間接的にもたらす場合の投与はまた、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、サイトカインの産生を含む、Ｂ細胞の活性化）の発達ももたらしうることが発見されている。しかし、驚くべきことに、末梢リンパ系組織内および／または内皮細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対する、少なくとも１つの結合部位、特に、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位の、ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への組込みが、ｍＲＮＡを、被験体へと投与した場合における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害しうることも裏付けられている。したがって、本開示は、ｍＲＮＡベースの治療剤を使用する場合に、望ましくない免疫細胞の活性化を、特に、末梢リンパ系器官または脾臓など、免疫系組織内の転写後調節により、低減または阻害する組成物および方法を提示する。 Another challenge associated with the clinical use of protein-based therapeutic agents in the art is the development of unwanted immune cell activation (eg, B cell activation) for therapeutic proteins, which is immune mediation. It is an expression that causes sexual side effects. However, now, for example, administration of an mRNA encoding a protein of interest, in particular, administration of the mRNA directly or indirectly expresses the encoded protein in an immune cell, eg, a splenic cell. It has been discovered that administration when resulting can also result in the development of unwanted immune cell activation (eg, B cell activation, including the production of cytokines). However, surprisingly, at least one binding site for microRNAs (miRNAs) expressed in peripheral lymphoid tissues and / or endothelial cells, in particular at least one miR-126 binding site and / or miR-142. It is also supported that the integration of the binding site into the mRNA (mRNA) can reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells when the mRNA is administered to the subject. Accordingly, the present disclosure reduces or inhibits unwanted immune cell activation when using mRNA-based therapeutic agents, especially by post-transcriptional regulation within immune system tissues such as peripheral lymphatic organs or spleen. The composition and method are presented.

実施例３で記載される実験は、ｍｉＲ－１２６結合部位もしくはｍｉＲ－１４２（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ）結合部位、または２つの部位の組合せの、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ構築物への組込みが、構築物を投与された動物において、ｍｉＲ結合部位を欠く構築物で処置された動物と比較して、活性化Ｂ細胞の頻度の低減、ならびにサイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）産生のレベルの低減をもたらすことを裏付けた。ｍｉＲ－１２６結合部位単独の効果は、ｍｉＲ－１４２結合部位単独の効果より強力であり、２つの部位を組合せで使用した場合に、最も強い効果が見られた。Ｂ細胞の活性化の頻度およびサイトカインの産生は、抗体応答を含む、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、初期の免疫応答の惹起についての指標である。こうして、これらの結果は、ｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れ（単独の、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた）が、レシピエント動物における、コードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答の発達の低減をもたらしうることを指し示す。 The experiments described in Example 3 include the integration of a miR-126 binding site or a miR-142 (eg, miR-142-3p) binding site, or a combination of the two sites, into an mRNA construct encoding the protein of interest. However, in animals treated with the construct, the frequency of activated B cells was reduced and cytokines (IL-6, TNF-α, IFN-γ) were reduced compared to animals treated with the construct lacking the miR binding site. It was confirmed to bring about a reduction in the level of production. The effect of the miR-126 binding site alone was stronger than that of the miR-142 binding site alone, and the strongest effect was observed when the two sites were used in combination. The frequency of B cell activation and cytokine production are indicators of the induction of an early immune response in vivo, including antibody response. Thus, these results show that the incorporation of the miR-126 binding site into the mRNA construct (alone or in combination with the miR-142-3p binding site) is the ADA response to the encoded protein in the recipient animal. Indicates that it can result in reduced development.

いかなる形でも理論に束縛されないが、ｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、ｍｉＲ－１２６の発現パターンに基づき、１または複数の可能な機構による免疫細胞の活性化の低減または阻害をもたらしうる。マイクロＲＮＡ－１２６は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）内で、高度かつ選択的に発現し、これらの細胞の、成熟、生存、およびエフェクター機能を調節することが公知である（Ａｇｕｄｏ， Ｊ．ら（２０１４年）、Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：５４～６２頁；Ｃｅｌｌａ， Ｍ．およびＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉ， Ｇ．（２０１４年）、Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：８～９頁）。形質細胞様樹状細胞は、末梢血単核細胞のうちの０．１％未満、および全脾臓細胞のうちの０．４～０．６％を占め、活性化すると、樹状細胞へと分化し、インターフェロンを産生し、生得的免疫と後天的免疫との間の連結として用いられるほか、抗原提示においても役割を果たしうる（ｐＤＣについての総説には、例えば、Ｊｅｇａｌｉａｎ， Ａ．Ｇ．ら（２００９年）、Ａｄｖ． Ａｎａｔ． Ｐａｔｈｏｌ．、１６巻：３９２～４０４頁；Ｒｅｉｚｉｓ， Ｂ．ら（２０１１年）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９巻：１６３～１８３頁；Ｔｅｌ， Ｊ．ら（２０１２年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐ．、６１巻：１２７９～１２８８頁を参照されたい）。さらに、ｐＤＣはまた、Ｂ細胞の活性化および分化の促進、ならびにサイトカイン産生の刺激にも関与する（例えば、Ｄｏｕａｇ， Ｉ．ら（２００９年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８２巻：１９９１～２００１頁；Ｄｉｎｇ， Ｃ．ら（２００９年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８３巻：７１４０～７１４９頁；Ｇｕｊｅｒ， Ｃ．ら（２０１１年）、Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ．、８９巻：８１１～８２１頁を参照されたい）。したがって、ｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れにより観察される、Ｂ細胞の活性化頻度の低減、およびサイトカイン産生の低減は、例えば、ｐＤＣの抗原提示機能が阻害され、かつ／またはｐＤＣが、外来核酸に対して、有効な応答をもたらすことができず、かつ／またはｐＤＣの成熟および生存が阻害され、これにより、Ｂ細胞の活性化の促進の低減、およびサイトカイン産生の低減がもたらされ、次いで、これらの効果の全体的な結果が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ｍＲＮＡ構築物によりコードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答の低減となることから生じうる。 Without being bound by theory in any way, incorporation of the miR-126 binding site into the mRNA construct is based on the expression pattern of miR-126 and reduces or inhibits immune cell activation by one or more possible mechanisms. Can bring. MicroRNA-126 is known to be highly and selectively expressed within plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and to regulate the maturation, survival, and effector function of these cells (Agudo, J.). Et al. (2014), Nat. Immunol., Vol. 15, pp. 54-62; Cella, M. and Trinchieri, G. (2014), Nat. Immunol., Vol. 15, pp. 8-9). Plasmacytoid dendritic cells make up less than 0.1% of peripheral blood mononuclear cells and 0.4-0.6% of all spleen cells and, when activated, divide into dendritic cells. In addition to being used as a link between innate and acquired immunity, it can also play a role in antigen presentation (reviews on pDCs include, for example, Jegalian, AG et al. ( 2009), Adv. Anat. Pathol., Vol. 16, pp. 392-404; Reizis, B. et al. (2011), Annu. Rev. Immunol., Vol. 29, pp. 163-183; Tel, J. et al. (2009). 2012), Cancer Immunol. Immunotherap., Vol. 61: pp. 1279-1288). In addition, pDCs are also involved in promoting B cell activation and differentiation, as well as stimulating cytokine production (eg, Doug, I. et al. (2009), J. Immunol., Vol. 182: pp. 1991-2001. See Ding, C. et al. (2009), J. Immunol., Vol. 183: pp. 7140-7149; Guger, C. et al. (2011), J. Leukoc. Biol., Vol. 89: pp. 811-821. I want to be). Thus, the reduction in B cell activation frequency and cytokine production observed by incorporation of the miR-126 binding site into the mRNA construct, for example, inhibits the antigen presenting function of pDC and / or pDC. However, it fails to provide an effective response to foreign nucleic acids and / or inhibits pDC maturation and survival, thereby reducing the promotion of B cell activation and also reducing cytokine production. The overall result of these effects can then result from a reduction in the ADA response to the protein encoded by the mRNA construct in vivo.

加えて、ｍｉＲ－１２６は、内皮細胞内で発現することも公知である（例えば、Ｆｉｓｈ， Ｊ．Ｅ．ら（２００８年）、Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ．、１５巻：２７２～２８４頁；Ｗａｎｇ， Ｓ．ら（２００８年）、Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ．、１５巻：２６１～２７１頁を参照されたい）。したがって、ｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの効果は、内皮細胞内のｍｉＲ－１２６の存在度と関連しうる。こうして、ｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、ｉｎ ｖｉｖｏの内皮細胞内でコードされるタンパク質の発現の低減をもたらしうる結果として、内皮細胞による抗原提示の低減をもたらすことから、Ｂ細胞の活性化の頻度およびサイトカインの産生の共時的な低減をもたらす結果として、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてコードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答の低減をもたらす。 In addition, miR-126 is also known to be expressed in endothelial cells (eg, Fish, JE et al. (2008), Dev. Cell., Vol. 15, pp. 272-284; Wang, S. Et al. (2008), Dev. Cell., Vol. 15, pp. 261-271). Therefore, the effect of incorporation of the miR-126 binding site into the mRNA construct may be related to the abundance of miR-126 in endothelial cells. Thus, incorporation of the miR-126 binding site into the mRNA construct can result in reduced expression of the protein encoded in the in vivo endothelial cells, resulting in reduced antigen presentation by the endothelial cells. As a result of resulting in a sympathetic reduction in cell activation frequency and cytokine production, it results in a reduction in ADA response to the protein encoded in vivo.

実施例６で裏付けられる通り、ｍｉＲ－１４２および／またはｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の総頻度の低減、ならびにＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞集団内の、活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞）の頻度の低減をもたらす。これに対し、ｍｉＲ－１４２および／またはｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、脾臓ＣＤ１９＋Ｂ細胞中の、ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の頻度にも影響を及ぼさず、ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞集団内のＣＤ２７の発現レベルにも影響を及ぼさなかった。さらに、ｍｉＲ結合部位含有構築物で処置されたマウスから単離されたｐＤＣと共にインキュベートしたところ、ｍｉＲ結合部位を欠くｍＲＮＡ構築物による処置と比較して、ナイーブＢ細胞の成長も低減された。したがって、この実験のデータは、提起される機構であって、ｍｉＲ結合部位の１つまたは組合せを含む修飾ｍＲＮＡ構築物で処置されたマウスにおける、Ｂ細胞の活性化の阻害およびサイトカインの産生の阻害が、ｐＤＣの頻度および／または活性化の減少から生じ、これにより、Ｂ細胞刺激の減少であり、ＣＤ７０－ＣＤ２７間相互作用の減少または樹状細胞によるサイトカイン分泌の低減からも同様に生じる低下をもたらすという機構を裏書きする。 As supported by Example 6, incorporation of miR-142 and / or miR-126 binding sites into the mRNA construct reduced the total frequency of CD11c + dendritic cells and activated within the CD11c + spleen cell population. It results in a reduction in the frequency of dendritic cells (CD11c + CD70 + CD86 + cells). In contrast, incorporation of miR-142 and / or miR-126 binding sites into the mRNA construct did not affect the frequency of CD27 + CD19 + B cells in spleen CD19 + B cells, CD27 + CD19. + It also did not affect the expression level of CD27 in the B cell population. In addition, incubation with pDCs isolated from mice treated with the miR binding site-containing construct also reduced naive B cell growth compared to treatment with mRNA constructs lacking the miR binding site. Therefore, the data in this experiment is a mechanism proposed by inhibition of B cell activation and cytokine production in mice treated with a modified mRNA construct containing one or a combination of miR binding sites. , A decrease in pDC frequency and / or activation, thereby a decrease in B cell stimulation, as well as a decrease in CD70-CD27 interaction or a decrease in cytokine secretion by dendritic cells. I will endorse the mechanism.

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）など、脂質を含む化合物および組成物の使用であって、治療剤、例えば、修飾ｍＲＮＡを送達する使用に関しては、２回目および後続の投与時において、薬剤が、血液から急速にクリアランスされる、別個の課題（すなわち、血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ））も存在する。機構は、脂質を含む化合物または組成物（例えば、ＬＮＰ）の、Ｂ細胞、特に、Ｂ１ａ細胞による認識であって、ホスファチジルコリンなどの脂質成分の、ＣＤ３６および／またはＴＬＲによる認識を介する認識を含む。活性化Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＭ、特に、ＡＢＣに寄与しうる（例えば、急性相応答型機構を介して）、天然ＩｇＭを分泌する。脂質を含む化合物または組成物（例えば、ＬＮＰ）のリン脂質成分（例えば、ＤＳＰＣ）はまた、例えば、循環中の血小板も活性化させうる。活性化血小板は、凝集してマクロファージに結合し、これは、後に、炎症性サイトカインを放出し、脾臓へと遊走しうる。脂質を含む化合物または組成物（例えば、ＬＮＰ）の、脾臓への封鎖は、ほぼ投与の直後に起こる。 With respect to the use of lipid-containing compounds and compositions, such as lipid nanoparticles (LNPs), for the use of delivering therapeutic agents, eg, modified mRNAs, the agent is rapidly removed from the blood during the second and subsequent doses. There is also a separate task (ie, Acceleration of Blood Clearance (ABC)) that is cleared to. Mechanisms include recognition of lipid-containing compounds or compositions (eg, LNPs) by B cells, particularly B1a cells, via recognition of lipid components such as phosphatidylcholine by CD36 and / or TLR. Activated B1a cells secrete IgM, in particular, native IgM, which may contribute to ABC (eg, via an acute phase-responsive mechanism). A phospholipid component (eg, DSPC) of a lipid-containing compound or composition (eg, LNP) can also activate, for example, circulating platelets. Activated platelets aggregate and bind to macrophages, which can later release inflammatory cytokines and migrate to the spleen. Sealing of a lipid-containing compound or composition (eg, LNP) into the spleen occurs approximately immediately after administration.

ＡＢＣは、少なくとも部分的に、Ｂ細胞、具体的には、Ｂ１ａ細胞により媒介されることが発見されている。これらのＢ細胞は通常、各々に対するアフィニティーは比較的低度であるが、様々な抗原に結合することが可能なことを意味する、多重反応性である天然ＩｇＭ抗体の分泌の一因となる。薬剤の第１の用量の実施時に、Ｂ１ａ細胞は、薬剤に結合し、活性化し、これにより、ホスファチジルコリンなどの薬剤に結合する天然ＩｇＭを分泌する。次いで、脂質を含む化合物または組成物の、２回目または後続の投与は、循環ＩｇＭによりターゲティングされ、急速にクリアランスされる。本明細書でＢ２細胞またはＣＤ１９（＋）Ｂ細胞と称する、従来のＢ細胞もまた、ＡＢＣに関与している。具体的には、従来のＢ細胞は、ＩｇＭ応答を最初に惹起し、続いて、メモリー応答と共時的な、ＩｇＧ応答を惹起することも可能である。従来のＢ細胞は、投与された薬剤およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に対して反応し、ＡＢＣを媒介するＩｇＭ（および、最終的に、ＩｇＧ）に寄与する。この課題に対するかつての解決策は、ＬＮＰ組成物を投与された被験体における免疫応答を抑制することに焦点を当てていた。特に、共投薬レジメン（例えば、抗ヒスタミン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド、コルチコステロイドなど）が、免疫系を抑制するのに使用されている。しかし今や、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１５５、およびこれらの組合せ）に対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位の、修飾ｍＲＮＡ構築物への組込みが、脂質を含む化合物または修飾ｍＲＮＡを含む組成物を、被験体へと投与する場合に、ＡＢＣを低減または阻害しうることが発見されている。具体的には、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位の、修飾ｍＲＮＡへの組込みは、形質細胞様樹状細胞の成長および／もしくは活性化を、低減もしくは阻害する場合もあり、かつ／または抗ＰＥＧ ＩｇＭの産生を低減もしくは阻害する場合もあることが発見されている。例えば、実施例７で裏付けられる通り、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れは、脂質を含む化合物またはｍＲＮＡ構築物を含む組成物を投与されたマウスにおいて、血清抗ＰＥＧ ＩｇＭ抗体レベルの減少をもたらす。 ABC has been found to be at least partially mediated by B cells, specifically B1a cells. These B cells usually have a relatively low affinity for each, but contribute to the secretion of multi-reactive native IgM antibodies, which means they are capable of binding to various antigens. Upon implementation of the first dose of drug, B1a cells bind to and activate the drug, thereby secreting native IgM that binds to the drug, such as phosphatidylcholine. Second or subsequent doses of the lipid-containing compound or composition are then targeted by circulating IgM and rapidly cleared. Conventional B cells, referred to herein as B2 cells or CD19 (+) B cells, are also involved in ABC. Specifically, conventional B cells can also elicit an IgM response first, followed by an IgG response that is synchronic with the memory response. Conventional B cells react to administered agents and polyethylene glycol (PEG) and contribute to ABC-mediated IgM (and ultimately IgG). The former solution to this challenge has focused on suppressing the immune response in subjects receiving the LNP composition. In particular, co-medication regimens (eg, antihistamines, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), steroids, corticosteroids, etc.) have been used to suppress the immune system. But now, the integration of at least one microRNA binding site into a modified mRNA construct for microRNAs expressed in immune cells (eg, miR-126, miR-142, miR-155, and combinations thereof) is now available. It has been discovered that ABC can be reduced or inhibited when a compound containing a lipid or a composition containing a modified mRNA is administered to a subject. Specifically, integration of at least one microRNA binding site into a modified mRNA may reduce or inhibit the growth and / or activation of plasmacytoid dendritic cells and / or anti-PEG IgM. It has been discovered that it may reduce or inhibit the production of. For example, as evidenced by Example 7, incorporation of at least one miR binding site into the mRNA construct is at the serum anti-PEG IgM antibody level in mice administered with a lipid-containing compound or composition comprising the mRNA construct. Brings a reduction.

本明細書で記載される、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位の、脂質を含む化合物または組成物により送達される、修飾ｍＲＮＡ構築物への組入れが、ＡＢＣの低減または阻害をもたらす、複数の可能な機構が存在する。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位の作用機構は、構築物内のｍｉＲＮＡ結合部位が、結合部位に結合するマイクロＲＮＡ「を吸い上げる」、マイクロＲＮＡ「スポンジ」である。このマイクロＲＮＡは、それらを調節するのにそれほど／全く利用可能でなくなるので、これは、特異的マイクロＲＮＡの天然標的に対する調節解除をもたらしうる。この筋書は、マイクロＲＮＡのノックダウン／ノックアウト効果を模倣する。マイクロＲＮＡの天然標的の適正な調節が、細胞が有効な免疫細胞として作用する能力に必要な例では、このマイクロＲＮＡスポンジ型効果は、細胞が免疫応答をもたらすことを不可能とする。また、マイクロＲＮＡによる内因性標的の調節解除が、細胞のホメオスタシス（例えば、カルシウムシグナル伝達）を破壊することから、ストレス応答（例えば、フォールディングされなかったタンパク質の応答）をもたらす可能性もある。代替的に、マイクロＲＮＡ結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れが、このｍＲＮＡの、特異的なマイクロＲＮＡ保有細胞型内の発現を抑制する可能性もある。また、マイクロＲＮＡ結合部位の組入れが、ＴＬＲ７などのセンサーが、それを認識する前に、ｍＲＮＡの分解をもたらす可能性もある。後者の２つの機構は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）により媒介される、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）に対する、１または複数の結合部位を含むｍＲＮＡの切断に依存する。また、これらの機構が、いずれも協同的に作用して、ｍｉＲにより媒介され、観察される、本明細書で記載される作用をもたらす可能性もある。 Multiple possible mechanisms by which the incorporation of at least one microRNA binding site described herein into a modified mRNA construct delivered by a lipid-containing compound or composition results in a reduction or inhibition of ABC. Exists. In one embodiment, the mechanism of action of a miRNA binding site is a microRNA "sponge", where the miRNA binding site in the construct "sucks up" the microRNA that binds to the binding site. This can result in deregulation of specific microRNAs against natural targets, as these microRNAs are less or less available to regulate them. This scenario mimics the knockdown / knockout effect of microRNAs. In examples where proper regulation of the natural target of microRNAs is required for the ability of cells to act as effective immune cells, this microRNA sponge-type effect makes it impossible for cells to elicit an immune response. Deregulation of endogenous targets by microRNAs can also result in stress responses (eg, unfolded protein responses) by disrupting cellular homeostasis (eg, calcium signaling). Alternatively, integration of the microRNA binding site into the mRNA may suppress the expression of this mRNA within a specific microRNA-carrying cell type. Incorporation of microRNA binding sites may also result in mRNA degradation before sensors such as TLR7 recognize it. The latter two mechanisms depend on cleavage of mRNA containing one or more binding sites for microRNA (miR) expressed in immune cells, mediated by RNA-induced silencing complex (RISC). It is also possible that all of these mechanisms act cooperatively to result in the effects described herein mediated and observed by miR.

関与する機構に関わらず、本明細書で記載される、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの結果としてもたらされる影響は、脂質を含む化合物または組成物を認識する免疫細胞（例えば、ｐＤＣ、Ｂ細胞（例えば、循環Ｂ細胞）、マクロファージ）が、活性化せず、したがって、Ｂ細胞（例えば、脾臓Ｂ細胞）を活性化させるように、脾臓へと遊走しないことである。加えて、サイトカインの産生（例えば、ＩＬ－６）も、低減または阻害され、これにより、さらに免疫細胞の活性化が防止される。Ｂ細胞の活性化の低減または阻害は、天然のＩｇＭ（例えば、Ｂ１ａ細胞による）、ＩｇＭ、およびＩｇＧの低減または阻害を結果としてもたらす。これらの分子の産生は、ＡＢＣに不可欠であり、したがって、それらの産生の低減または阻害は、ＡＢＣ全体を低減または阻害する。 Regardless of the mechanism involved, the effect of at least one microRNA binding site described herein as a result of incorporation into the mRNA construct is an immune cell that recognizes a lipid-containing compound or composition ( For example, pDCs, B cells (eg, circulating B cells), macrophages) are not activated and therefore do not migrate to the spleen to activate B cells (eg, spleen B cells). In addition, cytokine production (eg IL-6) is also reduced or inhibited, which further prevents the activation of immune cells. Reduction or inhibition of B cell activation results in reduction or inhibition of native IgM (eg, by B1a cells), IgM, and IgG. The production of these molecules is essential for ABC, and therefore reduction or inhibition of their production reduces or inhibits ABC as a whole.

したがって、本開示は、脂質を含む化合物または組成物であって、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む化合物または組成物を使用する場合に、ＡＢＣを低減または阻害するための方法を提示する。 Accordingly, the present disclosure presents a method for reducing or inhibiting ABC when a compound or composition comprising a lipid and comprising a modified mRNA encoding a polypeptide of interest is used. ..

本開示の多様な態様について、下記の小節でさらに記載する。 The various aspects of the disclosure are further described in the sections below.

ｍＲＮＡ
本開示は、目的のポリペプチドをコードし、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位）を含む、単離ＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍＲＮＡを提示する。他の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位）を含むが、必ずしも、目的のポリペプチドをコードしないＲＮＡ、例えば、化学修飾ＲＮＡを提示する。後者のＲＮＡはまた、ｍＲＮＡの他の典型的な特色（下記に記載するｍＲＮＡの特色など）を欠く場合もあるが、ｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位を含みうる。 mRNA
The present disclosure encodes an isolated RNA, particularly mRNA, eg, chemistry, which encodes a polypeptide of interest and comprises at least one microRNA binding site (eg, miR-126 binding site and / or miR-142 binding site). Present modified mRNA. In other embodiments, the present disclosure comprises at least one microRNA binding site (eg, a miR-126 binding site and / or a miR-142 binding site), but does not necessarily encode an RNA, eg, a polypeptide of interest. , Presenting a chemically modified RNA. The latter RNA may also contain a miR-126 binding site and / or a miR-142 binding site, although it may lack other typical features of mRNA (such as the mRNA features described below).

ＲＮＡは、天然のＲＮＡの場合もあり、非自然発生のＲＮＡの場合もあり、例えば、ｍＲＮＡでありうる。ｍＲＮＡは、下記で記載される、１または複数の修飾ヌクレオ塩基、修飾ヌクレオシド、または修飾ヌクレオチドを含み、この場合は、「化学修飾ｍＲＮＡ」と称する場合があるが、本明細書ではまた、「修飾ｍＲＮＡ」または「ｍｍＲＮＡ」とも称する。本明細書で記載される「ヌクレオシド」とは、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書ではまた、「ヌクレオ塩基」とも称する）と組み合わせた、糖分子（例えば、五炭糖またはリボース）またはその誘導体を含有する化合物と規定される。本明細書で記載される「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドと規定される。 RNA can be naturally occurring RNA or non-spontaneous RNA, for example mRNA. The mRNA comprises one or more modified nucleosides, modified nucleosides, or modified nucleotides described below, which in this case may be referred to as "chemically modified mRNA", but is also referred to herein as "modified". Also referred to as "mRNA" or "m mRNA". As used herein, a "nucleoside" is a sugar molecule (eg, penthalite) in combination with an organic base (eg, purine or pyrimidine) or a derivative thereof (also also referred to herein as a "nucleoside"). It is defined as a compound containing a sugar or ribose) or a derivative thereof. As used herein, the term "nucleotide" is defined as a nucleoside containing a phosphate group.

ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および／またはコード領域（例えば、オープンリーディングフレーム）を含みうる。ｍＲＮＡは、数百（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００）または数千（例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００）の塩基対を含む、任意の適する数の塩基対を含みうる。任意の数（例えば、全て、一部、またはゼロ）のヌクレオ塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドは、カノニカル分子種の類似体の場合もあり、置換されている場合もあり、修飾されている場合もあり、これら以外の形で非自然発生の場合もある。ある特定の実施形態では、特定のヌクレオチド型またはヌクレオ塩基型の全てが修飾されうる。 The mRNA can include a 5'untranslated region (5'UTR), a 3'untranslated region (3'UTR), and / or a coding region (eg, an open reading frame). mRNA can be hundreds (eg, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, or 900) or thousands (eg, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10). It may contain any suitable number of base pairs, including 000) base pairs. Any number (eg, all, part, or zero) of nucleobases, nucleosides, or nucleotides may be analogs of canonical molecular species, substituted, or modified. , It may occur non-naturally in other forms. In certain embodiments, all of the particular nucleotide or nucleobase types can be modified.

一実施形態では、ｍＲＮＡは、オープンリーディングフレーム（コード領域）の５’末端に配置される、第１のフランキング領域と、オープンリーディングフレーム（コード領域）の３’末端に配置される、第２のフランキング領域とを含み、この場合、第１のフランキング領域は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み、第２のフランキング領域は、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲと、３’ＵＴＲとは、同じ分子種から導出されない。一実施形態では、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ベータ－グロビンから導出されない。一実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡのコード領域に対して異種性である。別の実施形態では、３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡのコード領域に対して異種性である。さらに別の実施形態では、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡのコード領域に対して異種性である。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも２つの終止コドンを含む。 In one embodiment, the mRNA is located at the 5'end of the open reading frame (coding region), the first flanking region, and at the 3'end of the open reading frame (coding region), the second. In this case, the first flanking region includes the 5'untranslated region (5'UTR) and the second flanking region is the 3'untranslated region (3'UTR). including. In one embodiment, the mRNA 5'UTR and 3'UTR are not derived from the same molecular species. In one embodiment, the mRNA 5'UTR and / or 3'UTR is not derived from beta-globin. In one embodiment, the 5'untranslated region is heterologous to the coding region of the mRNA. In another embodiment, the 3'untranslated region is heterologous to the coding region of the mRNA. In yet another embodiment, the 5'untranslated region and the 3'untranslated region are heterologous to the coding region of the mRNA. In yet another embodiment, the mRNA comprises at least two stop codons.

ｍＲＮＡ構築物における使用に適する５’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号５３に示す。ｍＲＮＡ構築物における使用に適する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号３０に示す。当技術分野では、ｍＲＮＡ構築物における使用に適する、他の適する５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲも周知である。 A non-limiting example of a sequence of 5'UTR suitable for use in an mRNA construct is shown in SEQ ID NO: 53. A non-limiting example of a sequence of 3'UTR suitable for use in an mRNA construct is shown in SEQ ID NO: 30. Other suitable 5'UTRs and 3'UTRs suitable for use in mRNA constructs are also well known in the art.

例えば、適する５’ＵＴＲは、β－グロビン遺伝子（例えば、Ｋａｒｉｋｏら（２００８年）、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐ．、１６巻：１８３３～４０頁；ＵＳ８，２７８，０６３、ＵＳ９，０１２，２１９を参照されたい）、α－グロビン遺伝子（例えば、ＵＳ９，０１２，２１９を参照されたい）、ヒトチトクロームｂ－２４５αポリペプチド遺伝子（ＣＹＢＡ）（例えば、Ｆｅｒｉｚｉら（２０１５年）、Ｌａｂ． Ｃｈｉｐ．、２３巻：１４５６～１４６４頁を参照されたい）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）（例えば、Ｔｈｅｓｓら（２０１５年）、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐ．、２３巻：１４５６～１４６４頁；ＷＯ２０１５／０２４６６７を参照されたい）、ＴＯＰ遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６７を参照されたい）、リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０６２７３８を参照されたい）、およびＡＴＰ５１遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／０２４６６７を参照されたい）に由来する５’ＵＴＲ、ならびにタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）（例えば、Ｋａｔａｌｉｎら（２０１２年）、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐ．、２０巻：９４８～９５３頁；ＵＳ８，２７８，０６３、ＵＳ９，０１２，２１９を参照されたい）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）（例えば、Ａｎｄｒｉｅｓら（２０１５年）、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２１７巻：３３７～３４４頁を参照されたい）、およびＣＭＶ即初期１（ＩＥ１）遺伝子（例えば、ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＷＯ２０１４／１４４１９６、ＷＯ２０１４／１５２６５９、ＷＯ２０１４／１５２９４０、ＷＯ２０１４／１５２７７４、ＷＯ２０１４／１５３０５２を参照されたい）に由来する５’ＵＴＲを含む、ウイルス性５’ＵＴＲを含む。合成５’ＵＴＲについては記載されており、また、使用にも適する（例えば、ＭａｎｄａｌおよびＲｏｓｓｉ（２０１３年）、Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、５巻：６８～８２頁を参照されたい）。 For example, a suitable 5'UTR can be found in the β-globin gene (eg, Kariko et al. (2008), Mol. Therap., Vol. 16, pp. 1833-40; US8,278,063, US9,012,219. ), Α-globin gene (see, eg, US9,012,219), human chitochrome b-245α polypeptide gene (CYBA) (eg, Felizi et al. (2015), Lab. Chip., Vol. 23: 1456). (See pages 1464), hydroxysteroid (17-β) dehydrogenase gene (HSD17B4) (see, eg, Thess et al. (2015), Mol. Therap., Vol. 23: pp. 1456-1464; WO 2015/024667). See), TOP gene (see, eg, WO2015 / 101414, WO2015 / 101415, WO2015 / 062738, WO2015 / 024667, WO2015 / 024667), ribosome protein large 32 (L32) gene (eg, WO2015 / 101414, WO2015 /). 101415, WO2015 / 062738), and the 5'UTR derived from the ATP51 gene (see, eg, WO2015 / 024667), as well as the tobacco etch virus (TEV) (eg, Katalin et al. (2012), Mol. Therap., Vol. 20, pp. 948-953; see US8,278,063, US9,012,219), Venezuelauma encephalitis virus (VEEV) (eg, Andries et al. (2015), J. Control Release. , Vol. 217: pp. 337-344), and the CMV Immediate Early 1 (IE1) gene (eg, US201402065753, WO2014 / 089486, WO2013 / 185069, WO2014 / 144196, WO2014 / 152659, WO2014 / 152940, WO2014 / Includes viral 5'UTRs, including 5'UTRs derived from (see 152774, WO2014 / 153052). Synthetic 5'UTRs have been described and are also suitable for use (see, eg, Mandal and Rossi (2013), Nat. Protocol, Vol. 5, pp. 68-82).

加えて、例えば、適する３’ＵＴＲは、β－グロビン遺伝子（例えば、Ｋａｒｉｋｏら（２００８年）、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐ．、１６巻：１８３３～４０頁；ＵＳ８，２７８，０６３；ＵＳ９，０１２，２１９；ＷＯ２００７／０３６３６６、ＵＳ２０１１／００６５１０３、ＷＯ２０１１／０１５３４７、ＷＯ２０１２／０７２０９６、ＷＯ２０１３／１４３５５５、ＷＯ２０１４／０７１９６３を参照されたい）、α－グロビン遺伝子（例えば、ＵＳ９，０１２，２１９；ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５０２４６６７を参照されたい）、ヒトチトクロームｂ－２４５αポリペプチド遺伝子（ＣＹＢＡ）（例えば、Ｆｅｒｉｚｉら（２０１５年）、Ｌａｂ． Ｃｈｉｐ．、２３巻：１４５６～１４６４頁を参照されたい）、アルブミン遺伝子（例えば、Ｔｈｅｓｓら（２０１５年）、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐ．、２３巻：１４５６～１４６４頁を参照されたい）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子（例えば、ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＷＯ２０１４／１４４１９６、ＷＯ２０１４／１５２６５９、ＷＯ２０１４１５２９４０、ＷＯ２０１４／１５２７７４、ＷＯ２０１４／１５３０５２を参照されたい）、リボソームｒｐｓ９タンパク質遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１４を参照されたい）、ＦＩＧ４遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１５を参照されたい）、ヒトアルブミン７遺伝子（例えば、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／０６２７３、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２１０５／０６２７３７を参照されたい）に由来する３’ＵＴＲ、ならびにベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）（例えば、Ａｎｄｒｉｅｓら（２０１５年）、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２１７巻：３３７～３４４頁を参照されたい）に由来する３’ＵＴＲを含む、ウイルス性３’ＵＴＲを含む。 In addition, for example, suitable 3'UTRs are β-globin genes (eg, Kariko et al. (2008), Mol. Therap., Vol. 16: pp. 1833-40; US8,278,063; US9,012,219; WO2007 / 036366, US2011 / 0065103, WO2011 / 015347, WO2012 / 072096, WO2013 / 143555, WO2014 / 071963), α-globin gene (eg, US9,012,219; WO2015 / 101414, WO2015 / 101415, WO2015024667), human chitochrome b-245α polypeptide gene (CYBA) (see, eg, Felizi et al. (2015), Lab. Chip., Vol. 23: pp. 1456-1464), albumin gene (eg, see). , Thess et al. (2015), Mol. Therap., Vol. 23: pp. 1456-1464), Human Growth Hormone (hGH) Gene (eg, US201410206753, WO2013 / 185069, WO2014 / 089486, WO2014 / 144196, WO2014 / 152695, WO2014152940, WO2014 / 152774, WO2014 / 153052), ribosome rps9 protein gene (see, eg, WO2015 / 101414), FIG4 gene (see, eg, WO2015 / 101415), human. 3'UTRs derived from the albumin 7 gene (see, eg, WO2015 / 101415, WO2015 / 101414, WO2015 / 06273, WO2015 / 024667, WO2105 / 062737), as well as the Venezuelan encephalitis virus (VEEV) (eg, Andries et al.). (2015), J. Control Release, 217: pp. 337-344), including 3'UTRs, including viral 3'UTRs.

一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列としてもまた公知である）、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含みうる。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを欠き、ｍＲＮＡを安定化させるための代替的な構造を含有する。 In some embodiments, the mRNAs described herein are 5'cap structures, chain-terminated nucleotides, Kozak sequences (also known as Kozak consensus sequences), stem-loops, poly-A sequences, and / or. It may contain a polyadenylation signal. In other embodiments, the mRNA lacks a polyA sequence and / or a polyadenylation signal and contains an alternative structure for stabilizing the mRNA.

５’キャップ構造または５’キャップ分子種とは、リンカーにより接続された、２つのヌクレオシド部分を含む化合物であり、自然発生のキャップ、非自然発生のキャップもしくはキャップ類似体、または抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）から選択することができる。キャップ分子種は、１または複数の修飾ヌクレオシドおよび／またはリンカー部分を含みうる。例えば、天然ｍＲＮＡキャップは、グアニンヌクレオチドと、それらの５’位において三リン酸連結により接続された、７つの位置においてメチル化されたグアニン（Ｇ）ヌクレオチド、例えば、一般にｍ７ＧｐｐｐＧと書く、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとを含みうる。キャップ分子種はまた、抗リバースキャップ類似体でもありうる。可能なキャップ分子種の非限定的なリストは、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ２ ７，Ｏ３’ＧｐｐｐＧ、ｍ２ ７，Ｏ３’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ２ ７，Ｏ２’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ２ ７，Ｏ３’ＧｐｐｐＧ、ｍ２ ７，Ｏ３’ＧｐｐｐｐＧ、およびｍ２ ７，Ｏ２’ＧｐｐｐｐＧを含む。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチルグアノシン、２’フルオログアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシン、２－アミノグアノシン、ＬＮＡグアノシン、および２－アジドグアノシンからなる群から選択される５’末端キャップを含みうる。一実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ１である。 A 5'cap structure or 5'cap molecular species is a compound containing two nucleoside moieties linked by a linker and is a naturally occurring cap, a non-naturally occurring cap or cap analog, or an anti-reverse cap analog. Can be selected from (ARCA). The cap molecular species may contain one or more modified nucleosides and / or linker moieties. For example, a natural mRNA cap is a guanine nucleotide and a guanine (G) nucleotide methylated at seven positions linked by a triphosphate linkage at their 5'position, eg, commonly written as m7 GpppG , m. 7 G (5') ppp (5') G and may be included. Cap molecular species can also be anti-reverse cap analogs. A non-limiting list of possible cap molecular species is m 7 GppppG, m 7 Gpppm 7 G, m 7 3'dGpppG, m2 7, O3'GppppG, m2 7, O3'GppppG, m2 7, O2. Includes'GppppG, m7 Gpppm 7 G, m7 3'dGppppG, m2 7 , O3' GppppG , m2 7 , O3' GppppG, and m2 7, O2' GppppG. In various embodiments, the mRNA is Cap0, Cap1, ARCA, inosine, N1-methylguanosine, 2'fluoroguanosine, 7-deazaguanosine, 8-oxoguanosine, 2-aminoguanosine, LNAguanosine, and 2-azido. It may include a 5'end cap selected from the group consisting of guanosine. In one embodiment, the 5'end cap is Cap1.

ｍＲＮＡは、代わりに、または加えて、鎖終結ヌクレオシドを含みうる。例えば、鎖終結ヌクレオシドは、それらの糖基の２’位および／または３’位で脱酸素化されたヌクレオシドを含みうる。このような分子種は、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－デオキシウリジン、３’－デオキシシトシン、３’－デオキシグアノシン、３’－デオキシチミン、ならびに２’，３’－ジデオキシアデノシン、２’，３’－ジデオキシウリジン、２’，３’－ジデオキシシトシン、２’，３’－ジデオキシグアノシン、および２’，３’－ジデオキシチミンなどの２’，３’－ジデオキシヌクレオシドを含みうる。一部の実施形態では、例えば、３’末端における、鎖終結ヌクレオチドの、ｍＲＮＡへの組込みは、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１０３６５９号において記載されている、ｍＲＮＡの安定化を結果としてもたらしうる。 The mRNA may instead or additionally contain a chain termination nucleoside. For example, chain termination nucleosides can include nucleosides deoxygenated at the 2'and / or 3'positions of their glycosyl. Such molecular species include 3'-deoxyadenosine (cordicepine), 3'-deoxyuridine, 3'-deoxycytosine, 3'-deoxyguanosine, 3'-deoxythymine, and 2', 3'-dideoxyadenosine, It may contain 2', 3'-dideoxynucleosides such as 2', 3'-dideoxyuridine, 2', 3'-dideoxycytosine, 2', 3'-dideoxyguanosine, and 2', 3'-dideoxythymine. In some embodiments, for example, integration of a chain-terminated nucleotide at the 3'end into mRNA may result in mRNA stabilization, as described, for example, in International Patent Publication No. WO 2013/103659. ..

ｍＲＮＡは、代わりに、または加えて、ヒストンステムループなどのステムループを含みうる。ステムループは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれよりも多いヌクレオチド塩基対を含みうる。例えば、ステムループは、４、５、６、７、または８ヌクレオチド塩基対を含みうる。ステムループは、ｍＲＮＡの任意の領域内に配置されうる。例えば、ステムループは、非翻訳領域（５’非翻訳領域または３’非翻訳領域）内に配置される場合もあり、コード領域内に配置される場合もあり、ポリＡ配列内またはポリＡテール内に配置される場合もあり、これらの前に配置される場合もあり、これらの後に配置される場合もある。一部の実施形態では、ステムループは、翻訳の開始、翻訳の効率、および／または転写の終結など、ｍＲＮＡの１または複数の機能に影響を及ぼしうる。 The mRNA may optionally or additionally include stem-loops such as histone stem-loops. Stem-loops can contain 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more nucleotide base pairs. For example, stem loops can contain 4, 5, 6, 7, or 8 nucleotide base pairs. Stem-loops can be placed within any region of the mRNA. For example, the stem-loop may be located in the untranslated region (5'untranslated region or 3'untranslated region), in the code region, in the poly A sequence or in the poly A tail. It may be placed within, before them, or after them. In some embodiments, the stem-loop can affect one or more functions of the mRNA, such as translation initiation, translation efficiency, and / or transcription termination.

ｍＲＮＡは、代わりに、または加えて、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含みうる。ポリＡ配列は、完全に、またはほぼ、アデニンヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体から構成されうる。ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に隣接して配置されるテールでありうる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの核からの移出、翻訳、および／または安定性に影響を及ぼしうる。 The mRNA may optionally or additionally contain a polyA sequence and / or a polyadenylation signal. The poly A sequence can be composed entirely or almost entirely of adenine nucleotides or analogs or derivatives thereof. The poly A sequence can be a tail placed adjacent to the 3'untranslated region of the mRNA. In some embodiments, the poly A sequence can affect the export, translation, and / or stability of mRNA from the nucleus.

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、第１のコード領域および第２のコード領域を、第１のコード領域と、第２のコード領域との間で内部における翻訳の開始を可能とする、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む介在配列、または２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドをコードする介在配列と共に含む、バイシストロニックのｍＲＮＡである。ＩＲＥＳ配列および２Ａペプチドは典型的に、同じベクターからの、複数のタンパク質発現を増強するのに使用される。当技術分野では、様々なＩＲＥＳ配列が公知かつ利用可能であり、例えば、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳを含むＩＲＥＳ配列を使用することができる。 In some embodiments, the mRNA allows the initiation of internal translation of the first and second coding regions between the first and second coding regions. A bicistronic mRNA comprising an intervening sequence comprising a ribosome entry site (IRES) sequence or an intervening sequence encoding a self-cleaving peptide such as a 2A peptide. IRES sequences and 2A peptides are typically used to enhance expression of multiple proteins from the same vector. Various IRES sequences are known and available in the art, and for example, IRES sequences containing the cerebral myocarditis virus IRES can be used.

一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、自己切断ペプチドをコードする配列を含みうる。自己切断ペプチドは、２Ａペプチドでありうるがこれらに限定されない。当技術分野では、様々な２Ａペプチドが公知かつ利用可能であり、例えば***ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド、および１型ブタテッショウウイルス２Ａペプチドを含む２Ａペプチドを使用することができる。２Ａペプチドは、リボソームスキッピングにより、１つの転写物から、２つのタンパク質を発生させるのに、通常のペプチド結合が、２Ａペプチド配列において損なわれる結果として、１つの翻訳事象から、２つの不連続タンパク質が産生されるように、いくつかのウイルスにより使用されている。非限定的な例として、２Ａペプチドは、タンパク質配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４）、その断片または変異体を有しうる。一実施形態では、２Ａペプチドは、最後のグリシンと、最後のプロリンとの間で切断する。別の非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、タンパク質配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４）、その断片または変異体を有する２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一例は、ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ（配列番号５）である。例示的な一実施形態では、２Ａペプチドは、以下の配列：５’－ＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＴＣ－３’（配列番号６）によりコードされる。２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書で記載される方法および／または当技術分野で公知の方法により、修飾またはコドン最適化することができる。 In one embodiment, the polynucleotides of the present disclosure may comprise a sequence encoding a self-cleaving peptide. Self-cleaving peptides can be, but are not limited to, 2A peptides. Various 2A peptides are known and available in the art, including, for example, foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2A peptide, type A horse rhinitis virus 2A peptide, Thosea asigna virus 2A peptide, and type 1 porcine virus 2A peptide. 2A peptides containing can be used. The 2A peptide produces two proteins from one transcript by ribosome skipping, but the normal peptide bond is compromised in the 2A peptide sequence, resulting in two discontinuous proteins from one translation event. Used by several viruses to be produced. As a non-limiting example, the 2A peptide can have the protein sequence: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 4), a fragment or variant thereof. In one embodiment, the 2A peptide is cleaved between the last glycine and the last proline. As another non-limiting example, the polynucleotides of the present disclosure may include a polynucleotide sequence encoding a 2A peptide having a protein sequence: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 4), a fragment or variant thereof. An example of a polynucleotide sequence encoding a 2A peptide is GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCCGCTGAAGCAGGCTGGGAGACGTGGAGAGAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 5). In one exemplary embodiment, the 2A peptide is sequenced by the following sequence: 5'-TCCGACTCAGAATCCGGGGATCTCAAAATTGTCGCTCCCTGTCAAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACCATCAAAACTGGCTGGGGAGTAGTAGAAAGCAATCCAGGTCCACTC-3'. The polynucleotide sequence of the 2A peptide can be modified or codon-optimized by the methods described herein and / or by methods known in the art.

一実施形態では、この配列を使用して、２つまたはそれよりも多い、目的のポリペプチドのコード領域を分離することができる。非限定的な例として、２Ａペプチドをコードする配列は、第１のコード領域Ａと、第２のコード領域Ｂとの間にありうる（Ａ－２Ａｐｅｐ－Ｂ）。２Ａペプチドの存在は、１つの長いタンパク質の、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、および２Ａペプチドへの切断を結果としてもたらす。タンパク質Ａと、タンパク質Ｂとは、同じペプチドの場合もあり、異なるペプチドの場合もあり、目的のポリペプチドの場合もある。 In one embodiment, this sequence can be used to separate two or more coding regions of a polypeptide of interest. As a non-limiting example, the sequence encoding the 2A peptide can be between the first coding region A and the second coding region B (A-2Apep-B). The presence of the 2A peptide results in cleavage of one long protein into protein A, protein B, and 2A peptides. Protein A and protein B may be the same peptide, different peptides, or the polypeptide of interest.

修飾ｍＲＮＡ
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１または複数の修飾ヌクレオ塩基、修飾ヌクレオシド、または修飾ヌクレオチド（「化学修飾ｍＲＮＡ」と称するが、本明細書ではまた、「修飾ｍＲＮＡ」または「ｍｍＲＮＡ」とも称する）を含む。一部の実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、基準の非修飾ｍＲＮＡと比較した、安定性の増強、細胞内貯留、翻訳の増強、および／または、ｍＲＮＡが導入される細胞の生得的免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む有用な特性を有しうる。したがって、修飾ｍＲＮＡの使用は、タンパク質産生の効率、核酸の細胞内貯留を増強しうるほか、免疫原性の低減ももたらしうる。 Modified mRNA
In some embodiments, the mRNAs of the present disclosure are one or more modified nucleosides, modified nucleosides, or modified nucleotides (referred to as "chemically modified mRNAs", but also herein as "modified mRNAs" or "mRNAs". Also referred to as). In some embodiments, the modified mRNA is the parenchyma of the innate immune response of the cell into which the mRNA is introduced, such as enhanced stability, intracellular retention, enhanced translation, and / or mRNA compared to the standard unmodified mRNA. Can have useful properties, including lack of induction. Therefore, the use of modified mRNA can enhance the efficiency of protein production, the intracellular retention of nucleic acids, as well as the reduction of immunogenicity.

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１または複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの）異なる修飾ヌクレオ塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１または複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれよりも多い）異なる修飾ヌクレオ塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、ｍｍＲＮＡが導入される細胞内の分解を、対応する非修飾ｍＲＮＡと比べて低減している可能性がある。 In some embodiments, the mRNA comprises one or more (eg, one, two, three, or four) different modified nucleosides, nucleosides, or nucleotides. In some embodiments, the mRNA is one or more (eg, one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, or more) Containing different modified nucleobases, nucleosides, or nucleotides. In some embodiments, the modified mRNA may reduce the intracellular degradation into which the m mRNA is introduced compared to the corresponding unmodified mRNA.

一実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオシド（またはヌクレオチド）修飾を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣであるリボヌクレオシドの化学構造と比較した、少なくとも１つの修飾を含む。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、
（ａ）連結ヌクレオシドの第１の領域であって、目的のポリペプチドをコードする第１の領域と；
（ｂ）５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、少なくとも１つの５’末端キャップとを含む、前記第１の領域と比べて５’側に配置される、第１のフランキング領域と；
（ｃ）３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と、連結ヌクレオシドの３’テーリング配列とを含む、前記第１の領域と比べて３’側に配置される、第２のフランキング領域であって、
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む第２のフランキング領域と
を含む単離ポリヌクレオチドである。 In one embodiment, the mRNA comprises at least one nucleoside (or nucleotide) modification. In another embodiment, the mRNA comprises at least one modification compared to the chemical structure of the ribonucleoside which is A, G, U, or C. In yet another embodiment, the mRNA is
(A) A first region of the linked nucleoside that encodes the polypeptide of interest;
(B) A first flanking region located 5'side from the first region, including a 5'untranslated region (5'UTR) and at least one 5'end cap;
(C) A second flanking region located 3'side from the first region, comprising a 3'untranslated region (3'UTR) and a 3'tailing sequence of linked nucleosides. hand,
The polynucleotide is an isolated polynucleotide comprising a second flanking region containing at least one chemically modified nucleoside.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオシュードウリジン、２－チオシュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば、５－ヨードウリジンまたは５－ブロモウリジン）、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルシュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチルシュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオシュードウリジン、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、ヌクレオ塩基であるデオキシチミンを有する）、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオシュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、３－メチルシュードウリジン（ｍ３ψ）、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン（ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、および５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラウリジン、２’－Ｆウリジン、２’－ＯＨ－アラウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）］ウリジンを含む。 In some embodiments, the modified nucleobase is a modified uracil. Exemplary nucleobases and nucleosides with modified uracil are pseudouridine (ψ), pyridine-4-oneribonucleoside, 5-azauridine, 6-azauridine, 2-thio-5-azauridine, 2-thiouridine (s 2 ). U), 4-thiouridine (s 4 U), 4-thiopseudouridine, 2-thiopseudouridine, 5-hydroxyuridine (ho 5 U), 5-aminoallyl uridine, 5-halouridine (eg, 5-iodouridine) Or 5-bromouridine), 3-methyluridine (m 3 U), 5-methoxy uridine (mo 5 U), uridine 5-oxyacetic acid (cmo 5 U), uridine 5-oxyacetic acid methyl ester (mcmo 5 U). , 5-Carboxymethyl Pseudouridine (cm 5 U), 1-Carboxymethyl Pseudouridine, 5-Carboxyhydroxymethylseudouridine (chm 5 U), 5-Carboxyhydroxymethyl Uridine Methyl Estel (mchm 5 U), 5-methoxycarbonylmethyl Pseudouridine (mcm 5 U), 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine (mcm 5 s 2 U), 5-aminomethyl-2-thiouridine (nm 5 s 2 U), 5-methylaminomethyl uridine (nm m 5 U) ), 5-Methylaminomethyl-2-thiouridine (nmm 5 s 2 U), 5-methylaminomethyl-2-selenouridine (mnm 5 se 2 U), 5-carbamoylmethyluridine (ncm 5 U), 5- Carboxymethylaminomethyluridine (cmnm 5 U), 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine (cmnm 5 s 2 U), 5-propynyl uridine, 1-propynyl pseudouridine, 5-taurinomethyl uridine (τm 5 U) ), 1-Taurinomethyl Pseudouridine, 5-Taurinomethyl-2-thiouridine (τm 5 s 2 U), 1-Taurinomethyl-4-thiopseudouridine, 5-Methyluridine (m 5 U, ie, nucleobase). (Has deoxytimine), 1-methylseudouridine (m 1 ψ), 5-methyl-2-thiouridine (m 5 s 2 U), 1-methyl-4-thiopseudouridine (m 1 s 4 ψ), 4 -Thio-1-methylseudouridine, 3-methylseudouridine (m 3 ψ), 2-thio-1-methylseudouridine , 1-Methyl-1-deazasudouridine, 2-thio-1-methyl-1-deazasudouridine, dihydrouridine (D), dihydropseudouridine, 5,6-dihydrouridine, 5-methyldihydrouridine (M 5 D), 2-thiodihydrouridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-methoxyuridine, 2-methoxy-4-thiouridine, 4-methoxypseudouridine, 4-methoxy-2-thiopseudouridine, N1- Methylseudouridine, 3- (3-amino-3-carboxypropyl) uridine (acp 3 U), 1-methyl-3- (3-amino-3-carboxypropyl) pseudouridine (acp 3 ψ), 5- ( Isopentenylaminomethyl) uridine (inm 5 U), 5- (isopentenyl aminomethyl) -2-thiouridine (inm 5 s 2 U), α-thiouridine, 2'-O-methyluridine (Um), 5, 2 '-O-dimethylpseudouridine (m 5 Um), 2'-O-methylseudouridine (ψm), 2-thio-2'-O-methylseudouridine (s 2 Um), 5-methoxycarbonylmethyl-2'- O-methyluridine (mcm 5 Um), 5-carbamoylmethyl-2'-O-methyluridine (ncm 5 Um), 5-carboxymethylaminomethyl-2'-O-methyluridine (cmnm 5 Um), 3, 2'-O-dimethyluridine (m 3 Um), and 5- (isopentenylaminomethyl) -2'-O-methyluridine (inm 5 Um), 1-thiouridine, deoxythymidine, 2'-F-alauidine, Includes 2'-F uridine, 2'-OH-alauidine, 5- (2-carbomethoxyvinyl) uridine, and 5- [3- (1-E-propenylamino)] uridine.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、５－アザシチジン、６－アザシチジン、シュードイソシチジン、３－メチルシチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、５－ホルミルシチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチルシチジン（ｍ４Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロシチジン（例えば、５－ヨードシチジン）、５－ヒドロキシメチルシチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチルシュードイソシチジン、ピロロシチジン、ピロロシュードイソシチジン、２－チオシチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチルシチジン、４－チオシュードイソシチジン、４－チオ－１－メチルシュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザシュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザシュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザゼブラリン、５－メチルゼブラリン、５－アザ－２－チオゼブラリン、２－チオゼブラリン、２－メトキシシチジン、２－メトキシ－５－メチルシチジン、４－メトキシシュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチルシュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α－チオシチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１－チオシチジン、２’－Ｆ－アラシチジン、２’－Ｆ－シチジン、および２’－ＯＨ－アラシチジンを含む。 In some embodiments, the modified nucleobase is a modified cytosine. Exemplary nucleobases and nucleosides with modified cytidine are 5-azacitidine, 6-azacitidine, pseudoisocytidine, 3 -methylcytidine (m3C), N4-acetylcytidine (ac 4C ), 5-formylcytidine. (F 5 C), N4-methyl cytidine (m 4 C), 5-methyl cytidine (m 5 C), 5-halo cytidine (eg, 5-iodocytidine), 5-hydroxymethyl cytidine (hm 5 C), 1 -Methylpseudoisocytidine, Pyrrolocytidine, Pyrrolopseudoisocytidine, 2-thiocytidine (s2C), 2 -thio-5-methylcytidine, 4-thiopseudoisocytidine, 4-thio-1-methylpseudoisocytidine, 4 -Thio-1-methyl-1-deazapseudoisocytidine, 1-methyl-1-deazapseudoisocytidine, zebraline, 5-azazebrin, 5-methylzebralin, 5-aza-2-thiozebrin, 2-thiozebrin , 2-methoxycytidine, 2-methoxy-5-methylcytidine, 4-methoxypseudoisocytidine, 4-methoxy-1-methylpseudoisocytidine, lysidine ( k2C ), α-thiocytidine, 2'-O-methyl Cytidine (Cm), 5,2'-O-dimethylcytidine (m 5 Cm), N4-acetyl-2'-O-methylcytidine (ac 4 Cm), N4,2'-O-dimethylcytidine (m 4 Cm) ), 5-Formyl-2'-O-methylcytidine (f 5 Cm), N4, N4,2'-O-trimethylcytidine (m 42 Cm), 1 - thiocytidine, 2'-F-aracytidine, 2 ' Includes -F-cytidine, and 2'-OH-aracytidine.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、α－チオアデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロプリン（例えば、２－アミノ－６－クロロプリン）、６－ハロプリン（例えば、６－クロロプリン）、２－アミノ－６－メチルプリン、８－アジドアデノシン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチルアデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチルＮ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６－アセチルアデノシン（ａｃ６Ａ）、７－メチルアデニン、２－メチルチオアデニン、２－メトキシアデニン、α－チオアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチルプリン、１－チオアデノシン、８－アジドアデノシン、２’－Ｆ－アラアデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－アラアデノシン、およびＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノンアデシル）－アデノシンを含む。 In some embodiments, the modified nucleobase is a modified adenine. Exemplary nucleobases and nucleosides with modified adenosine are α-thioadenosine, 2-aminopurine, 2,6-diaminopurine, 2-amino-6-halopurine (eg, 2-amino-6-chloropurine). , 6-Halopurine (eg 6-chloropurine), 2-amino-6-methylpurine, 8-azidoadenosine, 7-deazaadenosine, 7-deaza-8-azaadenine, 7-deaza-2-aminopurine, 7- Deaza-8-aza-2-aminopurine, 7-deaza-2,6-diaminopurine, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurine, 1 -methyladenosine (m1A), 2-methyl Adenine (m 2 A), N6-methyladenosine (m 6 A), 2-methylthio-N6-methyl adenosine (ms 2 m 6 A), N6-isopentenyl adenosine (i 6 A), 2-methylthio-N 6- Isopentenyl adenosine (ms 2 i6 A), N6- (cis-hydroxyisopentenyl) adenosine (io 6 A), 2 -methylthio-N6- (cis-hydroxyisopentenyl) adenosine (ms 2 io 6 A), N6 -Glysinylcarbamoyladenosine ( g6A ), N6-threonylcarbamoyladenosine ( t6A ), N6-methyl N6-threonylcarbamoyladenosine ( m6t6A ), 2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine (Ms 2 g 6 A), N6, N6-dimethyladenosine (m 6 2 A), N6-hydroxynorvalyl carbamoyl adenosine (hn 6 A), 2-methylthio-N6-hydroxynorvalyl carbamoyl adenosine (ms 2 hn 6 ) A), N6-acetyladenosine ( ac6A ), 7-methyladenosine, 2-methylthioadenosine, 2-methoxyadenosine, α-thioadenosine, 2'-O-methyladenosine (Am), N6,2'-O -Dimethyladenosine (m 6 Am), N6, N6,2'-O-trimethyladenosine (m 6 2 Am), 1,2'-O-dimethyladenosine (m 1 Am), 2'-O-ribosyl adenosine (m 1 Am) Phosphoric acid) (Ar (p)), 2-amino-N6-methylpurine, 1-thioadenosine, 8-azidoadenosine, 2'-F-aradenosine, 2'-F-adenosine, 2'-OH-ara Adenosine, and N6- (19-amino-pentaoxanoneade Sil) -contains adenosine.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、α－チオグアノシン、イノシン（Ｉ）、１－メチルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－デメチルワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、未修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７－デアザグアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシルクエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシルクエオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザグアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７－デアザ－８－アザグアノシン、６－チオグアノシン、６－チオ－７－デアザグアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザグアノシン、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メチルグアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシグアノシン、１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－オキソグアノシン、７－メチル－８－オキソグアノシン、１－メチル－６－チオグアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオグアノシン、α－チオグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１－メチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチルイノシン（Ｉｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１－チオグアノシン、Ｏ６－メチルグアノシン、２’－Ｆ－アラグアノシン、および２’－Ｆ－グアノシンを含む。 In some embodiments, the modified nucleobase is a modified guanine. Exemplary nucleobases and nucleosides with modified guanosine are α-thioguanosine, inosin (I), 1-methylinosine (m 1 I), waiosin (imG), methylwiosin (mimG), 4-demethyl. Guanosine (imG-14), Isowaosine (imG2), Wibtosin (yW), Peroxywibtocin ( o2yW ), Hydroxylwibtocin (OhyW), Unmodified hydroxywibtocin (OhyW * ), 7-Dare Zaguanosine, guanosine (Q), epoxy guanosine (oQ), galactosyl eosin (galQ), mannosilk eosin (manQ), 7-cyano-7-deazaguanosine (preQ 0 ), 7-aminomethyl-7- Deazaguanosine (preQ 1 ), alkaeosin (G + ), 7-deaza-8-azaguanosine, 6-thioguanosine, 6-thio-7-deazaguanosine, 6-thio-7-deaza-8-aza Guanosine, 7-methylguanosine (m 7 G), 6-thio-7-methyl guanosine, 7-methyl inosine, 6-methoxy guanosine, 1-methyl guanosine (m 1 G), N2-methyl guanosine (m 2 G) , N2, N2-dimethylguanosine ( m2 2 G ), N2,7-dimethylguanosine (m 2,7 G), N2, N2,7-dimethylguanosine (m 2,2,7 G), 8-oxoguanosine , 7-Methyl-8-oxoguanosine, 1-methyl-6-thioguanosine, N2-methyl-6-thioguanosine, N2, N2-dimethyl-6-thioguanosine, α-thioguanosine, 2'-O-methyl Guanosine (Gm), N2-Methyl-2'-O-Methylguanosine ( m2 Gm), N2, N2-dimethyl-2'-O-Methylguanosine ( m2 2 Gm ), 1-Methyl-2'-O -Methylguanosine (m 1 Gm), N2,7-dimethyl-2'-O-methylguanosine (m 2,7 Gm), 2'-O-methylinosine (Im), 1,2'-O-dimethylinosine (M 1 Im), 2'-O-ribosyl guanosine (phosphate) (Gr (p)), 1-thioguanosine, O6-methylguanosine, 2'-F-araguanosine, and 2'-F-guanosine. include.

一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the mmRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、または２’－Ｏ－メチルウリジンである。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobases are pseudouridine (ψ), N1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methylcytosine, 2-thio-1-methyl. -1-Deasapseudouridine, 2-thio-1-methylseudouridine, 2-thio-5-azaudouridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2-thiopseudouridine, 4-methoxy-2 -Thiopseudouridine, 4-methoxypseudouridine, 4-thio-1-methylseudouridine, 4-thiopseudouridine, 5-azauridine, dihydropseudouridine, 5-methoxyuridine, or 2'-O-methylseudouridine. .. In some embodiments, the mmRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロシチジン（例えば、５－ヨードシチジン）、５－ヒドロキシメチルシチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチルシュードイソシチジン、２－チオシチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチルシチジンを含む。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobase is a modified cytosine. Exemplary nucleobases and nucleosides with modified cytosines are N4-acetylcytidine (ac 4 C), 5-methylcytidine (m 5 C), 5-halocytidine (eg 5-iodocytidine), 5-hydroxymethyl. Includes cytidine (hm 5 C), 1-methylpseudoisocytidine, 2-thiocytidine (s 2 C), 2-thio-5-methylcytidine. In some embodiments, the mmRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、７－デアザアデニン、１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチルアデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobase is a modified adenine. Exemplary nucleobases and nucleosides with modified adenine include 7-deazaadenine, 1 -methyladenosine (m1A), 2 -methyladenine (m2A), N6-methyladenosine ( m6A ). In some embodiments, the mmRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、イノシン（Ｉ）、１－メチルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザグアノシン、７－シアノ－７－デアザグアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソグアノシン、７－メチル－８－オキソグアノシンを含む。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobase is a modified guanine. Exemplary nucleobases and nucleosides with modified guanosine are inosin (I), 1-methylinosine (m 1 I), wyosine (imG), methylguanosine (mimG), 7-deazaguanosine, 7-cyano. -7-deazaguanosine (preQ 0 ), 7-aminomethyl-7-deazaguanosine (preQ 1 ), 7-methylguanosine (m 7 G), 1-methylguanosine (m 1 G), 8-oxoguanosine , 7-Methyl-8-oxoguanosine. In some embodiments, the mmRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、またはα－チオアデノシンである。一部の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡは、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの１または複数の組合せ（例えば、前述の修飾ヌクレオ塩基のうちの、２つ、３つ、または４つの組合せ）を含む。 In some embodiments, the modified nucleobases are 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudouridine (ψ), α. -Thioguanosine, or α-thioadenosine. In some embodiments, the mmRNAs of the present disclosure are a combination of one or more of the above-mentioned modified nucleobases (eg, a combination of two, three, or four of the above-mentioned modified nucleobases). include.

一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、例えば、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。 In some embodiments, the mMl contains a pseudouridine (ψ). In some embodiments, the mmRNA comprises pseudouridine (ψ) and 5 -methylcytidine (m5C). In some embodiments, the m mRNA comprises 1-methylseudouridine (m 1 ψ). In some embodiments, the m mRNA comprises 1-methylseudouridine (m 1 ψ) and 5-methylcytidine (m 5 C). In some embodiments, the mRNA comprises 2-thiouridine (s 2 U). In some embodiments, the m mRNA comprises 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5C ). In some embodiments, the mmRNA comprises 5-methoxyuridine (mo 5 U). In some embodiments, the RNA comprises, for example, 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5-methylcytidine (m 5 C). In some embodiments, the mmRNA comprises 2'-O-methyluridine. In some embodiments, the m mRNA comprises 2'-O-methyluridine and 5-methylcytidine (m 5C ). In some embodiments, the mMl contains N6-methyladenosine ( m6A ). In some embodiments, the mmRNA comprises N6-methyladenosine ( m6A ) and 5 -methylcytidine (m5C).

ある特定の実施形態では、本開示のｍｍＲＮＡを、特定の修飾について、一様に修飾する（すなわち、全修飾する、配列全体にわたり修飾する）。例えば、ｍｍＲＮＡは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）または５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で一様に修飾しうるが、これは、ｍｍＲＮＡ配列内の、全てのウリジン残基またはシトシン残基を、それぞれ、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）または５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で置きかえることを意味する。同様に、本開示のｍｍＲＮＡは、配列内に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、上記で明示した残基などの修飾残基で置きかえることにより、一様に修飾することができる。 In certain embodiments, the mRNAs of the present disclosure are uniformly modified (ie, fully modified, modified throughout the sequence) for a particular modification. For example, mmRNA can be uniformly modified with 1-methylpseudouridine (m 1 ψ) or 5-methylcytidine (m 5 C), which is all uridine residues or cytosine residues in the mmRNA sequence. It means replacing the groups with 1-methylpseudouridine (m 1 ψ) or 5-methylcytidine (m 5 C), respectively. Similarly, the mRNA of the present disclosure can be uniformly modified by replacing any kind of nucleoside residue present in the sequence with a modified residue such as the residue specified above.

一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡを、コード領域（例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム）内で修飾することができる。他の実施形態では、ｍＲＮＡを、コード領域以外の領域内で修飾することができる。例えば、一部の実施形態では、それらの一方または両方が、独立に、１または複数の異なるヌクレオシド修飾を含有しうる、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを提供する。このような実施形態では、ヌクレオシド修飾はまた、コード領域内にも存在しうる。 In some embodiments, the mRNAs of the present disclosure can be modified within a coding region (eg, an open reading frame encoding a polypeptide). In other embodiments, the mRNA can be modified within a region other than the coding region. For example, in some embodiments, one or both of them independently provide a 5'-UTR and / or a 3'-UTR that may contain one or more different nucleoside modifications. In such embodiments, the nucleoside modification may also be present within the coding region.

本開示のｍｍＲＮＡ内に存在しうる、ヌクレオシド修飾およびこれらの組合せの例は、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１２０４５０７５号、同第ＷＯ２０１４０８１５０７号、同第ＷＯ２０１４０９３９２４号、同第ＷＯ２０１４１６４２５３号、および同第ＷＯ２０１４１５９８１３号において記載されている、ヌクレオシド修飾およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。 Examples of nucleoside modifications and combinations thereof that may be present in the mRNAs of the present disclosure are described in PCT Patent Application Publication Nos. WO2011040575, WO2014081507, WO2014093924, WO20141644253, and WO2014159813. These include, but are not limited to, nucleoside modifications and combinations thereof.

本開示のｍｍＲＮＡは、糖、ヌクレオ塩基、および／またはヌクレオシド間連結に対する修飾の組合せを含みうる。これらの組合せは、本明細書で記載される、任意の１または複数の修飾を含みうる。 The mRNAs of the present disclosure may contain a combination of modifications to sugars, nucleoside bases, and / or nucleoside linkages. These combinations may include any one or more modifications described herein.

修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオシドの組合せの例を、下記の表１および表２に提示する。これらの修飾ヌクレオチドの組合せを使用して、本開示のｍｍＲＮＡを形成することができる。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドで、本開示のｍｍＲＮＡの天然ヌクレオチドを、部分的に置換することもでき、完全に置換することもできる。非限定的な例として、天然ヌクレオチドであるウリジンを、本明細書で記載される修飾ヌクレオシドで置換することができる。別の非限定的な例では、天然ヌクレオチドであるウリジンを、本明細書で開示される修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つで、部分的に（例えば、天然ウリジンのうちの、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％）置換することができる。

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 Examples of modified nucleosides and combinations of modified nucleosides are presented in Tables 1 and 2 below. Combinations of these modified nucleotides can be used to form the mRNAs of the present disclosure. In certain embodiments, modified nucleosides can be used to partially or completely replace the native nucleotides of the mmRNAs of the present disclosure. As a non-limiting example, the natural nucleotide uridine can be replaced with the modified nucleosides described herein. In another non-limiting example, the natural nucleotide uridine is partially (eg, about 0.1% of the natural uridine) with at least one of the modified nucleosides disclosed herein. 1, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, or 99.9%) can be substituted.
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本開示に従い、本開示のポリヌクレオチドを、表１または表２の修飾の組合せまたは単一の修飾を含むように合成してもよい。 According to the present disclosure, the polynucleotides of the present disclosure may be synthesized to include a combination or single modification of the modifications of Table 1 or Table 2.

単一の修飾を列挙する場合、列挙されるヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシドである、これらのＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣの１００パーセントを表す。百分率を列挙する場合、これらの百分率は、存在するＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣの三リン酸の総量のうちの、ヌクレオ塩基である、これらの特定のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣの三リン酸の百分率を表す。例えば、組合せ：２５％の５－アミノアリルＣＴＰ＋７５％のＣＴＰ／２５％の５－メトキシＵＴＰ＋７５％のＵＴＰは、シトシン三リン酸のうちの２５％が、５－アミノアリルＣＴＰであるが、シトシンのうちの７５％は、ＣＴＰである一方、ウラシルのうちの２５％が、５－メトキシＵＴＰであるが、ウラシルのうちの７５％は、ＵＴＰであるポリヌクレオチドを指す。修飾ＵＴＰが列挙されない場合、自然発生のＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、および／またはＣＴＰを、ポリヌクレオチド内で見出されるヌクレオチド部位の１００％において使用する。この例では、ＧＴＰヌクレオチドおよびＡＴＰヌクレオチドの全てを、非修飾とする。 When enumerating a single modification, the enumerated nucleosides or nucleotides represent 100 percent of these A, U, G, or C, which are modified nucleotides or nucleosides. When enumerating percentages, these percentages are the nucleobases of the total amount of A, U, G, or C triphosphates present, three of these particular A, U, G, or C. Represents the percentage of phosphoric acid. For example, a combination: 25% 5-aminoallyl CTP + 75% CTP / 25% 5-methoxy UTP + 75% UTP, where 25% of cytosine triphosphate is 5-aminoallyl CTP, but of cytosine. While 75% is CTP, 25% of uracil is 5-methoxyUTP, while 75% of uracil refers to polynucleotides that are UTP. If modified UTP is not listed, naturally occurring ATP, UTP, GTP, and / or CTP are used at 100% of the nucleotide sites found within the polynucleotide. In this example, all GTP and ATP nucleotides are unmodified.

本開示のｍＲＮＡまたはその領域は、最適化されたコドンでありうる。当技術分野では、コドン最適化法が公知であり、様々な目的：適正なフォールディングを確保するように、宿主生物におけるコドン頻度とマッチさせる目的、ｍＲＮＡの安定性を増大させるかもしくは二次構造を低減するように、ＧＣ含量にバイアスをかける目的、遺伝子の構築または発現を損ないうる、タンデムリピートコドンもしくは塩基の連なりを最小化する目的、転写制御領域および翻訳制御領域をカスタマイズする目的、タンパク質のトラフィッキング配列を挿入もしくは除去する目的、コードされるタンパク質内の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加する目的、タンパク質ドメインを付加、除去、またはシャッフルする目的、制限部位を挿入もしくは欠失させる目的、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾する目的、翻訳速度を調整して、タンパク質の多様なドメインが適正にフォールディングすることを可能とする目的、またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減するかもしくは消失させる目的で有用でありうる。当技術分野では、コドン最適化のツール、アルゴリズム、およびサービスが公知であり、非限定的な例は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）、および／または特許権のある方法によるサービスを含む。一実施形態では、例えば、哺乳動物細胞内の発現を最適化するか、またはｍＲＮＡの安定性を増強するように、最適化アルゴリズムを使用して、ｍＲＮＡ配列を最適化する。 The mRNA or region thereof of the present disclosure can be an optimized codon. Codon optimization methods are known in the art for a variety of purposes: matching with codon frequency in the host organism to ensure proper folding, increasing the stability of mRNA or secondary structure. The purpose of biasing GC content to reduce, the purpose of minimizing tandem repeat codon or base linkages that can impair gene construction or expression, the purpose of customizing transcriptional and translational regulatory regions, protein trafficking The purpose of inserting or removing sequences, the purpose of removing / adding post-translational modification sites (eg, glycosylation sites) within the encoded protein, the purpose of adding, removing, or shuffling protein domains, inserting or missing restriction sites. The purpose of loss, modification of ribosome binding and mRNA degradation sites, regulation of translation rate to allow proper folding of various domains of proteins, or secondary structure of problems within a polynucleotide. May be useful for the purpose of reducing or eliminating. Tools, algorithms, and services for codon optimization are known in the art, and non-limiting examples are GeneArt (Life Technologies), DNA 2.0 (Menlo Park, CA), and / or patented. Includes methodical services. In one embodiment, an optimization algorithm is used to optimize the mRNA sequence, eg, to optimize expression in mammalian cells or to enhance mRNA stability.

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。 In certain embodiments, the present disclosure is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, with respect to any of the polynucleotide sequences described herein. Or it comprises a polynucleotide having at least 99% sequence identity.

本開示のｍＲＮＡは、当技術分野で利用可能な手段であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）および合成法を含むがこれらに限定されない手段により産生することができる。酵素（ＩＶＴ）法、固相法、液相法、組合せ合成法、小領域合成法、およびライゲーション法を活用することができる。一実施形態では、ＩＶＴによる酵素的合成法を使用して、ｍＲＮＡを制作する。当技術分野では、ＩＶＴによりポリヌクレオチドを制作する方法が公知であり、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２号において記載されている。したがって、本開示はまた、本明細書で記載されるｍＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転写するのに使用しうる、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、構築物、およびベクターも含む。 The mRNAs of the present disclosure can be produced by means available in the art, including but not limited to in vitro transcription (IVT) and synthetic methods. Enzyme (IVT) method, solid phase method, liquid phase method, combination synthesis method, small area synthesis method, and ligation method can be utilized. In one embodiment, enzymatic synthesis by IVT is used to produce mRNA. Methods of making polynucleotides by IVT are known in the art and their contents are described in International Application No. PCT / US2013 / 30062, which is incorporated herein by reference in its entirety. .. Accordingly, the disclosure also includes polynucleotides such as DNA, constructs, and vectors that can be used to transcribe the mRNAs described herein in vitro.

非天然の修飾ヌクレオ塩基は、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡへと、合成時に導入することもでき、合成後に導入することもできる。ある特定の実施形態では、修飾は、ヌクレオシド間連結上の場合もあり、プリンまたはピリミジン塩基の場合もあり、糖の場合もある。特定の実施形態では、修飾は、ポリヌクレオチド鎖の末端に導入することもでき、ポリヌクレオチド鎖内の他の場所に導入することもでき、化学合成により導入することもでき、ポリメラーゼ酵素より導入することもできる。修飾核酸およびそれらの合成の例については、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号において開示されている。修飾ポリヌクレオチドの合成についてはまた、ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７６巻、９９～１３４頁（１９９８年）においても記載されている。 The unnatural modified nucleobase can be introduced into a polynucleotide, eg, mRNA, during synthesis or after synthesis. In certain embodiments, the modification may be on a nucleoside-to-nucleoside linkage, may be a purine or pyrimidine base, or may be a sugar. In certain embodiments, the modification can be introduced at the end of the polynucleotide chain, elsewhere in the polynucleotide chain, by chemical synthesis, or by a polymerase enzyme. You can also do it. Examples of modified nucleic acids and their synthesis are disclosed in PCT application No. PCT / US2012 / 058519. The synthesis of modified polynucleotides is also described in Verma and Eckstein, Annual Review of Biochemistry, Vol. 76, pp. 99-134 (1998).

酵素的ライゲーション法または化学的ライゲーション法を使用して、ポリヌクレオチドまたはそれらの領域を、ターゲティング剤または送達剤、蛍光標識、液体、ナノ粒子など、異なる機能的部分とコンジュゲートさせることができる。ポリヌクレオチドおよび修飾ポリヌクレオチドのコンジュゲートについては、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１巻（３号）、１６５～１８７頁（１９９０年）において総説されている。 Enzymatic or chemical ligation methods can be used to conjugate polynucleotides or regions thereof with different functional moieties such as targeting or delivery agents, fluorescent labels, liquids, nanoparticles and the like. Conjugates of polynucleotides and modified polynucleotides are reviewed in Goodchild, Bioconjugate Chemistry, Volume 1 (No. 3), pp. 165-187 (1990).

免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、マイクロＲＮＡ結合部位
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）とは、１９～２５ヌクレオチド長（一般に１９～２３ヌクレオチド長であり、最も典型的には、２２ヌクレオチド長）の非コードＲＮＡであって、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子の安定性を低減するか、または翻訳を阻害することにより、翻訳後において遺伝子発現を下方調節する非コードＲＮＡである。本開示のｍＲＮＡは、１もしくは複数のマイクロＲＮＡ標的配列もしくはマイクロＲＮＡ標的部位、マイクロＲＮＡ結合性配列もしくはマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ配列と相補的な配列、またはマイクロＲＮＡシード領域もしくはマイクロＲＮＡシード配列と相補的な配列を含みうる。このような配列は、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されている、マイクロＲＮＡなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応しうる。マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域または「シード」配列、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２～８位の領域内の配列であって、ｍｉＲＮＡの標的配列に対する、完壁なワトソン－クリック型相補性を有する配列を含む。マイクロＲＮＡのシード領域またはシード配列の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の領域から酵素的に導出され、自身に折り返されて、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（前駆体ｍｉＲＮＡ）と称することが多い短鎖ヘアピン構造を形成する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは典型的に、その３’末端において、２ヌクレオチドの突出を有し、３’ヒドロキシル基および５’リン酸基を有する。この前駆体ｍＲＮＡは、核内でプロセシングされ、その後、細胞質へと輸送され、そこで、ＤＩＣＥＲ（ＲＮアーゼＩＩＩ酵素）によりさらにプロセシングされ、約２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。次いで、成熟マイクロＲＮＡは、リボ核粒子へと組み込まれて、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体である、ＲＩＳＣを形成する。当技術分野で認識されている、成熟ｍｉＲＮＡのための命名法は典型的に、成熟ｍｉＲＮＡが導出されるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡアームを指示するものであり、「５ｐ」とは、マイクロＲＮＡが、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンの５プライムアームに由来することを意味し、「３ｐ」とは、マイクロＲＮＡが、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンの３プライム末端に由来することを意味する。本明細書では、番号で言及されるｍｉＲは、同じｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来する、２つの成熟マイクロＲＮＡの一方（例えば、３ｐマイクロＲＮＡまたは５ｐマイクロＲＮＡ）を指す場合がある。本明細書で言及される全てのｍｉＲは、３ｐまたは５ｐの呼称により特に、指定されない限り、配列ごとに、３ｐアームおよび５ｐアームの両方を含むことを意図する。 MicroRNA binding sites for miRs expressed in immune cells MicroRNAs (or miRNAs) are non-coding 19-25 nucleotides in length (generally 19-23 nucleotides in length, most typically 22 nucleotides in length). RNA is a non-coding RNA that binds to the 3'UTR of a nucleic acid molecule and downregulates gene expression after translation by reducing the stability of the nucleic acid molecule or inhibiting translation. The mRNAs of the present disclosure are one or more microRNA target sequences or microRNA target sites, microRNA binding or microRNA binding sites, sequences complementary to microRNA sequences, or microRNA seed regions or microRNA seed sequences. May contain sequences complementary to. Such sequences are optional, such as microRNAs, as taught in US Publications US2005 / 0261218 and US Publications US2005 / 0059005, whose contents are incorporated herein by reference in their entirety. It can correspond to the known microRNA of. A microRNA sequence is a "seed" or "seed" sequence, that is, a sequence within positions 2-8 of a mature microRNA that provides complete Watson-click complement to the miRNA's target sequence. Includes sequences with. The base of the seed region or seed sequence of the microRNA has complete complementarity with the target sequence. MicroRNAs are enzymatically derived from the region of RNA transcripts and folded back into themselves to form short-chain hairpin structures, often referred to as pre-miRNAs (precursor miRNAs). Pre-miRNAs typically have a 2 nucleotide overhang at their 3'end and have a 3'hydroxyl group and a 5'phosphate group. This precursor mRNA is processed in the nucleus and then transported to the cytoplasm, where it is further processed by DICE (RNase III enzyme) to form about 22 nucleotides of mature microRNA. Mature microRNAs are then integrated into ribonuclear particles to form RISC, an RNA-induced silencing complex that mediates gene silencing. The nomenclature for mature miRNAs recognized in the art typically refers to the pre-miRNA arm from which the mature miRNA is derived, where "5p" means that the microRNA is pre-. It means that it is derived from the 5 prime arm of the miRNA hairpin, and "3p" means that the microRNA is derived from the 3 prime end of the pre-miRNA hairpin. As used herein, the miR referred to by number may refer to one of two mature microRNAs (eg, 3p microRNA or 5p microRNA) derived from opposite arms of the same pre-miRNA. All miRs referred to herein are intended to include both 3p and 5p arms per sequence, unless otherwise specified by the designation of 3p or 5p.

一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１または複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含みうる。本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用するか、会合するか、またはこれに結合するように、ｍｉＲＮＡの全てまたは領域に対する十分な相補性を有するポリヌクレオチド内、例えば、ＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。例示的な実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位を、ｍＲＮＡ内、例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内および／または３’ＵＴＲ内に組み入れる。ｍｉＲに対して十分な相補性を有するｍｉＲ結合部位の配列とは、ｍｉＲにより媒介されるｍＲＮＡの調節、例えば、ｍｉＲにより媒介される、ｍＲＮＡの翻訳の抑圧または分解を容易とするのに十分な相補性の程度を指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲに対して十分な相補性を有するｍｉＲ結合部位の配列とは、ｍｉＲにより媒介されるｍＲＮＡの分解、例えば、ｍｉＲによりガイドされる、ｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断を容易とするのに十分な相補性の程度を指す。ｍｉＲ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチド長のｍｉＲ配列、１９～２３ヌクレオチド長のｍｉＲ、最も典型的には、２２ヌクレオチド長のｍｉＲ配列に対する相補性を有しうる。ｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲの一部だけ、例えば、自然発生のｍｉＲより１、２、３、または４ヌクレオチド短い一部に相補的でありうる。所望の調節が、ｍＲＮＡの分解である場合は、十全または完全な相補性（例えば、自然発生のｍｉＲの全てまたは著明な部分にわたり、十全に相補的であるかまたは完全に相補的であること）が好ましい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２、または３ヌクレオチドの置換、末端の付加、および／またはトランケーションを除き、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する。 In some embodiments, the mRNAs of the present disclosure may comprise one or more microRNA (miRNA) binding sites. As used herein, the term "microRNA (miRNA) binding site" provides sufficient complementarity to all or regions of miRNA so that it interacts with, associates with, or binds to miRNA. Refers to a sequence within a polynucleotide having, for example, in DNA or an RNA transcript. In an exemplary embodiment, the miRNA binding site is incorporated within the mRNA, eg, within the 5'UTR and / or 3'UTR of the mRNA. A sequence of miR binding sites with sufficient complementarity to miR is sufficient to facilitate miR-mediated regulation of mRNA, eg, miR-mediated suppression or degradation of mRNA translation. Refers to the degree of complementarity. In an exemplary embodiment of the present disclosure, a sequence of miR binding sites with sufficient complementarity to miR is associated with miR-mediated degradation of the mRNA, eg, RISC-mediated cleavage of the mRNA, which is guided by miR. Refers to the degree of complementarity sufficient to facilitate. The miR binding site may have complementarity to, for example, a 19-25 nucleotide long miR sequence, a 19-23 nucleotide long miR, and most typically a 22 nucleotide long miR sequence. The miR binding site can be complementary to only a portion of the miR, eg, a portion 1, 2, 3, or 4 nucleotides shorter than the naturally occurring miR. If the desired regulation is mRNA degradation, it is fully or completely complementary (eg, over all or prominent parts of the spontaneous miR, fully complementary or completely complementary. There is) is preferable. In some embodiments, the miRNA binding site comprises a sequence that has complementarity (eg, partial or complete complementarity) to the miRNA seed sequence. In certain embodiments, the miRNA binding site comprises a sequence that is fully complementary to the miRNA seed sequence. In some embodiments, the miRNA binding site comprises a sequence that has complementarity (eg, partial or complete complementarity) to the miRNA sequence. In certain embodiments, the miRNA binding site comprises a sequence that has complete complementarity to the miRNA sequence. In some embodiments, the miRNA binding site has complete complementarity with the miRNA sequence, except for 1, 2, or 3 nucleotide substitutions, terminal additions, and / or truncations.

１または複数のｍｉＲ結合性配列を、様々な異なる目的のうちの１または複数のために、本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことができる。例えば、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位の、本開示のｍＲＮＡへの組込みは、問題のｍｉＲＮＡが、ターゲティング可能である（例えば、標的細胞内または標的組織内で発現する）という条件で、分子を、分解または翻訳の低減のためにターゲティングしうる。一部の実施形態では、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位の、本開示のｍＲＮＡへの組込みは、核酸分子の送達時における、オフ標的作用の危険性を低減する場合もあり、かつ／またはｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現の組織特異的調節を可能とする場合もある。さらに他の実施形態では、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位の、本開示のｍＲＮＡへの組込みは、ｉｎ ｖｉｖｏの核酸送達時における免疫応答をモジュレートしうる。さらなる実施形態では、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位の、本開示のｍＲＮＡへの組込みは、本明細書で記載される、脂質を含む化合物および組成物の、血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）もモジュレートしうる。 One or more miR-binding sequences can be incorporated into the mRNAs of the present disclosure for one or more of a variety of different purposes. For example, integration of one or more miRNA binding sites into the mRNA of the present disclosure comprises the molecule, provided that the miRNA in question is targetable (eg, expressed in the target cell or tissue). Can be targeted for reduced decomposition or translation. In some embodiments, integration of one or more miRNA binding sites into the mRNA of the present disclosure may reduce the risk of off-target effects during delivery of nucleic acid molecules and / or by mRNA. It may also allow tissue-specific regulation of the expression of the encoded polypeptide. In yet another embodiment, integration of one or more miRNA binding sites into the mRNAs of the present disclosure can modulate an immune response during in vivo nucleic acid delivery. In a further embodiment, integration of one or more miRNA binding sites into the mRNAs of the present disclosure also accelerates blood clearance (ABC) of lipid-containing compounds and compositions described herein. Can be modulated.

代表的なｍｉＲＮＡは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞など、造血系の免疫細胞、ならびに内皮細胞および血小板など、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８を発現させることが公知であり、かつ／またはサイトカインを分泌することが可能な細胞内の発現および存在度に基づき選択した。したがって、対応するｍｉＲ部位の、ｍＲＮＡへの組込みが、特異的細胞型内の、ｍＲＮＡの不安定化および／またはこれらのｍＲＮＡの翻訳の抑制をもたらしうるように、ｍｉＲＮＡのセットは、これらの細胞の免疫原性の部分的な一因となりうるｍｉＲを含んだ。非限定的な代表例は、造血細胞の多くに特異的な、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、およびｍｉＲ－２２３；Ｂ細胞内で発現する、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、およびｍｉＲ－２２３；造血前駆細胞内で発現する、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６；ならびに形質細胞様樹状細胞内、血小板内、および内皮細胞内で発現する、ｍｉＲ－１２６を含む。組織によるｍｉＲの発現のさらなる議論については、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ－Ｍｏｎｔｏｙａ， Ｒ．ら（２０１４年）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、９巻：ｅ１０２２５９頁；Ｌａｎｄｇｒａｆ， Ｐ．ら（２００７年）、Ｃｅｌｌ、１２９巻：１４０１～１４１４頁；Ｂｉｓｓｅｌｓ， Ｕ．ら（２００９年）、ＲＮＡ、１５巻：２３７５～２３８４頁を参照されたい。証拠立てられる通り、任意の１つのｍｉＲ部位の、３’ＵＴＲ内および／または５’ＵＴＲ内への組込みは、目的の複数の細胞型内で、このような効果を媒介しうる（例えば、ｍｉＲ－１４２は、Ｂ細胞内および樹状細胞内のいずれでも夥多である）。 Representative miRNAs are known to express TLR7 / TLR8 such as hematopoietic immune cells such as B cells, T cells, macrophages, dendritic cells, and endothelial cells and platelets, and / or secrete cytokines. Selected based on possible intracellular expression and abundance. Therefore, a set of miRNAs can result in destabilization of mRNA and / or suppression of translation of these mRNAs within a specific cell type, such that integration of the corresponding miR site into the mRNA can result in these cells. Included miR, which can be a partial contributor to the immunogenicity of. Non-limiting representative examples are miR-142, miR-144, miR-150, miR-155, and miR-223; expressed in B cells, miR-142, miR150, which are specific to many hematopoietic cells. , MiR-16, and miR-223; expressed in hematopoietic progenitor cells, miR-223, miR-451, miR-26a, miR-16; and plasmacytoid dendritic cells, platelets, and endothelial cells. Includes miR-126, expressed in. For further discussion of the expression of miR by tissues, see, for example, Teruel-Montoya, R. et al. Et al. (2014), PLoS One, Vol. 9, e102259; Landgrave, P. et al. Et al. (2007), Cell, Vol. 129, pp. 1401-1414; Bissels, U.S.A. Et al. (2009), RNA, Vol. 15, pp. 2375-2384. As evidenced, integration of any one miR site into the 3'UTR and / or 5'UTR can mediate such effects within multiple cell types of interest (eg, miR). -142 is abundant both in B cells and in dendritic cells).

複数のｍｉＲを伴う同じ細胞型をターゲティングし、３ｐアームおよび５ｐアームの各々に対する結合部位を組み込むことは、これらのいずれもが夥多である（例えば、造血幹細胞内では、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ１４２－５ｐのいずれも夥多である）場合、有益である。こうして、例えば、ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、２つまたはそれよりも多い（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多い）ｍｉＲ結合部位であって、（ｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５およびｍｉＲ－２２３（多くの造血細胞内で発現する）からなる群；または（ｉｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６およびｍｉＲ－２２３（Ｂ細胞内で発現する）からなる群；またはｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６（造血前駆細胞内で発現する）からなる群に由来するｍｉＲ結合部位を含有する。 Targeting the same cell type with multiple miRs and incorporating binding sites for each of the 3p and 5p arms is abundant (eg, in hematopoietic stem cells, miR-142-3p and All of miR142-5p are abundant), which is beneficial. Thus, for example, in certain embodiments, the mRNA construct is two or more (eg, two, three, four, or more) miR binding sites, (i). A group consisting of miR-142, miR-144, miR-150, miR-155 and miR-223 (expressed in many hematopoietic cells); or (ii) miR-142, miR150, miR-16 and miR-223. It contains a miR binding site derived from the group consisting of (expressed in B cells); or the group consisting of miR-223, miR-451, miR-26a, miR-16 (expressed in hematopoietic progenitor cells).

また、複数の、目的の細胞型を、同時にターゲティングするように、多様なｍｉＲを組み合わせる（例えば、造血系の多くの細胞および内皮細胞をターゲティングするように、ｍｉＲ－１４２とｍｉＲ－１２６とを組み合わせる）ことも有益である。こうして、例えば、ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、２つまたはそれよりも多い（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多い）ｍｉＲ結合部位であって、（ｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、造血系の細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、またはｍｉＲ－２２３）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）をターゲティングするか；または（ｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、Ｂ細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、またはｍｉＲ－２２３）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）をターゲティングするか；または（ｉｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、造血前駆細胞（例えば、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、またはｍｉＲ－１６）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）をターゲティングするか；または（ｉｖ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、造血系の細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、またはｍｉＲ－２２３）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、Ｂ細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、またはｍｉＲ－２２３）をターゲティングし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、形質細胞様樹状細胞、血小板、もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）をターゲティングするｍｉＲ結合部位；あるいはｍｉＲ結合部位の前出の４つのクラス（すなわち、造血系をターゲティングするｍｉＲ結合部位、Ｂ細胞をターゲティングするｍｉＲ結合部位、造血前駆細胞をターゲティングするｍｉＲ結合部位、および／または形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞をターゲティングするｍｉＲ結合部位）の、他の任意の可能な組合せを含有する。 It also combines a variety of miRs to target multiple cell types of interest simultaneously (eg, miR-142 and miR-126 to target many cells and endothelial cells of the hematopoietic system). ) Is also beneficial. Thus, for example, in certain embodiments, the mRNA construct is two or more (eg, two, three, four, or more) miR binding sites, (i). At least one of the miRs targets hematopoietic cells (eg, miR-142, miR-144, miR-150, miR-155, or miR-223) and at least one of the miRs is plasmacytoid cells. Targeting plasmacytoid dendritic cells, platelets, or endothelial cells (eg, miR-126); or (ii) at least one of miRs is B cells (eg, miR-142, miR150, miR-16, or). Whether miR-223) is targeted and at least one of miR targets plasmacytoid dendritic cells, platelets, or endothelial cells (eg, miR-126); or at least one of (iii) miR. One targets hematopoietic precursor cells (eg, miR-223, miR-451, miR-26a, or miR-16), and at least one of the miRs is plasmacytoid dendritic cells, platelets, or endothelial cells (eg, miR-223, miR-451, miR-26a, or miR-16). For example, miR-126) is targeted; or at least one of (iv) miR is a hematopoietic cell (eg, miR-142, miR-144, miR-150, miR-155, or miR-223). ), And at least one of the miRs targets B cells (eg, miR-142, miR150, miR-16, or miR-223), and at least one of the miRs is plasmacytoid dendritic. MiR binding sites targeting cells, platelets, or endothelial cells (eg, miR-126); or the above four classes of miR binding sites (ie, miR binding sites targeting hematopoietic systems, miR targeting B cells) It contains any other possible combination of binding sites, miR binding sites targeting hematopoietic precursor cells, and / or miR binding sites targeting plasmacytoid dendritic cells / platelets / endothelial cells.

したがって、一実施形態では、免疫応答をモジュレートするように、ｍＲＮＡは、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現する、１または複数のｍｉＲに結合する、１または複数のｍｉＲ結合性配列を含みうる。今や、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現する、１または複数のｍｉＲの、ｍＲＮＡへの組込みは、免疫細胞の活性化（例えば、活性化Ｂ細胞の頻度により測定される、Ｂ細胞の活性化）、および／またはサイトカインの産生（例えば、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γおよび／またはＴＮＦαの産生）を低減または阻害することが発見されている。今やさらに、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現する、１または複数のｍｉＲの、ｍＲＮＡへの組込みは、ｍＲＮＡによりコードされる目的のタンパク質に対する、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害しうることも発見されている。 Thus, in one embodiment, the mRNA is conventional in immune cells or any cell that expresses TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines so as to modulate the immune response. It may contain one or more miR-binding sequences that bind to one or more miRs that are expressed within (eg, within immune cells of peripheral lymphoid organs and / or splenocytes and / or endothelial cells). Now in conventional immune cells, or in any cell that expresses TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines (eg, peripheral lymphoid organs and / or splenocytes and / or). Integration of one or more miRs expressed (in the immune cells of endothelial cells) into mRNA is the activation of immune cells (eg, activation of B cells, as measured by the frequency of activated B cells). And / or cytokine production (eg, IL-6, IFN-γ and / or TNFα production) has been found to be reduced or inhibited. Now even more, in conventional immune cells, or in any cell that expresses TLR7 and / or TLR8 and secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines (eg, peripheral lymphoid organs and / or splenocytes and /). Integration of one or more miRs expressed (or within the immune cells of endothelial cells) into the mRNA may also reduce or inhibit the anti-drug antibody (ADA) response to the protein of interest encoded by the mRNA. Has been discovered.

別の実施形態では、脂質を含む化合物または組成物に送達されるｍＲＮＡの、血中クリアランスの加速化をモジュレートするように、ｍＲＮＡは、従来の免疫細胞内、またはＴＬＲ７および／もしくはＴＬＲ８を発現させ、炎症促進性のサイトカインおよび／もしくはケモカインを分泌する任意の細胞内で（例えば、末梢リンパ系器官および／または脾細胞および／または内皮細胞の免疫細胞内で）発現する、１または複数のｍｉＲに結合する、１または複数のｍｉＲ結合性配列を含みうる。今や、ｍＲＮＡへの、１または複数のｍｉＲ結合部位の組込みは、脂質を含む化合物または組成物であって、ｍＲＮＡの送達における使用のための化合物または組成物の、血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）を低減または阻害することが発見されている。今やさらに、１または複数のｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡへの組込みは、抗ＰＥＧ抗ＩｇＭの血清レベルを低減し（例えば、Ｂ細胞による、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭの急速な産生を低減または阻害し）、かつ／または、脂質を含む化合物または組成物であって、ｍＲＮＡを含む化合物または組成物の投与後における、形質細胞様樹状細胞の成長および／もしくは活性化を低減もしくは阻害することも発見されている。 In another embodiment, the mRNA expresses TLR7 and / or TLR8 in conventional immune cells or so as to modulate the acceleration of blood clearance of the mRNA delivered to the lipid-containing compound or composition. And / or expressed in any cell that secretes pro-inflammatory cytokines and / or chemokines (eg, in the immune cells of peripheral lymphoid organs and / or splenocytes and / or endothelial cells). Can include one or more miR-binding sequences that bind to. Integration of one or more miR binding sites into mRNA is now a lipid-containing compound or composition that accelerates blood clearance (ABC) of the compound or composition for use in the delivery of mRNA. ) Has been found to be reduced or inhibited. Now further, integration of one or more miR binding sites into mRNA reduces serum levels of anti-PEG anti-IgM (eg, reduces the rapid production of polyethylene glycol (PEG) -recognizing IgM by B cells. Or inhibit) and / or reduce or inhibit the growth and / or activation of plasmacytoid dendritic cells after administration of the lipid-containing compound or composition and the mRNA-containing compound or composition. It has also been discovered.

このようなｍｉＲ配列は、任意の公知の、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡであって、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されているマイクロＲＮＡを含むがこれらに限定されないマイクロＲＮＡに対応しうる。免疫細胞内で発現するｍｉＲの非限定的な例は、脾臓細胞内、骨髄系細胞内、樹状細胞内、形質細胞様樹状細胞内、Ｂ細胞内、Ｔ細胞内、および／またはマクロファージ内で発現するｍｉＲを含む。例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７は、骨髄系細胞内で発現し、ｍｉＲ－１５５は、樹状細胞内、Ｂ細胞内、およびＴ細胞内で発現し、ｍｉＲ－１４６は、ＴＬＲにより刺激されると、マクロファージ内で上方調節され、ｍｉＲ－１２６は、形質細胞様樹状細胞内で発現する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲは、免疫細胞内で、夥多に、または優先的に発現する。例えば、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１２６－５ｐ）、ｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、およびｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐおよび／またはｍｉＲ１５５－５ｐ）は、免疫細胞内で、夥多に発現する。当技術分野では、これらのマイクロＲＮＡ配列が公知であるので、当業者は、これらのマイクロＲＮＡが、ワトソン－クリック型相補性に基づき結合する結合性配列または標的配列をたやすくデザインすることができる。 Such miR sequences are any known microRNAs expressed in immune cells, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety, US Publication No. US2005 / 0261218 and It can accommodate microRNAs including, but not limited to, microRNAs taught in US Publication US 2005/0059005. Non-limiting examples of miR expressed in immune cells are intracellular spleen cells, myeloid cells, dendritic cells, plasmacytoid dendritic cells, B cells, T cells, and / or macrophages. Contains miR expressed in. For example, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, and miR-27 are expressed in myeloid cells, and miR-155 is a tree. Expressed intracellularly, in B cells, and in T cells, miR-146 is upregulated in macrophages when stimulated by TLR, and miR-126 is expressed in plasmacytoid dendritic cells. .. In certain embodiments, miR is expressed extensively or preferentially within immune cells. For example, miR-142 (miR-142-3p and / or miR-142-5p), miR-126 (miR-126-3p and / or miR-126-5p), miR-146 (miR-146-3p and) and / Or miR-146-5p), and miR-155 (miR-155-3p and / or miR155-5p) are abundantly expressed in immune cells. As these microRNA sequences are known in the art, one of skill in the art can easily design binding or target sequences to which these microRNAs bind based on Watson-click complementarity. ..

したがって、多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択されるｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、１つ～４つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、およびこれらの組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものでありうる。一実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する、同じｍｉＲ結合部位の、２つまたはそれよりも多い（例えば、２つ、３つ、４つの）コピー、例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７からなるｍｉＲの群から選択されるｍｉＲ結合部位の、２つまたはそれよりも多いコピーを含む。 Therefore, in various embodiments, the mRNA is a group consisting of miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, and miR-27. Contains at least one microRNA binding site for miR selected from. In another embodiment, the mRNA comprises at least two miR binding sites for microRNA expressed in immune cells. In various embodiments, the mRNA comprises 1 to 4, 1, 2, 3, or 4 miR binding sites for microRNAs expressed in immune cells. In another embodiment, the mRNA comprises three miR binding sites. These miR binding sites are a group consisting of miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, and combinations thereof. Can be for microRNAs selected from. In one embodiment, the mRNA is expressed in two or more (eg, two, three, four) copies of the same miR binding site, eg, miR-142, miR-. Two or more of the miR binding sites selected from the miR group consisting of 146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27. Includes a copy.

例えば、一実施形態では、ｍＲＮＡは、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを含む。実施例８で記載する通り、ある特定の実施形態では、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーの使用は、単一のｍｉＲ結合部位の使用と比較して、有益な特性を呈示しうる。３つのｍｉＲ結合部位を含有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号３８（３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）、配列番号４０（３つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）、および配列番号５４（３つのｍｉＲ－１２２結合部位）に示す。 For example, in one embodiment, the mRNA comprises three copies of the same miR binding site. As described in Example 8, in certain embodiments, the use of three copies of the same miR binding site may exhibit beneficial properties as compared to the use of a single miR binding site. Non-limiting examples of sequences of 3'UTR containing 3 miR binding sites are SEQ ID NO: 38 (3 miR-142-3p binding sites), SEQ ID NO: 40 (3 miR-142-5p binding sites). , And SEQ ID NO: 54 (three miR-122 binding sites).

別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する、少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位の、２つまたはそれよりも多い（例えば、２つ、３つ、４つの）コピーを含む。２つまたはそれよりも多い、異なるｍｉＲ結合部位を含有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号３３（１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、および１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位）、配列番号４７（１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、および１つのｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位）、配列番号４１（２つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、および１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）、および配列番号４４（２つのｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、および１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）に示す。 In another embodiment, the mRNA comprises two or more (eg, two, three, four) copies of at least two different miR binding sites expressed within an immune cell. Non-limiting examples of sequences of 3'UTR containing two or more different miR binding sites are shown in SEQ ID NO: 33 (one miR-142-3p binding site and one miR-126-3p). Binding Site), SEQ ID NO: 47 (one miR-142-3p binding site and one miR-122-5p binding site), SEQ ID NO: 41 (two miR-142-5p binding sites, and one miR-142). -3p binding site), and SEQ ID NO: 44 (two miR-155-5p binding sites and one miR-142-3p binding site).

別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）に対する結合部位を含む。 In another embodiment, the mRNA comprises at least two miR binding sites for microRNAs expressed in immune cells, in which case one of the miR binding sites is for miR-142-3p. .. In various embodiments, the mRNA is miR-142-3p and miR-155 (miR-155-3p or miR-155-5p), miR-142-3p and miR-146 (miR-146-3 or miR-). 146-5p), or a binding site for miR-142-3p and miR-126 (miR-126-3p or miR-126-5p).

別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１２６－３ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６－３ｐおよびｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６－３ｐおよびｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐまたはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１２６－３ｐおよびｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ）に対する結合部位を含む。 In another embodiment, the mRNA comprises at least two miR binding sites for microRNAs expressed in immune cells, in which case one of the miR binding sites is for miR-126-3p. .. In various embodiments, the mRNA is miR-126-3p and miR-155 (miR-155-3p or miR-155-5p), miR-126-3p and miR-146 (miR-146-3p or miR-). 146-5p), or a binding site for miR-126-3p and miR-142 (miR-142-3p or miR-142-5p).

別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１４２－５ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－５ｐおよびｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－５ｐおよびｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１４２－５ｐおよびｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）に対する結合部位を含む。 In another embodiment, the mRNA comprises at least two miR binding sites for microRNAs expressed in immune cells, in which case one of the miR binding sites is for miR-142-5p. .. In various embodiments, the mRNA is miR-142-5p and miR-155 (miR-155-3p or miR-155-5p), miR-142-5p and miR-146 (miR-146-3 or miR-). 146-5p), or a binding site for miR-142-5p and miR-126 (miR-126-3p or miR-126-5p).

さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、この場合、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１５５－５ｐに対するものである。多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１５５－５ｐおよびｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１５５－５ｐおよびｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１５５－５ｐおよびｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）に対する結合部位を含む。 In yet another embodiment, the mRNA comprises at least two miR binding sites for microRNAs expressed in immune cells, in which case one of the miR binding sites is for miR-155-5p. be. In various embodiments, the mRNA is miR-155-5p and miR-142 (miR-142-3p or miR-142-5p), miR-155-5p and miR-146 (miR-146-3 or miR-). 146-5p), or a binding site for miR-155-5p and miR-126 (miR-126-3p or miR-126-5p).

例示的な実施形態では、１または複数のｍｉＲ結合部位は、ｍＲＮＡが、所望の特性を有するように、３’ＵＴＲ内に位置し、５’ＵＴＲ内に位置し、３’ＵＴＲ内および５’ＵＴＲ内のいずれにも位置する。ｍｉＲ結合部位は、ｍＲＮＡ構築物内のコード領域の終止コドンの直後（または構築物内に、終止コドンの複数のコピーが存在する場合、最後の終止コドンの直後）の３’ＵＴＲ内に位置する場合もあり、ｍｉＲ結合部位は、終止コドンのさらに下流に位置する場合もあるが、この場合、終止コドンとｍｉＲ結合部位との間には、３’ＵＴＲ塩基が存在する。例えば、３’ＵＴＲ内の、ｍｉＲのための、可能な挿入部位の、３つの非限定的な例を、配列番号４８、４９、および５０に示すが、これは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位を、それぞれ、３’ＵＴＲ内の、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つの中に挿入した３’ＵＴＲ配列を示す。さらに、１または複数のｍｉＲ結合部位は、５’ＵＴＲ内の、１または複数の可能な挿入部位に位置しうる。例えば、５’ＵＴＲ内の、ｍｉＲのための、可能な挿入部位の、３つの非限定的な例を、さらに実施例９に記載し、配列番号５５、５６、および５７に示すが、これは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位を、それぞれ、５’ＵＴＲ内の、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つの中に挿入した５’ＵＴＲ配列を示す。加えて、配列番号５８、５９、および６０は、ｍｉＲ－１２２部位を、それぞれ、５’ＵＴＲ内の、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つの中に挿入した５’ＵＴＲ配列も示す。 In an exemplary embodiment, one or more miR binding sites are located within the 3'UTR, within the 5'UTR, and within the 3'UTR and 5'so that the mRNA has the desired properties. Located anywhere in the UTR. The miR binding site may be located within 3'UTR immediately after the stop codon of the coding region within the mRNA construct (or immediately after the last stop codon if there are multiple copies of the stop codon within the construct). Yes, the miR binding site may be located further downstream of the stop codon, in which case there is a 3'UTR base between the stopping codon and the miR binding site. For example, three non-limiting examples of possible insertion sites for miR in the 3'UTR are shown in SEQ ID NOs: 48, 49, and 50, which include the miR-142-3p site. , Each show a 3'UTR sequence inserted into one of three different possible insertion sites within the 3'UTR. In addition, one or more miR binding sites may be located within one or more possible insertion sites within the 5'UTR. For example, three non-limiting examples of possible insertion sites for miR in the 5'UTR are further described in Example 9 and set forth in SEQ ID NOs: 55, 56, and 57, which are: , MiR-142-3p sites are shown in the 5'UTR sequence, each inserted into one of three different possible insertion sites within the 5'UTR. In addition, SEQ ID NOs: 58, 59, and 60 also indicate the 5'UTR sequence in which the miR-122 site was inserted into one of three different possible insertion sites within the 5'UTR, respectively.

一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１～１００ヌクレオチドの中に配置される。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置される。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、終止コドンの直後の３’ＵＴＲ内、または終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１５～２０ヌクレオチドの中、または終止コドンの後の、３’ＵＴＲの７０～８０ヌクレオチドの中に配置される。他の実施形態では、３’ＵＴＲは、１つを超えるｍｉＲ結合部位（例えば、２つ～４つのｍｉＲ結合部位）を含み、この場合、各ｍｉＲ結合部位の間には、スペーサー領域（例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチドの長さの）が存在しうる。別の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲ結合部位の末端と、ポリＡテールのヌクレオチドとの間のスペーサー領域を含む。例えば、１０～１００、２０～７０または３０～５０ヌクレオチドの長さのスペーサー領域は、ｍｉＲ結合部位の末端と、ポリＡテールの始端との間にありうる。 In one embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and at least one microRNA binding site is 1-100 nucleotides of 3'UTR after the stop codon. Placed inside. In one embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and at least one microRNA binding site for miR expressed in immune cells is after the stop codon. It is located within 30-50 nucleotides of the 3'UTR. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and at least one microRNA binding site for miR expressed in immune cells is after the stop codon. It is located in at least 50 nucleotides of the 3'UTR. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and at least one microRNA binding site for miR expressed in immune cells is immediately immediately after the stop codon. It is located within 3'UTR or within 15-20 nucleotides of 3'UTR after the stop codon, or within 70-80 nucleotides of 3'UTR after the stop codon. In another embodiment, the 3'UTR comprises more than one miR binding site (eg, 2-4 miR binding sites), in which case a spacer region (eg, eg) between each miR binding site. There can be 10-100, 20-70, or 30-50 nucleotides in length). In another embodiment, the 3'UTR comprises a spacer region between the end of the miR binding site and the nucleotide of the poly A tail. For example, a spacer region with a length of 10-100, 20-70 or 30-50 nucleotides can be between the end of the miR binding site and the beginning of the poly A tail.

一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの前の（上流の）、５’ＵＴＲの１～１００ヌクレオチドの中に配置される。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの前の（上流の）、５’ＵＴＲの１０～５０ヌクレオチドの中に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの前の（上流の）、５’ＵＴＲの少なくとも２５ヌクレオチドの中に配置される。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの直前の５’ＵＴＲ内、または開始コドンの前の、５’ＵＴＲの１５～２０ヌクレオチドの中、または開始コドンの前の、５’ＵＴＲの７０～８０ヌクレオチドの中に配置される。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、１つを超えるｍｉＲ結合部位（例えば、２つ～４つのｍｉＲ結合部位）を含み、この場合、各ｍｉＲ結合部位の間には、スペーサー領域（例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチドの長さの）が存在しうる。 In one embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises the start codon and at least one microRNA binding site is one of the (upstream), 5'UTRs before the start codon. Placed within ~ 100 nucleotides. In one embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises the start codon and at least one microRNA binding site for miR expressed in immune cells is prior to the start codon ( (Upstream) located within 10-50 nucleotides of the 5'UTR. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises the start codon and at least one microRNA binding site for miR expressed in immune cells is prior to the start codon. It is located within at least 25 nucleotides of the (upstream) 5'UTR. In another embodiment, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises the start codon and at least one microRNA binding site for the miR expressed in the immune cell is immediately preceding the start codon. It is located in the 5'UTR, or in the 15-20 nucleotides of the 5'UTR before the start codon, or in the 70-80 nucleotides of the 5'UTR before the start codon. In another embodiment, the 5'UTR comprises more than one miR binding site (eg, 2-4 miR binding sites), in which case a spacer region (eg, eg) between each miR binding site. There can be 10-100, 20-70, or 30-50 nucleotides in length).

一実施形態では、３’ＵＴＲは、１つを超える終止コドンを含み、この場合、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位は、終止コドンの下流に位置する。例えば、３’ＵＴＲは、１つ、２つ、または３つの終止コドンを含みうる。使用しうる三重終止コドンの非限定的な例は、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡおよびＵＡＧＵＡＧＵＡＧを含む。３’ＵＴＲ内には、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、終止コドンと直に隣接して位置する場合もあり、最後の終止コドンの任意の数のヌクレオチド下流に位置する場合もある。３’ＵＴＲが、複数のｍｉＲ結合部位を含む場合、これらの結合部位が、構築物内で互いと直接隣り合わせで（すなわち、順々に）位置する場合もあり、代替的に、スペーサーヌクレオチドが、各結合部位の間に位置する場合もある。 In one embodiment, the 3'UTR comprises more than one stop codon, in which case at least one miR binding site is located downstream of the stop codon. For example, the 3'UTR may include one, two, or three stop codons. Non-limiting examples of triple stop codons that can be used include UGAUAAUAG, UGAUAGUAA, UAAUGAUAG, UGAUAAUAA, UGAUAGUAG, UAAUGAUGA, UAAUAGUAG, UGAUGAUGA, UAAUAAUAA and UAGUAGUAG. Within the 3'UTR, for example, one, two, three, or four miR binding sites, such as the miR-142-3p binding site, may be located immediately adjacent to the stop codon. It may be located downstream of any number of nucleotides in the last stop codon. If the 3'UTR contains multiple miR binding sites, these binding sites may be located next to each other (ie, in sequence) directly next to each other in the construct, with alternative spacer nucleotides in each. It may be located between the binding sites.

一実施形態では、３’ＵＴＲは、単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位が、第３の終止コドンの下流に配置される、３つの終止コドンを含む。３つの終止コドンと、最後の終止コドンの下流の、異なる位置に配置される単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位とを有する、３’ＵＴＲの配列の非限定的な例を、配列番号３１および４８～５０に示す。 In one embodiment, the 3'UTR comprises three stop codons in which a single miR-142-3p binding site is located downstream of the third stop codon. A non-limiting example of a 3'UTR sequence with three stop codons and a single miR-142-3p binding site located downstream of the last stop codon, SEQ ID NO: 31. And 48-50.

一実施形態では、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。多様な実施形態では、３’ＵＴＲは、免疫細胞内で発現する、好ましくは免疫細胞内で、夥多に、または優先的に発現するｍｉＲに対する、１つ～４つ、少なくとも２つ、１つ、２つ、３つ、または４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。 In one embodiment, the mmRNA is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, a 3'UTR containing at least one microRNA binding site for miR expressed in immune cells, and. Includes the 3'tailing region of the linked nucleoside. In various embodiments, the 3'UTR is expressed in the intracellular, preferably one to four, at least two, one for miRs that are abundantly or preferentially expressed in the immune cells. Includes 2, 3, or 4 microRNA binding sites.

一実施形態では、免疫細胞内で発現する少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号２に示される配列を含む。 In one embodiment, the at least one miR expressed in the immune cell is the miR-142-3p microRNA binding site. In one embodiment, the miR-142-3p microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 3. In one embodiment, the 3'UTR of the mRNA containing the miR-142-3p microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

一実施形態では、免疫細胞内で発現する少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号２６に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号２７に示される配列を含む。 In one embodiment, the at least one miR expressed in the immune cell is the miR-126 microRNA binding site. In one embodiment, the miR-126 binding site is a miR-126-3p binding site. In one embodiment, the miR-126-3p microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 26. In one embodiment, the 3'UTR of the mRNA comprising the miR-126-3p microRNA binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 27.

本開示のマイクロＲＮＡ結合部位が結合しうるｍｉＲの、非限定的な例示的配列は、以下：ｍｉＲ－１４２－３ｐ（配列番号８）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ（配列番号９）、ｍｉＲ－１４６－３ｐ（配列番号１０）、ｍｉＲ－１４６－５ｐ（配列番号１１）、ｍｉＲ－１５５－３ｐ（配列番号１２）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ（配列番号１３）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号１４）、ｍｉＲ－１２６－５ｐ（配列番号１５）、ｍｉＲ－１６－３ｐ（配列番号１６）、ｍｉＲ－１６－５ｐ（配列番号１７）、ｍｉＲ－２１－３ｐ（配列番号１８）、ｍｉＲ－２１－５ｐ（配列番号１９）、ｍｉＲ－２２３－３ｐ（配列番号２０）、ｍｉＲ－２２３－５ｐ（配列番号２１）、ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号２２）、ｍｉＲ－２４－５ｐ（配列番号２３）、ｍｉＲ－２７－３ｐ（配列番号２４）、およびｍｉＲ－２７－５ｐ（配列番号２５）を含む。当技術分野では、免疫細胞内で発現する（例えば、免疫細胞内で、夥多に、または優先的に発現する）、他の適するｍｉＲ配列が公知であり、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭａｎｃｈｅｓｔｅｒによるマイクロＲＮＡデータベースである、ｍｉＲＢａｓｅにおいて利用可能である。前述のｍｉＲのうちのいずれかに結合する部位は、ｍｉＲに対する、ワトソン－クリック型相補性、典型的に、ｍｉＲに対する、１００％の相補性に基づきデザインし、本明細書で記載される、本開示のｍＲＮＡ構築物へと挿入することができる。 Non-limiting exemplary sequences of miR to which the microRNA binding sites of the present disclosure may bind include: miR-142-3p (SEQ ID NO: 8), miR-142-5p (SEQ ID NO: 9), miR-146. -3p (SEQ ID NO: 10), miR-146-5p (SEQ ID NO: 11), miR-155-3p (SEQ ID NO: 12), miR-155-5p (SEQ ID NO: 13), miR-126-3p (SEQ ID NO: 14) ), MiR-126-5p (SEQ ID NO: 15), miR-16-3p (SEQ ID NO: 16), miR-16-5p (SEQ ID NO: 17), miR-21-3p (SEQ ID NO: 18), miR-21- 5p (SEQ ID NO: 19), miR-223-3p (SEQ ID NO: 20), miR-223-5p (SEQ ID NO: 21), miR-24-3p (SEQ ID NO: 22), miR-24-5p (SEQ ID NO: 23). , MiR-27-3p (SEQ ID NO: 24), and miR-27-5p (SEQ ID NO: 25). Other suitable miR sequences that are expressed in the intracellular (eg, abundantly or preferentially in the immune cell) are known in the art, eg, a microRNA database by the Universality of Manchester. Is available in miRBase. Sites that bind to any of the aforementioned miRs are designed and described herein based on Watson-click complementarity to miR, typically 100% complementarity to miR. It can be inserted into the disclosed mRNA construct.

さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位の、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡへの組込みにより、本開示のポリペプチドの治療ウィンドウおよび／または示差的発現（例えば、組織特異的発現）を変更することができる。マイクロＲＮＡが、ｍＲＮＡを調節し、これにより、タンパク質の発現を調節することが公知である組織の例は、肝臓（例えば、ｍｉＲ－１２２）、筋肉（例えば、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、およびｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１７～９２およびｍｉＲ－１２６）、骨髄系細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７）、脂肪組織（例えば、ｌｅｔ－７およびｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（例えば、ｍｉＲ－１ｄおよびｍｉＲ－１４９）、腎臓（例えば、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、およびｍｉＲ－２０４）、および肺上皮細胞（例えば、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、およびｍｉＲ－１２６）を含むがこれらに限定されない。したがって、多様な実施形態では、ｍＲＮＡは、単独または組合せの、前述のｍｉＲのうちのいずれかに対する、１または複数の結合部位を含み、これにより、コードされる目的のタンパク質の、組織における発現をモジュレートしうる。 In yet another embodiment, integration of the miRNA binding site into the mRNA encoding the polypeptide can alter the therapeutic window and / or differential expression (eg, tissue-specific expression) of the polypeptides of the present disclosure. can. Examples of tissues in which microRNAs are known to regulate mRNA and thereby regulate protein expression include liver (eg, miR-122), muscle (eg, miR-133, miR-206, and). miR-208), endothelial cells (eg, miR-17-92 and miR-126), myeloid cells (eg, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223). , MiR-24, and miR-27), adipose tissue (eg, let-7 and miR-30c), heart (eg, miR-1d and miR-149), kidneys (eg, miR-192, miR-194,). And miR-204), and lung epithelial cells (eg, let-7, miR-133, and miR-126), but are not limited to these. Thus, in various embodiments, the mRNA comprises one or more binding sites for any of the aforementioned miRs, either alone or in combination, thereby expressing the encoded protein of interest in a tissue. Can be modulated.

例えば、ｍＲＮＡは、別の組織型内と比較して、１つの組織型内の発現が高度なｍｉＲＮＡが結合する、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含みうる。別の例では、ｍＲＮＡは、由来する組織が同じ非がん性細胞内と比較して、がん細胞内の発現が低度なｍｉＲＮＡが結合する、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含みうる。低レベルの、このようなｍｉＲＮＡを発現させるがん細胞内に存在する場合、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドは、発現の増大を示すことが典型的であろう。ポリペプチドが、アポトーシスを誘導することが可能である場合、これは、正常細胞と比較した、がん細胞の優先的な細胞殺滅を結果としてもたらしうる。 For example, an mRNA may contain one or more miRNA binding sites to which highly expressed miRNAs within one tissue type bind as compared to within another tissue type. In another example, the mRNA may contain one or more miRNA binding sites to which miRNAs with low expression in cancer cells bind as compared to those in non-cancerous cells from which the tissue is derived. When present in low-level, cancer cells expressing such miRNAs, the polypeptide encoded by the mRNA will typically exhibit increased expression. If the polypeptide is capable of inducing apoptosis, this may result in preferential cell killing of cancer cells compared to normal cells.

例えば、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）は、正常肝細胞と比較して、低レベルのｍｉＲ－１２２を発現させることが典型的である。したがって、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡであって、少なくとも１つのｍｉＲ－１２２結合部位（例えば、ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ内の）を含むｍＲＮＡは、正常肝細胞内では、比較的低レベルのポリペプチドを発現させ、肝がん細胞内では、比較的高レベルのポリペプチドを発現させることが典型的であろう。ポリペプチドが、アポトーシスを誘導することが可能である場合、これは、正常肝細胞と比較した、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）の優先的な細胞殺滅を引き起こしうる。 For example, liver cancer cells (eg, hepatocellular carcinoma cells) typically express lower levels of miR-122 as compared to normal liver cells. Thus, mRNA encoding a polypeptide that contains at least one miR-122 binding site (eg, within the 3'-UTR of the mRNA) is a relatively low level polypeptide in normal hepatocytes. Will typically be expressed and relatively high levels of the polypeptide will be expressed in hepatocyte cells. If the polypeptide is capable of inducing apoptosis, it can cause preferential cell killing of liver cancer cells (eg, hepatocellular carcinoma cells) compared to normal liver cells.

したがって、組織による、コードされる目的のタンパク質の発現をモジュレートする、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡへの組込みの非限定的な例として、本開示のｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ－１２２結合部位を含みうる。例えば、本開示のｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２シード配列と、部分的または完全に相補的な配列を含む、ｍｉＲ－１２２結合部位を含みうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２２シード配列は、ｍｉＲ－１２２のヌクレオチド２～７に対応しうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２２シード配列は、５’－ＧＧＡＧＵＧ－３’でありうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２２シード配列は、ｍｉＲ－１２２のヌクレオチド２～８でありうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２２シード配列は、５’－ＧＧＡＧＵＧＵ－３’でありうる。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２２結合部位は、５’－ＵＡＵＵＵＡＧＵＧＵＧＡＵＡＡＵＧＧＣＧＵＵ－３’（配列番号４５）もしくは５’－ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡ－３’（配列番号４６）のヌクレオチド配列、またはこれらの相補体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲ－１２２結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れは、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現であって、低レベルのｍｉＲ－１２２を発現させる、他の細胞型と比較した、正常肝細胞内の発現を減殺しうる。他の実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲ－１２２結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れは、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現であって、正常肝細胞と比較した、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）内の発現の増大を可能としうる。 Thus, as a non-limiting example of the integration of a miR binding site into an mRNA that modulates the expression of the protein of interest encoded by the tissue, the mRNAs of the present disclosure have at least one miR-122 binding site. Can include. For example, the mRNAs of the present disclosure may comprise a miR-122 binding site comprising a miR-122 seed sequence and a partially or fully complementary sequence. In some embodiments, the miR-122 seed sequence may correspond to nucleotides 2-7 of miR-122. In some embodiments, the miR-122 seed sequence can be 5'-GGAGUG-3'. In some embodiments, the miR-122 seed sequence can be nucleotides 2-8 of miR-122. In some embodiments, the miR-122 seed sequence can be 5'-GGAGUGU-3'. In some embodiments, the miR-122 binding site comprises the nucleotide sequence of 5'-UAUUAGUGUGAUAAUGGCGGUU-3'(SEQ ID NO: 45) or 5'-CAAAACCCAUUGUCACACCA-3' (SEQ ID NO: 46), or a complement thereof. .. In some embodiments, the incorporation of at least one miR-122 binding site into the mRNA is the expression of the polypeptide encoded by the mRNA, another cell type that expresses low levels of miR-122. Can diminish expression in normal hepatocytes as compared to. In another embodiment, the incorporation of at least one miR-122 binding site into the mRNA is the expression of the polypeptide encoded by the mRNA and is a liver cancer cell (eg, liver) compared to normal hepatocytes. It may be possible to increase the expression in (cell cancer cells).

さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、その３’ＵＴＲ）は、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏの核酸送達時における免疫の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化、サイトカインの産生、ＡＤＡ応答）を低減または阻害するように、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むことが可能であり、組織による、コードされる目的のタンパク質の発現をモジュレートするための、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含みうる。例えば、一実施形態では、ｍＲＮＡは、それにより、正常肝細胞と比較した、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）内の、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現の増大を可能とするように、ｍｉＲ－１２２結合部位を含み、また、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、１または複数のｍｉＲ結合部位であって、例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７からなる群から選択されるｍｉＲ結合部位も含む。 In yet another embodiment, the mRNA (eg, its 3'UTR) thereby reduces immune activation (eg, B cell activation, cytokine production, ADA response) during in vivo nucleic acid delivery. Alternatively, it is possible to include at least one miR binding site for miR expressed in immune cells to inhibit, and at least one to modulate the expression of the protein of interest encoded by the tissue. It may include a miR binding site. For example, in one embodiment, the mRNA thereby allows increased expression of the polypeptide encoded by the mRNA in a hepatocellular carcinoma cell (eg, hepatocellular carcinoma cell) as compared to normal hepatocellular carcinoma. Thus, it comprises a miR-122 binding site and is also one or more miR binding sites for miR expressed in immune cells, eg, miR-142, miR-146, miR-155, miR-126. Also includes a miR binding site selected from the group consisting of, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27.

別の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、その３’ＵＴＲ）は、それにより、例えば、Ｂ細胞による、例えば、ＰＥＧに対するＩｇＭの産生を低減もしくは阻害し、かつ／またはｐＤＣの成長および／もしくは活性化を低減もしくは阻害することにより、血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むことが可能であり、組織による、コードされる目的のタンパク質の発現をモジュレートするための、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含みうる。例えば、一実施形態では、ｍＲＮＡは、それにより、正常肝細胞と比較した、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）内の、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現の増大を可能とするように、ｍｉＲ－１２２結合部位を含み、また、１または複数のｍｉＲ結合部位であって、例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７からなる群から選択されるｍｉＲ結合部位も含む。 In another embodiment, the mRNA (eg, its 3'UTR) thereby reduces or inhibits the production of IgM by, for example, B cells, eg, for PEG, and / or the growth and / or activation of pDC. It is possible to include at least one miR binding site to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance by reducing or inhibiting the expression of the protein of interest encoded by the tissue. It may contain at least one miR binding site for the purpose. For example, in one embodiment, the mRNA thereby allows increased expression of the polypeptide encoded by the mRNA in a hepatocellular carcinoma cell (eg, hepatocellular carcinoma cell) as compared to normal hepatocellular carcinoma. As such, it comprises a miR-122 binding site and is one or more miR binding sites, eg, miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, It also includes a miR binding site selected from the group consisting of miR-223, miR-24, miR-27.

一実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位およびｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位およびｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位およびｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位およびｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位およびｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたは１４２－５ｐ）結合部位、およびｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたは１４２－５ｐ）結合部位、およびｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位、ｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたは１２６－５ｐ）結合部位、およびｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）結合部位を含む。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２結合部位、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ）結合部位、ｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたは１２６－５ｐ）結合部位、およびｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）結合部位を含む。これらの実施形態のうちのいずれかでは、ｍｉＲ－１２２結合部位は、ｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位でありうる。 In one embodiment, the mRNA comprises a miR-122 binding site and a miR-142-3p binding site. In another embodiment, the mRNA comprises a miR-122 binding site and a miR-142-5p binding site. In another embodiment, the mRNA comprises a miR-122 binding site and a miR-126-3p binding site. In another embodiment, the mRNA comprises a miR-122 binding site and a miR-155-5p binding site. In another embodiment, the mRNA comprises a miR-122 binding site and a miR-126-3p binding site. In another embodiment, the mRNA is a miR-122 binding site, a miR-142 (miR-142-3p or 142-5p) binding site, and a miR-126 (miR-126-3p or miR-126-5p) binding site. Including the site. In another embodiment, the mRNA is a miR-122 binding site, a miR-142 (miR-142-3p or 142-5p) binding site, and a miR-155 (miR-155-3p or miR-155-5p) binding site. Including the site. In another embodiment, the mRNA is a miR-122 binding site, a miR-126 (miR-126-3p or 126-5p) binding site, and a miR-155 (miR-155-3p or miR-155-5p) binding site. Including the site. In yet another embodiment, the mRNA is a miR-122 binding site, a miR-142 (miR-142-3p or miR-142-5p) binding site, a miR-126 (miR-126-3p or 126-5p) binding site. Includes a site and a miR-155 (miR-155-3p or miR-155-5p) binding site. In any of these embodiments, the miR-122 binding site can be a miR-122-5p binding site.

ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位およびｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位の両方を含む、３’ＵＴＲ配列の非限定的な例を、配列番号４７に示す。配列番号４７の３’ＵＴＲの構造は、その５’末端における３つの終止コドンと、これに直に後続する、単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、この下流に後続するスペーサーヌクレオチドと、次いで、単一のｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位とを含む。ｍｉＲ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐと、ｍｉＲ－１２２－５ｐと）の間の距離は、大幅に変動させることができ、多数の異なる構築物が、２つのｍｉＲ結合部位の異なる配置について調べられているが、全ての構築物が機能的であった。ある特定の実施形態では、ヌクレオチドスペーサーが、ＲＩＳＣの、各結合部位への結合を可能とするのに十分な長さの、２つのｍｉＲ結合部位の間に位置する。一実施形態では、２つのｍｉＲ結合部位は、互いから約４０塩基隔てて位置し、３’ＵＴＲの全長を、約１００～１１０塩基とする。 A non-limiting example of a 3'UTR sequence containing both a miR-142-3p binding site and a miR-122-5p binding site is shown in SEQ ID NO: 47. The structure of the 3'UTR of SEQ ID NO: 47 consists of three stop codons at its 5'end, a single miR-142-3p binding site immediately following it, and a spacer nucleotide following this downstream. It then comprises a single miR-122-5p binding site. The distance between the miR binding sites (eg, miR-142-3p and miR-122-5p) can vary significantly and many different constructs examine different arrangements of the two miR binding sites. However, all the constructs were functional. In certain embodiments, the nucleotide spacer is located between the two miR binding sites long enough to allow RISC to bind to each binding site. In one embodiment, the two miR binding sites are located about 40 bases apart from each other, with a total length of the 3'UTR of about 100-110 bases.

目的のタンパク質
本開示のｍＲＮＡは、目的のタンパク質、典型的に、被験体における使用のための治療的特性を有するタンパク質をコードしうる。目的のタンパク質は、ｍＲＮＡによりコードされうる、本質的に任意のタンパク質でありうる。特に、目的のタンパク質は、被験体における抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発するなど、免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化）を刺激し、したがって、被験体における免疫細胞の活性化を低減または阻害すること（例えば、ＡＤＡ応答を低減すること）が望ましいタンパク質でありうる。多様な実施形態では、目的のタンパク質は、例えば、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質でありうる。治療用タンパク質の非限定的な例は、例えば、血液因子（因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩなど）、補体因子、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、およびＭＵＴ１を含む。サイトカインの非限定的な例は、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、リンホカインなどを含む。増殖因子の非限定的な例は、エリスロポエチン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＩＧＦ、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦなどを含む。抗体の非限定的な例は、例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、イピリムマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、イトリズマブ、トラロキヌマブを含む。融合タンパク質の非限定的な例は、例えば、エタネルセプト、アバタセプト、およびバラタセプトを含む。 Protein of interest The mRNA of the present disclosure may encode a protein of interest, typically a protein with therapeutic properties for use in a subject. The protein of interest can be essentially any protein that can be encoded by mRNA. In particular, the protein of interest stimulates immune cell activation (eg, B cell activation), such as inducing an anti-drug antibody (ADA) response in the subject, and thus activation of the immune cell in the subject. (Eg, reducing the ADA response) can be the desired protein. In various embodiments, the protein of interest can be, for example, a therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion protein. Non-limiting examples of therapeutic proteins include, for example, blood factors (such as factor VIII and factor VII), complement factors, low density lipoprotein receptors (LDLR), and MUT1. Non-limiting examples of cytokines include, for example, interleukins, interferons, chemokines, lymphokines and the like. Non-limiting examples of growth factors include erythropoietin, EGF, PDGF, FGF, TGF, IGF, TNF, CSF, MCSF, GMCSF and the like. Non-limiting examples of antibodies include, for example, adalimumab, infliximab, rituximab, ipilimumab, tocilizumab, canakinumab, itrizumab, tralokinumab. Non-limiting examples of fusion proteins include, for example, etanercept, abatacept, and balatacept.

一実施形態では、目的のタンパク質は、ヒトエリスロポエチンである。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンをコードし、配列番号１に示される配列を有するｍＲＮＡなど、ｍｉＲ－１４２－３ｐに結合するマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンをコードし、配列番号２８に示される配列を有するｍＲＮＡなど、ｍｉＲ－１２６に結合するマイクロＲＮＡ結合部位を含む。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒトエリスロポエチンをコードし、配列番号２９に示される配列を有するｍＲＮＡなど、ｍｉＲ－１４２－３ｐに結合するマイクロＲＮＡ結合部位と、ｍｉＲ－１２６に結合するマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。別の実施形態では、目的のタンパク質は、ＬＤＬＲ（コレステロールの阻害における使用のための）である。別の実施形態では、目的のタンパク質は、ＭＵＴ１（メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の処置における使用のための）である。さらに他の実施形態では、ｍｍＲＮＡによりコードされる目的のタンパク質は、上記で列挙した抗体を含むがこれらに限定されない治療用抗体である。 In one embodiment, the protein of interest is human erythropoietin. In one embodiment, the mRNA encodes a human erythropoietin and comprises a microRNA binding site that binds to miR-142-3p, such as an mRNA having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In another embodiment, the mRNA comprises a microRNA binding site that encodes human erythropoietin and binds to miR-126, such as an mRNA having the sequence set forth in SEQ ID NO: 28. In yet another embodiment, the mRNA encodes a human erythropoetin and has a microRNA binding site that binds to miR-142-3p, such as the mRNA having the sequence set forth in SEQ ID NO: 29, and a microRNA that binds to miR-126. Includes binding sites. In another embodiment, the protein of interest is LDLR (for use in the inhibition of cholesterol). In another embodiment, the protein of interest is MUT1 (for use in the treatment of methylmalonic acidemia (MMA)). In yet another embodiment, the protein of interest encoded by the mmRNA is a therapeutic antibody including, but not limited to, the antibodies listed above.

ナノ粒子
本開示のｍＲＮＡは、例えば、被験体へと送達された場合に、それらを分解から保護するように、ナノ粒子内または他の送達ビヒクル内に製剤化することができる。例示的なナノ粒子については、Ｐａｎｙａｍ， Ｊ．およびＬａｂｈａｓｅｔｗａｒ， Ｖ．（２００３年）、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．、５５巻、３２９～３４７頁；ならびにＰｅｅｒ， Ｄ．ら（２００７年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈ．、２巻、７５１～７６０頁において記載されている。ある特定の実施形態では、本開示のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを、ナノ粒子内に封入する。特定の実施形態では、ナノ粒子とは、１０００ｎＭ未満であるかもしくはこれと等しいか、５００ｎＭ未満であるかもしくはこれと等しいか、または１００ｎＭ未満であるかもしくはこれと等しい、少なくとも１つの大きさ（例えば、直径）を有する粒子である。特定の実施形態では、ナノ粒子は、脂質を含む。脂質ナノ粒子は、リポソームおよびミセルを含むがこれらに限定されない。カチオン性脂質および／またはイオン化脂質、アニオン性脂質、中性脂質、両親媒性脂質、ＰＥＧ化脂質、および／または構造的脂質を含む、多数の脂質のうちのいずれも存在しうる。このような脂質を、単独で使用することもでき、組合せで使用することもできる。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書で記載される、１または複数のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、目的のポリペプチドをコードし、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍｍＲＮＡを含む。 Nanoparticles The mRNAs of the present disclosure can be formulated, for example, in nanoparticles or in other delivery vehicles to protect them from degradation when delivered to a subject. For exemplary nanoparticles, see Panyama, J. Mol. And Labhasetwar, V.I. (2003), Adv. Drug Deliv. Rev. , 55, 329-347; and Peer, D. et al. Et al. (2007), Nature Nanotech. 2, Volume 2, pp. 751-760. In certain embodiments, the RNAs of the present disclosure, eg mRNA, are encapsulated within nanoparticles. In certain embodiments, nanoparticles are at least one size (less than 1000 nM or equal to, less than 500 nM or equal to, or less than or equal to 100 nM). For example, a particle having a diameter). In certain embodiments, the nanoparticles contain lipids. Lipid nanoparticles include, but are not limited to, liposomes and micelles. Any of a large number of lipids can be present, including cationic and / or ionized lipids, anionic lipids, neutral lipids, amphipathic lipids, PEGylated lipids, and / or structural lipids. Such lipids can be used alone or in combination. In certain embodiments, the lipid nanoparticles encode one or more RNAs described herein, eg, mRNA, eg, a polypeptide of interest, at least one against miR expressed in immune cells. Contains an mRNA containing two microRNA binding sites.

一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍＲＮＡの脂質ナノ粒子製剤は、１または複数の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの）カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含みうる。このようなカチオン性脂質は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザオクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（Ｏｃｔｙｌ－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（Ｏｃｔｙｌ－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（Ｏｃｔｙｌ－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））；Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル－Ｎ，Ｎ－Ｎ－トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ－ジステアリール－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３－β－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔａｔｅ）（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）を含むがこれらに限定されない。加えて、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されている、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されている、ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）など、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質の、多数の市販の調製物も使用することができる。ＫＬ１０、ＫＬ２２、およびＫＬ２５については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９１，７５０号において記載されている。特定の実施形態では、脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡである。 In some embodiments, the lipid nanoparticle formulations of mRNA described herein are one or more (eg, one, two, three, four, five, six, seven, one, two, three, four, five, six, seven. Or it may contain 8) cationic lipids and / or ionized lipids. Such cationic lipids include 3- (didodecylamino) -N1, N1,4-tridodecyl-1-piperazine ethaneamine (KL10), N1- [2- (didodecylamino) ethyl] -N1, N4. N4-tridodecyl-1,4-piperazindietaneamine (KL22), 14,25-ditridecyl-15,18,21,24-tetraaza octatriacontane (KL25), 1,2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLin-DMA), 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl [1,3] -dioxolane (DLin-K-DMA), heptatoria contour-6,9,28,31-tetraene -19-Il 4- (dimethylamino) butanoate (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleyl-4- (2-dimethylaminoethyl)-[1,3] -dioxolane (DLin-KC2-DMA), 2-({8-[(3β) -cholest-5-ene-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3-[(9Z, 12Z) -octadeca-9,12-diene-1 -Iloxy] Propyl-1-amine (Octyl-CLinDMA), (2R) -2-({8-[(3β) -cholest-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl- 3-[(9Z, 12Z) -Octadeca-9,12-dien-1-yloxy] Propyl-1-amine (Octyl-CLinDMA (2R)), (2S) -2-({8-[(3β)- Choles-5-en-3-yloxy] octyl} oxy) -N, N-dimethyl-3-[(9Z, 12Z) -octadeca-9,12-diene-1-yloxy] propan-1-amine (Octyl-) CLINDMA (2S)); N, N-diorail-N, N-dimethylammonium chloride (“DODAC”); N- (2,3-diorailoxy) propyl-N, N-N-triethylammonium chloride (“DOTMA”) "); N, N-distearyl-N, N-dimethylammonium bromide ("DDAB "); N- (2,3-dioreoiloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride ("DOTAP" ); 1,2-Giorailoxy-3-trimethylaminopropane chloride salt ("DOTAP.Cl"); 3-β- (N- (N', N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl) cholesterol ("DC" -Chol ”), N- (1- (2,3-dioreyloxy) propyl) -N-2- (sperminecarboxamide) ethyl) -N, N-dimethylammonium trifluoroacetate (“DOSPA ”), di Octadecylamide glycylcarboxyspermin (“DOGS”), 1,2-diore oil-3-dimethylammonium propane (“DODAP”), N, N-dimethyl-2,3-dioreyloxy) propylamine (“DODMA”) , And N- (1,2-dimyristyloxypropa-3-yl) -N, N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide (“DMRIE”), but not limited to these. In addition, for example, LIPOFECTIN® (commercially available from GIBCO / BRL, including DOTMA and DOPE), and LIPOFECTAMINE® (commercially available from GIBCO / BRL, including DOSPA and DOPE) and the like. , Cationic lipids and / or ionized lipids, numerous commercially available preparations can also be used. KL10, KL22, and KL25 are described, for example, in US Pat. No. 8,691,750, which is incorporated herein by reference in its entirety. In certain embodiments, the lipid is DLin-MC3-DMA or DLin-KC2-DMA.

本開示の脂質ナノ粒子における使用に適するアニオン性脂質は、中性脂質へと接続された、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリールホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および他のアニオン性修飾基を含むがこれらに限定されない。 Suitable anionic lipids for use in the lipid nanoparticles of the present disclosure are phosphatidylglycerol, cardiolipin, diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidylic acid, N-dodecanoylphosphatidylethanolamine, N- Includes, but is not limited to, succinylphosphatidylethanolamine, N-glutarylphosphatidylethanolamine, lysylphosphatidylglycerol, and other anionic modifying groups.

本開示の脂質ナノ粒子における使用に適する天然脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドを含むがこれらに限定されない。鎖長および飽和度を変動させる、様々なアシル鎖基を有する脂質が利用可能であるか、または周知の技法により単離もしくは合成することができる。加えて、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖との混合物を有する脂質も使用することができる。一部の実施形態では、本開示で使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の類縁のホスファチジルコリンである。一部の実施形態では、中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンおよびイノシトールなど、他のヘッド基を伴うリン脂質から構成されうる。 Natural lipids suitable for use in the lipid nanoparticles of the present disclosure include, but are not limited to, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, ceramide, sphingomyelin, dihydrosphingomyelin, cephaline, and cerebroside. Lipids with various acyl chain groups that vary in chain length and saturation are available, or can be isolated or synthesized by well-known techniques. In addition, lipids having a mixture of saturated and unsaturated fatty acid chains can also be used. In some embodiments, the triglyceride used in the present disclosure is DOPE, DSPC, DPPC, POPC, or any related phosphatidylcholine. In some embodiments, the neutral lipid may be composed of sphingomyelin, dihydrosphingomyelin, or phospholipids with other head groups such as serine and inositol.

一部の実施形態では、両親媒性脂質を、本開示のナノ粒子内に組み入れる。本開示のナノ粒子における使用に適する、例示的な両親媒性脂質は、スフィンゴ脂質、リン脂質、およびアミノ脂質を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、リン脂質は、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、およびスフィンゴミエリンからなる群から選択される。スフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ－アシルオキシ酸など、他のリン非含有化合物もまた、使用することができる。加えて、このような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールなど、他の脂質とたやすく混合することもできる。 In some embodiments, the amphipathic lipid is incorporated within the nanoparticles of the present disclosure. Exemplary amphipathic lipids suitable for use in the nanoparticles of the present disclosure include, but are not limited to, sphingolipids, phospholipids, and aminolipids. In some embodiments, the phospholipids are 1,2-dilinole oil-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC), 1,2-dimiristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC), 1,2-diore oil-. sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dipalmitoyle-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2 -Diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC), 1-palmitoyle-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine ( 18: 0 Dieter PC), 1-oleoil-2-cholesterylhemiscusinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (OChemsPC), 1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (C16 Lyso PC), 1, 2 -Dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-diarachidnoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-dioreoil-sn -Glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ME 16.0 PE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol Amin, 1,2-dilinole oil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-diarachidnoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-dioreoil-sn-glycero-3-phospho-rac- (1-glycerol) sodium salt (DOPG), and sphingomyelin. It is selected from the group consisting of. Other phosphorus-free compounds such as sphingolipids, sugar sphingolipid families, diacylglycerols, and β-acyloxy acids can also be used. In addition, such amphipathic lipids can be easily mixed with other lipids such as triglycerides and sterols.

一部の実施形態では、本開示のナノ粒子の脂質成分は、１または複数のＰＥＧ化脂質を含みうる。ＰＥＧ化脂質（ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質としてもまた公知である）とは、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。脂質成分は、１または複数のＰＥＧ化脂質を含みうる。ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる、非限定的な群から選択することができる。例えば、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ脂質、ＰＥＧ－ＤＭＧ脂質、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ脂質、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ脂質、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ脂質、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質でありうる。 In some embodiments, the lipid component of the nanoparticles of the present disclosure may comprise one or more PEGylated lipids. A PEGylated lipid (also known as a PEG lipid or a PEG-modified lipid) is a lipid modified with polyethylene glycol. The lipid component may include one or more PEGylated lipids. The PEGylated lipid can be selected from a non-limiting group consisting of PEG-modified phosphatidylethanolamine, PEG-modified phosphatidylate, PEG-modified ceramide, PEG-modified dialkylamine, PEG-modified diacylglycerol, and PEG-modified dialkylglycerol. For example, the PEGylated lipid can be a PEG-c-DOMG lipid, a PEG-DMG lipid, a PEG-DLPE lipid, a PEG-DMPE lipid, a PEG-DPPC lipid, or a PEG-DSPE lipid.

本開示の脂質ナノ粒子は、１または複数の構造的脂質を含みうる。本開示の脂質ナノ粒子内に存在しうる、例示的で非限定的な構造的脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、またはアルファ－トコフェロールを含む。 The lipid nanoparticles of the present disclosure may contain one or more structural lipids. Exemplary, non-limiting structural lipids that may be present in the lipid nanoparticles of the present disclosure are cholesterol, fecosterols, sitosterols, campesterols, stigmasterols, brassicasterols, ergosterols, tomatidines, tomatins, ursolic acids. , Or alpha-tocopherol.

一部の実施形態では、本開示の１または複数のｍＲＮＡは、約１ｎｍ～約９００ｎｍ、例えば、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約２００ｎｍ、約１ｎｍ～約３００ｎｍ、約１ｎｍ～約４００ｎｍ、約１ｎｍ～約５００ｎｍ、約１ｎｍ～約６００ｎｍ、約１ｎｍ～約７００ｎｍ、約１ｎｍ～８００ｎｍ、約１ｎｍ～約９００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子内に製剤化することができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約１０ｎｍ～約３００ｎｍ、約２０ｎｍ～約２００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、または約４０ｎｍ～約８０ｎｍの直径を有しうる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約３０ｎｍ～約３００ｎｍ、約４０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約７０～約１１０ｎｍ、または約８０ｎｍ～約１２０ｎｍの直径を有しうる。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ、および／または約９０～約１００ｎｍなどであるがこれらに限定されない間の範囲を含む、約１０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子内に製剤化することができる。一実施形態では、ｍＲＮＡは、間の範囲を含む、約３０ｎｍ～約３００ｎｍ、約４０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約７０～約１１０ｎｍ、または約８０ｎｍ～約１２０ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子内に製剤化することができる。 In some embodiments, the mRNA of the present disclosure is about 1 nm to about 900 nm, eg, about 1 nm to about 100 nm, about 1 nm to about 200 nm, about 1 nm to about 300 nm, about 1 nm to about 400 nm, about. It can be formulated in lipid nanoparticles having diameters of 1 nm to about 500 nm, about 1 nm to about 600 nm, about 1 nm to about 700 nm, about 1 nm to 800 nm, and about 1 nm to about 900 nm. In some embodiments, the nanoparticles can have a diameter of about 10 nm to about 300 nm, about 20 nm to about 200 nm, about 30 nm to about 100 nm, or about 40 nm to about 80 nm. In some embodiments, the nanoparticles may have a diameter of about 30 nm to about 300 nm, about 40 nm to about 200 nm, about 50 nm to about 150 nm, about 70 to about 110 nm, or about 80 nm to about 120 nm. In one embodiment, the mRNA is about 10 to about 20 nm, about 10 to about 30 nm, about 10 to about 40 nm, about 10 to about 50 nm, about 10 to about 60 nm, about 10 to about 70 nm, about 10 to about 80 nm, About 10 to about 90 nm, about 20 to about 30 nm, about 20 to about 40 nm, about 20 to about 50 nm, about 20 to about 60 nm, about 20 to about 70 nm, about 20 to about 80 nm, about 20 to about 90 nm, about 20. ~ About 100 nm, about 30 ~ about 40 nm, about 30 ~ about 50 nm, about 30 ~ about 60 nm, about 30 ~ about 70 nm, about 30 ~ about 80 nm, about 30 ~ about 90 nm, about 30 ~ about 100 nm, about 40 ~ about 50 nm, about 40 to about 60 nm, about 40 to about 70 nm, about 40 to about 80 nm, about 40 to about 90 nm, about 40 to about 100 nm, about 50 to about 60 nm, about 50 to about 70 nm, about 50 to about 80 nm, About 50 to about 90 nm, about 50 to about 100 nm, about 60 to about 70 nm, about 60 to about 80 nm, about 60 to about 90 nm, about 60 to about 100 nm, about 70 to about 80 nm, about 70 to about 90 nm, about 70. Lipid nanoparticles having a diameter of about 10 to about 100 nm, including ranges from, but not limited to, to about 100 nm, about 80 to about 90 nm, about 80 to about 100 nm, and / or about 90 to about 100 nm. Can be formulated within. In one embodiment, the mRNA is a lipid nanowith a diameter of about 30 nm to about 300 nm, about 40 nm to about 200 nm, about 50 nm to about 150 nm, about 70 to about 110 nm, or about 80 nm to about 120 nm, including the range between. It can be formulated in particles.

一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍを超える、１５０ｎｍを超える、２００ｎｍを超える、２５０ｎｍを超える、３００ｎｍを超える、３５０ｎｍを超える、４００ｎｍを超える、４５０ｎｍを超える、５００ｎｍを超える、５５０ｎｍを超える、６００ｎｍを超える、６５０ｎｍを超える、７００ｎｍを超える、７５０ｎｍを超える、８００ｎｍを超える、８５０ｎｍを超える、９００ｎｍを超える、または９５０ｎｍを超える直径を有しうる。 In some embodiments, the lipid nanoparticles are greater than 100 nm, greater than 150 nm, greater than 200 nm, greater than 250 nm, greater than 300 nm, greater than 350 nm, greater than 400 nm, greater than 450 nm, greater than 500 nm, greater than 550 nm. It can have a diameter of greater than 600 nm, greater than 650 nm, greater than 700 nm, greater than 750 nm, greater than 800 nm, greater than 850 nm, greater than 900 nm, or greater than 950 nm.

一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の粒子サイズは、増大させることもでき、かつ／または減少させることもできる。粒子サイズを変化させて、炎症などであるがこれらに限定されない、生物学的反応に対抗する一助とすることも可能であり、患者または被験体へと送達されるｍＲＮＡの生物学的効果を増大させることもできる。 In some embodiments, the particle size of the lipid nanoparticles can be increased and / or decreased. It is also possible to change the particle size to help counter biological reactions, such as, but not limited to, inflammation, increasing the biological effect of mRNA delivered to the patient or subject. You can also let it.

ある特定の実施形態では、細胞型および／または組織型に特異的なターゲティング部分を使用して、本開示のナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子をターゲティングすることが望ましい。一部の実施形態では、ターゲティング部分を使用して、ナノ粒子を、特定の細胞、組織、および／または器官へとターゲティングすることができる。特定の実施形態では、ナノ粒子は、本明細書で記載される、１または複数のｍＲＮＡと、ターゲティング部分とを含む。例示的で非限定的なターゲティング部分は、リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）、および抗体（例えば、全長抗体、抗体断片（例えば、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片）、単一ドメイン抗体、ラクダ科動物抗体およびその断片、ヒト抗体およびその断片、モノクローナル抗体、ならびに多特異性抗体（例えば、二特異性抗体））を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ポリペプチドでありうる。ターゲティング部分は、全ポリペプチド（例えば、ペプチドまたはタンパク質）またはその断片を含みうる。ターゲティング部分は、ターゲティング部分が、標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるように、ナノ粒子の外部表面上に位置することが典型的である。当技術分野では、様々な、異なるターゲティング部分およびターゲティング法であって、例えば、Ｓａｐｒａら、Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、４２巻（５号）：４３９～６２頁、２００３年；およびＡｂｒａら、Ｊ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．、１２巻：１～３頁、２００２年において記載されているターゲティング部分およびターゲティング法を含むターゲティング部分およびターゲティング法が公知であり、利用可能である。 In certain embodiments, it is desirable to use cell type and / or tissue type specific targeting moieties to target the nanoparticles of the present disclosure, such as lipid nanoparticles. In some embodiments, targeting moieties can be used to target nanoparticles to specific cells, tissues, and / or organs. In certain embodiments, the nanoparticles include one or more mRNAs described herein and a targeting moiety. Exemplary, non-limiting moieties include ligands, cell surface receptors, glycoproteins, vitamins (eg, riboflavin), and antibodies (eg, full-length antibodies, antibody fragments (eg, Fv fragments, single chain Fv (scFv)). Fragments, Fab'fragments, or F (ab') 2 fragments), single domain antibodies, camel family animal antibodies and fragments thereof, human antibodies and fragments thereof, monoclonal antibodies, and multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies). ))including. In some embodiments, the targeting moiety can be a polypeptide. The targeting moiety can include the entire polypeptide (eg, peptide or protein) or a fragment thereof. The targeting moiety is typically located on the outer surface of the nanoparticles such that the targeting moiety is available for interaction with a target, eg, a cell surface receptor. In the art, various different targeting moieties and methods are described, eg, Sapra et al., Prog. Lipid Res. , Vol. 42 (No. 5): 439-62, 2003; and Abra et al., J. Mol. Liposomes Res. , Vol. 12, pp. 1-3, targeting moieties and targeting methods, including the targeting moieties and targeting methods described in 2002, are known and available.

一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖など、親水性ポリマー鎖の表面コーティングを含みうる（例えば、Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１２３７巻：９９～１０８頁、１９９５年；ＤｅＦｒｅｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１１８巻：６１０１～６１０４頁、１９９６年；Ｂｌｕｍｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１１４９巻：１８０～１８４頁、１９９３年；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２巻：３２１～３３４頁、１９９２年；米国特許第５，０１３，５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４巻：２９６～２９９頁、１９９３年；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５３巻：７１～７４頁、１９９４年；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、９章（ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌａ．、１９９５年を参照されたい）。１つの手法では、脂質ナノ粒子をターゲティングするためのターゲティング部分を、ナノ粒子を形成する脂質の極性ヘッド基へと連結する。別の手法では、ターゲティング部分を、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位末端へと接合させる（例えば、Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２巻：３２１～３３４頁、１９９２年；Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８８巻：１１５～１１８頁、１９９６年を参照されたい）。 In some embodiments, the lipid nanoparticles (eg, liposomes) may comprise a surface coating of a hydrophilic polymer chain, such as a polyethylene glycol (PEG) chain (eg, Allen et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 1237: 99). Pp. 108, 1995; DeFrees et al., Journal of the American Chemistry Society, Vol. 118: 6101-6104, 1996; Blume et al., Biochimica et Biophysica Acta, pp. 1149: 180 Journal of Liposomes Research, Volume 2: 321 to 334, 1992; US Pat. No. 5,013,556; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry, Volume 4: 296 to 299, 1993; Zalipsky, FEBS Letter. See pp. 71-74, 1994; Zalipsky, Stealth Liposomes, Chapter 9 (Lasic and Martin), CRC Press, Boca Raton Fla., 1995). In one approach, the targeting moiety for targeting the lipid nanoparticles is linked to the polar head groups of the lipid forming the nanoparticles. Alternatively, the targeting moiety is attached to the distal end of the PEG chain forming the hydrophilic polymer coating (eg, Klibanov et al., Journal of Liposomes Research, Vol. 2, pp. 321-334, 1992; Kirpotin et al. , FEBS Letters, 388: 115-118, 1996).

１または複数のターゲティング部分をカップリングするための標準的な方法を使用することができる。例えば、ターゲティング部分、または脂質誘導体化ブレオマイシンなど、誘導体化親油性化合物を接合させるために活性化させうる、ホスファチジルエタノールアミンを使用することができる。例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを使用して、抗体ターゲティングリポソームを構築することができる（例えば、Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１６３３７～１６３４２頁、１９９０年およびＬｅｏｎｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）、８７巻：２４４８～２４５１頁、１９９０年を参照されたい）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号において開示されている。ターゲティング部分の例はまた、新生物または腫瘍と関連する抗原を含む、細胞内構成要素に特異的である、他のポリペプチドも含みうる。ターゲティング部分として使用されるポリペプチドは、共有結合を介して、リポソームへと接合させることができる（例えば、Ｈｅａｔｈ、Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、１４９巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１１～１１９頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９８７年）を参照されたい）。他のターゲティング法は、ビオチン－アビジン系を含む。 Standard methods for coupling one or more targeting portions can be used. For example, phosphatidylethanolamine that can be activated to bond derivatized lipophilic compounds, such as targeting moieties or lipid derivatized bleomycin, can be used. For example, liposomes incorporating protein A can be used to construct antibody targeting liposomes (eg, Rennesen et al., J. Bio. Chem., Vol. 265, pp. 16337-16342, 1990 and Leonetti et al., Proc. See Natl. Acad. Sci. (USA), Vol. 87: pp. 2448-2451, 1990). Other examples of antibody conjugation are disclosed in US Pat. No. 6,027,726. Examples of targeting moieties can also include other polypeptides that are specific for intracellular components, including antigens associated with neoplasms or tumors. The polypeptide used as a targeting moiety can be attached to liposomes via covalent bonds (eg, Heath, Covalent Atchment of Proteins to Liposomes, 149 volumes, Methods in Enzymelogic, pp. 111-119 (Academ)). , Inc., 1987)). Other targeting methods include the biotin-avidin system.

一部の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子を、肝細胞、結腸細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞（原発性腫瘍細胞および転移性腫瘍細胞を含む）を含むがこれらに限定されない細胞へとターゲティングするターゲティング部分を含む。特定の実施形態では、ターゲティング部分は、脂質ナノ粒子を、肝細胞へとターゲティングする。他の実施形態では、ターゲティング部分は、脂質ナノ粒子を、結腸細胞へとターゲティングする。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、脂質ナノ粒子を、肝がん細胞（例えば、肝細胞癌細胞）または結腸直腸がん細胞（例えば、原発性腫瘍および転移性腫瘍）へとターゲティングする。 In some embodiments, the lipid nanoparticles of the present disclosure include lipid nanoparticles, hepatocytes, colon cells, epithelial cells, hematopoietic cells, epithelial cells, endothelial cells, lung cells, bone cells, stem cells, mesenchymal cells, Nerve cells, heart cells, fat cells, vascular smooth muscle cells, myocardial cells, skeletal muscle cells, beta cells, pituitary cells, synovial superficial cells, ovarian cells, testis cells, fibroblasts, B cells, T cells, reticular cells Includes targeting moieties that target cells including, but not limited to, erythrocytes, leukocytes, granulocytes, and tumor cells, including, but not limited to, primary and metastatic tumor cells. In certain embodiments, the targeting moiety targets lipid nanoparticles to hepatocytes. In another embodiment, the targeting moiety targets lipid nanoparticles to colon cells. In some embodiments, the targeting moiety targets lipid nanoparticles to hepatocellular carcinoma cells (eg, hepatocellular carcinoma cells) or colorectal cancer cells (eg, primary and metastatic tumors).

医薬組成物
本開示は、本明細書で記載されるｍＲＮＡまたはナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を含む医薬組成物であって、１または複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせた医薬組成物を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ナノ粒子内、例えば、脂質ナノ粒子内に存在する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡまたはナノ粒子は、医薬組成物中に存在する。多様な実施形態では、医薬組成物中に存在するｍＲＮＡを、ナノ粒子内、例えば、脂質ナノ粒子内に封入する。 Pharmaceutical Compositions The present disclosure is a pharmaceutical composition comprising the mRNA or nanoparticles described herein (eg, lipid nanoparticles), wherein one or more pharmaceutically acceptable excipients, carriers, and the like. Alternatively, it comprises a pharmaceutical composition in combination with a diluent. In certain embodiments, the mRNA is present within nanoparticles, eg, lipid nanoparticles. In certain embodiments, the mRNA or nanoparticles are present in the pharmaceutical composition. In various embodiments, the mRNA present in the pharmaceutical composition is encapsulated in nanoparticles, eg, in lipid nanoparticles.

医薬組成物は任意選択で、１または複数のさらなる活性物質、例えば、治療的活性物質および／または予防的活性物質を含みうる。本開示の医薬組成物は、滅菌および／または発熱物質非含有でありうる。医薬薬剤の製剤化および／または製造における一般的な検討事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、ｍＲＮＡおよび脂質ナノ粒子、またはこれらの複合体を含む。 The pharmaceutical composition may optionally include one or more additional active substances, such as therapeutically active substances and / or prophylactically active substances. The pharmaceutical compositions of the present disclosure may be sterile and / or pyrogen-free. General considerations in the formulation and / or manufacture of pharmaceutical agents are, for example, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (indicated herein by reference in its entirety). ) Can be found. In certain embodiments, the pharmaceutical composition comprises mRNA and lipid nanoparticles, or a complex thereof.

本明細書で記載される医薬組成物による製剤は、薬理学の技術分野で公知であるかまたは今後開発される任意の方法により調製することができる。一般に、このような調製法は、有効成分を、賦形剤および／または１もしくは複数の他のアクセサリー成分と会合させるステップと、次いで、必要および／または望ましい場合、生成物を、所望の単回投与または複数回投与の用量単位へと、分割、成形、および／またはパッケージングするステップとを含む。 The pharmaceutical composition described herein can be prepared by any method known in the art of pharmacology or developed in the future. In general, such a preparation method involves associating the active ingredient with an excipient and / or one or more other accessory ingredients, followed by the desired and / or product, if desired, in a single dose. Includes steps of dividing, shaping, and / or packaging into dose units of dosing or multiple doses.

本開示に従う医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される被験体の識別、サイズ、および／または状態に応じて変動するが、組成物を投与する経路に応じてもさらに変動するであろう。例として、組成物は、０．１％～１００％の間、例えば、０．５％～７０％の間、１％～３０％の間、５％～８０％の間、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含みうる。一部の実施形態では、活性薬剤は、目的のタンパク質と、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位であって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位などのマイクロＲＮＡ結合部位とをコードするｍＲＮＡである。 The relative amount of active ingredient, pharmaceutically acceptable excipient, and / or any additional ingredient in the pharmaceutical composition according to the present disclosure depends on the identification, size, and / or condition of the subject being treated. It will vary, but will vary further depending on the route of administration of the composition. As an example, the composition is between 0.1% and 100%, for example, between 0.5% and 70%, between 1% and 30%, between 5% and 80%, or at least 80% ( It may contain the active ingredient of w / w). In some embodiments, the active agent is at least one microRNA binding site for the protein of interest and miR expressed in immune cells, with a microRNA binding site such as the miR-142-3p binding site. Is the mRNA that encodes.

本開示のｍＲＮＡは、（１）安定性を増大させ；（２）細胞へのトランスフェクションを増大させ；（３）持続放出もしくは遅延放出（例えば、デポ製剤からの、ｍＲＮＡの）を可能とし；（４）生体内分布を変更させ（例えば、ｍＲＮＡを、特異的組織型または細胞型へとターゲティングする）；（５）ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ｍｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの翻訳を増大させ；かつ／または（６）ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの放出プロファイルを変更するように、１または複数の賦形剤を使用して製剤化することができる。任意の溶媒および全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散補助剤または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤など、従来の賦形剤に加えて、本開示の賦形剤は、限定せずに、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子（例えば、リポソームおよびミセル）、ポリマー、リポプレックス、コア－シェル型ナノ粒子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ｍＲＮＡをトランスフェクトされた細胞（例えば、被験体への移植のための）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣剤、およびこれらの組合せを含みうる。したがって、本開示の製剤は、各々が、併せて、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、細胞へのｍＲＮＡによるトランスフェクションを増大させ、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を増大させ、かつ／またはｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの放出プロファイルを変更する量で、１または複数の賦形剤を含みうる。さらに、本開示のｍＲＮＡは、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して製剤化することができる。 The mRNAs of the present disclosure allow (1) increased stability; (2) increased transfection into cells; (3) sustained or delayed release (eg, of mRNA from depot formulations); (4) alter in vivo distribution (eg, targeting mRNA to a specific histological or cellular type); (5) increase translation of the polypeptide encoded by mRNA in vivo; and / Alternatively, it can be formulated using one or more excipients to alter the release profile of the polypeptide encoded by the mRNA in (6) in vivo. Conventional additives such as any solvent and all solvents, dispersion media, diluents, or other liquid vehicles, dispersion aids or suspension aids, surfactants, isotonic agents, thickeners or emulsifiers, preservatives, etc. In addition to shaping agents, the excipients of the present disclosure include, but are not limited to, lipidoids, liposomes, lipid nanoparticles (eg, liposomes and micelles), polymers, lipoplexes, core-shell nanoparticles, peptides, proteins, etc. It may include carbohydrates, mRNA-transfected cells (eg, for transplantation into a subject), hyaluronidases, nanoparticle mimetics, and combinations thereof. Accordingly, the formulations of the present disclosure, respectively, together increase the stability of mRNA, increase transfection by mRNA into cells, increase expression of the polypeptide encoded by mRNA, and / or mRNA. Can include one or more excipients in an amount that alters the release profile of the polypeptide encoded by. In addition, the mRNAs of the present disclosure can be formulated using self-assembled nucleic acid nanoparticles.

当技術分野では、医薬組成物を製剤化するための多様な賦形剤と、組成物を調製するための技法とが公知である（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１版、Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年を参照されたい）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が、望ましくない任意の生物学的効果をもたらすか、または、他の有害な形で、医薬組成物の他の任意の成分と相互作用することなどにより、物質またはその誘導体と不適合でありうる場合を除き、本開示の範囲内にあると想定しうる。賦形剤は、例えば、抗付着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、薄膜形成剤またはコーティング、流動促進剤（流動増強剤）、滑沢剤、保存剤、印字インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和水を含みうる。例示的な賦形剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、結晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファデンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、滑石、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールを含むがこれらに限定されない。 Various excipients for formulating pharmaceutical compositions and techniques for preparing the compositions are known in the art (incorporated herein by reference in their entirety, Remington: The). See Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, AR Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). The use of conventional excipient media is that any conventional excipient medium results in any undesired biological effect or, in other harmful forms, any other ingredient of the pharmaceutical composition. It can be assumed to be within the scope of the present disclosure, except where it may be incompatible with the substance or its derivatives, such as by interacting with. Excipients are, for example, anti-adhesives, antioxidants, binders, coatings, compression aids, disintegrants, dyes (colorants), softeners, emulsifiers, fillers (diluents), thin film forming agents or coatings. , Flow enhancers (flow enhancers), lubricants, preservatives, printing inks, adsorbents, suspending or dispersants, sweeteners, and hydrated waters. Exemplary excipients are butylated hydroxytoluene (BHT), calcium carbonate, calcium phosphate (bibasic), calcium stearate, croscarmellose, crosslinked polyvinylpyrrolidone, citric acid, crospovidone, cysteine, ethylcellulose, gelatin, hydroxy. Propyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, lactose, magnesium stearate, martitol, mannitol, methionine, methyl cellulose, methyl paraben, crystalline cellulose, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, povidone, alpha starch, propyl paraben, retinyl palmitate, shelac, silicon dioxide , Sodium carboxymethyl cellulose, sodium citrate, sodium starch glycolate, sorbitol, starch (corn), stearic acid, sucrose, talc, titanium dioxide, vitamin A, vitamin E, vitamin C, and xylitol.

一部の実施形態では、本明細書で記載される製剤は、少なくとも１つの、薬学的に許容される塩を含みうる。本開示の製剤中に組入れうる、薬学的に許容される塩の例は、アミンなど、塩基性残基の、酸添加塩、アルカリ塩もしくはアルカリ土類金属塩、鉱酸塩、または有機酸塩；カルボン酸など、酸性残基の、アルカリ塩または有機塩などを含むがこれらに限定されない。代表的な酸添加塩は、酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ， ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ， ｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのほか、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオンを含む。 In some embodiments, the formulations described herein may comprise at least one pharmaceutically acceptable salt. Examples of pharmaceutically acceptable salts that can be incorporated into the formulations of the present disclosure are acid-added salts, alkali or alkaline earth metal salts, mineral salts, or organic acid salts of basic residues such as amines. Includes, but is not limited to, alkaline or organic salts of acidic residues such as carboxylic acids. Typical acid-added salts are acetate, acetic acid, adipate, alginate, ascorbate, asparagate, benzenesulfonate, bendene sulphonic acid, benzoate, and bicarbonate. Salt, borate, butyrate, cypress, camphor sulfonate, citrate, cyclopentanepropionate, digluconate, dodecyl sulfate, ethanesulfonate, fumarate, glucoheptonate, glycerophosphate , Hemisulfate, heptaneate, hexaneate, hydrobromide, hydrochloride, hydroiodide, 2-hydroxyethanesulfonate, lactobionate, lactate, laurate, lauryl sulfate , Appleate, maleate, malonate, methanesulfonate, 2-naphthalenesulfonate, nicotinate, nitrate, oleate, oxalate, palmitate, pamoate, pectinate , Persulfate, 3-phenylpropionate, phosphate, picrate, pivalate, propionate, stearate, succinate, sulfate, tartrate, thiocyanate, toluenesulfonate , Undecanoate, valerate, etc. Typical alkali salts or alkaline earth metal salts include sodium, lithium, potassium, calcium, magnesium and the like, as well as ammonium, tetramethylammonium, tetraethylammonium, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, triethylamine, ethylamine and the like. Includes, but not limited to, non-toxic ammonium, quaternary ammonium, and amine cations.

一部の実施形態では、本明細書で記載される製剤は、少なくとも１つの種類のポリヌクレオチドを含有しうる。非限定的な例として、製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または５つを超える、本明細書で記載されるｍＲＮＡを含有しうる。 In some embodiments, the formulations described herein may contain at least one type of polynucleotide. As a non-limiting example, the pharmaceutical product may contain one, two, three, four, five, or more than five mRNAs described herein.

例えば、非経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシル剤を含むがこれらに限定されない。有効成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用される、不活性の希釈剤であって、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物など、水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤などの希釈剤を含みうる。不活性の希釈剤のほか、経口組成物は、保湿剤、乳化剤、および／または懸濁剤などのアジュバントを含みうる。ある特定の実施形態では、非経口投与のために、組成物を、ＣＲＥＭＡＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組合せなどの可溶化剤と混合する。 For example, liquid dosage forms for parenteral administration include, but are not limited to, pharmaceutically acceptable emulsions, microemulsions, nanoemulsions, solutions, suspensions, syrups, and / or elixirs. In addition to the active ingredient, the liquid dosage form is an inert diluent commonly used in the art, eg, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, Of propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, oils (especially cottonseed oil, lacquer oil, corn oil, germ oil, olive oil, castor oil, and sesame oil), glycerol, tetrahydrofurfuryl alcohol, polyethylene glycol, and sorbitan. Diluters such as water or other solvents, solubilizers, and emulsifiers, such as fatty acid esters, and mixtures thereof, may be included. In addition to the inert diluent, the oral composition may include an adjuvant such as a moisturizer, an emulsifier, and / or a suspending agent. In certain embodiments, for parenteral administration, the composition is solubilized with CREMAPHOR®, alcohols, oils, modified oils, glycols, polysorbates, cyclodextrins, polymers, and / or combinations thereof. Mix with the agent.

注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性懸濁液または滅菌注射用油性懸濁液は、適する分散剤、保湿剤、および／または懸濁剤を使用して、公知の技術に従い製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液としての、非毒性で非経口的に許容可能な希釈剤中および／または溶媒中の、滅菌注射用溶液、滅菌注射用懸濁液、および／または滅菌注射用エマルジョンでありうる。援用されうる、許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、Ｕ．Ｓ．Ｐ．によるリンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。従来、滅菌の固定油も、溶媒または懸濁媒体として援用されている。この目的では、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油を援用することができる。注射剤の調製では、オレイン酸などの脂肪酸も使用することができる。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過により滅菌することもでき、かつ／または使用の前に、滅菌水中または他の滅菌注射用媒体中に溶解または分散させうる、滅菌固体組成物の形態で、滅菌剤を組み込むことにより滅菌することもできる。 Injectable preparations, such as sterile injectable aqueous suspensions or sterile injectable oily suspensions, should be formulated according to known techniques using suitable dispersants, moisturizers, and / or suspending agents. Can be done. Sterile injectable preparations are, for example, sterile injectable solutions in non-toxic, parenterally acceptable diluents and / or solvents, as solutions in 1,3-butanediol, sterile injectable suspensions. It can be a turbid solution and / or an emulsion for sterile injection. Acceptable vehicles and solvents that may be incorporated include water, U.S.A. S. P. There are Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. Traditionally, sterile fixed oils have also been used as solvents or suspension media. For this purpose, any non-irritating fixed oil can be incorporated, including synthetic monoglycerides or synthetic diglycerides. Fatty acids such as oleic acid can also be used in the preparation of injections. The injectable formulation can also be sterilized, for example, by filtration through a bacterial retention filter and / or prior to use, a sterile solid composition that can be dissolved or dispersed in sterile water or other sterile injectable medium. In the form, it can also be sterilized by incorporating a sterilizing agent.

一部の実施形態では、少なくとも１つの、本明細書で記載されるｍＲＮＡを含む医薬組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）へと投与する。本明細書では、ヒトへの投与に適する医薬組成物を主に被験体とする、医薬組成物についての記載が提示されるが、当業者には、このような組成物は一般に、他の任意の動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適することが理解されるであろう。多様な動物への投与に適するものとするために、ヒトへの投与に適する医薬組成物組成物の改変が十分に理解されており、獣医学の薬理技術分野の当業者は、存在する場合でも、規定の実験だけにより、このような改変をデザインおよび／または実施することができる。医薬組成物の投与が想定される被験体は、ヒトおよび／もしくは他の霊長動物；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットなど、商業的に関与性の哺乳動物を含む哺乳動物；ならびに／または家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなど、商業的に関与性の鳥類を含む鳥類を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、被験体に、２つまたはそれよりも多い、本明細書で記載されるｍＲＮＡ、例えば、第１の目的のポリペプチドをコードし、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む第１のｍＲＮＡと、第２の目的のポリペプチドをコードし、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む第２のｍＲＮＡとを施す。特定の実施形態では、第１のｍｍＲＮＡと、第２のｍｍＲＮＡとを、被験体へと、同時に、または異なる時点に、例えば、逐次的に施す。特定の実施形態では、第１のｍＲＮＡと、第２のｍＲＮＡとを、例えば、同じ細胞による両方のｍＲＮＡの取込みを容易とするために、被験体へと、同じ医薬組成物または製剤で施す。 In some embodiments, a pharmaceutical composition comprising at least one mRNA described herein is administered to a mammal (eg, a human). A description of a pharmaceutical composition is provided herein primarily subject to a pharmaceutical composition suitable for administration to a human, but those skilled in the art will generally find such composition to be any other option. It will be appreciated that it is suitable for administration to animals such as non-human mammals. Modifications of pharmaceutical compositions suitable for administration to humans are well understood to make them suitable for administration to a wide variety of animals, and those skilled in the art of veterinary pharmacology, if present, will be able to do so. Such modifications can be designed and / or carried out by only prescribed experiments. Subjects expected to receive the pharmaceutical composition are humans and / or other primate animals; commercially involved mammals such as cows, pigs, horses, ducks, cats, dogs, mice, and / or rats. Mammals including, and / or birds including, but not limited to, poultry, chickens, ducks, geese, and / or commercially involved birds such as, but not limited to. In certain embodiments, the subject encodes at least two or more mRNAs described herein, eg, the polypeptide of primary interest, for miR expressed in immune cells. A first mRNA containing one microRNA binding site and a second mRNA encoding a second polypeptide of interest and containing at least one microRNA binding site for miR expressed in immune cells are applied. .. In certain embodiments, the first mmRNA and the second mmRNA are applied to the subject simultaneously or at different time points, eg, sequentially. In certain embodiments, the first mRNA and the second mRNA are applied to the subject in the same pharmaceutical composition or formulation, eg, to facilitate the uptake of both mRNAs by the same cells.

免疫細胞の活性化およびサイトカインの産生の阻害
本開示の方法は、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐ）結合部位および／またはｍｉＲ－１４２（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ）結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れにより、ｍＲＮＡベースの治療薬によりコードされる、目的のポリペプチド（例えば、治療剤）により刺激される、望ましくない免疫細胞の活性化および／またはサイトカインの産生など、ｍＲＮＡベースの治療薬で処置される被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、および／または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害を可能とする。一実施形態では、免疫細胞の活性化は、リンパ球の活性化である。一実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化である。別の実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｔ細胞の活性化である。さらに他の実施形態では、免疫細胞の活性化は、マクロファージの活性化、樹状細胞の活性化、ＮＫ細胞の活性化、好塩基球の活性化、または好酸球の活性化である。 Activation of Immune Cells and Inhibition of Cytokine Production The methods of the present disclosure include at least one miR-126 (eg, miR-126-3p) binding site and / or miR-142 (eg, miR-142-3p) binding. Incorporation of the site into the mRNA construct, such as unwanted immune cell activation and / or cytokine production, stimulated by the polypeptide of interest (eg, therapeutic agent) encoded by the mRNA-based therapeutic agent. Allows activation of unwanted immune cells and / or reduction or inhibition of the production of unwanted cytokines in subjects treated with mRNA-based therapies. In one embodiment, the activation of immune cells is the activation of lymphocytes. In one embodiment, the activation of immune cells is the activation of B cells. In another embodiment, the activation of immune cells is the activation of T cells. In yet another embodiment, the activation of immune cells is the activation of macrophages, dendritic cells, NK cells, basophils, or eosinophils.

一実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害を、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位を欠く、ｍｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。多様な実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約５％～５０％、約１０％～５０％、約１５％～５０％、約２０％～５０％、約２５％～５０％、約１０％～８０％、約１０％～７０％、約１０％～６０％、約２０％～８０％、約２０％～７０％、約２０％～６０％、約２０％～４０％、または約２５％～７５％減少させる。 In one embodiment, the reduction or inhibition of undesired immune cell activation is determined compared to a control dose of mRNA lacking at least one miR-126 microRNA binding site or miR-142 microRNA binding site. In various embodiments, immune cell activation is at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least. 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, about 5% to 50%, about 10% to 50%, about 15% to 50%, about 20% to 50%, about 25% to 50%, about 10% to 80%, about 10% to 70%, about 10% to 60%, about 20% to 80%, about 20% to 70%, about 20% to 60%, about 20% to 40 %, Or about 25% to 75% reduction.

免疫細胞の活性化のレベルは、細胞表面活性化マーカーを発現させる細胞の検出により典型的に評価される、活性化免疫細胞集団の頻度、または免疫細胞の活性化を指し示す、１もしくは複数のサイトカインの産生レベルなど、当技術分野で確立された、免疫細胞の活性化を評価するための、本質的に任意の方法により査定することができる。一実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化であり、この場合、Ｂ細胞の活性化のレベルを、脾臓のＢ細胞集団にわたる活性化Ｂ細胞の頻度など、活性化Ｂ細胞の頻度を測定することにより決定する。当技術分野では、Ｂ細胞の活性化を指し示すＢ細胞表面マーカーが周知である（例えば、Ｍａｄｄａｌａｙ， Ｒ．ら（２０１０年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８４巻：４８８３～４８９４頁を参照されたい）。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する。別の実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化であり、この場合、Ｂ細胞の活性化のレベルを、例えば、処置される被験体の血清中の、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の分泌など、サイトカインの分泌により決定する。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、処置される被験体の血清中の、ＩＬ－６の分泌により決定する。他の実施形態では、低減または阻害される、望ましくないサイトカインの産生は、例えば、処置される被験体の血清中の、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生である。別の実施形態では、低減または阻害される、望ましくないサイトカインの産生は、インターロイキン６（ＩＬ－６）の産生である。 The level of immune cell activation is typically assessed by detection of cells expressing cell surface activation markers, indicating the frequency of activated immune cell populations, or one or more cytokines indicating immune cell activation. It can be assessed by essentially any method for assessing immune cell activation established in the art, such as production levels of. In one embodiment, the activation of immune cells is the activation of B cells, in which case the level of activation of B cells, such as the frequency of activated B cells across the B cell population of the spleen, activated B cells. Determined by measuring the frequency of. B cell surface markers indicating B cell activation are well known in the art (see, eg, Maddale, R. et al. (2010), FEBS Letters, Vol. 584: pp. 4883-4894). In one embodiment, B cell activation is determined by the frequency of CD19 + CD86 + CD69 + B cells. In another embodiment, the activation of immune cells is the activation of B cells, in this case the level of activation of B cells, eg, interleukin 6 (IL) in the serum of the subject being treated. -6), determined by the secretion of cytokines, such as the secretion of tumor necrosis factor α (TNF-α), or interferon gamma (IFN-γ). In one embodiment, B cell activation is determined, for example, by the secretion of IL-6 in the serum of the subject being treated. In other embodiments, the production of unwanted cytokines that are reduced or inhibited is, for example, interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNF-α), in the serum of the subject being treated. Or the production of interferon gamma (IFN-γ). In another embodiment, the production of unwanted cytokines that are reduced or inhibited is the production of interleukin 6 (IL-6).

一実施形態では、免疫細胞の活性化は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化であり、この場合、ｐＤＣ活性化のレベルは、脾臓のｐＤＣ集団にわたる活性化ｐＤＣの頻度など、活性化ｐＤＣの頻度を測定することにより決定する。当技術分野では、活性化を指し示すｐＤＣ表面マーカーが周知である（例えば、Ｄｚｉｏｎｅｋ， Ａ．ら（２００２年）、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６３巻（１２号）：１１３３～４８頁を参照されたい）。一実施形態では、ｐＤＣの活性化を、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞の頻度により決定する。 In one embodiment, the activation of immune cells is the activation of plasmacytoid dendritic cells (pDCs), in which case the level of pDC activation is such as the frequency of activated pDCs across the pDC population of the spleen. Determined by measuring the frequency of plasmacytoid dendritic cells. In the art, pDC surface markers indicating activation are well known (see, eg, Dzionek, A. et al. (2002), Hum Immunol., Vol. 63 (12): pp. 1133-48). In one embodiment, pDC activation is determined by the frequency of CD11c + CD70 + CD86 + cells.

一実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化、および／または望ましくないサイトカインの産生を、ｍｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる。こうして、本開示の方法は、被験体における治療剤の発現レベルに著明な影響を及ぼさずに、治療剤である、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡで処置された被験体における、免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の活性化、サイトカイン産生）を阻害または低減することを可能とする。 In one embodiment, the activation of unwanted immune cells and / or the production of unwanted cytokines is reduced without a corresponding reduction in the expression of the polypeptide of interest encoded by the mmRNA. Thus, the methods of the present disclosure are those of immune cells in a subject treated with mRNA encoding the polypeptide of interest, which is the therapeutic agent, without significantly affecting the expression level of the therapeutic agent in the subject. It makes it possible to inhibit or reduce activation (eg, activation of B cells, cytokine production).

本開示の方法で使用しうる、標準的な計量は、コードされるポリペプチド（タンパク質）のレベルまたは量であって、細胞、組織、または生物において産生されるレベルまたは量の、その発現が、細胞、組織、または生物において、化学修飾ｍＲＮＡの投与またはこれとの接触の結果として誘発されるサイトカインの１または複数（またはパネル）のレベルまたは量に対する比の尺度である。本明細書では、このような比を、タンパク質：サイトカイン比または「ＰＣ」比と称する。ＰＣ比が大きいほど、化学修飾ｍＲＮＡ（測定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド）は有効である。サイトカインによる、本開示の好ましいＰＣ比は、１を超える、１０を超える、１００を超える、１０００を超える、１０，０００を超える、またはそれよりも多いＰＣ比でありうる。異なる構築物による修飾ｍＲＮＡまたは非修飾構築物による修飾ｍＲＮＡよりＰＣ比が大きな修飾ｍＲＮＡが好ましい。 A standard measure that can be used in the methods of the present disclosure is the level or amount of the encoded polypeptide (protein), the expression of the level or amount produced in a cell, tissue, or organism. A measure of the ratio to the level or amount of one or more (or panels) of cytokines induced as a result of administration or contact with a chemically modified mRNA in a cell, tissue, or organism. As used herein, such ratios are referred to as protein: cytokine ratios or "PC" ratios. The higher the PC ratio, the more effective the chemically modified mRNA (polynucleotide that encodes the protein being measured). Preferred PC ratios according to cytokines in the present disclosure can be greater than 1, greater than 10, greater than 100, greater than 1000, greater than 10,000, or greater. Modified mRNAs with a higher PC ratio than modified mRNAs with different constructs or unmodified constructs are preferred.

ＰＣ比は、ｍＲＮＡ内に存在する修飾パーセントにより、さらに適格化しうる。例えば、１００％の修飾ｍＲＮＡに照らして標準化したタンパク質産生であって、サイトカインの関数としてのタンパク質産生（または危険性）またはサイトカインプロファイルを決定することができる。 The PC ratio can be further qualified by the percentage of modification present in the mRNA. For example, protein production (or risk) or cytokine profile as a function of cytokines can be determined for protein production standardized in the light of 100% modified mRNA.

一実施形態では、本開示は、ｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位を含む修飾ｍＲＮＡのＰＣ比を、ｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位を伴わない同じ構築物のＰＣ比と比較することにより、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位を含む、任意の特定の修飾ｍＲＮＡの相対的効能を、化学反応、サイトカイン、または修飾パーセントにわたり決定するための方法を提示する。 In one embodiment, the present disclosure sets the PC ratio of a modified mRNA containing a miR-126 binding site and / or a miR-142 binding site to the same construct without a miR-126 binding site and / or a miR-142 binding site. By comparison to the PC ratio, the relative efficacy of any particular modified mRNA, including at least one miR-126 binding site and / or miR-142 binding site, is determined over a chemical reaction, cytokine, or percentage of modification. Present a method for.

一実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）の血清中の、ｍｍＲＮＡによりコードされる目的のポリペプチドの発現レベルは、投与の少なくとも２時間後において、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌでありうる。別の実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）の血清中の、ｍｍＲＮＡによりコードされる目的のポリペプチドの発現レベルは、投与後少なくとも７２時間にわたり、５０ｐｇ／ｍｌを上回るレベルを維持しうる。別の実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）の血清中の、ｍｍＲＮＡによりコードされる目的のポリペプチドの発現レベルは、投与後少なくとも７２時間にわたり、６０ｐｇ／ｍｌを上回るレベルを維持しうる。 In one embodiment, the expression level of the polypeptide of interest encoded by mmRNA in the serum of a mammal (eg, human) can be at least 50 pg / ml at least 2 hours after administration. In another embodiment, the expression level of the polypeptide of interest encoded by mmRNA in the serum of a mammal (eg, human) can be maintained above 50 pg / ml for at least 72 hours after administration. In another embodiment, the expression level of the polypeptide of interest encoded by mmRNA in the serum of a mammal (eg, human) can be maintained above 60 pg / ml for at least 72 hours after administration.

Ｂ１ａ細胞の阻害／血中クリアランスの加速化の阻害
脾臓は、以前からＡＢＣに関与しているが、ＡＢＣの一因となる正確な機構は、いまだ理解されていない。脾臓は、赤脾髄（赤血球に富む）、白脾髄（リンパ球に富む）、および辺縁帯（赤脾髄と白脾髄との間、および辺縁洞の外側に配置される）から構成される。脾臓に入った抗原は、辺縁帯内に保持され、辺縁帯では、抗原と、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｂ細胞）との間の相互作用を可能とするように、血流が低減される（Ｈａｒｍら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎｏ．、６４巻：４２２０～４２２５頁、１９９６年）。血中クリアランスの加速化における脾臓の役割は、重要であると考えられる。生体内分布データは、脂質を含む化合物または組成物（例えば、ＬＮＰ）が、脾臓により取り込まれたことを裏付ける（データは示さない）。組織学的査定は、投与（例えば、ＩＶ投与）後、急速な、ＬＮＰの、辺縁帯への取込みを示す。脾臓内で、ＬＮＰは、脾臓Ｂ細胞と相互作用し、ＬＮＰに対する免疫応答の多様な要素に寄与しうる。例えば、ＬＮＰのある特定の成分（例えば、ＰＥＧ成分）は、脾臓内のＣＤ１９＋ Ｂ細胞と相互作用する結果として、結合、内部化、膜融合、および／またはこのような細胞の活性化をもたらす結果として、ＬＮＰの成分に特異的なＩｇＧ分子および／またはＩｇＭ分子の産生もたらすことから、例えば、ＬＮＰによる、２回目または後続の投与時における血中クリアランスの加速化をもたらしうる。 Inhibition of B1a cells / Inhibition of accelerated blood clearance The spleen has long been involved in ABC, but the exact mechanism that contributes to ABC is not yet understood. The spleen is from the red pulp (rich in red pulp), the white pulp (rich in lymphocytes), and the marginal zone (located between the red pulp and the white pulp and outside the marginal sinus). It is composed. The antigen that enters the spleen is retained within the marginal zone, where blood flow is reduced to allow interaction between the antigen and immune effector cells (eg, B cells). (Harm et al., Infect. Immuno., Vol. 64: pp. 4220-4225, 1996). The role of the spleen in accelerating blood clearance appears to be important. Biodistribution data confirm that the lipid-containing compound or composition (eg, LNP) was taken up by the spleen (data not shown). Histological assessment indicates rapid uptake of LNP into the marginal zone after dosing (eg, IV dosing). Within the spleen, LNPs can interact with spleen B cells and contribute to various components of the immune response to LNPs. For example, certain components of LNP (eg, PEG components) interact with CD19 + B cells in the spleen, resulting in binding, internalization, membrane fusion, and / or activation of such cells. As it results in the production of IgG and / or IgM molecules specific for the components of LNP, it can result in, for example, accelerated blood clearance during a second or subsequent dose with LNP.

驚くべきことに、本明細書ではまた、免疫系の特定の細胞、すなわち、ｐＤＣもまた、ＡＢＣ現象に寄与することも裏付けられている。本明細書では、ｍｉＲ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２６結合部位）の組入れが、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡ、例えば、修飾ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質に対する、望ましくない免疫応答（例えば、ＡＤＡ）の低減をもたらしうることが裏付けられている。今や、驚くべきことに、ｍｉＲ結合部位、特に、ｍｉＲ－１２６結合部位の組入れが、ｍＲＮＡを封入するＬＮＰに対する、さらなる、望ましくない免疫応答の低減をもたらしうることも裏付けられている。ｍｉＲ－１２６（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐ）は、ｐＤＣ内で高度に発現し、実際、ｐＤＣの活性化時に上方調節される。ｐＤＣは、核酸に応答して、Ｂ細胞の活性化を相乗作用的に増大させ、サイトカインの分泌および形質細胞の活性化を介して、活性化の他の形態を増大させる。さらに、「ｍｉＲ－１２６－３ｐが低度な」ｐＤＣ（例えば、ｍｉＲ－１２６がノックダウンまたはノックアウトされたｐＤＣ）は、活性化が損なわれている（例えば、核酸に対する有効な免疫応答を発し、ＩＦＮ－α／β分泌、ＩＬ－６分泌などをもたらすことができず、活性化時に、脾臓へと遊走できないことなど）。本明細書で裏付けられる通り、ｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡへの組入れは、数週間にわたる、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡの反復投与において、低度なＢ細胞の活性化および低血清ＩＬ－６を結果としてもたらす。タンパク質の発現は、同様の投与スケジュールにわたり維持される。驚くべきことに、抗ＰＥＧ ＩｇＭ応答は、数週間にわたる反復投与において、劇的に低下する。こうして、ｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍＲＮＡ、特に、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡへの組入れの、予測されない有益性は、ＡＢＣの低減である。 Surprisingly, it is also supported herein that specific cells of the immune system, namely pDCs, also contribute to the ABC phenomenon. As used herein, the incorporation of a miR binding site (eg, a miR-126 binding site) reduces an unwanted immune response (eg, ADA) to a protein encoded by an LNP-encapsulated mRNA, such as a modified mRNA. It is supported that it can bring about. Now, surprisingly, it is also supported that the incorporation of miR binding sites, in particular miR-126 binding sites, can result in a further reduction in the undesired immune response to LNPs encapsulating mRNA. miR-126 (eg, miR-126-3p) is highly expressed within pDCs and is, in fact, upregulated upon activation of pDCs. pDCs synergistically increase B cell activation in response to nucleic acids and increase other forms of activation through cytokine secretion and plasma cell activation. In addition, "low miR-126-3p" pDCs (eg, pDCs in which miR-126 are knocked down or knocked out) are impaired in activation (eg, eliciting a valid immune response against nucleic acids, It cannot bring about IFN-α / β secretion, IL-6 secretion, etc., and cannot migrate to the spleen at the time of activation, etc.). As supported herein, incorporation of the miR-126 binding site into mRNA results in low B cell activation and low serum IL-6 with repeated doses of LNP-encapsulated mRNA over several weeks. As a result. Protein expression is maintained over a similar dosing schedule. Surprisingly, the anti-PEG IgM response is dramatically reduced after repeated doses over several weeks. Thus, the unexpected benefit of incorporating the miR-126 binding site into mRNA, especially mRNA encapsulated in LNP, is the reduction of ABC.

脾臓内、例えば、脾臓の辺縁帯内では、これらの鍵となる免疫細胞のうちのいくつかは、例えば、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ－６）の結果として、直接的にまたは間接的に相互作用しうる。 Within the spleen, eg, within the marginal zone of the spleen, some of these key immune cells interact directly or indirectly, eg, as a result of cytokine production (eg, IL-6). Can work.

理論により束縛されることを望まずに、本開示は、辺縁帯内に存在する免疫細胞内で発現するｍｉＲが、血中クリアランスの加速化に参与するという証拠を提示する。本開示のｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現する、１または複数のｍｉＲに結合する、１または複数のｍｉＲ結合部位を含む場合、目的のｍｉＲは、下方調節される（例えば、アンタゴナイズされ、かつ／または分解される）。免疫細胞内で発現する、少なくとも１つのｍｉＲに結合する、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の組入れは、脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）に結合することが可能なＩｇＭ分子の産生の減少であって、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を伴わないｍＲＮＡと比較した減少を結果としてもたらす。ＩｇＭ分子の、血中クリアランスの加速化における公知の役割を踏まえると、免疫細胞内で発現するｍｉＲに結合するｍｉＲ結合部位が、ＩｇＭ分子の産生を阻害または低減する能力は、具体的には、脾臓の辺縁帯内の免疫細胞内で発現するｍｉＲの、血中クリアランスの加速化における重要な役割を指し示す。 Without wishing to be bound by theory, the present disclosure provides evidence that miR expressed in immune cells present within the marginal zone contributes to the acceleration of blood clearance. When the mRNA of the present disclosure contains one or more miR binding sites expressed in immune cells that bind to one or more miRs, the miR of interest is down-regulated (eg, untagonized and). / Or disassembled). Incorporation of at least one miR binding site that binds to at least one miR expressed in the intracellular is a reduction in the production of IgM molecules capable of binding to lipid components (eg, PEG lipids). The result is a reduction compared to mRNA without at least one miR binding site. Given the known role of IgM molecules in accelerating blood clearance, the ability of miR binding sites that bind to miR expressed in immune cells to inhibit or reduce IgM molecule production is specifically described as. It points to an important role of miR expressed in immune cells in the marginal zone of the spleen in accelerating blood clearance.

本開示の方法は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害することを可能とし、方法は、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、この場合、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む。 The methods of the present disclosure reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in subjects who have been repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). The method comprises administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), in this case a subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so that the acceleration of blood clearance in the body is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA is one or more. Contains modified nucleobases.

他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。 In another embodiment, the subject is intravenously administered with a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), wherein the chemically modified mRNA is intracellularly administered. To be performed, comprising at least one microRNA binding site for the expressed microRNA and the chemically modified mRNA comprising one or more modified nucleobases; reducing or inhibiting the acceleration of blood clearance in the subject. Thus, a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP is intravenously administered to the subject to encode the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). Reduces or inhibits the acceleration of blood clearance in subjects receiving messenger RNA (mRNA).

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。 In some embodiments, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), with one or more subsequent attempts. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject at the time of administration. Multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated within lipid nanoparticles (LNPs) by administration, comprising one or more modified nucleobases, were performed. Reduces or inhibits the acceleration of blood clearance in the subject.

他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、ｍＲＮＡの後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。 In another embodiment, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), at the time of subsequent administration of the mRNA. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell, and the chemically modified mRNA is one or more so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject. Acceleration of blood clearance in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP) by administration, containing the modified nucleobase of To reduce or inhibit.

さらなる実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。 A further embodiment is to administer to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), the blood clearance in the subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in the immune cell and the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases so as to reduce or inhibit the acceleration of the. , LNP does not activate B cells and / or induces the production of IgM molecules capable of binding to LNP, by administration, encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) of interest. Reduces or inhibits accelerated blood clearance in subjects repeatedly administered a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide.

さらなる実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することであって、被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、実施することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。 In a further embodiment, the subject is intravenously administered with a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), wherein the chemically modified mRNA is expressed in immune cells. To be carried out, which comprises at least one microRNA binding site for the microRNA to be made and the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleobases; to the subject of the chemically modified mRNA encapsulated in the LNP. The second dose is intravenously administered so that the LNP does not activate B cells and / or binds to LNP so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject. In subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated within lipid nanoparticles (LNPs) by performing, without inducing the production of possible IgM molecules, Reduces or inhibits the acceleration of blood clearance.

他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。 In another embodiment, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), with one or more subsequent doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject at the time of the procedure. By administering lipid nanoparticles (containing one or more modified nucleobases, LNP does not activate B cells and / or induces the production of IgM molecules capable of binding to LNP). Reduces or inhibits accelerated blood clearance in subjects who have undergone multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated in LNP).

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、ｍＲＮＡの後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。 In some embodiments, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), at the time of subsequent administration of the mRNA. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in the immune cell so that the acceleration of blood clearance in the subject is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA is 1 or Within lipid nanoparticles (LNPs) by administration containing multiple modified nucleobases, where LNP does not activate B cells and / or induces the production of IgM molecules capable of binding to LNP. Encapsulates or inhibits the acceleration of blood clearance in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated in.

一部の実施形態では、本開示は、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、反復投与後の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法を提示する。 In some embodiments, the disclosure is to administer to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the production of the IgM molecule that recognizes the PEG in the subject. Polyethylene glycol in a subject repeatedly administered a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) by administration, including one or more modified nucleobases. A method of reducing or inhibiting the production of IgM molecules that recognize (PEG) is presented.

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する。 In some embodiments, a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP) is intravenously administered to a subject, wherein the chemically modified mRNA is intracellular. The production of a PEG-recognizing IgM molecule in a subject is performed, comprising at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in, and the chemically modified mRNA comprising one or more modified nucleobases. Subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) by intravenous administration of a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP to the subject to reduce or inhibit. It reduces or inhibits the production of IgM molecules that recognize polyethylene glycol (PEG) in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide.

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する。 In some embodiments, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), with one or more subsequent attempts. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the production of PEG-recognizing IgM molecules in the subject at the time of administration. Multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated within lipid nanoparticles (LNPs) by administration, where the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases. Reduces or inhibits the production of IgM molecules that recognize polyethylene glycol (PEG) in the performed subject.

他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する。 In another embodiment, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), at the time of subsequent administration of the mRNA. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the production of PEG-recognizing IgM molecules in the subject. Polyethylene glycol in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated within lipid nanoparticles (LNP) by administration, comprising one or more modified nucleobases. Reduces or inhibits the production of IgM molecules that recognize PEG).

さらなる実施形態では、本開示は、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、反復投与後の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法を提示する。 In a further embodiment, the disclosure is to administer to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), the subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell such that the activation of B1a cells in, is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA comprises one or more modifications. Reduced activation of B1a cells in subjects receiving repeated doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), including nucleobases. Or present a method of inhibition.

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体においてＢ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する。 In some embodiments, a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP) is intravenously administered to a subject, wherein the chemically modified mRNA is intracellular. To be performed, which comprises at least one microRNA binding site for microRNA expressed in, and the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases; reduces or inhibits activation of B1a cells in the subject. Thus, a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP is intravenously administered to the subject to encode the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). Reduces or inhibits activation of B1a cells in subjects administered with messenger RNA (mRNA).

他の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する。 In another embodiment, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), with one or more subsequent doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the activation of B1a cells in the subject at the time of the procedure. Multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated within lipid nanoparticles (LNPs) by administration, including one or more modified nucleobases. Reduces or inhibits activation of B1a cells in the body.

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する。 In some embodiments, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), at the time of subsequent administration of the mRNA. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell such that the activation of B1a cells is reduced or inhibited in the subject, and the chemically modified mRNA is 1 or Activation of B1a cells in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated within lipid nanoparticles (LNPs) by administration, including multiple modified nucleobases. To reduce or inhibit.

さらなる実施形態では、本開示は、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、反復投与後の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法を提示する。 In a further embodiment, the disclosure is to administer to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), the subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell such that the activation of the plasmacytoid dendritic cell in Or plasma cell-like in a subject repeatedly administered a messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) by administration, including multiple modified nucleosides. A method of reducing or inhibiting the activation of dendritic cells is presented.

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与することであって、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、実施することと；被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与することとにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する。 In some embodiments, the subject is intravenously administered with a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), wherein the chemically modified mRNA is intracellular. To be performed, comprising at least one microRNA binding site for microRNA expressed in, and the chemically modified mRNA comprising one or more modified nucleobases; activation of plasmacytoid dendritic cells in the subject. The purpose of encapsulation in lipid nanoparticles (LNP) by intravenous administration of a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP to the subject so as to reduce or inhibit. Reduces or inhibits activation of plasmacytoid dendritic cells in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of.

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する。 In some embodiments, the subject is administered with a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), one or more subsequent times. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the activation of plasmacytoid dendritic cells in the subject at the time of administration. Multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated within lipid nanoparticles (LNPs) by administration, wherein the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases. Reduces or inhibits activation of plasmacytoid dendritic cells in the subject subjected to.

一部の実施形態では、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与することであって、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む、投与することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する。 In some embodiments, the subject is administered a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), at the time of subsequent administration of the mRNA. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the activation of plasmacytoid dendritic cells in the subject. Traits in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest encapsulated within lipid nanoparticles (LNP) by administration, comprising one or more modified nucleosides. Reduces or inhibits activation of cell-like dendritic cells.

さらなる実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、Ｂ細胞を活性化させない。他の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。 In a further embodiment, the mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) does not activate B cells and / or produces IgM molecules capable of binding to LNPs. Does not induce. In some embodiments, the mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) does not activate B cells. In another embodiment, the mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) does not induce the production of IgM molecules capable of binding to LNP.

一部の実施形態では、血中クリアランスの加速化の低減または阻害を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。他の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する低下または阻害を伴わずに、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。 In some embodiments, the reduction or inhibition of accelerated blood clearance is compared to control administration of chemically modified mRNAs that lack at least one microRNA binding site encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). decide. In other embodiments, it reduces or inhibits the acceleration of blood clearance without the corresponding reduction or inhibition of expression of the polypeptide of interest encoded by the chemically modified mRNA.

さらなる実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、２週間未満である。一部の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、１週間未満である。 In a further embodiment, the interval between two consecutive doses is less than 2 weeks. In some embodiments, the interval between two consecutive doses is less than a week.

一部の実施形態では、ＩｇＭ分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識する。 In some embodiments, the IgM molecule recognizes polyethylene glycol (PEG).

本開示の方法
一態様では、本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１２６－３ｐ）を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。上記で記載した通り、多様な実施形態では、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する１または複数のｍｉＲに対する、例えば、２つまたはそれよりも多い、１つ～４つ、１つ、２つ、３つ、または４つの結合部位を含みうる。ある特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲに対する、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対する第１の結合部位と、免疫細胞内で発現する、異なるｍｉＲであって、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１２６などのｍｉＲに対する第２の結合部位とを含みうる。代替的に、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐ）に対する第１の結合部位と、免疫細胞内で発現する、異なるｍｉＲであって、ｍｉＲ－１４２（ｍｉｒ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１５５、またはｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）などのｍｉＲに対する第２の結合部位とを含みうる。一実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対する第１の結合部位と、ｍｉＲ－１２６に対する第２の結合部位とを含む。 Methods of the present disclosure In one aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response in a subject, wherein the subject is administered with a modified messenger RNA (m mRNA) encoding the polypeptide of interest. At least one microRNA binding site (eg, miR-142) to miR expressed in immune cells by the mRNA is such that it comprises a step and reduces or inhibits the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. -3p and / or miR-126-3p), wherein the mRNA comprises one or more modified nucleoside bases. As described above, in various embodiments, the mmRNA is, for example, one to four, one, two, for one or more miRs expressed in immune cells, eg, two or more. It may contain three or four binding sites. In certain embodiments, the m mRNA comprises at least two binding sites for at least two different miRs expressed in immune cells. For example, mmRNA is a different miR expressed in immune cells with a first binding site for miR-142-3p, such as miR-155, miR-146 (miR-146-3p and / or miR-146). -5p), or a second binding site for miR such as miR-126. Alternatively, the mmRNA is the first binding site for miR-126 (eg, miR-126-3p) and a different miR expressed in the immune cell, miR-142 (mir-142-3p and). / Or may include a second binding site for miR such as miR-142-5p), miR-155, or miR-146 (miR-146-3p and / or miR-146-5p). In one embodiment, the m mRNA comprises a first binding site for miR-142-3p and a second binding site for miR-126.

関連する実施形態では、被験体に、ｍｍＲＮＡを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を施すかまたは投与する。さらなる関連する実施形態では、被験体に、本開示の医薬組成物を施すかまたは投与する。特定の実施形態では、医薬組成物は、目的のポリペプチドをコードし、本明細書で記載される、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むｍｍＲＮＡを含むか、またはｍｍＲＮＡを含むナノ粒子を含む。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ナノ粒子内、例えば、脂質ナノ粒子内に存在する。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡまたはナノ粒子は、医薬組成物中に存在する。 In a related embodiment, the subject is subjected to or administered with nanoparticles comprising mmRNA (eg, lipid nanoparticles). In a further related embodiment, the subject is subjected to or administered with the pharmaceutical composition of the present disclosure. In certain embodiments, the pharmaceutical composition encodes a polypeptide of interest and comprises mmRNAs comprising at least one miR binding site described herein, or nanoparticles comprising mmRNAs. In certain embodiments, the mRNA is present within nanoparticles, eg, lipid nanoparticles. In certain embodiments, the mRNA or nanoparticles are present in the pharmaceutical composition.

一実施形態では、ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。一実施形態では、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入（例えば、ポンプを介するものなどの静脈内注入）により投与する。一実施形態では、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により、少なくとも４週間にわたり投与する。 In one embodiment, mmRNA is encapsulated in lipid nanoparticles and administered intravenously. In one embodiment, mmRNA is administered by weekly injection (eg, intravenous infusion, such as via a pump). In one embodiment, mmRNA is administered by infusion once a week for at least 4 weeks.

別の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つの結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。 In another embodiment, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject, encapsulated in RNA to the subject. , A step of intravenously administering a first dose of a modified mRNA (m mRNA) encoding a polypeptide of interest, wherein the m mRNA is at least one binding site for miR expressed in immune cells (eg, miR-142). Steps containing -3p microRNA binding site and / or miR-126 microRNA binding site) and the mmRNA containing one or more modified nucleosides; reducing the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. Alternatively, the subject is presented with a method comprising intravenously administering to the subject a second dose of mRNA encapsulated in LNP.

別の態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、
ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の抗薬物抗体のレベルが低下したら、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法を提示する。 In another aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject.
(I) A step of intravenously administering to a subject a first dose of modified mRNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in LNP, where the mRNA is expressed in immune cells. Includes at least one microRNA binding site for miR (eg, miR-142-3p microRNA binding site and / or miR-126 microRNA binding site).
With a step in which the m mRNA contains one or more modified nucleobases;
(Ii) With the step of detecting the level of anti-drug antibody in the sample derived from the subject;
(Iii) When the level of anti-drug antibody in the sample is reduced, the mmRNA encapsulated in the LNP to the subject so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. A method comprising the step of intravenously administering the dose of 2 is presented.

ｍｍＲＮＡが投与される被験体の脾臓内のｍｍＲＮＡによりコードされる目的のタンパク質の発現を低減または阻害する本開示の方法の能力を踏まえ、本開示はさらに、ｍｍＲＮＡベースの治療薬の毒性を低減するための方法も提示する。したがって、別の態様では、本開示は、被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、ｍｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するｍｉＲに対する、少なくとも１つの結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位）を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法を提示する。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における血球数の減少（血球減少症）である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における自己免疫である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における補体媒介作用である。一実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における造血の減少である。他の実施形態では、薬物関連毒性は、例えば、腎毒性または肝毒性でありうる。 Given the ability of the methods of the present disclosure to reduce or inhibit the expression of the protein of interest encoded by the mmRNA in the spleen of the subject to whom the mmRNA is administered, the present disclosure further reduces the toxicity of the mmRNA-based therapeutic agent. I will also show you how to do it. Accordingly, in another aspect, the disclosure is a method of reducing or inhibiting drug-related toxicity in a subject, the step of administering to the subject a modified messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest. At least one binding site (eg, miR-142-3p microRNA binding) to a miR expressed in an immune cell by the mRNA is such that it reduces or inhibits drug-related toxicity to the polypeptide of interest in the subject. A site and / or a miR-126 microRNA binding site) is included, and an mRNA presents a method comprising one or more modified nucleobases. In one embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is a decrease in blood cell count (cytopenia) in the subject. In one embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is autoimmunity in the subject. In one embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is complement-mediated action in the subject. In one embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is a reduction in hematopoiesis in the subject. In other embodiments, the drug-related toxicity can be, for example, nephrotoxicity or hepatotoxicity.

別の態様では、本開示は、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、化学修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。別の態様では、本開示は、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、化学修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In another aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting the activation of unwanted immune cells in a subject to which RNA, eg, messenger RNA (mRNA), has been administered, to the subject, RNA. For example, the mRNA, eg, chemically modified RNA or mRNA, comprises at least the step of administering mRNA (eg, chemically modified mRNA or mRNA) to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells in the subject. The present invention relates to a method comprising one miR-126 microRNA binding site and / or a miR-142 microRNA binding site, wherein the mRNA, eg, a chemically modified mRNA or mRNA, comprises one or more modified nucleobases. In another aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting the production of unwanted cytokines in a subject administered with RNA, eg, messenger RNA (mRNA), to the subject, eg, RNA, eg. The mRNA, eg, a chemically modified mRNA or mRNA, comprises at least one miR- It relates to a method comprising 126 microRNA binding sites and / or miR-142 microRNA binding sites, wherein the mRNA, eg, a chemically modified mRNA, comprises one or more modified nucleobases.

上記で記載した通り、多様な実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡと称する）は、免疫細胞内で発現する１または複数のｍｉＲに対する、例えば、２つまたはそれよりも多い、１つ～４つ、１つ、２つ、３つ、または４つの結合部位を含みうる。ある特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、免疫細胞内で発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲに対する、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６に対する第１の結合部位と、免疫細胞内で発現する、異なるｍｉＲであって、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１５５またはｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）などのｍｉＲに対する第２の結合部位とを含みうる。代替的に、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）に対する第１の結合部位と、免疫細胞内で発現する、異なるｍｉＲであって、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１５５またはｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）などのｍｉＲに対する第２の結合部位とを含みうる。一実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐに対する第１の結合部位と、ｍｉＲ－１２６に対する第２の結合部位とを含む。 As described above, in various embodiments, the chemically modified mRNA (referred to as mmRNA) is, for example, one to four, for one or more miRs expressed in an immune cell, eg, two or more. It may include one, two, three, or four binding sites. In certain embodiments, the m mRNA comprises at least two binding sites for at least two different miRs expressed in immune cells. For example, mmRNA is a different miR expressed in immune cells with a first binding site for miR-126, such as miR-142 (miR-142-3p and / or miR-142-5p), miR-. It may include a second binding site for miR such as 155 or miR-146 (miR-146-3p and / or miR-146-5p). Alternatively, the mmRNA is a different miR expressed in immune cells with a first binding site for miR-142 (miR-142-3p and / or miR-142-5p), miR-126, It may include a second binding site for miR such as miR-155 or miR-146 (miR-146-3p and / or miR-146-5p). In one embodiment, the m mRNA comprises a first binding site for miR-142-3p and a second binding site for miR-126.

ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、目的のポリペプチド（例えば、治療剤）をコードし、この場合、望ましくない免疫細胞の活性化が、目的のポリペプチドに応答して生じる。 In certain embodiments, the mRNA encodes a polypeptide of interest (eg, a therapeutic agent), in which case unwanted immune cell activation occurs in response to the polypeptide of interest.

関連する実施形態では、被験体に、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を施すかまたは投与する。さらなる関連する実施形態では、被験体に、本開示の医薬組成物を施すかまたは投与する。特定の実施形態では、医薬組成物は、目的のポリペプチドをコードし、本明細書で記載される、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を含むｍｍＲＮＡを含むか、またはｍｍＲＮＡを含むナノ粒子を含む。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ナノ粒子内、例えば、脂質ナノ粒子内に存在する。特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡまたはナノ粒子は、医薬組成物中に存在する。 In a related embodiment, the subject is subjected to or administered with nanoparticles containing mRNA, eg, mRNA (eg, lipid nanoparticles). In a further related embodiment, the subject is subjected to or administered with the pharmaceutical composition of the present disclosure. In certain embodiments, the pharmaceutical composition encodes a polypeptide of interest and comprises mmRNAs comprising at least one miR binding site described herein, or nanoparticles comprising mmRNAs. In certain embodiments, the mRNA is present within nanoparticles, eg, lipid nanoparticles. In certain embodiments, the mRNA or nanoparticles are present in the pharmaceutical composition.

一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入（例えば、ポンプを介するものなどの静脈内注入）により投与する。一実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により、少なくとも４週間にわたり投与する。 In one embodiment, mRNA, eg, mRNA, is encapsulated in lipid nanoparticles and administered intravenously. In one embodiment, mRNA, eg, mRNA, is administered by weekly injection (eg, intravenous infusion, such as via a pump). In one embodiment, mRNA, eg mRNA, is administered by infusion once a week for at least 4 weeks.

別の実施形態では、本開示は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、リンパ球の活性化、Ｂ細胞の活性化）、または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法を提示する。 In another embodiment, the present disclosure discloses unwanted immune cell activation (eg, lymphocyte activation, B cell activation), or unwanted cytokines in a subject administered with messenger RNA (mRNA). A method of reducing or inhibiting the production of mRNA, which is a step of intravenously administering to a subject a first dose of mRNA encapsulated in LNP, eg, chemically modified mRNA (m mRNA). For example, with a step in which the mRNA comprises at least one miR-126 microRNA binding site and / or the miR-142 microRNA binding site and the mRNA, eg, the mRNA contains one or more modified nucleobases; subject. Intravenously administer a second dose of mRNA encapsulated in LNP, eg, mRNA, to the subject to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells or the production of unwanted cytokines. Presents a method that includes steps to be performed.

ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、目的のポリペプチド（例えば、治療剤）をコードし、この場合、望ましくない免疫細胞の活性化および／または望ましくないサイトカインの産生が、目的のポリペプチドに応答して生じる。 In certain embodiments, the mRNA encodes a polypeptide of interest (eg, a therapeutic agent), in which case activation of unwanted immune cells and / or production of unwanted cytokines responds to the polypeptide of interest. Occurs.

別の態様では、本開示は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、被験体へと反復投与した後に、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化（例えば、リンパ球の活性化、Ｂ細胞の活性化）、または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を、静脈内投与するステップであり、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位、および／またはｍｉＲ－１４２マイクロＲＮＡ結合部位を含み、
ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の免疫細胞の活性化のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の免疫細胞の活性化のレベルが低下したら、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化、または望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法を提示する。 In another aspect, the present disclosure discloses unwanted immune cell activation (eg, lymphocyte activation, B cell activation) in a subject after repeated administration of messenger RNA (mRNA) to the subject. ), Or a method of reducing or inhibiting the production of unwanted cytokines.
(I) A step of intravenously administering to a subject a first dose of mRNA encapsulated in LNP, eg, a chemically modified mRNA (m mRNA), wherein the mRNA, eg, m mRNA, is at least one miR-. Contains 126 microRNA binding sites and / or miR-142 microRNA binding sites
With a step in which the mRNA, eg, mRNA, comprises one or more modified nucleobases;
(Ii) With the step of detecting the level of activation of immune cells in a sample derived from a subject;
(Iii) Once the level of immune cell activation in the sample is reduced, the subject is injected into the LNP to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells or the production of unwanted cytokines in the subject. A method comprising the step of intravenously administering a second dose of mRNA encapsulated in, eg, mmRNA, is presented.

ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ、例えば、ｍｍＲＮＡは、目的のポリペプチド（例えば、治療剤）をコードし、この場合、望ましくない免疫細胞の活性化または望ましくないサイトカインの産生が、目的のポリペプチドに応答して生じる。 In certain embodiments, mRNA, eg, mRNA, encodes a polypeptide of interest (eg, a therapeutic agent), in which case activation of unwanted immune cells or production of unwanted cytokines is the polypeptide of interest. Occurs in response to.

ＡＤＡアッセイ
ＡＤＡアッセイ（バイオアッセイ）を使用して、中和抗体（ＮＡＢ）および非中和結合抗体（ＢＡＢ）の両方についてアッセイすることができる。ＮＡＢアッセイは、細胞ベースのアッセイ、例えば、細胞成長アッセイ、バイオマーカーアッセイ、遺伝子発現アッセイ、遺伝子レポーターアッセイ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイなど、ならびに非細胞ベースのアッセイ、例えば、競合的リガンド結合（ＣＬＢＡ）アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光（ＥＣＬ）、例えば、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、Ｇｙｒｏｓ（登録商標）抗薬物抗体（ＡＤＡ）イムノアッセイ、蛍光酵素イムノアッセイ（ＦＥＩＡ）、リストセチン誘導血小板凝集（ＲＩＰＡ）などの両方を含みうる。 ADA Assay The ADA assay (bioassay) can be used to assay for both neutralizing antibody (NAB) and non-neutralizing binding antibody (BAB). NAB assays are cell-based assays such as cell growth assay, biomarker assay, gene expression assay, gene reporter assay, antibody-dependent cell-mediated cell injury (ADCC) assay, complement-dependent cell injury (CDC) assay. Etc., as well as non-cell based assays such as Competitive ligand binding (CLBA) assay, surface plasmon resonance (SPR), enzyme immunoassay assay (ELISA), electrochemical luminescence (ECL), eg electrochemical luminescence immunoassay (ECLIA). ), DELFIA® (dissociation-enhanced laundry fluid assay), Gyros® anti-drug antibody (ADA) immunoassay, fluoroenzyme immunoassay (FEIA), wristsetin-induced platelet aggregation (RIPA), and the like.

例示的な態様では、治療レジメンは、治療レジメンの前または治療レジメン中に、１または複数のＡＤＡアッセイを行うことを含みうる。例示的な実施形態では、ＡＤＡアッセイは、ＮＡＢアッセイである。このような場合には、バイオアッセイは、生成物の作用機構と関連するものとし、それ以外のアッセイは、ＮＡＢの、臨床薬理学に対する効果について有用ではないであろう。好ましい実施形態では、細胞ベースのＮＡＢを、本開示の治療レジメンの特色とする。細胞ベースの中和アッセイが実施可能／利用可能でない場合、競合リガンド結合アッセイまたは代替法が適する場合がある。しかし、これらを使用する場合、アッセイは、適切な形で、中和能／力を裏付けることが好ましい。 In an exemplary embodiment, the treatment regimen may include performing one or more ADA assays before or during the treatment regimen. In an exemplary embodiment, the ADA assay is a NAB assay. In such cases, the bioassay shall be associated with the mechanism of action of the product, and other assays may not be useful for the effect of NAB on clinical pharmacology. In a preferred embodiment, cell-based NAB is characterized by the therapeutic regimen of the present disclosure. If a cell-based neutralization assay is not feasible / available, a competitive ligand binding assay or alternative method may be appropriate. However, when using them, the assay preferably supports neutralization / force in an appropriate manner.

ＡＤＡ応答の直接的な測定に加えて、免疫細胞の活性化のレベルはまた、抗体応答の発達の尺度としても査定することができる。免疫細胞の活性化のレベルは、細胞表面活性化マーカーを発現させる細胞の検出により典型的に評価される、活性化免疫細胞集団の頻度、または免疫細胞の活性化を指し示す、１もしくは複数のサイトカインの産生レベルなど、当技術分野で確立された、免疫細胞の活性化を評価するための、本質的に任意の方法により査定することができる。一実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化であり、この場合、Ｂ細胞の活性化のレベルを、脾臓のＢ細胞集団にわたる活性化Ｂ細胞の頻度など、活性化Ｂ細胞の頻度を測定することにより決定する。当技術分野では、Ｂ細胞の活性化を指し示すＢ細胞表面マーカーが周知である（例えば、Ｍａｄｄａｌａｙ， Ｒ．ら（２０１０年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８４巻：４８８３～４８９４頁を参照されたい）。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する。別の実施形態では、免疫細胞の活性化は、Ｂ細胞の活性化であり、この場合、Ｂ細胞の活性化のレベルを、例えば、処置される被験体の血清中の、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の分泌など、サイトカインの分泌により決定する。一実施形態では、Ｂ細胞の活性化を、例えば、処置される被験体の血清中の、ＩＬ－６の分泌により決定する。他の実施形態では、低減または阻害される、望ましくないサイトカインの産生は、例えば、処置される被験体の血清中の、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生である。別の実施形態では、低減または阻害される、望ましくないサイトカインの産生は、インターロイキン６（ＩＬ－６）の産生である。 In addition to the direct measurement of ADA response, the level of immune cell activation can also be assessed as a measure of the development of antibody response. The level of immune cell activation is typically assessed by detection of cells expressing cell surface activation markers, indicating the frequency of activated immune cell populations, or one or more cytokines indicating immune cell activation. It can be assessed by essentially any method for assessing immune cell activation established in the art, such as production levels of. In one embodiment, the activation of immune cells is the activation of B cells, in which case the level of activation of B cells, such as the frequency of activated B cells across the B cell population of the spleen, activated B cells. Determined by measuring the frequency of. B cell surface markers indicating B cell activation are well known in the art (see, eg, Maddale, R. et al. (2010), FEBS Letters, Vol. 584: pp. 4883-4894). In one embodiment, B cell activation is determined by the frequency of CD19 + CD86 + CD69 + B cells. In another embodiment, the activation of immune cells is the activation of B cells, in this case the level of activation of B cells, eg, interleukin 6 (IL) in the serum of the subject being treated. -6), determined by the secretion of cytokines, such as the secretion of tumor necrosis factor α (TNF-α), or interferon gamma (IFN-γ). In one embodiment, B cell activation is determined, for example, by the secretion of IL-6 in the serum of the subject being treated. In other embodiments, the production of unwanted cytokines that are reduced or inhibited is, for example, interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNF-α), in the serum of the subject being treated. Or the production of interferon gamma (IFN-γ). In another embodiment, the production of unwanted cytokines that are reduced or inhibited is the production of interleukin 6 (IL-6).

医薬組成物の投与
本開示の、１または複数のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む医薬組成物は、任意の適する経路により、被験体へと投与することができる。一部の実施形態では、本開示の組成物を、非経口経路（例えば、皮下注射法、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射法、静脈内注射法、腹腔内注射法、筋内注射法、関節内注射法、動脈内注射法、滑膜内注射法、胸骨下（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射法、髄腔内注射法、病変内注射法、または頭蓋内注射法、ならびに任意の適する注入法）、経口経路、経皮経路または皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）経路、皮間経路、直腸内経路、膣内経路、局所経路（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／またはドロップ）、経粘膜経路、経鼻経路、口腔内経路、腸内経路、硝子体内経路、腫瘍内経路、舌下経路、鼻腔内経路を含む、様々な経路のうちの１または複数により；気管内点滴、気管支内点滴、および／または吸入により；経口スプレーおよび／もしくは経口粉末、経鼻スプレー、および／もしくは経鼻エアゾールとして、ならびに／または門脈カテーテルを介して投与する。一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与、筋内投与、皮内投与、動脈内投与、腫瘍内投与、皮下投与、または吸入により投与することができる。しかし、本開示は、薬物送達についての科学の起こりうる進歩を考慮して、任意の適切な経路による、本開示の組成物の送達を包摂する。一般に、最も適切な投与経路は、１または複数のｍＲＮＡを含む医薬組成物の性格（例えば、血流および消化管など、多様な体内環境におけるその安定性）、および患者の状態（例えば、患者が、特定の投与経路を忍容することが可能であるのかどうか）を含む、様々な因子に依存するであろう。一実施形態では、組成物を、非経口的に投与する。別の実施形態では、組成物を、静脈内投与する。別の実施形態では、組成物を、腫瘍内投与する。 Administration of Pharmaceutical Compositions A pharmaceutical composition comprising one or more RNAs of the present disclosure, eg, mRNA, can be administered to a subject by any suitable route. In some embodiments, the compositions of the present disclosure are subjected to parenteral routes (eg, subcutaneous injection, intracutaneous injection, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, intra-articular injection). Method, intraarterial injection, intralubrisal injection, intrathoracic injection, intrathecal injection, intralesional or intracranial injection, and any suitable injection), oral route, trans. Transcutaneous or intradermal pathway, intercutaneous pathway, intracutaneous pathway, intravaginal pathway, topical pathway (eg, powder, ointment, cream, gel, lotion, and / or drop), transmucosal pathway, nasal pathway By one or more of a variety of routes, including intraoral, intestinal, intragranular, intratumoral, sublingual, intranasal routes; intratracheal, intrabronchial, and / or inhalation. By; oral spray and / or oral powder, nasal spray, and / or as nasal aerosol, and / or via a portal catheter. In some embodiments, the composition can be administered by intravenous administration, intramuscular administration, intradermal administration, intraarterial administration, intratumoral administration, subcutaneous administration, or inhalation. However, this disclosure includes delivery of the compositions of the present disclosure by any suitable route, given possible scientific advances in drug delivery. In general, the most appropriate route of administration is the nature of the pharmaceutical composition containing one or more mRNAs (eg, its stability in a variety of internal environments such as blood flow and gastrointestinal tract), and the patient's condition (eg, the patient). Will depend on a variety of factors, including whether it is possible to tolerate a particular route of administration. In one embodiment, the composition is administered parenterally. In another embodiment, the composition is administered intravenously. In another embodiment, the composition is administered intratumorally.

ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、所与の用量中、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇの用量は、被験体の体重１ｋｇ当たり、１ｍｇのｍＲＮＡまたはナノ粒子をもたらす）を送達するのに十分な投与量レベルで投与することができる。特定の実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの用量の、本開示のｍＲＮＡまたはナノ粒子を投与することができる。特定の実施形態では、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇの用量の、本開示のｍＲＮＡまたはナノ粒子を投与することができる。特定の実施形態では、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇの用量の、本開示のｍＲＮＡまたはナノ粒子を投与することができる。 In certain embodiments, the compositions of the present disclosure are about 0.0001 mg / kg to about 10 mg / kg, about 0.001 mg / kg to about 10 mg / kg, about 0.005 mg / kg at a given dose. ~ About 10 mg / kg, about 0.01 mg / kg ~ about 10 mg / kg, about 0.1 mg / kg ~ about 10 mg / kg, about 1 mg / kg ~ about 10 mg / kg, about 2 mg / kg ~ about 10 mg / kg, Approximately 5 mg / kg to approximately 10 mg / kg, approximately 0.0001 mg / kg to approximately 5 mg / kg, approximately 0.001 mg / kg to approximately 5 mg / kg, approximately 0.005 mg / kg to approximately 5 mg / kg, approximately 0.01 mg / Kg to about 5 mg / kg, about 0.1 mg / kg to about 10 mg / kg, about 1 mg / kg to about 5 mg / kg, about 2 mg / kg to about 5 mg / kg, about 0.0001 mg / kg to about 1 mg / kg kg, about 0.001 mg / kg to about 1 mg / kg, about 0.005 mg / kg to about 1 mg / kg, about 0.01 mg / kg to about 1 mg / kg, or about 0.1 mg / kg to about 1 mg / kg (A dose of 1 mg / kg can be administered at a dose level sufficient to deliver 1 mg of mRNA or nanoparticles per kg body weight of the subject). In certain embodiments, the mRNAs or nanoparticles of the present disclosure can be administered in doses of about 0.005 mg / kg to about 5 mg / kg. In certain embodiments, the mRNAs or nanoparticles of the present disclosure can be administered in doses of about 0.002 mg / kg to about 2 mg / kg. In certain embodiments, the mRNAs or nanoparticles of the present disclosure can be administered at a dose of about 0.02 mg / kg to about 0.2 mg / kg.

投与は、所望のｍＲＮＡレベル、発現、および／または効果（例えば、治療効果）を得るように、同じ量または異なる量で、毎日１回または複数回にわたり実施することができる。所望の投与量を、例えば、毎日３回、毎日２回、毎日１回、隔日、３日ごと、毎週、隔週、３週間ごと、または４週間ごとに送達することができる。ある特定の実施形態では、複数回にわたる投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれよりも多い回数にわたる投与）を使用して、所望の投与量を送達することができる。一部の実施形態では、単回投与は、例えば、手術の前もしくは後、または急性の疾患、障害、もしくは状態の場合に実施することができる。 Administration can be performed once or multiple times daily in the same or different amounts to obtain the desired mRNA level, expression, and / or effect (eg, therapeutic effect). The desired dose can be delivered, for example, three times daily, twice daily, once daily, every other day, every three days, every week, every other week, every three weeks, or every four weeks. In certain embodiments, multiple doses (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or more) are administered. It can be used to deliver the desired dose. In some embodiments, a single dose can be performed, for example, before or after surgery, or in the case of an acute disease, disorder, or condition.

任意の特定の患者に特異的な、治療的に有効な用量レベル、予防的に有効な用量レベル、またはそれ以外の適切な用量レベルは、存在する場合、処置される障害の重症度および識別；援用される、１または複数のｍＲＮＡ；援用される具体的組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および摂食；援用される具体的な医薬組成物の、投与回数、投与経路、および排出速度；処置の持続期間；援用される具体的な医薬組成物と組み合わせて、または同時に使用される薬物；および医療技術分野で周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存するであろう。 A therapeutically effective dose level, a prophylactically effective dose level, or any other suitable dose level specific to any particular patient, if present, is the severity and identification of the disorder being treated; Incorporated one or more mRNAs; incorporated specific composition; patient's age, weight, general health, gender, and feeding; incorporated specific pharmaceutical composition, dosing frequency, administration. Depends on a variety of factors, including pathways and rate of excretion; duration of treatment; drugs used in combination with or concurrently with the specific pharmaceutical composition to be invoked; and similar factors well known in the medical arts. Will.

一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、別の薬剤、例えば、別の治療剤、予防的薬剤、および／または診断的薬剤と組み合わせて投与することができる。「～と組み合わせた」とは、薬剤を同時に投与し、かつ／または送達のために併せて製剤化しなければならないことを含意するように意図するものではないが、これらの送達法も、本開示の範囲内にある。例えば、１または複数の異なるｍＲＮＡを含む、１または複数の組成物は、組み合わせて投与することができる。組成物は、１または複数の、他の所望の治療薬または医療手順と共時的に投与することもでき、これらの前に投与することもでき、これらに後続して投与することもできる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された、用量および／または時間スケジュールで投与する。一部の実施形態では、本開示は、それらのバイオアベイラビリティーを改善し、それらの代謝を低減および／もしくは修飾し、それらの排出を阻害し、かつ／またはそれらの体内の分布を改変する薬剤と組み合わせた、本開示の組成物、またはイメージング用組成物、診断用組成物、もしくは予防用組成物の送達を包摂する。 In some embodiments, the pharmaceutical compositions of the present disclosure can be administered in combination with another agent, eg, another therapeutic agent, prophylactic agent, and / or diagnostic agent. Although "combined with" is not intended to imply that the agents must be co-administered and / or formulated together for delivery, these delivery methods are also disclosed herein. Is within the range of. For example, one or more compositions comprising one or more different mRNAs can be administered in combination. The composition can be administered synchronically with one or more other desired therapeutic agents or medical procedures, can be administered before these, or can be administered following them. Generally, each drug is administered on a dose and / or time schedule determined for that drug. In some embodiments, the present disclosure is agents that improve their bioavailability, reduce and / or modify their metabolism, inhibit their excretion, and / or alter their distribution within the body. Incorporates the delivery of the compositions of the present disclosure, or imaging, diagnostic, or prophylactic compositions in combination with.

本開示の組成物と組み合わせて投与しうる、例示的な治療剤は、細胞傷害剤、化学療法剤、および他の治療剤を含むがこれらに限定されない。細胞傷害剤は、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、ラシェルマイシン、およびこれらの類似体を含みうる。放射性イオンもまた、治療剤として使用することができ、例えば、放射性ヨウ素、ストロンチウム、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、コバルト、イットリウム、サマリウム、およびプラセオジムを含みうる。他の治療剤は、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、および５－フルオロウラシル、およびデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、ラシェルマイシン、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、およびシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生剤（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、および抗有糸***剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびメイタンシノイド）を含みうる。 Exemplary therapeutic agents that can be administered in combination with the compositions of the present disclosure include, but are not limited to, cytotoxic agents, chemotherapeutic agents, and other therapeutic agents. Cell-damaging agents include, for example, taxol, cytocaracin B, gramicidine D, ethidium bromide, emetin, mitomycin, etoposide, teniposide, vincristine, vinblastine, corhitin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracindione, mitoxantrone, mitoxantrone, It may include actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoid, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, mitomycin, rachelmycin, and analogs thereof. Radioionic ions can also be used as therapeutic agents and may include, for example, radioactive iodine, strontium, phosphorus, palladium, cesium, iridium, cobalt, yttrium, samarium, and praseodymium. Other therapeutic agents include, for example, antimetabolites (eg, methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, and 5-fluorouracil, and decarbazine), alkylating agents (eg, chlormethine, thiotepa, chlorambucil, lashelmycin). , Melphalan, carmustine, lomustine, cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptzotocin, mitomycin C, and cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP), and cystarabine), anthracyclin (eg, daunorbisin and doxorubicin), It may include antibiotics (eg, dactinomycin, bleomycin, mitramycin, and anthramycin), and anti-thread splitting agents (eg, vincristine, vinblastine, taxol, and maytansinoid).

組合せレジメンを援用する、治療（治療薬または手順）の特定の組合せは、所望の治療薬および／または手順、ならびに達成される所望の治療効果に対する適合性を考慮に入れる。また、援用される治療が、同じ障害に所望の効果を達成する場合もあり（例えば、がんを処置するために有用な組成物は、化学療法剤と共時的に投与しうる）、異なる効果（例えば、任意の有害作用の制御）を達成する場合もあることも察知されるであろう。 A particular combination of treatments (therapeutic agents or procedures) with the aid of a combination regimen takes into account the desired therapeutic agent and / or procedure, as well as the suitability for the desired therapeutic effect achieved. Also, the treatments used may achieve the desired effect on the same disorder (eg, compositions useful for treating cancer may be co-administered with chemotherapeutic agents) and differ. It will also be detected that effects (eg, control of any adverse effects) may be achieved.

他の実施形態
本開示は、以下の実施形態に関する。 Other Embodiments The present disclosure relates to the following embodiments.

一部の態様では、本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response in a subject, such as reducing or inhibiting the anti-drug antibody response to a polypeptide of interest in the subject. To include the step of administering a modified messenger RNA (mmRNA) encoding the polypeptide of interest, the mmRNA comprises at least one miR-142-3p microRNA binding site, and the mmRNA contains one or more modified nucleosides. Concerning methods containing bases.

他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。 In another aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject, encapsulated in the LNP to the subject. A step of intravenously administering a first dose of a modified mRNA (m mRNA) encoding a polypeptide of interest, wherein the m mRNA comprises at least one miR-142-3p microRNA binding site and one or more m mRNAs. A second dose of m mRNA encapsulated within the LNP to the subject intravenously to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. The present invention relates to a method including an internal administration step.

なおさらなる態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含み、
ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の抗薬物抗体のレベルが低下したら、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法に関する。 In yet a further aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject.
(I) Intravenous administration of a first dose of modified mRNA (m mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in LNP to a subject, wherein the m mRNA is at least one miR-142. Includes -3p microRNA binding site
With a step in which the m mRNA contains one or more modified nucleobases;
(Ii) With the step of detecting the level of anti-drug antibody in the sample derived from the subject;
(Iii) When the level of anti-drug antibody in the sample is reduced, the mmRNA encapsulated in the LNP to the subject so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. The present invention relates to a method comprising a step of intravenously administering a dose of 2.

一部の態様では、本開示は、被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In some embodiments, the disclosure is a method of reducing or inhibiting drug-related toxicity in a subject, comprising administering to the subject a modified messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest. The mRNA contains at least one miR-142-3p microRNA binding site and the mRNA contains one or more modified nucleosides so as to reduce or inhibit drug-related toxicity to the polypeptide of interest in the subject. Regarding how to include.

他の態様では、本開示は、被験体における薬物関連毒性を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、被験体における、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性を低減または阻害するように、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In another aspect, the disclosure is a method of reducing or inhibiting drug-related toxicity in a subject comprising administering to the subject a modified messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest. Concerning a method in which an mRNA comprises at least one miR-126 microRNA binding site and the mRNA comprises one or more modified nucleosides so as to reduce or inhibit drug-related toxicity to the polypeptide of interest in a subject. ..

前出の態様の一部の実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における血球数の減少（血球減少症）である。前出の態様の他の実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における自己免疫である。前出の態様のさらなる実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における補体媒介作用である。前出の態様の一部の実施形態では、目的のポリペプチドに対する薬物関連毒性は、被験体における造血の減少である。前出の態様の他の実施形態では、薬物関連毒性は、腎毒性または肝毒性である。 In some embodiments of the aforementioned embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is a decrease in blood cell count (cytopenia) in the subject. In another embodiment of the aforementioned embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is autoimmunity in the subject. In a further embodiment of the aforementioned embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is complement-mediated action in the subject. In some embodiments of the aforementioned embodiment, the drug-related toxicity to the polypeptide of interest is a reduction in hematopoiesis in the subject. In another embodiment of the aforementioned embodiment, the drug-related toxicity is nephrotoxicity or hepatotoxicity.

一部の態様では、本開示は、被験体における抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を投与するステップを含み、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response in a subject, such as reducing or inhibiting the anti-drug antibody response to a polypeptide of interest in the subject. To include the step of administering a modified messenger RNA (m mRNA) encoding the polypeptide of interest, the m mRNA contains at least one miR-126 microRNA binding site, and the m mRNA contains one or more modified nucleosides. Regarding how to include.

他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。 In another aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject, encapsulated in the LNP to the subject. A step of intravenously administering a first dose of a modified mRNA (m mRNA) encoding a polypeptide of interest, wherein the m mRNA contains at least one miR-126 microRNA binding site and the m mRNA is one or more modifications. With a step comprising a nucleobase; a second dose of mmRNA encapsulated within the LNP is administered intravenously to the subject so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. And how to include it.

なおさらなる態様では、本開示は、目的のポリペプチドの、被験体への反復投与後における、抗薬物抗体応答を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、ＬＮＰ内に封入された、目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の第１の用量を静脈内投与するステップであり、ｍｍＲＮＡが、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含み、
ｍｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の抗薬物抗体のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の抗薬物抗体のレベルが低下したら、被験体における、目的のポリペプチドに対する抗薬物抗体応答を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入されたｍｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法に関する。 In yet a further aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting an anti-drug antibody response after repeated administration of a polypeptide of interest to a subject.
(I) A step of intravenously administering to a subject a first dose of a modified mRNA (m mRNA) encapsulated in an LNP that encodes a polypeptide of interest, wherein the m mRNA is at least one miR-126. Contains microRNA binding sites
With a step in which the m mRNA contains one or more modified nucleobases;
(Ii) With the step of detecting the level of anti-drug antibody in the sample derived from the subject;
(Iii) When the level of anti-drug antibody in the sample is reduced, the mmRNA encapsulated in the LNP to the subject so as to reduce or inhibit the anti-drug antibody response to the polypeptide of interest in the subject. The present invention relates to a method comprising a step of intravenously administering a dose of 2.

一部の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting unwanted immune cell activation in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest to the subject. And micro-expanded in the immune cells such that the chemically modified mRNA comprises the step of administering the chemically modified mRNA encoding the polypeptide of interest to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells in the subject. It relates to a method comprising at least one microRNA binding site for RNA, wherein the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases.

前出の態様の一部の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害を、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。前出の態様の他の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害は、リンパ球の活性化の低減または阻害である。 In some embodiments of the aforementioned embodiments, reduction or inhibition of unwanted immune cell activation is determined in comparison to control administration of chemically modified mRNA lacking at least one microRNA binding site. In another embodiment of the aforementioned embodiment, the reduction or inhibition of unwanted immune cell activation is the reduction or inhibition of lymphocyte activation.

前出の態様の一部の実施形態では、リンパ球の活性化の低減または阻害は、Ｂ細胞の活性化の低減または阻害である。前出の態様の他の実施形態では、Ｂ細胞の活性化の低減または阻害を、ＣＤ１９＋ＣＤ８６＋ＣＤ６９＋Ｂ細胞の頻度により決定する。 In some embodiments of the aforementioned embodiment, the reduction or inhibition of lymphocyte activation is a reduction or inhibition of B cell activation. In another embodiment of the aforementioned embodiment, the reduction or inhibition of B cell activation is determined by the frequency of CD19 + CD86 + CD69 + B cells.

前出の態様の一部の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害は、サイトカイン産生の低減または阻害を引き起こす。前出の態様の一部の実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも１０％減少させる。前出の態様のさらなる実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも２５％減少させる。前出の態様の一部の実施形態では、免疫細胞の活性化を、少なくとも５０％減少させる。前出の態様の他の実施形態では、免疫細胞の活性化を、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる。 In some embodiments of the aforementioned embodiments, the reduction or inhibition of unwanted immune cell activation causes a reduction or inhibition of cytokine production. In some embodiments of the aforementioned embodiments, the activation of immune cells is reduced by at least 10%. In a further embodiment of the aforementioned embodiment, the activation of immune cells is reduced by at least 25%. In some embodiments of the aforementioned embodiments, the activation of immune cells is reduced by at least 50%. In another embodiment of the aforementioned embodiment, the activation of immune cells is reduced without a corresponding reduction in the expression of the polypeptide of interest encoded by the chemically modified mRNA.

一部の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting unwanted immune cell activation in a subject administered with a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest to the subject. And a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP) is intravenously administered, wherein the chemically modified mRNA is at least one micron relative to the microRNA expressed in immune cells. With steps that include an RNA binding site and the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleobases; into the subject, into the LNP so as to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells in the subject. The present invention relates to a method comprising a step of intravenously administering a second dose of encapsulated chemically modified mRNA.

他の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の、被験体への反復投与後の被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、
（ｉ）被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、
化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；
（ｉｉ）被験体に由来する試料中の免疫細胞の活性化のレベルを検出するステップと；
（ｉｉｉ）試料中の免疫細胞の活性化のレベルが低下したら、被験体における、望ましくない免疫細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップと
を含む方法に関する。 In another aspect, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting unwanted immune cell activation in a subject after repeated administration of the messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest to the subject. hand,
(I) A step of intravenously administering to a subject a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), wherein the chemically modified mRNA is a microRNA expressed in immune cells. Containing at least one microRNA binding site for
With a step in which the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleosides;
(Ii) With the step of detecting the level of activation of immune cells in a sample derived from a subject;
(Iii) Once the level of activation of immune cells in the sample is reduced, the chemically modified mRNA encapsulated in the LNP to the subject so as to reduce or inhibit the activation of unwanted immune cells in the subject. The second dose of the above is the method comprising the step of intravenously administering.

前出の態様の一部の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害は、Ｂ細胞の活性化を低減または阻害する。前出の態様の一部の実施形態では、望ましくない免疫細胞の活性化の低減または阻害は、サイトカイン産生の低減または阻害を引き起こす。 In some embodiments of the aforementioned embodiment, the reduction or inhibition of unwanted immune cell activation reduces or inhibits B cell activation. In some embodiments of the aforementioned embodiments, the reduction or inhibition of unwanted immune cell activation causes a reduction or inhibition of cytokine production.

一部の態様では、本開示は、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、被験体における、望ましくないサイトカインの産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure is a method of reducing or inhibiting the production of unwanted cytokines in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest, to the subject. The chemically modified mRNA comprises at least the microRNA expressed in the immune cell, comprising the step of administering the chemically modified mRNA encoding the polypeptide of interest, such that the chemically modified mRNA reduces or inhibits the production of unwanted cytokines in the subject. It relates to a method comprising one microRNA binding site and the chemically modified mRNA comprising one or more modified cytokines.

前出の態様の一部の実施形態では、望ましくないサイトカインの産生の低減または阻害を、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。前出の態様の他の実施形態では、サイトカイン産生の低減または阻害は、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、またはインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生の低減または阻害である。前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生の低減または阻害は、インターロイキン６（ＩＬ－６）の産生の低減または阻害である。 In some embodiments of the aforementioned embodiments, reduction or inhibition of the production of unwanted cytokines is compared to control administration of chemically modified mRNAs lacking at least one microRNA binding site for microRNAs expressed in immune cells. To decide. In another embodiment of the aforementioned embodiment, reduction or inhibition of cytokine production reduces production of interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNF-α), or interferon gamma (IFN-γ). Or it is an inhibition. In some embodiments of the aforementioned embodiments, the reduction or inhibition of cytokine production is the reduction or inhibition of interleukin 6 (IL-6) production.

前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生を、少なくとも１０％減少させる。前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生を、少なくとも２５％減少させる。前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生を、少なくとも５０％減少させる。前出の態様の一部の実施形態では、サイトカイン産生を、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する減少を伴わずに減少させる。 In some embodiments of the aforementioned embodiments, cytokine production is reduced by at least 10%. In some embodiments of the aforementioned embodiments, cytokine production is reduced by at least 25%. In some embodiments of the aforementioned embodiments, cytokine production is reduced by at least 50%. In some embodiments of the aforementioned embodiments, cytokine production is reduced without a corresponding reduction in expression of the polypeptide of interest encoded by the chemically modified mRNA.

なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In yet a further aspect, the present disclosure reduces accelerated blood clearance in subjects repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). Alternatively, a method of inhibiting, comprising administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), comprising blood in the subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so that the acceleration of medium clearance is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleobases. Regarding methods including.

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure reduces accelerated blood clearance in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). Alternatively, it is a method of inhibiting the intravenous administration of a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in lipid nanoparticles (LNP) to a subject, wherein the chemically modified mRNA is intracellularly administered. With a step containing at least one microRNA binding site for microRNA expressed in, and the chemically modified mRNA containing one or more modified nucleobases; so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject. The present invention relates to a method comprising intravenously administering to a subject a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP.

他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In another aspect, the present disclosure relates to blood clearance in a subject who has undergone multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of reducing or inhibiting acceleration, comprising the step of administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), one or more. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject during subsequent subsequent doses. , A method in which a chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases.

なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、ｍＲＮＡの後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In yet a further aspect, the disclosure reduces or reduces the acceleration of blood clearance in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of inhibition comprising administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), comprising the step of administering to the subject during subsequent administration of the mRNA. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell and the chemically modified mRNA is one or more so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject. The present invention relates to a method containing a modified nucleobase.

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure accelerates blood clearance in subjects repeatedly administered a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of reducing or inhibiting, comprising administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), in the subject after repeated doses. To reduce or inhibit the acceleration of blood clearance, the chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in the immune cell, and the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleos. It relates to a method comprising a base, which does not activate B cells and / or induce the production of IgM molecules capable of binding to LNP.

他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップであり、被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しないステップとを含む方法に関する。 In another aspect, the disclosure reduces or reduces the acceleration of blood clearance in a subject administered with a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP). A method of inhibition, in which a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP) is intravenously administered to a subject, wherein the chemically modified mRNA is intracellularly administered. A step comprising at least one microRNA binding site for the expressed microRNA and the chemically modified mRNA comprising one or more modified nucleobases; a second of the chemically modified mRNA encapsulated within the LNP to the subject. Is a step of intravenous administration of the dose of LNP, which does not activate B cells and / or can bind to LNP so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject. The present invention relates to a method comprising a step of not inducing the production of IgM molecules.

なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない方法に関する。 In yet a further aspect, the present disclosure relates to blood clearance in a subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) and subjected to multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest. A method of reducing or inhibiting acceleration, comprising the step of administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), one or more. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the acceleration of blood clearance in the subject during subsequent subsequent doses. The method relates to a method in which a chemically modified mRNA contains one or more modified nucleobases and LNP does not activate B cells and / or induces the production of IgM molecules capable of binding to LNP.

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、ｍＲＮＡの後続の投与の実施時の被験体における血中クリアランスの加速化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含み、ＬＮＰが、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure reduces accelerated blood clearance in subjects administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). Alternatively, a method of inhibiting, comprising administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), at the time of subsequent administration of the mRNA. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so that the acceleration of blood clearance in the subject is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA is 1 or It relates to a method comprising a plurality of modified nucleobases, wherein the LNP does not activate B cells and / or induce the production of IgM molecules capable of binding to the LNP.

他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In another aspect, the disclosure recognizes polyethylene glycol (PEG) in a subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNP) and repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest. A method of reducing or inhibiting the production of IgM molecules, comprising the step of administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), repeated administration. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the production of PEG-recognizing IgM molecules in later subjects. Relates to a method comprising one or more modified nucleobases.

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure recognizes polyethylene glycol (PEG) in a subject administered with a messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP). A method of reducing or inhibiting the production of IgM molecules, which is a step of intravenously administering to a subject a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP), which is a chemical modification. A step in which the mRNA comprises at least one microRNA binding site for a microRNA expressed in an immune cell and the chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases; an IgM molecule recognizing PEG in a subject. The present invention relates to a method comprising intravenously administering to a subject a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP so as to reduce or inhibit the production of.

他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In another aspect, the present disclosure presents polyethylene glycol (PEG) in a subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNP) and subjected to multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest. ) Is a method of reducing or inhibiting the production of IgM molecules that recognize, the step of administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). Including, the chemically modified mRNA is applied to the microRNA expressed in immune cells so as to reduce or inhibit the production of PEG-recognizing IgM molecules in the subject at the time of performing one or more subsequent doses. It relates to a method comprising at least one microRNA binding site and the chemically modified mRNA comprising one or more modified nucleobases.

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、ＰＥＧを認識するＩｇＭ分子の産生を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure recognizes polyethylene glycol (PEG) in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). A method of reducing or inhibiting the production of IgM molecules, comprising administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), comprising the subsequent step. The chemically modified mRNA provides at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the production of PEG-recognizing IgM molecules in the subject at the time of administration of the mRNA. Containing and relating to a method in which a chemically modified mRNA comprises one or more modified nucleobases.

なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In yet a further aspect, the disclosure reduces or reduces activation of B1a cells in subjects who have been repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of inhibition comprising administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), comprising B1a in the subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so that the activation of the cell is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA contains one or more modified nucleobases. Regarding how to include.

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure reduces or reduces activation of B1a cells in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of inhibition, in which a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP) is intravenously administered to a subject, wherein the chemically modified mRNA is intracellularly administered. With a step comprising at least one microRNA binding site for the expressed microRNA and the chemically modified mRNA comprising one or more modified nucleobases; such as reducing or inhibiting activation of B1a cells in a subject. The present invention relates to a method comprising intravenously administering to a subject a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP.

他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In another aspect, the present disclosure describes the activity of B1a cells in a subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) and subjected to multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest. A method of reducing or inhibiting the formation of one or more times, comprising the step of administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the activation of B1a cells in the subject at the time of subsequent administration of. The present invention relates to a method in which a chemically modified mRNA contains one or more modified nucleobases.

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、Ｂ１ａ細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure reduces or reduces activation of B1a cells in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of inhibition comprising administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs), comprising the step of administering to the subject subsequent administration of the mRNA. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell such that the activation of B1a cells in the subject is reduced or inhibited, and the chemically modified mRNA is one or more. The present invention relates to a method containing a modified nucleobase.

他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を反復投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、反復投与後の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In another aspect, the present disclosure describes the activity of plasmacytoid dendritic cells in a subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNP) and repeatedly dosed with messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest. A method of reducing or inhibiting plasmacytoid dendrisis, comprising the step of administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), the subject after repeated doses. The chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site to the microRNA expressed in the immune cell so as to reduce or inhibit the activation of plasmacytoid dendritic cells in the body. It relates to a method comprising one or more modified nucleobases.

なおさらなる態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第１の用量を、静脈内投与するステップであり、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含むステップと；被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、被験体へと、ＬＮＰ内に封入された化学修飾ｍＲＮＡの第２の用量を、静脈内投与するステップとを含む方法に関する。 In yet a further aspect, the disclosure discloses activation of plasma cell-like dendritic cells in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). A method of intravenously administering to a subject a first dose of chemically modified mRNA encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), wherein the chemically modified mRNA is immune. With a step containing at least one microRNA binding site for intracellularly expressed microRNA and the chemically modified mRNA comprising one or more modified nucleobases; activation of plasmacytoid dendritic cells in the subject. The present invention relates to a method comprising intravenously administering a second dose of chemically modified mRNA encapsulated in LNP to a subject so as to reduce or inhibit it.

一部の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の複数回の投与を実施された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、１回または複数回の後続の投与の実施時の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In some embodiments, the present disclosure is plasma cell-like in a subject encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) and subjected to multiple doses of messenger RNA (mRNA) encoding the polypeptide of interest. A method of reducing or inhibiting the activation of dendritic cells, comprising administering to a subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). The chemically modified mRNA is at least relative to the microRNA expressed in the immune cells so as to reduce or inhibit the activation of plasmacytoid dendritic cells in the subject during one or more subsequent doses. It relates to a method comprising one microRNA binding site and the chemically modified mRNA comprising one or more modified nucleosides.

他の態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与された被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害する方法であって、被験体へと、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードする化学修飾ｍＲＮＡを投与するステップを含み、後続のｍＲＮＡの投与の実施時の被験体における、形質細胞様樹状細胞の活性化を低減または阻害するように、化学修飾ｍＲＮＡが、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、化学修飾ｍＲＮＡが、１または複数の修飾ヌクレオ塩基を含む方法に関する。 In another aspect, the disclosure discloses activation of plasmacytoid dendritic cells in a subject administered with messenger RNA (mRNA) encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP). A method of reducing or inhibiting a subject, comprising administering to the subject a chemically modified mRNA encoding a polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP), comprising administration of subsequent mRNA. Chemically modified mRNA comprises at least one microRNA binding site for microRNA expressed in immune cells so as to reduce or inhibit activation of plasmacytoid dendritic cells in the subject at the time of implementation. It relates to a method in which the modified mRNA contains one or more modified nucleobases.

前出の態様の一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、Ｂ細胞を活性化させず、かつ／またはＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。前出の態様の一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、Ｂ細胞を活性化させない。前出の態様の一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＬＮＰに結合することが可能なＩｇＭ分子の産生を誘導しない。 In some embodiments of the above embodiment, the mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNP) does not activate B cells and / or binds to LNP. Does not induce the production of possible IgM molecules. In some embodiments of the aforementioned embodiment, the mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) does not activate B cells. In some embodiments of the aforementioned embodiments, the mRNA encoding the polypeptide of interest encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) does not induce the production of IgM molecules capable of binding to LNP.

前出の態様の一部の実施形態では、血中クリアランスの加速化の低減または阻害を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入された、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を欠く化学修飾ｍＲＮＡの対照投与と比較して決定する。前出の態様の一部の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡによりコードされる、目的のポリペプチドの発現の、対応する低下または阻害を伴わずに、血中クリアランスの加速化を低減または阻害する。前出の態様の一部の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、２週間未満である。前出の態様の一部の実施形態では、２回にわたる連続投与の間の間隔は、１週間未満である。 In some embodiments of the above embodiments, the reduction or inhibition of accelerated blood clearance is controlled by a chemically modified mRNA lacking at least one microRNA binding site encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). Determined in comparison to administration. In some embodiments of the aforementioned embodiments, the acceleration of blood clearance is reduced or inhibited without the corresponding reduction or inhibition of expression of the polypeptide of interest encoded by the chemically modified mRNA. In some embodiments of the aforementioned embodiment, the interval between two consecutive doses is less than two weeks. In some embodiments of the aforementioned embodiment, the interval between two consecutive doses is less than one week.

前出の態様の一部の実施形態では、ＩｇＭ分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識する。 In some embodiments of the aforementioned embodiment, the IgM molecule recognizes polyethylene glycol (PEG).

前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子内に封入して、静脈内投与する。前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡを、毎週１回の注入により投与する。 In any of the above embodiments, the mmRNA described herein is encapsulated in lipid nanoparticles and administered intravenously. In any of the aforementioned embodiments, the mmRNA described herein is administered by weekly infusion.

前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、コード領域に対して異種性である、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡを全修飾する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡを、特定の化学修飾のために全修飾する。 In any of the aforementioned embodiments, the mmRNA described herein is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, at least one miR-142-3p microRNA. It contains a 3'UTR containing a binding site and a 3'tailing region of the nucleoside to be linked. In some embodiments, the mmRNA described herein comprises 5'UTRs and 3'UTRs that are heterologous to the coding region. In some embodiments, the mmRNA described herein is totally modified. In some embodiments, the mmRNA described herein is fully modified for a particular chemical modification.

前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）、シュードウリジン（ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２－チオウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、またはＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む。 In any of the above embodiments, the mmRNA described herein is pseudouridine (ψ), pseudouridine (ψ) and 5-methylcytidine (m5C), 1-methylpseudouridine (m 1 ψ). ), 1-Methyl pseudouridine (m 1 ψ) and 5-methylcytidine (m 5 C), 2-thiouridine (s 2 U), 2-thiouridine and 5-methylcytidine (m 5 C), 5-methoxyuridine (Mo 5 U), 5-methoxyuridine (mo 5 U) and 5-methylcytidine (m 5 C), 2'-O-methyl uridine, 2'-O-methyl uridine and 5-methylcytidine (m 5 C) ), N6-methyladenosine (m 6 A), or N6-methyl adenosine (m 6 A) and 5-methylcytidine (m 5 C).

前出の態様のうちのいずれかでは、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザシュードウリジン、２－チオ－１－メチルシュードウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオシュードウリジン、４－メトキシ－２－チオシュードウリジン、４－メトキシシュードウリジン、４－チオ－１－メチルシュードウリジン、４－チオシュードウリジン、５－アザウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、もしくは２’－Ｏ－メチルウリジン、またはこれらの組合せを含む。 In any of the above embodiments, the mmRNA described herein is pseudouridine (ψ), N1-methylseudouridine (m 1 ψ), 2-thiouridine, 4'-thiouridine, 5-methyl. Citocin, 2-thio-1-methyl-1-deazapseudouridine, 2-thio-1-methylseudouridine, 2-thio-5-azauridine, 2-thiodihydropseudouridine, 2-thiodihydrouridine, 2- Thio-pseudouridine, 4-methoxy-2-thio-pseudouridine, 4-methoxy-pseudouridine, 4-thio-1-methyl-pseudouridine, 4-thio-pseudouridine, 5-azauridine, dihydro-pseudouridine, 5-methoxy-pseudouridine, or Includes 2'-O-methyluridine, or a combination thereof.

一部の実施形態では、本明細書で記載されるｍｍＲＮＡは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、もしくはα－チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む。 In some embodiments, the mmRNAs described herein are 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudouridine. Includes (ψ), α-thioguanosine, or α-thioadenosine, or a combination thereof.

前出の態様のうちのいずれかでは、目的のポリペプチドは、治療用タンパク質、サイトカイン、増殖因子、抗体、または融合タンパク質である。 In any of the aforementioned embodiments, the polypeptide of interest is a Therapeutic protein, cytokine, growth factor, antibody, or fusion protein.

前出の態様のうちのいずれかでは、脂質ナノ粒子は、リポソームである。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質は、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡまたはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである。 In any of the aforementioned embodiments, the lipid nanoparticles are liposomes. In some embodiments, the lipid nanoparticles include cationic lipids and / or ionized lipids. In some embodiments, the cationic lipid and / or the ionized lipid is DLin-KC2-DMA or DLin-MC3-DMA.

前出の態様のうちのいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、この場合、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。前出の態様のうちのいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。 In any of the above embodiments, the mMRNA comprises at least two microRNA binding sites, in which case at least one of the microRNA binding sites is a miR-142-3p microRNA binding site. .. In any of the above embodiments, the mmRNA is the miR-142-3p binding site and miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-126, miR. Includes a second microRNA binding site for miR selected from the group consisting of -16, miR-21, miR-223, miR-24, and miR-27.

前出の態様のうちのいずれかでは、化学修飾ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。 In any of the above embodiments, the chemically modified mRNA is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, a 3'UTR containing at least one microRNA binding site, and a ligation. Contains the 3'tailing region of the nucleoside to be made.

前出の態様のうちのいずれかでは、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの１～１００ヌクレオチドの中に配置する。一部の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置する。 In one of the above embodiments, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and has at least one microRNA binding site in the 3'UTR after the stop codon. Place in 1-100 nucleotides of. In some embodiments, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon with at least one microRNA binding site, at least 50 nucleotides of 3'UTR after the stop codon. Place in.

前出の態様のうちのいずれかでは、化学修飾ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現するマイクロＲＮＡに対する、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。 In any of the above embodiments, the chemically modified mRNA is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, at least one microRNA relative to the microRNA expressed in the immune cell. Includes a 3'UTR containing the binding site and a 3'tailing region of the linked nucleoside.

前出の態様のうちのいずれかでは、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチドの中に配置する。一部の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置する。 In one of the preceding embodiments, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon with at least one miR-142-3p microRNA binding site after the stop codon. Placed in 30-50 nucleotides of the 3'UTR. In some embodiments, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon with at least one miR-142-3p microRNA binding site, 3'after the stop codon. Place in at least 50 nucleotides of the UTR.

前出の態様のうちのいずれかでは、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチドの中に配置する。一部の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を、終止コドンの後の、３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチドの中に配置する。 In any of the above embodiments, the codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and has at least one miR-126 microRNA binding site after the stop codon. Place in 30-50 nucleotides of 3'UTR. In some embodiments, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest comprises a stop codon and has at least one miR-126 microRNA binding site in the 3'UTR after the stop codon. Place in at least 50 nucleotides.

前出の態様のうちのいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、および連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。 In any of the above embodiments, the mmRNA is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the polypeptide of interest, a 3'UTR containing at least one miR-126 microRNA binding site, and. Includes the 3'tailing region of the linked nucleoside.

前出の態様のうちのいずれかでは、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、この場合、マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つは、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６結合部位と、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む。一部の実施形態では、化学修飾ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６結合部位およびｍｉＲ－１４２結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｍＲＮＡ構築物は、ｍｉＲ－１２６結合部位およびｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含む。 In any of the above embodiments, the mmRNA comprises at least two microRNA binding sites. In some embodiments, the mRNA comprises at least two microRNA binding sites, in which case at least one of the microRNA binding sites is the miR-126 microRNA binding site. In some embodiments, the mRNA is the miR-126 binding site and miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR. Includes a second microRNA binding site for miR selected from the group consisting of -21, miR-223, miR-24, and miR-27. In some embodiments, the chemically modified mRNA comprises a miR-126 binding site and a miR-142 binding site. In some embodiments, the mmRNA construct comprises a miR-126 binding site and a miR-142-3p binding site.

前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、配列番号３に示される配列を含む。 In any of the above embodiments, the microRNA binding site is the miR-142-3p binding site. In some embodiments, the miR-142-3p binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１２６結合部位は、配列番号２６に示される配列を含む。 In any of the above embodiments, the microRNA binding site is the miR-126 microRNA binding site. In some embodiments, the miR-126 binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 26.

前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１５５マイクロＲＮＡ結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１５５結合部位は、配列番号３５に示される配列を含む。 In any of the above embodiments, the microRNA binding site is the miR-155 microRNA binding site. In some embodiments, the miR-155 binding site comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 35.

前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、骨髄系細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、形質細胞様樹状細胞内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。前出の態様のうちのいずれかでは、マイクロＲＮＡ結合部位は、マクロファージ内で発現するマイクロＲＮＡに結合する。 In any of the above embodiments, the microRNA binding site binds to microRNA expressed in myeloid cells. In any of the aforementioned embodiments, the microRNA binding site binds to microRNA expressed within plasmacytoid dendritic cells. In any of the above embodiments, the microRNA binding site binds to microRNA expressed within macrophages.

定義
血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）：本明細書で使用される「血中クリアランスの加速化」または「ＡＢＣ」は、ある特定の、外因的に投与される薬剤が、２回目およびその後の投与において、血液から急速にクリアランスされる現象を指す。 Definitions Acceleration of Blood Clearance (ABC): As used herein, "acceleration of blood clearance" or "ABC" refers to a particular, extrinsically administered agent as a second and subsequent dose. In administration, it refers to the phenomenon of rapid clearance from blood.

～を投与すること：本明細書で使用される「～を投与すること」とは、組成物を、被験体または患者へと送達する方法を指す。投与法は、送達を、体内の特異的領域または系へとターゲティングする（例えば、特異的に送達する）ように選択することができる。例えば、投与は、非経口投与（例えば、皮下注射法、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射法、静脈内注射法、腹腔内注射法、筋内注射法、関節内注射法、動脈内注射法、滑膜内注射法、胸骨下注射法、髄腔内注射法、病変内注射法、または頭蓋内注射法、ならびに任意の適する注入法）、経口投与、経皮投与または皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）投与、皮間投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／またはドロップ）、経粘膜投与、経鼻投与、口腔内投与、腸内投与、硝子体内投与、腫瘍内投与、舌下投与、鼻腔内投与；気管内点滴、気管支内点滴、および／または吸入による投与；経口スプレーおよび／もしくは経口粉末、経鼻スプレー、および／もしくは経鼻エアゾールとしての投与、ならびに／または門脈カテーテルを介する投与でありうる。 Administering: As used herein, "administering" refers to a method of delivering a composition to a subject or patient. The method of administration can be selected to target (eg, specifically deliver) delivery to a specific region or system within the body. For example, administration is parenteral administration (eg, subcutaneous injection, intracutaneous injection, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, intraarticular injection, intraarterial injection, synovial membrane. Intrathoracic injection, subthoracic injection, intrathecal injection, intralesional or intracranial injection, and any suitable injection), oral, transdermal or intradermal (intradermal), intercutaneous. Administration, rectal administration, vaginal administration, topical administration (eg, powder, ointment, cream, gel, lotion, and / or drop), transmucosal administration, nasal administration, oral administration, intestinal administration, intravital administration , Intratumor, sublingual, intranasal; intratracheal, intrabronchial, and / or inhalation; oral spray and / or oral powder, nasal spray, and / or nasal aerosol, And / or administration via a portal catheter.

抗薬物抗体：本明細書で使用される「抗薬物抗体」または「ＡＤＡ」という用語は、被験体において存在する治療用タンパク質に対して、被験体において発生する抗体を指す。当技術分野では、古典的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答は、組換え治療用タンパク質の、被験体への全身投与から生じると理解される。さらに、ｍＲＮＡ治療薬に関して本明細書で使用されるＡＤＡ応答とは、本明細書で記載される動物研究において観察される抗体応答も包摂することが意図され、この場合、ｍＲＮＡ治療薬によりコードされる治療用タンパク質に結合する抗体（すなわち、ｍＲＮＡ薬によりコードされるタンパク質に対して発生する抗体）が発生した。ｍＲＮＡ薬によりコードされる治療用タンパク質に対する、このような抗体応答もまた、抗タンパク質抗体（ＡＰＡ）応答と称し、本明細書では、この用語法も、ＡＤＡ応答と互換的に使用することができる。 Anti-Drug Antibodies: As used herein, the term "anti-drug antibody" or "ADA" refers to an antibody that develops in a subject against a therapeutic protein that is present in the subject. In the art, it is understood that the classical anti-drug antibody (ADA) response results from systemic administration of a recombinant therapeutic protein to a subject. In addition, the ADA response as used herein with respect to the mRNA therapeutic is intended to include the antibody response observed in the animal studies described herein, in this case encoded by the mRNA therapeutic. Antibodies that bind to therapeutic proteins (ie, antibodies that develop against proteins encoded by mRNA drugs) have been generated. Such an antibody response to a Therapeutic protein encoded by an mRNA drug is also referred to as an anti-protein antibody (APA) response, and this terminology can also be used interchangeably herein. ..

アポトーシス：本明細書で使用される「アポトーシス」とは、プログラムされた事象の継起が細胞死をもたらす、細胞死の形態を指す。アポトーシスの顕徴は、形状の変化、細胞の収縮、カスパーゼの活性化、核および細胞質の凝縮、ならびに細胞膜のトポロジーの変更を含む。生化学的にアポトーシス性の細胞は、細胞内カルシウム濃度の増大、染色体ＤＮＡの断片化、および新規の細胞表面成分の発現により特徴付けられる。特定の実施形態では、アポトーシスを経る細胞は、ミトコンドリア外膜の透過化（ＭＯＭＰ）を経る場合がある。 Apoptosis: As used herein, "apoptosis" refers to a form of cell death in which the succession of programmed events results in cell death. Symptoms of apoptosis include changes in shape, contraction of cells, activation of caspases, condensation of nuclei and cytoplasm, and changes in cell membrane topology. Biochemically apoptotic cells are characterized by increased intracellular calcium concentration, fragmentation of chromosomal DNA, and expression of novel cell surface components. In certain embodiments, cells undergoing apoptosis may undergo permeabilization of the outer mitochondrial membrane (MOMP).

およそ、約：目的の、１または複数の値へと適用される場合に、本明細書で使用される「およそ」または「約」は、言明された基準値に近似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、そうでないことが言明されるか、または文脈からそうでないことが明らかでない限りにおいて（このような数が、可能な値の１００％を超える場合を除き）、言明された基準値に対して、いずれかの向き（基準値を超える向きまたは基準値未満の向き）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれ未満に収まる値の範囲を指す。 Approximately: As used herein, "approximately" or "approx." As applied to a given value of one or more, refers to a value that is close to the stated reference value. In certain embodiments, the term "approximately" or "approx." Is not stated otherwise, or unless the context makes it clear (such a number is a possible value of 100). 25%, 20%, 19%, 18%, 17% in either direction (direction exceeding the standard value or direction below the standard value) with respect to the declared standard value (except when exceeding%). , 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, or Refers to a range of values that fall below this.

結合抗体（ＢＡＢ）：本明細書で使用される「結合抗体」または「ＢＡＢ」とは、治療用タンパク質など、標的抗原に結合する、すなわち、これと相互作用することが可能な抗体を指す。結合抗体という用語は、中和抗体（すなわち、標的抗原に結合し、抗原の機能的活性を阻害する抗体）および非中和抗体（すなわち、標的抗原に結合するが、抗原の機能的活性を阻害しない抗体）を包摂することを意図する。 Bound antibody (BAB): As used herein, "binding antibody" or "BAB" refers to an antibody that can bind to, or interact with, a target antigen, such as a Therapeutic protein. The term bound antibody refers to neutralizing antibodies (ie, antibodies that bind to the target antigen and inhibit the functional activity of the antigen) and non-neutralizing antibodies (ie, bind to the target antigen but inhibit the functional activity of the antigen). Not intended to include antibodies).

がん：本明細書で使用される「がん」とは、細胞増殖の異常および／または調節不能を伴う状態である。がんという用語は、良性がんおよび悪性がんを包摂する。例示的で非限定的ながんは、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳がん、小児がん、原発不明がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間葉系腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、筋異形成症候群、鼻腔副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔がんおよび口腔咽頭がん、口腔肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟組織内の肉腫、皮膚の基底細胞がんおよび扁平上皮がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびにがん処置により引き起こされる続発がんを含む。特定の実施形態では、がんは、肝がん（例えば、肝細胞癌）または結腸直腸がんである。他の実施形態では、がんは、血液ベースのがんまたは造血がんである。 Cancer: As used herein, "cancer" is a condition associated with abnormal cell proliferation and / or dysregulation. The term cancer includes benign and malignant cancers. Exemplary, non-limiting cancers include corticolytic cancer, advanced cancer, anal cancer, regenerative anemia, bile duct cancer, bladder cancer, bone cancer, bone metastasis, brain tumor, brain cancer, Breast cancer, childhood cancer, cancer of unknown primary origin, Castleman's disease, cervical cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing family tumor, eye cancer, bile sac cancer, gastrointestinal tract Cartinoid tumor, gastrointestinal mesenchymal tumor, gestational chorionic villus disease, Hodgkin's disease, Kaposi's sarcoma, renal cell carcinoma, laryngeal pharyngeal cancer, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic Myeloid leukemia, chronic myeloid monocytic leukemia, liver cancer (eg, hepatocellular carcinoma), non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, lung cartinoid tumor, cutaneous lymphoma, malignant mesoderma, multiple myeloma, myopathy Plastic syndrome, nasal sinus cancer, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, non-hodgkin lymphoma, oral cancer and oropharyngeal cancer, oral sarcoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, penis cancer, pituitary tumor , Prostate cancer, retinal blastoma, rhizome myoma, salivary adenocarcinoma, sarcoma in adult soft tissue, basal cell cancer and squamous epithelial cancer of the skin, melanoma, small bowel cancer, gastric cancer, testis cancer, Includes pharyngeal cancer, thoracic adenocarcinoma, thyroid cancer, uterine sarcoma, vaginal cancer, genital cancer, Waldenstrom macroglobulinemia, Wilms tumor, and secondary cancers caused by cancer treatment. In certain embodiments, the cancer is liver cancer (eg, hepatocellular carcinoma) or colorectal cancer. In other embodiments, the cancer is a blood-based cancer or hematopoietic cancer.

コンジュゲートさせた：２つまたはそれよりも多い部分との関連で使用される場合に本明細書で使用される「コンジュゲートさせた」という用語は、部分が物理的に会合するか、あるいは直接的に、または連結剤として用いられる、１もしくは複数のさらなる部分を介して、互いと接続されて、構造が使用される条件下、例えば、生理学的条件下で、部分が依然として物理的に会合しているように、十分に安定的な構造を形成することを意味する。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い部分を、直接的な共有結合的化学的結合によりコンジュゲートさせることができる。他の実施形態では、２つまたはそれよりも多い部分を、イオン結合または水素結合によりコンジュゲートさせることができる。 Conjugated: The term "conjugated" as used herein in the context of two or more parts is that the parts physically meet or are directly associated with each other. The moieties are still physically associated under conditions where the structure is used, eg, physiological conditions, connected to each other, either specifically or through one or more additional moieties used as linking agents. As you can see, it means forming a sufficiently stable structure. In some embodiments, two or more moieties can be conjugated by direct covalent chemical bonds. In other embodiments, two or more moieties can be conjugated by ionic or hydrogen bonds.

～を接触させること：本明細書で使用される「～を接触させること」という用語は、２つまたはそれよりも多い実体の間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、細胞を、ｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子組成物と接触させることとは、細胞と、ｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子とに、物理的接続を共有させることを意味する。生物学的技術分野では、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏのいずれにおいても、細胞を、外部の実体と接触させる方法が周知である。本開示の例示的な実施形態では、哺乳動物の細胞を、組成物（例えば、本開示の単離ｍＲＮＡ、ナノ粒子、または医薬組成物）と接触させるステップを、ｉｎ ｖｉｖｏで実施する。例えば、生物（例えば、哺乳動物）内に配置されうる脂質ナノ粒子組成物と、細胞（例えば、哺乳動物細胞）とを接触させることは、任意の適する投与経路（例えば、生物への非経口投与であって、静脈内投与、筋内投与、皮内投与、および皮下投与を含む非経口投与）により実施することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏに存在する細胞では、組成物（例えば、脂質ナノ粒子または単離ｍＲＮＡ）と、細胞とは、例えば、組成物を、細胞の培養培地へと添加することにより接触させることができ、トランスフェクションを伴うか、これを結果としてもたらしうる。さらに、１つを超える細胞に、ナノ粒子組成物を接触させることもできる。 Contacting: As used herein, the term "contacting" means establishing a physical connection between two or more entities. For example, contacting a cell with an mRNA or lipid nanoparticle composition means causing the cell to share a physical connection with the mRNA or lipid nanoparticle. In the field of biological technology, methods of bringing cells into contact with external entities are well known in all of in vivo, in vitro, and ex vivo. In an exemplary embodiment of the present disclosure, the step of contacting mammalian cells with a composition (eg, an isolated mRNA, nanoparticles, or pharmaceutical composition of the present disclosure) is performed in vivo. For example, contacting a cell (eg, a mammalian cell) with a lipid nanoparticle composition that can be placed in an organism (eg, a mammal) can be any suitable route of administration (eg, parenteral administration to the organism). It can be carried out by parenteral administration including intravenous administration, intramuscular administration, intradermal administration, and subcutaneous administration). In cells present in vitro, the composition (eg, lipid nanoparticles or isolated mRNA) and the cells can be contacted, for example, by adding the composition to the culture medium of the cells, transfection. It can be accompanied by transfection or can result in this. In addition, the nanoparticle composition can be contacted with more than one cell.

薬物関連毒性：本明細書で使用される「薬物関連毒性」または単なる「毒性」という用語は、被験体における、ｍＲＮＡによりコードされる治療用タンパク質の発現から生じうる、望ましくないｉｎ ｖｉｖｏ作用であって、例えば、コードされる治療用タンパク質に結合する（そして、潜在的に中和する）抗体の発生など、コードされる治療用タンパク質に対して刺激される免疫応答の結果として生じうる、望ましくないｉｎ ｖｉｖｏ作用を指す。したがって、「薬物関連毒性」という用語は、コードされた治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答から生じる、ｉｎ ｖｉｖｏにおける有害作用であって、血液学的作用（例えば、血液毒性）、腎作用、自己免疫作用、肝作用などを含むがこれらに限定されない有害作用を包摂することを意図する。 Drug-related toxicity: As used herein, the term "drug-related toxicity" or simply "toxicity" is an undesired in vivo effect that may result from the expression of a Therapeutic protein encoded by mRNA in a subject. And, for example, the development of antibodies that bind (and potentially neutralize) the encoded therapeutic protein, which can result from an immune response stimulated against the encoded therapeutic protein, which is undesirable. Refers to in vivo action. Thus, the term "drug-related toxicity" is an in vivo adverse effect resulting from an undesired immune response to the encoded therapeutic protein, including hematological effects (eg, hematological toxicity), renal effects, autoimmunity. It is intended to include adverse effects including, but not limited to, effects, hepatic effects, etc.

～を封入する：本明細書で使用される「～を封入する」という用語は、囲い込むか、取り囲むか、または包み込むことを意味する。一部の実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、または他の組成物を、十全に封入することもでき、部分的に封入することもでき、実質的に封入することもできる。例えば、一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子、例えば、リポソーム内に封入することができる。 Encapsulating: As used herein, the term "encapsulating" means enclosing, enclosing, or enclosing. In some embodiments, the compound, polynucleotide (eg, mRNA), or other composition can be fully encapsulated, partially encapsulated, or substantially encapsulated. .. For example, in some embodiments, the mRNAs of the present disclosure can be encapsulated in lipid nanoparticles, eg, liposomes.

有効量：本明細書で使用される、薬剤の「有効量」という用語は、有益または所望の結果、例えば、臨床的結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、適用される文脈に依存する。例えば、がんを処置する薬剤を投与する文脈では、薬剤の有効量は、例えば、本明細書で規定される通り、薬剤の投与を伴わずに得られる応答と比較して、がんの処置を達成するのに十分な量である。一部の実施形態では、治療有効量とは、送達される薬剤（例えば、核酸、治療剤、診断剤、または予防剤）の量であって、感染、疾患、障害、および／もしくは状態を患うか、またはこれらを受けやすい被験体へと投与する場合に、感染、疾患、障害、および／または状態を、処置し、これらの症状を改善し、これらを診断し、防止し、かつ／またはこれらの発症を遅延させるのに十分な量である。 Effective Amount: As used herein, the term "effective amount" of a drug is an amount sufficient to produce a beneficial or desired result, eg, a clinical result, and thus "effective amount" is. Depends on the context in which it applies. For example, in the context of administering a drug that treats cancer, the effective amount of the drug is, for example, as defined herein, compared to the response obtained without administration of the drug to treat the cancer. Is enough to achieve. In some embodiments, a therapeutically effective amount is the amount of agent delivered (eg, nucleic acid, therapeutic agent, diagnostic agent, or prophylactic agent) that suffers from an infection, disease, disorder, and / or condition. Or, when administered to susceptible subjects, treat infections, diseases, disorders, and / or conditions, improve these symptoms, diagnose, prevent, and / or these. Enough to delay the onset of.

発現：本明細書で使用される核酸配列の「発現」とは、以下の事象：（１）ＲＮＡ鋳型の、ＤＮＡ配列からの産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡの、ポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの１または複数を指す。 Expression: The "expression" of a nucleic acid sequence as used herein refers to the following events: (1) production of an RNA template from a DNA sequence (eg, by transcription); (2) processing of an RNA transcript (2) For example, by splicing, editing, 5'cap formation, and / or 3'end processing); (3) translation of RNA into a polypeptide or protein; and (4) post-translational modification of the polypeptide or protein. Refers to one or more.

同一性：本明細書で使用される「同一性」という用語は、ポリマー分子の間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）の間および／またはポリペプチド分子の間の、全体的な類縁性を指す。例えば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較を目的として、２つの配列をアライメントすることにより実施することができる（例えば、最適なアライメントのために、第１の核酸配列および第２の核酸配列の一方または両方に、ギャップを導入することができ、同一でない配列は、比較を目的として無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較を目的としてアライメントされる配列の長さは、基準配列の長さの、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドにより占有されていれば、分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列により共有される、同一な位置の数の関数である。２つの配列の間の配列の比較、および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年において記載されている方法などの方法を使用して決定することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）へと組み込まれた、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、４巻：１１～１７頁）のアルゴリズムを使用して決定することができる。２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは代替的に、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列を使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定することもできる。配列の間の同一性パーセントを決定するのに一般に援用される方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８巻：１０７３頁（１９８８年）において開示されている方法を含むがこれらに限定されない。同一性を決定するための技法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムにおいてコード化されている。２つの配列の間の相同性を決定する、例示的なコンピュータソフトウェアは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻（１号）：３８７頁、１９８４年）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３頁、１９９０年）を含むがこれらに限定されない。 Identity: As used herein, the term "identity" is used between polymer molecules, eg, between polynucleotide molecules (eg, DNA and / or RNA molecules) and / or between polypeptide molecules. , Refers to the overall affinity. For example, the calculation of the percent identity of two polynucleotide sequences can be performed by aligning the two sequences for optimal comparison (eg, for optimal alignment, the first nucleic acid sequence. And a gap can be introduced into one or both of the second nucleic acid sequences, and non-identical sequences can be ignored for comparison purposes). In certain embodiments, the length of the sequence aligned for comparison is at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% of the length of the reference sequence. , At least 90%, at least 95%, or 100%. The nucleotides at the corresponding nucleotide positions are then compared. If a position in the first sequence is occupied by the same nucleotides as the corresponding position in the second sequence, the molecule is identical at this position. The percent identity between two sequences is the same, shared by the sequences, taking into account the number of gaps and the length of each gap that needs to be introduced for optimal alignment of the two sequences. It is a function of the number of positions. Sequence comparisons between two sequences and determination of percent identity can be accomplished using mathematical algorithms. For example, the percentage of identity between two nucleotide sequences is defined in Computational Molecular Biology, Lesk, A. et al., Each of which is incorporated herein by reference. M. Eds., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. et al. W. Hen, Academic Press, New York, 1993; Sequencing Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.M. , Academic Press, 1987; Computer Analysis of Section Data, Department I, Griffin, A. et al. M. And Griffin, H. et al. G. Hen, Humana Press, New Jersey, 1994; and Sex Anysis Primer, Gribskov, M. et al. And Devereux, J. Mol. It can be determined using methods such as ed., M Stockton Press, New York, the method described in 1991. For example, the percent identity between two nucleotide sequences was incorporated into the ALIGN program (version 2.0), which uses a PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12, and a gap penalty of 4. And Miller (CABIOS, 1989, Vol. 4: pp. 11-17) can be used to determine. The percent identity between the two nucleotide sequences is alternative to NWSgapdna. It can also be determined using the GAP program in the GCG software package, which uses the CMP matrix. Methods commonly used to determine percent identity between sequences are incorporated herein by reference, Carillo, H. et al. And Lipman, D.I. , SIAM J Applied Math. , 48: 1073 (1988), including, but not limited to, the methods disclosed. Techniques for determining identity are coded in commonly available computer programs. Illustrative computer software that determines homology between two sequences is the GCG program package (Deverex et al., Nucleic Acids Research, Vol. 12 (No. 1): 387, 1984) BLASTP, BLASTN, and FASTA ( Altschul, SF et al., J. Molec. Biol., Vol. 215, p. 403, 1990), but not limited to these.

断片：本明細書で使用される「断片」とは、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離されるか、または組換えＤＮＡ法により得られた、全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含みうる。 Fragment: As used herein, "fragment" refers to a portion. For example, a fragment of a protein may include a polypeptide isolated from cultured cells or obtained by digesting a full-length protein obtained by recombinant DNA methods.

血液毒性：本明細書で使用される「血液毒性」という用語は、造血系において生じる毒性学的事象（例えば、薬物関連毒性から生じる）であって、血球減少症（例えば、網状赤血球減少症、血小板減少症、好中球減少症）、造血の減少、および貧血を含むがこれらに限定されない事象を指す。機構に限定されることを意図するものではないが、被験体における血液毒性は、被験体へと投与されるｍＲＮＡによりコードされる治療用タンパク質に対する免疫応答の発達であって、例えば、治療用タンパク質に対して抗体が発生する結果としての免疫応答の発達から生じる場合があり、したがって、血液毒性は、薬物関連毒性のサブセットでありうる。 Hematological toxicity: As used herein, the term "hematological toxicity" is a toxic event that occurs in the hematopoietic system (eg, resulting from drug-related toxicity) and is cytopenia (eg, reticulocytopenia, etc.). Refers to events including, but not limited to, thrombocytopenia, neutrocytopenia), decreased hematopoiesis, and anemia. Although not intended to be limited to mechanics, hematological toxicity in a subject is the development of an immune response to a therapeutic protein encoded by the mRNA administered to the subject, eg, a therapeutic protein. Hematological toxicity can therefore be a subset of drug-related toxicity, as it may result from the development of an immune response as a result of the development of antibodies against.

異種：本明細書で使用される「異種」とは、配列（例えば、アミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）が通常、所与のポリペプチド内またはポリヌクレオチド内に存在しないことを指し示す。例えば、１つのタンパク質のドメインまたはモチーフに対応するアミノ酸配列は、第２のタンパク質に対して異種性でありうる。 Heterogeneous: As used herein, "heterologous" refers to the absence of a sequence (eg, an amino acid sequence, or a polynucleotide encoding an amino acid sequence), usually within a given polypeptide or polynucleotide. .. For example, the amino acid sequence corresponding to the domain or motif of one protein can be heterologous to the second protein.

疎水性アミノ酸：本明細書で使用される「疎水性アミノ酸」とは、非帯電の非極性側鎖を有するアミノ酸である。自然発生の疎水性アミノ酸の例は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）である。 Hydrophobic Amino Acids: As used herein, "hydrophobic amino acids" are amino acids with uncharged non-polar side chains. Examples of naturally occurring hydrophobic amino acids are alanine (Ala), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), proline (Pro), phenylalanine (Phe), methionine (Met), and tryptophan (Trp). Is.

単離された：本明細書で使用される「単離された」という用語は、それが会合していた（天然であれ、実験の設定下であれ）成分の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離物質は、それらが会合していた物質との関連で、変動するレベルの純度を有しうる。単離物質および／または単離実体は、それらが初期に会合していた他の成分のうちの少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くから分離することができる。一部の実施形態では、単離薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超えて、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される通り、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。 Isolated: The term "isolated" as used herein is a substance isolated from at least a portion of the components with which it was associated (whether natural or under experimental setting). Or refers to an entity. The isolated substances can have varying levels of purity in relation to the substance they were associated with. Isolated substances and / or isolated entities are at least about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60% of the other components they were initially associated with. It can be separated from about 70%, about 80%, about 90%, or more. In some embodiments, the isolated agent is about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97. %, About 98%, more than about 99%, or more than about 99% pure. As used herein, a substance is "pure" when it is substantially free of other components.

リポソーム：本明細書で使用される「リポソーム」とは、水性の内部を囲い込む、脂質含有膜を含む構造を意味する。リポソームは、１または複数の脂質膜を有しうる。リポソームは、単層型リポソーム（当技術分野ではまた、単層リポソームとしても公知である）および多層型リポソーム（当技術分野ではまた、多層リポソームとしても公知である）を含む。 Liposomes: As used herein, "liposome" means a structure containing a lipid-containing membrane that encloses an aqueous interior. Liposomes can have one or more lipid membranes. Liposomes include monolayer liposomes (also known in the art as monolayer liposomes) and multilayer liposomes (also known in the art as multilayer liposomes).

転移：本明細書で使用される「転移」という用語は、がんが、原発腫瘍として最初に生じた場所から、体内の遠隔の位置へと拡散する過程を意味する。この過程の結果として生じる続発腫瘍を、「転移」と称することができる。 Metastasis: As used herein, the term "metastasis" refers to the process by which cancer spreads from the place where it first originated as a primary tumor to a remote location in the body. Secondary tumors resulting from this process can be referred to as "metastasis".

ｍＲＮＡ：本明細書で使用される「ｍＲＮＡ」とは、メッセンジャーリボ核酸を指す。ｍＲＮＡは、天然の場合もあり、非自然発生の場合もある。例えば、ｍＲＮＡは、１または複数のヌクレオ塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーなど、修飾構成要素および／または非自然発生の構成要素を含みうる。ｍＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含みうる。ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有しうる。ｍＲＮＡの翻訳、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、哺乳動物細胞内の、ｍＲＮＡの翻訳は、ポリペプチドを産生しうる。従来、ｍＲＮＡ分子の塩基構成要素は、少なくとも１つのコード領域、５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、およびポリＡ配列を含む。 mRNA: As used herein, "mRNA" refers to messenger ribonucleic acid. mRNA may be natural or non-spontaneous. For example, mRNA may contain modifying and / or non-spontaneous components such as one or more nucleosides, nucleosides, nucleotides, or linkers. The mRNA may contain a cap structure, a chain termination nucleoside, a stem loop, a poly A sequence, and / or a polyadenylation signal. The mRNA can have a nucleotide sequence that encodes a polypeptide. Translation of mRNA, eg, in vivo, in mammalian cells, translation of mRNA can produce a polypeptide. Traditionally, the base component of an mRNA molecule comprises at least one coding region, a 5'-untranslated region (5'UTR), a 3'UTR, 5'cap, and a poly A sequence.

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、遺伝子発現の転写後調節（例えば、ｍＲＮＡの切断、そのポリＡテールの短縮によるｍＲＮＡの不安定化、および／またはリボソームによる、ｍＲＮＡの、ポリペプチドへの翻訳の効率に対する干渉などの、ＲＮＡサイレンシングによって）において機能しうる、小型の非コードＲＮＡ分子である。成熟ｍｉＲＮＡは典型的に、約２２～２３ヌクレオチド長である。 MicroRNA (miRNA): As used herein, "microRNA (miRNA)" refers to post-transcriptional regulation of gene expression (eg, mRNA cleavage, mRNA destabilization due to shortening of its polyA tail, and mRNA destabilization. / Or a small non-coding RNA molecule that can function in RNA silencing, such as interference with the efficiency of translation of mRNA into a polypeptide by ribosomes. Mature miRNAs are typically about 22-23 nucleotides in length.

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（ｍｉＲ）結合部位：本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（ｍｉＲ）結合部位」とは、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）標的部位もしくはｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）認識部位、またはｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）が結合または会合する任意のヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位とは、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合の少なくとも「シード」領域が結合する、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレオチド位置またはヌクレオチド領域を表す。「結合」は、従来のワトソン－クリック型ハイブリダイゼーション規則に従う場合もあり、ｍｉＲＮＡの、マイクロＲＮＡ部位における標的配列、またはこれに隣接する標的配列との、任意の安定的な会合を反映する場合もあることを理解されたい。ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位に言及する場合のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）配列とは、ｍｉＲＮＡ結合部位に結合するｍｉＲＮＡと相補性（例えば、部分的、実質的、または完全な（または十全な）相補性）を有すると理解されるものとする。ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）が、その対応するｍＲＮＡに対して、翻訳の制御および／または転写物安定性の制御を及ぼす場合にそうである通り、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）、例えば、内因性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）に部分的に相補的でありうる。代替的に、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）が、その対応するｍＲＮＡに対して、転写後制御および／または翻訳の制御を及ぼす場合にそうである通り、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）、例えば、内因性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）に十全に相補的（完全に相補的）でありうる。本開示の好ましい態様では、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）、例えば、内因性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）に十全に相補的であり、対応するｍｉＲが発現する、例えば、内因的に発現する、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞内および／または組織内の、前記ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）を含むｍＲＮＡの切断を引き起こしうる。 MicroRNA (miRNA) (miR) binding site: As used herein, the "microRNA (miRNA) (miR) binding site" is a miRNA (miR) target site, a miRNA (miR) recognition site, or a miRNA ( Refers to any nucleotide sequence to which a miR) binds or associates. In some embodiments, a miRNA (miR) binding site represents a nucleotide position or region of a polynucleotide (eg, mRNA) to which at least a "seed" region of miRNA (miR) binding is bound. "Binding" may follow conventional Watson-click hybridization rules and may reflect any stable association of miRNAs with the target sequence at the microRNA site, or with adjacent target sequences. Please understand that there is. When referring to a miRNA (miR) binding site, a miRNA (miR) sequence is complementary to a miRNA that binds to a miRNA binding site (eg, partial, substantial, or complete (or full) complementarity). It shall be understood that it has. MiRNA (miR) binding sites are miRNA (miR), eg, miRNA (miR), as is the case when miRNA (miR) exerts translational control and / or transcript stability control on its corresponding mRNA. It can be partially complementary to endogenous miRNA (miR). Alternatively, miRNA (miR) binding sites are miRNA (miR), eg, miRNA (miR), as is the case when miRNA (miR) exerts post-transcriptional and / or translational control on its corresponding mRNA. , Can be fully complementary (fully complementary) to endogenous miRNA (miR). In a preferred embodiment of the present disclosure, the miRNA (miR) binding site is fully complementary to a miRNA (miR), eg, an endogenous miRNA (miR), and the corresponding miR is expressed, eg, endogenously expressed. Can cause cleavage of the miRNA (miR) -containing mRNA in vivo cells and / or tissues.

ｍｉＲＮＡシード：本明細書で使用されるｍｉＲＮＡの「シード」領域とは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域内の配列であって、典型的に、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完壁なワトソン－クリック型相補性を有する配列を指す。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位または２～７位を含みうる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含むことが可能であり、この場合、対応するｍｉＲＮＡ結合部位内のシード相補性部位には、ｍｉＲＮＡの１位と対面するアデニン（Ａ）がフランキングする。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含むことが可能であり、この場合、対応するｍｉＲＮＡ結合部位内のシード相補性部位には、ｍｉＲＮＡの１位と対面するアデニン（Ａ）がフランキングする。ｍｉＲＮＡ結合部位に言及する場合のｍｉＲＮＡシード配列とは、ｍｉＲＮＡ結合部位に結合するｍｉＲＮＡのシード配列と相補性（例えば、部分的、実質的、または完全な（または十全な）相補性）を有すると理解されるものとする。 miRNA seeds: As used herein, the "seed" region of a miRNA is a sequence within the 2-8 region of a mature miRNA, typically a complete Watson-click type for the miRNA binding site. Refers to sequences that have complementarity. MiRNA seeds can include positions 2-8 or 2-7 of mature miRNAs. In some embodiments, the miRNA seed can contain 7 nucleotides (eg, nucleotides 2-8 of mature miRNA), in which case the seed complementation site within the corresponding miRNA binding site is the miRNA. Adenine (A), who faces the 1st place in the ranking, is flanked. In some embodiments, the miRNA seed can contain 6 nucleotides (eg, nucleotides 2-7 of the mature miRNA), in which case the seed complementation site within the corresponding miRNA binding site is the miRNA. Adenine (A), who faces the 1st place in the ranking, is flanked. When referring to a miRNA binding site, the miRNA seed sequence has complementarity (eg, partial, substantial, or complete (or full) complementarity) with the seed sequence of the miRNA that binds to the miRNA binding site. Then it shall be understood.

修飾された：本明細書で使用される「修飾された」とは、本開示の分子状態または構造の変化を指す。分子は、化学的修飾、構造的修飾、および機能的修飾を含む多くの方式で修飾することができる。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡ分子は、例えば、天然リボヌクレオチドであるＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣに関する場合の通り、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾する。キャップ構造など、非カノニカルのヌクレオチドも、リボヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕの化学的構造とは異なるが、「修飾された」と考えられる。 Modified: As used herein, "modified" refers to a change in the molecular state or structure of the present disclosure. Molecules can be modified in many ways, including chemical, structural, and functional modifications. In one embodiment, the mRNA molecules of the present disclosure are modified by introduction of unnatural nucleosides and / or nucleotides, as is the case with, for example, the natural ribonucleotides A, U, G, and C. Non-canonical nucleotides, such as cap structures, are also considered "modified", although they differ from the chemical structures of the ribonucleotides A, C, G, and U.

ナノ粒子：本明細書で使用される「ナノ粒子」とは、約１０００ｎｍ未満のスケールで、任意の１つの構造特色を有する粒子であって、同じ材料のバルク試料と比較して、新規の特性を呈示する粒子を指す。規定では、ナノ粒子は、約５００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍのスケールで、任意の１つの構造特色を有する。規定ではまた、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０～約１２０ｎｍのスケールでも、任意の１つの構造特色を有する。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１～１０００ｎｍのオーダーの、１または複数の大きさを有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍのオーダーの、１または複数の大きさを有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約５０～２００ｎｍのオーダーの、１または複数の大きさを有する粒子である。球形のナノ粒子は、例えば、約５０～１００または７０～１２０ナノメートルの間の直径を有するであろう。ナノ粒子は、その輸送および特性に関し、単位として挙動することが最も多い。ナノ粒子を、対応するバルク材料から差別化する新規の特性は典型的に、１０００ｎｍを下回るサイズスケール、または約１００ｎｍのサイズで発達するが、ナノ粒子は、例えば、楕円状粒子、管状粒子などでは、より大きなサイズでもありうることが注目される。大半の分子のサイズは、上記の概形に当てはまるが、個々の分子は通例、ナノ粒子とは称さない。 Nanoparticles: As used herein, "nanoparticles" are particles with any one structural feature on a scale less than about 1000 nm and have novel properties compared to bulk samples of the same material. Refers to particles that present. By definition, nanoparticles have any one structural feature on a scale of less than about 500 nm, less than about 200 nm, or about 100 nm. By definition, nanoparticles also have any one structural feature, even on a scale of about 50 nm to about 500 nm, about 50 nm to about 200 nm, or about 70 to about 120 nm. In an exemplary embodiment, the nanoparticles are particles having one or more sizes on the order of about 1-1000 nm. In another exemplary embodiment, the nanoparticles are particles having one or more sizes on the order of about 10-500 nm. In another exemplary embodiment, the nanoparticles are particles having one or more sizes on the order of about 50-200 nm. Spherical nanoparticles will have a diameter between, for example, about 50-100 or 70-120 nanometers. Nanoparticles most often behave as a unit in terms of their transport and properties. New properties that differentiate nanoparticles from the corresponding bulk material typically develop on a size scale below 1000 nm, or on a size of about 100 nm, although nanoparticles are, for example, in elliptical particles, tubular particles, and the like. It is noted that it can also be a larger size. The size of most molecules fits the above outline, but individual molecules are not usually referred to as nanoparticles.

中和抗体（ＮＡＢ）：本明細書で使用される「中和抗体」または「ＮＡＢ」は、標的抗原（治療用タンパク質など）に結合し（すなわち、これと相互作用し）、抗原の少なくとも１つの機能的活性を阻害することが可能な抗体を指す。中和抗体の、その標的抗原への結合は、抗原の少なくとも１つの機能的活性の部分的阻害を引き起こす場合もあり、抗原の少なくとも１つの機能的活性の完全な阻害を引き起こす場合もある。ある特定の場合には、中和抗体の、その標的抗原への結合は、標的抗原の全ての機能的活性の、部分的阻害を引き起こす場合もあり、完全な阻害を引き起こす場合もある。 Neutralizing antibody (NAB): As used herein, a "neutralizing antibody" or "NAB" binds to (ie, interacts with) a target antigen (such as a Therapeutic protein) and is at least one of the antigens. Refers to an antibody capable of inhibiting one of the functional activities. Binding of a neutralizing antibody to its target antigen may cause partial inhibition of at least one functional activity of the antigen, or may cause complete inhibition of at least one functional activity of the antigen. In certain cases, the binding of a neutralizing antibody to its target antigen may cause partial inhibition or complete inhibition of all functional activities of the target antigen.

核酸：本明細書で使用される「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む、任意の化合物および／または物質を包摂する。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称することが多い。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド体、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、三重螺旋形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（β－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノＬＮＡ、および２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含むＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッド体を含むがこれらに限定されない。 Nucleic Acid: As used herein, the term "nucleic acid" is used in its broadest sense to include any compound and / or substance, including polymers of nucleotides. These polymers are often referred to as polynucleotides. Exemplary nucleic acids or polynucleotides of the present disclosure are ribonucleic acid (RNA), deoxyribonucleic acid (DNA), DNA-RNA hybrids, RNAi inducers, RNAi agents, siRNA, shRNA, miRNA, antisense RNA, ribozymes, catalysts. Sex DNA, RNA that induces triple spiral formation, Treose nucleic acid (TNA), Glycol nucleic acid (GNA), Peptide nucleic acid (PNA), Locked nucleic acid (LNA with β-D-ribo configuration), α-L-ribo configuration Α-LNA (diastereomeric of LNA), 2'-amino LNA with 2'-amino functionalization, and 2'-amino-α-LNA with 2'-amino functionality), or Including, but not limited to, these hybrids.

患者：本明細書で使用される「患者」とは、処置を求めるかまたは必要としうる被験体、処置を要請する被験体、処置を受けつつある被験体、処置を受ける被験体、または特定の疾患または状態について訓練された従事者によるケア下にある被験体を指す。特定の実施形態では、患者は、ヒト患者である。 Patient: As used herein, "patient" is a subject who seeks or may need treatment, a subject who requests treatment, a subject who is undergoing treatment, a subject who receives treatment, or a specific subject. Refers to a subject under care by a worker trained for the disease or condition. In certain embodiments, the patient is a human patient.

薬学的に許容される：本明細書では、「薬学的に許容される」という語句を、健全な医療判断の範囲内にあり、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適し、妥当な有益性／危険性比に見合う、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように援用する。 Pharmaceutically acceptable: In the present specification, the phrase "pharmaceutically acceptable" is within sound medical judgment and is excessively toxic, irritating, allergic response, or other problem or complication. Incorporates to refer to a compound, material, composition, and / or dosage form that is suitable for use in contact with human and animal tissues and is commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書で記載される化合物以外の（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることが可能なビヒクル）で、患者において、実質的に非毒性および非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。賦形剤は、例えば、抗付着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、薄膜形成剤またはコーティング、香味剤、芳香剤、流動促進剤（流動増強剤）、滑沢剤、保存剤、印字インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和水を含みうる。例示的な賦形剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、結晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファデンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、滑石、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールを含むがこれらに限定されない。 Pharmaceutically Acceptable Excipients: The phrase "pharmaceutically acceptable excipients" as used herein refers to compounds other than those described herein (eg, suspending active compounds). Or a vehicle that can be dissolved) and refers to any ingredient that has properties that are substantially non-toxic and non-inflammatory in the patient. Excipients are, for example, anti-adhesives, antioxidants, binders, coatings, compression aids, disintegrants, dyes (colorants), softeners, emulsifiers, fillers (diluents), thin film-forming agents or coatings. , Flavors, fragrances, flow enhancers (fluid enhancers), lubricants, preservatives, printing inks, adsorbents, suspending or dispersants, sweeteners, and hydrated waters. Exemplary excipients are butylated hydroxytoluene (BHT), calcium carbonate, calcium phosphate (bibasic), calcium stearate, croscarmellose, crosslinked polyvinylpyrrolidone, citric acid, crospovidone, cysteine, ethylcellulose, gelatin, hydroxy. Propyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, lactose, magnesium stearate, martitol, mannitol, methionine, methyl cellulose, methyl paraben, crystalline cellulose, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, povidone, alpha starch, propyl paraben, retinyl palmitate, shelac, silicon dioxide , Sodium carboxymethyl cellulose, sodium citrate, sodium starch glycolate, sorbitol, starch (corn), stearic acid, sucrose, talc, titanium dioxide, vitamin A, vitamin E, vitamin C, and xylitol.

薬学的に許容される塩：本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」とは、開示される化合物の誘導体であって、親化合物を、既存の酸部分または塩基部分を、その塩形態へと転換することにより（例えば、遊離塩基基を、適する有機酸と反応させることにより）修飾した誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例は、アミンなど、塩基性残基の、鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸など、酸性残基の、アルカリ塩または有機塩などを含むがこれらに限定されない。代表的な酸添加塩は、酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ， ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ， ｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのほか、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオンを含む。本開示の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成された親化合物の、従来の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容される塩を、従来の化学的方法により、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸形態または遊離塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中の、化学量論量の、適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができ、一般に、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。適する塩のリストは、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５年、１４１８頁、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｐ．Ｈ． ＳｔａｈｌおよびＣ．Ｇ． Ｗｅｒｍｕｔｈ（編）、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００８年；ならびにＢｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６巻、１～１９頁（１９７７年）において見出される。 Pharmaceutically Acceptable Salts: As used herein, a "pharmaceutically acceptable salt" is a derivative of a disclosed compound, which is a parent compound, an existing acid moiety or a base moiety. Refers to a derivative modified by conversion to its salt form (eg, by reacting a free base group with a suitable organic acid). Examples of pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, mineral or organic salts of basic residues such as amines; alkaline salts or organic salts of acidic residues such as carboxylic acids. .. Typical acid-added salts are acetate, acetic acid, adipate, alginate, ascorbate, asparagate, benzenesulfonate, bendene sulphonic acid, benzoate, and bicarbonate. Salt, borate, butyrate, cypress, camphor sulfonate, citrate, cyclopentanepropionate, digluconate, dodecyl sulfate, ethanesulfonate, fumarate, glucoheptonate, glycerophosphate , Hemisulfate, heptaneate, hexaneate, hydrobromide, hydrochloride, hydroiodide, 2-hydroxyethanesulfonate, lactobionate, lactate, laurate, lauryl sulfate , Appleate, maleate, malonate, methanesulfonate, 2-naphthalenesulfonate, nicotinate, nitrate, oleate, oxalate, palmitate, pamoate, pectinate , Persulfate, 3-phenylpropionate, phosphate, picrate, pivalate, propionate, stearate, succinate, sulfate, tartrate, thiocyanate, toluenesulfonate , Undecanoate, valerate, etc. Typical alkali salts or alkaline earth metal salts include sodium, lithium, potassium, calcium, magnesium, etc., as well as ammonium, tetramethylammonium, tetraethylammonium, methylamine, dimethylamine salt, trimethylamine, triethylamine, ethylamine, etc. Includes, but is not limited to, non-toxic ammonium, quaternary ammonium, and amine cations. The pharmaceutically acceptable salts of the present disclosure include, for example, conventional non-toxic salts of parent compounds formed from non-toxic inorganic or organic acids. The pharmaceutically acceptable salts of the present disclosure can be synthesized from a parent compound containing a basic or acidic moiety by conventional chemical methods. In general, such salts allow the free acid or free base form of these compounds to react with a stoichiometric amount of the appropriate base or acid in water or in an organic solvent, or in a mixture of the two. In general, a non-aqueous medium such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol, or acetonitrile is preferred. A list of suitable salts is described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., Each of which is incorporated herein by reference in its entirety. , 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. et al. H. Stahl and C.I. G. Wermus (eds.), Wiley-VCH, 2008; and Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, Vol. 66, pp. 1-19 (1977).

ポリペプチド：本明細書で使用される「ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」という用語は、典型的に、天然で（例えば、単離または精製された）産生される場合もあり、合成により産生することもできるペプチド結合により接続された、アミノ酸残基のポリマーを指す。 Polypeptides: The terms "polypeptide" or "polypeptide of interest" as used herein may typically be produced naturally (eg, isolated or purified) and by synthesis. Refers to a polymer of amino acid residues linked by peptide bonds that can also be produced.

被験体：本明細書で使用される「被験体」という用語は、本開示に従う組成物を、例えば、実験、診断、予防、および／または治療の目的で投与しうる、任意の生物を指す。典型的な被験体は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物、およびヒトなどの哺乳動物）および／または植物を含む。一部の実施形態では、被験体は、患者でありうる。 Subject: As used herein, the term "subject" refers to any organism to which the composition according to the present disclosure can be administered, for example, for experimental, diagnostic, prophylactic, and / or therapeutic purposes. Typical subjects include animals (eg, mice, rats, rabbits, non-human primates, and mammals such as humans) and / or plants. In some embodiments, the subject can be a patient.

実質的に：本明細書で使用される「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の、全てまたはほぼ全ての広がりまたは程度を呈示する定性的条件を指す。生物学的技術分野の当業者は、生物学的現象および化学的現象が、仮にそうなるとしても、完結に至り、かつ／もしくは完全性へと進行するか、または絶対的な結果を達成もしくは回避することはまれであることを理解するであろう。したがって、本明細書では、「実質的に」という用語を、多くの生物学的現象および化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如を捕捉するのに使用する。 Substantially: As used herein, the term "substantially" refers to a qualitative condition that exhibits all or almost all extent or extent of a feature or property of interest. Those skilled in the art of biological technology will either reach completion and / or progress to completeness, or achieve or avoid absolute consequences, even if biological and chemical phenomena do so. You will understand that it is rare to do. Therefore, the term "substantially" is used herein to capture the potential lack of integrity inherent in many biological and chemical phenomena.

～を患うこと：疾患、障害、および／または状態「を患う」個体は、疾患、障害、および／または状態の１または複数の症状を伴うか、またはこれらを提示すると診断されている。 Affected by: A disease, disorder, and / or condition An individual "affected" is diagnosed with or presenting one or more symptoms of the disease, disorder, and / or condition.

ターゲティング部分：本明細書で使用される「ターゲティング部分」とは、ナノ粒子を、特定の細胞型、組織型、および／または器官型へとターゲティングしうる、化合物または薬剤である。 Targeting moiety: As used herein, a "targeting moiety" is a compound or agent capable of targeting nanoparticles to a particular cell, histology, and / or organ type.

治療剤：「治療剤」という用語は、被験体へと投与されると、治療的、診断的、および／もしくは予防的効果を及ぼし、かつ／または所望の生物学的効果および／もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。 Therapeutic agent: The term "therapeutic agent" has therapeutic, diagnostic, and / or prophylactic effects and / or desired biological and / or pharmacological effects when administered to a subject. Refers to any drug that induces an effect.

トランスフェクション：本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、分子種（例えば、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド）を、細胞へと導入する方法を指す。 Transfection: As used herein, the term "transfection" refers to a method of introducing a molecular species (eg, a polynucleotide such as mRNA) into a cell.

～を処置すること：本明細書で使用される「～を処置すること」という用語は、特定の感染、疾患、障害、および／または状態を、部分的もしくは完全に緩和し、軽快させ、改善し、和らげ、これらの発症を遅延させ、これらの進行を阻害し、これらの重症度を低減し、かつ／またはこれらの１もしくは複数の症状もしくは特色の発生率を低減することを指す。例えば、がん「を処置すること」とは、腫瘍の生存、増殖、および／または拡大を阻害することを指す場合がある。処置は、疾患、障害、および／または状態と関連する病態を発症する危険性を減少させる目的で、疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を呈示しない被験体、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の早期の徴候だけを呈示する被験体へと投与することができる。 Treating: The term "treating" as used herein partially or completely alleviates, relieves, or improves a particular infection, disease, disorder, and / or condition. It refers to relieving, delaying the onset of these, inhibiting their progression, reducing their severity, and / or reducing the incidence of one or more of these symptoms or features. For example, "treating" a cancer may refer to inhibiting the survival, growth, and / or spread of the tumor. Treatment is for subjects who show no signs of disease, disorder, and / or condition, and / or disease, disorder, and / or disease, disorder, and / or disease, disorder, with the aim of reducing the risk of developing a condition associated with the disease, disorder, and / or condition. / Or can be administered to a subject who presents only early signs of the condition.

～を防止すること：本明細書で使用される「～を防止すること」という用語は、特定の感染、疾患、障害、および／または状態の、１または複数の症状または特色の発症を、部分的または完全に阻害することを指す。 Preventing: The term "preventing" as used herein refers to the onset of one or more symptoms or features of a particular infection, disease, disorder, and / or condition. Refers to targeting or completely inhibiting.

腫瘍：本明細書で使用される「腫瘍」とは、良性であれ、悪性であれ、組織の異常な増殖である。 Tumor: As used herein, a "tumor" is an abnormal growth of tissue, benign or malignant.

非修飾：本明細書で使用される「非修飾」とは、任意の方式で変化させる前の、任意の物質、化合物、または分子を指す。非修飾とは、生体分子の野生型またはナイーブ形態を指す場合もあるが、常にそうであるわけではない。分子は、各修飾分子を、後続の修飾のための、「非修飾」の出発分子として用いうる、一連の修飾を経る場合もある。 Unmodified: As used herein, "unmodified" refers to any substance, compound, or molecule prior to modification in any manner. Unmodified may refer to the wild-type or naive form of a biomolecule, but this is not always the case. The molecule may also undergo a series of modifications in which each modified molecule can be used as an "unmodified" starting molecule for subsequent modifications.

同等物および範囲
当業者は、規定の実験だけを使用して、本明細書で記載される本開示に従う具体的な実施形態の多くの同等物を認識または確認することが可能であろう。本開示の範囲は、以下の記載に限定されることを意図するものではなく、付属の特許請求の範囲で明示される通りである。 Equivalents and Scope One of ordinary skill in the art will be able to recognize or confirm many equivalents of the specific embodiments according to the present disclosure described herein using only specified experiments. The scope of the present disclosure is not intended to be limited to the following description, but is as specified in the appended claims.

特許請求の範囲では、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」などの冠詞は、反対のことが指し示されるか、またはそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて、１つまたは１つを超えるを意味する場合がある。反対のことが指し示されるか、またはそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて、群の１または複数のメンバーの間の「または」を含む、特許請求の範囲または記載は、群のメンバーのうちの１つ、１つを超えるメンバー、または全てが、所与の生成物または過程において存在するか、これにおいて援用されるか、または他の形でこれに関与性であれば満たされると考えられる。本開示は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の生成物または過程において存在するか、これにおいて援用されるか、または他の形でこれに関与性である実施形態を含む。本開示は、群のメンバーのうちの１つを超えるメンバーまたは全てが、所与の生成物または過程において存在するか、これにおいて援用されるか、または他の形でこれに関与性である実施形態を含む。 In the claims, articles such as "is (a)", "is (an)", and "that" are, unless the context makes it clear that the opposite is pointed to or not. May mean one or more. Claims or statements, including "or" between one or more members of a group, are among the members of the group, unless the opposite is pointed to or otherwise apparent from the context. One, more than one member, or all of them, is considered to be satisfied if they are present in, incorporated into, or otherwise involved in a given product or process. .. The present disclosure includes embodiments in which exactly one member of the group is present, incorporated in, or otherwise involved in a given product or process. The present disclosure is an implementation in which more than one member or all of the members of the group are present, incorporated or otherwise involved in a given product or process. Including morphology.

「～を含むこと」という用語は、オープンであることを意図し、さらなる要素またはステップの包含を許容するが要請はしない。したがって、本明細書で、「～を含むこと」という用語を使用する場合、「～からなること」という用語もまた、包摂され、開示される。 The term "contains" is intended to be open and allows, but does not require, inclusion of additional elements or steps. Therefore, when the term "including" is used herein, the term "consisting of" is also included and disclosed.

範囲を与える場合、端点を含む。さらに、そうでないことが指し示されるか、またはそうでないことが文脈および当業者の理解から明らかでない限りにおいて、範囲として表される値は、本開示の異なる実施形態で言明される範囲内の、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、範囲の下限の単位の１０分の１までの、任意の具体的な値または部分範囲を仮定しうることを理解されたい。 When giving a range, include the endpoints. Further, unless otherwise indicated or otherwise apparent from the context and understanding of one of ordinary skill in the art, the values expressed as ranges are within the scope stated in the different embodiments of the present disclosure. It should be understood that any specific value or subrange can be assumed up to one tenth of the lower bound unit of the range, unless the context explicitly indicates otherwise.

全ての引用される情報源、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベース項目、および本明細書で引用される技術は、引用時に明示的に言明されない場合であってもなお、参照により本出願へと組み込まれる。引用される情報源の言明と本出願の言明とで齟齬が生じる場合は、本出願における言明を是とする。 All cited sources, such as references, publications, databases, database items, and techniques cited herein, are applied by reference, even if not explicitly stated at the time of citation. Is incorporated into. If there is a discrepancy between the statement of the source cited and the statement of this application, the statement in this application shall be correct.

本開示は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかし、これらの実施例は、本開示の範囲を限定するとはみなされないものとする。本明細書で記載される実施例および実施形態は、例示だけを目的とするものであり、当業者には、それに照らした多様な改変または変化が示唆され、本出願の精神および権限内、ならびに付属の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。 The present disclosure will be better understood by reference to the following examples. However, these examples are not considered to limit the scope of this disclosure. The examples and embodiments described herein are for purposes of illustration only, and those skilled in the art are suggested to make various modifications or changes in light of them, within the spirit and authority of the present application, as well as. It is understood that it is included within the scope of the attached claims.

（実施例１）
ｈＥＰＯをコードする修飾ｍＲＮＡは、非ヒト霊長動物において、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発する
本実施例では、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするが、ｍｉＲ結合部位を欠く修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を、４週間の研究において、カニクイザルへと投与して、動物におけるｈＥＰＯの発現について検討した。 (Example 1)
The modified mRNA encoding hEPO induces an anti-drug antibody (ADA) response in non-human primate animals. In this example, the modified mRNA (m mRNA) encoding human erythropoetin (hEPO) but lacking the miR binding site is used. In a 4-week study, the expression of hEPO in animals was investigated when administered to cynomolgus monkeys.

ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡを、５０％のＭＣ３、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含み、Ｎ：Ｐを約５．５とする（値は、モル％に基づく）、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した。ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ １である５’キャップ構造（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含有し、５－メチルシトシンおよび１－メチルシュードウリジンで全修飾され、１４０ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。ｍｍＲＮＡ構築物は、ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入の存在も欠いた。ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入も伴わない、このｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号７に示す（ポリＡテールは示さない）。 The mmRNA encoding hEPO contains 50% MC3, 10% DSPC, 38.5% cholesterol, 1.5% PEG-DMG, and N: P is about 5.5 (value is molar). %), Formulated into MC3 Lipid Nanoparticles (LNP). The mmRNA construct contains a 5'cap structure (7 mG (5') ppp (5') NlpNp) that is Cap 1, fully modified with 5-methylcytosine and 1-methylseudouridine, and has a 140 nucleotide poly A tail. Including. The mmRNA construct lacked the presence of any insertion of the miR binding site. The nucleotide sequence of this hEPO coding construct, without any insertion of the miR binding site, is shown in SEQ ID NO: 7 (poly A tail not shown).

研究は、７つの動物群を含んだ。陰性対照群は、ＰＢＳで処置した。３つの処置群を、投与１回当たり０．０２ｍｇ／ｋｇ、投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇ、または投与１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇの、３つの異なる用量のｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡ ＬＮＰのうちの１つで処置した。低用量を、ヒトＥＰＯの治療有効曝露量の少なくとも２倍を達成するように選択する一方で、高用量は、治療有効用量の、少なくとも１０倍のｈＥＰＯ曝露レベルを達成するように選択した。陽性対照群は、用量を６０００Ｕ／ｋｇとする組換えｈＥＰＯタンパク質で処置した。他の２つの対照群は、非関与性のｍｍＲＮＡ（非翻訳ｍＲＮＡ形態）を含有するＬＮＰ、またはＬＮＰ単独で処置した。投与スケジュールは、ＩＶ注入による、毎週１回、連続４週間（のべ５回にわたる投与）であった。注入は、ポンプを介して６０分間（ＩＶ）にわたった。４週間の投与期間に、４週間の回収査定期間（対照および高用量だけ）を後続させた。 The study included seven fauna. Negative controls were treated with PBS. The three treatment groups were divided into three different doses of hEPO-coded mmRNA LNP: 0.02 mg / kg per dose, 0.1 mg / kg per dose, or 0.2 mg / kg per dose. Treated with one. Low doses were selected to achieve at least twice the therapeutically effective exposure of human EPO, while high doses were selected to achieve at least 10 times the therapeutically effective dose of hEPO exposure. The positive control group was treated with recombinant hEPO protein at a dose of 6000 U / kg. The other two controls were treated with LNPs containing non-involved mRNA (untranslated mRNA form), or LNP alone. The administration schedule was once a week by IV infusion for 4 consecutive weeks (a total of 5 administrations). The infusion spanned 60 minutes (IV) via a pump. A 4-week dosing period was followed by a 4-week recovery assessment period (control and high dose only).

カニクイザルにおけるｈＥＰＯの発現レベルは、処置日の各々（１、８、１５、２２、および２９日目）の、注入の６時間後において、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果を、図１に示す。結果は、低用量のｍｍＲＮＡ（投与１回当たり０．０２ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルが、治療有効レベルのｈＥＰＯを呈示し、これが、４週間にわたる研究を通して、ほぼ同じレベルで維持されたことを裏付ける。これに対し、中用量および高用量のｍｍＲＮＡ（投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇおよび投与１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルでは、ＥＰＯレベルは、研究の８～１５日目の間から低下し、研究の持続期間にわたり、低レベルを維持した。網状赤血球数は、中用量および高用量のｍｍＲＮＡ（投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇおよび投与１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物における、網状赤血球減少症の遷延を明らかにした。さらに、組織学的解析も、中用量または高用量のｍｍＲＮＡで処置された動物の骨髄中の造血の減少を明らかにした。高用量のｍｍＲＮＡで処置された動物における、網状赤血球減少症および造血の減少は、動物において、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答が時間経過にわたり発達していることを示唆した。 Expression levels of hEPO in cynomolgus monkeys were measured by ELISA 6 hours after injection on each of the treatment days (days 1, 8, 15, 22, and 29). The results are shown in FIG. The results showed that cynomolgus monkeys treated with low doses of mMRNA (0.02 mg / kg per dose) exhibited therapeutically effective levels of hEPO, which were maintained at about the same level throughout the 4-week study. To support. In contrast, in cynomolgus monkeys treated with medium and high doses of mmRNA (0.1 mg / kg per dose and 0.2 mg / kg per dose), EPO levels were on days 8-15 of the study. It declined from time to time and remained at low levels for the duration of the study. Reticulocyte count revealed a protracted reticulocytopenia in animals treated with medium and high dose mmRNA (0.1 mg / kg per dose and 0.2 mg / kg per dose). .. In addition, histological analysis revealed a reduction in hematopoiesis in the bone marrow of animals treated with medium or high dose mmarrow. Reticulocytopenia and reduced hematopoiesis in animals treated with high doses of mmRNA suggested that anti-drug antibody (ADA) responses developed over time in animals.

ヒトＥＰＯに対するＡＤＡ応答が存在したのかどうかを決定するために、動物に由来する血清に対して、ＥＬＩＳＡを実施して、カニクイザル抗ヒトＥＰＯ抗体の存在を検出した。血液を、大腿部静脈穿刺により回収し、血清を、室温で回収し、少なくとも３０分間にわたり凝固させた後で、低温（４℃）遠心分離機内、２７００ｒｐｍで、１０分間にわたり遠心分離にかけた。血清中で抗ヒトＥＰＯ ＩｇＧを検出するために、標準的なＥＬＩＳＡ法を使用した。試料は、二連で解析した。 To determine if there was an ADA response to human EPO, ELISA was performed on animal-derived sera to detect the presence of cynomolgus monkey anti-human EPO antibody. Blood was collected by venipuncture of the thigh, serum was collected at room temperature, coagulated for at least 30 minutes, and then centrifuged in a low temperature (4 ° C.) centrifuge at 2700 rpm for 10 minutes. A standard ELISA method was used to detect anti-human EPO IgG in serum. The sample was analyzed in duplicate.

一連の陰性対照結果を使用して、それを上回るレベルが、アッセイにおける「陽性」結果を構成する、閾値レベルを確立した。陰性対照試料についての代表的な定量的ＥＬＩＳＡ結果であって、閾値レベルを設定するのに使用されたＥＬＩＳＡ結果を、下記の表３に示す。

Figure 0006990176000009
A series of negative control results was used to establish threshold levels above which would constitute a "positive" result in the assay. Typical quantitative ELISA results for negative control samples, the ELISA results used to set the threshold level, are shown in Table 3 below.
Figure 0006990176000009

研究において使用した、７つの異なる動物群についてのＥＬＩＳＡ結果を、下記の表４に示す。

Figure 0006990176000010
The ELISA results for the seven different fauna used in the study are shown in Table 4 below.
Figure 0006990176000010

結果は、最高用量のｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡ（投与１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルの全て、および中レベルの用量（投与１回当たり０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルのうちの５０％が、ヒトＥＰＯに対するＡＤＡ応答を呈示したことを裏付ける。これは、予測外の知見であり、このために、本発明者らは、非ヒト霊長動物において、コードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答を低減しようと試みるのに、さらなるｍｍＲＮＡ構築物をデザインし、これらについて調べた。これらの研究の結果を、実施例２に記載する。 The results show that all cynomolgus monkeys treated with the highest dose of hEPO-coded mmRNA (0.2 mg / kg per dose) and cynomolgus monkeys treated with the medium level dose (0.1 mg / kg per dose). This confirms that 50% of them presented an ADA response to human EPO. This is an unexpected finding, for which we have designed additional mmRNA constructs to attempt to reduce the ADA response to the encoded protein in non-human primates, and for these. Examined. The results of these studies are described in Example 2.

（実施例２）
ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の、ｍｍＲＮＡへの組込みは、コードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答を阻害する
本実施例では、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を、構築物の３’ＵＴＲへと組み込む、ヒトＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物を調製した。ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ １である５’キャップ（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含み、５－メチルシトシンおよび１－メチルシュードウリジンで全修飾され、およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。構築物の概略図を、図２に示す。このヒトＥＰＯコードｍｍＲＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号１（ポリＡテールを伴わない）に示す。ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含む３’ＵＴＲのヌクレオチド配列を、配列番号２に示す。ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位のヌクレオチド配列を、配列番号３に示す。ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の付加以外では、ｍｍＲＮＡ構築物およびＬＮＰ調製物は、実施例１のものと同じであった。 (Example 2)
Integration of the miR-142-3p binding site into the mmRNA inhibits the ADA response to the encoded protein In this example, the miR-142-3p binding site is integrated into the 3'UTR of the construct, human EPO. A coding mmRNA construct was prepared. The mmRNA construct contains a 5'cap (7 mG (5') ppp (5') NlmpNp) which is Cap 1 and is fully modified with 5-methylcytosine and 1-methylseudouridine to provide a poly A tail of approximately 140 nucleotides. Inclusive. A schematic diagram of the structure is shown in FIG. The nucleotide sequence of this human EPO code mmRNA is shown in SEQ ID NO: 1 (without poly A tail). The nucleotide sequence of 3'UTR containing the miR-142-3p binding site is shown in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence of the miR-142-3p binding site is shown in SEQ ID NO: 3. Except for the addition of the miR-142-3p binding site, the mmRNA construct and LNP preparation were the same as in Example 1.

カニクイザルを、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を伴うｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡをＬＮＰ中に含む構築物で、用量を１日当たり０．２ｍｇ／ｋｇとして処置した。この用量は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を欠く構築物を使用して、ｈＥＰＯに対するＡＤＡ応答を誘発することが既に示されていた（実施例１を参照されたい）。実施例１で記載した通り、動物を、１、８、１５、２２、および２９日目において処置する、４週間にわたる研究を行った。静脈内注入（６０分間）は、上腕静脈または伏在静脈への、一時的なカテーテル留置を介して施した。 Cynomolgus monkeys were treated with a construct containing hEPO-coded mmRNA with a miR-142-3p binding site in LNP at a dose of 0.2 mg / kg per day. This dose has already been shown to elicit an ADA response to hEPO using constructs lacking the miR-142-3p binding site (see Example 1). As described in Example 1, animals were treated on days 1, 8, 15, 22, and 29 for a 4-week study. Intravenous infusion (60 minutes) was performed via temporary catheter placement in the brachial or saphenous vein.

ｈＥＰＯに対するＡＤＡ応答が、動物において誘発されたのかどうかを検討するために、実施例１で記載した通りに、動物に由来する血清に対して、ＥＬＩＳＡを実施して、カニクイザル抗ヒトＥＰＯ抗体の存在を検出した。 To determine if the ADA response to hEPO was induced in animals, ELISA was performed on animal-derived sera as described in Example 1 to determine the presence of cynomolgus monkey anti-human EPO antibody. Was detected.

用量を０．２ｍｇ／ｋｇとする処置についての、５つの時点の各々における、４匹の動物（１３０１、１３０２、１３０３、および１３０４）の結果を、下記の表５に示す。「陰性」または「陽性」としての試料の状態は、実施例１で記載した通り、陰性対照試料についての結果に基づき設定された閾値と比べて決定した。

Figure 0006990176000011
The results of 4 animals (1301, 1302, 1303, and 1304) at each of the 5 time points for the treatment at a dose of 0.2 mg / kg are shown in Table 5 below. The state of the sample as "negative" or "positive" was determined as compared to the threshold set based on the results for the negative control sample, as described in Example 1.
Figure 0006990176000011

結果は、処置されたサル（１３０３）４匹のうちの１匹だけが、ｈＥＰＯに対するＡＤＡ応答を呈示することを示した。したがって、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を、ｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物へと組み込んだところ、高用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）の構築物で処置された動物のうちの２５％だけが、コードされるタンパク質に対するＡＤＡを呈示した（表５）のに対し、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を欠く構築物を使用する、同じ用量による処置は、１００％の動物が、コードされるタンパク質に対するＡＤＡを呈示する結果をもたらした（表４）。 The results showed that only one of the four treated monkeys (1303) exhibited an ADA response to hEPO. Therefore, when the miR-142-3p binding site was incorporated into the hEPO-encoded mmRNA construct, only 25% of animals treated with the high dose (0.2 mg / kg) construct were for the encoded protein. Treatment with the same dose using a construct lacking the miR-142-3p binding site, whereas ADA was presented (Table 5), resulted in 100% of animals presenting ADA for the encoded protein. (Table 4).

図３は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を欠く０．２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ構築物で処置されたサルについてのＥＬＩＳＡ結果と、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含有する０．２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ構築物で処置されたサルについてのＥＬＩＳＡ結果との比較を示し、動物における抗ｈＥＰＯ抗体のレベルを、時間経過にわたり示す。抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を呈示する動物が指し示される。結果は、ｍｉＲ結合部位を欠く構築物で処置された動物では、ｍｉＲ結合部位を含有する構築物と比較して、著明に大きなＡＤＡ応答が観察されたことを明確に裏付ける。 FIG. 3 shows ELISA results for monkeys treated with a 0.2 mg / kg mRNA construct lacking a miR-142-3p binding site and a 0.2 mg / kg mRNA construct containing a miR-142-3p binding site. Comparison with the ELISA results for monkeys treated with is shown and the levels of anti-hEPO antibody in animals are shown over time. Animals exhibiting an anti-drug antibody (ADA) response are pointed to. The results clearly support that significantly greater ADA responses were observed in animals treated with constructs lacking the miR binding site compared to constructs containing the miR binding site.

カニクイザルにおける追跡研究でも、上記で記載したパイロット研究と全く同様の結果が観察された。ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を欠くｈＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物の投与は、１００％の動物が、コードされるタンパク質に対するＡＤＡを呈示する結果をもたらしたが、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の、構築物への組込みは、５０％の動物だけが、コードされるタンパク質に対するＡＤＡを呈示する結果をもたらした。３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の、構築物への組込みが、効果の増強をもたらさなかったことから、単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位が、コードされるタンパク質に対するＡＤＡの低減に十分であることが裏付けられる。 Follow-up studies in cynomolgus monkeys showed exactly the same results as the pilot studies described above. Administration of the hEPO-encoded mmRNA construct lacking the miR-142-3p binding site resulted in 100% of animals exhibiting ADA for the encoded protein, but the miR-142-3p binding site to the construct. Integration resulted in only 50% of animals presenting ADA for the encoded protein. A single miR-142-3p binding site is sufficient to reduce ADA to the encoded protein, as integration of the three miR-142-3p binding sites into the construct did not result in enhanced efficacy. It is confirmed that there is.

したがって、これらの結果は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の、ｍｍＲＮＡ構築物への組込みが、コードされるタンパク質に対するＡＤＡ応答の低減または消失に有効であることを裏付ける。 Therefore, these results support that integration of the miR-142-3p binding site into the mmRNA construct is effective in reducing or eliminating the ADA response to the encoded protein.

（実施例３）
ｍｉＲ－１２６結合部位またはｍｉＲ－１４２結合部位の、ｍｍＲＮＡへの組込みは、Ｂ細胞の活性化およびサイトカインの発現を阻害する
本実施例では、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位およびｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲへと組み込む、ヒトＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物を調製した。ｍｍＲＮＡ構築物を、マウスへと投与して、ｍｉＲ結合部位を組み込むことの、マウスにおける多様な免疫パラメータに対する効果を検討した。 (Example 3)
Integration of the miR-126 binding site or miR-142 binding site into mmRNA inhibits B cell activation and cytokine expression In this example, the miR-142-3p binding site or miR-126-3p binding site. A human EPO-coded mRNA construct was prepared in which the site, or both the miR-142-3p binding site and the miR-126-3p binding site, were incorporated into the 3'UTR of the construct. The effect of administering the mmRNA construct to mice and incorporating the miR binding site on various immune parameters in mice was investigated.

ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ １である５’キャップ構造（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含有し、５－メチルシトシンおよび１－メチルシュードウリジンで全修飾され、１４０ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。対照ｍｍＲＮＡ構築物は、ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入の存在も欠いた。ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入も伴わない、この対照ｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号７に示す（ポリＡテールは示さない）。ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を挿入したｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号１に示す（ポリＡテールは示さない）。ｍｉＲ－１２６－３ｐ部位を挿入したｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号２８に示す（ポリＡテールは示さない）。ｍｉＲ－１４２－３ｐ部位、およびｍｉＲ－１２６－３ｐ部位を挿入したｈＥＰＯコード構築物のヌクレオチド配列を、配列番号２９に示す（ポリＡテールは示さない）。例示的なｍｍＲＮＡ構築物の概略図を、図２に示す。ｈＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡ構築物を、５０％のＭＣ３、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含み、Ｎ：Ｐを約５．５とする（値は、モル％に基づく）、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した。 The mmRNA construct contains a 5'cap structure (7 mG (5') ppp (5') NlpNp) that is Cap 1, fully modified with 5-methylcytosine and 1-methylseudouridine, and has a 140 nucleotide poly A tail. Including. The control mmRNA construct lacked the presence of any insertion of the miR binding site. The nucleotide sequence of this control hEPO coding construct, without any insertion of the miR binding site, is shown in SEQ ID NO: 7 (poly A tail not shown). The nucleotide sequence of the hEPO code construct with the miR-142-3p binding site inserted is shown in SEQ ID NO: 1 (poly A tail not shown). The nucleotide sequence of the hEPO code construct with the miR-126-3p site inserted is shown in SEQ ID NO: 28 (poly A tail not shown). The nucleotide sequence of the hEPO code construct inserted with the miR-142-3p site and the miR-126-3p site is shown in SEQ ID NO: 29 (poly A tail not shown). A schematic diagram of an exemplary mMn construct is shown in FIG. The mRNA construct encoding hEPO contains 50% MC3, 10% DSPC, 38.5% cholesterol, 1.5% PEG-DMG and has an N: P of about 5.5 (values are: Based on mol%), it was formulated into MC3 lipid nanoparticles (LNP).

初期研究では、マウス３０匹ずつの群を、以下の処置群：（ｉ）いずれのｍｉＲ結合部位も伴わないｈＥｐｏ構築物；（ｉｉ）ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を伴うｈＥｐｏ構築物；（ｉｉｉ）ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位を伴うｈＥｐｏ構築物；および（ｉｖ）ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位およびｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位を伴うｈＥｐｏ構築物へと割り当てた。ｍｍＲＮＡを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへと、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内投与した。投与レジメンは、１、８、１５、２２、２９、および３６日目であった。各処置群について、群１つ当たり５匹ずつのマウスに、各投与日に、合計６回の投与を実施した。各群内でさらに２５匹のマウスを、５匹ずつのマウスに、８、１５、２２、２９、および３６日目の投与の各々において１回ずつで、マウス１匹当たり合計１回ずつ投与するように、５つのサブセットに分けた。 In the initial study, a group of 30 mice was subjected to the following treatment group: (i) hEpo construct without any miR binding site; (ii) hEpo construct with miR-142-3p binding site; (iii) miR. It was assigned to an hEpo construct with a -126-3p binding site; and an hEpo construct with an (iv) miR-142-3p binding site and a miR-126-3p binding site. The mRNA was intravenously administered to C57Bl / 6 mice at a dose of 0.05 mg / kg. The dosing regimen was days 1, 8, 15, 22, 29, and 36. For each treatment group, 5 mice per group were administered a total of 6 times on each administration day. An additional 25 mice in each group are administered to 5 mice once for each of the 8, 15, 22, 29, and 36 day doses, for a total of 1 per mouse. As described above, it was divided into five subsets.

処置後、マウスを、（ｉ）ｈＥｐｏ（ｎｇ／ｍｌ単位の）を測定することによる、ｍｍＲＮＡ構築物からのタンパク質発現、（ｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、Ｂ細胞の頻度、および（ｉｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞中の、活性化ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、活性化Ｂ細胞の頻度について検討した。これらの３つのリードアウトの結果を、それぞれ、図４Ａ、Ｂ、およびＣに示す。この初期研究からの結果は、単独または組合せの、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位またはｍｉＲ－１２６結合部位の、ｍｍＲＮＡ構築物への組入れにより、タンパク質の発現に感知可能な差違は見られなかったが、単独で、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位の組入れにより、わずかであるが、統計学的に有意な、Ｂ細胞の活性化の減少が観察されることを裏付けた。 After treatment, mice were subjected to (i) protein expression from mmRNA constructs by measuring hEpo (in ng / ml units), (ii) frequency of B cells by measuring spleen CD19 + cell%, and (i). iii) The frequency of activated B cells by measuring activated CD19 + cell% in spleen CD19 + cells was investigated. The results of these three lead-outs are shown in FIGS. 4A, B, and C, respectively. Results from this initial study showed no discernible differences in protein expression by incorporation of the miR-142-3p or miR-126 binding sites, either alone or in combination, into the mmRNA construct. A slight but statistically significant reduction in B cell activation is observed with the incorporation of the miR-126-3p binding site alone or in combination with the miR-142-3p binding site. Was confirmed.

この初期観察についてさらに研究するために、ｍｍＲＮＡ構築物について、高用量（最高の感度をもたらすように）で、かつ、群１つ当たりのマウスの数を増大させて（統計学的信頼性を増大させるように）調べるように、第２のセットの実験を行った。投与量レジメンは、１および８日目であった。群１つ当たり１２匹ずつのマウスに、１日目に、０．２ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの、上記で記載した４つの異なるｍｍＲＮＡ構築物（ｈＥｐｏ；ｈＥｐｏ＋ｍｉＲ－１４２－３ｐ；ｈＥＰＯ＋ｍｉＲ－１２６－３ｐ；またはｈＥｐｏ＋ｍｉＲ－１４２－３ｐ／ｍｉＲ－１２６－３ｐ）であって、ＭＣ３ ＬＮＰ中で製剤化したｍｍＲＮＡ構築物のうちの１つを、静脈内投与した。１日目における投与の６時間後に、Ｅｐｏ ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベルの発現についての解析のために、血清を回収した。また、１日目における投与の６時間後に、Ｂ細胞の解析のために、マウスのうちの６匹から、脾臓も採取した。８日目に、残りの群１つ当たり６匹ずつのマウスに再度投与した後、さらなる解析のために、投与の６時間後に、血清の回収および脾臓の採取を行った。 To further study this initial observation, we increased the number of mice per group (increasing statistical reliability) at high doses (to provide the highest sensitivity) for the mmRNA construct. A second set of experiments was performed to investigate. The dose regimen was on days 1 and 8. Four different m mRNA constructs (hEpo; hEpo + miR-142-3p; hEPO + miR-126-3p) described above at 0.2 mg / kg or 1 mg / kg on day 1 for 12 mice per group. ; Or hEpo + miR-142-3p / miR-126-3p), one of the mmRNA constructs formulated in MC3 LNP was administered intravenously. Six hours after dosing on day 1, sera were collected for analysis of protein level expression by Epo ELISA. Spleens were also collected from 6 of the mice for B cell analysis 6 hours after dosing on day 1. On day 8, 6 mice per remaining group were re-administered, followed by serum recovery and spleen harvesting 6 hours after dosing for further analysis.

タンパク質発現についての結果を、図５Ａ～Ｂ（１回の投与について、図５Ａにおける０．２ｍｇ／ｋｇ、または図５Ｂにおける１ｍｇ／ｋｇ）、および図６Ａ～Ｂ（２回の投与について、図６Ａの０．２ｍｇ／ｋｇ、または図６Ｂの１ｍｇ／ｋｇ）に示す。結果は、ｍｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質の発現のレベルが、ｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、またはこれらの両方）の、構築物への組入れの著明な影響を受けないことを裏付けた。タンパク質の発現は、研究の６週目まで、さらにモニタリングした。発現は、４週目までに低減され、５週目における発現は、ほぼベースラインまで低減された（データは示さない）。６週目に、対照群内のほぼ全てのマウスが、発現を欠いたのに対し、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、またはこれらの両方）への組入れは、著明な発現レベルを維持した（図２９）。 Results for protein expression are shown in FIGS. 5A-B (0.2 mg / kg in FIG. 5A or 1 mg / kg in FIG. 5B for one dose) and FIGS. 6A-B (for two doses, FIG. 6A). 0.2 mg / kg, or 1 mg / kg in FIG. 6B). The results show that the level of expression of the protein of interest encoded by the mmRNA construct has a significant effect on the incorporation of the miR binding site (miR-142-3p, miR-126-3p, or both) into the construct. I confirmed that I would not receive it. Protein expression was further monitored until the 6th week of the study. Expression was reduced by week 4 and expression at week 5 was reduced to near baseline (data not shown). At 6 weeks, almost all mice in the control group lacked expression, whereas miR binding sites to mRNA constructs (miR-142-3p, miR-126-3p, or both). Incorporation maintained significant expression levels (Fig. 29).

単回投与による処置の、Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度についての結果を、それぞれ、図７および８に示す。２回の投与による処置の、Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度についての結果を、それぞれ、図９および１０に示す。これらの結果は、全Ｂ細胞頻度は、ｍｉＲの、ｍｍＲＮＡ構築物への組入れの著明な影響を受けないが、Ｂ細胞の活性化が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の存在下でわずかに減少し、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位（単独の、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた）の存在により、著明に低減されることを示した。Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度を、研究の６週目まで毎週測定し、研究の経過を通して、同様の結果であって、全Ｂ細胞の頻度は、ｍｉＲ結合部位の組入れの著明な影響を受けないが、活性化Ｂ細胞の頻度は、単独のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの存在により阻害される結果を観察した。 Results for B cell frequency and activated B cell frequency for single dose treatment are shown in FIGS. 7 and 8, respectively. Results for B cell frequency and activated B cell frequency for treatment with two doses are shown in FIGS. 9 and 10, respectively. These results show that total B cell frequency is not significantly affected by the incorporation of miR into the mmRNA construct, but B cell activation is slightly reduced in the presence of the miR-142-3p binding site. However, it was shown to be significantly reduced by the presence of the miR-126-3p binding site (either alone or in combination with the miR-142-3p binding site). B cell frequency and activated B cell frequency were measured weekly until the 6th week of the study, with similar results throughout the course of the study, with total B cell frequency markedly incorporating the miR binding site. Unaffected, but observed that the frequency of activated B cells is inhibited by the presence of a single miR-142-3p binding site, a miR-126-3p binding site, or a combination of both miR binding sites. did.

１回の投与で処置されたマウスの、ＩＬ－６の発現についての結果を、図１１Ａ～Ｂ（図１１Ａの０．２ｍｇ／ｋｇ、および図１１Ｂの１ｍｇ／ｋｇ）に示し、２回の投与で処置されたマウスについての結果を、図１２Ａ～Ｂ（図１２Ａの０．２ｍｇ／ｋｇ、および図１２Ｂの１ｍｇ／ｋｇ）に示す。これらの結果は、ＩＬ－６の発現が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の存在下で減少し、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位（単独の、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた）の存在により、なおさらに低減されることを裏付ける。 Results for IL-6 expression in mice treated with a single dose are shown in FIGS. 11A-B (0.2 mg / kg in FIG. 11A and 1 mg / kg in FIG. 11B) in two doses. Results for mice treated with are shown in FIGS. 12A-B (0.2 mg / kg in FIG. 12A and 1 mg / kg in FIG. 12B). These results show that IL-6 expression is reduced in the presence of the miR-142-3p binding site and that of the miR-126-3p binding site (alone or in combination with the miR-142-3p binding site). The existence confirms that it is further reduced.

ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのレベルならびにＩＬ－６のレベルを測定することにより、サイトカインの発現もさらに検討した。０．２ｍｇ／ｋｇの２回の投与で処置されたマウスの、これらの３つのサイトカインについての結果を、図１３Ａ（ＩＬ－６）、１３Ｂ（ＴＮＦ－α）、および１３Ｃ（ＩＦＮ－γ）に示し、１ｍｇ／ｋｇの２回の投与で処置されたマウスについての結果を、図１４Ａ（ＩＬ－６）、１４Ｂ（ＴＮＦ－α）、および１４Ｃ（ＩＦＮ－γ）に示す。これらの結果は、３つのサイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ）全ての発現が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の存在下で減少し、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位（単独の、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた）の存在により、なおさらに低減されることを裏付ける。 Cytokine expression was also further investigated by measuring TNF-α and IFN-γ levels as well as IL-6 levels. Results for these three cytokines in mice treated with two doses of 0.2 mg / kg are shown in FIGS. 13A (IL-6), 13B (TNF-α), and 13C (IFN-γ). The results for mice treated with two doses of 1 mg / kg are shown and shown in FIGS. 14A (IL-6), 14B (TNF-α), and 14C (IFN-γ). These results show that expression of all three cytokines (IL-6, TNF-α and IFN-γ) is reduced in the presence of the miR-142-3p binding site and the miR-126-3p binding site (single). , Or in combination with the miR-142-3p binding site), confirming further reduction.

サイトカインの発現を、研究の６週目まで、毎週、さらにモニタリングしたところ、血清中の３つのサイトカインである、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－α全てのレベルが、単独のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの、ｍＲＮＡ構築物内の存在により著明に阻害されることが裏付けられた。 Cytokine expression was further monitored weekly and weekly until week 6 of the study, and levels of all three cytokines in the serum, IL-6, IFN-γ, and TNF-α, were miR-142 alone. It was confirmed that the presence of the -3p binding site, the miR-126-3p binding site, or a combination of both miR binding sites in the mRNA construct was markedly inhibited.

したがって、上記で記載した研究は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの、ｍＲＮＡ構築物への組込みが、ｍＲＮＡ構築物で処置された動物のｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｂ細胞の活性化の頻度の低減、および異なる免疫刺激性サイトカインのパネル（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）の分泌の低減を結果としてもたらす一方で、処置された動物において、ｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質の発現に対して及ぼす影響が最小限であることを裏付ける。 Therefore, in the studies described above, the integration of miR-126-3p binding sites, miR-142-3p binding sites, or a combination of both miR binding sites into mRNA constructs was treated with mRNA constructs. Treated animals while resulting in reduced frequency of B cell activation and reduced secretion of different panels of immunostimulatory cytokines (IL-6, TNF-α, IFN-γ) in vivo. In, it supports that the effect on the expression of the protein of interest encoded by the mRNA construct is minimal.

（実施例４）
ｍｉＲ－１２６結合部位および／またはｍｉＲ－１４２結合部位を、ｍｍＲＮＡ構築物へと組み込む、さらなる研究
本実施例では、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位およびｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位の両方を、構築物の３’ＵＴＲへと組み込む、ルシフェラーゼコードｍｍＲＮＡ構築物を調製した。ｍｍＲＮＡ構築物を、マウスへと投与して、ｍｉＲ結合部位を組み込むことの、マウスにおける多様な免疫パラメータに対する効果を検討した。ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ １である５’キャップ構造（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含有し、５－メチルシトシンおよび１－メチルシュードウリジンで全修飾され、１００ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。対照ｍｍＲＮＡ構築物は、いずれの公知のｍｉＲ結合部位の存在も欠いた。ルシフェラーゼ （Ｌｕｃ）をコードするｍｍＲＮＡ構築物を、５０％のＭＣ３、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含み、Ｎ：Ｐを約５．５とする（値は、モル％に基づく）、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した。 (Example 4)
Further Research Incorporating the miR-126 Binding Site and / or the MiR-142 Binding Site into the mmRNA Construct In this example, the miR-142-3p binding site or the miR-126-3p binding site, or the miR-142-3p. A luciferase-coded mmRNA construct was prepared that integrates both the binding site and the miR-126-3p binding site into the 3'UTR of the construct. The effect of administering the mmRNA construct to mice and incorporating the miR binding site on various immune parameters in mice was investigated. The mmRNA construct contains a 5'cap structure (7 mG (5') ppp (5') NlmpNp) which is Cap 1, fully modified with 5-methylcytosine and 1-methylseudouridine, and has a 100 nucleotide poly A tail. Including. The control mmRNA construct lacked the presence of any known miR binding site. The mRNA construct encoding luciferase (Luc) contains 50% MC3, 10% DSPC, 38.5% cholesterol, 1.5% PEG-DMG and has an N: P of about 5.5 (N: P). Values are based on mol%), formulated into MC3 Lipid Nanoparticles (LNP).

初期研究では、マウス２４匹ずつの群を、以下の処置群：（ｉ）いずれのｍｉＲ結合部位も伴わないルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）構築物（その配列を、配列番号３０に示す）；（ｉｉ）ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を伴うＬｕｃ構築物（その配列を、配列番号３１に示す）；（ｉｉｉ）ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位を伴うＬｕｃ構築物（その配列を、配列番号３２に示す）；および（ｉｖ）ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位およびｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位を伴うＬｕｃ構築物（その配列を、配列番号３３に示す）へと割り当てた。ｍｍＲＮＡを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへと、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内投与した。各群において、１５匹のマウスを、１、８、１５、２２、２９、および３６日目に投与するように選択し、３匹のマウスには、２２日目に１回だけ投与し、３匹のマウスには、３６日目に１回だけ投与した。反復投与のために選択された１５匹のマウスのうち、５匹ずつを、脾臓を回収するために、１日目における投与の６時間後、２２日目における投与の６時間後、および３６日目における投与の６時間後に屠殺した。 In the initial study, a group of 24 mice was subjected to the following treatment group: (i) a luciferase (Luc) construct without any miR binding site (its sequence is shown in SEQ ID NO: 30); (ii) miR-. Luc construct with 142-3p binding site (its sequence is shown in SEQ ID NO: 31); (iii) Luc construct with miR-126-3p binding site (its sequence is shown in SEQ ID NO: 32); and (iv ) A Luc construct with a miR-142-3p binding site and a miR-126-3p binding site (its sequence is shown in SEQ ID NO: 33). The mRNA was intravenously administered to C57Bl / 6 mice at a dose of 0.2 mg / kg. In each group, 15 mice were selected to be administered on days 1, 8, 15, 22, 29, and 36, and 3 mice were administered only once on day 22 and 3 The mice were administered only once on the 36th day. Of the 15 mice selected for repeated doses, 5 each were used to recover the spleen 6 hours after administration on day 1, 6 hours after administration on day 22, and 36 days. Slaughtered 6 hours after dosing in the eye.

処置後、マウスを、（ｉ）全身の発光を測定することによる、ｍｍＲＮＡ構築物からのルシフェラーゼの発現；（ｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、Ｂ細胞の頻度；（ｉｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞中の、活性化ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、活性化Ｂ細胞の頻度；および（ｉｖ）サイトカインの産生（ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）について検討した。 After treatment, mice were subjected to (i) expression of luciferase from mRNA constructs by measuring systemic luminescence; (ii) frequency of B cells by measuring spleen CD19 + cell%; (iii) spleen CD19 + cells. Frequency of activated B cells by measuring activated CD19 + cell% in; and (iv) cytokine production (IL-6, IFN-γ, TNF-α) were investigated.

ルシフェラーゼの発現についての結果を、図１５Ａおよび１５Ｂに示す。図１５Ａは、１週目（１回の投与）後の結果を示し、図１５Ｂは、２週目（または２回の投与）後の結果を示す。Ｌｕｃのレベルは、実施例１で論じたｈＥＰＯレベルよりはるかに可変的であった。しかし、結果は、ｍｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質（Ｌｕｃ）の発現のレベルが、ｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、またはこれらの両方）の、構築物への組入れの著明な影響を受けないことを裏付けた。タンパク質の発現は、研究の６週目まで、さらにモニタリングした。ルシフェラーゼの発現は、６週間を通して、わずかな変化～無変化を示した。図３０は、５週目における発現を示す。 The results for the expression of luciferase are shown in FIGS. 15A and 15B. FIG. 15A shows the results after the first week (single dose) and FIG. 15B shows the results after the second week (or two doses). Luc levels were much more variable than the hEPO levels discussed in Example 1. However, the results show that the level of expression of the protein of interest (Luc) encoded by the mmRNA construct is the incorporation of the miR binding site (miR-142-3p, miR-126-3p, or both) into the construct. It was confirmed that it was not significantly affected by. Protein expression was further monitored until the 6th week of the study. Expression of luciferase showed slight to no change throughout the 6 weeks. FIG. 30 shows the expression at the 5th week.

Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度についての結果を、それぞれ、図１６および１７に示す。示される結果は、１週目（１回の投与）のものである。これらの結果は、全Ｂ細胞頻度は、ｍｉＲ結合部位の、Ｌｕｃ ｍｍＲＮＡ構築物への組入れの著明な影響を受けないが、活性化Ｂ細胞の頻度が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の存在下でわずかに減少し、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位（単独の、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた）の存在により、著明に低減されることを示した。（ｉ）本発明者らは、全Ｂ細胞集団内の活性化Ｂ細胞の百分率を測定し、（ｉｉ）Ｂ細胞頻度は、群間で変動しなかったので、活性化Ｂ細胞の頻度の低減は、ＣＤ１９＋細胞の数の低減のためではなかった。Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度を、研究の６週目まで毎週測定し、研究の経過を通して、同様の結果であって、全Ｂ細胞の頻度は、ｍｉＲ結合部位の組入れの著明な影響を受けないが、活性化Ｂ細胞の頻度は、単独のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの存在により阻害される結果を観察した。 Results for B cell frequency and activated B cell frequency are shown in FIGS. 16 and 17, respectively. The results shown are for the first week (single dose). These results show that the frequency of total B cells is not significantly affected by the incorporation of the miR binding site into the Luc m mRNA construct, but the frequency of activated B cells is in the presence of the miR-142-3p binding site. It was shown to be significantly reduced in the presence of the miR-126-3p binding site (alone or in combination with the miR-142-3p binding site). (I) We measured the percentage of activated B cells in the entire B cell population, and (ii) the frequency of B cells did not fluctuate between groups, thus reducing the frequency of activated B cells. Was not due to the reduction in the number of CD19 + cells. B cell frequency and activated B cell frequency were measured weekly until the 6th week of the study, with similar results throughout the course of the study, with total B cell frequency markedly incorporating the miR binding site. Unaffected, but observed that the frequency of activated B cells is inhibited by the presence of a single miR-142-3p binding site, a miR-126-3p binding site, or a combination of both miR binding sites. did.

サイトカインの発現は、血清中の、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αのレベルを測定することにより検討した。０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスの、これらの３つのサイトカインについての結果を、図１８Ａ（ＩＬ－６）、１８Ｂ（ＩＦＮ－γ）、および１８Ｃ（ＴＮＦ－α）に示す。示される結果は、２週目についてのものであり、同様の結果は、１週目および３週目においても観察された。ここでもまた、Ｌｕｃで処置された動物では、実施例１で記載した、ｈＥＰＯ処置された動物と比較して、サイトカインの発現の、より大きなばらつきが観察された。しかし、これらの結果は、少なくとも一部のサイトカインの発現が、単独または組合せの、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位および／またはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位の存在下で減少する（ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αについて最も顕著に）ことを裏付ける。サイトカインの発現を、研究の６週目まで、さらにモニタリングしたところ、血清中の３つのサイトカインである、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－α全てのレベルが、単独のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位もしくはｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの、ｍＲＮＡ構築物内の存在により著明に阻害されることが裏付けられた。 Cytokine expression was examined by measuring serum levels of IL-6, IFN-γ, and TNF-α. Results for these three cytokines in mice treated with 0.2 mg / kg mM mRNA are shown in FIGS. 18A (IL-6), 18B (IFN-γ), and 18C (TNF-α). The results shown are for the second week and similar results were observed at the first and third weeks. Again, in Luc-treated animals, greater variability in cytokine expression was observed compared to the hEPO-treated animals described in Example 1. However, these results show that expression of at least some cytokines is reduced in the presence of the miR-142-3p binding site and / or the miR-126-3p binding site alone or in combination (IFN-γ and TNF). -The most prominent thing about α). Further monitoring of cytokine expression up to week 6 of the study revealed that levels of all three cytokines in the serum, IL-6, IFN-γ, and TNF-α, were single miR-142-3p. It was confirmed that the presence of the binding site, the miR-126-3p binding site, or a combination of both miR binding sites in the mRNA construct was significantly inhibited.

したがって、上記で記載した研究は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、または両方のｍｉＲ結合部位の組合せの、ｍＲＮＡ構築物への組込みが、ｍＲＮＡ構築物で処置された動物のｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｂ細胞の活性化の頻度の低減、および異なる免疫刺激性サイトカインのパネル（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）の分泌の低減を結果としてもたらす一方で、処置された動物において、ｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質の発現に対して及ぼす影響が最小限であることを裏付ける。 Therefore, in the studies described above, the integration of miR-126-3p binding sites, miR-142-3p binding sites, or a combination of both miR binding sites into mRNA constructs was treated with mRNA constructs. In vivo, the mRNA constructs in treated animals, while resulting in a reduced frequency of B cell activation and a reduction in the secretion of panels of different immunostimulatory cytokines (TNF-α, IFN-γ). Supports minimal effect on the expression of the protein of interest encoded by.

（実施例５）
ｍｉＲ－１４２結合部位および／またはｍｉＲ－１５５結合部位を、ｍｍＲＮＡ構築物へと組み込む、さらなる研究
本実施例では、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、もしくはこれらの組合せ、および／またはこれらの複数のコピーを、構築物の３’ＵＴＲへと組み込む、ＥＰＯコードｍｍＲＮＡ構築物を調製した。それへの結合部位の挿入をデザインしたｍｉＲ－１５５－５ｐ配列は、以下：ｕｕａａｕｇｃｕａａｕｕｇｕｇａｕａｇｇｇｇｕ（配列番号３４）の通りである。３’ＵＴＲへと挿入されるｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位は、以下：ＡＣＣＣＣＴＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ（配列番号３５）の通りの配列を有する。 (Example 5)
Further research to integrate the miR-142 binding site and / or the miR-155 binding site into the mmRNA construct In this example, the miR-142-3p binding site, miR-142-5p binding site, miR-155-5p binding site. An EPO-coded mmRNA construct was prepared in which the site, or a combination thereof, and / or multiple copies thereof were incorporated into the 3'UTR of the construct. The miR-155-5p sequence designed for insertion of a binding site into it is as follows: uuaauugcuaauugugauaggggu (SEQ ID NO: 34). The miR-155-5p binding site inserted into the 3'UTR has the sequence as follows: ACCCCTATTCACATTAGCATTAA (SEQ ID NO: 35).

ｍｍＲＮＡ構築物を、マウスへと投与して、ｍｉＲ結合部位を組み込むことの、マウスにおける多様な免疫パラメータに対する効果を検討した。ｍｍＲＮＡ構築物は、Ｃａｐ １である５’キャップ構造（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を含有し、５－メチルシトシンおよび１－メチルシュードウリジンで全修飾され、１００ヌクレオチドのポリＡテールを含んだ。対照ｍｍＲＮＡ構築物は、ｍｉＲ結合部位のいずれの挿入の存在も欠いた。ＥＰＯをコードするｍｍＲＮＡ構築物を、５０％のＭＣ３、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含み、Ｎ：Ｐを約５．５とする（値は、モル％に基づく）、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化した。 The effect of administering the mmRNA construct to mice and incorporating the miR binding site on various immune parameters in mice was investigated. The mmRNA construct contains a 5'cap structure (7 mG (5') ppp (5') NlmpNp) which is Cap 1, fully modified with 5-methylcytosine and 1-methylseudouridine, and has a 100 nucleotide poly A tail. Including. The control mmRNA construct lacked the presence of any insertion of the miR binding site. The mRNA construct encoding EPO contains 50% MC3, 10% DSPC, 38.5% cholesterol, 1.5% PEG-DMG and has an N: P of about 5.5 (values are: Based on mol%), it was formulated into MC3 lipid nanoparticles (LNP).

この研究では、マウスを、以下の処置群：（ｉ）いずれのｍｉＲ結合部位も伴わないＥＰＯ構築物（その配列を、配列番号３６に示す）；（ｉｉ）１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（その配列を、配列番号３７に示す）；（ｉｉｉ）３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（ＥＰＯ＿３Ｘ ｍｉＲ－１４２－３ｐ）（その配列を、配列番号３８に示す）；（ｉｖ）１つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（その配列を、配列番号３９に示す）；（ｖ）３つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（ＥＰＯ＿３Ｘ ｍｉＲ－１４２－５ｐ）（その配列を、配列番号４０に示す）；（ｖｉ）２つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物、および１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位（ＥＰＯ＿２Ｘ ｍｉＲ－１４２－５ｐ＿１Ｘ ｍｉＲ－１４２－３ｐ）（その配列を、配列番号４１に示す）；（ｖｉｉ）１つのｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（その配列を、配列番号４２に示す）；（ｖｉｉｉ）３つのｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物（ＥＰＯ＿３Ｘ ｍｉＲ－１５５）（その配列を、配列番号４３に示す）；（ｉｘ）２つのｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位を伴うＥＰＯ構築物、および１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位（ＥＰＯ＿２Ｘ ｍｉＲ－１５５－５ｐ＿１Ｘ ｍｉＲ－１４２－３ｐ）（その配列を、配列番号４４に示す）；ならびに（ｘ）非翻訳対照配列を伴うＬＮＰ（「空」）のうちの１つへと割り当てた。ｍｍＲＮＡを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへと、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内投与した。投与レジメンは、１および８日目であった。 In this study, mice were subjected to the following treatment group: (i) EPO construct without any miR binding site (the sequence is shown in SEQ ID NO: 36); (ii) one miR-142-3p binding site. EPO construct with it (its sequence is shown in SEQ ID NO: 37); (iii) EPO construct with three miR-142-3p binding sites (EPO_3X miR-142-3p) (its sequence is shown in SEQ ID NO: 38). (Iv) EPO construct with one miR-142-5p binding site (its sequence is shown in SEQ ID NO: 39); (v) EPO construct with three miR-142-5p binding sites (EPO_3X miR-142). -5p) (its sequence is shown in SEQ ID NO: 40); (vi) an EPO construct with two miR-142-5p binding sites and one miR-142-3p binding site (EPO_2X miR-142-5p_1X miR). -142-3p) (its sequence is shown in SEQ ID NO: 41); (vii) EPO construct with one miR-155-5p binding site (its sequence is shown in SEQ ID NO: 42); (viii) three EPO construct with miR-155-5p binding site (EPO_3X miR-155) (its sequence is shown in SEQ ID NO: 43); (ix) EPO construct with two miR-155-5p binding sites, and one miR. -142-3p binding site (EPO_2X miR-155-5p_1X miR-142-3p) (the sequence is shown in SEQ ID NO: 44); and (x) of the LNP (“empty”) with an untranslated control sequence. Assigned to one. The mRNA was intravenously administered to C57Bl / 6 mice at a dose of 0.2 mg / kg. The dosing regimen was on days 1 and 8.

処置後、マウスを、（ｉ）コードされたＥＰＯレベル（ｎｇ／ｍｌ単位の）を測定することによる、ｍｍＲＮＡ構築物からのタンパク質発現；（ｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、全Ｂ細胞の頻度；（ｉｉｉ）脾臓ＣＤ１９＋細胞中の、活性化ＣＤ１９＋細胞％を測定することによる、活性化Ｂ細胞の頻度；および（ｉｖ）サイトカインの産生（ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）について検討した。 After treatment, mice were subjected to (i) protein expression from mRNA constructs by measuring encoded EPO levels (in ng / ml units); (ii) total B by measuring spleen CD19 + cell%. Cell frequency; (iii) Frequency of activated B cells by measuring activated CD19 + cell% in spleen CD19 + cells; and (iv) Cytokine production (IL-6, IFN-γ, TNF) -Α) was examined.

ＥＰＯタンパク質発現についての結果を、図１９Ａが、１週目における結果を示し、図１９Ｂが、２週目についての結果を示す、図１９Ａ～Ｂに示す。結果は、ｍｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質（ＥＰＯ）の発現のレベルが、ｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、もしくはこれらの複数のコピー、および／またはこれらの組合せ）の、構築物への組入れの著明な影響を受けないことを裏付けた。 The results for EPO protein expression are shown in FIGS. 19A-B, where FIG. 19A shows the results for the first week and FIGS. 19B shows the results for the second week. The results show that the level of expression of the protein of interest (EPO) encoded by the mmRNA construct is the miR binding site (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-155-5p, or multiple copies thereof). And / or combinations of these) were not significantly affected by the incorporation into the structure.

Ｂ細胞の頻度および活性化Ｂ細胞の頻度についての結果を、１週目については、それぞれ、図２０および２１に示し、２週目については、それぞれ、図２２および２３に示す。これらの結果は、全Ｂ細胞頻度は、ｍｉＲの、ＥＰＯ ｍｍＲＮＡ構築物への組入れの著明な影響を受けないが、活性化Ｂ細胞の頻度は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、もしくはこれらの複数のコピー、および／またはこれらの組合せの存在下で減少することを示した。 Results for B cell frequency and activated B cell frequency are shown in FIGS. 20 and 21, respectively for the first week, and FIGS. 22 and 23 for the second week, respectively. These results show that the frequency of total B cells is not significantly affected by the incorporation of miR into the EPO m mRNA construct, whereas the frequency of activated B cells is the miR-142-3p binding site, miR-142-. It has been shown to decrease in the presence of a 5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies thereof, and / or a combination thereof.

サイトカインの発現は、血清中の、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γのレベルを測定することにより検討した。０．２ｍｇ／ｋｇのｍｍＲＮＡで処置されたマウスの、これらの３つのサイトカインについての結果を、図２４Ａ（ＩＬ－６）、２４Ｂ（ＴＮＦ－α）、および２４Ｃ（ＩＦＮ－γ）に示す。示される結果は、２週目についてのものである。ＥＰＯで処置された動物では、サイトカインの発現のばらつきが観察された。しかし、これらの結果は、少なくとも一部のサイトカインの発現が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、もしくはこれらの複数のコピー、および／またはこれらの組合せの存在下で減少することを裏付ける。 Cytokine expression was examined by measuring serum levels of IL-6, TNF-α, and IFN-γ. Results for these three cytokines in mice treated with 0.2 mg / kg mM mRNA are shown in FIGS. 24A (IL-6), 24B (TNF-α), and 24C (IFN-γ). The results shown are for the second week. Variations in cytokine expression were observed in animals treated with EPO. However, these results show that expression of at least some cytokines is a miR-142-3p binding site, a miR-142-5p binding site, a miR-155-5p binding site, or multiple copies thereof, and / or. Support the reduction in the presence of these combinations.

したがって、上記で記載した研究は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位、もしくはこれらの複数のコピー、および／またはこれらの組合せの、ｍＲＮＡ構築物への組込みが、ｍＲＮＡ構築物で処置された動物のｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｂ細胞の活性化の頻度の低減、および異なる免疫刺激性サイトカインのパネルの分泌の低減を結果としてもたらす一方で、処置された動物において、ｍＲＮＡ構築物によりコードされる目的のタンパク質の発現に対して及ぼす影響が最小限であることを裏付ける。 Therefore, the studies described above are the mRNA constructs of the miR-142-3p binding site, the miR-142-5p binding site, the miR-155-5p binding site, or multiple copies thereof, and / or combinations thereof. While integration into the mRNA construct results in reduced frequency of B cell activation and reduced secretion of panels of different immunostimulatory cytokines in vivo in treated animals. In, support that the effect on the expression of the protein of interest encoded by the mRNA construct is minimal.

（実施例６）
ｍｉＲ結合部位の、特定の免疫細胞集団に対する効果
本実施例では、ｍＲＮＡ構築物への、免疫細胞内で発現するｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、またはｍｉＲ－１４２＋ｍｉＲ－１２６の両方）の組入れの、特定の免疫細胞集団の頻度および活性化に対する効果について検討する研究を実施した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、上記の実施例３で記載した、ＥＰＯをコードするｍＲＮＡ構築物であって、ｍｉＲ結合部位を欠くか、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、もしくはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位およびｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位の両方を含有する構築物で処置した。マウスを、１、８、および１５日目において、ＭＣ３脂質ナノ粒子へと製剤化された、０．２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ構築物により、静脈内において処置した。 (Example 6)
Effect of miR binding sites on specific immune cell populations In this example, miR binding sites expressed within immune cells (both miR-142, miR-126, or miR-142 + miR-126) on mRNA constructs. A study was conducted to examine the effect of inclusion on the frequency and activation of specific immune cell populations. The Balb / c mouse is the EPO-encoding mRNA construct described in Example 3 above, which either lacks a miR binding site or has a miR-142-3p binding site, a miR-126-3p binding site, or It was treated with a construct containing both the miR-142-3p binding site and the miR-126-3p binding site. Mice were treated intravenously on days 1, 8 and 15 with a 0.2 mg / kg mRNA construct formulated into MC3 lipid nanoparticles.

第１の実験のセットは、ｍｉＲが、ＣＤ２７＋Ｂ細胞の頻度、またはこれらの細胞内のＣＤ２７発現のレベルに対して何らかの効果を及ぼすのかどうかについて検討した。結果を、図２５Ａ～Ｂに示す。図２５Ａは、脾臓ＣＤ１９＋Ｂ細胞中の、ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の頻度を示し、ＣＤ２７＋Ｂ細胞集団が、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの影響を受けなかったことを裏付ける。図２５Ｂは、ＣＤ２７＋Ｂ細胞集団内の、ＣＤ２７の発現レベルを示すが、また、同様に、この発現が、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの影響を受けなかったことも示す。こうして、この第１の実験のセットは、Ｂ細胞の活性化の阻害、および／またはサイトカインの産生の阻害における、ｍｉＲ結合部位の効果が、ＣＤ２７＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の頻度、またはこれらの細胞内のＣＤ２７発現のレベルに影響を及ぼす、ｍｉＲ結合部位から生じたのではないことを裏付けた。 The first set of experiments examined whether miR had any effect on the frequency of CD27 + B cells, or the level of CD27 expression in these cells. The results are shown in FIGS. 25A-B. FIG. 25A shows the frequency of CD27 + CD19 + B cells in spleen CD19 + B cells, confirming that the CD27 + B cell population was unaffected by the incorporation of the miR binding site into the mRNA construct. FIG. 25B shows the expression level of CD27 in the CD27 + B cell population, but also shows that this expression was not affected by the incorporation of the miR binding site into the mRNA construct. Thus, in this first set of experiments, the effect of the miR binding site on inhibition of B cell activation and / or inhibition of cytokine production is CD27 + CD19 + B cell frequency, or within these cells. It was confirmed that it did not originate from the miR binding site, which affects the level of CD27 expression in.

第２の実験のセットは、ｍｉＲが、樹状細胞のマーカーとしてのＣＤ１１ｃ＋細胞の頻度、および／または活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞）の頻度に対して何らかの効果を及ぼすのかどうかについて検討した。結果を、図２６Ａ～Ｂに示す。図２６Ａは、マウスに由来する脾臓細胞中の、ＣＤ１１ｃ＋細胞の百分率を示し、ＣＤ１１ｃ＋細胞の総頻度が、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位、または両方の結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れにより阻害されたことを裏付ける。図２６Ｂは、ＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞集団内の、活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ７０＋ＣＤ８６＋細胞）の頻度を示すが、また、同様に、活性化樹状細胞の頻度が、ｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れにより阻害されたことも示す。こうして、この第２の実験のセットは、ｍｉＲ結合部位の組入れが、樹状細胞の総頻度および活性化樹状細胞の頻度の両方を阻害し、これにより、ｍｉＲ結合部位の組入れが、どのようにして、Ｂ細胞の活性化の阻害およびサイトカインの産生の阻害をもたらすのかについての機構に、この細胞集団を関与させることを裏付けた。機構に限定されることを意図するものではないが、これらの結果は、マウスでは、活性化ＣＤ７０＋樹状細胞のレベルの減少が、ＣＤ２７＋Ｂ細胞との相互作用の減少をもたらし、これにより、Ｂ細胞の活性化の減少、およびサイトカインの産生の減少をもたらすことを示唆する。 In the second set of experiments, miR has some effect on the frequency of CD11c + cells as a marker of dendritic cells and / or the frequency of activated dendritic cells (CD11c + CD70 + CD86 + cells). I examined whether or not. The results are shown in FIGS. 26A-B. FIG. 26A shows the percentage of CD11c + cells in spleen cells derived from mice, where the total frequency of CD11c + cells is the miR-142-3p binding site, the miR-126-3p binding site, or both binding sites. Supports the inhibition by incorporation into the mRNA construct. FIG. 26B shows the frequency of activated dendritic cells (CD11c + CD70 + CD86 + cells) within the CD11c + spleen cell population, but also the frequency of activated dendritic cells at the miR binding site. It is also shown that it was inhibited by incorporation into the mRNA construct. Thus, in this second set of experiments, the incorporation of miR binding sites inhibits both the total frequency of dendritic cells and the frequency of activated dendritic cells, thereby allowing the incorporation of miR binding sites. It was confirmed that this cell population is involved in the mechanism of whether it causes inhibition of B cell activation and cytokine production. Although not intended to be limited to mechanics, these results show that in mice, reduced levels of activated CD70 + dendritic cells result in reduced interactions with CD27 + B cells. , B cell activation is reduced, and cytokine production is reduced.

これについてさらに探索するために、第３の実験のセットを実施した。マウスに由来する形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の能力であって、ナイーブＢ細胞の成長を刺激する能力について検討した。これらの実験のために、１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭの存在下で、ＣＦＳＥで標識されたナイーブＢ細胞２×１０５個を、ｈＥＰＯ ｍＲＮＡまたはｈＥＰＯ ｍＲＮＡ－ｍｉＲ１４２、ｈＥＰＯ ｍＲＮＡ－ｍｉＲ１２６またはｈＥＰＯ ｍＲＮＡ－ｍｉＲ１２６＋１４２を注射されたマウスの脾臓から精製されたｐＤＣ ４×１０４個と共にインキュベートした。５日間にわたる培養の後で、細胞を採取し、ＣＦＳＥの発現について、フローサイトメトリーで解析した。ｐＤＣと共にインキュベートされたナイーブＢ細胞の成長のレベルを、図２７のグラフに示す。結果は、ナイーブＢ細胞の成長が、ｍｉＲ－１４２結合部位、ｍｉＲ－１２６結合部位、または両方の結合部位を含むｍＲＮＡ構築物で処置されたマウスに由来するｐＤＣの存在下では、低下することを裏付ける。これらの実験は、ｍｉＲ含有構築物で処置されたマウスにおいて、活性化ｐＤＣのレベルの減少が、Ｂ細胞の刺激の減少をもたらし、これにより、Ｂ細胞の活性化の阻害と、サイトカインの産生の阻害とをもたらす機構もさらに裏書きする。 To explore this further, a third set of experiments was performed. The ability of plasmacytoid dendritic cells (pDC) derived from mice to stimulate the growth of naive B cells was investigated. For these experiments, in the presence of 10 μg / ml anti-IgM, CFSE-labeled naive B cells 2 × 10 5 were subjected to hEPO mRNA or hEPO mRNA-miR142, hEPO mRNA-miR126 or hEPO mRNA-miR126 + 142. Was incubated with 4 x 10 pDCs purified from the spleen of the injected mice. After 5 days of culture, cells were harvested and the expression of CFSE was analyzed by flow cytometry. The level of growth of naive B cells incubated with pDC is shown in the graph of FIG. 27. The results support that naive B cell growth is reduced in the presence of pDCs from mice treated with mRNA constructs containing a miR-142 binding site, a miR-126 binding site, or both binding sites. .. In these experiments, in mice treated with miR-containing constructs, reduced levels of activated pDC resulted in reduced B cell stimulation, thereby inhibiting B cell activation and cytokine production. The mechanism that brings about is also endorsed.

（実施例７）
ｍｉＲ結合部位の、ＩｇＭに対する効果
本実施例では、ｍＲＮＡ構築物への、免疫細胞内で発現するｍｉＲ結合部位（ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、またはｍｉＲ－１４２＋ｍｉＲ－１２６の両方）の組入れの、ＰＥＧに結合するＩｇＭ（抗ＰＥＧ ＩｇＭ）のレベルに対する効果について検討する研究を実施した。ＰＥＧは、ｍＲＮＡ構築物が封入されるＬＮＰの成分であるので、マウスの血清中の、抗ＰＥＧ ＩｇＭの存在は、ＬＮＰ／ｍＲＮＡ組成物の血中クリアランスの加速化（ＡＢＣ）に寄与する。 (Example 7)
Effect of miR binding site on IgM In this example, PEG of the incorporation of a miR binding site (both miR-142, miR-126, or miR-142 + miR-126) expressed in immune cells into an mRNA construct. A study was conducted to examine the effect on the level of IgM (anti-PEG IgM) that binds to. Since PEG is a component of LNP in which the mRNA construct is encapsulated, the presence of anti-PEG IgM in mouse serum contributes to accelerated blood clearance (ABC) of the LNP / mRNA composition.

マウスを、実施例２で記載した通り、ルシフェラーゼコードｍＲＮＡ構築物で処置した。処置の２、３、および４回目の投与の後で、血清を、マウスから回収し、血清中の抗ＰＥＧ ＩｇＭレベル（ｎｇ／ｍｌ単位の）を測定した。結果を、図２８Ａ～Ｃのグラフに示す。図２８Ａは、第２の用量後における抗ＰＥＧ ＩｇＭレベルを示し、図２８Ｂは、３回目の投与後における抗ＰＥＧ ＩｇＭレベルを示し、図２８Ｃは、４回目の投与後における抗ＰＥＧ ＩｇＭレベルを示す。結果は、ｍｉＲ結合部位の組入れが、マウスにおける抗ＰＥＧ ＩｇＭのレベルを著明に減少させたことを裏付ける。この効果は、第２の用量による処置の後で既に観察され、効果は、４回目の投与による処置を通して持続した。ｍｉＲ結合部位含有ｍＲＮＡ構築物で処置されたマウスにおける、抗ＰＥＧ ＩｇＭのこの低減は、これらのマウスでは、少なくとも部分的に抗ＰＥＧ ＩｇＭにより媒介されるＡＢＣが、低減されると予測されることを指し示す。 Mice were treated with the luciferase-encoding mRNA construct as described in Example 2. After the second, third, and fourth doses of treatment, sera were harvested from mice and anti-PEG IgM levels (in ng / ml units) in the sera were measured. The results are shown in the graphs of FIGS. 28A-C. FIG. 28A shows anti-PEG IgM levels after the second dose, FIG. 28B shows anti-PEG IgM levels after the third dose, and FIG. 28C shows anti-PEG IgM levels after the fourth dose. .. The results support that the incorporation of the miR binding site markedly reduced the level of anti-PEG IgM in mice. This effect was already observed after treatment with the second dose and the effect persisted throughout the treatment with the fourth dose. This reduction in anti-PEG IgM in mice treated with the miR binding site-containing mRNA construct indicates that in these mice, at least partially anti-PEG IgM-mediated ABC is expected to be reduced. ..

（実施例８）
複数のｍｉＲ結合部位と対比した、単一のｍｉＲ結合部位の効果
本実施例では、ｍＲＮＡ構築物への、複数のｍｉＲ結合部位（例えば、３つのｍｉＲ結合部位を有する３Ｘ）と対比した、単一のｍｉＲ結合部位（１Ｘ）の組入れの効果について検討する研究を実施した。 (Example 8)
Effect of a Single MiR Binding Site Against Multiple MiR Binding Sites In this example, a single miR binding site compared to multiple miR binding sites (eg, 3X with 3 miR binding sites) to the mRNA construct. A study was conducted to examine the effect of incorporating the miR binding site (1X).

肝細胞内のｍＲＮＡの発現を調節することが公知である、ｍｉＲ－１２２について検討する、第１の研究のシリーズを実施した。３つのｍｉＲ－１２２結合部位と対比した、１つのｍｉＲ－１２２結合部位の組入れの、ｍＲＮＡ構築物によりコードされるタンパク質の発現に対する効果を決定するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、初代肝細胞に、ルシフェラーゼｍＲＮＡ構築物（Ｌｕｃ）および増強型緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ構築物（ｅＧＦＰ）であって、各構築物の３’ＵＴＲが、（ｉ）ｍｉＲ－１２２結合部位を欠く（対照）か；（ｉｉ）１つのｍｉＲ－１２２結合部位を含有するか；または（ｉｉｉ）３つのｍｉＲ－１２２結合部位を含有する、Ｌｕｃ構築物およびｅＧＦＰ構築物を共トランスフェクトした。別の対照は、推定コード配列内に、ＡＴＧを伴わない、Ｌｕｃ様ＲＮＡ配列およびｅＧＦＰ様ＲＮＡ配列のトランスフェクションを含んだ。これら４つのｅＧＦＰ構築物のｍＲＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６１～６４に示す。これら４つのＬｕｃ構築物のｍＲＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６５～６８に示す。３つのｍｉＲ－１２２結合部位を含有する３’ＵＴＲの配列を、配列番号５４に示す。 A series of first studies was performed examining miR-122, which is known to regulate the expression of mRNA in hepatocytes. To determine the effect of the incorporation of one miR-122 binding site on the expression of the protein encoded by the mRNA construct as opposed to three miR-122 binding sites, Lipofectamine 2000 was used on primary hepatocytes. , Luciferase mRNA construct (Luc) and enhanced green fluorescent protein mRNA construct (eGFP), where the 3'UTR of each construct lacks (i) miR-122 binding site (control); (ii) one. Luc and eGFP constructs containing a miR-122 binding site; or (iii) containing three miR-122 binding sites were co-transfected. Another control included transfection of Luc-like RNA sequences and eGFP-like RNA sequences without ATG within the putative coding sequence. The mRNA sequences of these four eGFP constructs are shown in SEQ ID NOs: 61-64, respectively. The mRNA sequences of these four Luc constructs are shown in SEQ ID NOs: 65-68, respectively. The sequence of 3'UTR containing three miR-122 binding sites is shown in SEQ ID NO: 54.

細胞に、７．５ｎｇ、１５ｎｇ、５０ｎｇ、または１００ｎｇのｍＲＮＡをトランスフェクトした。緑色の総組入れ強度を、２４時間にわたり経時的に測定した。結果を、図３１Ａ～Ｄに示すが、これにより、低ｍＲＮＡ用量（それぞれ、図３１Ａおよび３１Ｂの、７．５ｎｇおよび１５ｎｇ）では、１Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物および３Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物のいずれもが、初代肝細胞内のｅＧＦＰの発現の著明な低減をもたらしたのに対し、高ｍＲＮＡ用量（それぞれ、図３１Ｃおよび３１Ｄの、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）では、３Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物が、１Ｘ ×ｍｉＲ－１２２構築物よりより強いｅＧＦＰ発現の阻害を呈示し、高用量では、３Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物が、時間経過にわたり、タンパク質発現のこの喪失を維持することが可能であったことが裏付けられる。また、ルシフェラーゼの発光についても、初代肝細胞内で検討したが、同様の結果：３Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物が、特に、高ｍＲＮＡ用量において、タンパク質発現の高度なノックダウンをもたらすことを観察した。 Cells were transfected with 7.5 ng, 15 ng, 50 ng, or 100 ng mRNA. The total green inclusion intensity was measured over time for 24 hours. The results are shown in FIGS. 31A-D, which result in both the 1X miR-122 construct and the 3X miR-122 construct at low mRNA doses (7.5 ng and 15 ng of FIGS. 31A and 31B, respectively). High mRNA doses (50 ng and 100 ng, respectively, FIGS. 31C and 31D) resulted in a marked reduction in eGFP expression in primary hepatocytes, whereas the 3X miR-122 construct was 1X x miR-122. It exhibited a stronger inhibition of eGFP expression than the construct, confirming that at high doses, the 3X miR-122 construct was able to maintain this loss of protein expression over time. The luminescence of luciferase was also examined in primary hepatocytes and similar results were observed: the 3X miR-122 construct resulted in a high degree of knockdown of protein expression, especially at high mRNA doses.

３つのｍｉＲ－１２２結合部位と対比した、１つのｍｉＲ－１２２結合部位の組入れの、ｍＲＮＡ構築物によりコードされるタンパク質の発現に対する効果について検討する、第２の実験のシリーズでは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、初代肝細胞に、カスパーゼをコードするｍＲＮＡ構築物であって、その３’ＵＴＲ内に、（ｉ）ｍｉＲ－１２２結合部位（対照）を有さないか；（ｉｉ）１つのｍｉＲ－１２２結合部位を有するか；または（ｉｉｉ）３つのｍｉＲ－１２２結合部位を有するｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。別の対照は、推定コード配列内に、ＡＴＧを伴わない、カスパーゼ様ＲＮＡ配列のトランスフェクションを含んだ。これら４つのカスパーゼ構築物のｍＲＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６９～７２に示す。カスパーゼ媒介毒性を、２４時間にわたり経時的に測定した。結果を、図３２Ａ～Ｄに示すが、これにより、低ｍＲＮＡ用量（図３２Ａの７．５ｎｇ）では、１Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物および３Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物のいずれもが、カスパーゼ媒介毒性を阻害し、３Ｘ ×ｍｉＲ－１２２構築物が、毒性の阻害にはるかに強力な効果を及ぼすことが裏付けられる。さらに、高ｍＲＮＡ用量（それぞれ、図３２Ｂ、３２Ｃ、および３２Ｄの、１５ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇ）では、３Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物だけが、カスパーゼ媒介毒性を阻害することが可能であった。また、初代肝細胞に、ＭＣ３脂質ナノ粒子内のカスパーゼｍＲＮＡ構築物をトランスフェクトする研究も実施したが、同様の結果：３Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物によるカスパーゼ媒介毒性の緩和が、１Ｘ ｍｉＲ－１２２構築物によるカスパーゼ媒介毒性の緩和より、著明に強力であることを観察した。 In the second series of experiments, Lipofectamine 2000 was used to examine the effect of the incorporation of one miR-122 binding site on the expression of the protein encoded by the mRNA construct as opposed to three miR-122 binding sites. Is there an mRNA construct encoding caspase in the primary hepatocytes that does not have (i) a miR-122 binding site (control) in its 3'UTR; (ii) one miR-122 binding? An mRNA construct having a site or (iii) having three miR-122 binding sites was transfected. Another control included transfection of a caspase-like RNA sequence without ATG within the putative coding sequence. The mRNA sequences of these four caspase constructs are shown in SEQ ID NOs: 69-72, respectively. Caspase-mediated toxicity was measured over time for 24 hours. The results are shown in FIGS. 32A-D, which show that at low mRNA doses (7.5 ng in FIG. 32A), both the 1X miR-122 construct and the 3X miR-122 construct inhibited caspase-mediated toxicity. It is supported that the 3X × miR-122 construct has a much stronger effect on inhibition of toxicity. Moreover, at high mRNA doses (15 ng, 50 ng and 100 ng of FIGS. 32B, 32C and 32D, respectively), only the 3X miR-122 construct was able to inhibit caspase-mediated toxicity. We also conducted a study of transfecting primary hepatocytes with a caspase mRNA construct in MC3 lipid nanoparticles, with similar results: mitigation of caspase-mediated toxicity by the 3X miR-122 construct and caspase by the 1X miR-122 construct. It was observed to be significantly more potent than mitigation of mediating toxicity.

これらのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける研究結果を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて確認するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０、１つ、または３つのｍｉＲ－１２２結合部位を含有するＭＣ３ナノ粒子内のＬｕｃ ｍＲＮＡ構築物およびｅＧＦＰ ｍＲＮＡ構築物（０．５ｍｇ／ｋｇ）を共投与した。肝臓内のｅＧＦＰ蛍光について検討した結果は、１つのｍｉＲ－１２２結合部位の組入れが、肝臓内のｅＧＦＰ発現のわずかなノックダウンをもたらすのに対し、３つのｍｉＲ－１２２結合部位の組入れは、肝臓内のｅＧＦＰ発現の著明なノックダウンをもたらすことを示した。ルシフェラーゼの発現についても、同様の結果が観察され、１Ｘ 部位も、ルシフェラーゼの発現を低減するが、３Ｘ 部位は、タンパク質発現のより強いノックダウンをもたらした。 To confirm the results of these in vitro studies in vivo, the Luc mRNA constructs and eGFP mRNAs in MC3 nanoparticles containing 0, 1, or 3 miR-122 binding sites in Balb / c mice. The construct (0.5 mg / kg) was co-administered. The results of examining eGFP fluorescence in the liver show that the incorporation of one miR-122 binding site results in a slight knockdown of eGFP expression in the liver, whereas the incorporation of three miR-122 binding sites in the liver. It was shown to result in a marked knockdown of eGFP expression within. Similar results were observed for luciferase expression, with the 1X site reducing luciferase expression, but the 3X site resulting in a stronger knockdown of protein expression.

第３の実験のシリーズでは、カニクイザルに、３’ＵＴＲ内に、０、１つ、または３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含有するＭＣ３ナノ粒子内のｈＥＰＯ ｍＲＮＡ構築物（０．２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。サルにおけるｈＥＰＯの発現レベル（ｎｇ／ｍｌ単位の）を、ＥＬＩＳＡにより測定したが、その結果を、図３３に示す。結果は、３Ｘ ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位の、ｈＥＰＯ構築物への組入れが、０または１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を伴う構築物と比較して、ｈＥＰＯの、著明に低度の発現をもたらすことを示す。 In a third series of experiments, hEPO mRNA constructs (0.2 mg / kg) in MC3 nanoparticles containing 0, 1, or 3 miR-142-3p binding sites in cynomolgus monkeys in 3'UTR. Was administered. The expression level of hEPO (in units of ng / ml) in monkeys was measured by ELISA, and the results are shown in FIG. 33. The results show that incorporation of the 3X miR-142-3p binding site into the hEPO construct results in significantly lower expression of hEPO compared to constructs with 0 or one miR-142-3p binding site. Show that it will bring.

全体的に、上記で記載した研究は、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物への組入れの有益性と、３つのｍｉＲ結合部位の、構築物への組入れによる効果の増強とを裏付ける。 Overall, the studies described above support the benefit of incorporating at least one miR binding site into the mRNA construct and the enhanced effect of incorporating three miR binding sites into the construct.

（実施例９）
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内のｍｉＲ結合部位の効果
本実施例では、ｍＲＮＡ構築物への、ｍＲＮＡ構築物の５’ＵＴＲ内の、３つの異なる挿入部位のうちの１つの中のｍｉＲ結合部位の組入れの効果について検討する研究を実施した。使用される５’ＵＴＲ配列を、下記に示す。 (Example 9)
Effect of miR binding sites within the 5'untranslated region (5'UTR) In this example, miR binding to the mRNA construct in one of three different insertion sites within the 5'UTR of the mRNA construct. A study was conducted to examine the effect of site incorporation. The 5'UTR sequences used are shown below.

ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧ＾ＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡ＾ＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡ＾ＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号５３）［配列中、３つの可能な挿入部位（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）を、キャレット記号（＾）で指し示す］。Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３へと挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を有する５’ＵＴＲの配列を、それぞれ、配列番号５５～５７に示す。Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３へと挿入されたｍｉＲ－１２２結合部位を有する５’ＵＴＲの配列を、それぞれ、配列番号５８～６０に示す。 GGGAAATAAGAG ^ AGAAAAAGAAGAGTA ^ AGAAGAAATATA ^ AGAGCCACC (SEQ ID NO: 53) [Three possible insertion sites (P1, P2, P3) in the sequence are indicated by a caret symbol (^)]. The sequences of 5'UTRs with miR-142-3p binding sites inserted into P1, P2, or P3 are shown in SEQ ID NOs: 55-57, respectively. The sequences of 5'UTRs with miR-122 binding sites inserted into P1, P2, or P3 are shown in SEQ ID NOs: 58-60, respectively.

第１の実験のシリーズでは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ｍＲＮＡ構築物を、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞へとトランスフェクトしたが、この場合、構築物は、３’ＵＴＲ内の１Ｘ ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位または３Ｘ ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含有するか、または５’ＵＴＲのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３へと挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含有するか、または３’ＵＴＲ内の単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた、５’ＵＴＲのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３へと挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含有した。ｅＧＦＰ蛍光は、トランスフェクションの４８時間後において測定した。結果を、図３４に示す。結果は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３に挿入した構築物であって、単独の、または３’ＵＴＲ内のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた構築物を含む被験構築物の全てが、細胞内のタンパク質の発現の著明な低減をもたらしたことを裏付ける。 In the first series of experiments, Lipofectamine 2000 was used to transfect enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA constructs into RAW264.7 mouse macrophage cells, in which case the constructs were in the 3'UTR. Whether it contains a 1X miR-142-3p binding site or a 3X miR-142-3p binding site, or a miR-142-3p binding site inserted into P1, P2, or P3 of a 5'UTR. , Or a miR-142-3p binding site inserted into P1, P2, or P3 of the 5'UTR combined with a single miR-142-3p binding site within the 3'UTR. eGFP fluorescence was measured 48 hours after transfection. The results are shown in FIG. The result is a construct in which the miR-142-3p binding site is inserted into P1, P2, or P3, and the test construct comprises a structure containing the miR-142-3p binding site alone or in combination with the miR-142-3p binding site in the 3'UTR. All of these support a significant reduction in intracellular protein expression.

ｈＥＰＯを、コードされるタンパク質として使用して、同様の構築物を制作し、ＲＡＷ２６４．７細胞にトランスフェクトして、同様の実験を行った。ｈＥＰＯ構築物による結果は、ｅＧＦＰ構築物による結果と全く同様であり、ｍｉＲ結合部位を、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３に挿入した構築物であって、単独の、または３’ＵＴＲ内のｍｉＲ結合部位と組み合わせた構築物を含む全ての被験構築物は、細胞内のタンパク質発現の著明な低減をもたらした。しかし、ｈＥＰＯ構築物では、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３における５’ＵＴＲ構築物による阻害の程度は、ｅＧＦＰ構築物による阻害の程度（それぞれ、８９％、９６％、および９８％）と比較して、わずかに低度（それぞれ、６０％、７３％、および９３％）であった。 Similar constructs were made using hEPO as the encoded protein and transfected into RAW264.7 cells to perform similar experiments. The results with the hEPO construct were exactly the same as those with the eGFP construct, with the miR binding site inserted into P1, P2, or P3 and combined with the miR binding site alone or within the 3'UTR. All test constructs, including constructs, resulted in a marked reduction in intracellular protein expression. However, in the hEPO construct, the degree of inhibition by the 5'UTR construct in P1, P2, and P3 is slightly lower than the degree of inhibition by the eGFP construct (89%, 96%, and 98%, respectively). Degrees (60%, 73%, and 93%, respectively).

第２の実験のシリーズでは、構築物が、３’ＵＴＲ内の１Ｘ ｍｉＲ－１２２結合部位または３Ｘ ｍｉＲ－１２２結合部位を含有するか、または５’ＵＴＲのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３へと挿入されたｍｉＲ－１２２結合部位を含有するか、または３’ＵＴＲ内の単一のｍｉＲ－１２２結合部位と組み合わせた、５’ＵＴＲのＰ１、Ｐ２、もしくはＰ３へと挿入されたｍｉＲ－１２２結合部位を含有したことを除き、上記で記載した構築物と同様のｈＥＰＯ ｍＲＮＡ構築物を制作した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ｍＲＮＡ構築物を、初代肝細胞へとトランスフェクトした。ｈＥＰＯ発現（ｎｇ／ｍＬ単位の）を、ＥＬＩＳＡにより測定した結果を、図３５に示す。結果は、ｍｉＲ－１２２結合部位を、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３に挿入した構築物であって、単独の、または３’ＵＴＲ内のｍｉＲ－１２２結合部位と組み合わせた構築物を含む被験構築物の全てが、細胞内のタンパク質の発現の著明な低減をもたらしたことを裏付ける。 In the second series of experiments, the construct contained a 1X miR-122 binding site or a 3X miR-122 binding site in the 3'UTR, or was inserted into P1, P2, or P3 of the 5'UTR. Contains a miR-122 binding site or a miR-122 binding site inserted into the P1, P2, or P3 of a 5'UTR combined with a single miR-122 binding site within the 3'UTR. An hEPO mRNA construct similar to that described above was produced, except that Lipofectamine 2000 was used to transfect the mRNA construct into primary hepatocytes. The results of measuring hEPO expression (in units of ng / mL) by ELISA are shown in FIG. 35. The result is that all of the test constructs containing the miR-122 binding site inserted into P1, P2, or P3, either alone or in combination with the miR-122 binding site in the 3'UTR, are all test constructs. It supports a significant reduction in intracellular protein expression.

これらのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける研究結果を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて確認するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＭＣ３ナノ粒子内のｈＥＰＯ／ｍｉＲ－１２２ｍＲＮＡ構築物のパネルを投与するか、またはｈＥＰＯ／ｍｉＲ－１４２－３ｐ構築物のパネルを投与した。結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける観察と同様に、ｍｉＲ－１２２またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３に挿入した構築物であって、単独の、または３’ＵＴＲ内のｍｉＲ－１２２またはｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と組み合わせた構築物を含む被験構築物の全てが、マウスにおけるタンパク質の発現の著明な低減をもたらしたことを示した。 To confirm the results of these in vitro studies in vivo, Lipofectamine 2000 was used to administer a panel of hEPO / miR-122 mRNA constructs in MC3 nanoparticles to Balb / c mice, or hEPO. A panel of / miR-142-3p constructs was administered. The result is a construct in which the miR-122 or miR-142-3p binding site is inserted into P1, P2, or P3, as in the in vitro observation, and the miR-122 alone or within the 3'UTR. Alternatively, it was shown that all of the test constructs, including constructs combined with the miR-142-3p binding site, resulted in a marked reduction in protein expression in mice.

全体的に、これらの研究は、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位の、ｍＲＮＡ構築物の３’ＵＴＲもしくは５’ＵＴＲへの組入れ、またはｍｉＲ結合部位の組合せの、３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲの両方への組入れの有益性を裏付ける。
配列表の概要

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 Overall, these studies included the incorporation of at least one miR binding site into the 3'UTR or 5'UTR of the mRNA construct, or the combination of miR binding sites into both the 3'UTR and 5'UTR. Support the benefits of incorporation.
Summary of sequence listing
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Claims (15)

治療用ポリペプチドの、ヒト被験体への反復投与後における、全身性の抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害するための組成物であって、ＬＮＰ内に封入された、治療用ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を含み、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡ内のすべてのウラシルヌクレオ塩基が、修飾されたウラシルヌクレオ塩基で置き換えられており；
前記被験体における、前記治療用ポリペプチドに対する全身性のＡＤＡ応答を低減または阻害するように、前記組成物が、前記被験体へと、第１の用量で静脈内投与され、前記組成物が、前記被験体へと、第２の用量で静脈内投与されることを特徴とし、前記ＡＤＡ応答の低減または阻害が、治療用ポリペプチドに対するＩｇＧ抗体応答の低減または阻害を含む、
組成物。 A composition for reducing or inhibiting a systemic anti-drug antibody (ADA) response after repeated administration of a therapeutic polypeptide to a human subject, the therapeutic polypeptide encapsulated in RNAP. Contains modified mRNAs (mRNAs) encoding: (i) at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-126 binding site; or (iii) at least one. All uracilnucleobases in the mmRNA, including the miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site, have been replaced with modified uracilnucleobases;
The composition is administered intravenously to the subject at a first dose so as to reduce or inhibit the systemic ADA response to the therapeutic polypeptide in the subject. It is characterized in that it is administered intravenously to the subject at a second dose, wherein the reduction or inhibition of the ADA response comprises reducing or inhibiting the IgG antibody response to the Therapeutic polypeptide.
Composition. 治療用ポリペプチドの、ヒト被験体への反復投与後における、全身性の抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害するための組成物であって、
ＬＮＰ内に封入された、治療用ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を含み、前記ｍｍＲＮＡが、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を含み、前記ｍｍＲＮＡ内のすべてのウラシルヌクレオ塩基が、修飾されたウラシルヌクレオ塩基で置き換えられており；前記組成物が、前記被験体へと、第１の用量で静脈内投与されることを特徴とし、
前記被験体に由来する試料中のＩｇＧ抗薬物抗体のレベルが検出され；
前記試料中のＩｇＧ抗薬物抗体の前記レベルが低下したら、前記被験体における、前記治療用ポリペプチドに対する全身性のＡＤＡ応答を低減または阻害するように、前記組成物が、前記被験体へと、第２の用量で静脈内投与されることを特徴とする、
組成物。 A composition for reducing or inhibiting a systemic anti-drug antibody (ADA) response after repeated administration of a therapeutic polypeptide to a human subject.
It contains a modified mRNA (mmRNA) that encodes a therapeutic polypeptide encapsulated in an LNP, wherein the mmRNA is (i) at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) at least one miR-. 126 binding sites; or (iii) containing at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site, and all uracilnucleobases in the mRNA are modified uracilnucleobases. It has been replaced; characterized in that the composition is administered intravenously to the subject at a first dose.
Levels of IgG anti-drug antibody in samples derived from said subject were detected;
When the level of the IgG anti-drug antibody in the sample is reduced, the composition is transferred to the subject so as to reduce or inhibit the systemic ADA response to the therapeutic polypeptide in the subject. It is characterized by being administered intravenously at a second dose,
Composition. 前記ｍｍＲＮＡが、５’ＵＴＲ、前記治療用ポリペプチドをコードする、コドン最適化オープンリーディングフレーム、（ｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位；（ｉｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位；または（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位および少なくとも１つのｍｉＲ－１２６結合部位を含む３’ＵＴＲ、ならびに連結されるヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、請求項１または２に記載の組成物。 The mmRNA is a 5'UTR, a codon-optimized open reading frame encoding the therapeutic polypeptide, (i) the at least one miR-142-3p microRNA binding site; (ii) the at least one miR-. 126 binding sites; or (iii) 3'UTRs comprising at least one miR-142-3p microRNA binding site and at least one miR-126 binding site, as well as a 3'tailing region of the nucleoside to be linked. Item 2. The composition according to Item 1 or 2 . 前記ｍｍＲＮＡ内のすべてのシトシンヌクレオ塩基が、修飾されたシトシンで置き換えられている、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 3 , wherein all cytosine nucleobases in the mM mRNA are replaced with modified cytosine. 前記ｍｍＲＮＡが、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオグアノシン、もしくはα－チオアデノシン、またはこれらの組合せを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の組成物。 The mmRNA is 1-methylpseudouridine (m 1 ψ), 5-methoxyuridine (mo 5 U), 5-methylcytidine (m 5 C), pseudo-pseudouridine (ψ), α-thioguanosine, or α-thio. The composition according to any one of claims 1 or 2 , comprising adenosine, or a combination thereof. 脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質および／またはイオン化脂質を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 5 , wherein the lipid nanoparticles contain a cationic lipid and / or an ionized lipid. 前記ｍｍＲＮＡが、配列番号３に示される配列を含む、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 6 , wherein the mRNA comprises at least one miR-142-3p microRNA binding site comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 3. 前記ｍｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。 6. One of claims 1-6 , wherein the mRNA comprises at least two microRNA binding sites and at least one of the microRNA binding sites is a miR-142-3p microRNA binding site. Composition. 前記ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項８に記載の組成物。 The mRNA is the binding site of miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223. The composition of claim 8 , comprising a second microRNA binding site for miR selected from the group consisting of, miR-24, and miR-27. 前記ｍｍＲＮＡが、配列番号２６に示される配列を含む、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 9 , wherein the mRNA comprises at least one miR-126 microRNA binding site comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 26. 前記ｍｍＲＮＡが、少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 9 , wherein the mRNA comprises at least two microRNA binding sites and at least one of the microRNA binding sites is a miR-126 microRNA binding site. thing. 前記ｍｍＲＮＡが、ｍｉＲ－１２６結合部位と、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、およびｍｉＲ－２７からなる群から選択される、ｍｉＲに対する第２のマイクロＲＮＡ結合部位とを含む、請求項１１に記載の組成物。 The mRNA is the binding site of miR-126 and miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223. The composition of claim 11 , comprising a second microRNA binding site for miR selected from the group consisting of, miR-24, and miR-27. ｍｍＲＮＡ構築物が、ｍｉＲ－１２６結合部位およびｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 12 , wherein the mmRNA construct comprises a miR-126 binding site and a miR-142-3p binding site. ｍｍＲＮＡ構築物が、３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 6 , wherein the mmRNA construct comprises three miR-142-3p binding sites. ｍｍＲＮＡ構築物が、３つのｍｉＲ－１２６結合部位を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 6 , wherein the mmRNA construct comprises three miR-126 binding sites.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP4023249A1 (en) 2014-04-23 2022-07-06 ModernaTX, Inc. Nucleic acid vaccines
US11007260B2 (en) 2015-07-21 2021-05-18 Modernatx, Inc. Infectious disease vaccines
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
WO2017062513A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
MD3718565T2 (en) 2015-10-22 2022-09-30 Modernatx Inc Respiratory virus vaccines
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. Tropical disease vaccines
JP2018531290A (en) 2015-10-22 2018-10-25 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド Sexually transmitted disease vaccine
WO2017070613A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EA201891001A1 (en) 2015-10-22 2018-11-30 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. VACCINES ON THE BASIS OF NUCLEIC ACIDS AGAINST WINDSHEAD VIRUS (VZV)
AU2016366978B2 (en) 2015-12-10 2022-07-28 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
US10465190B1 (en) 2015-12-23 2019-11-05 Modernatx, Inc. In vitro transcription methods and constructs
KR102533456B1 (en) 2016-05-18 2023-05-17 모더나티엑스, 인크. Polynucleotides encoding relaxin
WO2017201332A1 (en) * 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding acyl-coa dehydrogenase, very long-chain for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
GB201612214D0 (en) * 2016-07-14 2016-08-31 Univ Oxford Innovation Ltd Method
ES2928475T3 (en) 2016-09-14 2022-11-18 Modernatx Inc High purity RNA compositions and methods for their preparation
JP6980780B2 (en) 2016-10-21 2021-12-15 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド Human cytomegalovirus vaccine
CN110167587A (en) 2016-11-11 2019-08-23 摩登纳特斯有限公司 Influenza vaccines
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
WO2018111967A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 Modernatx, Inc. Rna affinity purification
EP3582790A4 (en) 2017-02-16 2020-11-25 ModernaTX, Inc. High potency immunogenic compositions
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
EP3609534A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
WO2018170347A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
MA48047A (en) * 2017-04-05 2020-02-12 Modernatx Inc REDUCTION OR ELIMINATION OF IMMUNE RESPONSES TO NON-INTRAVENOUS THERAPEUTIC PROTEINS, FOR EXAMPLE SUBCUTANEOUSLY
AU2018270111B2 (en) 2017-05-18 2022-07-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (IL12) polypeptides and uses thereof
EP3638215A4 (en) 2017-06-15 2021-03-24 Modernatx, Inc. Rna formulations
US20210079440A1 (en) * 2017-07-12 2021-03-18 Kyoto University HIGH EXPRESSION mRNA SWITCH
WO2019036683A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. Analytical hplc methods
EP3668979A4 (en) 2017-08-18 2021-06-02 Modernatx, Inc. Methods for hplc analysis
EP3668971B8 (en) 2017-08-18 2024-05-29 ModernaTX, Inc. Rna polymerase variants
MX2020002348A (en) 2017-08-31 2020-10-08 Modernatx Inc Methods of making lipid nanoparticles.
GB201714430D0 (en) * 2017-09-07 2017-10-25 Micol Romain Compositions and processes for targeted delivery and expression and modulation of therapeutic components in tissue
US10653767B2 (en) 2017-09-14 2020-05-19 Modernatx, Inc. Zika virus MRNA vaccines
US20220265856A1 (en) * 2017-11-22 2022-08-25 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia
JP7423521B2 (en) * 2017-11-22 2024-01-29 モダーナティエックス・インコーポレイテッド Polynucleotide encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
US11684577B2 (en) 2018-01-18 2023-06-27 Etherna Immunotherapies Nv Lipid nanoparticles
US11911453B2 (en) 2018-01-29 2024-02-27 Modernatx, Inc. RSV RNA vaccines
WO2019202035A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Curevac Ag Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US11851694B1 (en) 2019-02-20 2023-12-26 Modernatx, Inc. High fidelity in vitro transcription
CA3130888A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Modernatx, Inc. Rna polymerase variants for co-transcriptional capping
EP3965830A1 (en) * 2019-05-07 2022-03-16 ModernaTX, Inc. Differentially expressed immune cell micrornas for regulation of protein expression
EP4031527A1 (en) 2019-09-19 2022-07-27 ModernaTX, Inc. Headgroup lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CN114728886B (en) 2019-09-19 2024-04-12 摩登纳特斯有限公司 Lipid compounds and compositions containing carbonates for intracellular delivery of therapeutic agents
CN114728887A (en) 2019-09-19 2022-07-08 摩登纳特斯有限公司 Branched tail end lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
IL294866A (en) 2020-01-31 2022-09-01 Modernatx Inc Methods of preparing lipid nanoparticles
GB2594365B (en) 2020-04-22 2023-07-05 BioNTech SE Coronavirus vaccine
US20230277457A1 (en) 2020-08-06 2023-09-07 Modernatx, Inc. Methods of preparing lipid nanoparticles
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP4217377A1 (en) * 2020-09-23 2023-08-02 Myeloid Therapeutics, Inc. Improved methods and compositions for expression of nucleic acids in cells
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
EP4313938A1 (en) 2021-03-24 2024-02-07 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
EP4334446A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 CureVac SE Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression
WO2023107400A1 (en) * 2021-12-06 2023-06-15 Ohio State Innovation Foundation Diamino lipid (dal) compounds and pharmaceutical compositions comprising an immunotherapeutic agent
AR127892A1 (en) 2021-12-10 2024-03-06 Modernatx Inc COMPOUNDS AND COMPOSITIONS FOR THE ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC AGENTS
TW202333654A (en) 2021-12-16 2023-09-01 美商現代公司 Processes for preparing lipid nanoparticles
WO2023193002A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Modernatx, Inc. Cross mixers for lipid nanoparticle production, and methods of operating the same
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024026482A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions comprising surface lipid derivatives and related uses
WO2024026475A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Compositions for delivery to hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) and related uses
WO2024026487A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions comprising phospholipid derivatives and related uses
WO2024091918A2 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Modernatx, Inc. Methods of lipid nanoparticle production in cross-mixers

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008541737A (en) 2005-06-03 2008-11-27 サウザーン アデレード ヘルス サービス−ファインダーズ メディカル センター Targeting cells with altered microRNA expression
JP2013500704A (en) 2009-07-31 2013-01-10 エスリス ゲーエムベーハー RNA having a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
WO2014081507A1 (en) 2012-11-26 2014-05-30 Moderna Therapeutics, Inc. Terminally modified rna
JP2014523411A (en) 2011-06-08 2014-09-11 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド Lipid nanoparticle compositions and methods for mRNA delivery
JP2015501844A (en) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Modified nucleosides, nucleotides and nucleic acid compositions

Family Cites Families (175)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
EP2292771A3 (en) 1997-09-19 2011-07-27 Life Technologies Corporation Sense mRNA therapy
EP1030925A1 (en) 1997-11-12 2000-08-30 Brigham & Women's Hospital, Inc. The translation enhancer element of the human amyloid precursor protein gene
US7655777B2 (en) 1997-11-24 2010-02-02 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules associated with the tocopherol pathway
WO2001055371A1 (en) 2000-01-28 2001-08-02 The Scripps Research Institute Methods of identifying synthetic transcriptional and translational regulatory elements, and compositions relating to same
US7871598B1 (en) 2000-05-10 2011-01-18 Novartis Ag Stable metal ion-lipid powdered pharmaceutical compositions for drug delivery and methods of use
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
AU2002311869A1 (en) 2001-04-27 2002-11-11 Sunnybrook And Women's College Health Sciences Centre Breast cancer-associated genes and uses thereof
EP2305699B1 (en) 2001-06-05 2014-08-13 CureVac GmbH Stabilised mRNA with increased G/C content which is optimised for translation in its coded areas for the vaccination against sleeping sickness, leishmaniosis and toxoplasmosis
DE10162480A1 (en) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr The application of mRNA for use as a therapeutic agent against tumor diseases
SE0201907D0 (en) 2002-06-19 2002-06-19 Atos Medical Ab Patches for tracheostoma valves
EP1572242B1 (en) 2002-12-13 2014-04-16 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
KR20050115231A (en) 2003-02-10 2005-12-07 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 Regulation of mammalian cells
GB0316089D0 (en) 2003-07-09 2003-08-13 Xo Bioscience Ltd Differentiation method
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
DE10335833A1 (en) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfection of blood cells with mRNA for immune stimulation and gene therapy
WO2006111512A1 (en) 2005-04-19 2006-10-26 Basf Plant Science Gmbh Improved methods controlling gene expression
DE102005023170A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimized formulation for mRNA
US8236731B2 (en) 2005-05-24 2012-08-07 Monsanto Technology Llc Herbicide compatibility improvement
DK2002003T3 (en) 2005-05-27 2016-03-21 Ospedale San Raffaele Srl Gene vector comprising miRNA
EP3611266B1 (en) 2005-08-23 2022-11-09 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
JP5225087B2 (en) 2005-08-24 2013-07-03 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート Translation enhancer element-dependent vector system
DE102005046490A1 (en) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz New nucleic acid molecule comprising promoter, a transcriptable nucleic acid sequence, a first and second nucleic acid sequence for producing modified RNA with transcriptional stability and translational efficiency
WO2007044627A2 (en) 2005-10-06 2007-04-19 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Compositions and methods for delivery of interfering rna
ATE539765T1 (en) 2005-11-04 2012-01-15 Novartis Vaccines & Diagnostic FLU VACCINES WITH PARTICLE ADJUVANTS AND IMMUNE BOOSTERS COMBINATIONS
US8603457B2 (en) 2005-12-02 2013-12-10 University Of Rochester Nonsense suppression and genetic codon alteration by targeted modification
US20070281336A1 (en) 2006-04-14 2007-12-06 Epicentre Technologies Kits and methods for generating 5' capped RNA
DE102006051516A1 (en) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Base) modified RNA to increase the expression of a protein
EA200900784A1 (en) 2006-12-06 2009-12-30 Новартис Аг VACCINES INCLUDING ANTIGENS FROM FOUR STRAINS OF THE INFLUENZA VIRUS
WO2008140615A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Novozymes, Inc. Modified messenger rna stabilizing sequences for expressing genes in bacterial cells
DE102007001370A1 (en) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-encoded antibodies
WO2008091799A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Cell-based methods for identifying inhibitors of parkinson's disease-associated lrrk2 mutants
CA2707436C (en) 2007-06-29 2014-01-28 Epicentre Technologies Corporation Copy dna and sense rna
WO2009015071A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Dharmacon, Inc. Screening of micro-rna cluster inhibitor pools
US20130108663A1 (en) 2007-09-14 2013-05-02 Vrije Universiteit Brussel Enhancing the t-cell stimulatory capacity of human antigen presenting cells in vitro and in vivo and their use in vaccination
US20110086904A1 (en) 2007-09-17 2011-04-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania GENERATION OF HYPERSTABLE mRNAs
DK3156414T3 (en) 2007-09-26 2020-03-09 Intrexon Corp SYNTHETIC 5'PRESE EXPRESSION VECTORS AND METHODS FOR INCREASING TRANSGENIC EXPRESSION
EP2221371B1 (en) * 2007-11-22 2013-11-13 Japan Science and Technology Agency Translation regulation system in cell or artificial cell model by using low-molecular-weight rna
CN103911378A (en) 2007-12-11 2014-07-09 斯克利普斯研究所 Compositions and methods related to mRNA translational enhancer elements
EP2072618A1 (en) 2007-12-14 2009-06-24 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Use of RNA for reprogramming somatic cells
WO2009093384A1 (en) 2008-01-24 2009-07-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Polynucleotide or analogue thereof, and gene expression regulation method using the polynucleotide or the analogue thereof
WO2010051048A1 (en) 2008-02-20 2010-05-06 The Wistar Institute Microrna modulators and method for identifying and using the same
US20120027813A1 (en) 2008-02-22 2012-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
US9394538B2 (en) 2008-05-07 2016-07-19 Shi-Lung Lin Development of universal cancer drugs and vaccines
PL215513B1 (en) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski New borane phosphate analogs of dinucleotides, their application, RNA particle, method of obtaining RNA and method of obtaining peptides or protein
US20110250237A1 (en) 2008-07-15 2011-10-13 O'hagan Derek Immunogenic amphipathic peptide compositions
WO2010017510A1 (en) 2008-08-07 2010-02-11 University Of Southern California A system for synergistic expression of multiple small functional rna elements
US20120100558A1 (en) 2008-09-08 2012-04-26 Hanash Samir M Lung cancer diagnosis
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EP3207944B1 (en) 2008-11-10 2020-01-15 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
EP2364362B1 (en) 2008-11-12 2015-10-21 Ospedale San Raffaele S.r.l. Gene vector for inducing transgene-specific immune tolerance
EP3243504A1 (en) 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
EP2401365B1 (en) 2009-02-24 2016-04-27 The Scripps Research Institute Reengineering mrna primary structure for enhanced protein production
US10837020B2 (en) 2009-04-22 2020-11-17 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long RNA molecules
CN102596255B (en) 2009-04-30 2017-10-13 圣拉法埃莱医院有限公司 Genophore
JP5769701B2 (en) 2009-05-05 2015-08-26 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイションＴｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Lipid composition
AU2010259984B2 (en) 2009-06-10 2017-03-09 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
US20110300205A1 (en) 2009-07-06 2011-12-08 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
JP2014501097A (en) 2009-07-06 2014-01-20 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Composition and method for enhancing production of biological material
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
ES2713852T3 (en) 2009-12-01 2019-05-24 Translate Bio Inc Derived from steroids for the administration of mRNA in human genetic diseases
DE102009056884B4 (en) 2009-12-03 2021-03-18 Novartis Ag Vaccine Adjuvants and Improved Methods for Making Same
US20130189741A1 (en) 2009-12-07 2013-07-25 Cellscript, Inc. Compositions and methods for reprogramming mammalian cells
PL3287525T3 (en) 2009-12-07 2020-05-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
EP2336354A1 (en) 2009-12-18 2011-06-22 Roche Diagnostics GmbH A method for the detection of a RNA molecule, a kit and a use related thereof
EP2338520A1 (en) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Conjugate with targeting ligand and use of same
EP3721943A1 (en) 2009-12-23 2020-10-14 Novartis AG Lipids, lipid compositions and methods of using them
US8846631B2 (en) 2010-01-14 2014-09-30 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compositions and methods
US20110247090A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Intrexon Corporation Synthetic 5'UTRs, Expression Vectors, and Methods for Increasing Transgene Expression
EP2556151A1 (en) 2010-04-07 2013-02-13 Novartis AG Method for generating a parvovirus b19 virus-like particle
CA2795695A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 The University Of Tokyo Microrna-controlled recombinant vaccinia virus and use thereof
US8802438B2 (en) 2010-04-16 2014-08-12 Children's Medical Center Corporation Compositions, kits, and methods for making induced pluripotent stem cells using synthetic modified RNAs
CA2803239A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
EP2590625B1 (en) 2010-07-06 2017-09-20 GlaxoSmithKline Biologicals SA Cationic oil-in-water emulsions
PT2591114T (en) 2010-07-06 2016-08-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunisation of large mammals with low doses of rna
RS54489B1 (en) 2010-07-06 2016-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomes with lipids having an advantageous pka-value for rna delivery
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
LT2590676T (en) 2010-07-06 2016-10-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
EP2590670B1 (en) 2010-07-06 2017-08-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods of raising an immune response by delivery of rna
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
WO2012009644A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Arizona Board Of Regents Methods to identify synthetic and natural rna elements that enhance protein translation
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
JP5908477B2 (en) 2010-08-31 2016-04-26 ノバルティス アーゲー Lipids suitable for liposome delivery of protein-encoding RNA
PL3970742T3 (en) 2010-08-31 2022-09-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
ES2935542T3 (en) 2010-08-31 2023-03-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Small liposomes for delivery of RNA encoding immunogen
CN104531671A (en) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US20140030292A1 (en) 2010-10-11 2014-01-30 Novartis Ag Antigen delivery platforms
WO2012056440A1 (en) * 2010-10-28 2012-05-03 Nanodoc Ltd. COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
JP2014511694A (en) 2011-04-03 2014-05-19 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション ドゥーイング ビジネス アズ マサチューセッツ ジェネラル ホスピタル Efficient in vivo protein expression using modified RNA (MOD-RNA)
LT3275892T (en) 2011-05-13 2020-04-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pre-fusion rsv f antigens
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
BR112013029490A2 (en) 2011-05-17 2019-09-24 Moderna Therapeutics Inc engineered nucleic acids and methods of use for non-human vertebrates
AU2012261237B2 (en) 2011-05-24 2017-06-01 BioNTech SE Individualized vaccines for cancer
JP6022557B2 (en) 2011-06-08 2016-11-09 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド Cleavable lipids
MX345704B (en) 2011-06-10 2017-02-10 Novartis Tiergesundheit Ag Bovine vaccines and methods.
WO2013003475A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Cellscript, Inc. Inhibition of innate immune response
JP2014520807A (en) 2011-07-06 2014-08-25 ノバルティス アーゲー Immunogenic compositions and uses thereof
CA2840965C (en) 2011-07-06 2021-03-02 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
EP2729126B1 (en) 2011-07-06 2020-12-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
US11896636B2 (en) 2011-07-06 2024-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combination compositions and uses thereof
EP3424495A1 (en) 2011-07-06 2019-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
SG11201400250UA (en) 2011-08-31 2014-03-28 Novartis Ag Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2755986A4 (en) 2011-09-12 2015-05-20 Moderna Therapeutics Inc Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012308205A1 (en) 2011-09-16 2014-03-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA engineered T cells for the treatment of cancer
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
RU2014118727A (en) 2011-10-11 2015-11-20 Новартис Аг RECOMBINANT SELF-REPLICING POLYCISTRON RNA MOLECULES
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
EP2791159A4 (en) 2011-12-14 2015-10-14 Moderna Therapeutics Inc Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
JP2015510495A (en) 2011-12-21 2015-04-09 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Methods for extending the viability or longevity of an organ or organ graft
EP2797634A4 (en) 2011-12-29 2015-08-05 Moderna Therapeutics Inc Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
WO2013102203A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Cellscript, Inc. MAKING AND USING IN VITRO-SYNTHESIZED ssRNA FOR INTRODUCING INTO MAMMALIAN CELLS TO INDUCE A BIOLOGICAL OR BIOCHEMICAL EFFECT
WO2013103659A1 (en) 2012-01-04 2013-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Stabilizing rna by incorporating chain-terminating nucleosides at the 3'-terminus
US20150030576A1 (en) 2012-01-10 2015-01-29 Moderna Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier
WO2013109713A1 (en) 2012-01-18 2013-07-25 The General Hospital Corporation Targeting rnas to microvesicles
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
US20130236504A1 (en) 2012-03-06 2013-09-12 Medical University Of South Carolina Delivery System for Enhancing Drug Efficacy
US20150126581A1 (en) * 2012-03-08 2015-05-07 The University Of Western Australia MicroRNAs and Uses Thereof
CN108929880A (en) 2012-03-27 2018-12-04 库瑞瓦格股份公司 Artificial nucleic acid molecule comprising 5 ' TOPUTR
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243953A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
US20140275229A1 (en) 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013151666A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9150841B2 (en) 2012-06-29 2015-10-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
US20150307542A1 (en) 2012-10-03 2015-10-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
US20140141037A1 (en) 2012-11-20 2014-05-22 Novartis Ag Rsv f prefusion trimers
WO2014093574A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
MX2015008847A (en) 2013-01-10 2015-10-30 Novartis Ag Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof.
EP2946014A2 (en) 2013-01-17 2015-11-25 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US20160022840A1 (en) 2013-03-09 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
EP2968397A4 (en) 2013-03-12 2016-12-28 Moderna Therapeutics Inc Diagnosis and treatment of fibrosis
EP2968391A1 (en) * 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc Removal of dna fragments in mrna production process
US20140288149A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Graham Lord Mir-142 and antagonists thereof for treating disease
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
US20160032273A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US20160017313A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
CA2917348A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
WO2015007871A2 (en) 2013-07-17 2015-01-22 Ospedale San Raffaele S.R.L. Micrornas and autoimmune-immune mediated inflammatory disease
CA2923029A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3043826A4 (en) 2013-09-13 2017-05-24 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US20160264614A1 (en) 2013-10-02 2016-09-15 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015051214A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP3058082A4 (en) 2013-10-18 2017-04-26 ModernaTX, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
WO2015105926A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
WO2016011306A2 (en) 2014-07-17 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Terminal modifications of polynucleotides
EP3041948B1 (en) 2014-11-10 2019-01-09 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
US20170362605A1 (en) 2014-12-19 2017-12-21 Modernatx, Inc. Terminal modifications of polynucleotides
DK3326641T3 (en) 2015-04-22 2019-09-30 Curevac Ag RNA-Containing Composition for the Treatment of Tumor Diseases
WO2017062513A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
SI3394093T1 (en) 2015-12-23 2022-05-31 Modernatx, Inc. Methods of using ox40 ligand encoding polynucleotides

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008541737A (en) 2005-06-03 2008-11-27 サウザーン アデレード ヘルス サービス−ファインダーズ メディカル センター Targeting cells with altered microRNA expression
JP2013500704A (en) 2009-07-31 2013-01-10 エスリス ゲーエムベーハー RNA having a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
JP2014523411A (en) 2011-06-08 2014-09-11 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド Lipid nanoparticle compositions and methods for mRNA delivery
JP2015501844A (en) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Modified nucleosides, nucleotides and nucleic acid compositions
WO2014081507A1 (en) 2012-11-26 2014-05-30 Moderna Therapeutics, Inc. Terminally modified rna

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