JP6988480B2 - 浮遊培養馴化接着型細胞の調製方法、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導方法、及びそれらの利用 - Google Patents

Description

本発明は、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法に関する。また、本発明は接着型上皮細胞の上皮間葉転換の誘導方法に関する。

近年、低分子化合物からなる医薬品に代わり、副作用の少ないバイオ医薬品の研究が盛んになっている。バイオ医薬品は、遺伝子組み換え技術により製造される組み換え医薬品である。例えば、組み換え医薬品として、ガン治療やリウマチ治療に用いられる抗体や、赤血球を増やすためのホルモンであるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）等のタンパク質を成分とするものが知られている。
しかしながら、組み換え医薬品は、治療のために投与する量が多く、また、生産するための費用が高いことがあり、十分に普及するには至っていない。したがって、生産性を上げることが課題となっている。

組み換え医薬品は、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスタ−の卵巣；Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞等の接着型細胞に、目的のタンパク質の遺伝子を導入して、浮遊状態で増殖するよう調製した組み換えＣＨＯ細胞内で、目的のタンパク質を生合成させることにより生産される。一般的に、細胞は浮遊培養システム中では、接着型由来細胞の平均倍化時間は遅くなる。そこで、増殖能力を高めるために浮遊培養環境への馴化操作が必要となる。

接着型細胞を浮遊培養に馴化させる方法として、例えば特許文献１には、目的のタンパク質をコードする遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有するプラスミドをＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、得られた組み換えＣＨＯ細胞を、通常よりも細胞密度が低い条件で培養を繰り返すことにより、組み換えＣＨＯ細胞を浮遊状態で培養する方法が記載されている。
しかしながら、この方法は、ＣＨＯ細胞を浮遊状態にするまで培養を繰り返すものであるため、８週間程度という長い時間が必要になる。また、継代培養期間が長くなると、遺伝子の変異や細胞の変質等の状態を管理し、確認する手間と費用が増加することとなる。

また、特許文献２には、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損株細胞に、ヒトアンチトロンビン遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を組み込み、浮遊状態とした組み換えＣＨＯ細胞を、ホローファイバー型培養装置を用いて培養することで、この細胞を浮遊させながら、ヒトアンチトロンビンを製造する方法が記載されている。
しかしながら、この方法には、ホローファイバーを組み込んだ装置が複雑で高価であるため、費用面での問題があった。また、大量培養のためにホローファイバーサイズを大きくすると、ホローファイバーの両端での培地交換が均等ではなく、培地が不均一になりやすかった。この結果、培地のｐＨ等が変化し、ホローファイバー内の細胞にストレスがかかるため、目的のタンパク質の生産性が低下するおそれがあった。

ところで、上皮間葉転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；ＥＭＴ）は、発生、創傷治癒、及びがんの浸潤や転移等の生命現象の中で観察される、上皮細胞の性質が間葉細胞のそれに転換されるプロセスである。上皮間葉転換により、細胞が発現するある種のタンパク質に変化が起こる。そのようなタンパク質を上皮間葉転換マーカーと言い、上皮間葉転換の誘導により発現量が増加するもの（ｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）と減少するもの（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）とがある。例えば、発現量が増加するものとしては、Ｎ−カドヘリンやビメンチンが知られ、発現量が減少するものとしては、Ｅ−カドヘリンやサイトケラチンが知られている（特許文献３）。また、上皮間葉転換は、ＴＧＦ等の成長因子により誘導されるため、ＴＧＦ等の成長因子は、上皮間葉転換誘導因子として知られている（非特許文献１）。

特開平２−００９３８８号公報 特開２００５−０７３５０９号公報 ＷＯ２００６／１０１９２５号パンフレット

Ｍａｓｓａｇｕｅ Ｊ，Ｃｅｌｌ，２００８年７月，１３４巻，２号，２１５−２３０ページ

上記のように、これまでにも、接着型細胞を浮遊培養に馴化させる技術がいくつか提案されてきたものの、より効率よく、かつ、より安価に馴化させ得る方法が要望されているのが現状である。
本発明は、かかる実情に鑑みてなされたものであり、接着型細胞を特殊な操作を要さずに、浮遊状態でも死滅することのない、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法、当該方法で調整された浮遊培養に馴化した接着型細胞を用いた核酸又はタンパク質の生産方法、脂環構造含有重合体成形体からなる接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤、接着型細胞を浮遊培養に馴化させるための脂環構造含有重合体成形体の使用、及び接着型細胞の浮遊培養馴化用容器を提供することを目的とする。
また本発明は、接着型上皮細胞を接触させるのみの操作で該細胞に上皮間葉転換を誘導する方法、当該方法で上皮間葉転換された細胞を用いた核酸又はタンパク質の生産方法、脂環構造含有重合体成形体からなる接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導剤、接着型上皮細胞を上皮間葉転換誘導させるための脂環構造含有重合体成形体の使用、及び接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導用容器を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、接着型培養細胞を、脂環構造含有重合体成形体に接触させた状態で培養することで、本来、足場である細胞外基質を必要とする接着型細胞を、浮遊培養システム中で増殖させることができる、即ち接着型細胞を馴化できることを見出し、接着型細胞の浮遊馴化に関する本発明を完成するに至った。更に、本発明者らは、該細胞が脂環構造含有重合体成形体と接触することで、間葉系細胞のような性質に転換されることを見出し、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導に関する本発明を完成するに至った。

かくして本発明によれば、（１）〜（５）の接着型細胞の調製方法、（６）、（１５）の、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法、（７）の接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤、（８）、（１７）の脂環構造含有重合体成形体の使用、（９）、（１０）の浮遊培養馴化用容器、（１１）〜（１４）の上皮間葉転換の誘導方法、（１６）の接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導剤、（１８）、（１９）の、接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導用容器が提供される。

（１）接着型細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養する工程を有する、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法。
（２）前記接着型細胞が、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である、（１）に記載の接着型細胞の調製方法。
（３）前記外来遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子である、（２）に記載の接着型細胞の調製方法。
（４）前記接着型細胞が動物由来の細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載の接着型細胞の調製方法。
（５）前記動物由来の細胞がＣＨＯ細胞である、（４）に記載の接着型細胞の調製方法。

（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の接着型細胞の調製方法により、前記浮遊培養に馴化した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法。
（７）脂環構造含有重合体成形体からなる接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤。
（８）接着型細胞を液体培地中に浮遊培養に馴化させるための、脂環構造含有重合体成形体の使用。
（９）少なくとも底面が脂環構造含有重合体成形体からなるものである接着型細胞の浮遊培養馴化用容器。
（１０）前記脂環構造含有重合体が飽和ノルボルネン系重合体である、（９）に記載の浮遊培養馴化用容器。

（１１）接着型上皮細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養する工程を有する、上皮間葉転換の誘導方法。
（１２）前記接着型上皮細胞が、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である、（１１）に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
（１３）前記接着型上皮細胞が動物由来の細胞である、（１１）または（１２）に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
（１４）前記動物由来の細胞がＣＨＯ細胞である、（１３）に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
（１５）前記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の上皮間葉転換の誘導方法により、上皮間葉転換した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法。

（１６）脂環構造含有重合体成形体からなる接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導剤。
（１７）接着型上皮細胞を上皮間葉転換誘導させるための、脂環構造含有重合体成形体の使用。
（１８）少なくとも底面が脂環構造含有重合体成形体からなるものである接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導用容器。
（１９）前記脂環構造含有重合体が飽和ノルボルネン系重合体である、（１８）に記載の上皮間葉転換誘導用容器。

図１は、本発明の方法により前培養したＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の細胞数計測結果を示すグラフである。 図２は、本発明の方法により調製された浮遊培養に馴化されたＣＨＯ細胞を主成分とする前培養後の全ての細胞を浮遊培養システムで培養したときの、経過日数に対する総細胞数を示すグラフである。 図３は、本発明の方法により、浮遊培養システムで培養された総細胞データから計算した、培養１日目〜３日目（生細胞の増殖フェーズ）における各々前培養試料の平均倍化時間を示すグラフである。

本発明の方法は、接着型細胞を脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養することにより、当該接着型細胞を、液体培地中での浮遊培養に馴化させることを特徴とする、接着型細胞の調製方法である。
接着型細胞が浮遊培養に馴化されると、接着型細胞が培養環境に適合するため、浮遊馴化していない接着型細胞を浮遊培養したときの平均倍化時間と比較して、浮遊培養に馴化された接着型細胞は平均倍化時間が短くなる。

本発明に係る接着型細胞は、特に限定されず、目的に応じて任意に選択することができる。
本発明において、接着型細胞は、通常の培養条件において、細胞外基質に接着することで生存及び増殖可能な細胞のことをいう。接着型細胞としては、上皮細胞や線維芽細胞が挙げられる。また、これらの細胞に外来遺伝子を組み込んだ、遺伝子組み換えされた接着型細胞などの遺伝子工学処理を施された細胞であっても良い。接着細胞の具体例としては、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。これらの中でも浮遊馴化のしやすさからＣＨＯ細胞が好ましい。

本発明においては、この接着型細胞に、ファージやプラスミドのベクター等を用いた形質導入等によって、外来遺伝子を発現することのできる様になったものを用いる。
尚、本発明の上皮間葉転換の誘導方法に用いる細胞は、上記接着細胞の内、単層扁平上皮細胞、重層扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、線毛（多列線毛）上皮細胞、移行上皮細胞、立方上皮細胞等に分類される上皮細胞やこれらと同様の形態を持つ上皮細胞様の細胞である。上述した具体例の内、ＣＨＯ細胞やＨＥＫ２９３細胞が上皮細胞の例となる。

外来遺伝子は、目的に応じて任意に選択することができる。具体的には、エリスロポエチン（以下、「ＥＰＯ」という）、インターフェロン（α、β、γ）、顆粒球コロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ、人成長ホルモン、インスリン、グルカゴンＨＧＦ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒト型抗体等のサイトカインやホルモンのような生理活性タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子；例えばｍｉＲ−３６９等、特定のターゲット（例えばガン細胞）のＲＮＡ合成を阻害し、次世代核酸医療の候補として期待されているマイクロＲＮＡ及びその前駆体等の核酸（ＲＮＡ）をコードする遺伝子；等が挙げられる。
こうした組み換え細胞の培養中に脂環構造含有重合体成形体を接触させると、生理活性タンパク質の生産量が増大する。

細胞を培養する際には、液体培地が用いられる。
液体培地としては、通常、ｐＨ緩衝作用があり、浸透圧が細胞に好適なものであり、細胞の栄養成分を含み、かつ、細胞に対して毒性がないものが用いられる。
ｐＨ緩衝作用を示す成分としては、トリス塩酸塩、各種リン酸塩、各種炭酸塩等が挙げられる。
液体培地の浸透圧調整は、通常、細胞の浸透圧とほぼ同じになるように、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース等の濃度を調整した水溶液を用いて行われる。かかる水溶液としては、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等の生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；等が挙げられる。
細胞の栄養成分としては、アミノ酸、核酸、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
液体培地としては、ＲＰＭＩ−１６４０、ＨＡＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等の各種市販品を利用することができる。

液体培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、タンパク質等の誘導因子、分化誘導活性を有する低分子化合物、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
用いる添加剤としては、細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチン等の細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝又は２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内又はミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；ウィルスベクター等と組み合わせて細胞内に導入することができるＤＮＡやＲＮＡ；等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。

細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。
例えば、二酸化炭素濃度が５％程度で、温度が２０℃〜３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。

本発明に用いる脂環構造含有重合体成形体は、脂環構造含有重合体を任意の形状に成形してなるものである。
脂環構造含有重合体は、主鎖及び／又は側鎖に脂環構造を有する樹脂である。なかでも、機械的強度、耐熱性等の観点から、主鎖に脂環構造を含有するものが好ましい。

脂環構造としては、飽和環状炭化水素（シクロアルカン）構造、不飽和環状炭化水素（シクロアルケン）構造等が挙げられる。機械的強度、耐熱性等の観点から、シクロアルカン構造やシクロアルケン構造が好ましく、なかでもシクロアルカン構造を有するものが最も好ましい。

脂環構造を構成する炭素原子数は、格別な制限はないが、通常４〜３０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは５〜１５個である。脂環構造を構成する炭素原子数がこの範囲内であるときに、機械的強度、耐熱性、及び成形性の特性が高度にバランスされ、好適である。

脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％である。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合が過度に少ないと耐熱性に劣り好ましくない。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位以外の残部は、格別な限定はなく、使用目的に応じて適宜選択される。

脂環構造含有重合体の具体例としては、（１）ノルボルネン系重合体、（２）単環の環状オレフィン系重合体、（３）環状共役ジエン系重合体、（４）ビニル脂環式炭化水素重合体、及び（１）〜（４）の水素化物等が挙げられる。これらの中でも、耐熱性、機械的強度等の観点から、ノルボルネン系重合体の水素化物が好ましい。

（１）ノルボルネン系重合体及びその水素化物
ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。

開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体及びノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、並びにこれらの水素化物等が挙げられる。付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体及びノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体等が挙げられる。これらの中でも、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物、ノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体、及び当該付加重合体の水素添加物等の飽和ノルボルネン系重合体が、耐熱性、機械的強度等の観点から好ましく、細胞が浮遊しやすいことから、とりわけ極性基を有しないものが好ましい。

ノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（慣用名：ノルボルネン）、５−メチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５，５−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチリデン−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−ビニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メチル−５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン等の２環式単量体；トリシクロ［４．３．０^１，６．１^２，５］デカ−３，７−ジエン（慣用名：ジシクロペンタジエン）、２−メチルジシクロペンタジエン、２，３−ジメチルジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；テトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８，９−ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチル−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデン−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、８−メチル−８−カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１^２，５．１^７，１０］−３−ドデセン、７，８−ベンゾトリシクロ［４．３．０．１^２，５］デカ−３−エン（慣用名：メタノテトラヒドロフルオレン：１，４−メタノ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４−メタノ−８−メチル−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−クロロ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−ブロモ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。

ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４−シクロヘキサジエン、１，５−シクロオクタジエン、１，５−シクロデカジエン、１，５，９−シクロドデカトリエン、１，５，９，１３−シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。

ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等の炭素数２〜２０のα−オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０^２，１０．０^３，８］テトラデカ−３，５，７，１２−テトラエン（３ａ，５，６，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノ−１Ｈ−インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４−ヘキサジエン、４−メチル−１，４−ヘキサジエン、５−メチル−１，４−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α−オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。

ノルボルネン系単量体の開環重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウム等の金属のハロゲン化物と、硝酸塩又はアセチルアセトン化合物、及び還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデン等の金属のハロゲン化物又はアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。

ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウム等の遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素−炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。

ノルボルネン系単量体の付加重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。

（２）単環の環状オレフィン系重合体
単環の環状オレフィン系重合体としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン等の、単環の環状オレフィン系単量体の付加重合体を用いることができる。
（３）環状共役ジエン系重合体及びその水素化物
環状共役ジエン系重合体及びその水素化物としては、例えば、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン等の環状共役ジエン系単量体を１，２−又は１，４−付加重合した重合体及びその水素化物等が挙げられる。
（４）ビニル脂環式炭化水素重合体及びその水素化物
ビニル脂環式炭化水素重合体及びその水素化物としては、例えば、ビニルシクロヘキセン、ビニルシクロヘキサン等のビニル脂環式炭化水素系単量体の重合体及びその水素化物；スチレン、α−メチルスチレン等のビニル芳香族系単量体の重合体の芳香環部分の水素化物；等が挙げられる。ビニル脂環式炭化水素重合体は、これらの単量体と共重合可能な他の単量体との共重合体であってもよい。
これらの脂環構造含有重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。

脂環構造含有重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで測定したポリスチレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００〜５００，０００、より好ましくは８，０００〜２００，０００、特に好ましくは１０，０００〜１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。

脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０〜３００℃、好ましくは１００〜２８０℃、特に好ましくは１１５〜２５０℃、更に好ましくは１３０〜２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
本発明においてガラス転移温度は、ＪＩＳ Ｋ ７１２１に基づいて測定されたものである。

また、脂環構造含有重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料等の着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤等の配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
また、脂環構造含有重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。脂環構造含有重合体に混合されるその他の重合体の量は、脂環構造含有重合体１００重量部に対して、通常２００重量部以下、好ましくは１５０重量部以下、より好ましくは１００重量部以下である。
脂環構造含有重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合順序に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機等を用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、又は直接乾燥法により溶剤を除去する方法等が挙げられる。
二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。

脂環構造含有重合体の成形方法は、細胞と接触させる際に用いる脂環構造含有重合体成形体の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法としては、例えば、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。

細胞が接触する脂環構造含有重合体成形体の形状に格別な制限はなく、板状、シート状等が挙げられ、また、その表面は平らであっても、凹凸形状を有していてもよい。さらに、このような形状の成形体を、構成部材の一部として含む容器であってもよいし、脂環構造含有重合体成形体で全体を構成された容器であってもよいし、脂環構造含有重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器であってもよい。
具体的な容器の形状としては、ディッシュ、プレート、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンター等の培養容器が挙げられる。
そして、こうして得られる脂環構造含有重合体成形体は、接着細胞の浮遊培養への馴化を促進する機能を有する、本発明の浮遊培養馴化促進剤である。

本発明においては、成形体を培養細胞と接触させるに当たり、通常、成形体を滅菌処理する。
滅菌処理の方法に格別な制限はなく、成形体の形状や用いる細胞に応じて、公知の滅菌処理法選択することができる。例えば、高圧蒸気法や乾熱法等の加熱法；γ線や電子線等の放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）等のガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；等、医療分野で一般的に採用される方法が挙げられる。これらの中でも、表面状態の変化が少ないことから、ガス法が好ましい。

本発明に用いる脂環構造含有重合体成形体は、少なくとも細胞が接触する面が脂環構造含有重合体で形成されたものであればよく、全体が脂環構造含有重合体から形成されたものでなくてもよい。
この脂環構造含有重合体成形体の細胞と接触する面の水接触角は通常８５°以上１１０°以下であり、８５°以上１０５°以下であることが好ましく、８５°以上１００°以下であることが特に好ましい。
ここで、水接触角は、公知の全自動接触角計（本願実施例においては、協和界面科学社製「ＬＣＤ−４００Ｓ」を使用）を用い、ディッシュ底面をΦ３０ｍｍのサークルカッターで切り取って、試料の中心と、そこを中央とする１辺２０ｍｍの正方形の頂点４か所、計５か所を測定点とし、液滴の半径ｒと高さｈを求め、ｔａｎθ１＝ｈ／ｒ、θ＝２ａｒｃｔａｎ（ｈ／ｒ）で求められるθである（θ／２法）。

また、これらの成形体表面は、プラズマ処理、コロナ放電処理、オゾン処理、紫外線照射処理等培養容器に対して、滅菌目的以外の一般的な表面処理を行うこともできる。ただし、これらの表面処理操作を施すことにより発生する費用を抑えることができること；表面処理に伴う形成体表面の部分分解により清浄性が損なわれるおそれがあること；細胞の浮遊化能又は上皮間葉転換能が低下するおそれがあること；等の理由から、これらの表面処理操作を実質的に行わないことが好ましい。ここで、「これらの表面処理操作を実質的に行わない」とは、これらの表面処理操作を行わないか、又は、表面処理操作を行った場合であっても、下記式で定義される表面処理操作後における成形体表面（環構造含有重合体成形体の細胞と接触する面）の水接触角の変化割合〔Ｘ（％）〕が±２０％、好ましくは±１０％の範囲内であることを意味する。

培養細胞を脂環構造含有重合体成形体に接触した状態で培養する方法は、脂環構造含有重合体成形体の形状に応じて任意の方法を採用すればよい。通常、シャーレ状、袋状、ボトル状等の容器であって、少なくとも一面が脂環構造含有重合体で形成されたものを用いて、脂環構造含有重合体で形成された面に細胞が接着するように培養する。播種当初、脂環構造含有重合体で形成された面に接着していた細胞は、数日で自然に剥離して浮遊状態で生存するようになる。即ち、この浮遊状態で生存する細胞が、浮遊培養に馴化した接着型細胞である。

本発明の方法により浮遊培養に馴化した接着型細胞は、そのまま継続して静置培養すると、細胞塊を形成することがあるが、通常の浮遊培養型システムで、揺動することで解離し、単独の浮遊培養に馴化した接着型細胞として用いることができる。

上記のように、本発明の培養方法は、接着型細胞であっても、浮遊状態で、高い密度で培養することができるため、当該細胞に核酸やタンパク質を産生させる際に、好ましく利用される。
例えば、タンパク質をコードする外来遺伝子を発現することのできる組み換え細胞の培養中に、当該細胞と脂環式構造含有重合体成形体とを接触させることにより、タンパク質を大量に産生させることができる。

こうして、脂環構造含有重合体成形体と接触した接着型細胞は、ＴＧＦ、ＨＧＦ及びＦＧＦ等の上皮間葉転換因子の転写量が増強され、また、Ｅ−カドヘリンの減少、Ｎ−カドヘリンとビメンチンの増加といった上皮間葉転換マーカーの転写量に変化が認められる。即ち、上述した通り、接着型上皮細胞を、脂環構造含有重合体成形体と接触した状態で培養することで、接着細胞に上皮間葉転換を誘導することができる。
即ち、脂環構造含有重合体成形体は、上皮間葉転換剤として機能するものである。脂環構造含有重合体成形体が培養容器である場合、特別な操作を要さず、本容器を用いて培養するだけで上皮間葉転換を起こすことができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

〔製造例１〕組み換えＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の作製
抗生物質Ｇ４１８への耐性遺伝子を内包するベクターｐＬＸＲＮ（Ｃｈｌｏｎｔｅｃｈ社製）の発現遺伝子の挿入サイトに、ＥＰＯ遺伝子配列を挿入してプラスミドｐＬＸＲＮ−ＥＰＯを構築した。構築したプラスミドの中のＥＰＯ遺伝子は、その塩基配列解析を行うことにより確認した。
次に、構築したプラスミドｐＬＸＲＮ−ＥＰＯとプラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を、パッケージ細胞であるＧＰ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に形質導入することにより、ＥＰＯ遺伝子を含有するウイルス粒子を調製した。
なお、細胞へのプラスミドｐＬＸＲＮ−ＥＰＯの導入操作のための遺伝子導入試薬として、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用い、遺伝子導入操作は、メーカーのマニュアルに従った。

遺伝子導入操作を行ったＧＰ２９３Ｔ細胞を培養し、その培養上清を取り出して、フィルタ濾過し、８μｇ／ｍｌのポリブレン（ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）を加えることにより、ＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子を含む培養上清試料を調製した。
続いて、あらかじめ培養したＣＨＯ細胞試料の培養液を除いて、上記のＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子を含む培養上清試料を添加して、８時間培養維持することにより、ＥＰＯ遺伝子を保持したウイルス粒子をＣＨＯ細胞に感染させた。
８時間のインキュベーションの後に、ＣＨＯ細胞の培養培地に交換を行い、組み換えＥＰＯを産生するＣＨＯ細胞の培養操作を行った。

ウイルスの感染は、以下のようにゲノムＰＣＲにより確認した。まず、Ｉｎｓｔａｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、感染操作を行ったＣＨＯ細胞からゲノムを抽出し、ｐＬＸＲＮ−ＥＰＯ配列がゲノムに導入されていることをＰＣＲで確認した。ＰＣＲに用いたＰｒｉｍｅｒは、ｐＬＸＲＮ−ｓｅｑ−Ｆ（５’−ＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＴＧＡＡＴＴＴＴＴ）及びｐＬＸＲＮ−ｓｅｑ−Ｒ（ＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣ）とした。
ウイルスが感染し、ゲノムにＥＰＯ遺伝子が組み込まれたＣＨＯ細胞を選抜するため、抗生物質Ｇ４１８を培地に添加し、培養維持して、抗生物質Ｇ４１８耐性のＣＨＯ細胞を薬剤選択することにより、組み換えＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞（以下、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞という。）を選抜した。

〔実施例１〕
脂環構造含有重合体として、ノルボルネン系開環重合体水素化物〔ゼオネックス（登録商標）７９０Ｒ、日本ゼオン社製；以下、単に「７９０Ｒ」という〕を用いて、射出成形法により、直径３ｃｍのディッシュを作製した。以下、このディッシュを「７９０Ｒ製ディッシュ」という。７９０Ｒ製ディッシュの底面（細胞と接触する側）の水接触角は、９０°であった。
培養容器として７９０Ｒ製ディッシュを使用し、液体培地として１０％牛胎児血清を含むＨａｍ培地を使用して、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞を０．６２４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種して、５％ＣＯ_２雰囲気３７℃の条件で７日間培養を行った。
（細胞数の計測）
以下の方法により、浮遊している細胞と接着している細胞の数を計測した。
浮遊している細胞：培養上清を取り出して遠心処理した試料から、培地上清のみを除き、得られた細胞成分にトリパンブルーを作用させた。３分程度反応させた後、試料をトリパンブルー染色して生細胞及び死細胞数を計測した。計測には、細胞数計測装置を用いた。
接着している細胞：培養上清を除去し、生理食塩水で洗浄後、トリプシン処理によりディッシュから細胞を剥離した。剥離後、血清含培養培地で、これら細胞試料をトリパンブルー染色して生細胞及び死細胞数を計測した。計測は、同様に装置を用いた。

〔比較例１〕
実施例１において、７９０Ｒ製ディッシュに代えて、ポリスチレン製ディッシュ〔ファルコン（登録商標）ディッシュ（型番３５３００１、ベクトンデッキンソン社製）〕を使用したことを除き、実施例１と同様にして培養を行い、細胞数を計測した。

前培養工程である実施例１及び比較例１の結果を図１に示す。
前培養（播種後７日）期間に、７９０Ｒ製ディッシュでは、全細胞数に対して８割程度の浮遊しているＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞の出現が観察され、大部分が生細胞であった。一方、ポリスチレン製ディッシュでは、大部分は底面に接着している細胞であり、浮遊している細胞は、１個の細胞単独で存在し、かつ、大部分が死滅状態にあった。

〔実施例２〕
７９０Ｒ製ディッシュ前培養工程で出現した浮遊しているＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞及び未だ接着しているＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞をチューブに回収した。尚、ここで接着している細胞については、ディッシュ中の培養上清を除去し、生理食塩水で洗浄後、トリプシン処理によりディッシュから細胞を剥離・回収した。各々の細胞を滅菌チューブの中に混合し、遠心分離操作後に、培養培地を取り除き、細胞成分のみを新しい培地に懸濁した。細胞が懸濁された培地を浮遊培養装置（エイブル社製）の培養容器に添加し、浮遊培養を開始した。

〔比較例２〕
実施例２において、前培養工程でポリスチレン製ディッシュを使用したことを除き、実施例２と同様に操作を行い、浮遊培養を開始した。

浮遊培養工程である実施例２及び比較例２の結果を図２に示す。
７９０Ｒ製ディッシュで前培養したＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞は、ポリスチレン製ディッシュで前培養したＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞よりも増殖しており、７９０Ｒ製ディッシュで前培養した細胞試料は、浮遊細胞システムに馴化した試料であると考えられる。

更に、浮遊培養システムの試験から得られた細胞数計測結果から、実施例２及び比較例２の浮遊培養システムにおける細胞の増殖フェーズの培養１日目〜３日目（Ｄａｙ１−３）に関して、各々細胞試料の平均倍化時間を算出した。結果を図３に示す。
更に、比較のため、ポリスチレン製ディッシュで静置培養した、即ち接着状態で培養されている細胞の平均倍化時間も測定した。

図３に示されるように、ポリスチレン製ディッシュで静置培養した接着している細胞の平均倍化時間は１５．６時間であり、比較した中では最も早かった。ポリスチレン製ディッシュで前培養した細胞試料に比較して、７９０Ｒ製ディッシュで前培養した細胞試料は、平均倍化時間が早くなっており、７９０Ｒ製ディッシュで前培養した細胞試料は、浮遊培養に馴化した状態に変換されたと考えられる。

〔実施例３〕
実施例１と同様の方法により８日間培養後の培養容器中のＣＨＯ細胞と、比較例１と同様の方法により８日間培養後培養容器中のＣＨＯ細胞を回収し、回収した全細胞をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で溶解した。溶解した試料から、ＲＮＡを採取した。採取方法は製品マニュアルに従った。次いで、回収されたＲＮＡを、（ＨｉＳｅｑ（登録商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）で解析した。
実験はＮＧＳ解析条件を変更して２回実施した。両解析とも、ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ法で実施した。各々Ｒｅａｄ数は３０００万または５０００万程度であった。リファレンスとして、公開情報（ＧＣＦ＿０００２２３１３５．１＿ＣｒｉＧｒｉ＿１．０＿ｍａ．ｆａ．ｆａｉ）を用いた。
得られた転写量のデータを、（ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ、ＣＬＣ ｂｉｏ社製）にてＲＮＡ−Ｓｅｑを解析し、ｍＲＮＡの転写量をＲＰＫＭ値として数値化した。
得られたＲＰＫＭ値を、（ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ、ＣＬＣ ｂｉｏ社製）にてＥＤＧＥ解析し、７９０Ｒ製ディッシュで培養した細胞群の転写量と、ポリスチレン製ディッシュで培養した細胞群の転写量を比較し、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値（ポリスチレン製ディッシュでの転写量に対する７９０Ｒ製ディッシュでの転写量の比率）を得た。ここで、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値が正の整数であれば７９０Ｒ製ディッシュの転写量が多く、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値が負の整数であればポリスチレン製ディッシュの転写量が多いことになり、その絶対値が大きいほど、両者間での差が大きいことになる。
得られた結果を表１及び２に示す。

表１の結果から、７９０Ｒ製ディッシュで培養した細胞試料は、ポリスチレン製ディッシュで培養した細胞試料に比べて、上皮間葉転換誘導因子であるＴＧＦ、ＨＧＦ及びＦＧＦの転写量が増強されていることが分かる。

表２の結果から、７９０Ｒ製ディッシュで培養した細胞試料は、ポリスチレン製ディッシュで培養した細胞試料に比べて、上皮間葉転換マーカーであるＥ−カドヘリンとサイトケラチンが減少し、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、及びフィブロネクチンが増加していることが分かる。
表１及び２の結果は、本発明の方法により培養された細胞が、上皮間葉転換誘導されたことを示唆するものである。

Claims (13)

1. 外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞を、
   少なくとも細胞が接触する面が飽和ノルボルネン系重合体で形成されたノルボルネン系重合体成形体であって、飽和ノルボルネン系重合体の板状成形体、飽和ノルボルネン系重合体のシート状成形体、これらの成形体を構成部材の一部として含む容器、飽和ノルボルネン系重合体成形体で全体を構成された容器、及び、飽和ノルボルネン系重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器からなる群から選ばれる飽和ノルボルネン系重合体成形体の、飽和ノルボルネン系重合体部分と接触した状態で培養する工程を有する、浮遊培養に馴化した接着型細胞の調製方法。
2. 前記外来遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の接着型細胞の調製方法。
3. 前記接着型細胞が動物由来の細胞である、請求項１又は２に記載の接着型細胞の調製方法。
4. 前記動物由来の細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３に記載の接着型細胞の調製方法。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の接着型細胞の調製方法により、前記浮遊培養に馴化した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法。
6. 飽和ノルボルネン系重合体の板状成形体、飽和ノルボルネン系重合体のシート状成形体、これらの成形体を構成部材の一部として含む容器、飽和ノルボルネン系重合体成形体で全体を構成された容器、及び、飽和ノルボルネン系重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器からなる群から選ばれる飽和ノルボルネン系重合体成形体からなり、少なくとも、接着型細胞と接触する部分が、飽和ノルボルネン系重合体である、
   接着型細胞の浮遊培養馴化促進剤。
7. 接着型細胞を、
   少なくとも細胞が接触する面が飽和ノルボルネン系重合体で形成されたノルボルネン系重合体成形体であって、飽和ノルボルネン系重合体の板状成形体、飽和ノルボルネン系重合体のシート状成形体、これらの成形体を構成部材の一部として含む容器、飽和ノルボルネン系重合体成形体で全体を構成された容器、及び、飽和ノルボルネン系重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器からなる群から選ばれる飽和ノルボルネン系重合体成形体の、飽和ノルボルネン系重合体部分と接触させ、液体培地中に浮遊培養に馴化させる、前記飽和ノルボルネン系重合体成形体の使用。
8. 外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である接着型上皮細胞を、
   少なくとも細胞が接触する面が飽和ノルボルネン系重合体で形成されたノルボルネン系重合体成形体であって、飽和ノルボルネン系重合体の板状成形体、飽和ノルボルネン系重合体のシート状成形体、これらの成形体を構成部材の一部として含む容器、飽和ノルボルネン系重合体成形体で全体を構成された容器、及び、飽和ノルボルネン系重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器からなる群から選ばれる飽和ノルボルネン系重合体成形体の、飽和ノルボルネン系重合体部分と接触した状態で培養する工程を有する、上皮間葉転換の誘導方法。
9. 前記接着型上皮細胞が動物由来の細胞である、請求項８に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
10. 前記動物由来の細胞がＣＨＯ細胞である、請求項９に記載の上皮間葉転換の誘導方法。
11. 請求項８〜１０のいずれかに記載の上皮間葉転換の誘導方法により、上皮間葉転換した接着型細胞を培養することによる、外来遺伝子によってコードされた核酸又はタンパク質の生産方法。
12. 飽和ノルボルネン系重合体の板状成形体、飽和ノルボルネン系重合体のシート状成形体、これらの成形体を構成部材の一部として含む容器、飽和ノルボルネン系重合体成形体で全体を構成された容器、及び、飽和ノルボルネン系重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器からなる群から選ばれる飽和ノルボルネン系重合体成形体からなり、少なくとも、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である接着型上皮細胞と接触する部分が、飽和ノルボルネン系重合体である、
    前記接着型上皮細胞の上皮間葉転換誘導剤。
13. 少なくとも細胞が接触する面が飽和ノルボルネン系重合体で形成されたノルボルネン系重合体成形体であって、飽和ノルボルネン系重合体の板状成形体、飽和ノルボルネン系重合体のシート状成形体、これらの成形体を構成部材の一部として含む容器、飽和ノルボルネン系重合体成形体で全体を構成された容器、及び、飽和ノルボルネン系重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器からなる群から選ばれる飽和ノルボルネン系重合体成形体の、飽和ノルボルネン系重合体部分を、外来遺伝子を発現する遺伝子組み換えされた接着型細胞である接着型上皮細胞に接触させ、上皮間葉転換誘導させる、前記飽和ノルボルネン系重合体成形体の使用。

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