JP6986299B2 - 遺伝子変異特異性が増加したdna重合酵素およびその活性増加用pcrバッファー組成物 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1のアミノ酸配列で507番目アミノ酸残基の置換;および
(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列で536番目アミノ酸残基の置換、
(ii)配列番号1のアミノ酸配列で660番目アミノ酸残基の置換、
(iii)配列番号1のアミノ酸配列で536番目および660番目アミノ酸残基の置換、または
(iv)配列番号1のアミノ酸配列で536番目、587番目および660番目アミノ酸残基の置換;を含むDNA重合酵素を提供する。
a)一つ以上の鋳型;
b)一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマーまたは一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方とも;および
c)ヌクレオシドトリホスフェートと接触させることを含み、
前記一つ以上のマッチしたプライマーおよびミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその3’末端から7個までの塩基位置に非標準(non−canonical)ヌクレオチドを含む、一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはSNPを生体外(in vitro)で検出する方法を提供する。
a)一つ以上のバッファー;
b)二本鎖DNAに結合する定量化のための試薬;
c)重合酵素遮断抗体;
d)一つ以上の対照値または対照配列;および
e)一つ以上の鋳型;をさらに含むことができる。
(a)配列番号1のアミノ酸配列で507番目アミノ酸残基の置換;および
(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列で536番目アミノ酸残基の置換、
(ii)配列番号1のアミノ酸配列で660番目アミノ酸残基の置換、
(iii)配列番号1のアミノ酸配列で536番目および660番目アミノ酸残基の置換、または
(iv)配列番号1のアミノ酸配列で536番目、587番目および660番目アミノ酸残基の置換。
(a)配列番号1のアミノ酸配列で507番目アミノ酸残基の置換;および
(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列で536番目アミノ酸残基の置換、
(ii)配列番号1のアミノ酸配列で660番目アミノ酸残基の置換、
(iii)配列番号1のアミノ酸配列で536番目および660番目アミノ酸残基の置換、または
(iv)配列番号1のアミノ酸配列で536番目、587番目および660番目アミノ酸残基の置換;を含むDNA重合酵素に関するものである。
a)一つ以上の鋳型;
b)ヌクレオシドトリホスフェート;および
c)一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマーまたは一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方ともと接触させることを含み、前記一つ以上のマッチしたプライマーおよびミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその3’末端から7個までの塩基位置に非標準(non−canonical)ヌクレオチドを含む、一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはSNPを生体外(in vitro)で検出する方法を提供する。
(a)配列番号1のアミノ酸配列で507番目アミノ酸残基の置換;および
(b)(i)配列番号1のアミノ酸配列で536番目アミノ酸残基の置換、
(ii)配列番号1のアミノ酸配列で660番目アミノ酸残基の置換、
(iii)配列番号1のアミノ酸配列で536番目および660番目アミノ酸残基の置換、または
(iv)配列番号1のアミノ酸配列で536番目、587番目および660番目アミノ酸残基の置換。
Taq重合酵素の突然変異誘発
1−1.断片PCR
本実施例では、配列番号1のアミノ酸配列で536番目アミノ酸残基をアルギニンからリシンに置換されたTaq DNA重合酵素(以下「R536K」という)、660番目アミノ酸残基をアルギニンからバリンに置換されたTaq DNA重合酵素(以下「R660V」という)および536番目アミノ酸残基をアルギニンからリシンに置換され、660番目アミノ酸残基をアルギニンからバリンに置換されたTaq DNA重合酵素(以下「R536K/R660V」という)を下記のように製造した。
前記1−1で増幅した各断片を鋳型にして両末端のプライマー(Eco−FおよびXba−Rプライマー)を利用して全長を増幅した。反応条件は、表3および表4に示された通りである。
pUC19を下記表5の条件で37℃で4時間の間制限酵素EcoRI/XbaIで分解した後、DNAを精製し、精製されたDNAを表6の条件で37℃で1時間の間SAPを処理してベクターを準備した。
E507K変異の導入
2−1.断片PCR
前記実施例1で製造された「R536K」、「R660V」および「R536K/R660V」のTaq重合酵素活性をテストしてみた結果、活性が劣ることを確認し(データ不図示)、R536K、R660V、R536K/R660Vそれぞれに追加にE507K変異(配列番号1のアミノ酸配列で507番目アミノ酸残基をグルタミン酸からリシンに置換)を導入し、対照群として使用するために野生型Taq DNA重合酵素(WT)にもE507K変異を導入した。E507K変異が導入されたTaq DNA重合酵素の製造方法は、実施例1と同一である。
前記2−1で増幅した各断片を鋳型にして両末端のプライマー(Eco−FおよびXba−Rプライマー)を利用して全長を増幅した。反応条件は、表11に示された通りである。
本発明のDNA重合酵素を利用したqPCR実行
前記実施例2で収得した「E507K/R536K」、「E507K/R660V」および「E507K/R536K/R660V」変異をそれぞれ含むTaq重合酵素を使用してSNPを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、E507K変異を含む「E507K」 Taq重合酵素を使用した。
R587I変異の導入
4−1.断片PCR
実施例2で製造された「E507K/R536K/R660V」変異が導入されたTaqクローンにR587I変異(配列番号1のアミノ酸配列で587番目アミノ酸残基をアルギニンからイソロイシンに置換)を追加に導入するために、下記表18に記載されたプライマーを利用して図9(a)に示されたように、2個の断片をPCRで増幅した。反応条件は、表19に示された通りである。
Taqプラスミドベクター(E507K/R536K/R660V)は、表20の条件で37℃で4時間の間制限酵素KpnI/XbaIで分解した後、精製して(溶出:25ul)、分解された線状のベクターで準備した。その後、表21の条件でインフュージョンクローニング反応を37℃で15分の間行った後、E.coli DH5αまたはDH10βに形質転換してアンピシリンが含まれた培地で選別した。収得されたコロニーから準備されたプラスミドをシーケンシングしてR587I変異が導入されたTaq DNA重合酵素突然変異体(「E507K/R536K/R587I/R660V」)を収得した。
「E507K/R536K/R587I/R660V」Taq重合酵素を利用したqPCR実行
5−1.KRAS遺伝子のQ61H変異区分
前記実施例4で収得した「E507K/R536K/R587I/R660V」変異を含むTaq重合酵素を使用してKRAS遺伝子でQ61HのSNPを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、「E507K/R536K/R660V」変異を含むTaq重合酵素を使用した。
前記実施例4で収得した「E507K/R536K/R587I/R660V」変異を含むTaq重合酵素を使用してKRAS遺伝子でG13DのSNPを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、「E507K/R536K/R660V」変異を含むTaq重合酵素を使用した。
前記実施例4で収得した「E507K/R536K/R587I/R660V」変異を含むTaq重合酵素を使用してKRAS遺伝子でG13SのSNPを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、「E507K/R536K/R660V」変異を含むTaq重合酵素を使用した。
前記実施例4で収得した「E507K/R536K/R587I/R660V」変異を含むTaq重合酵素を使用してEGFR遺伝子でL858RのSNPを含む鋳型に対してミスマッチしたプライマーを延長するための能力が減少したか否かを確認した。対照群としては、「E507K/R536K/R660V」変異を含むTaq重合酵素を使用した。
反応バッファーのKCl濃度最適化
本実施例では、ミスマッチによる増幅を最大に遅延させながら、マッチによる増幅効率が減少しない状態の高いカチオン濃度を探すために、PCR反応バッファー内でKClの濃度を調節して最適なKCl濃度を確認した。
反応バッファーの(NH4)2SO4濃度最適化
本実施例では、前記実施例4の結果を基に、反応バッファー内KCl濃度を75mMに一定に固定した後、(NH4)2SO4の濃度を多様に変化させて最適な(NH4)2SO4濃度を確認した。プライマーは、表13に記載されたrs1408799−T特異的プライマーを使用し、qPCR条件(Applied Biosystems 7500 Fast)は、表14の条件で35サイクルを行い、反応条件は、表35、対照群反応バッファーの組成は、表36に示された通りである。
反応バッファーのTMAC追加および濃度最適化
本実施例では、反応バッファーにTMACを追加して最適な濃度を確認した。前記実施例6および7の結果を基に、反応バッファー内KClの濃度は、75mM、(NH4)2SO4の濃度は、5mMに一定に固定した後、TMACを多様な濃度に変化させて、適正なTMACの濃度を導き出した。
反応バッファーのKCl、(NH4)2SO4およびTMAC濃度最適化
本実施例では、前記実施例8で確認された結果を基に、E507K/R536K/R660V Taq重合酵素を使用して反応バッファー内最適なKCl、(NH4)2SO4およびTMAC濃度を確認した。
Claims (26)
- 配列番号1のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基507番目でグルタミン酸(E)がリシン(K)に置換され、アミノ酸残基536番目でアルギニン(R)がリシン(K)に置換され、およびアミノ酸残基660番目でアルギニン(R)がバリン(V)に置換されている、配列番号8のTaq重合酵素アミノ酸配列、または、
配列番号1のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基507番目でグルタミン酸(E)がリシン(K)に置換され、アミノ酸残基536番目でアルギニン(R)がリシン(K)に置換され、アミノ酸残基587番目でアルギニン(R)がイソロイシン(I)に置換され、およびアミノ酸残基660番目でアルギニン(R)がバリン(V)に置換されている、配列番号37のTaq重合酵素アミノ酸配列
を含むDNA重合酵素。 - 前記DNA重合酵素は、マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーを区別し、前記マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションされ、前記ミスマッチしたプライマーは、ハイブリダイゼーションされる標的配列に対してその3’末端に非標準ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項1に記載のDNA重合酵素。
- 前記DNA重合酵素は、マッチしたプライマーを含む標的配列の増幅がミスマッチしたプライマーを含む標的配列の増幅より低いCt値を示すことを特徴とする請求項1に記載のDNA重合酵素。
- 請求項1に記載のDNA重合酵素のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
- 請求項4に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項5に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項1に記載のDNA重合酵素を
a)一つ以上の鋳型;
b)一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマー、または一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方とも;および
c)ヌクレオシドトリホスフェートと接触させることを含む、一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはSNPを生体外(in vitro)で検出する方法であって、
前記一つ以上のマッチしたプライマー、前記一つ以上のミスマッチしたプライマー、または前記一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方は、標的配列とハイブリダイゼーションされることを特徴とする方法。 - 前記方法は、二本鎖特異的染料を利用した溶融温度分析をさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記方法は、リアルタイムPCR、標準PCR後のアガロースゲルでの分析、リアルタイムPCRを通した遺伝子変異特異的増幅または対立遺伝子−特異的増幅、テトラ−プライマー増幅−不応性突然変異システムPCRまたは等温増幅により行われることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載のDNA重合酵素を含む遺伝子変異またはSNP検出用組成物。
- 請求項10に記載の組成物を含むPCRキット。
- 前記PCRキットは、Competitive allele−specific TaqMan PCR(キャストPCR、登録商標名)、ドロプレットデジタルPCR(Droplet digital PCR)(登録商標名)、またはマスアレイ(MassARRAY)(登録商標名)に使用されることを特徴とする請求項11に記載のPCRキット。
- 一つ以上のマッチしたプライマー、一つ以上のミスマッチしたプライマー、または一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方ともをさらに含み、前記一つ以上のマッチしたプライマー、前記一つ以上のミスマッチしたプライマー、または前記一つ以上のマッチしたプライマーと一つ以上のミスマッチしたプライマーの両方は、標的配列とハイブリダイゼーションされることを特徴とする請求項11に記載のPCRキット。
- ヌクレオシドトリホスフェートをさらに含むことを特徴とする請求項11に記載のPCRキット。
- a)一つ以上のバッファー;
b)二本鎖DNAに結合する定量化のための試薬;
c)重合酵素遮断抗体;
d)一つ以上の対照値または対照配列;および
e)一つ以上の鋳型;をさらに含むことを特徴とする請求項11に記載のPCRキット。 - 25〜100mMのKCl;および
1〜15mMの(NH4)2SO4;を含み、最終pHが8.0〜9.0である、遺伝子変異特異的増幅効率が増加したDNA重合酵素の活性増加用PCRバッファー組成物;ならびに
請求項1に記載のDNA重合酵素を含む、遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。 - 前記KClの濃度は、60〜90mMであることを特徴とする請求項16に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。
- 前記(NH4)2SO4の濃度は、2.5〜8mMであることを特徴とする請求項16に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。
- 前記KClの濃度は、70〜80mMであり、前記(NH4)2SO4の濃度は、4〜6mMであることを特徴とする請求項16に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。
- 5〜80mMのTMAC(Tetra methyl ammonium chloride)をさらに含むことを特徴とする請求項16に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。
- 前記KClの濃度は、40〜90mMであることを特徴とする請求項20に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。
- 前記(NH4)2SO4の濃度は、1〜7mMであることを特徴とする請求項20に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。
- 前記TMACの濃度は、15〜70mMであり、前記KClの濃度は、50〜80mMであり、前記(NH4)2SO4の濃度は、1.5〜6mMであることを特徴とする請求項20に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。
- Tris・ClおよびMgCl2をさらに含むことを特徴とする請求項16に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。
- a)ヌクレオシドトリホスフェート;
b)二本鎖DNAに結合する定量化のための試薬;
c)重合酵素遮断抗体;
d)一つ以上の対照値または対照配列;および
e)一つ以上の鋳型;をさらに含むことを特徴とする請求項16に記載の遺伝子変異またはSNP検出用PCRキット。 - 請求項16に記載のPCRキットを利用して一つ以上の鋳型で一つ以上の遺伝子変異またはSNPを生体外(in vitro)で検出する方法。
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