JP6967810B2 - 肝癌の予防または治療用の薬学的組成物 - Google Patents

Description

本発明は、肝癌の予防または治療用の薬学的組成物に関する。

肝癌（Hepatocellular carcinoma、ＨＣＣ）は、世界の癌死亡原因の第２位の疾患である。ＨＣＣは、最近発症率が増加している少数の癌の一つである。

肝癌の一次治療法は外科的切除術であり、初期治療の段階で治癒的治療（curative treatment）が可能な患者は少数である。切除術（Resection）と経皮的切除術（percutaneous ablation）は、５年後の再発率が７０％に達し、生存率と密接な関係がある。

他の癌と同様に、ＨＣＣは多発性腫瘍の進行過程を特徴とする。損傷した肝組織は、初期段階で異型結節（dysplastic nodules、ＤＮｓ）と呼ばれる小さな結節性過増殖病変（small nodular hypercellular lesions）に進化する。この前癌性病変は、曖昧な結節形態の小さくてよく分化された肝細胞に発展した後、間質性形状と頻繁な微細血管への侵犯を特徴とする進行性肝細胞と定義される早期肝癌（ｅＨＣＣ）に進行する。多段階の肝癌の発生に関する現在の知識に基づいて、高リスク患者に対して密接に追跡調査が行われ、小さなサイズを有し、かつ原因が明らかになっていない一つの病変の数が増加することが画像診断により検知される。超音波誘導針生検は、この病変に対して行われる。がんと組織学的診断を受けると治療を受ける。しかし、ｅＨＣＣは、最小の異型性を示し、明確な侵襲的または破壊的な成長に欠けている。このため、肝病理学者でさえも再生結節、前がん病変および早期病変を区別することが困難な場合がしばしばある。この理由から、初期ＨＣＣの組織学的診断を標準化し、適切な治療を誘導する客観的な分子マーカーの発見が熱望されている。また、肝癌種の正確な診断と関連するバイオマーカーの発見は、肝癌種に進行する可能性のある前癌病変を確認し、外科的に切除可能な病変を決定するのに役立つので、医師が肝癌患者の手術範囲を設計するのに役立たせることができる。前癌病巣でのＨＣＣの発症可能性を予測する追加の分子マーカーの確認は、外科的切除術後の再発リスクがある患者を確認するのに役立たせることができる。

本研究では、肝病理学者が定義した段階的肝癌組織の臨床病理学的および遺伝子発現データを統合して、潜在的な原因遺伝子を職別するための遺伝子選別戦略を策定しようとした。これにより、初期段階のＨＣＣの原因と推定される１０個の遺伝子を選別することができた。

臨床的及び実験的な研究の結果によると、１０個の推定駆動遺伝子の中で、プロコラーゲン−リシン、２−オキソグルタル酸５−ジオキシゲナーゼ３（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ―ｌｙｓｉｎｅ、２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ５−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ３）、およびスプライシングファクター３ｂサブユニット４（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ ４）に対する障壁が前癌病巣でＨＣＣを示し、グリピカン３、グルタミンシンセターゼ（ｇｌｙｐｈｉｃａｎ ３、ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、および熱ショックタンパク質７０（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０）などの現在のＨＣＣ診断マーカートリオに比べて肝癌患者の大規模な集団でｅＨＣＣを診断することができた。

生体外実験と生体内腫瘍形成の分析結果により、ＢＡＮＦ１、ＰＬＯＤ３およびＳＦ３Ｂ４遺伝子の標的破壊は、ＨＣＣ細胞の腫瘍及び転移特性を抑制することを確認することができた。ＳＦＢ４の過度な過剰反応はｐ２７とＨＣＣ細胞でスラグ（Slug）を増強させ、悪性肝変換および増殖に寄与する上皮間葉転移（ＥＭＴ）を抑制し、細胞周期検査ポイントを阻害してスプライソソーム（spliceosome）の活動過剰を引き起こし、ＫＬＦ４腫瘍の成長を抑制する選択的スプライシングバリアントの生産を加速化することがわかった。

我々の結果は、新しい肝癌診断マーカーＢＡＮＦ１、ＰＬＯＤ３及びＳＦ３Ｂが肝腫瘍の形成で肝細胞の早期悪性形質転換に寄与し、肝悪性腫瘍の分子治療法における有望な標的であることを提示する。

本発明の目的は、初期の肝癌細胞で高発現される特異遺伝子をノックダウン（knockdown）させる肝癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供することにある。

１．配列番号５〜１５７の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、
配列番号１５８〜３１０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。

２．前記項目１において、
前記組成物は、配列番号５〜１２、１４〜１９、２１、２３、２４、２６、２８〜３４、３５〜３７、３９〜４１、４３、４５〜４７、４９〜５３、５５〜６０、６２〜７３、７５〜８１、８４〜８７、８９〜９８、１００〜１０２、１０５〜１１６、１１８〜１２８、１３０〜１５４、１５６、および１５７の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、
配列番号１５８〜１６５、１６７〜１７２、１７４、１７６、１７７、１７９、１８１〜１８７、１８８〜１９０、１９２〜１９４、１９６、１９８〜２００、２０２〜２０６、２０８〜２１３、２１５〜２２６、２２８〜２３４、２３７〜２４０、２４２〜２５１、２５３〜２５５、２５８〜２６９、２７１〜２８１、２８３〜３０７、３０９、および３１０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。

３．前記項目１において、
前記組成物は、配列番号５〜２８の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、
配列番号１５８〜１８１の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。

４．前記項目１において、
前記組成物は、配列番号２９〜５５の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、
配列番号１８２〜２０８の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。

５．前記項目１において、
前記組成物は、配列番号５６〜１２０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、
配列番号２０９〜２７３の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。

６．前記項目１において、
前記組成物は、配列番号１２１〜１５７の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、
配列番号２７４〜３１０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。

７．前記項目１〜６のいずれか１つにおいて、
前記ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、リポソーム、リポフェクタミン、デンドリマー、ミセル、多孔性シリカ粒子、アミノクレイ、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、グラフェン、酸化グラフェン、キトサン、デキストラン、ペクチン、二酸化マンガン２次元シート、ＰＶＡ、ゼラチン、シリカ、ガラス粒子、プロタミン、エクソソーム、ポリエチレンイミン、Ｎ−ブチルシアノアクリレート、ゼルフォーム、ゼラチン、エタノール、ナノクリスタル、ナノチューブ、炭素ナノ粒子、ヒアルロン酸、酸化鉄、ポリ乳酸、ポリブチルシアノアクリレート、アルブミン、リピド粒子、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルロニックアルギネート、ポリグリコリック−ポリアクチック酸、ポリジオキサノン、ポリグリコール酸−ｃｏ−カプロラクトン、ポリプロピレン、及びヒドロゲルからなる群より選択される少なくとも一つである担持体に担持された組成物。

８．前記項目７において、
前記担持体は、下記数式１の吸光度の比が１／２となるtが２０以上である多孔性シリカ粒子である組成物。
[数式１]
Ａ_ｔ／Ａ_０
（式中、Ａ_０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは、７．４であり、
Ａ_ｔは、Ａ_０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）

９．前記項目８において、
前記tは、４０以上である組成物。

１０．前記項目８において、
前記ｓｉＲＮＡは、配列番号２８、１１９および１３６の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなり、
前記ｄｓＲＮＡは、配列番号１８１、２７２および２８９からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる組成物。

１１．前記項目８において、
前記多孔性シリカ粒子は、親水性置換基または疎水性置換基を有する組成物。

１２．前記項目８において、
前記多孔性シリカ粒子は、アルデヒド基、ケト基、カルバメート基、スルフェート基、スルホネート基、アミノ基、アミン基、アミノアルキル基、シリル基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、アンモニウム基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、メチルホスホネート基、ポリエチレングリコール基、置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_３０のアルキル基、置換または非置換のＣ_３〜Ｃ_３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ_６〜Ｃ_３０のアリール基、およびＣ_１〜Ｃ_３０のエステル基からなる群より選択される少なくとも一つの親水性置換基を有する組成物。

１３．前記項目８において、
前記多孔性シリカ粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陽電荷または陰電荷を帯びる組成物。

１４．前記項目８において、
前記多孔性シリカ粒子は、外部表面および気孔内部が中性のｐＨで陽電荷を帯びる組成物。

１５．前記項目８において、
前記多孔性シリカ粒子は、平均直径が１００〜４００ｎｍであり、気孔直径が４〜３０ｎｍである組成物。

本発明の薬学的組成物は、初期の肝癌細胞で発現される遺伝子を特異的にノックダウンさせて肝癌の発症を防ぎ、肝癌細胞の転移と増殖を抑制することにより、肝癌の予防及び治療の効果を提供する。

図１は、実施例１のＨｅｐａ−１ｃ１ｃ７、ＳＮＵ−４４９細胞株に対して、表１１の配列を有するセンスＲＮＡ及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを、それぞれ実施例１−２または１−８の方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ トランスフェクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、各ｓｉＲＮＡが対応する指標因子の発現量をウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で測定した結果を示す図である。 図２は、実施例１−１のＳＮＵ−４４９細胞株に対して、表１２の配列を有するセンスＲＮＡ及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを、実施例１−２の方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ トランスフェクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、各ｓｉＲＮＡが対応する指標因子の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）反応および浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）反応を実施例１−５の方法により分析し、実施例１−６の方法によりスクラッチ創傷治癒（ｓｃｒａｔｃｈ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ）能力を分析した結果を示す図である。 図３（Ａ）は、実施例１のＳＮＵ−４４９細胞株に表１２の配列を有するセンスＲＮＡ及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを、実施例１−２の方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、各ｓｉＲＮＡが対応する指標因子の発現量と前記ＥＭＴ調節タンパク質の発現量を実施例１−９の方法により分析した結果を示す図である。図３（Ｂ）は、前記（Ａ）のトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した細胞（ｃｅｌｌ）を胸腺欠失マウス（athymic nude mice）の皮下に注入した後、肝腫瘍の大きさとマウスの生存率を分析した結果を示す図である。 図４（Ａ）は、表１３の配列を有するセンスＲＮＡ及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを実施例１−８の方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション（ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、その過程と超音波画像および時間経過による腫瘍の数を示す図である。図４（Ｂ）は、多孔性ナノ粒子に担持された前記ｓｉＲＮＡの各指標遺伝子の発現抑制レベルを、実施例１−９の方法により分析した結果を示す図である。 図５は、多孔性シリカ粒子の顕微鏡写真である。 図６は、多孔性シリカ粒子の顕微鏡写真である。 図７は、多孔性シリカ粒子の製造工程中の小気孔粒子の顕微鏡写真である。 図８は、小気孔粒子の顕微鏡写真である。 図９は、多孔性シリカ粒子の生分解性を確認できる顕微鏡写真である。 図１０は、円筒状の透過膜を備えたチューブである。 図１１は、多孔性シリカ粒子の時間経過による吸光度の減少の結果を示す図である。 図１２は、多孔性シリカ粒子の時間経過による粒径別の吸光度の減少の結果を示す図である。 図１３は、多孔性シリカ粒子の時間経過による気孔直径別の吸光度の減少の結果を示す図である。 図１４は、多孔性シリカ粒子の時間経過による環境のｐＨ別の吸光度の減少の結果を示す図である。 図１５は、多孔性シリカ粒子の時間経過による吸光度の減少の結果を示す図である。 図１６は、多孔性シリカ粒子の生理活性物質の放出を確認するチューブである。 図１７は、多孔性シリカ粒子に担持された生理活性物質の時間経過による放出程度を示す図である。 図１８は、多孔性シリカ粒子にｓｉＲＮＡを担持し、マウス内におけるｓｉＲＮＡの放出を確認した顕微鏡写真である。

本発明で使用される用語の定義は、以下の通りである。

「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉または遺伝子サイロンシンを媒介することができる核酸分子を意味する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できるので、効率のよい遺伝子のノックダウン方法または遺伝子治療の方法として提供される。ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相応する（corresponding）配列）と、アンチセンス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的な配列）とが互いに反対側に位置して二重鎖をなす構造を有することができる。また、ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補性（self−complementary）のセンス及びアンチセンス鎖を有する単一鎖の構造を有することができる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ同士にペアをなす二重鎖ＲＮＡの部分が完全に対をなすものに限定されず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）等によって対を成していない部分が含まれ得る。ｓｉＲＮＡの末端構造は、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉ（RNA interference）効果により抑制できるものであれば、平滑（blunt）末端または粘着（cohesive）末端のいずれも可能である。粘着末端構造としては、３’−末端突出構造と５’末端突出構造のいずれも可能である。また、ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補性のセンスとアンチセンス鎖との間に短いヌクレオチド配列（例えば、約５−１５ｎｔ）が挿入された形態を有することができる。この場合、ヌクレオチド配列の発現によって形成されたｓｉＲＮＡ分子は、分子内混成化によってヘアピン構造を形成することになり、全体としてはステム・アンド・ループ構造を形成することになる。このステム・アンド・ループ構造は、インビトロ（in vitro）またはインビボ（in vivo）でプロセシングされ、ＲＮＡｉを媒介できる活性のｓｉＲＮＡ分子を生成する。

「ｄｓＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡの前駆体分子であり、標的細胞のＤＩＣＥＲ酵素（リボヌクレアーゼＩＩＩ、Ribonuclease III）を含むＲＩＳＣ複合体と会合してｓｉＲＮＡに切断され、この過程でＲＮＡｉが発生する。ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも数ヌクレオチドだけ長い配列を有し、センス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相応する（corresponding）配列）とアンチセンス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的な配列）が互いに反対側に位置して二重鎖をなす構造を有することができる。

「核酸」とは、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、組織サンプルに存在する染色体、ミトコンドリア、ウイルス及び／又は細菌核酸を含む意味である。二本鎖核酸分子のいずれか１つ又は２つの鎖を含み、無損傷核酸分子の任意の断片または一部を含む。

「遺伝子」とは、タンパク質のコーディングまたは転写時、または他の遺伝子発現の調節時に機能的な役割を持つ任意の核酸配列またはその一部を意味する。遺伝子は、機能的タンパク質をコードするすべての核酸またはタンパク質をコードまたは発現する核酸の一部のみからなり得る。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始または終了領域、プロモーター配列、他の調節配列または遺伝子に隣接する特有の配列内に遺伝子を含むことができる。

用語「遺伝子発現」とは、一般的に生物学的活性のあるポリペプチドがＤＮＡ配列から生成され、細胞で生物学的活性を示す細胞プロセスを意味する。その意味で、遺伝子発現は、転写及び解読のプロセスを含むだけでなく、遺伝子または遺伝子産物の生物学的活性に影響を与えることができる転写後および解読後のプロセスを含む。前記プロセスは、ＲＮＡ合成、加工及び輸送だけでなく、ポリペプチドの合成、輸送、およびポリペプチドの解読後の変形を含むが、これらに限定されるものではない。タンパク質産物を暗号化しない遺伝子、例えば、ｓｉＲＮＡ遺伝子の場合に、「遺伝子発現」という用語は、前駆体ｓｉＲＮＡが遺伝子から生成されるプロセスを意味する。通常、前記プロセスは、タンパク質暗号遺伝子に対してＲＮＡポリメラーゼＩＩによって誘導される転写とは異なり、ｓｉＲＮＡ遺伝子の転写産物が解読されてタンパク質を生成しないが、転写と呼ばれる。それにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ遺伝子からの成熟ｓｉＲＮＡの生成は、その用語が本明細書に使用されるように「遺伝子発現」という用語によって含まれる。

用語「標的遺伝子（target gene）」とは、本願に開示される主題の方法および組成物を使用して調整するために標的とする遺伝子を意味する。このため、標的遺伝子は、その発現レベルがｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルにｓｉＲＮＡによって下向き調節される核酸配列を含む。同様に、用語「標的ＲＮＡ」または「標的ｍＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡが結合して標的遺伝子の発現の調節を誘導する標的遺伝子の転写体を意味する。

用語「転写（transcription）」とは、遺伝子の暗号配列に存在する構造情報のＲＮＡへの発現を誘導する遺伝子とＲＮＡポリメラーゼの相互作用を含む細胞プロセスを意味する。

「下向き調節（down−regulation）」という表現は、正常組織細胞に比べて、活性化された細胞で細胞内転写（gene transcription）または翻訳（gene translation）によって、特定の遺伝子のｍＲＮＡへの発現またはタンパク質への発現量が顕著に減少したことを意味する。

「治療」とは、有益な、または望ましい臨床的結果を得るためのアクセスを意味する。本発明の目的のために、有益な、または望ましい臨床的結果は、非限定的に、症状の緩和、疾患の範囲の減少、疾患状態の安定化（即ち、悪化しない）、疾患の進行の遅延化または緩徐化、疾患状態の改善または一時的緩和および軽減（部分的または完全な）、検出可能かまたは検出不可能かを含む。また、「治療」は、治療を受けていないときに予想される生存率と比較して生存率を伸ばすことを意味し得る。治療は、治療学的治療および予防的または予防措置方法のすべてを指す。前記治療は、予防される障害だけでなく、既に発生した障害において要する治療を含む。

「予防」とは、関連疾患の発症を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。本願の組成物が、初期症状、または示される前に投与した場合に関連疾患を予防できることは、当業者に自明であろう。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、配列番号５〜１５７の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、
配列番号１５８〜３１０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、ヒトを含む動物、例えば、サル（monkeys）、ブタ（pigs）、ウマ（horses）、ウシ（cows）、ヒツジ（sheeps）、イヌ（dogs）、ネコ（cats）、マウス（mice）、ウサギ（rabbits）などに由来するものであってもよく、好ましくは、ヒト由来のものであってもよい。

本発明のｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡは、それを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、本発明のｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡの一部塩基配列が、欠失（deletion）、置換（substitution）または挿入（insertion）によって変形されたが、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡと機能的に同じ作用をすることができる変異体（variants）を含む概念である。

本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、標準分子生物学技術、例えば、化学的合成方法または組換え方法を用いて分離または製造するか、又は市販のものを使用することができる。また、本発明の組成物は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡそのものだけでなく、細胞内で本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの発現率を増加させることができる他の物質、例えば化合物、天然物、新規タンパク質などを含むことができる。

なお、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、細胞内発現のためのベクターに含んで提供することができる。

本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、ＤＮＡ及びＤＥＡＥ−デキストラン（デキストランにジエチルアミノエチル基を導入した陰イオン交換体）の複合体、ＤＮＡ及び核タンパク質の複合体、ＤＮＡ及び脂質の複合体などの様々な形質転換技術を用いて細胞内に導入できる。そのために、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、細胞内への効率的な導入を可能にする送達体内に含まれたものであってもよい。前記送達体は、好ましくはベクターであり、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターのいずれも使用可能である。ウイルスベクター（viral vector）としては、例えば、レンチウイルス（lentivirus）、レトロウイルス（retrovirus）、アデノウイルス（adenovirus）、ヘルペスウイルス（herpes virus）およびアビポックスウイルス（avipox virus）ベクターなどを使用することができ、好ましくはレンチウイルスベクターであるが、これらに限定されるものではない。レンチウイルスは、レトロウイルスの一種であり、核膜孔（nucleopore）や完全な核膜への能動導入を可能にする事前−統合複合体（ウイルス「シェル（shell）」）の求核性により、***細胞だけでなく、未***細胞も感染させる特徴がある。

また、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含むベクターは、選別マーカーをさらに含むことが好ましい。前記「選別マーカー（selection marker）」とは、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡが導入された細胞の選別を容易にするためのものである。前記ベクターで使用できる選別マーカーとしては、ベクターの導入有無を容易に検出または測定できる遺伝子であれば特に限定されないが、代表的に薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカー、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ピューロマイシン（puromycin）、ネオマイシン（Neomycin：Neo）、ハイグロマイシン（hygromycin：Hyg）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（histidinol dehydrogenase gene：hisD）、及びグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（guanine phosphosribosyltransferase：Gpt）などがあり、好ましくは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）及びピューロマイシンマーカーを使用することができる。

本発明の組成物は、下記表１の配列番号５〜２８の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、下記表１の配列番号１５８〜１８１の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む。

下記表１の配列番号５〜２８の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、下記表１の配列番号１５８〜１８１の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡは、ヒトＢＡＮＦ１遺伝子のｖａｒｉａｎｔ１配列（配列番号１）をターゲットするものであり、ヒトＢＡＮＦ１遺伝子ｖａｒｉａｎｔ１の発現をＲＮＡｉにより抑制することにより、肝癌の予防または治療の効果を有する。なお、以下に示す表１〜４において、「Target sequence」は「標的配列」を、「Position in gene sequence」は「遺伝子配列の位置」を、「GC content」は「GC含有量」を、「Sense strand」は「センス鎖」を、「Antisense strand」は「アンチセンス鎖」を、それぞれ意味する。

本発明の組成物は、下記表２の配列番号２９〜５５の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、下記表２の配列番号１８２〜２０８の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む。

下記表２の配列番号２９〜５５の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、下記表２の配列番号１８２〜２０８の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡは、ヒトＢＡＮＦ１遺伝子のｖａｒｉａｎｔ２配列（配列番号２）をターゲットするものであり、ヒトＢＡＮＦ１遺伝子ｖａｒｉａｎｔ２の発現をＲＮＡｉにより抑制することにより、肝癌の予防または治療の効果を有する。

本発明の組成物は、下記表３の配列番号５６〜１２０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、下記表３の配列番号２０９〜２７３の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む。

下記表３の配列番号５６〜１２０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、下記表３の配列番号２０９〜２７３の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡは、ヒトＰＬＯＤ３遺伝子の配列（配列番号３）をターゲットするものであり、ヒトＰＬＯＤ３遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することにより、肝癌の予防または治療の効果を有する。

本発明の組成物は、下記表４の配列番号１２１〜１５７の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、下記表４の配列番号２７４〜３１０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む。

下記表４の配列番号１２１〜１５７の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、下記表４の配列番号２７４〜３１０の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡは、ヒトＳＦ３Ｂ４遺伝子の配列（配列番号４）をターゲットするものであり、ヒトＳＦ３Ｂ４遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することにより、肝癌の予防または治療の効果を有する。

本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、担持体に担持されたものであってもよく、担持体の種類は、ＲＮＡ分子を担持できるものであって当業界で公知のものであれば、特に制限されないが、例えば、リポソーム、リポフェクタミン、デンドリマー、ミセル、多孔性シリカ粒子、アミノクレイ、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、グラフェン、酸化グラフェン、キトサン、デキストラン、ペクチン、二酸化マンガン２次元シート、ＰＶＡ、ゼラチン、シリカ、ガラス粒子、プロタミン、エクソソーム、ポリエチレンイミン、Ｎ−ブチルシアノアクリレート、ゼルフォーム、ゼラチン、エタノール、ナノクリスタル、ナノチューブ、炭素ナノ粒子、ヒアルロン酸、酸化鉄、ポリ乳酸、ポリブチルシアノアクリレート、アルブミン、リピド粒子、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルロニックアルギネート、ポリグリコリック−ポリアクチック酸、ポリジオキサノン、ポリグリコール酸−ｃｏ−カプロラクトン、ポリプロピレン、及びヒドロゲルからなる群より選択される少なくとも一つであってもよく、好ましくは、高いＲＮＡ担持率、徐放性、生分解性などの利点を有する多孔性シリカ粒子であってもよい。

本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、多孔性シリカ粒子に担持されたものであってもよい。前記粒子は、シリカ（ＳｉＯ_２）素材の粒子であり、ナノサイズの粒径を有する。

前記多孔性シリカ粒子は、多孔性粒子であり、ナノサイズの気孔を有し、その表面及び／又は気孔内部に本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのような生理活性物質を担持することができる。

前記多孔性シリカ粒子は、生分解性粒子であり、生理活性物質を担持して体内に投与されたとき、体内で生分解されて生理活性物質を放出することができる。つまり、多孔性シリカ粒子が生分解されて生理活性物質が放出されるが、本発明に係る多孔性シリカ粒子は、体内で徐々に分解され、担持された生理活性物質に徐放性を持たせることができる。例えば、下記数式１の吸光度の比が１／２になるｔは、２０以上である。

[数式１]
Ａ_ｔ／Ａ_０
（式中、Ａ_０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは、７．４であり、
Ａ_ｔは、前記Ａ_０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）

前記数式１は、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。

前記数式１における吸光度Ａ_０、Ａ_ｔは、例えば円筒状の透過膜に多孔性シリカ粒子および懸濁液を入れ、透過膜の外部にも同じ懸濁液を入れて測定したものであり得る。

前記多孔性シリカ粒子は、生分解性であり、懸濁液中で徐々に分解され得る。直径５０ｋＤａは約５ｎｍに相当するものであり、生分解された多孔性シリカ粒子は、直径５０ｋＤａの透過膜を通過することができる。円筒状の透過膜は、６０ｒｐｍの水平攪拌下にあるので、懸濁液を均一に混合することができ、分解された多孔性シリカ粒子は、透過膜の外部に放出され得る。

前記数式１での吸光度は、例えば、透過膜の外部の懸濁液が新しい懸濁液に入れ替わる環境下で測定したものであり得る。懸濁液は、持続的に入れ替わるものであってもよく、一定期間ごとに入れ替わるものであってもよい。前記一定期間は、定期的または不定期的な期間であってもよい。たとえば、１時間〜１週間の範囲内で、１時間おき、２時間おき、３時間おき、６時間おき、１２時間おき、２４時間おき、２日おき、３日おき、４日おき、７日おき等に入れ替えることができるが、これらに限定されるものではない。

前記「吸光度の比が１／２となる」ということは、ｔ時間後の吸光度が初期吸光度の半分になるということであり、これは多孔性シリカ粒子の約半分が分解されたことを意味する。

前記懸濁液は緩衝溶液であってもよく、具体的には、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）およびＳＢＦ（疑似体液）からなる群より選択される１種以上であってもよく、より具体的にはＰＢＳであってもよい。

前記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは２０以上であり、例えばｔは２０〜１２０であってもよく、例えば、前記範囲内で２０〜９６、２０〜７２、３０〜７０、 ４０〜７０、５０〜６５などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／５となるｔが、例えば７０〜１４０であってもよく、例えば、前記範囲内で８０〜１４０、８０〜１２０、８０〜１１０、７０〜１４０、７０〜１２０、７０〜１１０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／２０となるｔが、例えば、１３０〜２２０であってもよく、例えば、前記範囲内で１３０〜２００、１４０〜２００、１４０〜１８０、１５０〜１８０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、測定される吸光度が０．０１以下となるｔが、例えば２５０以上、例えば、３００以上、３５０以上、４００以上、５００以上、１，０００以上などであってもよく、その上限は２，０００であってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子における前記数式１の吸光度の比とｔは、高い量の相関関係を有するものであり、例えばピアソン相関係数が０．８以上であってもよく、例えば０．９以上、０．９５以上であってもよい。

前記数式１のｔは、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。これは、例えば多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することによって調節できる。

例えば、粒子の表面積を増加させてｔを減少させるか、表面積を減少させてｔを増加させることができる。表面積は、粒子の直径、気孔の直径を調節することによって調節できる。また、表面及び／又は気孔内部に置換基を位置させ、多孔性シリカ粒子が環境（溶媒など）に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、多孔性シリカ粒子に生理活性物質を担持させ、生理活性物質と多孔性シリカ粒子間の親和度を増加させ、多孔性シリカ粒子が環境に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、粒子の製造時に表面をより緻密に製造してｔを増加させることもできる。前記に数式１のｔを調節できる様々な例を示したが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、例えば球状粒子であってもよいが、これに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、平均直径が例えば１００ｎｍ〜１，０００ｎｍであってもよく、例えば、前記範囲内で１００ｎｍ〜８００ｎｍ、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、１００ｎｍ〜４００ｎｍ、１００ｎｍ〜３００ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径が例えば１ｎｍ〜１００ｎｍであってもよく、例えば、前記範囲内で４ｎｍ〜１００ｎｍ、４ｎｍ〜５０ｎｍ、４ｎｍ〜３０ｎｍ、１０ｎｍ〜３０ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記のような大きな直径を有することにより、多量の生理活性物質を担持することができ、サイズの大きい生理活性物質の担持も可能となる。

前記多孔性シリカ粒子は、ＢＥＴ表面積が例えば２００ｍ^２／ｇ〜７００ｍ^２／ｇであってもよい。例えば、前記範囲内で２００ｍ^２／ｇ〜７００ｍ^２／ｇ、２００ｍ^２／ｇ〜６５０ｍ^２／ｇ、２５０ｍ^２／ｇ〜６５０ｍ^２／ｇ、３００ｍ^２／ｇ〜７００ｍ^２／ｇ、３００ｍ^２／ｇ〜６５０ｍ^２／ｇ、３００ｍ^２／ｇ〜６００ｍ^２／ｇ、３００ｍ^２／ｇ〜５５０ｍ^２／ｇ、３００ｍ^２／ｇ〜５００ｍ^２／ｇ、３００ｍ^２／ｇ〜４５０ｍ^２／ｇなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、ｇ当たりの体積が、例えば０．７ｍｌ〜２．２ｍｌであってもよい。例えば、前記範囲内で０．７ｍｌ〜２．０ｍｌ、０．８ｍｌ〜２．２ｍｌ、０．８ｍｌ〜２．０ｍｌ、０．９ｍｌ〜２．０ｍｌ、１．０ｍｌ〜２．０ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。ｇ当たりの体積が小さすぎると、分解速度が速くなりすぎることがあり、大きすぎると、製造が困難であるか、完全な形状を有しないことがある。

前記多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部に親水性置換基及び／又は疎水性置換基が存在し得る。例えば、表面及び気孔内部の両方に親水性置換基のみが存在するか、疎水性置換基のみが存在してもよく、表面または気孔内部のみに親水性置換基が存在するか、疎水性置換基が存在してもよく、表面に親水性置換基が、気孔内部に疎水性置換基が存在してもよく、その逆の場合も可能である。

前記多孔性シリカ粒子に担持された生理活性物質の放出は、主に粒子の分解によって行われるので、前記置換基の調節により生理活性物質の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、粒子自体の分解速度を調節して、生理活性物質の放出速度を調節することができる。また、生理活性物質は、粒子から拡散して放出されることもあるが、前記置換基の調節により生理活性物質の粒子への結合力を調節し、生理活性物質の放出を調節することができる。

また、難溶性（疎水性）生理活性物質との結合力を強化するために、気孔内部に疎水性置換基が存在し、使用、剤形化のし易さなどの側面で粒子の表面に親水性置換基が存在するようにするなどの処理も可能である。

親水性置換基としては、例えば、アルデヒド基、ケト基、カルバメート基、スルフェート基、スルホネート基、アミノ基、アミン基、アミノアルキル基、シリル基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、アンモニウム基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、メチルホスホネート基、ポリエチレングリコール基、置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_３０のアルキル基、置換または非置換のＣ_３〜Ｃ_３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ_６〜Ｃ_３０のアリール基、およびＣ_１〜Ｃ_３０のエステル基などが挙げられる。疎水性置換基としては、例えば、置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_３０のアルキル基、置換または非置換のＣ_３〜Ｃ_３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ_６〜Ｃ_３０のアリール基、置換または非置換のＣ_２〜Ｃ_３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ_１〜Ｃ_３０のエステル基、およびハロゲン含有基などが挙げられる。

前記「置換または非置換」における「置換」される作用基は、アルデヒド基、ケト基、カルバメート基、スルフェート基、スルホネート基、アミノ基、アミン基、アミノアルキル基、シリル基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、アンモニウム基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、メチルホスホネート基、及びポリエチレングリコール基からなる群より選択される少なくとも一つであってもよいが、これらに限定されない。

また、前記多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部が陽電荷及び／又は陰電荷に帯電したものであってもよい。例えば、表面及び気孔内部の両方が陽電荷に帯電されるか、陰電荷に帯電されてもよく、表面または気孔内部のみが陽電荷に帯電されるか、陰電荷に帯電されてもよく、表面が陽電荷、気孔内部が陰電荷に帯電されてもよく、その逆の場合も可能である。

前記帯電は、例えば、陽イオン性置換基または陰イオン性置換基が存在することによって行われたものであり得る。

陽イオン性置換基は、例えば、塩基性基としてアミノ基、その他の窒素含有基などであってもよく、陰イオン性置換基は、例えば、酸性基としてカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ_３Ｈ）、チオール基（−ＳＨ）などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

同様に、前記帯電によって前記置換基の調節により生理活性物質の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、粒子自体の分解速度を調節して、生理活性物質の放出速度を調節することができる。また、生理活性物質は粒子から拡散されて放出されることもあるが、前記置換基の調節により生理活性物質の粒子への結合力を調節し、生理活性物質の放出を調節することができる。

また、前記多孔性シリカ粒子は、その表面及び／又は気孔内部に前記の他に生理活性物質の担持、生理活性物質の標的細胞への移動、その他の目的のための物質の担持、またはその他の追加置換基の結合などのための置換基が存在してもよく、それに結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーなどをさらに含んでいてもよい。

前述した表面及び／又は気孔内部の置換基、電荷、結合物質などは、例えば、表面改質によって付加することができる。

前記表面改質は、例えば、導入しようとする置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができる。前記化合物は、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１つ以上有するものであり、例えば１〜３つを有することができ、アルコキシ基の結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があり得る。

前記多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程を経て製造したものであってもよく、必要に応じて、か焼（calcination）工程、表面改質工程などをさらに経て製造したものであってもよい。か焼及び表面改質工程をすべて経た場合は、か焼後に表面改質されたものであってもよい。

前記小気孔の粒子は、例えば、平均気孔直径が１ｎｍ〜５ｎｍである粒子であってもよい。

前記小気孔の粒子は、溶媒に界面活性剤とシリカ前駆物質を入れて攪拌および均質化して得ることができる。

前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ−ブチロラクトン、１，３−ジメチル−イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ−メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ−ジオキサン、Ｐ−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはメタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記溶媒において、水と有機溶媒の混合溶媒の使用時の割合は、例えば、水と有機溶媒を１：０．７〜１．５の体積比、例えば１：０．８〜１．３の体積比で使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記界面活性剤は、例えば、CTAB（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、TMABr（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）、TMPrCl（塩化ヘキサデシルトリメチルピリジニウム）、TMACl（塩化テトラメチルアンモニウム）などであってもよく、具体的には、CTABを使用することができる。

前記界面活性剤は、例えば、溶媒１リットル当たりに１ｇ〜１０ｇ、例えば、前記範囲内で１ｇ〜８ｇ、２ｇ〜８ｇ、３ｇ〜８ｇなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。

前記シリカ前駆物質は、溶媒に界面活性剤を添加して攪拌した後に添加することができる。シリカ前駆物質は、例えば、ＴＭＯＳ（テトラメチルオルソシリケート）であってもよいが、これに限定されるものではない。

前記攪拌は、例えば１０分〜３０分間行うことができるが、これに限定されるものではない。

前記シリカ前駆物質は、例えば溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ〜５ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ〜４ｍｌ、０．５ｍｌ〜３ｍｌ、０．５ｍｌ〜２ｍｌ、１ｍｌ〜２ｍｌなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて、触媒として水酸化ナトリウムをさらに使用することができるが、これは溶媒に界面活性剤を添加した後、シリカ前駆物質の添加前に撹拌しながら添加することができる。

前記水酸化ナトリウムは、例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を基準で溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ〜８ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ〜５ｍｌ、０．５ｍｌ〜４ｍｌ、１ｍｌ〜４ｍｌ、１ｍｌ〜３ｍｌ、２ｍｌ〜３ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記シリカ前駆物質の添加後に溶液を攪拌して反応させることができる。攪拌は、例えば２時間〜１５時間行うことができ、例えば、前記範囲内で３時間〜１５時間、４時間〜１５時間、４時間〜１３時間、５時間〜１２時間、６時間〜１２時間、６時間〜１０時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。攪拌時間（反応時間）が短すぎると、結晶核生成（nucleation）が不足することがある。

前記攪拌の後には、溶液を熟成（aging）させることができる。熟成は、例えば、８時間〜２４時間行うことができ、例えば、前記範囲内で８時間〜２０時間、８時間〜１８時間、８時間〜１６時間、８時間〜１４時間、１０時間〜１６時間、１０時間〜１４時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

その後、反応産物を洗浄及び乾燥して多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができるが、これは例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。

前記遠心分離は、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、例えば、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができ、具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。

前記有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ−ブチロラクトン、１，３−ジメチル−イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ−メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ−ジオキサン、Ｐ−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば、６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、例えば、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記洗浄は、遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。

前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば、２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。

前記乾燥は、例えば２０℃〜１００℃で行うことができるが、これらに限定されず、真空状態で行うこともできる。

その後、前記で得られた多孔性シリカ粒子の気孔を拡張する。気孔の拡張は、気孔膨張剤を用いて行うことができる。

前記気孔膨張剤としては、例えば、トリメチルベンゼン、トリエチルベンゼン、トリプロピルベンゼン、トリブチルベンゼン、トリペンチルベンゼン、トリヘキシルベンゼン、トルエン、ベンゼンなどを使用でき、具体的にはトリメチルベンゼンを使用できるが、これらに限定されるものではない。

また、前記気孔膨張剤としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミン（N，N−dimethylhexadecylamine、DMHA）を使用できるが、これに限定されるものではない。

前記気孔の拡張は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子を気孔膨張剤と混合し、加熱して反応させて行うことができる。

前記溶媒は、例えば、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、例えば、溶媒１リットル当たりに１０ｇ〜２００ｇ、例えば、前記範囲内で１０ｇ〜１５０ｇ、１０ｇ〜１００ｇ、３０ｇ〜１００ｇ、４０ｇ〜１００ｇ、５０ｇ〜１００ｇ、５０ｇ〜８０ｇ、６０ｇ〜８０ｇなどの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子は、溶媒中に均一に分散されているものであってもよく、例えば、溶媒に多孔性シリカ粒子を添加して超音波分散したものであってもよい。混合溶媒を使用する場合には、第１の溶媒に多孔性シリカ粒子を分散した後、第２の溶媒を添加したものであってもよい。

前記気孔膨張剤は、例えば、溶媒１００体積部に対して１０〜２００体積部、前記範囲内で１０〜１５０体積部、１０〜１００体積部、１０〜８０体積部、３０〜８０体積部、３０〜７０体積部などの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。

前記反応は、例えば１２０℃〜１８０℃で行うことができる。例えば、前記範囲内で１２０℃〜１７０℃、１２０℃〜１６０℃、１２０℃〜１５０℃、１３０℃〜１８０℃、１３０℃〜１７０℃、１３０℃〜１６０℃、１３０℃〜１５０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。

前記反応は、例えば２４時間〜９６時間行うことができる。例えば、前記範囲内で３０時間〜９６時間、３０時間〜９６時間、３０時間〜８０時間、３０時間〜７２時間、２４時間〜８０時間、２４時間〜７２時間、３６時間〜９６時間、３６時間〜８０時間、３６時間〜７２時間、３６時間〜６６時間、３６時間〜６０時間、４８時間〜９６時間、４８時間〜８８時間、４８時間〜８０時間、４８時間〜７２時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記例示した範囲内で時間および温度を調節して、反応が過剰せずに十分に行われるようにすることができる。例えば、反応温度が低くなると反応時間を増やしたり、反応温度が高くなると反応時間を短くしたりすることができる。反応が十分でないと、気孔の拡張が十分でないことがあり、反応が進行しすぎると、気孔の過剰拡張により粒子が崩壊することがある。

前記反応は、例えば、段階的に昇温して行うことができる。具体的には、常温から前記温度まで０．５℃／分〜１５℃／分の速度で段階的に昇温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分〜１５℃／分、３℃／分〜１５℃／分、３℃／分〜１２℃／分、３℃／分〜１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記反応後は、反応液を徐々に冷却させることができ、例えば、段階的に減温して冷却することができる。具体的には、前記温度から常温まで０．５℃／分〜２０℃／分の速度で段階的に減温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分〜２０℃／分、３℃／分〜２０℃／分、３℃／分〜１２℃／分、３℃／分〜１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記冷却後に反応産物を洗浄および乾燥し、気孔が拡張された多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。これは、例えば遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。

前記遠心分離は、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、例えば、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上、１０回以下、例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回などであってもよい。

前記有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができ、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、例えば、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。

前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。

前記乾燥は、例えば２０℃〜１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。

その後、得られた粒子は、か焼することができる。か焼は、粒子を加熱してその表面および内部をより緻密な構造にし、気孔を満たす有機物を除去する工程であり、例えば４００℃〜７００℃で３時間〜８時間、具体的には５００℃〜６００℃で４時間〜５時間行うことができるが、これらに限定されるものではない。

その後、得られた多孔性シリカ粒子は、表面改質することができる。

前記表面改質は、表面および／または気孔内部に行うことができる。粒子表面と気孔内部は、同じように表面改質してもよく、異なるように表面改質してもよい。

前記表面改質により粒子が帯電されるようにするか、または親水性及び／又は疎水性の性質を持つようにすることができる。表面改質は、例えば、導入しようとする親水性、疎水性、陽イオン性、陰イオン性などの置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができ、前記化合物は、例えばＣ１〜Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１個以上有するものであり、例えば１〜３個有することができ、アルコキシ基が結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、またはそれで置換された置換基があってもよい。

前記アルコキシシランを多孔性シリコン粒子と反応させると、シリコン原子と酸素原子との共有結合が形成され、アルコキシシランが多孔性シリコン粒子の表面及び／又は気孔内部と結合することができる。前記アルコキシシランは、導入しようとする置換基を有しているので、当該置換基を多孔性シリコン粒子の表面及び／又は気孔内部に導入することができる。

前記反応は、溶媒に分散した多孔性シリカ粒子をアルコキシシランと反応させて行うことができる。

前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ−ブチロラクトン、１，３−ジメチル−イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ−メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ−ジオキサン、Ｐ−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはトルエンを使用できるが、これらに制限されるものではない。

前記陽電荷での帯電は、例えばアミノ基、アミノアルキル基などの窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N−［3−（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１−（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1−（3−Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3−Aminopropyl）trimethoxysilane）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］アニリン（N−［3−（Trimethoxysilyl）propyl］aniline）、トリメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3−（methylamino）propyl］silane）、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3−（2−Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記陰電荷での帯電は、例えばカルボキシ基、スルホン酸基、チオール基などの酸性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3−Mercaptopropyl）trimethoxysilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記親水性の性質は、親水性基、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、チオール基、アンモニウム基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、ポリエチレングリコール基などを有するアルコキシシランと反応させて持たせることができる。具体的には、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N−［3−（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１−（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1−（3−Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3−Aminopropyl）trimethoxysilane）、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3−Mercaptopropyl）trimethoxysilane）、トリメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3−（methylamino）propyl］silane）、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3−（2−Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記疎水性の性質は、疎水性置換基、例えば、置換または非置換のＣ１〜Ｃ３０のアルキル基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ６〜Ｃ３０のアリール基、置換または非置換のＣ２〜Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１〜Ｃ３０のエステル基、ハロゲン含有基などを有するアルコキシシランと反応させて持たせることができる。具体的には、トリメトキシ（オクタデシル）シラン（Trimethoxy（octadecyl）silane）、トリメトキシ−ｎ−オクチルシラン（Trimethoxy−n−octylsilane）、トリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）、イソブチル（トリメトキシ）シラン（Isobutyl（trimethoxy）silane）、トリメトキシ（７−オクテン−１−イル）シラン（Trimethoxy（7−octen−1−yl）silane）、トリメトキシ（３，３，３−トリフルオロプロピル）シラン（Trimethoxy（3，3，3−trifluoropropyl）silane）、トリメトキシ（２−フェニルエチル）シラン（Trimethoxy（2−phenylethyl）silane）、ビニルトリメトキシシラン（Vinyltrimethoxysilane）、シアノメチル（Cyanomethyl）、［３−（トリメトキシシリル）プロピル］トリチオカーボネート（［3−（trimethoxysilyl）propyl］trithiocarbonate）、（３−ブロモプロピル）トリメトキシシラン（（3−Bromopropyl）trimethoxysilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。

そのほか、表面改質により難溶性（疎水性）の生理活性物質との結合力を強化するために、気孔内部に疎水性置換基が存在し、使用、剤形化のし易さなどの側面で粒子の表面に親水性置換基が存在するようにするなどの処理も可能であり、表面に生理活性物質以外の他の物質を結合するための置換基が存在してもよい。

また、前記表面改質は、複合的に行うこともできる。例えば、外部表面または気孔内部に２回以上の表面改質を行うこともできる。具体的な例として、アミノ基が導入されたシリカ粒子にカルボキシル基を含む化合物をアミド結合で結合して陽電荷に帯電した粒子を、他の表面特性を持つように変化させることができるが、これに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば、加熱下で行うことができる。

前記加熱は、例えば８０℃〜１８０℃、例えば、前記範囲内で８０℃〜１６０℃、８０℃〜１５０℃、１００℃〜１６０℃、１００℃〜１５０℃、１１０℃〜１５０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。

前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば４時間〜２０時間、例えば、前記範囲内で４時間〜１８時間、４時間〜１６時間、６時間〜１８時間、６時間〜１６時間、８時間〜１８時間、８時間〜１６時間、８時間〜１４時間、１０時間〜１４時間などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。

前記反応温度、時間、そして表面改質に使用される化合物の量などは、表面改質しようとする程度によって選択できる。生理活性物質の親水性、疎水性、電荷の程度によって反応条件を変えて多孔性シリカ粒子の親水性、疎水性、電荷の程度を調節することにより、生理活性物質の放出速度を調節することができる。例えば、生理活性物質が中性のｐＨで強い陰電荷を帯びる場合には、多孔性シリカ粒子が強い陽電荷を帯びるようにするために、反応温度を高くしたり、反応時間を長くしたり、化合物の処理量を増やすことができるが、これらに制限されるものではない。

また、前記多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造、気孔の拡張、表面改質、気孔内部の改質工程を経て製造されたものであってもよい。

小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程は前述通りの工程によって行うことができ、小気孔の粒子の製造後、そして気孔拡張工程の後に洗浄及び乾燥工程を行うことができる。

必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。これは例えば遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。

前記遠心分離は、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、具体的には、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記小気孔の粒子の製造後の洗浄は、先に例示した範囲内の方法／条件で行うことができるが、これらに限定されるものではない。

前記気孔拡張後の洗浄は、先の例示よりは緩和された条件で行うことができる。例えば、洗浄を３回以内で行うことができるが、これに限定されるものではない。

前記表面改質と気孔内部改質のそれぞれは、前述の工程によって行うことができる。表面改質と気孔内部改質の順に工程を行うことができ、前記二つの工程の間に粒子の洗浄工程をさらに行うことができる。

前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張の後に洗浄をより緩和された条件で行う場合、気孔内部には粒子製造、気孔拡張に使用された界面活性剤などの反応液が満たされており、表面改質時に気孔内部が改質されずに、表面だけが改質され得る。その後、粒子を洗浄すると、気孔内部の反応液が除去され得る。

前記表面改質と気孔内部改質工程との間の粒子の洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。

前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、具体的には、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液をそのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。

前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。

前記乾燥は、例えば２０℃〜１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。

本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのような生理活性物質は、多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に担持することができる。

前記担持は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子と生理活性物質を混合して行うことができる。

前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができる。

また、前記溶媒として、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＳＢＦ（疑似体液）、ホウ酸緩衝食塩水（Borate−buffered saline）、トリス緩衝食塩水（Tris−buffered saline）などを使用することもできる。

前記多孔性シリカ粒子と生理活性物質との割合は、特に限定されず、例えば重量比が１：０．０５〜０．８、例えば、前記範囲内で１：０．０５〜０．７、１：０．０５〜０．６、１：０．１〜０．８、１：０．１〜０．６、１：０．２〜０．８、１：０．２〜０．６などであってもよい。

前記多孔性シリカ粒子に担持された本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのような生理活性物質は、延長された時間をかけて段階的に放出され得る。このような遅い放出は、連続性または非連続性、線形または非線形であってもよく、多孔性シリカ粒子の特徴及び／又はそれと生理活性物質との相互作用に起因して異なり得る。

前記多孔性シリカ粒子に担持された生理活性物質は、多孔性シリカ粒子が生分解されながら放出されるが、本発明に係る多孔性シリカ粒子は徐々に分解され、担持された生理活性物質が徐放的に放出されるようにすることができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することで調節できるが、これらに限定されるものではない。

また、前記多孔性シリカ粒子に担持された生理活性物質は、多孔性シリカ粒子から離脱して拡散しながら放出されることもある。これは多孔性シリカ粒子と生理活性物質、生理活性物質の放出環境との関係に影響を受けるものであるところ、これを調節して生理活性物質の放出を調節することができる。例えば、表面改質によって多孔性シリカ粒子の生理活性物質との結合力を強化または弱化させることによって調節することができる。

より具体的な例として、担持された生理活性物質が難溶性（疎水性）である場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部が疎水性置換基を有して多孔性シリカ粒子と生理活性物質との結合力が増加したものであってもよく、これにより、生理活性物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が疎水性置換基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。

本明細書で「難溶性」とは、（水に対して）不溶性（insoluble）、実質的に不溶性（practically insoluble）、またはごくわずかの可溶性（only slightly soluble）を含む意味である。これは「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」１８^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（USP、Remington、Mack Publishing Company発行）に定義されている用語である。

前記難溶性の生理活性物質は、例えば１気圧、２５℃での水溶解度が１０ｇ／Ｌ未満、具体的には５ｇ／Ｌ未満、より具体的には１ｇ／Ｌ未満であってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記担持された生理活性物質が水溶性（親水性）である場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部が親水性置換基を有して多孔性シリカ粒子と生理活性物質との結合力が増加したものであってもよく、これにより生理活性物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が親水性置換基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。

前記水溶性生理活性物質は、例えば１気圧、２５℃での水溶解度が１０ｇ／Ｌ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

前記担持された生理活性物質が電荷を帯びる場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部がその逆の電荷に帯電して多孔性シリカ粒子と生理活性物質との結合力が増加したものであってもよく、これにより生理活性物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が酸性基または塩基性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。

具体的には、前記生理活性物質が中性のｐＨで陽電荷を帯びるものであれば、粒子の表面及び／又は気孔内部が中性のｐＨで陰電荷に帯電するものであってもよい。これにより、多孔性シリカ粒子と生理活性物質との結合力が増加して生理活性物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子がカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ_３Ｈ）などの酸性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。

また、前記生理活性物質が中性のｐＨで陰電荷を帯びるものであれば、粒子の表面及び／又は気孔内部が陽電荷に帯電するものであってもよく、これにより多孔性シリカ粒子と生理活性物質との結合力が増加して生理活性物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子がアミノ基、その他窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。

前記生理活性物質は、必要な治療の種類、放出環境、使用される多孔性シリカ粒子に依存して、例えば７日〜１年またはそれ以上の期間にわたって放出され得る。

また、前記多孔性シリカ粒子は、生分解性で１００％分解され得るので、これに担持された生理活性物質は１００％放出され得る。

本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化することができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。液状溶液に製剤化される組成物における薬学的に許容可能な担体は、滅菌および生体に適したものであり、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１つの成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。

本発明の組成物は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを有効成分として含むいずれの剤型にも適用可能であり、経口用または非経口用の剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔（oral）、直腸（rectal）、鼻腔（nasal）、局所（topical；頬及び舌下を含む）、皮下、膣（vaginal）または非経口（parenteral；筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適したもの、あるいは吸入（inhalation）または注入（insufflation）による投与に適した形態を含む。

本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。有効容量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定できる。本発明の組成物は、個々の治療剤として投与しても、他の治療剤と併用して投与してもよい。また、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。

本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食物、投与時間、投与方法、***率および疾患の重症度などによってその範囲が非常に多様である。適正な投与量は、例えば、患者の体内に蓄積された薬物の量及び／又は使用される本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの具体的な効能程度によって異なり得る。一般的に、イン・ビボ動物モデル及びイン・ビトロで効果的なものと測定されたＥＣ５０に基づいて計算することができ、例えば、体重１ｋｇ当たりに０．０１μｇ〜１ｇであってもよい。日、週、月、または年の単位期間に、単位期間当たりの一回または数回に分けて投与してもよく、若しくはインフュージョンポンプを用いて長期間連続して投与してもよい。反復投与の回数は、薬物の体内滞在時間、体内薬物濃度などを考慮して決定する。疾患の治療経過によっては、治療された後でも再発防止のために組成物を投与することができる。

本発明の組成物は、肝癌の治療に関連して同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上、または有効成分の溶解性及び／又は吸収性を維持／増加させる化合物をさらに含有することができる。また必要に応じて、化学治療剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、及び／又は免疫調節剤などをさらに含むことができる。

また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように、当業界で公知の方法を用いて剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態であってもよい。

以下、具体的な実施例を挙げて本発明を詳細に説明することにする。

実施例１．実験材料及び方法
１．細胞培養
ヒト肝癌細胞株（ＳＮＵ−４４９）およびマウスＨｅｐａ−１ｃ１ｃ７肝癌細胞株は、韓国細胞株銀行（ソウル、大韓民国）から得た。すべての細胞株は、加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，FBS、Lonza）および１００単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen社、Carlsbad、CA）を含有するＥＭＥＭ（American Type Culture Collection、Manassas、VA）、ＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭ培地（Lonza、Walkersville、MD）で培養された。

２．siRNA、dsRNAの合成及びトランスフェクション（Transfection）
本実験で使用されるｓｉＲＮＡ及びｄｓＲＮＡは、Ｌｅｍｏｎｅｘ（ソウル、大韓民国）によって合成された。ｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｃ−（Ｋ）−ＤＹＫプラスミド内の遺伝子ＯＲＦ配列（BANF1：NM_003860、PLOD3：NM_001084、SF3B4：NM_005850）をサブクローニングするヒトのＢＡＮＦ１、ＰＬＯＤ３、ＳＦ３Ｂ４発現プラスミドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ（Piscataway、NJ、USA）から購入した。形質注入はメーカーのマニュアルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Invitrogen）を用いて行った。

３．RNA、DNA extraction、RT−PCR and qRT−PCR
氷結組織および細胞から総ＲＮＡがトリゾール試薬（invitrogen）を用いて分離された。１μｇの総ＲＮＡがＴｅｔｒｏ ｃＤＮＡ合成キット（Bioline、London、UK）を用いて、メーカーのマニュアルに従ってｃＤＮＡに逆転写された。ＲＴ−ＰＣＲ反応がｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Enzynomics、大田市、大韓民国）で行われ、検出はＧｅｌ Ｄｏｃ ＸＲイメージシステム（Bio−Rad、Hercules、CA）内のエチジウムブロマイドを用いた。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ＳＹＢＲ Ｎｏ−ＲＯＸ Ｋｉｔ（Bioline）で行われ、ｉＱ^ＴＭ−５（Bio−Rad）によってリアルタイムモニターされた。３回繰り返し実験からの平均Ｃｔ（threshold cycle）が、計算のために用いられた。正常化された遺伝子発現が相対定量化方法を用いて決定された。結果は３回繰り返し実験の平均値で表現された。組織及び細胞からの誘電体ＤＮＡは、マニュアルに従ってＤＮＡｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて分離された。コピー数変異分析（copy number variation analysis）のために、ＳＦ３Ｂ４誘電体ＤＮＡ領域が２０対（非腫瘍及び腫瘍）ＨＣＣ組織からエクソン−１からイントロン−１までのプライマーセットでＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ_０００００１．１１の誘電体配列によって増幅された。ｑＲＴ−ＰＣＲは、前述の通りに行われ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）がｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いられた。ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマー配列は、表５に示す。

４．細胞成長および増殖アッセイ（Cell Growth and Proliferation assay）
細胞成長の分析のために、細胞株は３０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅの１２ウェルプレートに供給された。形質注入または阻害治療の後に、細胞は、２４時間ごとに３７℃で１時間の間０．５ｍｇ／ｍＬの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）と共に培養された。ホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌ）をＤＭＳＯに溶かし、ＶＩＣＴＯＲ３^ＴＭ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（PerkinElmer、Boston、MA）を用いて、５７０ｎｍにおける吸光度を読み取った。

細胞増殖の分析のために、細胞株は２４ウェルプレートに３０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅに供給された。形質注入の後に、細胞は、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（５−ｂｒｏｍｏ−２'−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ，BrdU）試薬で２時間処理され、常温で３０分間固定された。細胞は、常温で１時間抗ＢｒｄＵ抗体と共に培養された。結合していない抗体は、洗浄バッファ（washing buffer）によって除去された。西洋ワサビペルオキターゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）２次抗体が各ウェルに添加された。基質溶液が添加され、反応はストップ溶液で３０分後に停止された。最終産物は、ＶＩＣＴＯＲ３^ＴＭ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（PerkinElmer）によって４９０ｎｍで定量化された。

５．細胞運動性および浸潤アッセイ（Cell motility and invasion assay）
試験管内の細胞運動性および浸潤の分析のために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔｓ（BD Biosciences）を用いた。侵入分析のコーティングのために、コーティングバッファ（0.01 M Tris, 0.7% NaCl, pH 8.0）でマトリゲル（BD Biosciences）を０．３ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、１００μｌのマトリゲルを細胞培養インサートの上部区画にコーティングした。３７℃で１時間培養した後、細胞培養インサートをシードする準備が完了した。ｓｉ−ＳＦ３Ｂ４形質注入の後に、細胞は、５％ＦＢＳが化学誘引物質として存在するセラム−フリー培地の細胞培養インサート内に適切にシードされた（0.5×10⁵ cells/well for the motility assay、1×10⁵ cells/well for the invasion assay）。３７℃で６時間（migration assay）または１２時間（invasion assay）培養した後、移動または侵入された細胞は、Ｄｉｆｆ―Ｑｕｉｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（Sysmex、Japan）を用いて染色された。細胞を２００倍の倍率でＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００倒立顕微鏡（inverted microscope）（Zeiss、Jena、Germany）で撮影した。細胞は、３つのランダムな視界で列挙された。

６．創傷治癒アッセイ（Wound healing assay）
形質注入細胞は６ウェルプレートのウェル内に供給された。１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅでは、マイクロピペットの先端（ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ ｔｉｐ）を用いてスクラッチが同一の層上に作られた。傷の同じ領域の写真がＩＸ７０ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（オリンパス、東京、日本）を用いて、０時間及び２４時間後に撮られた。

７．マウス肝癌モデル
異種移植（xenograft）腫瘍形成の評価のために、１×１０^７個の形質注入された細胞が０．２ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および３０％（v／v）マトリゲルマトリックス（BD Biosciences）に混合された。細胞懸濁液は、６週齢のＢａｌｂ／ｃ−ｎｕｄｅ ｍｉｃｅに皮下注射された。マウスは注射部位での腫瘍形成を確認するために、週２回検査された。腫瘍体積は、０．５×長さ（Ｌ）×幅^２（Ｗ^２）で算出した。各実験群は、１０匹のマウスからなり、腫瘍の成長は、三直角の方向にキャリパスを用いて測定することにより定量化された。結果は、平均腫瘍体積および９５％信頼区間で表された。Ｈ−ｒａｓ１２Ｖ活性化同型遺伝形質転換マウスは、ユデヨル博士（Laboratory of Human Genomics、Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology、Daejeon、Korea）から提供された。形質転換マウスは、Ｈ−ｒａｓ１２Ｖ活性化された。オスのマウスは、自然に１５週齢からＨＣＣが発達し始めた。外科的に３５週齢の５匹のマウスから非腫瘍部位及びＨＣＣ ｍａｓｓを得、病理学的スコアリングによって３対のＨＣＣ組織を選別した。ジエチルニトロサミン（Diethylnitrosamine（DEN））がＨＣＣの導入のために使用された。

８．多孔性シリカ粒子トランスフェクション（Mesoporous nanoparticleTransfection)
ＢＡＮＦ１、ＰＬＯＤ３、ＳＦ３Ｂ４に特異的なｓｉＲＮＡが３ｎｍｏｌの８０μlＩｎＶｉＶｏｊｅｃｔｉｏｎＴＭ ＲＮＡｉ−ｎａｎｏ ｒｅａｇｅｎｔ（実施例１−１２（１）−２）−ｉｉの多孔性シリカナノ粒子、Cat．No．DHMSN−vivoRNA；Lemonex Inc.，Seoul、Korea）に担持され、２００μlＰＢＳに準備された。ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡとナノ粒子の混合物は、９週間から２３週間まで毎週尾静脈注射によってＨ−ｒａｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ＨＣＣマウスモデルに注射された。超音波機械（Affiniti 50、Philips、Seoul、Korea）で１７、１９、２１週に超音波検査の写真を撮った。

９．ウエスタンブロッティング分析（Western blotting analysis）
細胞は、タンパク質抽出緩衝液（50mM HEPES、5mM EDTA、50mM NaCl、1％ Triton X−100、50mM NaF、10mM Na₂P₂O₇、1mM Na₃VO₄、100 x Halt protease inhibitor cocktail）で溶解させた。同じ量のタンパク質を含有する溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリビニリデンフッ化物（PVDF）膜（Bio−Rad）上に移した。ブロットを５％脱脂乳でブロッキングし、各抗体（表６）と共に培養した。

１０．統計的分析
生存曲線は、カプラン−マイヤー法（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｉｍｉｔ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて描かれ、生存曲線間の有意差は、ｌｏｇ―ｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いて決定された。すべての実験は３回以上行われ、すべてのサンプルは３回分析された。結果は、平均±標準偏差または平均の標準誤差で示した。実験群間の差の統計的有意性は、Ｇｒａｐｈｐａｄ^ＴＭ ７．０ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ−ｔｅｓｔｓにより評価された。統計的有意性は、ｐ＜０．０５で決定された。ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔ（2−sided）は、パラメータ間の関連を決定した。

１１．多孔性シリカ粒子（Mesoporous nanoparticle）の製造
（１）粒子１の製造
１）小気孔粒子の製造
２Ｌ丸底フラスコに蒸留水（ＤＷ）の９６０ｍＬとＭｅＯＨの８１０ｍＬを入れた。前記フラスコにＣＴＡＢを７．８８ｇ入れた後、攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨの４．５２ｍＬを素早く入れた。１０分間攪拌して均一な混合液を入れた後、ＴＭＯＳの２．６ｍＬを入れた。６時間攪拌して均一に混合した後、２４時間熟成した。
その後、前記反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、１．５ｇの粉末状の小気孔多孔性シリカ粒子（気孔平均直径２ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。

２）気孔の拡張
１．５ｇの小気孔多孔性シリカ粒子の粉末をエタノール１０ｍｌに添加して超音波分散し、水１０ｍｌ、ＴＭＢ（trimethyl benzene）１０ｍｌを添加して超音波分散した。
その後、前記分散液をオートクレーブに入れて１６０℃、４８時間反応させた。
反応は、２５℃で開始し、１０℃／分の速度で昇温して行った。その後、オートクレーブ内で１〜１０℃／分の速度で徐々に冷却した。
冷却した反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０〜１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。

３）か焼
前記２）で製造された多孔性シリカ粒子をガラスバイアル（ｖｉａｌ）に入れて５５０℃で５時間加熱し、反応終了後、常温に徐々に冷やして粒子を製造した。

（２）粒子２の製造
気孔拡張時の反応条件を１４０℃、７２時間に変更した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（３）粒子３の製造（１０Ｌスケール）
５倍大きな容器を使用し、各物質をいずれも５倍の容量で使用した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（４）粒子４の製造（粒径３００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（５）粒子５の製造（粒径５００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水８００ｍｌ、メタノール１，０１０ｍｌ、ＣＴＡＢ１０．６ｇを使用した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（６）粒子６の製造（粒径１，０００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水６２０ｍｌ、メタノール１，３８０ｍｌ、ＣＴＡＢ７．８８ｇを使用した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（７）粒子７の製造（気孔直径４ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを２．５ｍＬ使用した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（８）粒子８の製造（気孔直径７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを４．５ｍＬ使用した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（９）粒子９の製造（気孔直径１７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍＬ使用した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（１０）粒子１０の製造（気孔直径２３ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１２．５ｍＬ使用した以外は、実施例１−１１（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。

（１１）粒子１１の製造（二重改質）
１）小気孔粒子の製造
実施例１−１１（１）の方法と同様にして小気孔粒子を製造した。

２）気孔の拡張
実施例１−１１（１）−２）の方法と同様にして小気孔粒子をＴＭＢと反応させ、冷却し、遠心分離して上澄み液を除去した。その後、実施例１−１１（１）−２）と同じ条件で遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に３回洗浄した。その後、実施例１−１１（１）−２）と同じ条件で乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０〜１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。

３）表面改質
気孔が拡張された多孔性シリカ粒子０．８ｇ〜１ｇを５０ｍＬのトルエンに分散した後、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）を５ｍＬ入れて１２０℃で還流したまま１２時間加熱した。この過程は、前述の洗浄過程および乾燥過程を経た後、１ｍＬのトリエチレングリコール（PEG3，2−[2−（2−methoxyethoxy）ethoxy] acetic acid）と、１００ｍｇのＥＤＣ（1−Ethyl−3−（3−dimethylaminopropyl）carbodiimide）と、２００ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ＮＨＳ）を３０ｍＬのＰＢＳに分散して常温で攪拌したまま１２時間反応する。その後、生成物は、前記の洗浄および乾燥過程を経る。
気孔内部に、前のステップの反応液が残っているため、気孔内部は改質されない。

４）気孔内部の洗浄
表面改質された粒子粉末８００ｍｇを２Ｍ ＨＣｌ／エタノール４０ｍｌに溶かし、１２時間強く撹拌下に還流した。
その後、冷却された反応液を１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥して粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。

５）気孔内部の改質
ｉ）後述する実施例１−１２（２）−１）の方法と同様にして気孔内部にプロピル基を導入した。
ｉｉ）後述する実施例１−１２（２）−２）の方法と同様にして気孔内部にオクチル基を導入した。

１２．多孔性シリカ粒子の表面改質
（１）陽電荷での帯電
１）粒径３００ｎｍの粒子
実施例１−１１（４）の多孔性シリカ粒子を（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン）（（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ，ＡＰＴＥＳ）と反応して陽電荷に帯電した。
具体的には、１００ｍＬ丸底フラスコに１００ｍｇの多孔性シリカ粒子を１０ｍＬのトルエンに洗浄器（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で分散した。その後、１ｍＬのＡＰＴＥＳを添加し、４００ｒｐｍで攪拌し、１３０℃で攪拌して１２時間反応させた。
反応後、常温まで徐々に冷やし、１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、表面および気孔内部にアミノ基を有する粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。

２）粒径２００ｎｍの粒子
ｉ）実施例１−１１（１）の多孔性シリカ粒子を（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン）（（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ，ＡＰＴＥＳ）と反応して陽電荷に帯電し、ＡＰＴＥＳを０．４ｍｌ添加し、反応時間を３時間とした以外は、実施例１−１２（１）−１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉ）実施例１−１１（９）の多孔性シリカ粒子を（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン）（（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ，ＡＰＴＥＳ）と反応して陽電荷に帯電し、それ以外は、実施例１−１２（１）−１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉｉ）実施例１−１１（１０）の多孔性シリカ粒子を（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン）（（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ，ＡＰＴＥＳ）と反応して陽電荷に帯電し、それ以外は、実施例１−１２（１）−１）の方法と同様にして改質した。

（２）疎水性基の導入
１）プロピル基
実施例１−１１（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ（プロピル）シラン（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｒｏｐｙｌ）ｓｉｌａｎｅ）と反応して表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ（プロピル）シラン（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｒｏｐｙｌ）ｓｉｌａｎｅ）を０．３５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、実施例１−１２（１）の方法と同様にして改質した。

２）オクチル基
実施例１−１１（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ−ｎ−オクチルシラン（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ−ｎ−ｏｃｔｙｌｓｉｌａｎｅ）と反応して表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ−ｎ−オクチルシラン（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ−ｎ−ｏｃｔｙｌｓｉｌａｎｅ）を０．５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、実施例１−１２（１）の方法と同様にして改質した。

（３）陰電荷での帯電
１）カルボキシル基
実施例１−１１（１）の多孔性シリカ粒子を無水コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と反応して陰電荷に帯電し、トルエンの代わりにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を使用し、ＡＰＴＥＳの代わりに８０ｍｇの無水コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を添加して２４時間常温で攪拌し反応させ、洗浄時に蒸留水の代わりにＤＭＳＯを使用した以外は、実施例１−１２（１）−１）の方法と同様にして改質した。

２）チオール基
ＡＰＴＥＳの代わりにＭＰＴＥＳ１．１ｍＬを使用した以外は、実施例１−１２（１）−１）の方法と同様にして改質した。

３）スルホン酸基
実施例１−１２（３）−２）の多孔性シリカナノ粒子１００ｍｇを、１Ｍ硫酸水溶液１ｍＬと３０％過酸化水素水２０ｍＬに分散して常温で攪拌し、酸化反応を誘導してチオール基をスルホン酸基に酸化した。その後、実施例１−１２（１）−１）の方法と同様にして洗浄および乾燥した。

１３．多孔性シリカ粒子へのｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの担持
緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein、GFP）を標的とする２１ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｄｕｐｌｅｘ ｓｉＲＮＡを（株）バイオニアに合成依頼して購入した（配列：sense；5'−GGCUACGUCCAGGAGCGCACC−3'（配列番号324）、antisense；5' − UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU−3 '（配列番号325））。

実施例１−１２（１）−２）−ｉｉ）の多孔性シリカ粒子１０μｇと５０ｐｍｏｌの前記ｓｉＲＮＡを１ｘＰＢＳ条件で混ぜた後、常温で３０分間置いてロードされるようにした。

実施例２．本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの指標遺伝子発現抑制率の分析
前記実施例１の１〜３による実験方法に従い、本発明のｓｉＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの指標遺伝子（BANF1 variant 1、BANF1 variant 2、PLOD3、SF3B4）発現抑制率を分析した。その結果は下記表７〜１０に示す。

下記表７〜１０を参照すると、本発明のすべてのｓｉＲＮＡおよびｄｓＲＮＡは、前記指標遺伝子の発現を、優れた割合で抑えたことを確認することができる。

実施例３．多孔性シリカ粒子のＲＮＡ送達の優秀性の確認
実施例１のＨｅｐａ−１ｃ１ｃ７、ＳＮＵ−４４９細胞株に対して、下記表１１の配列を有するセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡをそれぞれ実施例１−２または１−８の方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、各ｓｉＲＮＡが対応する指標因子の発現量をウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で測定し、その結果を図１に示した。

図１を参照すると、表１１のｓｉＲＮＡをトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）したときに各指標因子を効果的に抑制したこと、特に多孔性シリカ粒子に担持してトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した場合に発現量の抑制レベルがより高いことを確認することができる。

実施例４．本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの肝癌細胞の転移能力抑制能の確認
１．細胞運動性および浸潤アッセイ（Cell motility and invasion assay）及び創傷治癒アッセイ（Wound healing assay）
実施例１−１のＳＮＵ−４４９細胞株に対して、下記表１２の配列を有するセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを、実施例１−２の方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、各ｓｉＲＮＡが対応する指標因子の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）反応および浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）反応を実施例１−５の方法によって分析し、実施例１−６の方法によってスクラッチ創傷治癒（ｓｃｒａｔｃｈ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ）能力を分析した。その結果は図２に示す。

図２（Ａ）を参照すると、前記表１２のｓｉＲＮＡをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、各指標因子をノックダウンさせた細胞（ｃｅｌｌ）は、対照群に比べて、顕著に遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）反応および浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）反応が低下することを確認することができる。また、図２（Ｂ）を参照すると、対照群に比べて、顕著に創傷治癒（ｗｏｕｎｄ―ｈｅａｌｉｎｇ）能力が低下することを確認することができる。これらの結果は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡが肝癌細胞の転移能力を抑制し、悪性に進行することを低下させることができることを示すものである。

２．ＥＭＴ調節タンパク質の抑制能の確認
肝癌細胞の転移と関連した代表的な上皮間葉転換（ＥＭＴ：epithelial−mesenchymal transition）調節タンパク質であるＮ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、スネイル（Ｓｎａｉｌ）及びスラグ（Ｓｌｕｇ）の発現を、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡが各指標因子の発現を抑制することで肝癌の転移を抑制できるかを確認するために、実施例１のＳＮＵ−４４９細胞株に前記表１２の配列を有するセンスＲＮＡ及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを、実施例１−２の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、各ｓｉＲＮＡが対応する指標因子の発現量と前記ＥＭＴ調節タンパク質の発現量を実施例１−９の方法によって分析し、その結果を図３（Ａ）に示した。

図３（Ａ）を参照すると、前記表１２のｓｉＲＮＡをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、各指標因子をノックダウンさせた細胞（ｃｅｌｌ）は、対照群に比べて有意に各指標因子の発現量はもちろん、上皮間葉転換（ＥＭＴ：epithelial−mesenchymal transition）調節タンパク質であるＮ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、スネイル（Ｓｎａｉｌ）及びスラグ（Ｓｌｕｇ）の発現量も抑制されることを確認できる。この結果は、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、各々の対応する指標因子の発現を選択的に抑制し、肝癌細胞の潜在的な転移能力を抑制できることを示すものである。

実施例５．本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの腫瘍成長抑制能の確認
実施例１のＳＮＵ−４４９細胞株に前記表１２の配列を有するセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを、実施例１−２の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）された際棒（ｃｅｌｌ）を胸腺欠失マウス（athymic nude mice）の皮下に注入した。その後、肝腫瘍の大きさとマウスの生存率を分析し、その結果を図３（Ｂ）に示した。

図３（Ｂ）の左側の画像を参照すると、ほとんどの実験群は、対照群に比べて肝腫瘍の大きさが顕著に小さいことを確認できる。これにより、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡによる指標因子のノックダウンが全体的な腫瘍の成長率を低下させ、平均的な腫瘍の体積を減少させることが分かる。

図３（Ｂ）の右側の画像を参照すると、実験群の生存率（tumor−free survival rate）が対照群の生存率よりも顕著に高いことが確認できる。より具体的には、前記トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）された際棒（ｃｅｌｌ）皮下注入後５０日が経過したとき、対照群では、１０匹のマウスのうち６匹のマウスで腫瘍が発見されたが、実験群では１０匹のマウスのうち１〜２匹のマウスで腫瘍が発見された。これにより、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡが肝腫瘍の成長を効果的に抑制できることが分かる。

実施例６．本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの肝癌予防効果の確認
下記表１３の配列を有するセンスＲＮＡ及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡを、実施例１−８の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション（ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、その過程と超音波画像、および時間の経過による腫瘍の数を図４（Ａ）に示す。また、多孔性ナノ粒子に担持された前記ｓｉＲＮＡの各指標遺伝子の発現抑制レベルを、実施例１−９の方法で分析して図４（Ｂ）に示す。

図４（Ａ）を参照すると、多孔性ナノ粒子のみを注入した対照群の場合には、注入後１７週間が経過して３〜４匹のマウスで大きな複数の肝腫瘍が発見されたのに対して、前記ｓｉＲＮＡを担持した多孔性ナノ粒子を注入した実験群の場合には、注入後１９週間が経過して２〜４匹のマウスで相対的に小さな肝腫瘍のみが発見されたことを確認できる。図４（Ｂ）を参照すると、対照群に比べて実験群の場合に、指標遺伝子の発現量をｉｎ ｖｉｖｏで顕著に減少させることをウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）の結果から確認することができる。この結果から、ｉｎ ｖｉｖｏでも、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、各指標因子の発現を効果的に抑制して肝腫瘍の生成抑制および肝癌の予防に優れた効果を発揮することが分かる。

実施例７．多孔性シリカ粒子の形成および気孔拡張の確認
実施例１−１１（１）〜（３）の粒子の小気孔粒子、製造された多孔性シリカ粒子を顕微鏡で観察し、小気孔粒子が均一に生成されているか、気孔が十分に拡張されて多孔性シリカ粒子が均一に形成されているかを確認した（図５〜８）。

図５は、１−１１（１）の多孔性シリカ粒子の写真、図６は、１−１１（２）の多孔性シリカ粒子の写真であり、気孔が十分に拡張された球状の多孔性シリカ粒子が均一に生成されたことを確認することができる。図７は１−１１（１）の小気孔粒子の写真、図８は、１−１１（１）と１−１１（３）の小気孔粒子の比較写真であり、球状の小気孔粒子が均一に生成されたことを確認することができる。

実施例８．多孔性シリカ粒子の生分解性の確認
実施例１−１１（１）の多孔性シリカ粒子の生分解性を確認するために、３７℃、ＳＢＦ（ｐＨ７．４）における生分解の程度を０時間、１２０時間、３６０時間に顕微鏡で観察し、それを図９に示した。
図９を参照すると、多孔性シリカ粒子が生分解され、３６０時間経過後はほぼすべてが分解されたことを確認することができる。

実施例９．多孔性シリカ粒子の吸光度比の測定
１．測定方法
時間別に下記数式１による吸光度比を測定した。

[数式１]
Ａ_ｔ／Ａ_０
（式中、Ａ_０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、
前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
Ａ_ｔは、前記Ａ_０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）

具体的には、多孔性シリカ粒子粉末５ｍｇをＳＢＦ（ｐＨ７．４）５ｍｌに溶かした。その後、５ｍｌの多孔性シリカ粒子溶液を、図１０に示す直径５０ｋＤａの気孔を有する透過膜に入れた。外部膜に１５ｍｌのＳＢＦを添加し、外部膜のＳＢＦは１２時間ごとに入れ替えた。多孔性シリカ粒子の分解は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌して行った。
その後、紫外・可視分光法（ＵＶ−ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によって吸光度を測定し、λ＝６４０ｎｍで分析した。

２．吸光度比の測定結果
実施例１−１１（１）の多孔性シリカ粒子の吸光度比を前記方法に従って測定し、その結果を図１１に示した。
図１１を参照すると、吸光度比が１／２となるｔは約５８時間であり、非常にゆっくりと分解されることが確認できた。

３．粒径別の測定結果
実施例１−１１（１）、（５）、（６）の多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定し、その結果を図１２に示した（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用）。
図１２を参照すると、粒径の増加によってｔが減少することが分かる。

４．気孔の平均直径別の測定結果
実施例１−１１（１）、（９）の多孔性シリカ粒子、そしてコントロールとして実施例１−１１（１）の小気孔多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定し、その結果を図１３に示した（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用）。
図１３を参照すると、実施例の多孔性シリカ粒子は、コントロールに比べてｔが非常に大きいことが確認できる。

５．ｐＨ別の測定結果
実施例１−１１（４）の多孔性シリカ粒子のｐＨ別吸光度を測定した。吸光度は、ＳＢＦで、そしてｐＨ２、５及び７．４のＴｒｉｓで測定し、その結果を図１４に示した。
図１４を参照すると、ｐＨ別にｔの差はあるが、いずれも吸光度の比が１／２になるｔは２４以上であった。

６．帯電
実施例１−１２（１）−１）の多孔性シリカ粒子の吸光度を測定し、その結果を図１５に示した（懸濁液と溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を使用）。
図１５を参照すると、陽電荷に帯電した粒子も吸光度の比が１／２になるｔは２４以上であった。

実施例１０．多孔性シリカ粒子に担持されたｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの放出
実施例１−１３のｓｉＲＮＡをロードした多孔性シリカ粒子１０μｌをＳＢＦ（ｐＨ７．４、３７℃）に再浮遊させ、気孔直径２０ｋＤａの透過膜（図１６のチューブ）に入れた。その後、透過チューブを１．５ｍｌのＳＢＦに浸漬した。ｓｉＲＮＡの放出は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌して行われた。

２４時間の前は、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間経過した時刻に放出溶媒を回収し、その後は２４時間おきに０．５ｍｌの放出溶媒を蛍光測定のために回収し、等量のＳＢＦを添加した。

前記ｓｉＲＮＡの蛍光強度は、６７０ｎｍの波長（λｅｘ＝６４７ｎｍ）で測定し、ｓｉＲＮＡの放出程度を測定した。その結果は、図１７に示す。

図１７を参照すると、ｓｉＲＮＡが５０％放出された時間は約４０時間以上であることを確認することができる。

実施例１１．多孔性シリカ粒子に担持されたｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの標的送達有無の確認
動物レベルにおけるｓｉＲＮＡ送達の研究に適したレベルの送達体の役割が可能なことを検証するために、マウス（ネズミ）を対象として生理活性物質の放出による腫瘍の抑制程度を確認した。

Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅオス（５週齢）を（株）オリエントバイオから購入し、滅菌された１ｘ ＰＢＳに３００万個のＨｅＬａ細胞（子宮頸がん細胞）を分散して、マウスに皮下注射異種移植（Xenograft）腫瘍を成長させた。７０ｍｍ^３サイズの固形化された腫瘍が確認されたとき、ＰＢＳ、ＦＩＴＣ−多孔性シリカ粒子（実施例１−１２（１）−２）−ｉｉ）の多孔性シリカ粒子）、実施例１−１３のｓｉＲＮＡをロードしたＦＩＴＣ−多孔性シリカ粒子（実施例１−１２（１）−２）−ｉｉ）の多孔性シリカ粒子）をそれぞれマウスの腫瘍内に注射投与した。投与直前、投与直後、そして４８時間後に蛍光強度および分布をＦＯＢＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Neo science、Korea）機器により観察した。

前記ＦＩＴＣ標識は、シリカ粒子５０ｍｇを１ｍＬ ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide））に分散し、ＦＩＴＣ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（N−hydroxycuccinimide））溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）２５μｇ（１０μｌ）を入れ、アルミホイルで光を遮断した状態で常温で１８時間反応させ、反応物を遠心分離（８，５００ｒｐｍ、１０分）で精製して上層液を捨てて、沈んだ粒子を集めてエタノールに均一に分散し、それをエタノール−蒸留水で交差して３〜４回繰り返して上層液にＦＩＴＣ色が見えなくなるまで精製して行った。

前記実験の結果を示す図１８を参照すると、ｃｏｎｔｒｏｌはＰＢＳ単独投与、実施例１−１３のｓｉＲＮＡは、実施例１−１３のｓｉＲＮＡ単独投与、ＦＩＴＣ−ＤＤＶはＦＩＴＣで標識した多孔性シリカ粒子の単独投与、ｃｏｍｐｌｅｘは実施例１−１３のｓｉＲＮＡがロードされ、ＦＩＴＣ標識された多孔性シリカ粒子の投与を示すものである。これを参照すると、粒子にロードして体内に送達されたｓｉＲＮＡは、活性を維持する期間がより長く、注入された部位でより長く滞在して、４８時間が経過しても強い蛍光を示すことを確認できる。

Claims (14)

1. 配列番号５、７、９、１０、１２、１５〜１９、２１、２４、２９〜３１、３５〜３７、４０、４１、４３、４５、４９〜５１、５３、５６、５８〜６０、６３、６４、６６、６７、６９〜７１、７６〜７８、８１、８５〜８７、９１、９２、９４、９５、９８、１００、１０５、１０６、１０８、１０９、１１３、１１６、１１９、１２１〜１２４、１２６、１２７、１３２〜１３６、１３８〜１４０、１４４、１４５、１４８〜１５０、１５３及び１５６の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるセンスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または、
   配列番号１５８、１６０、１６２、１６３、１６５、１６８〜１７２、１７４、１７７、１８２〜１８４、１８８〜１９０、１９３、１９４、１９６、１９８、２０２〜２０４、２０６、２０９、２１１〜２１３、２１６、２１７、２１９、２２０、２２２〜２２４、２２９〜２３１、２３４、２３８〜２４０、２４４、２４５、２４７、２４８、２５１、２５３、２５８、２５９、２６１、２６２、２６６、２６９、２７２、２７４〜２７７、２７９、２８０、２８５〜２８９、２９１〜２９３、２９７、２９８、３０１〜３０３、３０６及び３０９の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるｄｓＲＮＡを含む肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。
2. 前記組成物は、配列番号５、７、９、１０、１２、１５〜１９、２１及び２４の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記センスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなる前記アンチセンスＲＮＡからなる前記ｓｉＲＮＡ；または、
   配列番号１５８、１６０、１６２、１６３、１６５、１６８〜１７２、１７４及び１７７の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記ｄｓＲＮＡを含む請求項１に記載の肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。
3. 前記組成物は、配列番号２９〜３１、３５〜３７、４０、４１、４３、４５、４９〜５１及び５３の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記センスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなる前記アンチセンスＲＮＡからなる前記ｓｉＲＮＡ；または、
   配列番号１８２〜１８４、１８８〜１９０、１９３、１９４、１９６、１９８、２０２〜２０４及び２０６の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記ｄｓＲＮＡを含む請求項１に記載の肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。
4. 前記組成物は、配列番号５６、５８〜６０、６３、６４、６６、６７、６９〜７１、７６〜７８、８１、８５〜８７、９１、９２、９４、９５、９８、１００、１０５、１０６、１０８、１０９、１１３、１１６及び１１９の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記センスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなる前記アンチセンスＲＮＡからなる前記ｓｉＲＮＡ；または、
   配列番号２０９、２１１〜２１３、２１６、２１７、２１９、２２０、２２２〜２２４、２２９〜２３１、２３４、２３８〜２４０、２４４、２４５、２４７、２４８、２５１、２５３、２５８、２５９、２６１、２６２、２６６、２６９及び２７２の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記ｄｓＲＮＡを含む請求項１に記載の肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。
5. 前記組成物は、配列番号１２１〜１２４、１２６、１２７、１３２〜１３６、１３８〜１４０、１４４、１４５、１４８〜１５０、１５３及び１５６の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記センスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなる前記アンチセンスＲＮＡからなる前記ｓｉＲＮＡ；または、
   配列番号２７４〜２７７、２７９、２８０、２８５〜２８９、２９１〜２９３、２９７、２９８、３０１〜３０３、３０６及び３０９の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記ｄｓＲＮＡを含む請求項１に記載の肝癌の予防または治療用の薬学的組成物。
6. 前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡは、リポソーム、リポフェクタミン、デンドリマー、ミセル、多孔性シリカ粒子、アミノクレイ、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、グラフェン、酸化グラフェン、キトサン、デキストラン、ペクチン、二酸化マンガン２次元シート、ＰＶＡ、ゼラチン、シリカ、ガラス粒子、プロタミン、エクソソーム、ポリエチレンイミン、Ｎ−ブチルシアノアクリレート、ゼルフォーム、ゼラチン、エタノール、ナノクリスタル、ナノチューブ、炭素ナノ粒子、ヒアルロン酸、酸化鉄、ポリ乳酸、ポリブチルシアノアクリレート、アルブミン、リピド粒子、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルロニックアルギネート、ポリグリコリック−ポリアクチック酸、ポリジオキサノン、ポリグリコール酸−ｃｏ−カプロラクトン、ポリプロピレン、及びヒドロゲルからなる群より選択される少なくとも一つである担持体に担持された請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記担持体は、下記数式１の吸光度の比が１／２となるtが２０以上である多孔性シリカ粒子である請求項６に記載の組成物。
   [数式１]
   Ａ_ｔ／Ａ_０
   （式中、Ａ_０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
   前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
   前記懸濁液のｐＨは、７．４であり、
   Ａ_ｔは、Ａ_０の測定時からｔ時間経過後に測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
8. 前記tは、４０以上である請求項７に記載の組成物。
9. 前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１１９および１３６の配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる前記センスＲＮＡ、及びそれに相補的な配列からなる前記アンチセンスＲＮＡからなるものであり、
   前記ｄｓＲＮＡは、配列番号２７２および２８９からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなる請求項７に記載の組成物。
10. 前記多孔性シリカ粒子は、親水性置換基または疎水性置換基を有する請求項７に記載の組成物。
11. 前記多孔性シリカ粒子は、アルデヒド基、ケト基、カルバメート基、スルフェート基、スルホネート基、アミノ基、アミン基、アミノアルキル基、シリル基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、アンモニウム基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、エステル基、イミド基、チオイミド基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、メチルホスホネート基、ポリエチレングリコール基、置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_３０のアルキル基、置換または非置換のＣ_３〜Ｃ_３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ_６〜Ｃ_３０のアリール基、およびＣ_１〜Ｃ_３０のエステル基からなる群より選択される少なくとも一つの親水性置換基を有する請求項７に記載の組成物。
12. 前記多孔性シリカ粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陽電荷または陰電荷を帯びる請求項７に記載の組成物。
13. 前記多孔性シリカ粒子は、外部表面および気孔内部が中性のｐＨで陽電荷を帯びる請求項７に記載の組成物。
14. 前記多孔性シリカ粒子は、平均直径が１００〜４００ｎｍであり、気孔直径が４〜３０ｎｍである請求項７に記載の組成物。

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