JP6967404B2 - Composition for promoting Akkermansia mucinifira increase - Google Patents
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本発明は、シアリル糖ペプチドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物、及び該組成物を含む飲食品、医薬品、飼料に関する。 The present invention relates to a composition for promoting Akkermansia muciniphila increase containing a sialyl glycopeptide, and foods and drinks, pharmaceuticals, and feeds containing the composition.
近年、腸内細菌が宿主の代謝調節機能に重要な役割を担っていること、そして腸内細菌叢の破綻により宿主の代謝機能に異変が生じ、様々な疾患の原因となることが明らかにされつつある。したがって、健全な腸内細菌叢を保つことが宿主の健康維持に重要である。宿主によい効果をもたらす腸内細菌としては、ビフィドバクテリウム属菌やある種のラクトバチルス属菌などが知られており、それらをプロバイオティクスとして食品とともに摂取する、または腸内でそれらの増殖を促進する食品をプレバイオティクスとして摂取することが推奨されている。 In recent years, it has been clarified that intestinal bacteria play an important role in the metabolic regulation function of the host, and that the disruption of the intestinal flora causes changes in the metabolic function of the host, causing various diseases. It's getting better. Therefore, maintaining a healthy gut flora is important for maintaining the health of the host. Bifidobacterium spp. And certain Lactobacillus spp. Are known as intestinal bacteria that have a positive effect on the host, and they are taken as probiotics with food or they are taken in the intestine. It is recommended to consume foods that promote growth as prebiotics.
一方、最近の腸内細菌研究からは、宿主の健康に寄与する新たな腸内細菌が報告されてきている。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、ヒトの腸内細菌の１〜５％を占める細菌であり、宿主が消化管から分泌するムチンを分解・資化する特徴を有する（非特許文献１）。Clement K.らは、ヒト腸内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの量が、空腹時血糖値、血中インスリン値、およびウエスト周囲長と逆相関を示すことを報告している。すなわち、アッカーマンシア・ムシニフィラは、肥満、糖尿病、心疾患などの予防に効果的である可能性が示唆されている。また、マウスに高脂肪食を食べさせると肥満、腸管のバリア機能の低下、および脂肪組織の炎症マーカーが上昇、などの症状を呈するが、このとき盲腸内容物中のアッカーマンシア・ムシニフィラ量が低下することが報告されている。この高脂肪食のマウスに経口的に生きたアッカーマンシア・ムシニフィラを投与すると、脂肪量の増加、インスリン抵抗性、腸管バリア機能、脂肪組織の炎症などの代謝不全が改善された（非特許文献２）。 On the other hand, recent studies on gut microbiota have reported new gut microbiota that contribute to the health of the host. Akkermansia muciniphila is a bacterium that accounts for 1 to 5% of human intestinal bacteria, and has a characteristic of decomposing and assimilating mucin secreted from the digestive tract by the host (Non-Patent Document 1). Clement K. et al. Report that the amount of Akkermansia muciniphila in the human gut is inversely correlated with fasting blood glucose, blood insulin levels, and waist circumference. That is, it is suggested that Akkermansia muciniphila may be effective in preventing obesity, diabetes, heart disease and the like. In addition, when mice are fed a high-fat diet, symptoms such as obesity, decreased intestinal barrier function, and increased adipose tissue inflammation markers are exhibited, but at this time, the amount of Akkermansia muciniphila in the contents of the appendix decreases. It has been reported to do. Oral administration of live Akkermansia muciniphila to these high-fat diet mice improved metabolic disorders such as increased fat mass, insulin resistance, intestinal barrier function, and inflammation of adipose tissue (Non-Patent Document 2). ).
このように、腸管内でのアッカーマンシア・ムシニフィラ量が低下することは、腸の機能だけではなく全身の代謝機能を低下させることが明らかにされつつある。したがって現在では、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させるための様々な方法が検討されている。抗糖尿病薬として一般的に用いられているメトフォルミンの投与により、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラが増加することが報告され、アッカーマンシア・ムシニフィラ増加剤として期待されている。しかし、薬剤であることから既に糖尿病を発症している患者以外には適用することはできない。健康なヒト、または肥満気味なヒトなどが疾病予防を目的に食事として摂取できるアッカーマンシア・ムシニフィラ増加剤が期待されてきた。 Thus, it is becoming clear that a decrease in the amount of Akkermansia muciniphila in the intestinal tract reduces not only the function of the intestine but also the metabolic function of the whole body. Therefore, various methods for increasing Akkermansia muciniphila in the intestine are currently being investigated. It has been reported that administration of metformin, which is generally used as an antidiabetic drug, increases Akkermansia muciniphila in the intestine, and is expected as an Akkermansia muciniphila increasing agent. However, since it is a drug, it cannot be applied to patients other than those who have already developed diabetes. Akkermansia muciniphila-increasing agents that can be taken as a diet by healthy humans or obese humans for the purpose of disease prevention have been expected.
κ−カゼイングリコマクロペプチド（以下、ＧＭＰと略記する）は糖ペプチドの一種で、牛乳タンパク質の８０〜８５％を占めるカゼインのうちで唯一の糖タンパク質であるκ−カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、κ−カゼインの１０６−１６９残基に相当し、分子量は、約７，０００である。また、ＧＭＰは、グルタミン酸残基を多く持つほか、糖鎖中にシアル酸残基を持つなど、カルボキシ基に富んでいる。
ＧＭＰはこれまでに、胃から出るホルモン（ＣＣＫ：満腹ホルモン）の分泌促進を介した食欲抑制作用（非特許文献３）、脂肪細胞への直接的な作用による脂肪蓄積抑制作用（非特許文献４）、ビフィズス菌の増殖促進作用（非特許文献５）、感染防御作用（特許文献１）、カルシウム吸収促進剤（特許文献２）などが報告されているが、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する作用について記載や示唆のある文献等は知られていない。同様にＧＭＰ等を加水分解して得られるシアリル糖ペプチド（以下、ＳＧＰと略記する）も、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する作用はなんら検討されていない。
κ-Casein glycomacropeptide (hereinafter abbreviated as GMP) is a type of glycopeptide and is a C-terminal containing the sugar chain of κ-casein, which is the only glycoprotein of casein that accounts for 80 to 85% of milk protein. It is a peptide, corresponding to residues 106-169 of κ-casein, and has a molecular weight of about 7,000. In addition, GMP has a large number of glutamic acid residues and is rich in carboxy groups such as having a sialic acid residue in a sugar chain.
So far, GMP has an appetite-suppressing action (Non-Patent Document 3) through promotion of secretion of a hormone (CCK: satiety hormone) from the stomach, and a fat accumulation-suppressing action by a direct action on adipocytes (Non-Patent Document 4). ), Growth promoting action of bifidus bacteria (Non-Patent Document 5), Infection protection action (Patent Document 1), Calcium absorption promoting agent (Patent Document 2), etc. No suggestive literature is known. Similarly, the action of sialyl glycopeptide (hereinafter abbreviated as SGP) obtained by hydrolyzing GMP or the like on Akkermansia muciniphila has not been investigated.
本発明の課題は、従来にない新たなアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料を提供することである。 An object of the present invention is to provide a new composition for promoting the increase of Akkermansia muciniphila, which has never existed before, and foods, pharmaceuticals, and feeds containing the composition.
本発明者らは、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させる素材を鋭意検討した結果、ＧＭＰの分解物であるＳＧＰにアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させる作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。また、換言すればＳＧＰのこれまでに報告されていない新たな用途を見出したことに基づく発明である。即ち本発明は以下の構成を有する。
〔１〕スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、
前記糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔２〕前記シアリル糖ペプチドの糖鎖がシアル酸及びガラクト−Ｎ−ビオースからなるものである〔１〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔３〕前記シアル酸と前記ガラクト−Ｎ−ビオースのモル比が１：１〜２：１である〔２〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔４〕前記シアリル糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ酸残基数が１以上１３以下である〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔５〕スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチド、を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖鎖が、以下の（１）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
〔６〕前記糖鎖が、前記（１）及び前記（２）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上である〔５〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔７〕シアリル糖ペプチドが乳由来であることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品。
〔９〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品。
〔１０〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飼料。
As a result of diligent studies on materials that increase Akkermansia muciniphila in the intestine, the present inventors have found that SGP, which is a decomposition product of GMP, has an action of increasing Akkermansia muciniphila, and complete the present invention. It came to. In other words, it is an invention based on the discovery of a new use of SGP that has not been reported so far. That is, the present invention has the following configuration.
[1] A composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila, which comprises a sialyl glycopeptide in which a sugar chain is bound to a peptide having a threonine and / or serine residue.
The molecular weight of the glycopeptide is 500 or more and 3,000 or less.
The sugar chain binds to the hydroxyl group of the threonine or serine residue of the peptide,
A composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila, wherein the constituent sugar of the sugar chain is one or more selected from the group consisting of sialic acid, N-acetylgalactosamine and galactose.
[2] The composition for promoting the increase in Akkermansia muciniphila according to [1], wherein the sugar chain of the sialyl glycopeptide is composed of sialic acid and galacto-N-biose.
[3] The composition for promoting the increase in Akkermansia muciniphila according to [2], wherein the molar ratio of the sialic acid to the galacto-N-biose is 1: 1 to 2: 1.
[4] The composition for promoting Akkermansia muciniphila increase according to any one of [1] to [3], wherein the number of amino acid residues in the peptide chain of the sialyll glycopeptide is 1 or more and 13 or less.
[5] A composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila, which comprises a sialyl glycopeptide having a threonine and / or serine residue and having a sugar chain bonded to a hydroxyl group of the residue.
A composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila, wherein the sugar chain is one or more selected from the group consisting of the following (1) to (5).
(1) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(2) Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(3) Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
(4) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (O-Ac-Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(5) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (O-diAc-Neu5Acα2-6) GalNAcα1
[6] The composition for promoting the increase in Akkermansia muciniphila according to [5], wherein the sugar chain is one or more selected from the group consisting of the above (1) and the above (2) to (5).
[7] The composition for promoting Akkermansia muciniphila increase according to any one of [1] to [6], wherein the sialyll glycopeptide is derived from milk.
[8] An Akkermansia mucinifira increase-promoting food or drink containing the Akkermansia muciniphila increase-promoting composition according to any one of [1] to [7].
[9] A pharmaceutical product for promoting Akkermansia mucinifira, which comprises the composition for promoting Akkermansia muciniphila according to any one of [1] to [7].
[10] A feed for promoting Akkermansia mucinifira, which comprises the composition for promoting Akkermansia muciniphila according to any one of [1] to [7].
本発明は、従来にない新たなアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料を提供することが可能となった。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention has made it possible to provide a new composition for promoting the increase of Akkermansia muciniphila, and foods and drinks, pharmaceuticals, and feeds for promoting the increase of Akkermansia muciniphila containing the composition.
本発明のＳＧＰを有効成分として含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及びＳＧＰを有効成分として含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料について以下に詳細に説明する。
本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含む飲食品、医薬品、飼料について以下に詳細に説明する。
The composition for promoting the increase of Akkermansia muciniphila containing SGP as an active ingredient of the present invention, and the food and drink, pharmaceuticals and feeds for promoting the increase of Akkermansia muciniphila containing SGP as an active ingredient will be described in detail below.
The composition for promoting the increase of Akkermansia muciniphila of the present invention, and foods and drinks, pharmaceuticals, and feeds containing the composition will be described in detail below.
（シアリル糖ペプチド：ＳＧＰ）
本発明のＳＧＰは、スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドであって、分子量が５００以上であり、糖鎖がスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースから選択される１つ以上であるものを用いることができる。
本発明のＳＧＰは、糖鎖がシアル酸、およびガラクト−Ｎ−ビオース(Galβ1-3GalNAc)から成るものが好ましく、シアル酸とガラクト−Ｎ−ビオースのモル比が１：１〜２：１であるものが更に好ましい。また、本発明のＳＰＧはペプチド鎖が１アミノ酸残基以上１３アミノ酸残基以下程度のものを用いることができる。さらに、本発明のＳＰＧはアセチル化したシアル酸を含むものも用いることができる。
(Sialyl Glycopeptide: SGP)
The SGP of the present invention is a glycopeptide in which a sugar chain is bound to a peptide having a threonine and / or serine residue, has a molecular weight of 500 or more, and the sugar chain is bound to the hydroxyl group of the threonine or serine residue to form a sugar. One or more sugars selected from sialic acid, N-acetylgalactosamine, and galactose can be used as the constituent sugars of the chain.
The SGP of the present invention preferably has a sugar chain composed of sialic acid and galacto-N-biose (Galβ1-3GalNAc), and the molar ratio of sialic acid to galacto-N-biose is 1: 1 to 2: 1. The one is more preferable. Further, as the SPG of the present invention, a peptide chain having a peptide chain of 1 amino acid residue or more and 13 amino acid residues or less can be used. Further, the SPG of the present invention can also be one containing acetylated sialic acid.
本願発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物の一態様として、スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドであって、前記糖鎖が、以下の（１）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするシアリル糖ペプチドを含む組成物が挙げられる。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
As one aspect of the composition for promoting the increase of Ackermancia mucinifira of the present invention, it is a sialyl glycopeptide having a threonine and / or serine residue and a sugar chain bonded to the hydroxyl group, wherein the sugar chain is as follows ( Examples thereof include a composition containing a sialyll glycopeptide which is one or more selected from the group consisting of 1) to (5).
(1) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(2) Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(3) Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
(4) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (O-Ac-Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(5) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (O-diAc-Neu5Acα2-6) GalNAcα1
また、本願発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物のもうひとつの態様として、前記糖鎖が、下記（１）及び下記（２）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上の組み合わせであることを特徴とするシアリル糖ペプチドを含む組成物が挙げられる。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
Further, as another embodiment of the composition for promoting the increase of Akkermansia muciniphila of the present invention, one or more combinations in which the sugar chain is selected from the group consisting of the following (1) and the following (2) to (5). Examples thereof include a composition containing a sialyl glycopeptide, which is characterized by the above.
(1) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(2) Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(3) Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
(4) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (O-Ac-Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(5) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (O-diAc-Neu5Acα2-6) GalNAcα1
本発明のＳＧＰは、ＧＭＰ等を酵素等で加水分解することにより得ることができる。
ＧＭＰはκ−カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、牛乳の場合κ−カゼインの１０６−１６９残基に相当し、分子量は、約７，０００である。本発明のＳＧＰの原料となるＧＭＰは、牛乳以外にもヤギやヒツジなどの獣乳由来のホエイ中から得られるものであればどのようなものでも用いることができる。
また、本発明のＳＧＰは、微生物、植物、動物の臓器の抽出物を酵素などで加水分解することにより調製することもできる。さらに、化学的に合成されたもの、もしくは遺伝子組換え体で調製したものでもよい。
The SGP of the present invention can be obtained by hydrolyzing GMP or the like with an enzyme or the like.
GMP is a C-terminal peptide containing a sugar chain of κ-casein, and in the case of milk, it corresponds to the 106-169 residue of κ-casein and has a molecular weight of about 7,000. As the GMP which is a raw material of the SGP of the present invention, any one obtained from whey derived from animal milk such as goats and sheep can be used in addition to milk.
Further, the SGP of the present invention can also be prepared by hydrolyzing an extract of an organ of a microorganism, a plant or an animal with an enzyme or the like. Further, it may be chemically synthesized or prepared with a genetically modified organism.
（ＳＧＰの製造方法）
本発明のＳＧＰの製造方法についてその一態様を示し説明する。
本発明のＳＧＰは、例えばＧＭＰを加水分解することにより得られるため、まず、ＧＭＰの製造方法の一態様について説明する。
ＧＭＰを含む組成物は、特許第２６７３８２８号、または特開平６−２５２９７号公報に記載の方法により調製することができる。すなわち、ＧＭＰを含有する乳質原料物質、例えばチーズホエー、ホエー蛋白質濃縮物、除蛋白質チーズホエー等を、まずｐＨ４未満に調整した後、分画分子量１０，０００〜５０，０００の膜を用い、限外濾過処理をして透過液を得、好ましくは再度、該透過膜をｐＨ４以上に調整した後、分画分子量５０，０００以下の膜を用いて脱塩し濃縮することによりＧＭＰを調整する方法が挙げられる。また、乳質ホエーをｐＨ６．０以上に調整し４０〜７９℃で加熱処理したものを膜処理に付して乳清たんぱく質を除去し、ＧＭＰを濃縮液側に回収し、得られた濃縮液をｐＨ５．５以下にした後、再び膜処理に供してＧＭＰを透過液側に回収することによりＧＭＰ含有量の高い組成物を調製する方法を挙げることができる。
得られた組成物中のＧＭＰ量は、例えば、特許文献２の実施例に示されるようなウレア−ＳＤＳ電気泳動法により分析することができる。
次に、このようにして得られるＧＭＰをエンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼで処理する工程と、前記工程で得られた処理物を分画分子量５００以上３，０００以下の限外ろ過に供する処理工程を経ることにより本発明のＳＧＰを製造することができる。
糖ペプチド製造に用いるプロテアーゼの種類は、ペプチド結合を加水分解し、上記（シアリル糖ペプチド：ＳＧＰ）で記載したような分子量と糖鎖を有する糖ペプチドを得ることができるものであれば特に限定されるものではなく、１種類、又は複数のエンド型プロテアーゼ、エキソ型プロテアーゼを用いることができる。好ましくは、食品や医薬品の製造に使用可能な酵素がよく、アクチナーゼＥ（科研ファルマ）、アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ）、ヌクレイシン（ＨＢＩ）、オリエンターゼＡＹ（ＨＢＩ）、スミチームＦＰ（新日本化学工業）、スミチームＳＰＰ−Ｇ（新日本化学工業）、プロテアーゼＡ（天野エンザイム）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム）などを単独、あるいは組み合わせて使用することができる。
(Manufacturing method of SGP)
One aspect of the method for producing SGP of the present invention will be shown and described.
Since the SGP of the present invention can be obtained, for example, by hydrolyzing GMP, one aspect of the method for producing GMP will be described first.
The composition containing GMP can be prepared by the method described in Japanese Patent No. 2673828 or Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-25297. That is, a milky raw material containing GMP, for example, cheese whey, whey protein concentrate, deproteinized cheese whey, etc., is first adjusted to a pH of less than 4, and then a membrane having a fractional molecular weight of 10,000 to 50,000 is used. A method of adjusting GMP by performing an ultrafiltration treatment to obtain a permeate, preferably again adjusting the permeation membrane to pH 4 or higher, and then desalting and concentrating using a membrane having a fractionation molecular weight of 50,000 or less. Can be mentioned. In addition, whey whey adjusted to pH 6.0 or higher and heat-treated at 40 to 79 ° C. was subjected to membrane treatment to remove whey protein, GMP was collected on the concentrate side, and the obtained concentrate was used. A method of preparing a composition having a high GMP content can be mentioned by lowering the pH to 5.5 or less and then subjecting it to membrane treatment again to recover GMP on the permeate side.
The amount of GMP in the obtained composition can be analyzed by, for example, urea-SDS electrophoresis as shown in Examples of
Next, a step of treating the GMP thus obtained with an endo-type protease or an exo-type protease, and a treatment step of subjecting the treated product obtained in the above step to ultrafiltration having a molecular weight cut-off of 500 or more and 3,000 or less. The SGP of the present invention can be produced through the above process.
The type of protease used for producing a glycopeptide is particularly limited as long as it can hydrolyze the peptide bond to obtain a glycopeptide having a molecular weight and a sugar chain as described above (sialyl glycopeptide: SGP). However, one kind or a plurality of endo-type proteases and exo-type proteases can be used. Preferred are enzymes that can be used in the production of foods and pharmaceuticals, such as Actinase E (Kaken Pharma), Actinase AS (Kaken Pharma), Nucresin (HBI), Orientase AY (HBI), Sumiteam FP (Shin Nippon Chemical Industrial). , Sumiteam SPP-G (Shin Nippon Chemical Industrial Co., Ltd.), Protease A (Amano Enzyme), Peptidase R (Amano Enzyme), etc. can be used alone or in combination.
（ＳＧＰのアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用の評価）
本発明のＳＧＰによるアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用は、ＳＧＰを投与した場合と非投与の場合における腸内または糞便中のアッカーマンシア・ムシニフィラの増加を比較し、非投与よりも投与の方が増加した場合に本発明の増加促進作用があると評価することができる。増加は増殖と同義で用いられる。アッカーマンシア・ムシニフィラの増加・増殖は菌の増加・増殖の評価に通常用いられる方法であればいずれでもよく、例えば、以下の実施例に記載した方法を挙げることができる。
(Evaluation of SGP's increase-promoting effect of Akkermansia muciniphila)
The effect of promoting the increase of Akkermansia muciniphila by SGP of the present invention is to compare the increase of Akkermansia muciniphila in the intestine or feces with and without SGP administration, and the administration is better than the non-administration. When it increases, it can be evaluated that there is an increase promoting action of the present invention. Increase is used synonymously with proliferation. The increase / proliferation of Akkermansia muciniphila may be any method usually used for evaluating the increase / proliferation of bacteria, and examples thereof include the methods described in the following examples.
（ＳＧＰを含む飲食品、医薬品、飼料）
本発明の上記製造方法により得られたＳＧＰ（あるいはＳＧＰを含む組成物）は、そのまま飲食品の原材料として用いることができ、ＳＧＰを含む組成物を添加すること以外は、各食品の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のＳＧＰはどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
このようにして製造された有効量のＳＧＰを含む飲食品は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品として提供される。
(Food and drink including SGP, medicines, feed)
The SGP (or composition containing SGP) obtained by the above-mentioned production method of the present invention can be used as a raw material for foods and drinks as it is, and is produced by a conventional method for each food except for the addition of the composition containing SGP. Just do it.
Therefore, the effective amount of SGP of the present invention may be blended in any food or drink, or may be added to the raw material during the manufacturing process of the food or drink. Examples of food and drink include cheese, fermented milk, dairy fermented milk products, lactic acid bacteria beverages, lactic acid bacteria beverages, butter, dairy products such as margarine, dairy beverages, fruit juice beverages, beverages such as soft drinks, and eggs such as jelly, candy, pudding, and mayonnaise. Processed products, sweets and breads such as butter cakes, various powdered milks, infant foods, nutritional compositions and the like can be mentioned, but are not particularly limited.
The food or drink containing an effective amount of SGP produced in this manner is provided as a food or drink for promoting the increase of Akkermansia muciniphila.
本発明の上記製造方法により得られたＳＧＰ（あるいはＳＧＰを含む組成物）は、そのまま医薬品の原材料として用いることができ、ＳＧＰを含む組成物を添加すること以外は、錠剤、カプセル、粉末、シロップ等の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明のＳＧＰを有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、ＳＧＰをそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
このようにして製造された有効量のＳＧＰを含む医薬品は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用医薬品として提供される。
The SGP (or composition containing SGP) obtained by the above-mentioned production method of the present invention can be used as a raw material for pharmaceutical products as it is, and tablets, capsules, powders and syrups are used except that the composition containing SGP is added. It may be manufactured by a conventional method such as.
Therefore, when formulating a pharmaceutical product containing the SGP of the present invention as an active ingredient, an excipient, a stabilizer, a flavoring agent, etc. permitted in the formulation are appropriately mixed and formulated, and the SGP is dried as it is. It can also be used as a powder or a powder. In addition, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a flavoring agent, a suspending agent, a coating agent, or any other agent may be mixed as long as it does not interfere with the increase-promoting action of Akkermansia muciniphila. It can also be formulated. The dosage form may be tablets, capsules, granules, powders, powders, syrups and the like.
The drug containing an effective amount of SGP produced in this manner is provided as an increase-promoting drug for Akkermansia muciniphila.
本発明の上記製造方法により得られたＳＧＰ（あるいはＳＧＰを含む組成物）は、そのまま飼料の原材料として用いることができ、ＳＧＰを含む組成物を添加すること以外は、飼料の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のＳＧＰは前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
このようにして製造された有効量のＳＧＰを含む飼料は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飼料として提供される。
The SGP (or composition containing SGP) obtained by the above-mentioned production method of the present invention can be used as a raw material for feed as it is, and can be produced by a conventional feed method except that the composition containing SGP is added. good.
Therefore, the effective amount of SGP of the present invention may be blended with any feed as in the food and drink, or may be added to the raw material during the feed manufacturing process.
The feed containing an effective amount of SGP thus produced is provided as an increase-promoting feed for Akkermansia muciniphila.
（ＳＧＰの摂取量）
本発明のＳＧＰを飲食品、医薬品、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させてアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物を製造する場合、配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。
一日投与量は、投与対象の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、成人ヒトの場合、ＳＧＰを1日当り０．１ｇ以上を摂取すればよく、１ｇ以上が好ましく、１０ｇ以上がさらに好ましい。
(Intake of SGP)
When the SGP of the present invention is blended with a material such as food or drink, a pharmaceutical product, a feed, or a processed product of those materials to produce a composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila, the blending ratio is not particularly limited and the production is easy. It may be appropriately adjusted according to the sex and the preferable daily dose.
The daily dose is determined individually in consideration of the symptom, age, etc. of the administration target, but in the case of an adult human, 0.1 g or more of SGP may be ingested per day, preferably 1 g or more, and 10 g. The above is more preferable.
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, examples of the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited thereto.
〔実施例１〕本発明のＳＧＰの調製方法
１．ＧＭＰの製造方法
ホエイタンパク質濃縮物（サンラクトＮ−２、太陽化学製）１ｋｇを５０℃の水５０Ｌに溶解し、濃塩酸によりｐＨ３．５に調整した。これを、分画分子量２０，０００の限外ろ過膜（ＧＲ６１ＰＰ、ＤＤＳ製）を用い、５０℃、圧力０．４ＭＰａ、平均透過液流速５２．４Ｌ／ｍ２・ｈにて限外ろ過を行なった。透過液量が４０Ｌに達した時点で濃縮液に５０℃の水４０Ｌを加え、連続して限外ろ過を行なった。以上の様にして連続運転を行い、透過液を１６０Ｌ得た。
得られた透過液に２５％苛性ソーダを加え、ｐＨ７．０とし、再度同じ条件、同じ限外ろ過膜で濃縮液が５Ｌになるまで限外ろ過を行い、脱塩濃縮した。続いて５０℃の水を加え、濃縮液量を常に１０Ｌに保ちながら、これまでと同じ条件、同じ限外ろ過膜でダイアフィルトレーションを行い、さらに脱塩した。このダイアフィルトレーションにより透過液量が８０Ｌに達した時点で濃縮液に水を加えるのをやめ、濃縮液量が２Ｌになるまで限外ろ過にて濃縮し、この濃縮液を乾燥し、ＧＭＰ５４ｇを得た。
[Example 1] Method for preparing SGP of the present invention
1. 1. Method for Producing GMP 1 kg of whey protein concentrate (Sanlacto N-2, manufactured by Taiyo Kagaku) was dissolved in 50 L of water at 50 ° C., and the pH was adjusted to 3.5 with concentrated hydrochloric acid. This is subjected to ultrafiltration at 50 ° C., a pressure of 0.4 MPa, and an average permeation flow rate of 52.4 L / m 2 · h using an ultrafiltration membrane (GR61PP, manufactured by DDS) having a molecular weight cut off of 20,000. rice field. When the amount of permeated liquid reached 40 L, 40 L of water at 50 ° C. was added to the concentrated liquid, and ultrafiltration was continuously performed. Continuous operation was performed as described above to obtain 160 L of a permeated liquid.
25% caustic soda was added to the obtained permeate to adjust the pH to 7.0, and the ultrafiltration was performed again under the same conditions and the same ultrafiltration membrane until the concentration reached 5 L, and the mixture was desalted and concentrated. Subsequently, water at 50 ° C. was added, and while maintaining the concentrated liquid volume at 10 L, diafiltration was performed under the same conditions and the same ultrafiltration membrane as before, and further desalting was performed. When the permeate volume reaches 80 L by this diafiltration, stop adding water to the concentrate, concentrate by ultrafiltration until the concentrate reaches 2 L, dry the concentrate, and GMP 54 g. Got
２．ＳＧＰの製造方法
上記１．で得られたＧＭＰを用い、３０Ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これをエンド型プロテアーゼ（アクチナーゼＡＳ、科研ファルマ製）を添加して５０℃で６時間反応させた。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行なった。濃縮液に水を加えて連続して限外ろ過を行なうことでダイアフィルトレーションを行ない、５倍の加水濃縮を行なった後に濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、ＳＧＰ（１）２７１．７ｇを得た。
３．２種類の酵素を組合わせたＳＧＰの製造方法
上記１．で得られたＧＭＰを用い、３０Ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これをエンド型プロテアーゼ（オリエンターゼＡＹ、ＨＢＩ製）を添加して５０℃で４時間反応させた後、エキソ型プロテアーゼ（ペプチダーゼＲ、天野エンザイム製）を添加して３７℃で２時間反応した。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行なった。濃縮液に水を加えて連続して限外ろ過を行なうことでダイアフィルトレーションを行ない、５倍の加水濃縮を行なった後に濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、ＳＧＰ（２）を３１２．６ｇ得た。
2. 2. Manufacturing method of SGP 1. Using the GMP obtained in the above, a 5% GMP solution of 30 kg was prepared. This was reacted at 50 ° C. for 6 hours by adding an end-type protease (Actinase AS, manufactured by Kaken Pharma). This was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 1,000. Diafiltration was performed by adding water to the concentrated solution and performing ultrafiltration continuously to obtain a concentrated solution fraction after performing 5-fold water concentration. This concentrate was dried to obtain 271.7 g of SGP (1).
3. Method for manufacturing SGP by combining two types of enzymes 1. Using the GMP obtained in the above, a 5% GMP solution of 30 kg was prepared. An endoprotease (Orientase AY, manufactured by HBI) was added and reacted at 50 ° C. for 4 hours, and then an exo-type protease (Peptidase R, manufactured by Amano Enzyme) was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours. This was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 1,000. Diafiltration was performed by adding water to the concentrated solution and performing ultrafiltration continuously to obtain a concentrated solution fraction after performing 5-fold water concentration. This concentrate was dried to obtain 312.6 g of SGP (2).
〔実施例２〕ＳＧＰのシアリダーゼ処理
実施例１で調製したＳＧＰ（１）を２ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２０ｍｇ／ｍＬに調製し、それにシアリダーゼ（Clostridium perfringens由来：Ｓｉｇｍａ，Ｎ２８７６−２５ＵＮ）を１０Ｕ／ｍＬとなるように加え、３７℃で２０時間反応させた。酵素添加なしのブランクは、酵素を添加せずに同条件で反応させた。反応後は５分間ボイルすることで、反応を停止させた。得られた反応液は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した。ＳＥＣ分析には、２本のＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷ（東ソー）を装着したＬ−２０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）システムを用い、ＵＶ２１４ｎｍの吸収を検出した。移動相として０．１％トリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリル溶液を用い、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで１２０分間室温でアイソクラチック（isocratic）に溶出した。
ＳＥＣ分析の結果を図１に示す。７０分付近に大きなピークが認められたが、このピークは、酵素反応に用いた酢酸緩衝液である。
ＳＧＰの主要なピークは５０分から６０分の間に認められたが、これらはシアリダーゼ処理することで全体的に低分子側にシフトした。このことから、調製したＳＧＰ（１）の主体は、シアル酸を含有する化合物であることが明らかとなった。
[Example 2] SGP sialidase treatment The SGP (1) prepared in Example 1 was prepared at 20 mg / mL with 100 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 2 mM calcium chloride, and sialidase (derived from Clostridium perfringens: Sigma). , N2876-25UN) was added at 10 U / mL, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 20 hours. The blank without the addition of the enzyme was reacted under the same conditions without the addition of the enzyme. After the reaction, the reaction was stopped by boiling for 5 minutes. The resulting reaction was subjected to size exclusion chromatography (SEC). For SEC analysis, an L-2000 (HITACHI) system equipped with two TSKgel G3000PW (Tosoh) was used to detect absorption at UV214 nm. A 40% acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid was used as the mobile phase and eluted isocraticly at room temperature for 120 minutes at a flow rate of 0.3 ml / min.
The result of SEC analysis is shown in FIG. A large peak was observed around 70 minutes, and this peak was the acetate buffer used for the enzymatic reaction.
Major peaks of SGP were observed between 50 and 60 minutes, but these were totally shifted to the small molecule side by treatment with sialidase. From this, it was clarified that the main component of the prepared SGP (1) was a compound containing sialic acid.
〔実施例３〕ＳＧＰのＬＣ／ＭＳを用いた構造解析
ＬＣ／ＭＳ分析には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ＰａｒａｄｉｇｍＭＳ２（Michrom Bioresources）に接続したイオントラップ型質量分析計ＬＴＱ Ｖｅｌｏｓ（Thermofisher scientific）を用い（ＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴ ＭＳ）、分離カラムとしてＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（φ０．２ｍｍ×１５０ｍｍ，ジーエルサイエンス）を装着した。移動相には、０．１％のギ酸を含んだ２％アセトニトリル溶液（Ａ液）、および０．１％ギ酸を含んだ９０％アセトニトリル溶液（Ｂ液）を用いた。各ＳＧＰを５０％アセトニトリル−０．１％ギ酸溶液で１００μｇ／ｍＬに調製し、２５μＬをＨＰＬＣに導入した。移動相は２μＬ／ｍｉｎで通液し、試料導入後０分から９０分の間にＢ液の割合を０％から４５％まで直線的に増加させた。質量分析計は、ＭＳ測定（ｍ／ｚ４００−２０００，ポジティブモード）とＭＳ／ＭＳ測定を行った。
ＭＳ／ＭＳ測定は、ＭＳのうち強度の高い順に５つのイオンを自動的にプレカーサーイオンとして選択し、コリジョンエネルギー３５Ｖで破壊して生じたプロダクトイオンのｍ／ｚを観測した。プレカーサーイオンとプロダクトイオンのｍ／ｚの差が２９２であるものをＮｅｕ５Ａｃ、３３４をＮ，Ｏ−ジアセチルノイラミン酸（O-Ac-Neu5Ac）、３７６をＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルノイラミン酸（O,O-diAc-Neu5Ac）、２０３をＧａｌＮＡｃ、１６２をＧａｌと帰属し、プロダクトイオンのパターンから糖鎖構造を決定した。糖鎖が完全に解離したと思われるイオンのｍ／ｚをペプチドにプロトンが付加したイオンに由来すると推定し、そのｍ／ｚに相当するペプチド配列をＧＭＰの配列中から探索することで、糖ペプチドの構造を推定した。
実施例１で調製したＳＧＰ（１）について、ＬＣ／ＭＳ分析で得られたＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルから、ＳＧＰに含まれる糖ペプチドの糖鎖構造を推定した。
表１に、ＬＣ／ＭＳ分析で検出した糖ペプチドの糖鎖構造を示す。その結果、検出したいずれの糖ペプチドもシアル酸を含む糖鎖が結合したペプチドであった。検出した多くの糖ペプチドがシアル酸を２分子結合したNeu5Acα1-3Galβ1-3(Neu5Acα1-6)GalNAcの糖鎖構造（Glycan type 3, 4, 5, 6, 7）を有していたが、シアル酸が１分子であるNeu5Acα1-3Galβ1-3GalNAc（Glycan type 1）やGalβ1-3(Neu5Acα1-6)GalNAc（Glycan type 2）も検出された。さらに、シアル酸のＯ−アセチル体であるＮ，Ｏ−ジアセチルノイラミン酸（O-Ac-Neu5Ac、Glycantype 4）、およびＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルノイラミン酸（O- diAc-Neu5Ac、Glycan type 5）も検出された。、また、一つのペプチド鎖に2本の糖鎖が結合した糖ペプチド（Glycan type 6, 7）も検出された。
ＭＳ／ＭＳスペクトル解析から検出したペプチド鎖は、いずれもウシのグリコマクロペプチドに含まれるペプチド鎖であった。検出した全ての糖ペプチドにはセリンまたはスレオニン残基が1分子以上存在し、ペプチド鎖長は最も短いもので１残基、最も長いもので１３残基であった。また、検出したペプチド鎖の分子量は、７４５から２９２８の範囲であった。
[Example 3] Structural analysis using LC / MS of SGP For LC / MS analysis, an ion trap type mass spectrometer LTQ Velos (Thermofisher scientific) connected to high performance liquid chromatography (HPLC) Paradigm MS2 (Michrom Bioresources) was used. (LC-ESI-IT MS), InertSstein C18 (φ0.2 mm × 150 mm, GL Sciences) was attached as a separation column. As the mobile phase, a 2% acetonitrile solution (solution A) containing 0.1% formic acid and a 90% acetonitrile solution (solution B) containing 0.1% formic acid were used. Each SGP was prepared at 100 μg / mL with a 50% acetonitrile-0.1% formic acid solution and 25 μL was introduced into the HPLC. The mobile phase was passed at 2 μL / min, and the proportion of solution B was linearly increased from 0% to 45% between 0 and 90 minutes after sample introduction. The mass spectrometer performed MS measurement (m / z400-2000, positive mode) and MS / MS measurement.
In the MS / MS measurement, five ions of MS were automatically selected as precursor ions in descending order of intensity, and m / z of product ions generated by breaking with collision energy of 35 V was observed. Neu5Ac 334 is N, O-diacetylneuraminic acid (O-Ac-Neu5Ac), and 376 is N, O, O-triacetylneuraminic acid, which has a m / z difference of 292 between the precursor ion and the product ion. (O, O-diAc-Neu5Ac), 203 was assigned to GalNAc, 162 was assigned to Gal, and the sugar chain structure was determined from the pattern of product ions. It is presumed that the m / z of the ion in which the sugar chain is completely dissociated is derived from the ion to which a proton is added to the peptide, and the peptide sequence corresponding to the m / z is searched from the GMP sequence to obtain the sugar. The structure of the peptide was estimated.
For SGP (1) prepared in Example 1, the sugar chain structure of the glycopeptide contained in SGP was estimated from the MS spectrum and MS / MS spectrum obtained by LC / MS analysis.
Table 1 shows the sugar chain structure of the glycopeptide detected by LC / MS analysis. As a result, all the detected glycopeptides were peptides to which sugar chains containing sialic acid were bound. Many of the detected glycopeptides had a sugar chain structure (
The peptide chains detected by MS / MS spectral analysis were all peptide chains contained in bovine glycomacropeptides. All the detected glycopeptides contained one or more serine or threonine residues, and the shortest peptide chain length was 1 residue and the longest was 13 residues. The molecular weight of the detected peptide chain was in the range of 745 to 2928.
〔実施例４〕ＳＧＰの構成糖と存在比
ＳＧＰは糖鎖とペプチド鎖から成るが、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加作用にはＳＧＰ中の糖鎖の構成糖とその存在比率が重要と考えられる。
実施例３で示したように、ＳＧＰの糖鎖は、シアル酸、およびガラクト−Ｎ−ビオース（Galb1-3GalNAc）から成ることが明らかとなった。よって、次にＳＧＰ中のシアル酸とガラクト-Ｎ-ビオースのそれぞれの量を測定し、これらの存在比を調べた。
実施例１で調製したＳＧＰ中のシアル酸量は、以下に記載した方法で測定した。すなわち、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）量を測定するために、ねじ口試験管に１００μＬのサンプル溶液、８００μＬの水、および１００μＬの１Ｎ硫酸溶液を添加し、ブロックヒーターを用いて８０℃で４５分間、加熱した。冷却後、等量の１００ｍＭの水酸化ナトリウムで中和した後、０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した。得られた反応液中の糖含量は、Carbopak PA1カラムを装着したDIONEX ICS-5000DPシステムを用いて測定した。
実施例１で調製したＳＧＰからガラクト−Ｎ−ビオースを遊離させるために、まず実施例２に記載した方法でＳＧＰをシアリダーゼ処理した。シアリダーゼ処理後のＳＧＰは、引き続きＯ−グルカナーゼ（エンド−a−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ）処理することで、ＳＧＰからガラクト−Ｎ−ビオースを遊離させた。遊離したガラクト−Ｎ−ビオースは、Carbopak PA1カラムを装着したDIONEX ICS-5000DPシステムを用いて測定した。
シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）とガラクト−Ｎ−ビオースのモル比は、実施例１で調製したＳＧＰ（１）が１．８６：１、ＳＧＰ（２）が１．６７：１であった
[Example 4] Constituent sugars and abundance ratio of SGP SGP consists of sugar chains and peptide chains, and it is considered that the constituent sugars of sugar chains and their abundance ratio in SGP are important for the increasing action of Akkermansia muciniphila.
As shown in Example 3, the sugar chain of SGP was found to consist of sialic acid and galact-N-bioce (Galb1-3GalNAc). Therefore, next, the amounts of sialic acid and galacto-N-biose in SGP were measured, and the abundance ratios of these were investigated.
The amount of sialic acid in the SGP prepared in Example 1 was measured by the method described below. That is, in order to measure the amount of sialic acid (N-acetylneuraminic acid), 100 μL of a sample solution, 800 μL of water, and 100 μL of a 1N sulfuric acid solution were added to a screw cap test tube, and the temperature was 80 ° C. using a block heater. Was heated for 45 minutes. After cooling, the mixture was neutralized with an equal amount of 100 mM sodium hydroxide, and then insoluble matter was removed with a 0.45 μm filter. The sugar content in the obtained reaction solution was measured using a DIONEX ICS-5000DP system equipped with a Carbopak PA1 column.
In order to release galacto-N-biose from the SGP prepared in Example 1, the SGP was first treated with sialidase by the method described in Example 2. After the sialidase treatment, the SGP was subsequently treated with O-glucanase (endo-a-N-acetylgalactosaminidase) to release galacto-N-biose from the SGP. Free galact-N-biose was measured using a DIONEX ICS-5000DP system equipped with a Carbopak PA1 column.
The molar ratio of sialic acid (N-acetylneuraminic acid) to galacto-N-biose was 1.86: 1 for SGP (1) and 1.67: 1 for SGP (2) prepared in Example 1. rice field
〔試験例１〕
マウスに通常餌（コントロール）、実施例１で調製したＳＧＰ（１）を１０％添加した餌を３週間摂取させた。摂取期間終了後に盲腸内容物を採取し、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡから総菌量とアッカーマンシア・ムシニフィラ量を測定するために、リボゾームＲＮＡ遺伝子をターゲットとした定量的ＰＣＲを行なった。ヒトにおける難消化性成分の主な発酵部位は大腸でありアッカーマンシア・ムシニフィラも大腸に存在するが、マウスでの主な発酵部位は盲腸であるため、この試験では盲腸内容物について測定した。したがって、実験結果は盲腸内容物中の総菌量、及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量を示すが、これらの結果が盲腸での作用に限定するわけではなく、ヒトでの主な発酵部位である大腸における大腸内容物または糞便中の総菌量、及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量に置き換えることができる。
総菌量はＣｏｎｔｒｏｌ群に比べてＳＧＰを１０％添加した餌を摂取したＳＧＰ群で有意に増加した（図２）。
また、アッカーマンシア・ムシニフィラ量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、ＳＧＰ群で顕著に増加した（図３）。ＳＧＰ群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群よりも約１，０００倍多いアッカーマンシア・ムシニフィラが検出された。
これらの結果から、ＳＧＰは腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラが増加させる作用を有していることが明らかとなった。
[Test Example 1]
Mice were fed a normal diet (control) and a diet supplemented with 10% of SGP (1) prepared in Example 1 for 3 weeks. After the end of the ingestion period, the contents of the cecum were collected and DNA was extracted. In order to measure the total amount of bacteria and the amount of Akkermansia muciniphila from the obtained DNA, quantitative PCR targeting the ribosome RNA gene was performed. The main fermentation site for indigestible components in humans is the large intestine, and Akkermansia muciniphila is also present in the large intestine, but since the main fermentation site in mice is the cecum, the contents of the cecum were measured in this study. Therefore, although the experimental results show the total amount of bacteria in the cecal contents and the amount of Akkermansia muciniphila, these results are not limited to the action in the cecum, but in the large intestine, which is the main fermentation site in humans. It can be replaced with the total amount of bacteria in the large intestine contents or feces, and the amount of Akkermansia muciniphila.
The total bacterial mass was significantly increased in the SGP group ingesting a diet supplemented with 10% SGP as compared with the Control group (Fig. 2).
In addition, the amount of Akkermansia muciniphila was significantly increased in the SGP group as compared with the Control group (Fig. 3). Akkermansia muciniphila was detected in the SGP group about 1,000 times more than in the Control group.
From these results, it was clarified that SGP has an action of increasing Akkermansia muciniphila in the intestine.
〔実施例５〕サプリメントの製造
実施例１で得られたＳＧＰ粉末３０ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用サプリメントを製造した。
[Example 5] Preparation of supplement To 30 g of the SGP powder obtained in Example 1, 40 g of an equal amount mixture of vitamin C and citric acid, 100 g of granulated sugar, and 60 g of an equal amount mixture of cornstarch and lactose were added and mixed. The mixture was packed in a stick-shaped bag to produce the supplement for promoting the increase of Akkermansia muciniphila of the present invention.
〔実施例６〕飲料の製造
表２に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲料を製造した。
[Example 6] Production of beverage The raw materials were mixed according to the formulation shown in Table 2, filled in a container, and then sterilized by heating to produce the beverage for promoting the increase of Akkermansia muciniphila of the present invention.
〔実施例７〕医薬品（カプセル剤）の製造
表３に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに１０ｍｇずつ充填して、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品を含むカプセル剤を製造した。
[Example 7] Production of pharmaceutical product (capsule) The raw materials are mixed according to the formulation shown in Table 3, granulated into granules, and then filled in empty capsules in an amount of 10 mg each to increase Akkermansia muciniphila of the present invention. Manufactured capsules containing accelerators.
本発明によれば、ＳＧＰを有効成分とする新たなアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物、及びＳＧＰを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料を提供することが可能となった。 According to the present invention, it is possible to provide a new composition for promoting the increase of Akkermansia muciniphila containing SGP as an active ingredient, and foods and drinks, pharmaceuticals and feeds for promoting the increase of Akkermansia mucinifila containing SGP as an active ingredient. It has become possible.
Claims (8)
ドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖がシアル酸及びガラクト−Ｎ−ビオースからなるものであり、
前記ガラクト−Ｎ−ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト−Ｎ−ビオースに結合し、
前記シアル酸と前記ガラクト−Ｎ−ビオースのモル比が１：１〜２：１であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。 A composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila, which comprises a sialyl glycopeptide in which a sugar chain is bound to a peptide having a threonine and / or serine residue.
The molecular weight of the glycopeptide is 500 or more and 3,000 or less.
The sugar chain is composed of sialic acid and galacto-N-biose.
The galacto-N-biose binds to the hydroxyl group of the threonine or serine residue of the peptide, and the sialic acid binds to the galacto-N-biose.
A composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila , wherein the molar ratio of the sialic acid to the galacto-N-biose is 1: 1 to 2: 1.
１に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。 Claim that the number of amino acid residues in the peptide chain of the sialyl glycopeptide is 1 or more and 13 or less.
The composition for promoting the increase of Akkermansia mucinifira according to 1.
ペプチド、を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖鎖が、以下の（１）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1 A composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila, which comprises a sialyl glycopeptide having a threonine and / or serine residue and having a sugar chain bonded to the hydroxyl group of the residue.
A composition for promoting an increase in Akkermansia muciniphila, wherein the sugar chain is one or more selected from the group consisting of the following (1) to (5).
(1) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(2) Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(3) Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
(4) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (O-Ac-Neu5Acα2-6) GalNAcα1
(5) Neu5Acα2-3Galβ1-3 (O-diAc-Neu5Acα2-6) GalNAcα1
る請求項３に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。 The composition for promoting the increase in Akkermansia muciniphila according to claim 3 , wherein the sugar chain is one or more selected from the group consisting of the above (1) and the above (2) to (5).
項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。 Any 1 of claims 1 to 4 , wherein the sialyll glycopeptide is derived from milk.
The composition for promoting the increase of Akkermansia mucinifira according to the section.
用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品。 A food or drink for promoting Akkermansia mucinifira, which comprises the composition for promoting Akkermansia mucinifira according to any one of claims 1 to 5.
用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品。 An Akkermansia muciniphila increase-promoting drug comprising the Akkermansia muciniphila increase-promoting composition according to any one of claims 1 to 5.
用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飼料。 A feed for promoting Akkermansia mucinifira, which comprises the composition for promoting Akkermansia muciniphila according to any one of claims 1 to 5.
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