JP6964843B2 - バイナリー遺伝子発現システム - Google Patents
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Description
(2)前記主要標的塩基配列が以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列からなる、(1)に記載のバイナリー遺伝子発現システム。
(b)配列番号5で示す塩基配列、及び
(c)配列番号4又は5において配列番号6で示す塩基配列の1〜5個の塩基が置換された塩基配列
(3)前記配列番号4で示す塩基配列が配列番号7で示す塩基配列である、(2)に記載のバイナリー遺伝子発現システム。
(4)前記配列番号5で示す塩基配列が配列番号8で示す塩基配列である、(2)に記載のバイナリー遺伝子発現システム。
(5)前記転写活性単位がARII、又はVP16である、(1)〜(4)のいずれかに記載のバイナリー遺伝子発現システム。
(6)前記TAL認識配列は標的塩基配列を含む配列番号9で示す塩基配列が5〜25個連結された繰り返し配列からなる、(3)〜(5)のいずれかに記載のバイナリー遺伝子発現システム。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載のバイナリー遺伝子発現システムの第1発現ユニットを含む形質転換体。
(8)(6)に記載のバイナリー遺伝子発現システムにおける第2発現ユニットを除く、(1)〜(5)のいずれかに記載のバイナリー遺伝子発現システムの第2発現ユニットを含む形質転換体。
(9)(1)〜(6)のいずれかに記載のバイナリー遺伝子発現システムにおける第1発現ユニット及び第2発現ユニットを含む形質転換体。
(10)前記形質転換体がチョウ目昆虫である、(7)〜(9)のいずれかに記載の形質転換体。
(11)前記チョウ目昆虫がカイコである、(10)に記載の形質転換体。
(12)(7)に記載の第1発現ユニットを有する形質転換体と(8)に記載の第2発現ユニットを有する形質転換体とを交配させる工程、及び前記交配工程後に第1及び第2発現ユニットを有する個体を選択する工程を含む目的遺伝子又はその断片の発現強化個体の作出方法。
1−1.概要
本発明の第1の態様は、バイナリー遺伝子発現システムである。
本発明のバイナリー遺伝子発現システムは、第1発現ユニット及び第2発現ユニットの2つのユニットからなる。各発現ユニットは、対象とする遺伝子又はその活性ドメイン(以下、「対象遺伝子等」とする)を発現可能な状態で含み、その遺伝子等の発現を制御できる発現ベクターで構成される。各ユニットの構成を以下で説明する。
第1発現ユニットは、図1Aに示すようにプロモーターとその制御下に配置されたTAL領域及び転写活性領域、その他に、母核ベクターを必須の構成要素として含む。また、必要に応じて標識遺伝子、ターミネーター、エンハンサー、5’UTR及び3’UTR、インスレーター及びトランスポゾンの逆位末端反復配列等の選択的構成要素を含むこともできる。以下、各構成要素について説明する。
「TAL領域及び転写活性領域」は、TALドメイン及びそのC末端側に連結された転写活性ドメインからなるキメラタンパク質(融合タンパク質)をコードするキメラ遺伝子である。
本明細書において「TAL(Transcription Activator-Like)領域」とは、TALドメインをコードする塩基配列からなる領域である。
本明細書において「転写活性領域」とは、転写活性ドメインをコードする塩基配列からなる領域である。
「プロモーター」は、その制御下に配置された遺伝子(対象遺伝子)の発現を制御することのできる遺伝子発現調節領域である。第1発現ユニットにおける「プロモーター」は、対象遺伝子であるTAL領域及び転写活性領域からなるキメラ遺伝子の発現を制御することができる。
「母核ベクター」は、第1発現ユニットのベース部分であって、第1発現ユニットがベクターとして機能する上で必要な構成を有する。ベクターの種類は、特に限定はしない。プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミド、バクミド、フォスミド、BAC、YAC等が挙げられる。プラスミドベクター又はウイルスベクターが好ましい。母核ベクターは、第1発現ユニットを導入する宿主に応じて適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌の場合には、pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、及びpBluescript系(Agilent technologies)等の大腸菌由来のプラスミドベクターやλgt11及びλZAP等のλファージベクターを利用することができる。宿主が酵母の場合には、YEp13、YEp24、及びYCp50等のプラスミドベクターを利用することができる。また、宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターやバクミドを用いることができる。さらに、宿主がヒト等の哺乳類動物の場合には、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクター、あるいは非ウイルスベクターを母核とする公知のベクターを使用することができる。さらに、この他、大腸菌又は酵母内でも複製可能なシャトルベクター、染色体中に相同又は非相同組換え可能なベクター、又は各メーカーから市販されている様々な宿主専用発現ベクターを利用してもよい。
「標識遺伝子」は、第1発現ユニットにおける選択的構成要素であって、選抜マーカー又はレポータータンパク質とも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。「標識タンパク質」とは、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるポリペプチドをいう。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出するものであってもよいし、色素のような標識タンパク質の活性によって発生する代謝物を介して間接的に検出するものであってもよい。検出は、生物学的検出(抗体、アプタマー等のペプチドや核酸の結合による検出を含む)、化学的検出(酵素反応的検出を含む)、物理的検出(行動分析的検出を含む)、又は検出者の感覚的検出(視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む)により行うことができる。標識遺伝子は、第1発現ユニットを保有する宿主細胞又は形質転換体を判別する目的で用いられる。
「ターミネーター」は、前記TAL領域及び転写活性領域からなるキメラ遺伝子の3’末端側、好ましくは終止コドンの下流に配置される塩基配列であって、前記プロモーターにより発現したキメラ遺伝子の転写を終結できる配列である。ターミネーターの種類は、特に限定はしない。好ましくはプロモーターと同一生物種由来のターミネーターである。例えば、大腸菌であれば、リポポリプロテインlppの3’ターミネーター、trpオペロンターミネーター、amyBターミネーター、ADH1遺伝子のターミネーター等が使用できる。カイコ等の昆虫であれば、配列番号33で表される塩基配列からなるhsp70ターミネーター、配列番号34で表される塩基配列からなるSV40ターミネーター等が使用できる。一遺伝子発現制御においてゲノム上で前記プロモーターと対になっているターミネーターは特に好ましい。
「5’UTR(5’untranslated region)及び3’UTR(3’untranslated region)」は、それ自身がアミノ酸や機能性核酸をコードしない非翻訳領域からなるポリヌクレオチドである。各UTRを構成する塩基配列は、限定はしない。第1発現ユニットにおいて5’UTRは、前記キメラ遺伝子の開始コドンの上流(5’末端側)に配置され、3’UTRは、キメラ遺伝子の終止コドンの下流(3’末端側)に配置される。なお、3’UTRは、ポリAシグナルを含むことができる。
「エンハンサー」は、第1発現ユニットにおける選択的構成要素であって、ベクター内の遺伝子又はその断片の発現効率を増強できる塩基配列からなる。その種類及び塩基配列は、特に限定はされない。
「インスレーター」は第1発現ユニットにおける選択的構成要素であって、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けることなく、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、安定的に制御できる塩基配列である。例えば、ニワトリのcHS4配列やショウジョウバエのgypsy配列などが挙げられる。
「トランスポゾンの逆位末端反復配列(ITRs:inverted terminal repeat sequence)」は、第1発現ユニットを相同組換え可能な発現ベクターとする場合に含まれ得る選択構成要素である。逆位末端反復配列は、通常は2個1組で使用される。トランスポゾンの具体例として、宿主が昆虫であれば、piggyBac、mariner、minos等を用いることができる(Shimizu,K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9, 277-281;Wang W. et al.,2000, Insect Mol Biol 9(2):145-55)。
前記第2発現ユニットは、図1Bに示すように、TAL認識配列とその制御下に配置された目的遺伝子等を含み、その他に、母核ベクターを必須の構成要素として含む。また、必要に応じて標識遺伝子、ターミネーター、エンハンサー、5’UTR及び3’UTR、インスレーター及びトランスポゾンの逆位末端反復配列等の選択的構成要素を含むこともできる。以下、TAL認識配列、及び目的遺伝子等について説明する。なお、第2発現ユニットに含まれる母核ベクター及び選択的構成要素については、前記第1発現ユニットで説明した対応する構成要素と基本構成は同じであることから、ここでの説明は省略する。
本明細書において「TAL認識配列」とは、第1発現ユニットにコードされたキメラタンパク質のTALドメインによって特異的に認識される塩基配列である。第1発現ユニットのTALドメインと第2発現ユニットのTAL認識配列は原則として1対1の関係にあり、当該関係によって一組のバイナリー遺伝子発現システムが構成されている。ただし、1つの第1発現ユニットのTALドメインが認識し得るTAL認識配列を、複数の異なる第2発現ユニットが包含する場合には、1対複数の関係となり、第1発現ユニットが複数の第2発現ユニットと組を形成することができる。本発明のバイナリー遺伝子発現システムでは、第1及び第2発現ユニットにおける前記1対1の特異性を利用して、異なる複数組のバイナリー遺伝子発現システムを一個体に導入することによって、各組の第2発現ユニットに含まれる目的遺伝子の発現を、時期特異的及び/又は組織特異的に制御することが可能となる。
本明細書において「目的遺伝子又はその断片」は、第2発現ユニットに含まれ、本発明のバイナリー遺伝子発現システムによって発現を増強する対象となる任意の遺伝子又はその断片である。遺伝子の種類は、特に限定されず、所望のタンパク質若しくはそのペプチド断片をコードする核酸、又は機能性核酸をコードする核酸とすることができる。
2−1.概要
本発明の第2の態様は形質転換体である。本態様の形質転換体は、第1態様に記載のバイナリー遺伝子発現システムを構成する第1発現ユニット及び/又は第2発現ユニットを細胞内に包含する。本発明の形質転換体は、バイナリー遺伝子発現システムを構成するいずれか一方の発現ユニットを含む系統の維持を容易にする。また2つの発現ユニットを含む個体において、第2発現ユニットに含まれる目的遺伝子等の発現を増強させることができる。さらに複数組のバイナリー遺伝子発現システムを個体に導入することで、それぞれのシステムの第2発現ユニットに含まれる目的遺伝子の発現時期や発現場所を個別に制御することができる。
本明細書において「形質転換体」とは、第1態様に記載のバイナリー遺伝子発現システムを構成する第1発現ユニット及び/又は第2発現ユニットを細胞内に包含する導入体をいう。より具体的には、第1態様に記載のバイナリー遺伝子発現システムを構成する第1発現ユニット及び/又は第2発現ユニット(本明細書ではしばしば「第1及び/又は第2発現ユニット」と略称する)を宿主に導入し、形質転換させた第1世代、及びその第2世代以降の後代、又はそれぞれの発現ユニットを包含する形質転換体を交配して得られる2つの発現ユニットを含むF1個体及びその第2世代以降の後代が該当する。ただし、形質転換体が包含する第2発現ユニットのTAL認識配列が配列番号9で示す塩基配列を5〜25個連結した繰り返し配列からなる場合、その形質転換体は、本発明の形質転換体から除外される。
各発現ユニットの宿主導入方法について、説明をする。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、遺伝子発現増強個体の作出方法である。本発明の作出方法は、第1態様のバイナリー遺伝子発現システムにおける第1及び第2発現ユニットの両方を含むF1形質転換体を作出する方法である。得られた形質転換体は、第2発現ユニットに包含される目的遺伝子等の発現を増強することができる。
本発明の作出方法は、交配工程及び選択工程を必須工程として含む。以下、各工程について説明をする。
「交配工程」とは、第2態様に記載の第1発現ユニットのみを有する形質転換体と第2発現ユニットのみを有する形質転換体とを交配させる工程である。
「選択工程」とは、前記第1及び第2発現ユニットを有する個体を選択する工程である。本工程では、交配工程後に得られるF1個体から、それぞれの発現ユニットにコードされた標識タンパク質の活性に基づいて、両発現ユニットを有する個体を選抜することによって達成し得る。
(目的)
本発明のバイナリー遺伝子発現システムを構築するために、UASを認識するTALドメインをコードする様々な第1発現ユニットを構築し、第2発現ユニットに対する目的遺伝子の発現効率を検証する。
(1)第1発現ユニットの構築
第1発現ユニットのベースとなるベクターには、Takasuら(Takasu Y., et al., 2013, PLoS ONE 8: 9, e73458. doi:10.1371/journal.pone.0073458)により構築されたカイコ用TALEN発現ベクターpBlue-TALを用いた。
本実施例で使用する第2発現ユニットは、GAL4/UASシステムのUAS系統と基本構成は同じであり、UASリピートの下流に目的遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子が連結された構造を有する。
第1発現ユニットの転写活性化能を調べるため、カイコ培養細胞でルシフェラーゼアッセイを行った。第1発現ユニットUASTAL(1-3)-GAL4AD/pIB及び第2発現ユニットpUAS-fLucをpRL-TK(プロメガ:内部標準用)と共にカイコ培養細胞BmN4にトランスフェクションした。陽性対照として従来のGAL4/UASシステムにおけるGAL4系統の転写活性化能も測定した。なお、陽性対照におけるUAS系統は第2発現ユニットと同一である。
図3のレーン2〜4に結果を示す。陽性対照(GAL4/UASシステムのGAL4系統)はレーン1である。TAL領域にGAL4ADの全長コードする領域を連結するだけでは、UASTAL1〜3のいずれの場合も陽性対照と比較して、転写活性化能が減少することが明らかとなった。この理由として、標的認識配列が単純なリピート配列であることに起因する、UASTALの立体障害に原因がある可能性が考えられた。
(目的)
実施例1の第1発現ユニットでは、従来のGAL4/UASシステムを超える転写活性化能を得ることができなかった。そこで、UASTALの立体障害を減少させるために転写活性ドメインを短縮化した新たな第1発現ユニットを構築し、第2発現ユニットに対する目的遺伝子の発現効率を再度検証する。
(1)第1発現ユニットの構築
本実施例では、第1発現ユニットにおける転写活性領域を、実施例1のGAL4転写活性化ドメインの全長に替えて、ARII又はVP16を用いた。ARIIはGAL4転写活性化ドメインのC末端側に位置する最小活性単位(転写活性単位)であり、VP16は単純ヘルペスウイルスのVP16の転写活性化ドメインである。なお、TAL領域には、実施例1で最も転写活性化能が高かったUASTAL3と次に転写活性化能が高かったUASTAL2を用いた(以下これら2つをまとめて、しばしば「UASTAL(2-3)」と表記する。
・UASTAL(2-3)-ARII(x2)の構築
まず、GAL4遺伝子において配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるARIIをコードする領域(ARII領域;配列番号17)を、BamHI GAL4ARII U(配列番号46)及びBgl GAL4ARII L(配列番号47)をプライマーとし、pBac[Ser1-GAL4/3xP3-DsRed]を鋳型に用いて、PCRにより増幅した。PCRは、実施例1の記載の方法に準じた。次に、増幅産物をBamHIで消化した後、得られたBamHI断片を実施例1で調製したpBlue-Bsm-UASTAL(2-3)-BamHI-XhoIadのBamHIサイトへ挿入した。得られたベクターを「pBlue-Bsm-UASTAL(2-3)-ARII」とした。
・UASTAL3-VP16(x2)の構築
まず、配列番号18で表されるアミノ酸配列からなるVP16をコードする領域(VP16領域;配列番号19)を、BamHI VP16 U(配列番号48)及びBgl VP16operon L(配列番号49)をプライマーとし、人工合成した遺伝子を鋳型に用いて、PCRにより増幅した。人工合成遺伝子は、配列番号19で示される塩基配列に基づいて、ユーロフィンジェノミクス株式会社に合成を委託した。
上記UASTAL(2-3)-ARII(x2)の培養細胞へのトランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイについては、実施例1に記載の方法に準じた。第2発現ユニットには、実施例1で作製したpUAS-fLucを用いた。
図3のレーン5〜10に結果を示す。陽性対照(GAL4/UASシステムのGAL4)はレーン1である。レーン5及び6はそれぞれUASTAL2-ARII/pIB及びUASTAL2-ARIIx2/pIBを、レーン7及び8はそれぞれUASTAL3-ARII/pIB及びUASTAL3-ARIIx2/pIBを、そしてレーン9及び10はそれぞれUASTAL3-VP16/pIB及びUASTAL3-VP16x2/pIBを示す。
(目的)
実施例2で構築した第1発現ユニットによる本発明のバイナリー遺伝子発現システムの発現効率をさらに向上させるため、第1発現ユニットの転写活性単位であるARIIやVP16の個数(繰り返し数)と転写活性化能の関係を検証する。
(1)第1発現ユニットの構築
・UASTAL3-ARII(xX)(ここで「X」は3〜6の整数)の構築
基本的な方法は、実施例2に準じた。ここでは、新たに実施例2で得られたBamHI断片をpBlue-Bsm-UASTAL3-ARIIx2のBamHIサイトに挿入し、ARIIを3連結した。また、このベクターに対して同様の操作を繰り返して、ARIIを4連結、5連結、そして6連結にした。得られたベクターをまとめて「pBlue-Bsm-UASTAL3-ARIIx(3-6)」と表記する。各ベクターをSnaBI及びXhoIで消化し、SnaBI-XhoI断片をpIB/V5-His(life technologies)のEcoRV/XhoIサイトへ挿入し、第1発現ユニットを「UASTAL2-ARIIx(3-6)/pIB」とした。
・UASTAL3-VP16(xX)(ここで「X」は3〜6の整数)の構築
基本的な方法は、実施例2、及び上記UASTAL3-ARII(xX)の構築に準じた。ここで得られた第1発現ユニットを「UASTAL2-VP16x(3-6)/pIB」とした。
基本的な方法は、実施例1及び2に準じた。対照用として、実施例2で構築したGAL4/pIB、及び実施例2で構築したUASTAL2-ARII/pIB、UASTAL2-ARIIx2/pIB、UASTAL3-VP16/pIB及びUASTAL3-VP16x2/pIBを用いた。
図4のレーン2〜13に結果を示す。陽性対照(GAL4/UASシステムのGAL4)はレーン1である。図中の値は、GAL4の測定値を1としたときの相対値で示している。レーン2〜7は、それぞれARIIを1個、2個、3個、4個、5個及び6個連結した第1発現ユニットを用いた結果であり、またレーン8〜13は、それぞれVP16を1個、2個、3個、4個、5個及び6個連結した第1発現ユニットを用いた結果である。
(目的)
第1発現ユニットにコードされたTALドメインによって認識される第2発現ユニットの標的塩基配列の塩基数と転写活性効率との関係について検証する。
第1発現ユニットの構築は、基本的に第1実施例の記載の方法に従った。ただし、本実施例では標的塩基配列の塩基数が14個のUASTAL3をベースとして、配列番号9で示す塩基配列からなるGAL4認識配列上で3’側に標的塩基配列を1塩基ずつ20個まで伸長させた6種類のTAL領域、すなわちUASTAL4(標的塩基配列の塩基数15個)、UASTAL5(同16個)、UASTAL6(同17個)、UASTAL7(同18個)、UASTAL8(同19個)、及びUASTAL2を有する第1発現ユニットを作製した。なお、標的塩基配列の塩基数が20個の有する第1発現ユニットには、実施例1で構築したUASTAL2のTAL領域を転用した。第2発現ユニットは、実施例1と同じpUAS-fLucを用いた。
図5に結果を示す。標的塩基配列の塩基数が14個又は15個の場合、陽性対照(GAL4)よりも高い転写活性を示したが、16個以上になると、転写活性が顕著に低下した。標的塩基配列の塩基数が20個のときの転写活性の低さは、実施例1の結果とも矛盾しなかった。したがって、本発明のバイナリー遺伝子発現システムにおいて、標的塩基配列の最適塩基数は14又は15塩基であることが明らかとなった。
(目的)
第1発現ユニットにコードされたTALドメインの標的塩基配列特異性について検証する。
(1)各発現ユニットの構築
第1発現ユニットは実施例2で構築したUASTAL3-ARIIx2を含む第1発現ユニットを、また第2発現ユニットは実施例1で構築したTAL認識配列をUASとし、ルシフェラーゼ遺伝子を目的遺伝子とするUAS-fLucを含む第2発現ユニットを、それぞれベースとした。
基本的な方法は、実施例1に記載の方法に準じた。ここでは、第1発現ユニット(GAL4/pIB、UASTAL4-ARIIx2/pIB、及びUASTAL4m2-ARIIx2/pIBと、第2発現ユニット(pUAS4-fLuc、pUAS4m2-fLuc、及びpUAS4m4-fLuc)を組み合わせてカイコ培養細胞BmN4にトランスフェクションし、ルシフェラーゼアッセイを行った。
図6に結果を示す。第1発現ユニットがGAL4を含む場合、第2発現ユニットはUAS4、UAS4m2、及びUAS4m4のいずれに対しても転写活性化能を示した。これはGAL4のGAL4認識配列に対する配列特異性が低いことを示している。一方、本発明のバイナリー遺伝子発現システムの構成を有するUASTAL4-ARIIx2は、UASTAL4の標的塩基配列を含むUAS4に対してのみ高い転写活性化能を示した。また、同様にUASTAL4m2-ARIIx2は、UASTAL4m2の標的塩基配列を含むUAS4m2に対してのみ高い転写活性化能を示した。これらの結果は、UASTALを用いた本発明のバイナリー遺伝子発現システムは、標的塩基配列に対する配列特異性が高いことを示している。したがって、本発明のバイナリー遺伝子発現システムを用いることにより、複数の遺伝子の発現を別個に時間的又は空間的に制御可能であること、また、従来のGAL4/UASシステムとの互換性を維持していることを示唆している。
(目的)
実施例2〜5では、カイコの培養細胞を用いて本発明のバイナリー遺伝子発現システムの発現効率を検証した。そこで、本実施例では、遺伝子組換えカイコを用いたときの本発明のバイナリー遺伝子発現システムの発現効率を検証する。
(1)中部絹糸腺特異的第1発現ユニット
本実施例では、カイコの中部絹糸腺におけるUASTAL3の転写活性化能について検証する。
・Ser1p-UASTAL3-ARII(xX)(ここで「X」は1、4又は6)の構築
中部絹糸腺特異的プロモーターであるセリシン1プロモーターに連結したUASTAL3-ARIIの第1発現ユニットを構築した。
・Ser1p-UASTAL3-VP16(xX)(ここで「X」は3又は6)の構築
中部絹糸腺特異的プロモーターであるセリシン1プロモーターに連結したUASTAL3-VP16の第1発現ユニットを構築した。基本的な方法は、前記Ser1p-UASTAL3-ARII(xX)の構築方法に準じて行った。
UASの下流にセリシン1遺伝子の分泌シグナル(配列番号58)をコードする塩基配列(配列番号59)と、その3’末端側に付加したクローニング用付加塩基配列(配列番号60)と目的の水溶性ペプチドDNAとしてのEGFP遺伝子(配列番号62)を結合し、その下流にセリシン1の3’UTR(配列番号63)を連結したpBacSerUAS-ser_sigEGFP/3xP3EGFPを構築した。
カイコの系統は、農業生物資源研究所で維持されている白眼・白卵・非休眠系統のw1-pnd系統を宿主系統として用いた。飼育条件は、25〜27℃の飼育室で、幼虫の全齢を人工飼料(シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工)で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した(Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol, 75:89-97)。
前記各遺伝子組換えカイコを飼育し、5齢6日目の吐糸直前に氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットで中部絹糸腺を傷つけないように摘出した(森靖編,カイコによる新生物学実験,三省堂, 1970,pp.249-255参照)。次に、中部絹糸腺1本当たり10 mLのPBS(pH 7.2)/1%Tween20/0.05%アジ化ナトリウムに入れて、室温で24時間振とうすることによって水溶性タンパク質を抽出した。得られた水溶性タンパク質抽出液を、2,000×gで10分間遠心し、上清を回収した。上清に含まれる水溶性タンパク質中のEGFPタンパク質濃度をReacti-Bind Anti-GFP Coated Plates(PIERCE)で測定した。具体的にはReacti-Bind Anti-GFP Coated Platesに上清液を100 μL添加し、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、horseradish peroxidase-conjugated anti-GFP antibody (Rockland Immunochemicals)を添加して、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、TMB Peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad)を用いて発色反応を行い、1N 硫酸を加えて反応を停止させた。発色をplate reader (SpectraMax 250; Molecular Devices)で定量した。標準曲線は、リコンビナントGFPタンパク質(タカラバイオ; Z2373N)の系列希釈液(1〜400pg/μL)を用いて作製した。
図7に結果を示す。ARIIやVP16を複数回繰り返し融合したUASTAL3第1発現ユニットでは、従来のGAL4を用いた対照用第1発現ユニットと比較して、非常に高いEGFPの発現が観察された。特にARIIの4回繰り返したUASTAL3-ARIIx4を用いた場合、最大で約6倍の発現量が得られた。この結果から、カイコ培養細胞での結果と同様に、遺伝子組換えカイコにおいても本発明のバイナリー遺伝子発現システムは、GAL4/UASシステムと比較して、目的遺伝子等の発現効率の向上に非常に有効であることが明らかになった。
(目的)
GAL4/UASシステムではGAL4を含む第1発現ユニットが宿主に対して細胞毒性を示す。そこで、本発明のバイナリー遺伝子発現システムにおける第1発現ユニットの宿主に対する細胞毒性について検証する。
遺伝子組換えカイコとして第1発現ユニットのpBac[Ser1-GAL4/3xP3-DsRed]を有するw1-pnd系統、及びpBac[Ser1-UASTAL3-ARIIx4/3xP3-DsRed]を有するw1-pnd系統を実施例4に記載の方法に準じて飼育し、各遺伝子組換えカイコが作った繭、蛹から、繭層重、営繭率、化蛹歩合を計算した。
図8に繭層重、営繭率、化蛹歩合の結果を、また図9にSDS-PAGEの結果を示す。図8Aは繭層重を、図8Bは営繭率を、そして図8Cは化蛹歩合である。当該分野では、中部絹糸腺でGAL4を発現させると、GAL4による細胞毒性により、繭層重、営繭率、化蛹歩合、及び中部絹糸腺で発現するセリシン1の発現量などが低下することが知られている。
(目的)
本発明のバイナリー遺伝子発現システムがカイコ生体内において組織ごとに機能できることを検証する。
(1)中部及び後部絹糸腺特異的第1発現ユニットの構築
中部絹糸腺特異的第1発現ユニットは、中部絹糸腺特異的プロモーターであるセリシン1プロモーターにUASTAL4-ARIIx4を連結したpBac[Ser1-UASTAL4-ARIIx4/3xP3-DsRed]とした。Ser1-UASTAL4-ARIIx4の具体的な構築方法は、実施例6の「(1)中部絹糸腺特異的第1発現ユニット」に記載のSer1-UASTAL3-ARIIx4の方法に準じ、またUASTAL4の構築は実施例5に記載の方法に準じた。なお、UASTAL4は図6の結果で示したようにUAS4を認識する。
中部絹糸腺特異的第1発現ユニットと対を成す第2発現ユニットは、UAS4の下流に目的のタンパク質遺伝子としてのEGFP遺伝子(配列番号62)を連結し、その下流にセリシン1の3’UTR(配列番号63)を連結したpBacUAS4-EGFP/3xP3EYFPとした。pBacUAS4-EGFP/3xP3EYFPの構築では、まず、pBacUAS4-EGFP/3xP3EGFPを作製した。pBacUAS4-EGFPの具体的な構築方法は、実施例6の「(1)中部絹糸腺特異的第1発現ユニット」に記載のpBacSerUAS-ser_sigEGFP/3xP3EGFPの方法に準じた。また、3xP3EYFPについては、Tada M. et al., 2015,. MAbs. 7(6):1138-1150に記載の方法に従い作製した。その後、pBacUAS4-EGFP/3xP3EGFPの3xP3EGFPマーカーを3xP3EYFPに置換して、目的のpBacUAS4-EGFP/3xP3EYFPを得た。
2組のバイナリー遺伝子発現システム、すなわち中部絹糸腺特異的バイナリー遺伝子発現システムの第1発現ユニットであるpBac[Ser1-UASTAL4-ARIIx4/3xP3-DsRed]及び第2発現ユニットであるpBacUAS4-EGFP/3xP3EYFP、並びに後部絹糸腺特異的バイナリー遺伝子発現システムの第1発現ユニットであるpBac[FibH-UASTAL4m2-ARIIx4/A3-KMO]、及びそれに対応する第2発現ユニットであるpBacUAS4m2-DsRed/3xP3AmCyanの計4つの発現ユニットをカイコに導入し、遺伝子組換えカイコを作出した。遺伝子組換えカイコの作出は、実施例6に記載の「(3)遺伝子組換えカイコの作出」の方法に準じた。
2組のバイナリー遺伝子発現システムを有する遺伝子組換えカイコは、実施例6に記載の「(3)遺伝子組換えカイコの作出」に記載の方法で飼育し、5齢6日目の吐糸直前に氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットで絹糸腺を傷つけないように摘出した。これを固定せずに蛍光顕微鏡(オリンパスSZX16、GFP HQフィルター&RFPフィルター)で観察した。
摘出した絹糸腺を中部絹糸腺と後部絹糸腺に切り分けて、それぞれから常法によりtotal RNAを調製し、EGFPプライマーペア(配列番号64及び65)及びDsRedプライマーペア(配列番号66及び67)を用いてRT-PCRを行った。陰性対照にはバイナリー遺伝子発現システムを持たない宿主系統(w1-pnd系統)を用いた。
図10−1は、2組のバイナリー遺伝子発現システムを有する遺伝子組換えカイコの絹糸腺の蛍光図を示す。中部絹糸腺特異的バイナリー遺伝子発現システムは、目的タンパク質の遺伝子としてEGFP遺伝子を、また後部絹糸腺特異的バイナリー遺伝子発現システムは、目的タンパク質の遺伝子としてDsRed遺伝子をコードしていたが、A〜CよりEGFPは中部絹糸腺のみで、またDsRedは後部絹糸腺のみで発現していることが確認された。さらにD〜F及びG〜Iからも明らかなように、中部絹糸腺と後部絹糸腺の境界線においてもEFGPとDsRedの発現制御は顕著であり、蛍光レベルでは両者間で発現の漏れは見られなかった。
(目的)
実施例6では、カイコ生体内での本発明のバイナリー遺伝子発現システムによる中部絹糸腺での発現効率を検証した。本実施例では、カイコ生体内での本発明のバイナリー遺伝子発現システムによる後部絹糸腺での発現効率を検証する。
(1)後部絹糸腺特異的第1発現ユニット
後部部絹糸腺特異的プロモーターであるフィブロインHプロモーターにUASTAL3-ARIIを連結した第1発現ユニットpBac[FibH-UASTAL3-ARIIx4/3xP3-DsRed]を構築した。基本手順は、実施例6の「(1)中部絹糸腺特異的第1発現ユニット」に記載の方法に準じた。
UAS4の下流にEGFP遺伝子を結合し、その下流にセリシン1の3’UTRを連結したpBacUAS-sigEGFP/3xP3EYFPを構築した。
基本手順は、実施例6の「(3)遺伝子組換えカイコの作出」に記載の方法に準じた。
基本手順は、実施例6の「(4)EGFPの定量」に記載の方法に準じた。
図11に結果を示す。本発明の後部絹糸腺特異的なバイナリー遺伝子発現システムによれば、従来のGAL4を用いた対照用第1発現ユニットと比較して、いずれの系統も10倍以上高いEGFPの発現が観察された。この結果から、本発明のバイナリー遺伝子発現システムは、中部絹糸腺と同様に後部絹糸腺においても従来のGAL4/UASシステムと比較して、目的遺伝子等の発現効率の向上に非常に有効であることが示された。
Claims (10)
- 第1発現ユニット及び第2発現ユニットからなるバイナリー遺伝子発現システムであって、
前記第1発現ユニットはプロモーター、及びその制御下に配置された、TALドメインをコードする塩基配列からなるTAL領域及びその下流に連結され転写活性ドメインをコードする塩基配列からなる転写活性領域を含み、ここで、
前記TALドメインは、標的塩基配列を認識するN末端部位及びTAL-DNA塩基配列認識部位を含み、
前記転写活性ドメインは、ARII又はVP16からなる転写活性単位が2〜10個連結された配列からなり、また
前記第2発現ユニットは、TAL認識配列、及びその制御下に配置された目的遺伝子若しくはその断片を含み、ここで、
前記TAL認識配列は、5'末端のt及びそれに続く主要標的塩基配列からなる前記標的塩基配列を5〜25個含む塩基配列からなり、
前記第1発現ユニットのTALドメインにおいて、
前記N末端部位は前記第2発現ユニットの前記標的塩基配列における5'末端のtを、また前記TAL-DNA塩基配列認識部位は前記第2発現ユニットの前記主要標的塩基配列を、それぞれ認識し、そして
前記TAL-DNA塩基配列認識部位は前記主要標的塩基配列を構成するそれぞれの塩基に対して配列番号3で表されるアミノ酸配列からなり、
前記第2発現ユニットのTAL認識配列において、
前記主要標的塩基配列は
(a)配列番号4で表される塩基配列、
(b)配列番号5で表される塩基配列、及び
(c)配列番号4又は5において配列番号6で表される塩基配列の1〜5個の塩基が置換された塩基配列
のいずれかからなる、
前記システム。 - 前記配列番号4で表される塩基配列が配列番号7で表される塩基配列である、請求項1に記載のバイナリー遺伝子発現システム。
- 前記配列番号5で表される塩基配列が配列番号8で表される塩基配列である、請求項1に記載のバイナリー遺伝子発現システム。
- 前記TAL認識配列は標的塩基配列を含む配列番号9で表される塩基配列が5〜25個連結された繰り返し配列からなる、請求項2又は3に記載のバイナリー遺伝子発現システム。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のバイナリー遺伝子発現システムにおける第1発現ユニットを含むヒト個体以外の形質転換体。
- 請求項4に記載のバイナリー遺伝子発現システムにおける第2発現ユニットを除く、請求項1〜3のいずれか一項に記載のバイナリー遺伝子発現システムの第2発現ユニットを含むヒト個体以外の形質転換体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のバイナリー遺伝子発現システムにおける第1発現ユニット及び第2発現ユニットを含むヒト個体以外の形質転換体。
- 前記形質転換体がチョウ目昆虫である、請求項5〜7のいずれか一項に記載の形質転換体。
- 前記チョウ目昆虫がカイコである、請求項8に記載の形質転換体。
- 請求項5に記載の第1発現ユニットを有する形質転換体であるカイコと請求項6に記載の第2発現ユニットを有する形質転換体であるカイコとを交配させる工程、及び
前記交配工程後に第1及び第2発現ユニットを有するカイコを選択する工程
を含む目的遺伝子又はその断片の発現効率を増強したカイコの作出方法。
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