JP6964032B2 - Sample container - Google Patents
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Description
この発明は、光干渉断層撮像に供される生試料を液体とともに担持する試料容器に関するものである。 The present invention relates to a sample container that carries a raw sample to be subjected to optical coherence tomography together with a liquid.
医学や生化学の技術分野では、容器中で培養された細胞や微生物を観察することが行われる。観察対象となる細胞等に影響を与えることなく観察を行う方法として、顕微鏡等を用いて細胞等を撮像する技術が提案されている。このような技術の１つとして、光コヒーレンストモグラフィ（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）技術を利用したものがある。この技術は、光源から出射される低コヒーレンス光を照明光として被撮像物に入射させ、被撮像物からの反射光（信号光）と光路長が既知である参照光との干渉光を検出することで、被撮像物からの反射光の深さ方向における強度分布を求めて断層画像化するものである。 In the technical fields of medicine and biochemistry, observation of cells and microorganisms cultured in a container is performed. As a method of observing cells or the like without affecting the cells or the like to be observed, a technique of imaging cells or the like using a microscope or the like has been proposed. As one of such techniques, there is one using optical coherence tomography (OCT) technique. In this technique, low coherence light emitted from a light source is incident on an imaged object as illumination light, and interference light between reflected light (signal light) from the imaged object and reference light having a known optical path length is detected. Therefore, the intensity distribution of the reflected light from the imaged object in the depth direction is obtained and a tomographic image is formed.
細胞等の生試料を光学的に観察または撮像する場合、生試料は、一般的には液体とともに試料容器中に入った状態で撮像に供される。このような生試料の撮像は、例えば試料容器の壁面を介して行うことが可能である。しかしながら、このような壁面を介した撮像に好適な透明材料は、その屈折率が容器中の液体の屈折率と大きな差を持つ場合が多い。このため、容器壁面での光の反射が撮像結果に影響を及ぼすことがある。 When a raw sample such as a cell is optically observed or imaged, the raw sample is generally subjected to imaging in a state of being contained in a sample container together with a liquid. Imaging of such a raw sample can be performed, for example, through the wall surface of the sample container. However, the refractive index of a transparent material suitable for imaging through such a wall surface often has a large difference from the refractive index of the liquid in the container. Therefore, the reflection of light on the wall surface of the container may affect the imaging result.
このような問題に対応するため、例えば特許文献１に記載の技術では、試料を保持する容器の透明な底面に反射防止コートが施されている。この技術における反射防止コートは、容器底面の下側表面、つまり容器底面と外気との界面に相当する箇所に設けられている。これは、容器材料と空気との屈折率の差が容器材料と液体との屈折率の差よりも大きいことから、容器と外部の空気との界面における反射がより顕著であることに着目したものである。
In order to deal with such a problem, for example, in the technique described in
一方、ＯＣＴ撮像においては、容器内底面、つまり容器底部のうち容器中の液体に接する上面と液体との界面での反射が問題となり得る。というのは、この反射光が強いと、断層画像内における容器の内底面の位置に「底面の像」が強く現れ、これが画像ノイズとして作用して、内底面付近にある生試料の像が隠ぺいされたり、生試料の像と底面の像とが一体になってしまいそれらの分離ができなくなったりするからである。このような現象は生試料の観察に支障を来す。 On the other hand, in OCT imaging, reflection at the inner bottom surface of the container, that is, the upper surface of the bottom of the container in contact with the liquid in the container and the interface between the liquid can be a problem. This is because when this reflected light is strong, a "bottom image" appears strongly at the position of the inner bottom surface of the container in the tomographic image, which acts as image noise and hides the image of the raw sample near the inner bottom surface. This is because the image of the raw sample and the image of the bottom surface become one and cannot be separated from each other. Such a phenomenon interferes with the observation of the raw sample.
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、光干渉断層撮像に供される生試料を得液体とともに担持する試料容器において、画像に現れる容器底面の像が観察の妨げとなるのを防止することのできる技術を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and prevents the image of the bottom surface of the container appearing in the image from interfering with the observation in the sample container in which the raw sample to be subjected to optical coherence tomography is carried together with the liquid. The purpose is to provide a technology that can be used.
この発明の一の態様は、液体を貯留可能な貯留空間を形成する凹部を有し、光干渉断層撮像用の生試料を前記液体とともに前記貯留空間に担持するための試料容器であって、上記目的を達成するため、前記凹部の底部のうち前記貯留区間に面する内底面と、前記内底面とは反対側の外底面との間で赤外線透過性を有し、前記内底面が、屈折率１．３５以下のフッ素樹脂により形成されている。 One aspect of the present invention is a sample container having a recess forming a storage space capable of storing a liquid and carrying a raw sample for optical interference tomography in the storage space together with the liquid. In order to achieve the purpose, the inner bottom surface of the bottom portion of the recess facing the storage section and the outer bottom surface opposite to the inner bottom surface have infrared transmission, and the inner bottom surface has a refractive index. It is made of 1.35 or less fluororesin.
このように構成された発明では、液体を担持する凹部の底部が赤外線透過性を有しており、したがって底部を介して生試料の光干渉断層撮像を行うのに適している。また、底部のうち貯留区間に面する、したがって貯留空間に液体が貯留されているときには液体と接する内底面が屈折率１．３５以下のフッ素樹脂により形成されている。例えば屈折率が１．３３ないし１．３５のフッ素樹脂を好適に適用可能である。 In the invention configured in this way, the bottom of the recess that carries the liquid has infrared transmission, and is therefore suitable for performing optical interference tomography of a raw sample through the bottom. Further, the inner bottom surface of the bottom surface facing the storage section, and therefore in contact with the liquid when the liquid is stored in the storage space, is formed of a fluororesin having a refractive index of 1.35 or less. For example, a fluororesin having a refractive index of 1.33 to 1.35 can be preferably applied.
細胞等の生試料とともに貯留空間に貯留される液体は水を主体とするものであり、その屈折率は、添加される化学物質の種類や量による変動があるが、概ね１．３３ないし１．３５程度である。このことから、これと同程度の屈折率を有する材料により試料容器の内底面を構成すれば、液体と内底面との界面が光学的には無視できることになる。ここで、市場に流通しているフッ素樹脂材料の屈折率は、製品によって異なるが１．３３ないし１．４２程度である。このうち例えば屈折率１．３４のものは、水とほぼ同じ屈折率を有するから、上記した内底面を構成する材料として好適なものである。 The liquid stored in the storage space together with the raw sample such as cells is mainly water, and its refractive index varies depending on the type and amount of the added chemical substance, but is generally 1.33 to 1. It is about 35. From this, if the inner bottom surface of the sample container is made of a material having a refractive index similar to this, the interface between the liquid and the inner bottom surface can be optically ignored. Here, the refractive index of the fluororesin material on the market varies depending on the product, but is about 1.33 to 1.42. Of these, for example, one having a refractive index of 1.34 has substantially the same refractive index as water, and is therefore suitable as a material constituting the inner bottom surface described above.
このように容器内底面を適宜に選択されたフッ素樹脂材料により構成することで、内底面と液体との間の屈折率の違いに起因する反射を抑えることができる。これにより、断層画像に現れる底面の像による生試料の像の隠ぺいを防止することができる。なお、フッ素樹脂による構造物の面のうち内底面とは反対側の面での反射も画像ノイズとして問題となり得るが、容器内の生試料とは離れた位置にある面であるため、少なくとも生試料の観察には支障を及ぼさないような措置を別途取ることが可能である。例えばフッ素樹脂層の厚さを調整して、生試料の像と重なるような画像ノイズの発生を防止することができる。 By forming the inner bottom surface of the container with an appropriately selected fluororesin material in this way, it is possible to suppress reflection caused by the difference in the refractive index between the inner bottom surface and the liquid. This makes it possible to prevent the image of the raw sample from being concealed by the image of the bottom surface that appears in the tomographic image. Reflection on the surface of the structure made of fluororesin on the side opposite to the inner bottom surface can also be a problem as image noise, but since it is a surface located away from the raw sample in the container, it is at least raw. It is possible to take additional measures so as not to interfere with the observation of the sample. For example, the thickness of the fluororesin layer can be adjusted to prevent the generation of image noise that overlaps with the image of the raw sample.
上記のように、本発明によれば、試料容器の底部のうち容器に担持される液体に接する内底面が、水とほぼ同じ屈折率を有するフッ素樹脂により構成される。そのため、容器内の液体と内底面との界面での反射がほとんどなくなり、この界面での反射に起因する像が生試料の観察の妨げとなるのを効果的に抑制することができる。 As described above, according to the present invention, the inner bottom surface of the bottom of the sample container in contact with the liquid supported on the container is made of a fluororesin having a refractive index substantially equal to that of water. Therefore, the reflection at the interface between the liquid in the container and the inner bottom surface is almost eliminated, and it is possible to effectively suppress that the image caused by the reflection at this interface interferes with the observation of the raw sample.
図１は本発明に係る撮像方法の実施に好適な撮像装置の一構成例を示す図である。この撮像装置１は、培地Ｍ中で培養された細胞や、多数の細胞からなるスフェロイド（細胞集塊）、組織様構造体、受精卵など（以下、「細胞等」と総称する）を撮像対象物として断層撮像し、得られた断層画像を画像処理して、撮像対象物の立体像を作成する。なお、ここでは培地中の受精卵を撮像対象物とした例を説明するが、撮像対象物はこれに限定されない。以下の各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面を表す。また、Ｚ軸が鉛直軸を表し、より詳しくは（−Ｚ）方向が鉛直下向き方向を表している。
FIG. 1 is a diagram showing a configuration example of an imaging device suitable for carrying out the imaging method according to the present invention. The
撮像装置１は保持部１０を備えている。保持部１０は、内部の貯留空間に液体を保持可能な凹部が設けられたディッシュ５を、その開口面を上向きにして略水平姿勢に保持する。ディッシュ５には適宜の培養液Ｍが所定量貯留され、培地中ではディッシュ５の底面５１付近に試料Ｓｐとしての受精卵が培養されている。
The
保持部１０により保持されたディッシュ５の下方に、撮像ユニット２０が配置される。撮像ユニット２０には、撮像対象物の断層画像を非接触、非破壊（非侵襲）で撮像することが可能な光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置が用いられる。詳しくは後述するが、ＯＣＴ装置である撮像ユニット２０は、撮像対象物への照明光を発生する光源２１と、ビームスプリッタ２２と、物体光学系２３と、参照ミラー２４と、分光器２５と、光検出器２６とを備えている。
The
また、撮像装置１はさらに、装置の動作を制御する制御ユニット３０と、撮像ユニット２０の可動機構を制御する駆動制御部４０とを備えている。制御ユニット３０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）３１、Ａ／Ｄコンバータ３２、信号処理部３３、３Ｄ復元部３４、インターフェース（ＩＦ）部３５、画像メモリ３６およびメモリ３７を備えている。
Further, the
ＣＰＵ３１は、所定の制御プログラムを実行することで装置全体の動作を司り、ＣＰＵ３１が実行する制御プログラムや処理中に生成したデータはメモリ３７に保存される。Ａ／Ｄコンバータ３２は、撮像ユニット２０の光検出器２６から受光光量に応じて出力される信号をデジタルデータに変換する。信号処理部３３は、Ａ／Ｄコンバータ３２から出力されるデジタルデータに基づき後述する信号処理を行って、撮像対象物の断層画像を作成する。３Ｄ復元部３４は、撮像された複数の断層画像の画像データに基づいて、撮像された撮像対象物の立体像（３Ｄ像）を作成する機能を有する。信号処理部３３により作成された断層画像の画像データおよび３Ｄ復元部３４により作成された立体像の画像データは、画像メモリ３６により適宜記憶保存される。
The
インターフェース部３５は撮像装置１と外部との通信を担う。具体的には、インターフェース部３５は、外部機器と通信を行うための通信機能と、ユーザからの操作入力を受け付け、また各種の情報をユーザに報知するためのユーザインターフェース機能とを有する。この目的のために、インターフェース部３５には、装置の機能選択や動作条件設定などに関する操作入力を受け付け可能な例えばキーボード、マウス、タッチパネルなどの入力デバイス３５１と、信号処理部３３により作成された断層画像や３Ｄ復元部３４により作成された立体像など各種の処理結果を表示する例えば液晶ディスプレイからなる表示部３５２とが接続されている。
The
また、ＣＰＵ３１は駆動制御部４０に制御指令を与え、これに応じて駆動制御部４０は撮像ユニット２０の可動機構に所定の動作を行わせる。次に説明するように、駆動制御部４０により実行される撮像ユニット２０の走査移動と、光検出器２６による受光光量の検出との組み合わせにより、試料Ｓｐである受精卵の断層画像が取得される。
Further, the
図２はこの撮像装置における撮像原理を説明する図である。より具体的には、図２（ａ）は撮像ユニット２０における光路を示す図であり、図２（ｂ）はスフェロイドの断層撮像の様子を模式的に示す図である。前記したように、撮像ユニット２０は光干渉断層撮像（ＯＣＴ）装置として機能するものである。
FIG. 2 is a diagram illustrating an imaging principle in this imaging device. More specifically, FIG. 2A is a diagram showing an optical path in the
撮像ユニット２０では、例えば発光ダイオードまたはスーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）などの発光素子を有する光源２１から、広帯域の波長成分を含む低コヒーレンス光ビームＬ１が出射される。光ビームＬ１はビームスプリッタ２２に入射して分岐し、破線矢印で示すように一部の光Ｌ２が１つのディッシュ５に向かい、一点鎖線矢印で示すように一部の光Ｌ３が参照ミラー２４に向かう。
In the
ディッシュ５に向かった光Ｌ２は、物体光学系２３を経てディッシュ５に入射する。より具体的には、ビームスプリッタ２２から出射される光Ｌ２は、物体光学系２３を介してディッシュ底面５１に入射する。物体光学系２３は、ビームスプリッタ２２からディッシュ５に向かう光Ｌ２をディッシュ５内の試料Ｓｐ（この場合には受精卵）に収束させる機能と、撮像対象物から出射される反射光を集光してビームスプリッタ２２に向かわせる機能とを有する。図では物体光学系２３は単一の対物レンズにより代表的に表されているが、複数の光学素子が組み合わされたものであってもよい。
The light L2 directed toward the
物体光学系２３は、駆動制御部４０に設けられた焦点調整機構４１により、Ｚ方向に移動可能に支持されている。これにより、撮像対象物に対する物体光学系２３の焦点位置がＺ方向に変更可能となっている。物体光学系２３の光軸は鉛直方向と平行であり、したがって略平面状のディッシュ底面５１に垂直である。また、物体光学系２３への照明光の入射方向は光軸と平行であり、その光中心が光軸と一致するように、物体光学系２３の配置が定められている。
The object
ユーザが入力デバイス３５１を介して焦点深さの設定情報を与えることにより、焦点調整機構４１は設定情報に応じて物体光学系２３の焦点位置を変更する。焦点調整機構４１は、例えば物体光学系２３に含まれる対物レンズを光軸方向に移動させることにより、焦点位置を変更することができる。１ステップ当たりの焦点位置の変化量が予め定められたステップ単位で焦点位置を調整する構成であってもよい。
When the user gives the setting information of the focal depth via the
試料Ｓｐが光Ｌ２に対する透過性を有するものでなければ、ディッシュ底面５１を介して入射した光Ｌ２は試料Ｓｐの表面で反射される。一方、試料Ｓｐが光Ｌ２に対してある程度の透過性を有するものである場合、光Ｌ２は試料Ｓｐ内まで進入してその内部の構造物により反射される。光Ｌ２として例えば近赤外線を用いることで、入射光を試料Ｓｐ内部まで到達させることが可能である。試料Ｓｐからの反射光は散乱光として種々の方向に放射される。そのうち物体光学系２３の集光範囲内に放射された光Ｌ４が、物体光学系２３で集光されてビームスプリッタ２２へ送られる。
If the sample Sp is not transparent to the light L2, the light L2 incident through the
参照ミラー２４は、駆動制御部４０に設けられたミラー駆動機構４２により、その反射面を光Ｌ３の入射方向に対し垂直姿勢に、しかも、該入射方向に沿った方向（図ではＹ方向）に移動可能に支持されている。参照ミラー２４に入射した光Ｌ３は反射面で反射されて、入射光路を逆向きに辿るように進む光Ｌ５としてビームスプリッタ２２に向かう。この光Ｌ５が参照光となる。ミラー駆動機構４２により参照ミラー２４の位置が変更されることにより、参照光の光路長が変化する。参照ミラー２４の位置は撮像の用途に応じて自動的に設定されるほか、入力デバイス３５１を介したユーザからの設定入力に応じて適宜変更される。
The
試料Ｓｐの表面もしくは内部の反射面で反射された反射光Ｌ４と、参照ミラー２４で反射された参照光Ｌ５とは、ビームスプリッタ２２を介して光検出器２６に入射する。このとき、反射光Ｌ４と参照光Ｌ５との間で位相差に起因する干渉が生じるが、干渉光の分光スペクトルは反射面の深さにより異なる。つまり、干渉光の分光スペクトルは撮像対象物の深さ方向の情報を有している。したがって、干渉光を波長ごとに分光して光量を検出し、検出された干渉信号をフーリエ変換することにより、撮像対象物の深さ方向における反射光強度分布を求めることができる。このような原理に基づくＯＣＴ撮像技術は、フーリエドメイン（Fourier Domain）ＯＣＴ（ＦＤ−ＯＣＴ）と称される。
The reflected light L4 reflected by the surface or the internal reflecting surface of the sample Sp and the reference light L5 reflected by the
この撮像ユニット２０では、ビームスプリッタ２２から光検出器２６に至る干渉光の光路上に分光器２５が設けられている。分光器２５としては、例えばプリズムを利用したもの、回折格子を利用したもの等を用いることができる。干渉光は分光器２５により波長成分ごとに分光されて光検出器２６に受光される。
In the
光検出器２６が検出した干渉光に応じて光検出器２６から出力される干渉信号をフーリエ変換することで、試料Ｓｐのうち、光ビームＬ２の入射位置における深さ方向、つまりＺ方向の反射光強度分布が求められる。ディッシュ５に入射する光ビームＬ２をＸ方向に走査することで、ＸＺ平面と平行な平面における反射光強度分布が求められ、その結果から当該平面を断面とする試料Ｓｐの断層画像を作成することができる。以下、本明細書では、Ｘ方向へのビーム走査によってＸＺ平面と平行な断面における１つの断層画像Ｉｔを取得する一連の動作を、１回の撮像と称することとする。
By Fourier transforming the interference signal output from the
また、Ｙ方向におけるビーム入射位置を多段階に変更しながら、その都度断層画像の撮像を行うことで、図２（ｂ）に示すように、試料ＳｐをＸＺ平面と平行な断面で断層撮像した多数の断層画像Ｉｔを得ることができる。Ｙ方向の走査ピッチを小さくすれば、試料Ｓｐの立体構造を把握するのに十分な分解能の画像データを得ることができる。Ｘ方向およびＹ方向へのビーム走査は、例えば図示しないガルバノミラー等の光路を変化させる光学部品を用いてビーム入射位置をＸＹ方向に変化させる方法、試料Ｓｐを担持するディッシュ５と撮像ユニット２０とのいずれかをＸＹ方向に移動させてこれらの相対位置を変化させる方法などにより実現可能である。
Further, by taking a tomographic image each time while changing the beam incident position in the Y direction in multiple stages, as shown in FIG. 2B, the sample Sp was tomographically imaged in a cross section parallel to the XZ plane. A large number of tomographic images It can be obtained. If the scanning pitch in the Y direction is reduced, image data having a resolution sufficient to grasp the three-dimensional structure of the sample Sp can be obtained. For beam scanning in the X and Y directions, for example, a method of changing the beam incident position in the XY direction using an optical component that changes the optical path such as a galvanometer mirror (not shown), a
なお、上記の原理説明では、撮像ユニット２０において光源２１からの光を照明光と参照光とに分岐させる分波機能、および信号光と参照光とを合成して干渉光を生じさせる機能がビームスプリッタ２２により実現されている。一方、近年では、ＯＣＴ装置においてこのような分波・合波機能を担うものとして、ビームスプリッタに代え光ファイバカプラを用いたものも使用されている。撮像装置１はそのような構成のものであってもよい。
In the above explanation of the principle, the beam is a beam that splits the light from the
図３はディッシュの構造を示す図である。このディッシュ５は、本発明に係る試料容器の一実施形態である。より具体的には、図３上段はディッシュ５の側面断面図、中段は平面図、下段はその外観を示す俯瞰図である。ディッシュ５は、略円板状の底面５１と、底面５１の周縁部が上向きに延びる筒状の側面５２とを有しており、これらに囲まれる貯留空間Ｓに液体を貯留可能である。ディッシュ５の代表的なサイズは、直径３５ｍｍ程度、高さ１０ｍｍ程度である。
FIG. 3 is a diagram showing the structure of the dish. The
ディッシュ５の底面５１のうち貯留区間ＳＰに面する内底面５１ａは概ね平坦であるが、中央部分にはこの平坦面よりも１段低くなった段差部５１０が少なくとも１つ設けられている。段差部５１０の断面形状、深さおよび個数は任意であり、複数の段差部５１０が設けられる場合にはこれらが互いに相違していてもよい。このような段差部５１０内で細胞等を培養すると、培養液内での細胞等の移動が各段差部５１０内に制限される。これにより、１つのディッシュ５で複数の細胞等が培養される場合でもこれらが混ざって相互に識別不可能となることが防止される。
Of the
図４は段差部の形状例を示す拡大断面図である。段差部５１０の底面は平坦であってもよいが、図４（ａ）ないし図４（ｃ）に示すようにその中心に窪みが設けられてもよい。図４（ａ）に示す例では、段差部５１０の略中央に逆円錐形の表面形状を有する窪み５１１ａが設けられている。また、図４（ｂ）に示す例では、段差部５１０の略中央に半球状の表面形状を有する窪み５１１ｂが設けられている。また、図４（ｃ）に示す例では、窪み５１１ｃの周囲に環状の溝５１１ｄが設けられている。図４（ｃ）では、断面図の上方に窪み５１１ｃおよび溝５１１ｄの外観を表す俯瞰図を示している。
FIG. 4 is an enlarged cross-sectional view showing an example of the shape of the step portion. The bottom surface of the
このような窪みは、段差部５１０内で培養される細胞等を段差部５１０の中央部に留めておく作用を有する。特に、スフェロイドや受精卵のように略球形をなすものは、それ自体の活動や外部からの振動によって転がり、段差部５１０内での位置が次第に変化してゆくことがあり得る。窪みを設けることにより、このような移動を抑制することができる。
Such a depression has an effect of retaining cells and the like cultured in the
また、細胞等が段差部５１０の側壁面に付着した状態となることで培養液に触れる面積が小さくなり、これにより代謝が阻害されて細胞等が衰弱するのを防止することができる。特に、図４（ｃ）に示すように窪み５１１ｃの周囲に溝５１１ｄが設けられた構成では、窪み５１１ｃに捕捉された細胞等の周囲における培養液の循環が促進され、細胞等の衰弱をより効果的に防止することができる。１つのディッシュ５に複数の段差部５１０が設けられるとき、それらの複数の段差部に設けられる窪みの形状が異なっていてもよい。すなわち、１つのディッシュ５において形状の異なる窪み５１１ａ〜５１１ｃ等が混在していてもよい。
Further, since the cells or the like are attached to the side wall surface of the
なお、試料Ｓｐとして直径１００μｍないし２００μｍ程度のスフェロイドや受精卵を観察対象とするとき、１つの段差部５１０について１つずつの試料Ｓｐを収容するのに適した各部のサイズは、例えば次のとおりである。１つの段差部５１０の直径は例えば２．５ｍｍ、深さは４００μｍ程度とすることができる。また、窪み５１１ａ〜５１１ｃの直径は、試料Ｓｐの直径と同等の例えば２００μｍないし３００μｍ程度とすることができる。また、窪み５１１ａ〜５１１ｃの深さは、試料Ｓｐの高さよりは小さく、例えば１００μｍ程度とすることができる。
When a spheroid or a fertilized egg having a diameter of about 100 μm to 200 μm is to be observed as the sample Sp, the size of each part suitable for accommodating one sample Sp for one
ディッシュ５はその全体がフッ素樹脂により構成されている。より具体的には、ディッシュ５は、屈折率が１．３５以下のフッ素樹脂により形成されている。したがって、ディッシュ５の底面５１は、その内底面と外底面との間が全てフッ素樹脂により連続的に充満した構造となっている。このようなフッ素樹脂は、撮像ユニット２０が使用する近赤外線領域で高い透過性を有する。フッ素樹脂を使用する理由は、ディッシュ５の底面５１による光の反射がＯＣＴ撮像の結果に及ぼす影響を軽減するためである。以下、この点につき詳しく説明する。
The
図５はディッシュの底面による反射の影響を示す図である。図５（ａ）に示すように、撮像ユニット２０からの光Ｌ２がディッシュ底面５１を介して培養液Ｍ中の試料Ｓｐに入射するときの反射光としては、底面５１のうち下側で外部雰囲気と接する外底面５１ｂによる反射光Ｌｒ１、培養液Ｍと接する内底面５１ａによる反射光Ｌｒ２、および試料Ｓｐからの反射光Ｌｒ３が生じる。このうち試料Ｓｐからの反射光Ｌｒ３が、撮像ユニット２０が受光すべき反射光Ｌ４である。
FIG. 5 is a diagram showing the effect of reflection by the bottom surface of the dish. As shown in FIG. 5A, when the light L2 from the
底面５１ａ，５１ｂからの反射光Ｌｒ１，Ｌｒ２は、ＯＣＴ撮像により得られる断層画像においてそれぞれの面の像を生じさせる。ここで、外底面５１ｂの像は底面５１の厚さに対応して試料Ｓｐから離れた位置に生じるから、試料Ｓｐの観察・評価には大きな影響を与えない。これに対して、試料Ｓｐに近い位置にある内底面５１ａからの反射光Ｌｒ２が強いと、高輝度で現れる内底面５１ａの像が試料Ｓｐの像と不可分に一体のものとなってしまうことがある。このことは試料Ｓｐのサイズや形状を評価する上で障害となり得る。また、光路長差の少ない内底面５１ａからの反射光Ｌｒ２と試料Ｓｐからの反射光Ｌｒ３とが干渉することで画像ノイズの原因ともなる。
The reflected lights Lr1 and Lr2 from the bottom surfaces 51a and 51b give rise to images of the respective surfaces in the tomographic image obtained by OCT imaging. Here, since the image of the outer
内底面５１ａでの反射光Ｌｒ２の強度は、内底面５１ａを構成する材料と培養液Ｍとの屈折率の差に依存する。屈折率の違いが大きいほど反射光も強くなる。一方、細胞等である試料Ｓｐの屈折率は、概ね培養液Ｍと同等である。したがって、内底面５１ａの反射光Ｌｒ２を抑えるためには、内底面５１ａを構成する材料が培養液Ｍの屈折率にできるだけ近い屈折率を有するものであることが望ましい。ここで、水を主成分とする培養液Ｍの屈折率はほぼ水の屈折率１．３３に近く、添加される物質により純水の屈折率より少し大きくなるが、概ね１．３３ないし１．３５程度である。
The intensity of the reflected light Lr2 on the
図５（ｂ）は内底面５１ａからの反射の影響が現れた画像の例を示す。この画像は、試料容器の材料として一般的なポリスチレン樹脂（屈折率１．５９）製のディッシュに収容された試料ＳｐをＯＣＴ撮像した画像である。この画像では、試料Ｓｐの像の下部で培養液Ｍとの界面に内底面５１ａの像が高い輝度で現れており、試料Ｓｐのうち内底面５１ａに近い位置の構造が隠ぺいされて不明瞭になっている。また、スフェロイドＳｐの周囲に縞状のゴーストノイズが生じている。
FIG. 5B shows an example of an image in which the influence of reflection from the
図５（ｃ）に示す画像は、屈折率１．３４のフッ素樹脂製チューブ内に収容された試料ＳｐをＯＣＴ撮像した画像である。このとき外底面５１ｂに対応する位置にはこの面での反射に起因して比較的高輝度の像が現れている。これに対し、内底面５１ａと培養液Ｍとの界面では、両者の若干の屈折率差に起因する境界線が見られるものの、特に高輝度の像は現れていない。またゴーストノイズもほとんどない。このため、試料Ｓｐの形状が明瞭に画像に現れている。
The image shown in FIG. 5C is an OCT image of the sample Sp housed in a fluororesin tube having a refractive index of 1.34. At this time, a relatively high-luminance image appears at the position corresponding to the outer
このように、試料Ｓｐを担持するディッシュ５を培養液Ｍに近い屈折率を有するフッ素樹脂により形成することで、内底面５１ａと培養液Ｍとの界面における反射を抑え、この位置に強い像が現れて試料Ｓｐの像を隠ぺいすることが回避される。フッ素樹脂材料としては種々の屈折率を有するものが製品化されているが、その中でも屈折率が培養液の屈折率に近い１．３３ないし１．３５程度であるものが、培養液Ｍの屈折率とほぼ等しいという点で好適である。特に、底面５１の内底面５１ａから外底面５１ｂまでを連続したフッ素樹脂により構成すると、両者の間に他の界面が存在しないため、界面での反射に起因する画像ノイズを効果的に防止することが可能である。
In this way, by forming the
撮像ユニット２０からの光Ｌ２が入射する外底面５１ｂについては、周囲雰囲気との屈折率の違いを解消することは困難であり、この面での反射が画像に影響を及ぼし得るが、底面５１の厚さを適宜に設定する、具体的には試料サイズに対して十分に厚くすれば、少なくとも試料Ｓｐの像に影響が及ぶことは回避できる。
Regarding the outer
なお、この実施形態のディッシュ５は実質的にその全体がフッ素樹脂により構成されているが、内底面の像が試料の像に影響を及ぼすのを防止するという目的からは、少なくとも内底面がフッ素樹脂製であればよく、ディッシュ全体がフッ素樹脂製である必要は必ずしもない。このため、ディッシュを次のような構造としてもよい。
Although the
図６はディッシュの他の構造例を示す図である。図６（ａ）に例示するディッシュ６１では、底面６１１がフッ素樹脂で形成される一方、側面６１２は他の透明な材料、例えばポリスチレン、ポリエチレン等の樹脂材料またはガラスにより底面６１の周囲を取り巻くように形成されている。また、図６（ｂ）に例示するディッシュ６２も、底面６２１がフッ素樹脂で形成され、側面６２２は他の材料で形成される。底面６２１が側面６２２下部の開口を塞ぐように取り付けられている点が図６（ａ）の例とは相違している。これらの構成によっても、上記と同様の効果が得られる。
FIG. 6 is a diagram showing another structural example of the dish. In the
また、図６（ｃ）に例示するディッシュ６３では、底面および側面がフッ素樹脂でない透明な樹脂材料またはガラス等で一体的に形成された本体６３２の内底面にフッ素樹脂の層６３１が積層された構造を有している。また、図６（ｄ）に例示するディッシュ６４では、本体６４２の内底面および側壁面がフッ素樹脂の層６４１により覆われた構造を有している。これらの構造によっても、培養液Ｍとこれに接する内底面との間で屈折率をほぼ等しくすることができ、これにより内底面における光の反射を抑えることが可能である。
Further, in the
なお、図６（ｃ）および図６（ｄ）に示す例では、ディッシュ本体６３２，６４２とフッ素樹脂層６３１，６４１との界面での反射が生じる。このため、この界面の位置が試料Ｓｐに近いと、これに対応する位置に現れる像が試料Ｓｐの像を隠ぺいすることがあり得る。これを回避するために、フッ素樹脂層６３１，６４１の厚さは試料Ｓｐの高さよりも大きいことが望ましい。一般的にスフェロイドや受精卵等の直径は１００μｍないし２００μｍ程度であるから、フッ素樹脂層６３１，６４１の厚さは例えば２００μｍ以上とすることができる。こうすることで、ディッシュ本体６３２，６４２とフッ素樹脂層６３１，６４１との界面の像が試料Ｓｐの像を隠ぺいすることが回避される。
In the examples shown in FIGS. 6 (c) and 6 (d), reflection occurs at the interface between the
上記した各構成のように、ＯＣＴ撮像に供される試料Ｓｐをフッ素樹脂製のディッシュ５に担持させることにより、ディッシュ５の内底面５１ａと培養液Ｍとの屈折率をほぼ等しくし、両者の界面における反射を抑制することができる。これにより、ＯＣＴ撮像において光学的には両者の界面がないものとみなすことができる。図４（ａ）ないし図４（ｃ）に示した窪みの構造は、ディッシュ５の内底面５１ａと培養液Ｍとの屈折率の違いを考慮する必要がないが故に実現可能なものである。というのは、これらの界面での屈折率の差が小さくない場合、図４に示した界面の複雑な形状は撮像結果に影響する境界面の映り込みや光の屈折による像の劣化を引き起こすが、反射が生じなければ界面の形状がどのようなものであっても撮像結果に悪影響を及ぼすことがないからである。
By supporting the sample Sp to be subjected to OCT imaging on the
つまり、ディッシュ５の内底面５１ａを水と同程度の屈折率を有するフッ素樹脂製としたことで、内底面５１ａの形状は撮像時の都合とは関係なく、培養時の都合によって選択することが可能になる。このため、例えば次に説明するような形状を実現することも可能である。
That is, since the
図７はディッシュ内底面に設けられる窪みの他の例を示す図である。より具体的には、図７（ａ）は窪み形状の一例を示す平面図であり、図７（ｂ）はその俯瞰図である。また、図７（ｃ）、図７（ｄ）、図７（ｅ）は、図７（ａ）のＡ−Ａ線断面図を実線で、Ｂ−Ｂ線断面図を点線で重畳表示したものである。図７（ａ）および図７（ｂ）に示すように、逆円錐状の表面形状を有する窪み５１１ａに加えて、窪み５１１ａよりも深くまで到達する十字形状の溝５１１ｅを設けた場合、窪み５１１ａに担持される細胞等の下部に培養液Ｍが流通する流路が形成されることになる。これにより、細胞の周囲で培養液Ｍの循環が促進され、細胞等から放出される老廃物に起因する細胞等の代謝の低下が抑制され、細胞等の衰弱を防止することができる。
FIG. 7 is a diagram showing another example of the recess provided on the inner bottom surface of the dish. More specifically, FIG. 7A is a plan view showing an example of the recessed shape, and FIG. 7B is a bird's-eye view thereof. Further, in FIGS. 7 (c), 7 (d), and 7 (e), the cross-sectional view taken along the line AA of FIG. 7 (a) is shown by a solid line, and the cross-sectional view taken along the line BB is shown by a dotted line. Is. As shown in FIGS. 7A and 7B, when a
溝５１１ｅの断面形状は任意であり、例えば図７（ｃ）ないし図７（ｅ）に示すような形状とすることができる。いずれの形状によっても、窪み５１１ａに担持される細胞等の下方に培養液Ｍを流通、循環させる流路を形成することができる。なお、ここでは十字形状の溝５１１ｅを例示しているが、溝の形状についても任意である。例えば格子状の溝が設けられてもよい。また、窪み５１１ａの表面に微小な凹凸構造が設けられてもよい。こうすることによっても、細胞等が窪み５１１ａの表面に接する面積が小さくなり、細胞等と窪み５１１ａの表面との間に培養液Ｍを流通させることが可能になる。
The cross-sectional shape of the
上記のように内底面の屈折率を培養液Ｍの屈折率に近づけることによる反射の低減効果は、内底面に窪みを設けない場合にも有効である。この場合でも、内底面の表面形状が撮像結果に影響を与えないため、任意の形状とすることが可能である。 The effect of reducing reflection by bringing the refractive index of the inner bottom surface close to the refractive index of the culture solution M as described above is effective even when the inner bottom surface is not provided with a dent. Even in this case, since the surface shape of the inner bottom surface does not affect the imaging result, any shape can be used.
図８は窪みを設けないディッシュ底面の表面形状の例を示す図である。図８（ａ）に例示するディッシュ６５では、内底面にストライプ状の微細な溝６５１が設けられる。また、図８（ｂ）に例示するディッシュ６６では、内底面に格子状の微細な溝６６１が設けられる。ディッシュ内底面をこのような構造とすることで、図８（ｃ）に示すように、撮像ユニット２０から入射する光Ｌ２に影響を与えることなく、試料Ｓｐの下部に培養液Ｍを流通させるための流路を確保することができる。なお、これらの溝はディッシュ内底面の全体に施されてもよく、また段差部のみに施されてもよい。
FIG. 8 is a diagram showing an example of the surface shape of the bottom surface of the dish without a dent. In the
以上のように、この実施形態においては、ＯＣＴ撮像の撮像対象となる細胞等を収容する試料容器（ディッシュ５等）のうち、培養液Ｍと接する内底面が、培養液Ｍと同等の屈折率を有するフッ素樹脂により形成される。これにより、ＯＣＴ撮像において培養液Ｍと試料容器との界面は光学的には存在しないのと同様となり、界面での反射に起因する画像ノイズを低減することができる。すなわち、界面の位置に現れる像が試料の観察を妨げることが防止される。
As described above, in this embodiment, the inner bottom surface of the sample container (
また、このように反射の問題が解消されているため、底面の形状を自由に設計することが可能である。例えば細胞等の移動を規制するための窪みを設けたり、培養液の循環を促進するための溝を設けたりすることが可能になる。 Further, since the problem of reflection is solved in this way, it is possible to freely design the shape of the bottom surface. For example, it is possible to provide a recess for restricting the movement of cells and the like, and a groove for promoting circulation of the culture solution.
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態は略平底のディッシュと呼ばれる試料容器であるが、本発明の適用対象となる試料容器の形状はこれに限定されるものではない。例えば、平板プレートにウェルと呼ばれる凹部が複数設けられた、ウェルプレートと呼ばれる器具にも本発明を適用することが可能である。 The present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications other than those described above can be made without departing from the spirit of the present invention. For example, the above embodiment is a sample container called a dish having a substantially flat bottom, but the shape of the sample container to which the present invention is applied is not limited to this. For example, the present invention can be applied to an instrument called a well plate in which a plurality of recesses called wells are provided on a flat plate.
また例えば、上記実施形態のディッシュ５は、ＯＣＴ撮像される試料Ｓｐを培養液Ｍとともに担持するものであるが、容器内底面をフッ素樹脂としたことによる培養液Ｍとの界面における反射防止効果は、他の観察方式、例えば位相差顕微鏡による観察においても好適なものである。
Further, for example, the
また例えば、上記実施形態のディッシュ５では、略平坦な内底面５１ａに段差部５１０が設けられ、略平坦な段差部５１０の中央部分に窪み５１１ａ等が設けられている。こも意味において段差部５１０の平坦部が本発明の「平坦面」に相当しているが、段差部を設けないディッシュ内底面の平坦面に直接窪みが設けられる構成であってもよい。
Further, for example, in the
また、上記実施形態の説明では、ディッシュ内底面の水に対する濡れ性について特に言及していない。光学的な見地においては、フッ素樹脂製であるディッシュ内底面と培養液との間の屈折率の関係が問題であり、内底面が親水性であるか疎水性であるかは特に問わない。 Further, in the description of the above-described embodiment, the wettability of the inner bottom surface of the dish to water is not particularly mentioned. From an optical point of view, the relationship of the refractive index between the inner bottom surface of the dish made of fluororesin and the culture solution is a problem, and it does not matter whether the inner bottom surface is hydrophilic or hydrophobic.
以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、本発明に係る試料容器では、底部において、外底面と内底面との間がフッ素樹脂により連続的に充満されている構成であってもよい。このような構成によれば、外底面と内底面との間に屈折率の違いを有する界面が存在しないため、界面での反射に起因する画像ノイズを効果的に抑制することができる。 As described above by exemplifying a specific embodiment, the sample container according to the present invention has a configuration in which the outer bottom surface and the inner bottom surface are continuously filled with fluororesin at the bottom portion. You may. According to such a configuration, since there is no interface having a difference in refractive index between the outer bottom surface and the inner bottom surface, image noise caused by reflection at the interface can be effectively suppressed.
また、底部は、内底面を形成するフッ素樹脂層と、外底面を形成する透明材料層とが積層された構造を有するものであってもよい。屈折率の違いによる反射を防止するとの観点からは、例えば培養液のような液体と接する部分がフッ素樹脂製であればよく、底部全体がフッ素樹脂で形成されている必要は必ずしもない。したがって、外底面側については他の透明材料により構成されていてもよい。ただし、単なるコーティングのようにフッ素樹脂層が薄い場合には、フッ素樹脂層と透明材料層との界面の像が試料の近傍に現れることとなるため、フッ素樹脂層が試料のサイズに対し十分厚いことが望ましい。 Further, the bottom portion may have a structure in which a fluororesin layer forming an inner bottom surface and a transparent material layer forming an outer bottom surface are laminated. From the viewpoint of preventing reflection due to the difference in refractive index, for example, the portion in contact with the liquid such as a culture solution may be made of fluororesin, and the entire bottom portion does not necessarily have to be made of fluororesin. Therefore, the outer bottom surface side may be made of another transparent material. However, when the fluororesin layer is thin as in a simple coating, an image of the interface between the fluororesin layer and the transparent material layer appears in the vicinity of the sample, so that the fluororesin layer is sufficiently thick with respect to the size of the sample. Is desirable.
また、内底面は、平坦面に窪みが設けられた構造を有するものであってもよい。このような構成によれば、試料を窪みに捕捉することで貯留空間内における試料の横方向への移動を規制し、一定の位置に留まらせることができる。内底面と液体との間で屈折率が異なる場合、このような窪みは複雑な反射を生じさせ画像に影響を与えることがあるが、屈折率がほぼ同じであればこのような形状の影響が画像に及ぶことはない。 Further, the inner bottom surface may have a structure in which a depression is provided on a flat surface. According to such a configuration, by capturing the sample in the recess, the lateral movement of the sample in the storage space can be restricted and the sample can be kept in a fixed position. If the index of refraction differs between the inner surface and the liquid, such a depression can cause complex reflections and affect the image, but if the index of refraction is about the same, the effect of such a shape will affect. It does not extend to the image.
さらに、平坦面には窪みを取り囲んで環状の溝が設けられてもよい。あるいは、窪みを横断して窪みよりも深い溝が設けられてもよい。このような構成によれば、窪みに捕捉された試料の周囲における液体の流通を促進することができ、液体の滞留により試料の代謝を妨げることが回避される。 Further, the flat surface may be provided with an annular groove surrounding the recess. Alternatively, a groove deeper than the depression may be provided across the depression. According to such a configuration, it is possible to promote the flow of the liquid around the sample trapped in the depression, and it is possible to avoid hindering the metabolism of the sample due to the retention of the liquid.
また、内底面は、平坦面にストライプ状または格子状の溝が設けられた構造であってもよい。このような構成によれば、平坦面に付着した状態の試料についても、その下部に液体を流通させる流路を確保することができ、体の滞留による試料の代謝阻害を防止することができる。 Further, the inner bottom surface may have a structure in which a striped or lattice-shaped groove is provided on a flat surface. According to such a configuration, even for a sample in a state of being attached to a flat surface, it is possible to secure a flow path for flowing a liquid under the sample, and it is possible to prevent the metabolism of the sample from being inhibited due to the retention of the body.
この発明は、細胞等の生化学試料を担持するための試料容器全般に適用することができる。特に生化学試料をＯＣＴ撮像する目的において好適なものである。したがって、容器中で培養された細胞や細胞集塊を撮像する医学・生化学・創薬の分野において好適に適用することができる。 The present invention can be applied to all sample containers for supporting biochemical samples such as cells. It is particularly suitable for the purpose of OCT imaging a biochemical sample. Therefore, it can be suitably applied in the fields of medicine, biochemistry, and drug discovery for imaging cells and cell agglomerates cultured in a container.
１ 撮像装置
５ ディッシュ（試料容器）
２０ 撮像ユニット
５１ （ディッシュ５の）底面
５１ａ （ディッシュ５の）内底面
５１０ 段差部
５１１，５１１ａ，５１１ｂ，５１１ｃ 窪み
５１１ｄ 環状溝
６５１，６６１ 溝
Ｍ 培養液
Ｓｐ 試料
Ｓ 貯留空間
1
20 Imaging unit 51 (dish 5)
Claims (8)
前記凹部の底部のうち前記貯留区間に面する内底面と、前記内底面とは反対側の外底面との間で赤外線透過性を有し、前記内底面が、屈折率１．３５以下のフッ素樹脂により形成されている試料容器。 A sample container having a recess forming a storage space capable of storing a liquid and carrying a raw sample for optical interference tomography in the storage space together with the liquid.
Of the bottom of the recess, the inner bottom surface facing the storage section and the outer bottom surface opposite to the inner bottom surface have infrared transmission, and the inner bottom surface is fluoropolymer having a refractive index of 1.35 or less. A sample container made of resin.
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