JP6959378B2 - 酵素不要及び増幅不要の配列決定 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年11月21日に出願された米国仮特許出願第第62/082,883号の利益を主張する。前記特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、EFS−Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列リストを含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。2015年11月19日に作成されたこのASCIIコピーは、NATE−025_ST25.txtという名前で、サイズは20,860バイトである。
現在、核酸配列決定のための様々な方法、すなわち核酸分子内のヌクレオチドの正確な順序を決定する方法が存在する。現在の方法は、酵素的、例えばPCR及び/又はクローニングにより、核酸を増幅することを必要とする。光検出手段により検出可能な信号を生成するためには、さらなる酵素的重合が必要である。このような増幅及び重合工程は、費用及び/又は時間がかかる。従って当該技術分野では、増幅不要でかつ酵素不要の核酸配列決定の方法が必要とされている。本発明は、これらのニーズに取り組む。
本発明は、長い読み取り長さ及び低いエラー率を有する、酵素不要で、増幅不要で、及びライブラリー不要の核酸配列決定法を提供する、配列決定プローブ、方法、キット、及び装置を提供する。更に、本方法、キット、及び装置は、試料から結果への迅速な能力を有する。これらの特徴は、臨床環境での配列決定に特に有用である。
配列決定プローブ
配列決定方法
定義:
本明細書に記載の方法は、本方法を実行し及び/又は結果を記録することができる任意のデバイスを用いて、実行し及び/又は結果を記録することができる。使用できる装置の例には、特に限定されないが、すべてのタイプのコンピュータを含む電子計算装置が含まれる。本明細書に記載の方法がコンピュータで実施され及び/又は記録される場合、本方法の工程を実行するようにコンピュータを構成するために使用できるコンピュータプログラムは、コンピュータプログラムを含むことができる任意のコンピュータ可読媒体に含めることができる。使用可能なコンピューター可読媒体の例には、特に限定されないが、ディスケット、CD−ROM、DVD、ROM、RAM、非一時的コンピュータ可読媒体、及び他のメモリ、及びコンピュータ記憶装置が含まれ得る。本方法の工程を実行し、シーケンス情報を組み立て、及び/又は結果を記録するように、コンピュータを構成するために使用できるコンピュータプログラムは、電子ネットワークを介して、例えばインターネット、イントラネット又は他のネットワークを介して提供されてもよい。
標的核酸配列を決定する本発明の方法は迅速である
塩基占有割合×<ギャップ長>×FOV当たりのギャップの数×光学的バーコード当たりの塩基の数/[60秒(プローブを標的核酸にハイブリダイズさせる)+0.5秒(洗浄)+m:バーコードドメイン内の位置×(15秒(相補的核酸を結合する)+nfovs×1+15秒(相補的核酸の結合をはずす))+60秒(標的核酸に対してプローブを脱ハイブリダイズさせる)]
60秒(プローブを標的核酸にハイブリダイズさせる)+0.5秒(洗浄)+m塩基×(15秒(相補的核酸を結合する)+nFOV×1+15秒(相補的核酸の結合をはずす))+60秒(標的核酸に対してプローブを脱ハイブリダイズさせる)。m=6、nFOV=20を使用すると、時間=60+0.5+390+60=510.5秒が得られる。
0.01×4000×5000×20=510.5秒当たり4,000,000の6塩基読み取り=47,012.73塩基/秒
の正味のスループットが得られる。
本発明の方法のエラー率は低い
5’ATCGTACG3’
(配列決定すべき領域)
3’TAGCATGC5’
(完璧に一致した光学的バーコードの配列決定)
3’TAGTATGC5’
(単一塩基ミスマッチ(G−T)対を有する光学的バーコードの配列決定)
5’CGCCGGCC3’
(配列決定すべき領域)
3’GCGGCCGG5’
(完璧に一致した光学的バーコードの配列決定)
3’GCGGACGG5’
(単一塩基ミスマッチ(G−A)対を有する光学的バーコードの配列決定)
本発明は単一塩基対の分解能を有する
・25μlの要素(194コードセット)を取る
・5μlプローブB+相補配列を標的(100μM)に添加する
・15μlのハイブリダイゼーション(Hyb)緩衝液(14.56×SSPE 0.18%ツイーン20)を加える
SSPE(150mM NaCl、NaH2PO4×H2O 10mM、Na2EDTA 10mM)
・氷上で10分間インキュベートする。
・150μlのGビーズ(10mg/mlの40μlのGビーズ+110μlの5xSSPE 0.1%Tween20)を加える
・室温で10分間インキュベートする
・0.1SSPE 0.1%Tween20でマグネットコレクタを用いて3回洗浄する
・100μlの0.1×SSPE中で45℃で10分間溶出する。
・上記の溶出した試料20μlを取る
・10μlのハイブリダイゼーション(Hyb)緩衝液を加える
・1μlの標的(100nMビオチン化RNA)を加える
・氷上で30分間インキュベートする
15μlを取って、ストレプトアビジンスライドに20分間結合させ、Gフックを用いてフローストレッチを行い、nCounterを用いてカウントする
要素194コードセット
IDTから購入したオリゴ
SSPE(150mM NaCl、NaH2PO4×H2O 10mM、Na2EDTA 10mM)
ハイブリダイゼーション緩衝液(14.56×SSPE 0.18%ツイーン20)
Claims (18)
- 標的結合ドメインとバーコードドメインとを含む配列決定プローブであって、
前記標的結合ドメインは、少なくとも12つのヌクレオチドを含み、かつ標的核酸に結合することができ、
前記バーコードドメインは合成主鎖を含み、前記バーコードドメインは少なくとも6つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は少なくとも1つの付着領域を含み、前記付着領域は相補的核酸分子にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸配列を含み;
前記少なくとも6つの付着位置のそれぞれの付着位置は、標的結合ドメイン中の1つのヌクレオチドに相当し、前記少なくとも6つの付着位置のそれぞれは異なった核酸配列を有し、
前記少なくとも6つの付着位置のそれぞれの位置の核酸配列は、前記標的結合ドメインにより結合される前記標的核酸中の対応する1つのヌクレオチドの位置及び本体を決定する、配列決定プローブ。 - 前記合成主鎖が1本鎖DNAを含む、請求項1に記載の配列決定プローブ。
- 前記標的結合ドメインと前記バーコードドメインとの間に2本鎖DNAスペーサーを含む、請求項1に記載の配列決定プローブ。
- 前記標的結合ドメイン中のヌクレオチドの数は、バーコードドメイン中の付着位置の数よりも少なくとも2つ多い、請求項1に記載の配列決定プローブ。
- 前記バーコードドメイン中のそれぞれの位置が、(a)同じ数の付着領域、(b)1つの付着領域、又は(c)2つ以上の付着領域、を有する、請求項1に記載の配列決定プローブ。
- それぞれの相補的核酸分子が、
(a)それぞれの付着位置について、検出可能標識物を含み;あるいは
(b)核酸分子スペーサーを介して第1の核酸分子に間接的に連結され;あるいは、
(c)それぞれの付着位置について、8つのヌクレオチド〜20のヌクレオチドを含む、請求項1に記載の配列決定プローブ。 - それぞれの相補的核酸分子が、それぞれの付着位置について、12つのヌクレオチドを含む、請求項6に記載の配列決定プローブ。
- それぞれの第1の核酸分子が少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ又は5つの第2の核酸分子とハイブリダイズする、請求項6又は7に記載の配列決定プローブ。
- 前記第2の核酸分子が少なくとも1つの検出可能標識物を含む、請求項8に記載の配列決定プローブ。
- それぞれの第2の核酸分子が、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又は7つの、少なくとも1つの検出可能標識物を含む第3の核酸分子とハイブリダイズする、請求項8に記載の配列決定プローブ。
- 前記バーコードドメイン中の1つ以上の付着位置が、少なくとも1つのフランキング1本鎖ポリヌクレオチドに隣接する、請求項1記載の配列決定プローブ。
- 複数の請求項1記載の配列決定プローブを含む配列決定プローブ集団。
- 核酸配列を決定するための方法であって、
(1)請求項1〜11のいずれか1項記載の複数の配列決定プローブを含む第1配列決定プローブの少なくとも1つの第1集団を、基板に固定化された標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで、前記標的核酸は1以上の位置に固定化される;
(2)少なくとも6つの付着位置の第1付着位置に、検出可能標識物を含む第1の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第1のレポーター複合体の第1の相補的核酸分子を結合させる工程;
(3)結合した第1の相補的核酸分子の検出可能標識物、又は第1のレポーター複合体の結合した第1の相補的核酸分子の検出可能標識物を検出する工程;
(4)固定化された標的核酸中の第1ヌクレオチドの位置及び本体を特定する工程;
(5)第1付着位置に、検出可能標識物を欠く第1のハイブリダイズ性核酸分子を結合させ、こうして、検出可能標識物を含む第1の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第1のレポーター複合体の第1の相補的核酸分子の結合をはずす工程;
(6)少なくとも6つの付着位置の第2付着位置に、検出可能標識物を含む第2の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第2レポーター複合体の第2の相補的核酸分子を結合させる工程;
(7)結合された第2の相補的核酸分子の検出可能標識物、又は第2のレポーター複合体の結合された第2の相補的核酸分子の検出可能標識物を検出する工程;
(8)固定化標的核酸中の第2ヌクレオチドの位置及び本体を特定する工程;
(9)少なくとも6つの付着位置の各々の付着位置が、検出可能標識物を含む相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含むレポーター複合体の相補的核酸分子、及び結合された相補的核酸分子の検出可能標識物、又はレポーター複合体の結合された相補的核酸分子の検出可能標識物によって結合されるまで、工程(5)〜(8)を繰り返し、こうして、配列決定プローブの標的結合ドメインによってハイブリダイズされた固定化された標的核酸の少なくとも第1領域のための少なくとも6つのヌクレオチドの線状順序を特定する工程;そして
(10)固定された標的核酸から第1配列決定プローブの少なくとも1つの第1集団を脱ハイブリダイズする工程
を含む、方法。 - 工程(5)及び(6)は連続して又は同時に行われる、請求項13に記載の方法。
- 第1の相補的核酸分子及び検出可能標識物を欠く第1のハイブリダイズ性核酸分子が、同じ核酸配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 検出可能標識物を欠く第1のハイブリダイズ核酸分子が、第1付着位置に隣接するフランキング1本鎖ポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 以下の工程を更に含む請求項13に記載の方法:
(11)請求項1〜11のいずれか1項記載の複数の配列決定プローブを含む第2配列決定プローブの少なくとも1つの第2集団を、基板に固定化された標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで、前記標的核酸は1以上の位置の基板に固定化され、第1配列決定プローブ及び第2配列決定プローブの標的結合ドメインは異なり;
(12)少なくとも6つの付着位置の第1付着位置に、検出可能標識物を含む第1の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第1レポーター複合体の第1の相補的核酸分子を結合させる工程;
(13)結合された第1相補的核酸分子の検出可能標識物、又は第1レポーター複合体の結合された第1の相補的核酸分子の検出可能標識物を検出する工程;
(14)固定化標的核酸中の第1ヌクレオチドの位置及び本体を特定する工程;
(15)第1付着位置に、検出可能標識物を欠く第1のハイブリダイズ性核酸分子を結合させ、こうして、検出可能標識物を含む第1の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第1のレポーター複合体の第1の相補的核酸分子の結合をはずす工程;
(16)少なくとも6つの付着位置の第2付着位置に、検出可能標識物を含む第2の相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含む第2のレポーター複合体の第2の相補的核酸分子を結合させる工程;
(17)結合された第2の相補的核酸分子の検出可能標識物、又は第2のレポーター複合体の結合された第2の相補的核酸分子の検出可能標識物を検出する工程;
(18)固定化標的核酸中の第2ヌクレオチドの位置及び本体を特定する工程;
(19)少なくとも6つの付着位置の各々の付着位置が、検出可能標識物を含む相補的核酸分子、又は検出可能標識物を含むレポーター複合体の相補的核酸分子、及び結合された相補的核酸分子の検出可能標識物、又はレポーター複合体の結合された相補的核酸分子の検出可能標識物によって結合されるまで、工程(15)〜(18)を繰り返し、こうして、配列決定プローブの標的結合ドメインによってハイブリダイズされた固定化された標的核酸の少なくとも第2領域のための少なくとも6つのヌクレオチドの線状順序を特定する工程;そして
(20)固定された標的核酸から第2配列決定プローブの少なくとも1つの第2集団を脱ハイブリダイズする工程。 - 固定化された標的核酸の少なくとも第1領域及び少なくとも第2領域におけるヌクレオチドの各特定された線状順序を組み立て、こうして固定化された標的核酸の配列を特定する工程を更に含む、請求項17に記載の方法。
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