JP6956709B2 - Ompgバリアント - Google Patents
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Description
[0035]本明細書においては、「バリアント」という用語は、別の(すなわち、親の)OmpGに由来し、親OmpGと比較して1つまたは複数のアミノ酸変異(例えば、アミノ酸欠失、挿入または置換)を含有するOmpGを指す。
[0039]本明細書においては、「ヌクレオチド」という用語は、糖部分(ペントース)、リン酸、および窒素含有複素環塩基からなるDNAまたはRNAの単量体ユニットを指す。塩基はグリコシドの炭素(ペントースの1’炭素)を介して糖部分に連結され、その塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが、ペントースの3’位または5’位に結合したリン酸基を含有する場合、それはヌクレオチドと呼ばれる。作用的に連結されたヌクレオチドの配列は、本明細書においては典型的に「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」と呼び、本明細書においては、左から右への方向が、5’末端から3’末端への従来の方向になっている式によって表す。
[0043]「鋳型依存的な方式」という用語は、鋳型依存的なプライマー分子の延長(例えば、DNAポリメラーゼによるDNA合成)を含むプロセスを指す。「鋳型依存的な方式」という用語は、典型的には、新たに合成されるポリヌクレオチド鎖の配列が、相補的な塩基対形成の周知の規則によって規定される、RNAまたはDNAのポリヌクレオチドの合成を指す(例えば、Watson,J.D.ら、Molecular Biology of the Gene、第4版、W.A.Benjamin,Inc.、Menlo Park、Calif.(1987)を参照のこと)。
[0049]本明細書においては、「下降ノイズ」という用語は、平均開口チャネル電流より低いレベルへのイオン電流の揺らぎを指す。
バリアントOmpGポリペプチド
[0056]一態様においては、本開示は、バリアントOmpGポリペプチドを提供する。バリアントOmpGポリペプチドは、大腸菌(E.coli)の親OmpG、例えば、配列番号2に示される親OmpGから誘導され得る。親OmpGは、大腸菌(E.coli)由来の親OmpGの相同体であり得る。
[0066]親OmpGをコードするDNA配列は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して、問題のOmpGを産生する任意の細胞または微生物から単離され得る。第1に、ゲノムDNAおよび/またはcDNAライブラリーは、研究されるべきOmpGを産生する生物に由来する染色体DNAまたはメッセンジャーRNAを使用して構築され得る。次いで、OmpGのアミノ酸配列が公知である場合には、問題の生物から調製されたゲノムライブラリーからOmpGをコードするクローンを同定するために、相同の標識されたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、使用され得る。あるいは、既知OmpG遺伝子と相同の配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用してOmpGをコードするクローンを同定するためのプローブとして使用され得る。
[0069]ひとたび、OmpGをコードするDNA配列を単離し、変異のための所望の部位を同定すると、合成オリゴヌクレオチドを使用して変異を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位のそれぞれの両端に位置するヌクレオチド配列を含有し、オリゴヌクレオチド合成の間に変異体ヌクレオチドが挿入される。特定の方法においては、OmpG遺伝子を保持するベクター中に、OmpGをコードする配列またはその一部を架橋するDNAの一本鎖ギャップを創造する。次いで、所望の変異を有する合成ヌクレオチドを、一本鎖DNAの相同部分にアニーリングする。次いで、DNAポリメラーゼI(クレノウ断片)を用いて残存するギャップを埋め、T4リガーゼを使用して構築物をライゲートする。この方法の具体例が、Morinagaら(1984) Nature Biotechnology 2:636〜639に記載されている。米国特許第4,760,025号には、カセットのわずかな変更を実施することによる複数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入が開示されている。しかし、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入できるので、Morinaga法によってさらにより多くの種々の変異をどの時点においても導入することができる。部位特異的突然変異誘発を達成する他の方法として、Kunkel法、カセット突然変異誘発およびPCR部位特異的突然変異誘発が挙げられる。バリアントを提供するための代替法として、例えば、WO95/22625(Affymax Technologies N.V.からの)に、もしくはWO96/00343(Novo Nordisk A/Sからの)に記載されるような遺伝子シャッフリングまたは問題の変異(複数可)、例えば、置換(複数可)および/もしくは欠失(複数可)を含むハイブリッド酵素をもたらす他の対応する技術が挙げられる。
[0070]OmpGバリアントをコードするDNA配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび任意選択で、レプレッサー遺伝子または種々のアクチベーター遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを使用して、バリアントOmpGを発現するために使用することができる。バリアントOmpGを発現するために使用できるベクターの例として、pET発現系(Novagen)のベクターが挙げられる。
[0076]バリアントOmpGの特性決定は、測定可能な電気性状の変動を引き起こす分子の任意の特質を決定するステップを含み得る。例えば、ゲート開閉頻度の低減は、バリアントOmpGナノポアにわたって定電圧が印加される時の、ナノポアを通る上昇および/または下降ゲート開閉の低減の測定に由来し得る。さらに、バリアントOmpGの特性決定は、OmpGナノポアの通過に近接して、またはOmpGナノポアの通過において、個々のヌクレオチドのタグが検出される時の、ナノポアを通るイオン電流フローの変動を測定するステップによって、DNAまたはRNA鎖と相補的である個々のタグ付きヌクレオチドのタグを同定するステップを含み得る。DNAまたはRNA分子のセグメントの塩基配列は、成長している核酸鎖が合成される時の、タグ付きヌクレオチドのタグの測定された電気性状(複数可)を比較し、関連付けるステップによって決定され得る。
[0085]一部の場合においては、ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ)を、ナノポアに付ける、および/またはナノポアに近接して位置付ける。ポリメラーゼは、ナノポアが膜中に組み込まれる前または後にナノポアに付けてもよい。一部の場合においては、ポリメラーゼを、OmpGタンパク質モノマーに付け、次いで、ナノポアポリメラーゼ複合体を、膜中に挿入することができる。
[0092]ポリメラーゼを、ポリメラーゼがヌクレオチドを核酸鎖(例えば、成長している核酸鎖)中に組み込む速度を低減するように変異することができる。一部の場合においては、ヌクレオチドを核酸鎖中に組み込む速度は、ヌクレオチドおよび/または鋳型鎖に官能基付与して、例えば、鋳型核酸鎖のメチル化によって立体障害を提供することによって低減することができる。一部の例においては、速度を、メチル化ヌクレオチドを組み込むことによって低減する。
[0093]本明細書において記載されるバリアントOmpGポリペプチドを使用して特性決定されている分子は、帯電した分子または極性分子、例えば、帯電したポリマー分子または極性ポリマー分子を含む種々の種類のものであり得る。具体例として、リボ核酸(RNA)およびデオキシリボ核酸(DNA)分子が挙げられる。DNAは、一本鎖DNA(ssDNA)であっても二本鎖DNA(dsDNA)分子であってもよい。
実施例
[0098]Grosseら(Biochemistry 53:4826〜4838[2014])によって記載されるΔL6ΙΙ構築物に基づいて、ループ6を欠き、置換E229Aを有する成熟OmpGタンパク質の形態をコードするDNA(残基22〜301;UniprotエントリーP76045)(OmpG−EXT)を合成した(Genscript、NJ)。合成DNA(OmpG−ΔL6/E229Α)は、ループ6の欠失およびC末端配列:リンカー1−Hisタグ−リンカー2−Spyタグ(配列番号3)を有するOmpG構築物をコードする。野生型配列(配列番号4)に由来し、ループ6の切り詰め(ΔL6)および置換E229Aをコードする合成DNA配列を、pET−26b ベクターにクローニングし、封入体としてOmpG欠損BI21DE3大腸菌(E.coli)において産生した(www.neb.com/products/c2527−bl21 de3−competent−e−coli)。
[00102]バリアントOmpGポリペプチドの、自発性ゲート開閉を低減する能力を実証するために、個々のバリアントを、半導体センサーチップ(a)上のウェルの上の脂質二重層中の細孔として再構成し、OmpGバリアント細孔(b)の各々について単一チャネル記録を得た。
[00104]ループ6の欠失(ΔL6)およびアミノ酸置換E229A、すなわち、ΔL6/E229Αを、Y50K、Y50N、R68N、R211NもしくはE17Kから選択されるアミノ酸置換のうち1種と組み合わせて、および/またはD215の欠失と組み合わせて含むバリアントOmpGタンパク質を、実施例1に記載されるように発現させ、精製した。PCT/US2014/061853(「Methods for Forming Lipid Bilayers on Biochips」と題され、2014年10月22日に出願された)に記載されるように、脂質二重層が形成され、ナノポアが挿入された。
[00106]電流フローに対する変異の効果を決定するために、OmpG−EXTナノポアのバリアントを通過する電流について単一チャネル記録を作製した。OmpGナノポアを通るイオン電流フローの測定は、DCを使用して行った。
[00111]Hisタグ付きポリメラーゼをコードするDNA配列、pol6は、商業的供給源(DNA 2.0、Menlo Park、California)から購入し、次いで、そのC末端にSpyCatcherドメインを含むように操作した(Liら、J Mol Biol 23:426(2):309−317[2014])。Pol6を、pD441ベクター(発現プラスミド)中にライゲーションし、続いて、これをコンピテント大腸菌(E.coli)に形質転換した。グルコース0.2%およびカナマイシン100μg/mlを含むLB中で、スターター培養物1mlを、約8時間。対数期のスターター培養物25μlを、96ディープウェルプレートの発現培地1ml(グルコース0.2%、リン酸カリウム50mM、MgCl2 5mM、およびカナマイシン100μg/mlを追加したTerrific Broth(TB)自己誘導培地)に移した。プレートを、250〜300rpmで振盪しながら28℃で36〜40時間インキュベートした。
[00115]OmpG−EXT−del215(配列番号10)、すなわち、OmpG−ΔL6/E229A−del215の、ポリメラーゼによって捕獲されたヌクレオチドを同定する能力を、NaCl300mM、CaCl2 3mM、HEPES20mM、pH7.5中、DNA鋳型JAM1Aの存在下で、ポリメラーゼPol6と複合体形成しているOmpG−EXT−del215を使用して評価した。鋳型JAM1Aは、アッセイに使用されるタグ付きチミジンヌクレオチド(Roche Penzberg、Germanyにより合成)と相補的であり、ポリメラーゼによって捕獲されるであろうアデニンヌクレオチド塩基を提供するDNA鋳型である。
配列表フリーテキスト
特許文献
[1] PCT/US2005/009702 (published as WO2006/028508 on 16 March 2006; President and Fellows of Harvard College; entitled METHODS AND APPARATUS FOR CHARACTERIZING POLYNUCLEOTIDES.
[2] PCT/US2011/065640 (published as WO2012/083249 on 21 June 2012; Columbia University; entitled DNA SEQUENCING BY SYNTHESIS USING MODIFIED NUCLEOTIDES AND NANOPORE DETECTION).
[3] PCT/US2013/068967 (published as WO2014/074727 on 15 May 2014; Genia Technologies; entitled NUCLEIC ACID SEQUENCING USING TAGS).
[4] US20140134616 (published on May 15 2014; Genia Technologies; entitled NUCLEIC ACID SEQUENCING USING TAGS).
[5] PCT/US2014/061853 (published AS WO2015/061510 on April 30, 2015; Genia Technologies; entitled METHODS FOR FORMING LIPID BILAYERS ON BIOCHIPS).
[6] PCT/US2011/000205 (Genia Technologies, Inc. entitled SYSTEMS FOR MANIPULATING A MOLECULE IN A NANOPORE, published August 11, 2011 as WO2011/097028)
非特許文献
[1] Conlan and Bayley, Folding of a Monomeric Porin, OmpG, in Detergent Solution; Biochemistry 42;9453-9465 (2003).
[2] Subbarao and van den Berg, Crystal Structure of the monomeric Porin OmpG; J Mol Biol 360:750-759 (2006).
[3] Grosse et al., Structural and functional characterization of a synthetically modified OmpG; Bioorganic and Medicinal Chem18:7716-7723 (2010).
[4] Anbazhagan et al., Incorporation of Outer Membrane Protein OmpG in Lipid Membranes: Protein-lipid Interactions and β-Barrel Orientation; Biochemistry47:6189-698 (2008).
[5] Fahie et al., Resolved Single-Molecule Detection of Individual Species within a Mixture of anti-Biotin Antibodies using an Engineered Monomeric Nanopore; ACS Nano 9:1089-1098 (2015).
[6] Chen et al., Outer membrane protein G: Engineering a quiet pore for biosensing, Proc Natl Acad Sci 105:6272-6277 (2008).
[7] Grosse et al., Structure-based Engineering of a Minimal Porin Reveals Loop-Independent Channel closure; Biochemistry 53:4826-4838 (2014).
[8] Astier et al., J Am Chem Soc 10.1021/ja057123+, published online on December 30, 2005.
Claims (9)
- 配列番号2の親大腸菌(E.coli)OmpGの単離されたOmpGバリアントであって、前記バリアントが(i)アミノ酸216〜227の欠失、(ii)アミノ酸置換E229A、(iii)アミノ酸D215の欠失、および(iv)アミノ酸置換Y50Kを含み、前記バリアントがナノポアを形成する能力を保持する、前記単離されたOmpGバリアント。
- 前記バリアントOmpGと作動可能に連結されるポリメラーゼをさらに含む、請求項1に記載の単離されたOmpGバリアント。
- 脂質層中にナノポアを形成する能力を保持する、請求項1または2に記載の単離されたOmpGバリアント。
- 配列番号2の親OmpGのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記バリアントOmpGが、(i)アミノ酸216〜227の欠失、(ii)アミノ酸置換E229A、(iii)アミノ酸D215の欠失、および(iv)アミノ酸置換Y50Kを含み、前記バリアントが配列番号2の大腸菌由来OmpGと少なくとも90%の配列同一性を有する、前記単離された核酸。
- 検出電極に隣接する膜中のバリアントOmpGナノポアを利用して核酸試料をシーケンシングするための方法であって、
(a)タグ付きヌクレオチドを、前記ナノポアを含む反応チャンバー中に提供するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドが、ヌクレオチドに連結されたタグを含み、タグが前記ナノポアを利用して検出可能である;
(b)前記バリアントOmpGナノポアに連結された単一ポリメラーゼを利用して重合反応を実施し、それによって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸試料に由来する一本鎖核酸分子と相補的である伸長している鎖中に組み込むステップ;および
(c)請求項1〜3のいずれか一項に記載のバリアントOmpGナノポアを利用して、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの際に、前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出するステップであって、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合される間に、前記タグが前記ナノポアを利用して検出される;
を含む、前記方法。 - 核酸試料をシーケンシングするためのチップであって、請求項1〜3のいずれか一項に記載の複数のバリアントOmpGナノポアを含み、前記複数のOmpGナノポアが、電極に隣接して、または近接して配置され、前記ナノポアが、個々にアドレス可能であり、前記ナノポアに付けられた単一ポリメラーゼを有し、個々のナノポアが、前記ポリメラーゼにより伸長している核酸鎖中へのヌクレオチドの組込みの際にタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出する、前記チップ。
- 配列番号16のリンカー−His−Spyタグ構築物を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離されたOmpGバリアント。
- 検出電極に隣接する膜中のバリアントOmpGナノポアを利用して核酸試料をシーケンシングするための方法であって、
(a)タグ付きヌクレオチドを、前記ナノポアを含む反応チャンバー中に提供するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドが、ヌクレオチドに連結されたタグを含み、タグが前記ナノポアを利用して検出可能である;
(b)前記バリアントOmpGナノポアに連結された単一ポリメラーゼを利用して重合反応を実施し、それによって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを、前記核酸試料に由来する一本鎖核酸分子と相補的である伸長している鎖中に組み込むステップ;および
(c)請求項1〜3のいずれか一項に記載のバリアントOmpGナノポアを利用して、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組込みの際に前記個々のタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出するステップであって、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと会合される間に、前記タグが前記ナノポアを利用して検出される;
を含む、前記方法。 - 核酸試料をシーケンシングするためのチップであって、請求項1〜3のいずれか一項に記載の複数のバリアントOmpGナノポアを含み、前記複数のOmpGナノポアが、電極に隣接して、または近接して配置され、前記ナノポアが、個々にアドレス可能であり、前記ナノポアに付けられた単一ポリメラーゼを有し、個々のナノポアが、前記ポリメラーゼによる成長している核酸鎖中へのヌクレオチドの組込みの際にタグ付きヌクレオチドと会合されたタグを検出する、前記チップ。
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