JP6956340B2 - 細胞培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、医学、薬学、生物学、組織工学、再生医療学等に用いる細胞の培養技術に係り、特に、培養細胞の成長や分化を促進して培養時間を短縮することができる細胞培養装置に関するものである。

近年、組織工学や再生医療学の分野では、移植のための人工組織・臓器の開発が盛んである。代表的な例として皮膚移植の場合を説明する。現在はスキンバンクで保存している同種皮膚（他者の皮膚）が移植皮膚としての重要な役割を果たしているが、慢性的なドナー不足が続いているため、迅速かつ安定的に皮膚を供給する手法として、人工皮膚の開発が進められている。そして、人工皮膚を作製する有力な方法の一つとして、培養細胞から人工的に移植組織を作製する様々な三次元細胞培養技術が注目されている。

下記特許文献１に示すように、松崎・明石らは、Layer-by-Layer法（Ｌb Ｌ法）を用いて接着膜で被覆した細胞を調製し、被覆細胞同士を互いに接着した状態で積層することで三次元構造体を製造する技術を発明した。この発明によれば、移植皮膚の迅速な生着に重要となる血管系をも有する培養皮膚を作製することが可能である。

特開２０１２−１１５２５４号

前記特許文献１に記載の細胞培養技術を含む従来の三次元細胞培養技術には、組織が必要機能を獲得するまでに数週間程度の培養時間を要するという共通の問題があった。そのため、移植の必要性が生じた際に迅速に組織を提供できず、治療が遅延する可能性があった。例えば、広範囲重症熱傷では創部における感染を併発しやすく、皮膚移植による治療が遅れると細菌が体内に移行して致死的な敗血症を来しやすくなる。

本願発明者等は、このような従来の細胞培養技術における問題を解決し、迅速な細胞培養を実現するための研究開発に鋭意努力してきたが、その途上において、次の報告に開示された内容に着目した。すなわち、細胞ないし組織に可視から近赤外領域の光を照射すると、細胞のミトコンドリアの電子伝達系の末端酵素であるシトクロムｃオキシダーゼがその光を吸収し、電子伝達が促進され（Karu et al., Lasers Surg. Med., 2005）、アデノシン三リン酸（adenosine triphosphate, ＡＴＰ）や活性酸素種（reactive oxygen species,ＲＯＳ）等の産生量が増大するという報告である（Avci et al., Semin. Cutan. Med. Surg., 2013 ）。この報告に開示された作用は、低レベルレーザー作用（Low Level Light Treatment,ＬＬＬＴ）、光生体調整作用（Photobiomodulation, ＰＢＭ）等と呼ばれている。

本願発明者等は、前記ＰＢＭ等において産生量が増大するとされたＡＴＰが生体内のエネルギー源であり、また適量のＲＯＳは細胞の分化の重要なメディエーターとなることから、前記ＰＢＭが細胞や組織の分化および成長に直接的に寄与すると考えるに至った。

本願発明は、前述した従来の三次元細胞培養技術における課題を解決するためになされたものであり、前記ＰＢＭを効率的に生起させ、培養組織の成長と分化を促進することで培養時間を短縮し、上記移植治療開始の遅延の問題を解決することができる細胞培養装置を提供することを目的としている。

請求項１に記載された細胞培養装置は、
細胞の三次元構造体を製造する三次元細胞培養を行なうための細胞培養装置であって、
細胞を収納した容器が配置され、内面が光学反射する特性を有している培養室と、
前記容器の細胞に光を照射する光源と、
前記光源と前記培養室の間に設けられた光透過性の隔板と、
前記光源又は白色光源から照射されて前記培養室内にある細胞で拡散反射を起こした光を分光してスペクトルを取得する分光器と、
前記分光器で取得したスペクトルから細胞の状態を評価する制御手段と、
を具備し、
前記制御手段による前記評価に基づき、前記光源と、前記培養室内の酸素濃度を制御することを特徴としている。

請求項２に記載された細胞培養装置は、請求項１記載の細胞培養装置において、
前記光源から照射される光の波長が４００〜２５００ｎｍの範囲内であることを特徴とする。

請求項３に記載された細胞培養装置は、請求項１又は２に記載の細胞培養装置において、
前記隔板は断熱性を有することを特徴としている。

請求項４に記載された細胞培養装置は、請求項１〜３の何れか一つに記載の細胞培養装置において、
前記光源を冷却するための冷却手段を有することを特徴としている。

請求項５に記載された細胞培養装置は、請求項１〜４の何れか一つに記載の細胞培養装置において、
前記光源の放射照度を５Ｗ／ｃｍ² 以下の範囲内で制御する制御手段を有することを特徴としている。

請求項６に記載された細胞培養装置は、請求項５に記載の細胞培養装置において、
前記光源の制御を、前記光源が光を照射する時間または光を照射する位置の少なくとも何れか一方について行うことを特徴としている。

請求項７に記載された細胞培養装置は、請求項１〜６の何れか一つに記載の細胞培養装置において、
前記培養室内の気体、前記培養室内に配置された前記容器、前記培養室内に配置された前記容器に収納された細胞の少なくとも一つの温度を測定する温度測定手段と、
前記培養室内に設けられた温度調節手段と、
前記温度測定手段の測定結果に応じて前記温度調節手段を制御して前記温度が３７℃となるように制御する制御手段と、
を有することを特徴としている。

請求項８に記載された細胞培養装置は、請求項１〜７の何れか一つに記載の細胞培養装置において、
前記培養室内の酸素濃度を検知する酸素センサと、
前記培養室に接続されて前記培養室に酸素を供給する酸素供給手段と、
前記酸素センサの検知結果に応じて前記酸素供給手段を制御することにより前記培養室内の酸素濃度を大気中の酸素濃度と実質的に同程度となるように制御する制御手段と、
を有することを特徴としている。

請求項９に記載された細胞培養容器は、
細胞の三次元構造体を製造する三次元細胞培養を行なうための細胞培養装置の培養室に設けられ、光源から光が照射される細胞を収容するための細胞培養容器であって、
前記光源に近い側に開口部が設けられ前記光源に向けて径が拡がる形状の収容部と、前記光源と対面する表面に反射防止膜が設けられ前記開口部を閉止する光透過性の蓋部とを有することを特徴としている。

請求項１０に記載された細胞培養装置は、
細胞の三次元構造体を製造する三次元細胞培養を行なうための細胞培養装置であって、
内面が光学反射する特性を有している培養室と、
前記培養室に光を照射する光源と、
前記光源と前記培養室の間に設けられた光透過性の隔板と、
前記光源に近い側に開口部が設けられ光源に向けて径が拡がる形状の収容部と、前記光源と対面する表面に反射防止膜が設けられ前記開口部を閉止する光透過性の蓋部とを有し、細胞を収容して前記培養室に設けられる細胞培養容器と、
前記光源又は白色光源から照射されて前記培養室内にある細胞で拡散反射を起こした光を分光してスペクトルを取得する分光器と、
前記分光器で取得したスペクトルから細胞の状態を評価する制御手段と、
を具備し、
前記制御手段による前記評価に基づき、前記光源と、前記培養室内の酸素濃度を制御することを特徴としている。

請求項１に記載された細胞培養装置によれば、
細胞（組織を含む。この項において以下同じ。）を収納した容器を培養室に配置して光源から光を照射することにより、細胞の分化を促して細胞の三次元構造体を製造し、細胞を迅速かつ大量に培養することができる。例えば前述した皮膚移植の場合であれば、ドナーから採取した皮膚細胞（他家細胞）を用いることで、移植皮膚を大量に生産・貯蔵することが可能となる。また、作製した皮膚のＡＴＰ産生を促進し続けることで、同組織のバイアビリティ（活性）の低下や細胞死を防ぎ、高品質のまま貯蔵できる期間を延長することが可能となる。以上の２点の効果から、移植を必要とする患者や受傷者が多発した場合の迅速な対応が可能になるという効果が得られる。すなわち、ドナー不足の問題が解決され、また、患者・受傷者自身の細胞（自家細胞）を用いる場合には、従来よりも早期に移植が行えるようになり、治療の効果や成功率の向上が期待できる。

また、光源と培養室の間を仕切る隔板は光透過性であるため、光源からの光は培養室内の細胞に確実に到達して細胞の分化を促進する前記効果が確実に得られ、加えて培養室内の高湿度雰囲気により光源の電気系に支障が生じることが防止され、さらに光源から発生する熱が培養室内にある細胞に直接的に作用するのを防止する効果も得られる。
また、培養室内に照射された光のうち、培養室の内面に入射した光が多重反射することにより、光の照射方向と直交する方向における光の強度分布が一様となり、細胞に照射される光の強度が培養室内での位置に関わらず可及的に均一化される効果が得られる。
また、ＰＢＭによる細胞の分化の促進及び同組織のバイアビリティ（活性）の低下や細胞死を防ぐために使用する光源又は白色光源から培養室内に光を照射し、細胞で拡散反射を起こした光を分光器で分光してスペクトルを取得し、このスペクトルを制御手段が分析して細胞の状態や品質を評価できる。この分析結果（細胞の状態や品質）をＰＢＭの光照射条件、培養室内の酸素濃度等にフィードバックして制御することにより、ＰＢＭによる細胞の分化の促進及び同組織のバイアビリティ（活性）の低下や細胞死の防止をより一層効果的に行わせることができる。

請求項２に記載された細胞培養装置によれば、
光源から照射される光の波長が４００〜２５００ｎｍの範囲内であるため、多種多様な細胞についてＰＢＭにより分化を促進することができる。

請求項３に記載された細胞培養装置によれば、
隔板は断熱性を有しているため、光源から発生する熱が培養室内に伝導しにくくなり、この熱が細胞に与える影響を減少させる効果が得られる。

請求項４に記載された細胞培養装置によれば、
光源は冷却手段で冷却されるため、光源から発生して培養室内に伝導する熱の量が減少し、この熱が培養室内の細胞に与える影響を減少させる効果が得られる。

請求項５に記載された細胞培養装置によれば、
多種多様な細胞についてＰＢＭによる分化の促進を必要十分なエネルギー範囲で行うことができる。

請求項６に記載された細胞培養装置によれば、
光源の制御を光の照射時間に関して行うことができる。例えば、細胞に対して間欠的に光を照射すれば、ＰＢＭにより枯渇しやすい酸素を周囲からの自然拡散によって供給を受けるために有効な場合がある。または、光源の制御を光の照射位置に関して行うことができる。例えば、細胞が収納された多数の容器を培養室内に並べて培養する場合に、状態や品質の悪い細胞・組織に選択的に光を照射することができる。

請求項７に記載された細胞培養装置によれば、
培養室内の気体、培養室内に配置された容器、その容器に収納された細胞のうち、少なくとも一つの温度を温度測定手段が測定し、その測定結果に応じて制御手段が温度調節手段を制御することによって前記温度が３７℃となるように制御することができるため、ＰＢＭによる細胞の分化の促進を効果的に行わせることができる。

請求項８に記載された細胞培養装置によれば、
培養室内の酸素濃度を酸素センサで検知し、その検知結果に応じて制御手段が酸素供給手段を制御することによって培養室内の酸素濃度を大気中の酸素濃度と実質的に同程度となるように制御することができるため、ＰＢＭによる細胞の分化の促進を効果的に行わせることができる。

請求項９に記載された細胞培養容器によれば、
細胞を収容する収容部は光源に向けて径が拡がっているため、容器内の細胞は高い効率で光を受けることができる。
また、収容部の開口部を閉止する光透過性の蓋部には、光源と対面する側の表面に反射防止膜が設けられているので、細胞培養容器に照射された光をなるべく反射することなく、高い効率で容器内に導入して細胞に照射させることができる。

請求項１０に記載された細胞培養装置によれば、
細胞の培養において、前述した請求項１に記載された細胞培養装置による効果と、請求項９に記載された細胞培養容器による効果を得ることができる。

以上説明したように、本発明の細胞培養装置及び細胞培養容器によれば、細胞および組織を迅速かつ大量に培養することができる。例えば上記した皮膚移植の場合、ドナーから採取した皮膚細胞（他家細胞）を用いることで、移植皮膚を大量に生産・貯蔵することが可能となる。また、作製した皮膚のＡＴＰ産生を促進し続けることで、同組織のバイアビリティ（活性）の低下や細胞死を防ぎ、高品質のまま貯蔵できる期間を延長することが可能となる。以上２点の特徴により、移植を必要とする患者や受傷者が多発した場合の迅速な対応が可能になる。すなわち、ドナー不足の問題が解決される。また、患者・受傷者自身の細胞（自家細胞）を用いる場合には、従来よりも早期に移植が行えるようになり、治療の効果や成功率の向上が期待できる。

実施形態の細胞培養装置の模式的構造図である。 実施形態の細胞培養容器の断面図である。 実施形態の細胞培養容器において一収容部を拡大して示す断面図である。 実施形態の細胞培養容器における収容部の形状例を模式的に示す斜視図である。 実施形態の細胞培養容器において光源による光の照射を照射時間について制御する例を示す図である。 実施形態の細胞培養容器において光源による光の照射を照射位置について制御する例を示す図である。 実施形態の細胞培養容器を用いて培養したヒト細胞を用いて培養した三次元皮膚体を、光照射群（＋ＰＢＭ）と非光照射群（−ＰＢＭ）に分け、それぞれについて経上皮電気抵抗測定法を用いて電気抵抗を測定した結果を示す図である。 図７に結果を示した三次元細胞培養皮膚体の実験における光照射群（＋ＰＢＭ）と非光照射群（−ＰＢＭ）の病理組織断層画像（ＨＥ染色）を示す図である。 実施形態の細胞培養容器で培養中の皮膚の状態等を評価するために、白色光源から照射した光の拡散反射光の強度を、脂質の吸収ピーク付近の１２１０ｎｍと、生体分子による光吸収がほとんど生じない９００ｎｍにおいて、それぞれ経時的に測定した結果を示す図である。

光照射機能を具備し、ＰＢＭによって細胞の分化及び成長を促進して培養を行う実施形態の細胞培養装置１について、図１〜図９を参照して説明する。
なお、以下の説明において、「細胞」なる用語は、細胞そのものはもちろん、１種類以上の細胞を含む生体の組織も含む意味で使用している。従って、実施形態の細胞培養装置は組織培養装置であるとも言える。

図１を参照して細胞培養装置１の構成を説明する。
図１に示すように、本実施形態の細胞培養装置１は、培養しようとする細胞を収納する筐体２を備えている。筐体２の内部は、隔板５により、ＰＢＭ用光源としてのＬＥＤ光源７等が設けられた上部の機器収容部３と、細胞を収納した細胞培養容器（以下、容器６と称する。詳細は後述する。）が配置される下部の培養室４に仕切られている。

機器収容部３と培養室４を区画する隔板５は、細胞培養に必要な培養室４内の高湿度雰囲気が、機器収容部３にあるＬＥＤ光源７等の機器類に電気ショート等のトラブルを起こすことを防止する機能を有する。また、隔板５は光透過性であるため、隔板５によって培養室４と隔てられた機器収容部３にあるＬＥＤ光源７からの光は、実質的な減衰をみることなく必要な放射強度で培養室４の細胞に到達することができる。また、隔板５は高い断熱性を有し、ＬＥＤ光源７の温度上昇が与える細胞・組織への熱影響を防ぐ機能を有する。このような各種の機能を備える隔板５の材料（素材）としては、例えば熱線吸収フィルタの機能を有する透光性の耐熱プラスチック等を例示することができる。

図１に示すように、筐体２の機器収容部３には、隔板５を通して培養室４の容器６の細胞に光を照射するＰＢＭ用光源としてのＬＥＤ光源７と、ＬＥＤ光源７の冷却手段であるラジエータ８と、後述するその他の機器類（分光器９及び白色光源１０）と、これらを統括して制御する制御機１１が設けられている。なお、ＬＥＤ光源７の冷却手段はラジエータ８に限るものではなく、例えば空冷式の冷却装置等でもよく、冷却原理は問わない。

ＬＥＤ光源７は、培養対象である細胞の種類に応じてＰＢＭに有効な波長範囲の素子を高い自由度で選択できるとともに、安価、長寿命、メンテナンスフリーという実用上重要な特長を有するため、本実施形態の細胞培養装置１のＰＢＭ用光源として適している。

ＬＥＤ光源７が照射する光の波長範囲は、ＰＢＭを効果的に生起させる有効な波長範囲である４００〜２５００ｎｍとする。特にヒトの皮膚細胞の培養に好ましいのは、４５０〜９００ｎｍの範囲であり、この範囲内でさらに好ましい範囲をより細かく示せば、４５０〜５４０ｎｍ、６２０〜６８０ｎｍ、７５０〜８３０ｎｍとなる。さらに、７５０〜８３０ｎｍの範囲内で好ましい範囲をより細かく示せば、７５０〜７７０ｎｍ及び８００〜８３０ｎｍとなる。これらのより細かく示した好ましい波長範囲は、ミトコンドリアのシトクロムｃオキシダーゼの吸収帯が存在する範囲である。

ＬＥＤ光源７として、これらの波長範囲の光を放射する複数種類の素子を予め設けておき、培養しようとする細胞の種類に応じて、必要な波長の光を放射するＬＥＤに切り替えて光を照射する構成としてもよいし、特定種類の細胞のみを対象とするのであれば、当該細胞に対応した特定の必要な波長範囲のみを照射できるＬＥＤ光源７を設けておいて、それを使用する構成としてもよい。

図１に示すように、筐体２の機器収容部３に設けられたＬＥＤ光源７は制御機１１に接続されており、制御機１１によって制御される。ＬＥＤ光源７が放射する光の放射照度は５Ｗ／ｃｍ² 以下とされており、ＬＥＤ光源７は、培養しようとする細胞の種類や、細胞の状態等に応じた必要な放射強度で光を照射するように制御される。また、詳細は後述するが、制御機１１によるＬＥＤ光源７の放射照度の制御は、ＬＥＤ光源７が光を照射する時間または光を照射する位置の少なくとも何れか一方について行うことができる。

図１に示すように、筐体２の機器収容部３には、ＬＥＤ光源７の背面側（図示上側）に、ＬＥＤ光源７の熱を筐体２外に放出する冷却手段として、ラジエータ８が設けられている。ラジエータ８は、培養室４に設けられた後述する温度センサ２２からの信号に基づき、又は予想されるＬＥＤ光源７の発熱量に応じて、制御機１１によって制御される。ＬＥＤ光源７を適宜に冷却することにより、ＰＢＭにとって好ましくない無用な熱を培養室４の細胞に伝導せずに済み、またＬＥＤ光源７の長寿命化と出力の安定化が達成される効果も得られる。

図１に示すように、筐体２の培養室４は、細胞を収納した細胞培養容器６（以下、容器６とも称する。詳細は後述する。）を配置するためのスペースであり、ＰＢＭによる細胞の培養に適した環境条件（例えば湿度、温度、気体の濃度等）を維持できる程度の密閉性を有するとともに、前記環境条件を維持するための機器類として、各種センサ（酸素センサ２０、二酸化炭素センサ２１、温度センサ２２、湿度センサ２３、受光センサ２４）と、容器６の温度を調節する加熱・冷却器（温度調節手段）２５と、培養室４内の湿度を調節する加湿・除湿器（湿度調節手段）２６を有している。

各種センサは、制御機１１に接続されており、検出した環境データを制御機１１に送るようになっている。また、加熱・冷却器２５と加湿・除湿器２６は、制御機１１に接続されており、各種センサから得た環境データを基に制御機１１によって制御される。これによって、加熱・冷却器２５と加湿・除湿器２６は培養室４内を必要な環境条件に設定することができる。具体的には、ＰＢＭによる細胞の培養に適した値として、温度については３７度程度が好ましく、湿度については概ね９０〜１００％の範囲が好ましい。

前述した各種センサのうち、温度測定手段としての温度センサ２２は、具体的にはサーモグラフィーや放射温度計等で構成できる。また、温度センサ２２は、模式図である図１では培養室４内の上隅部に示されているが、より具体的には、温度測定対象である培養室４内の気体と、容器６と、容器６内の細胞のうち、何れか少なくとも一つの温度を測定するのに適した配置とするのが好ましいが、細胞そのものの温度を検出できるように構成するのが最も好ましい。

前述した各種センサのうち、受光センサ２４は、機器収容部３に設けられた分光器９を介して制御機１１に接続されている。詳細は後述するが、分光器９は、ＬＥＤ光源７又は白色光源１０から照射されて培養室４内にある細胞を透過し又は反射した光を分光し、スペクトルを取得して制御機１１に送る。制御機１１は、分光器９から送られたスペクトルから細胞の状態を評価することができる。

図１に示すように、筐体２の培養室４には、酸素ガスボンベ（酸素供給手段）３０と二酸化炭素ガスボンベ（二酸化炭素供給手段）３１がガス通路３２，３２を介して接続されており、これら両ガスボンベ３０，３１の開閉機構（図示せず）は制御機１１に接続されている。制御機１１は、培養室４にある酸素センサ２０と二酸化炭素センサ２１がそれぞれ検出した培養室４内の酸素濃度及び二酸化炭素濃度に応じて、開閉機構の開閉又は開度を制御し、培養室４内の酸素濃度及び二酸化炭素濃度をＰＢＭによる細胞の培養に適した値に維持することができる。具体的には、酸素濃度は大気中の酸素濃度である２０％程度が好ましく、二酸化炭素濃度は５％程度が好ましい。

ミトコンドリアの電子伝達反応には酸素が必要であることから、この反応を促進することが機序の一つと考えられるＰＢＭでは、細胞・組織およびその周囲にある培養液中の酸素はより多く消費されて枯渇しやすいと考えられる。本実施形態の細胞培養装置１において、培養室４内の二酸化炭素濃度だけでなく、酸素濃度を測定して制御する機構が設けられているのはこれが理由である。

図１に示すように、培養室４の内壁１５は光学反射する特性を有している。内壁１５としては反射率の高い金属板や誘電体薄膜等を用いることができる。この内壁１５により、ＬＥＤ光源７からの照射光Ｌは培養室４内の壁面において多重反射を生じ、照射光Ｌの水平方向の強度分布が均一化される。

図２〜図４を参照して培養室４に配置される容器６（細胞培養容器６）の構成を説明する。
図２及び図３に示すように、容器６は、基箱体４１（ウェルプレートとも称する。）と、基箱体４１内に取り付けられた複数の収容部４２（インサートとも称する。）と、基箱体４１の開口４１ａを閉止する蓋部４３とを有している。これらの各構成部品は透明な樹脂を成形して製造することができる。

図２に示すように、基箱体４１は上面に開口４１ａを有する中空直方体状の部材であり、その内部には緩衝溶液５０（又は培地５０）が収納される。基箱体４１の内部は壁体４１ｂによって同一形状の複数の区画に区分されている。図２では、第１列を構成する４つの区画が示されているが、紙面の奥側に第１列と平行に第２列〜第６列まで、各列あたり４つの区画があるため、基箱体４１の全体としては２４の区画を有している。

なお、緩衝溶液５０とは、培養対象となる細胞内外のｐＨや浸透圧を維持するとともに、同細胞に必要な水分や無機イオンを供給し、細胞を損傷することなく細胞を保持することができる液体である。また、培地５０とは、例えばグルコースやＬ−グルタミンのような細胞の培養に有用な養分を供給するための培養基である。本実施形態はＬＥＤ光源７からの照射光ＬによってＰＢＭによる細胞培養を行う装置であるため、緩衝溶液５０や培地５０は光透過性であることが望ましい。そこで、緩衝溶液５０としては、例えば光学的に透明なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）やHank's平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）等が利用できる。しかしながら、採用したＬＥＤ光源７の照射光Ｌの波長によっては必ずしも透明でなくてもよく、ＬＥＤ光源７の照射光Ｌの色（波長）と、緩衝溶液５０や培地５０の色が合致していればよい。

図３に示すように、収容部４２は、基箱体４１の各区画に取り付けられる部材であり、その内部には培養しようとする細胞６０が収納される。収容部４２は中空逆円錐台状であって、図３中上側にある光源に向けて径が拡がり、光源に近い側の上端が最大径の上開口部４２ａとなっている。上開口部４２ａの側にあるＬＥＤ光源７からの照射光Ｌは、拡がりながら伝搬するが、光源に向けて開口径が広がるテーパ構造の収容部４２には照射光Ｌが効率的に照射され、培養すべき細胞は照射光Ｌを高効率に受光することができる。このように、細胞６０を収納・保持・培養するための細胞培養容器６は、ＰＢＭ用のＬＥＤ光源７から放射された照射光Ｌが細胞に効率よく照射される構造となっている。

収容部４２の下端は最小径の下開口部４２ｂとなっているが、ここには多孔質膜４４（トランスメンブレンとも称する。）が張設されている。多孔質膜４４は、大きさが数１００ｎｍ〜数１０００ｎｍである多数の孔を備えたフィルムであり、分子レベルの大きさの物質は通過できるが、細胞レベルの大きさの物質は通過できない。収容部４２内に収容された細胞６０は多孔質膜４４の上に載置され、多孔質膜４４を介して基箱体４１内の緩衝溶液５０や培地５０に接触することができる。なお、収容部４２内の細胞６０の上を緩衝溶液５０や培地５０で覆う必要があるか否かは、当該細胞６０の種類による。

図２に示すように、蓋部４３は、基箱体４１の開口４１ａの外側に係止する枠部４３ａを備えた板体であって、基箱体４１内にある細胞６０の乾燥を防ぐために基箱体４１の開口４１ａを覆っている。図２及び図３に示すように、蓋部４３のＬＥＤ光源７と対面する表面（図２及び図３において上面）には、反射防止膜４５が設けられている。従って、同図中の上側にあるＬＥＤ光源７からの照射光Ｌは、蓋部４３の表面での反射が最小限に抑えられて大部分が蓋部４３を透過し、収容部４２内に入射することができる。

図４は、細胞培養容器６の収容部４２の形状を模式的に示す斜視図である。図４（ａ）は図２及び図３に示した実施形態の例であり、中空逆円錐台状である。図４（ｂ）は変形例の収容部４６であり、中空逆四角錐台状である。図４（ｂ）に示す変形例の収容部４６は、図３及び図４（ａ）に示した実施形態と同様、最大径の上開口部４６ａと、最小径であり多孔質膜４４が張設された下開口部４６ｂを有する。変形例の収容部４６によれば、実施形態の場合と同等の効果が得られる。

図５〜図９を参照して実施形態の細胞培養装置１及び細胞培養容器６を用いた細胞培養方法、又は当該方法を実行するための細胞培養装置１の制御手法について説明する。
実施形態の細胞培養容器６においてＰＢＭにより得られる効果の特性や大きさは、ＬＥＤ光源７の光照射条件（波長、エネルギー、照射時間等）や、培養室４内の環境条件（温度・湿度、大気濃度等）のわずかな違いによって変化し得るため、所望の効果を得るためには光照射条件及び環境条件の精密な制御が重要である。本実施形態においては、環境条件の制御とともに、ＬＥＤ光源７からの照射光Ｌを目的に適合した時間パターンに応じて、また目的に適合した空間パターンに応じて制御することにより、効果を得ている。

図５は、実施形態の細胞培養装置１において、ＬＥＤ光源７による光照射の制御を照射時間に関して行う例を示す図である。
実施形態の細胞培養装置１において、ＰＢＭにより分化を促進された細胞は多くの酸素を消費する。これによって、容器６内の酸素濃度は低下していくが、培養室４内に必要量の酸素があれば、この酸素が容器６内に自然に流入する。従って、容器６内で消費される酸素の量と、容器６外（培養室４内）から容器６内へ流入する酸素の量との間でバランスがとれていれば、ＰＢＭによる細胞の培養は問題なく連続して行われる。

しかしながら、培養室４内の酸素濃度が低下した状態で、ＬＥＤ光源７による光照射を連続させると、前記バランスが崩れて容器６内の酸素濃度が低下する場合がある。そこで、実施形態の細胞培養装置１では、まず第１に、酸素センサ２０が培養室４内の酸素濃度の有意な低下を検知すると、制御機１１が酸素ガスボンベ３０の開閉機構を操作し、培養室４内に適量の酸素ガスを供給して約２０％の酸素濃度の維持を図るようにした。

しかしながら、培養室４内に酸素ガスが供給されても、その酸素ガス容器６内に入るには一定の時間が必要になる。そこで、実施形態の細胞培養装置１では、第２に、ＬＥＤ光源７による光の照射を、図５に示すように間欠的に行うこととした。

ＰＢＭによって容器６内の酸素が消費されるのは、ＬＥＤ光源７による光照射が行われている間だけであり、ＬＥＤ光源７による光照射が行われていなければ酸素は消費されない。従って、図５に示すように光照射を、所定時間間隔をおいて間欠的に行うものとし、酸素が消費されない時間帯を定期的に設けることにより、酸素ガスが容器６内に流入して細胞６０に供給されるまでの時間を確保し、光照射を行うことで酸素が消費される時間帯では容器６内には常に十分な濃度の酸素ガスが存在しているようにした。

このように、実施形態の細胞培養装置１によれば、ＰＢＭを利用した細胞培養では酸素が枯渇しがちである点に鑑み、培養室４外から培養室４内へ酸素ガスを適時に供給するとともに、培養室４内では容器６内へ酸素を自然に拡散させ、さらにＬＥＤ光源７による光照射を間欠的に行うことによって、細胞６０の酸素消費量と容器６内への酸素流入量がバランスするようにした。これによって光が照射されている時間帯ではＰＢＭに必要な酸素が確保され、確実にＰＢＭによる細胞６０の分化を促進する効果が得られる。

図６は、実施形態の細胞培養装置１において、ＬＥＤ光源７による光照射の制御を照射位置に関して行う例を示す図である。
実施形態の細胞培養装置１において多数の細胞を培養する場合には、同じ条件で培養したとしても、状態や品質が悪い細胞と良い細胞が生じてしまう場合がある。このような場合、図６に示すように、状態や品質が悪い細胞６０に選択的に光を照射することにより、当該細胞６０の状態や品質を改善し、培養室４内の細胞６０を全体として良好な状態、品質に均一化する効果が得られる。

上述のように細胞６０の状態や品質を検知するため、実施形態の細胞培養装置１では、ＬＥＤ光源７と、受光センサ２４と、分光器９と、制御機１１（以上、図１参照）を使用する。
ＰＢＭのためにＬＥＤ光源７が照射した光の一部は、細胞６０で拡散反射を起こす。拡散反射光には細胞６０に含まれる光の散乱体・吸収体の情報が含まれるため、これを解析することで細胞６０の状態や品質を評価することができる。

すなわち、実施形態の細胞培養装置１では、細胞６０からの拡散反射光を受光センサ２４が検出する。分光器９が受光センサ２４の出力を分析してスペクトルを出力する。制御機１１がこのスペクトルを分析し、その分析結果（細胞・組織の状態や品質）をＬＥＤ光源７の光照射条件にフィードバックして制御する。例えば、分析の結果、細胞６０の分化に伴う形態変化による散乱光強度の時間変化が相対的に小さい場合、その細胞６０に対して選択的に光を照射し、分化を促すことができる。

図７は、実施形態の細胞培養容器６を用いて培養したヒトの皮膚の三次元細胞培養皮膚体を、光照射群（＋ＰＢＭ）と非光照射群（−ＰＢＭ）に分け、それぞれについて経上皮電気抵抗測定法を用いて電気抵抗を測定した結果を示す図である。図８は、図７に結果を示した三次元細胞培養皮膚体の実験における光照射群（＋ＰＢＭ）と非光照射群（−ＰＢＭ）の病理組織断層画像（ＨＥ染色）を示す図である。

前述したＬb Ｌ法により、ヒト真皮線維芽細胞と血管内皮細胞を積層させて真皮層を形成させ、翌日に表皮角化細胞を積層させて表皮・真皮一体型の三次元細胞培養皮膚体とし、これを実施形態の細胞培養装置１によって３７℃・５％ＣＯ₂ 濃度の条件で培養した。この培養皮膚体の表皮を気相に晒すことで分化の誘導を開始し、その５日後に一部のサンプルにＬＥＤ光源７（波長６６０ｎｍ）で光照射（１５ｍＷ／ｃｍ² 、６００ｓ）を行った。その２日後に光照射群（＋ＰＢＭ）と非光照射群（−ＰＢＭ）とで分化の進展より得られるバリア機能を評価した。バリア機能の評価には経上皮電気抵抗測定法を用い、培養皮膚体に交流電圧を付加して電気抵抗を測定した。その結果、電気抵抗値は光照射群（ｎ＝４）で平均４３１Ω・ｃｍ² 、非光照射群（ｎ＝４）で平均３２９Ω・ｃｍ² となり、光照射群で高い値が得られた（図７）。

一般に皮膚の電気抵抗は角質が支配的であるため、上記結果は実施形態の細胞培養装置１において、三次元培養皮膚体の表皮角化細胞の角質化（分化）が光照射によって促進されたことを示唆する。また、図８に示す培養皮膚体の断面の組織画像から分かるように、培養皮膚体の角質層の厚さは光照射サンプル（＋ＰＢＭ）では４１μｍであったのに対し、非光照射サンプル（−ＰＢＭ）では２５μｍであり、光照射により厚くなる傾向が見られた。以上の結果は、実施形態の細胞培養装置１におけるＰＢＭにより、三次元培養皮膚体の表皮角化細胞の分化が促進されたことを示唆する。

実施形態の細胞培養装置１において、培養中の培養皮膚体について上述したような評価が得られた場合、その分析結果に基づいてＬＥＤ光源７の光照射条件や培養室４内の環境条件を制御すれば、評価が思わしくない細胞・組織に対して選択的に光を照射し、また環境条件を整えることで、分化を促すことができる。

図９は、実施形態の細胞培養容器６で培養中の皮膚の状態等を評価するために、白色光源１０（具体的にはハロゲンランプ）から照射した光の拡散反射光の強度を、脂質の吸収ピーク付近の１２１０ｎｍと、生体分子による光吸収がほとんど生じない９００ｎｍにおいて、それぞれ経時的に測定した結果を示す図である。

この測定例は、実施形態の細胞培養容器６で培養中の皮膚の状態や品質を評価することを目的として行った。実施形態の細胞培養容器６において、白色光源１０を照射して広帯域スペクトルの光を培養室４にある同皮膚の表皮側から照射した。その拡散反射光を受光センサ２４で受け、分光器９でスペクトルを取得して制御機１１において記録した。測定は経時的に行った。

図９に示すように、脂質の吸収ピーク付近の１２１０ｎｍと、生体分子による光吸収がほとんど生じない９００ｎｍの拡散反射光の強度（分化誘導開始日の光強度で規格化）を比較した結果、９００ｎｍでは分化誘導開始３日後から５日後にかけて拡散反射光強度が上昇したのに対し、１２１０ｎｍでは低下した。

前者は、三次元培養皮膚の分化（角質化）に伴う組織の光散乱係数の増大を示し、後者は、培養皮膚の成長による含有脂質量の増大を示すものと考えられる。以上の結果は、本実施形態の細胞培養装置１における光照射により生じる細胞の拡散反射光のスペクトルに基づき、その状態や品質を評価できることを示している。

実施形態の細胞培養装置１において、培養中の培養皮膚体について上述したような評価が得られた場合、その分析結果に基づいてＬＥＤ光源７の光照射条件や培養室４内の環境条件を制御すれば、評価が思わしくない細胞・組織に対して選択的に光を照射し、また環境条件を整えることで、分化を促すことができる。

またこのような組織の品質評価には、白色光源１０ではなく、ＰＢＭ用光源であるＬＥＤ光源７の光を利用することも可能である。例えば、上記ミトコンドリアのシトクロムｃオキシダーゼの吸収波長（例えば６６０ｎｍ付近または８３０ｎｍ付近）のＬＥＤ光を用いたＰＢＭにおいて、同時にその組織からの拡散反射光強度を測定することで、同組織に含まれるミトコンドリアの量や活性度を評価できる。このように組織の品質評価にＬＥＤ光源７を利用するものとすれば、実施形態の細胞培養装置１から白色光源１０を省略することができ、装置を簡素化することができる。

１…細胞培養装置
４…培養室
５…隔板
６…細胞培養容器（容器）
７…ＬＥＤ光源
８…冷却手段としてのラジエータ
９…分光器
１０…白色光源
１１…制御手段としての制御機
１５…反射膜
２０…酸素センサ
２２…温度センサ
２５…温度調節手段としての加熱・冷却器
３０…酸素供給手段としての酸素ガスボンベ
４２…細胞培養容器の収容部
４２ａ…細胞培養容器の収容部の上開口部
４３…細胞培養容器の蓋部
４５…反射防止膜
４６…変形例の収容部
５０…緩衝溶液又は培地
６０…細胞
Ｌ…照射光

Claims (10)

1. 細胞の三次元構造体を製造する三次元細胞培養を行なうための細胞培養装置であって、
   細胞を収納した容器が配置され、内面が光学反射する特性を有している培養室と、
   前記容器の細胞に光を照射する光源と、
   前記光源と前記培養室の間に設けられた光透過性の隔板と、
   前記光源又は白色光源から照射されて前記培養室内にある細胞で拡散反射を起こした光を分光してスペクトルを取得する分光器と、
   前記分光器で取得したスペクトルから細胞の状態を評価する制御手段と、
   を具備し、
   前記制御手段による前記評価に基づき、前記光源と、前記培養室内の酸素濃度を制御することを特徴とする細胞培養装置。
2. 前記光源から照射される光の波長が４００〜２５００ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養装置。
3. 前記隔板は断熱性を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養装置 。
4. 前記光源を冷却するための冷却手段を有することを特徴とする請求項１〜３の何れか一つに記載の細胞培養装置。
5. 前記光源の放射照度を５Ｗ／ｃｍ² 以下の範囲内で制御する制御手段を有することを特徴とする請求項１〜４の何れか一つに記載の細胞培養装置。
6. 前記光源の制御を、前記光源が光を照射する時間または光を照射する位置の少なくとも何れか一方について行うことを特徴とする請求項５に記載の細胞培養装置。
7. 前記培養室内の気体、前記培養室内に配置された前記容器、前記培養室内に配置された前記容器に収納された細胞の少なくとも一つの温度を測定する温度測定手段と、
   前記培養室内に設けられた温度調節手段と、
   前記温度測定手段の測定結果に応じて前記温度調節手段を制御して前記温度が３７℃となるように制御する制御手段と、
   を有することを特徴とする請求項１〜６の何れか一つに記載の細胞培養装置。
8. 前記培養室内の酸素濃度を検知する酸素センサと、
   前記培養室に接続されて前記培養室に酸素を供給する酸素供給手段と、
   前記酸素センサの検知結果に応じて前記酸素供給手段を制御することにより前記培養室内の酸素濃度を大気中の酸素濃度と実質的に同程度となるように制御する制御手段と、
   を有することを特徴とする請求項１〜７の何れか一つに記載の細胞培養装置。
9. 細胞の三次元構造体を製造する三次元細胞培養を行なうための細胞培養装置の培養室に設けられ、光源から光が照射される細胞を収容するための細胞培養容器であって、
   前記光源に近い側に開口部が設けられ前記光源に向けて径が拡がる形状の収容部と、前記光源と対面する表面に反射防止膜が設けられ前記開口部を閉止する光透過性の蓋部とを有することを特徴とする細胞培養容器。
10. 細胞の三次元構造体を製造する三次元細胞培養を行なうための細胞培養装置であって、
    内面が光学反射する特性を有している培養室と、
    前記培養室に光を照射する光源と、
    前記光源と前記培養室の間に設けられた光透過性の隔板と、
    前記光源に近い側に開口部が設けられ光源に向けて径が拡がる形状の収容部と、前記光源と対面する表面に反射防止膜が設けられ前記開口部を閉止する光透過性の蓋部とを有し、細胞を収容して前記培養室に設けられる細胞培養容器と、
    前記光源又は白色光源から照射されて前記培養室内にある細胞で拡散反射を起こした光を分光してスペクトルを取得する分光器と、
    前記分光器で取得したスペクトルから細胞の状態を評価する制御手段と、
    を具備し、
    前記制御手段による前記評価に基づき、前記光源と、前記培養室内の酸素濃度を制御することを特徴とする細胞培養装置。

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