JP6945200B2 - Clostridium difficileの遺伝子型タイピング法及びこれに用いるプライマーセット - Google Patents
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Description
欧州や米国の医療機関では、高病原性クローンの流行が知られ、高病原性クローンによる下痢症は死亡率が高いことから、蔓延を防ぐことも重要である。
Clostridium difficileのタイピングの方法としては、従来、PCR-ribotyping法が多用されている。PCR-ribotyping法は菌のゲノム中に複数存在する16S-rRNAと23s-rRNA遺伝子のスペーサー領域の長さに多型性があることを利用し、そのPCR増幅産物の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、比較的短時間で実施が可能で、再現性があることからClostridium difficileの菌株識別の定法とされる。
前記2進法コード化した結果をさらに10進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより判別しやすくなるとともに、他の日時、他の検査室等で得られた結果と正確に比較することが可能となる。
本発明に係るClostridium difficileは菌株識別のための方法は、Clostridium difficileの染色体上の、(1)genomic isletを構成するORF、および(2)染色体上のgenomic island中に存在するhyper variableなORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、これら2種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのORFについて説明する。
(Clostridium difficileの遺伝的特徴)
Clostridium difficileの遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、PCR-ribotypingやmultilocus sequence typing(MLST)解析が利用されている。
前記のST型を区別するためには、Clostridium difficileにおいてもgenomic isletを構成するORFを検出することが有用であることがわかった(下記表1参照)。genomic isletとは、細菌のゲノム同士を比較した場合に、5kbp程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これはゲノム全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
遺伝子CD630_36250は、配列表の配列番号6(フォワード)および7(フォワード)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1458は、配列表の配列番号8(フォワード)および9(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_33700は、配列表の配列番号10(フォワード)および11(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1802は、配列表の配列番号12(フォワード)および13(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_25270は、配列表の配列番号14(フォワード)および15(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_06080は、配列表の配列番号16(フォワード)および17(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能である。
遺伝子配列番号1は、配列表の配列番号20(フォワード)および21(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD196_2957は、配列表の配列番号22(フォワード)および23(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD196_0710は、配列表の配列番号36(フォワード)および37(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子配列番号2は、配列表の配列番号38(フォワード)および39(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にST型の区別ができる。
Clostridium difficileの中には、比較的分離頻度の高いクローンが存在することが知られている。分離頻度の高いクローンは関連性の見いだされない事例間においても分離されることがしばしばあるため、クローン識別より高い識別能力が必要な菌株識別法が必要となる。
遺伝子CD630_09400は、配列表の配列番号26(フォワード)および27(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09720は、配列表の配列番号28(フォワード)および29(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09290は、配列表の配列番号30(フォワード)ならびに31(リバース)および22(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1456は、配列表の配列番号32(フォワード)および33(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09360は、配列表の配列番号34(フォワード)および35(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09380は、配列表の配列番号40(フォワード)および41(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD196_2048は、配列表の配列番号42(フォワード)および43(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09120は、配列表の配列番号44(フォワード)および45(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子配列番号3は、配列表の配列番号46(フォワード)および47(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09270は、配列表の配列番号48(フォワード)および49(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD630_09310は、配列表の配列番号50(フォワード)および51(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1456は、配列表の配列番号52(フォワード)および53(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能であり、
遺伝子CD196_1096は、配列表の配列番号54(フォワード)および55(リバース)のプライマーを使用することで、PCRにより検出可能である。
上述した、Clostridium difficileの染色体上の、genomic isletを構成するORF(1)およびgenomic islandを構成するORF(2)の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、または、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、あるいは、全てのORFを同時に検出してもよい。ORFを検出する手段としては、PCRおよびハイブリダイゼーションが挙げられる。
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する1組のプライマー(フォワードプライマーおよびリバースプライマー)を用いて、独立した系で、Clostridium difficileのDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応などを行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光などをリアルタイムに検出する。
これらのうちでは、複数のORFを簡便な手法で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましい。
Clostridium difficileゲノムはATリッチであるため、メルティング温度が低く、マルチプレックスPCRに適したプライマーを設計するには、GC比が比較的高い領域から、プライマーを設計し、実際にPCRおよびマルチプレックスPCRに使用し、機能することを確認しながら設計を進める必要がある。さらに、上記genomic isletを構成するORF(1)およびgenomic islandを構成するORF(2)については塩基配列が90%程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、臨床分離されることの多いほとんどのClostridium difficileに汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。
(1)genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして10組のプライマー、
(2)genomic island中に存在するhyper variableなORFためのプライマーとして6組のプライマー、
の合計16組のプライマー(配列表の配列番号4〜35)を本発明者は設計した。
ハイブリダイゼーションによりORFを検出する場合には、まず培養菌(Clostridium difficile)からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたDNAをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のORFとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成DNAでも、上記で説明したプライマーを利用したPCRで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出DNAとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ORFについて実施する。
以下、マルチプレックスPCRを行い、上記(1)〜(2)のORFのうち、上述した検出対象として好ましいORFを検出する場合を一例とし、本発明のClostridium difficileのクローン同定法及び菌株同定の手順を説明する。
便などの患者由来の検体から、CCMA培地などのClostridium difficileを分離可能な培地を用いてClostridium difficileを分離する。その後、グラム染色による形態の確認、および毒素産生性の確認により、Clostridium difficileと同定する。
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、市販のDNA抽出キットによるDNA抽出、あるいは蒸留水またはTris-EDTAバッファーなどに菌体を懸濁し加熱して得られる熱抽出法などの方法でDNAを抽出し、PCR反応用の試料(テンプレート)とする。
マルチプレックスPCRで上記表3および4に記載の、genomic isletを構成するORF 10個、genomic islandを構成するORF 6個に加え、Clostridium difficileマーカーとしてのCD196_0948、及びbinary toxin (cdtA)、toxinA (tcdA)、toxinB (tcdB)の検出を行う。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組(フォワードプライマー及びリバースプライマー)を、11組および10組の2群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ一括してPCR反応を行う。なお、菌種同定およびクローン同定と菌株識別は同時に実施しても、別々に実施しても良い。
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるような条件下でアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、50分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどで染色して写真撮影を行う。また、たとえばAgilent 2100 バイオアナライザや島津製作所MultiNAのような各種のキャピラリー型電気泳動装置等を用いてPCR産物を分離し画像化することも可能である。
最大11本または10本のバンドが現れる。本発明の遺伝子型タイピング法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異バンドは無視する。目的のサイズのバンド(各ORFに対応するバンドおよびポジティブコントロールに対応するバンド)が増幅していれば1、増幅が見られない場合を0として2進法のコードを作成する。
このように得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ある病院で臨床分離されたClostridium difficile16株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
Clostridium difficileであると同定された16の菌株を、ブルセラHK寒天培地を用いて37℃で二日間培養した。
培養した菌から、市販のカラムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、その20倍液をテンプレートDNAとした。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl(反応液の1/10量)加えた。
サーマルサイクラー(ASTEC社製、GeneAtlas G02)に抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を15℃で保存した。
アガロースゲル(4% NuSieve 3:1 in TBE buffer)を用い、ミニゲルを作成し、100Vで65分間、3μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
1反応につき最大11本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば1、増幅が見られない場合を0として、上記表5と同様の2進法のコードを作成した。さらに2進法のコードを10進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図1および表6に示す。
以下、プライマー配列に2塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ、ある病院で臨床分離されたClostridium difficile16株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
Clostridium difficileであると同定された16の菌株を、ブルセラHK寒天培地を用いて37℃で二日間培養した。
培養した菌から、市販のカラムDNA抽出キットを用いてDNAを抽出し、その20倍液をテンプレートDNAとした。
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.16μl、蒸留水15.24μlおよびprimer mixtureを0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl(反応液の1/10量)加えた。
サーマルサイクラー(ASTEC社製、GeneAtlas G02)に抽出DNAと反応液の混合液をセットし、最初に95℃で10分間処理し、その後、95℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 2分のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を15℃で保存した。
アガロースゲル(4% NuSieve 3:1 in TBE buffer)を用い、ミニゲルを作成し、100Vで65分間、3μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
1反応につき最大11本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば1、増幅が見られない場合を0として、上記表5と同様の2進法のコードを作成した。さらに2進法のコードを10進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図2に示す。図1および表6と同様の結果が得られた。
Claims (8)
- Clostridium difficileの染色体上の、
(1)genomic isletを構成するORF、および
(2)genomic island中に存在するhyper variableなORFを構成するORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、Clostridium difficileの菌株識別のための方法であって、前記(1)のORFにおける genomic isletがCD196_0620、CD630_36250、CD196_1458、CD630_33700、CD196_1802、CD630_25270、CD630_06080、CD630_31360、配列番号1およびCD196_2957からなる10種の遺伝子であり、前記(2)のgenomic island中に存在するhyper variableなORFがCD196_0825、CD630_09400、CD630_09720、CD630_09290、CD196_1456およびCD630_09360からなる6種の遺伝子である、方法。 - 配列表の配列番号4と5、配列番号6と7、配列番号8と9、配列番号10と11、配列番号12と13、配列番号14と15、配列番号16と17、配列番号18と19、配列番号20と21、配列番号22と23に示された10組の塩基配列の組み合わせ(但し、上記塩基配列は、2塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び/又は挿入を有していてもよい)からなる10組のプライマーを用いて、PCR法により前記(1)のORFの検出を行い、配列番号24と25、配列番号26と27、配列番号28と29、配列番号30と31、配列番号32と33、配列番号34と35に示された6組の塩基配列の組み合わせ(但し、上記塩基配列は、2塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び/又は挿入を有していてもよい)からなる6組のプライマーを用いて、PCR法により前記(2)のORFの検出を行う、請求項1に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び/又は挿入を有していない、請求項2に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 前記PCR法がマルチプレックスPCR法である、請求項2又は3に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 前記(1)及び(2)のORF有無の検出結果を、それぞれ1(有)と0(無)に置き換えて2進法コード化する、請求項1〜4の何れか1項に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 前記2進法コード化した結果をさらに10進法コード化する、請求項5に記載のClostridium difficileの菌株識別のための方法。
- 配列表の配列番号4と5、配列番号6と7、配列番号8と9、配列番号10と11、配列番号12と13、配列番号14と15、配列番号16と17、配列番号18と19、配列番号20と21、配列番号22と23に示された10組の塩基配列の組み合わせ(但し、上記塩基配列は、2塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び/又は挿入を有していてもよい)からなる10組のプライマーと、配列番号24と25、配列番号26と27、配列番号28と29、配列番号30と31、配列番号32と33、配列番号34と35に示された6組の塩基配列の組み合わせ(但し、上記塩基配列は、2塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び/又は挿入を有していてもよい)からなる6組のプライマーを含むClostridium difficileの菌株識別のためのプライマーセット。
- 上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び/又は挿入を有していない、請求項7に記載のClostridium difficileの菌株識別のためのプライマーセット。
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