JP6944875B2 - Met受容体アゴニストタンパク質 - Google Patents
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Description
また、本発明の別の目的は、かかるタンパク質を含む組成物の提供である。
さらに、本発明の別の目的は、特に診断と治療応用における、かかるタンパク質の使用に関する。
該K1ペプチドドメインは、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性を有する配列からなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
該K1ペプチドドメインは、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%同一性を有する配列からなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導することができ、
ただし、該タンパク質はHGF/SFのN末端ドメインを含まない、
タンパク質に関する。
最も重要な技術的利点は、本発明のタンパク質が強力なMETアゴニスト活性を有する点である。よって、このタンパク質は、さまざまなインビトロ及びインビボアッセイにおいて、MET受容体を活性化することができ、且つ/又は、MET活性化に関連するいかなる表現型も誘導することができる。
- MET受容体に結合し、
- METリン酸化と、細胞における下流のシグナル伝達とを活性化し、及び
- 生存、増殖、形態形成及び/又は移動などの少なくとも1つの細胞表現型を誘導する。
該K1ペプチドドメインは配列番号1に対して少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性を有する配列からなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
該K1ペプチドドメインは配列番号2に対して少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性を有する配列からなり、
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
該タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメイK1a及びK1bが互いに異なる、上で定義したタンパク質に関する。
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが配列番号1のアミノ酸配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
一実施形態で、本発明は、ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが配列番号2のアミノ酸配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
K1a及びK1bのK1ペプチドドメインが、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有する配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
K1a及びK1bのK1ペプチドドメインは、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有する配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
K1a及びK1bのK1ペプチドドメインは、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有する配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
それぞれのK1ペプチドドメインは、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有する配列からなる、上で定義したタンパク質に関する。
配列番号1は79アミノ酸のサイズを有し、2つのシステインで挟まれている。
配列番号4は、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列に対応する。
該ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、肝細胞増殖因子/分散因子(HGF/SF)のK1ペプチドドメイン(クリングル1)を含み、
該K1ペプチドドメインは、配列番号1に対して少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性を有する配列からなり、
該タンパク質はチロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導できる、
タンパク質に関する。
一実施形態で、リンカーのサイズは4アミノ酸である。
配列番号5のペプチドリンカーは、配列番号6の核酸配列(TCAGAAGTTGAA)によりコードされ得る。
配列番号8は、N端末からC端末までにおいて、配列番号2、配列番号6及び配列番号2により構成される。
配列番号14は、SEVEリンカーが、柔軟なリンカーとしての17アミノ酸の配列(GGGGSLVPRGSGGGGS、配列番号17)により置換されている、本発明のK1K1タンパク質に対応する。この伸長リンカーは、トロンビンのための切断部位(LVPRGS、配列番号18)を含み、2つのK1ドメインに分離することが可能になる。
配列番号15は、SEVEリンカーが、構造的制約が全くないGSリンカー(GSGGS、配列番号19)により置換されている、本発明のK1K1タンパク質に対応する。
- 配列番号9、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16から選択されるアミノ酸配列、又は
- 配列番号9、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16から選択される配列に対して少なくとも80%の同一性、好ましくは90%の同一性を有するアミノ酸配列。
本発明において、「組換タンパク質」は、遺伝子工学から生じるタンパク質である。遺伝的構築物は、組換タンパク質を得るために古典的な分子生物学的技術を使用して、ベクターに挿入されてもよいし、細菌又は酵母などの宿主細胞に発現されてもよい。
特に、かかるタンパク質は、KD≦200 nM、≦150 nM、≦100 nM、≦90 nM、≦80 nM、≦70 nM、≦60 nM、≦50 nM、≦40 nM、≦30 nM、≦10 nM、又は≦5 nMの解離定数でチロシンキナーゼ受容体METに結合可能である。
- 少なくとも2つのK1ペプチドドメイン、好ましくは2つのK1ペプチドドメインを含む組換タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入する工程、
- かかるベクターを宿主細胞にクローニングして、かかる組換タンパク質を発現させる工程、
- かかる組換タンパク質が少なくとも2つのK1ドメインを含み、かかる組換タンパク質を抽出及び精製する工程
を含む方法に関する。
- 上に定義したタンパク質、又は
- かかるタンパク質をコードする核酸分子、又は
- かかる核酸分子を含む発現ベクター、又は
- かかる発現ベクターを含む宿主細胞。
本発明のタンパク質は、そのMETに結合する能力により、診断方法のための、特にHGF/SF及びMET分子の発現に関与する病変の診断方法のための有用なツールになる。
別の態様で、本発明は、医用撮像に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
別の態様で、本発明は、インビボ撮像に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
特に、本発明のタンパク質は、画像誘導手術に使用できる。現在、術前及び術中の画像化は、手術器具の入念な位置決め及び特定組織の除去において、外科医師の支援に利用されている。蛍光(IR/NIR)プローブは、術中の生体画像化に使用できる。
別の態様で、本発明は、インビトロ診断ツールとしての、上に定義したタンパク質の使用に関する。
別の態様で、本発明は、インビトロ又はエクスビボ撮像のための本発明のタンパク質の使用に関する。
実際、本発明のタンパク質は、マーカーで標識することができ、MET受容体の検出、局在化及び定量化を可能にする。
例えば、タンパク質は、放射線医薬品トレーサ又は蛍光トレーサで標識できる。
特に、赤外(IR)色素及び近赤外(NIR)色素、並びに蛍光タンパク質は、高い浸透性と低い自己蛍光により、インビボ撮像に好ましいトレーサである。
一実施形態で、本発明はまた、かかるタンパク質により、チロシンキナーゼ受容体METの検出が可能である、医用撮像の方法に関する。
一実施形態で、本発明は、かかるタンパク質により、抗体のプレターゲティングが可能である、医用撮像の方法に関する。
実際、本発明のタンパク質は、トレーサの特定のエピトープを認識する抗体への結合が可能である。
- 上に定義したタンパク質、又は
- 該タンパク質をコードする核酸分子、又は
- 該核酸分子を含む発現ベクター、又は
- 該発現ベクターを含む宿主細胞、及び
医薬的に許容可能な賦形剤。
一実施形態で、本発明は、細胞生存又は組織再生を促進することによる組織損傷の治療に用いるための、上に定義したタンパク質に関する。
本発明のタンパク質は、その強力なMETアゴニスト活性により、METとHGF/SFとの相互作用の機構を理解するために使用できる。
別の態様で、本発明は、インビトロ研究用ツールとしての、上に定義したタンパク質の使用に関する。
別の態様で、本発明は、かかるタンパク質が、少なくとも2つのK1ドメインによりチロシンキナーゼ受容体METと複合化された、上に定義したタンパク質とチロシンキナーゼ受容体METとの間の分子複合体に関する。
原核生物発現プラスミド(pET45b(+)-K1K1)を、HGF/SFのK1ドメイン(aa 128-206)の2つのタンデム反復を含むDNAフラグメントをサブクローニングして構築した(図1)。短いリンカーは、第1と第2のK1ドメインとを接続する。構築物を、HGF/SF-K1K1(K1K1と略称)と称する。該原核生物発現プラスミドをBL21(DE3)細胞にトランスフェクトした。
K1K1の結合能力を、組換MET-IgG1キメラを使用する交差力価測定ALPHAScreen(登録商標)アッセイで測定し(図6A)、K1K1とMETとの結合を示す。HGF/SF、K1K1、K1B(ビオチン化単量体K1ドメイン)又は組換NK1とインキュベーションしたHeLa細胞におけるMET活性化及び下流のシグナル伝達を、ウエスタンブロット法(図5)又はALPHAscreenの定量的アプローチ(図6B)により分析した。典型的には、HGF/SFはpM濃度まで、最大のERK及びAkt活性化を誘発した。興味深いことに、K1K1は、ERK及びAktのリン酸化レベルを、低いnMの範囲まで誘発できたので、NK1タンパク質と同様のアゴニスト活性を示した。さらに、K1K1は100 nMで強力なMETリン酸化を誘導した。
K1K1タンパク質の生物活性に関する最初の研究は、MDCKコロニー分散アッセイを用いて行われ、図8に要約されている。7つの異なる発現実験からのHisTrapプールの活性を、天然の完全長HGF/SF、及び広範囲に特性化されたHGF/SFのフラグメントであって、より有用なベンチマークであるNK1のそれらと比較した。K1K1の活性は、モル基準でHGF/SFのそれよりも〜3倍低い。
HGF/SF、K1K1(6xHisタグ)、K1K1バリアント1(タグ無し)、K1K1バリアント2(長いリンカー)、K1K1バリアント3(GSリンカー)又は組換NK1とインキュベーションしたHeLa細胞におけるMET活性化及び下流のシグナル伝達を、ウエスタンブロット法(図12)及びALPHAScreen(登録商標)定量化アプローチ(図13)で分析した。典型的に、HGF/SFはpM濃度まで、最大のERK及びAkt活性化を誘発した。興味深いことに、K1K1及びそのバリアントは、ERK及びAktのリン酸化レベルを100 pMの範囲まで誘発できたので、NK1よりも少なくとも10倍強力なアゴニスト活性を示した。さらに、K1K1及びそのバリアントは、100 pMで開始する強力なMETリン酸化を誘導した。
K1K1とK1K1バリアント1(タグ無し)との両方の結晶構造をX線結晶学により、それぞれ1.4及び1.8Å(オングストローム)の分解能で明らかにした。これらの構造は非常に興味深く、重要な事実を示す:両方のケースにおいて、K1K1分子は、外部に露出した広がった立体配座をとり、両側に2つのMET結合部位をとる(図18、パネルA)。このことは、活性化シグナル伝達複合体を形成する正しい配向で2つの受容体を結合可能な分子の生成の有用性を確認する。K1K1及びK1K1バリアント1の3D構造の整列から、これらは1Åよりも小さいRMSD値(原子配置の根平均二乗偏差)でほぼ同一である(図18、パネルB)。
ベクター構築
原核生物発現プラスミド(pET45b(+)-K1K1)を、頭-尾(N-terからC-terまで)配向でK1ドメインの2つのコピーを含むDNAフラグメントをサブクローニングして構築した。K1K1をコードするcDNA配列を、酵母P.パストリスでのK1K1の発現のために生産された別の発現プラスミド(pPIC9K-K1K1)からPCRにより増幅した。発現ベクター(pET45b(+)-K1K1)を組み立てるために、それぞれが予めPCR技術で増幅されている2つのヒトSGF/SFクリングル1ドメインの融合によって、K1K1 cDNAを予め生成した。K1K1のN末端単量体を増幅させるために、次のプライマーのセットを使用した:フォワードプライマーP1(5'-ATCATCCCATGGCCATTAGAAACTGCATCATTGGTAAAGGACG-3')(配列番号22)及びリバースプライマーP3(5'-TTCAACTTCTGAACACTGAGGA-3')(配列番号20)。C末端単量体については、次のプライマーのセットを使用した:フォワードプライマーP4((5'-CAGAAGTTGAATGCATCATTGGTGAAGGA-3')(配列番号21)及びリバースプライマーP2 (5'-ACAGCGGCCGCTCATCAA-3')(配列番号23)。N末端とC末端の融合を可能にするために、K1 cDNAのフォワードプライマーP3とリバースプライマーP4の両方ともHpy188I制限部位を有する。
K1K1タンパク質及びそのバリアントは、合計で6つのジスルフィド結合(それぞれのクリングルドメインに3つ)を含む。大腸菌におけるジスルフィドリッチタンパク質の生産は重大な課題であり、大多数の場合、かかるタンパク質は、封入体と呼ばれる大きな凝集体で蓄積する。典型的な封入体は直径が0.5μm-1.3μmであり、細菌の細胞質の内側又はペリプラスムに見出される。封入体は、主に標的タンパク質(50%から90%まで)からなる一方で、別の細胞質タンパク質及び別の細胞構成成分がほぼ常に封入体に付随する。しかし、特に低い温度で培養するときには、封入体は、正しく折り畳まれた標的タンパク質も含み得る。この「非古典的な」封入体は、非変性条件下で効果的に抽出される、標的タンパク質の正しく折り畳まれた前駆体に富む。
2MのL-アルギニンでの一晩のインキュベーションと、さらなる遠心分離工程(5,000gで30分間、4℃)の後に得られた上清を、0.22μmのフィルターで濾過して、2 ml/分で500 mMのNaC1に調整されたPBSで平衡化された、1 mlのHisTrap粗FF親和性カラムに装填した。ベースラインがゼロに戻るまでカラムを洗浄し、結合タンパク質を、500 mMのNaClに調整されたPBS中のイミダゾール(0-500 mM)の勾配(130 ml)で溶出した。タンパク質含有フラクションを、SDS-PAGE、Superdex 75 10/30 (GE Healthcare)カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより、また生物活性について、MDCKコロニー分散アッセイを用いて分析した(Stoker, M. et al., Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility. Nature 327, 239-242 (1987))。
HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 75を、カラム緩衝液(25 mMのTris、500 mMのNaCl、pH7.4)で平衡化した。アフィニティクロマトグラフィー工程からの濃縮されたフラクションを、5 mlのループを使用するカラムに装填した。クロマトグラフランを0.5 ml/分の流量で行い、5 mlのフラクションを全溶出の手順にて回収した。予期したピークに対応するフラクションを回収して、合わせてプールし、分析及び必要に応じて−80℃で瞬間冷凍した。
封入体からの可溶性バリアント1タンパク質及びHis-Trapカラムからのフラクションを含むタンパク質(K1K1、バリアント2及びバリアント3)をプールし、4℃で24時間、50 mM MES、150 mM NaCl(pH6.0)に対して透析した。試料を遠心分離し、0.22μmのフィルターで濾過して、流速0.5 ml/分で50 mM MES、150 mM NaCl(pH6.0)で平衡化された1 mlのResource-Sカラム(GE Healthcare)に装填した。結合したタンパク質を、NaCl勾配(0.25〜100 M)で溶出した。フラクションを回収し、SDS-PAGE及びMDCKコロニー分散アッセイで分析した。
HeLa細胞を、500 pMのHGF/SF、1 nMのK1K1、1 nMのK1K1バリアント1、2及び3、又は1 nMもしくは100 nMのNK1を用いて10分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKのウエスタンブロット法により分析した。細胞をスクレイピングにより回収して、新たに添加されたプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(Sigma)を補充した溶解用緩衝液(20 mM HEPES pH7.4, 142 mMのKCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5%グリセロール、1% NP40、0.1% SDS)を用いて氷上で溶解した。溶解物を遠心分離(20,000g x 15分)により取り除き、タンパク質濃度を測定した(BCA protein assay Kit, Pierce(登録商標), Thermo scientific, IL, USA)。同じタンパク質量の細胞抽出物を古典的なSDS-PAGE又はNuPAGE(4-12%又は10%ビス-トリスプレキャストゲル)(Life technologies)のいずれかで分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(Merck Millipore)に電気的に転写した。膜を、示された一次抗体によってプローブし、続いて適切なHRP結合二次抗体を用いてインキュベーションした。タンパク質-抗体複合体を、SuperSignal(登録商標) West Dura Extended Duration Substrate X-rayフィルム(CL-Xposure(商標)フィルム、Thermo scientific)による化学発光で可視化した。
HeLa細胞を、100 pMのHGF、100 nMのK1K1及び100 nMのNK1を用いて1分、5分、10分又は20分間処理した。次に、細胞溶解物を、特異的な全MET、Akt及びERK、又はリン酸化MET、リン酸化Akt及びリン酸化ERKでウエスタンブロット法により分析した。細胞をスクレイピングで回収して、新たに添加されたプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤(Sigma)を補充した溶解用緩衝液(20 mM HEPES pH7.4, 142 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5%グリセロール, 1% NP40及び0.1% SDS)を用いて氷上で溶解した。溶解物を遠心分離(20,000 g x 15分)により取り除き、タンパク質濃度を測定した(BCA protein assay Kit, Pierce(登録商標), Thermo scientific, IL, USA)。同じタンパク質量細胞抽出物を、古典的なSDS-PAGE又はNuPAGE(4-12%又は10%ビス-トリスプレキャストゲル)(Life technologies)のいずれかで分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(Merck Millipore)に電気的に転写した。膜を、示された一次抗体によってプローブし、続いて適切なHRP抱合二次抗体を用いてインキュベーションした。タンパク質-抗体複合体を、X線フイルム(CL-Xposure(商標)フィルム, Thermo scientific)を使用して、SuperSignal(登録商標) West Dura Extended Duration Substrate (Thermo scientific)による化学発光で可視化した。
MDCKの単離細胞島は100 pMのHGF/SF、100 nMのK1K1、100 nMのNK1を用いて培養培地で18-24時間インキュベートし。別法では、MDCKの単離細胞島を500 pMのHGF/SF、10 nMのK1K1、バリアント1、2又は3並びに100 nMのK1単量体を用いて培養培地で24時間インキュベートした。次に細胞を染色して顕微鏡下(100倍)で観察した。
MDCK細胞を、増殖因子低減Matrigel(商標)(BD Biosciences)の層に播種し(24ウェルプレートに100,000細胞/ウェル)、100 pMのHGF/SF、100 nMのK1K1及び100 nMのNK1を用いて18〜24時間処理し、位相差顕微鏡で観察した。代表的な画像を、40倍及び100倍率(Nikon Eclipse TS100)で取得した。
細胞を、1 nMのHGF/SF (HGF)、100 nMのNK1、100 nMのK1K1、バリアント1及び100 nMのK1単量体を含む培養培地によりカバーした24ウェルプレート中のタイプ1コラーゲンMatrigel(商標)の厚い層に播種した。細胞を固定して、エバンスブルー(0.01%)を用いて染色した後、位相差顕微鏡(Nikon Eclipse TS100)及び共焦点(Leica LSM 880)顕微鏡(Ex405nm/Em630)で観察した。代表的な画像を40倍又は100倍率で取得し、Z-stackに3D再構築された。
細胞を、アニソマイシン(0.7μM)添加又は無添加の0.1%FBS含有培地で、500 pMのHGF/SF、100 nMのK1K1及び100 nMのNK1の存在下で一晩培養した。次に、MTTアッセイを実施して細胞生存を評価した。結果を、未処理対照のパーセンテージで表した。
K1K1を組換MET-Fcタンパク質に結合させる交差力価測定アッセイを、384ウェルのマイクロタイタープレートで実施した(OptiPlate(商標)-384, PerkinElmer(C), CA, USA、50μLの最終反応容積)。最終濃度は、K1K1が0〜300 nM、MET-Fcが0〜10 nM、ストレプトアビジンで被覆したドナービーズ及びプロテインA結合アクセプタービーズが10μg/mLであった。すべてのタンパク質溶液とビーズ懸濁液との調製に使用した緩衝液は、PBS、5 mM HEPES pH 7.4、0.1% BSAであった。プレートを暗箱内で23℃にて60分間インキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。
アッセイを、ALPHAScreen(登録商標)SureFire(登録商標)Ultra(商標) (PerkinElmer(C), CA, USA)に記載されている製造業者のプロトコールに則って実施した。手短に言えば、細胞をプレートに播いて、異なるアゴニスト(HGF/SF、NK1、K1K1及びK1B(ビオチン化K1))を用いて7分間刺激し、同じ96ウェル培養プレート中で溶解した。溶解物(10μL)を、リン酸化Art(ALSU-PAKT-B500、Ser473)及びERK(ALSU-PERK-A500、Thr202/Tyr204)の検出のために384-ウェルマイクロプレートに移した。ALPHAScreen(登録商標)SureFire(登録商標)Ultra(商標)のアクセプタービーズ及びドナービーズを添加して2時間インキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。
アッセイを、ALPHAScreen(登録商標)SureFire(登録商標)のERK(TGRES500)及びAkt (TGRA4S500) (PerkinElmer(C), CA, USA)に記載されている製造業者のプロトコールに則って実施した。手短に言えば、細胞をプレートに播いて、異なるアゴニスト(HGF/SF、NK1、K1K1、バリアント1、2又は3、及びK1(ビオチン化K1))を用いて10分間刺激し、同じ96ウェル培養プレート中で溶解した。溶解物(5μL)を、リン酸化Art(Ser473)とERK(Thr202/Tyr204)の検出のために384-ウェルマイクロプレートに移した。ALPHAScreen(登録商標) SureFire(登録商標)のアクセプタービーズとドナービーズとの混合物を、製造業者の定める手順で添加して2時間インキュベートした。放射信号強度を、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダ(PerkinElmer)を標準アルファ設定にして測定した。
肝臓でのMET活性化の可視化のために、体重19〜21 gのFVBマウス(n=2)(Charles River)を用いた。イソフルランを用いた麻酔(Aerrane, Baxter, USA)の後、PBS中の5μgのK1単量体又はK1K1バリアント1をマウスに静脈注射した。10分後、マウスを犠牲にして、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充したPBSで肝臓を潅流した。肝臓を抽出して、MET、ERK及びAktの活性化をウエスタンブロット法で分析した。
この実験には、体重19〜21 gのFVBマウスを用いた。イソフルランを用いた麻酔の後、K1K1バリアント1(タグ無し)、HGF/SF、NK1などの異なるアゴニストと混合した抗Fas抗体(Clone Jo-2, CD95, Pharmingen,BD Biosciences)を、マウスに125 ng/g体重で静脈注射した。最初の注射から90分後、マウスに、それぞれのアゴニストで2回目の注射をした。さらに3時間後、マウスを犠牲にして、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充したPBSで肝臓を潅流した。
動物モデルは豚(研究用の3頭の豚)である。
順応は、7日間の環境順応期間及び25日間のフォローアップ期間を含む。
臨床観察及び計量は4週間中、週1回行う。
- 四角い皮膚-表皮創傷(2x2 cm)を動物の両側に負わせる。
- 各動物が自己の証人である。
○ 第1の側=製剤で処理
○ 第2の側=負の対照、プラセボで処理
- 処理:2つの濃度(1 nM及び50 nM)でのK1K1 TL(タグ無し)の2つの製剤
○ 4週間中に週2回
次のパラメータ検討後の創傷治癒アセスメント:
- 創口閉鎖-形態計測学的検討(創傷の写真)
- 組織生検(HES及びMTG)-血管新生-肉芽組織
- D7、D14、D35における上皮形成
- 安楽死。
Claims (14)
- それぞれK1a及びK1bと名付けられる同一の又は異なる2つのペプチドドメインを含む直鎖ペプチドからなるタンパク質であって、前記ペプチドドメインK1a及びK1bのそれぞれが、配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなり、
前記タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体METの活性化を誘導することができ、
ただし、前記タンパク質はHGF/SFのN末端ドメインを含まない、
タンパク質。 - 前記ペプチドドメインK1a及びK1bが同一である、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、K1a及びK1bを接続するペプチドリンカーを含み、前記ペプチドリンカーが1〜50アミノ酸で構成される、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、配列番号7のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 配列番号10の核酸配列からなる、請求項1〜4のいずれか一項に定義したタンパク質をコードする核酸分子。
- 配列番号11の核酸配列を含むか又はそれからなる、請求項5に定義した核酸分子を含む発現ベクター。
- 酵母細胞及び細菌細胞からなる群から選択される、請求項6に定義した発現ベクターを含む宿主細胞。
- - 請求項1〜4のいずれか1項に定義したタンパク質、又は
- 前記タンパク質をコードする請求項5に定義した核酸分子、又は、
- 前記核酸分子を含む請求項6に定義した発現ベクター、又は
- 前記発現ベクターを含む請求項7に定義した宿主細胞
を含む組成物。 - 診断方法に用いるための請求項1〜4のいずれか1項に定義したタンパク質。
- 医用撮像に用いるための請求項1〜4のいずれか1項に定義したタンパク質。
- 医薬品として用いるための請求項1〜4のいずれか1項に定義したタンパク質。
- 細胞生存又は組織再生を促進して組織損傷の治療に用いるための請求項1〜4のいずれか1項に定義したタンパク質。
- 急性及び慢性肝臓病、急性及び慢性腎臓病、慢性肺疾患及び慢性皮膚創傷を含む上皮器官の疾患、ニューロン疾患及び硬化症を含む中枢神経の疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、糖尿病及び末梢神経障害などの関連する合併症から選択される病変の治療に用いるための請求項1〜4のいずれか1項に定義したタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか1項に定義する、ペプチドドメインK1a及びK1bを含むタンパク質を取得する方法であって、次の工程:
- ペプチドドメインK1a及びK1bを含む組換タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入する工程、
- 前記ベクターを宿主細胞にクローニングして、前記組換タンパク質を発現させる工程、
- 前記組換タンパク質がペプチドドメインK1a及びK1bを含み、前記組換タンパク質を抽出及び精製する工程
を含む、方法。
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