JP6944748B2 - C4ジカルボン酸の製造方法 - Google Patents
C4ジカルボン酸の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6944748B2 JP6944748B2 JP2018525105A JP2018525105A JP6944748B2 JP 6944748 B2 JP6944748 B2 JP 6944748B2 JP 2018525105 A JP2018525105 A JP 2018525105A JP 2018525105 A JP2018525105 A JP 2018525105A JP 6944748 B2 JP6944748 B2 JP 6944748B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dicarboxylic acid
- seq
- acid
- polynucleotide
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01001—Carbonate dehydratase (4.2.1.1), i.e. carbonic anhydrase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
(特許文献1)中国特許出願公開第103013843号明細書
(非特許文献1)Metabolic Engineering,2012,14:512−520
また本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有するベクター又はDNA断片を提供する。
また本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクター又はDNA断片を含む形質転換細胞を提供する。
さらに本発明は、上記形質転換細胞を培養することを含む、C4ジカルボン酸の製造方法を提供する。
さらに本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターを宿主細胞に導入することを含む、形質転換細胞の製造方法を提供する。
さらに本発明は、上記ポリヌクレオチド又は上記ベクター又はDNA断片を宿主細胞に導入するか、又は上記ポリヌクレオチドの発現を強化することを含む、宿主細胞におけるC4ジカルボン酸生産能の向上方法を提供する。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Lipman−Pearson法(Science,1985,227:1435−1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYCS Ver.12のホモロジー解析プログラムのアミノ酸配列×アミノ酸配列マキシマムマッチング又はヌクレオチド配列×ヌクレオチド配列マキシマムマッチングを用いて、Matchesを−1、Mismatchesを1、Gapsを1、*N+2として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチド配列の同一性とは、2つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を一致度が最大となるように整列(アラインメント)したときに、両方の配列において同一のアミノ酸又はヌクレオチドが存在する位置の数の全長アミノ酸数又はヌクレオチド数に対する割合(%)をいう。当該同一性は、類似アミノ酸又はヌクレオチドのグループも含めて類似とみなして類似性と同一性の両者を含めて算出する相同性とは区別される。
向上率(%)
=(形質転換細胞のC4ジカルボン酸生産能/宿主細胞又はコントロール細胞のC4ジカルボン酸生産能)×100−100
ここで、形質転換細胞とは、本発明のポリペプチドの発現が強化された細胞、例えば、宿主細胞に対して本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞、又は当該ポリヌクレオチドの発現が強化(すなわち転写量が向上)された細胞を意味する。ここで、宿主細胞とは、上記形質転換細胞の宿主細胞(親細胞)をいう。またコントロール細胞とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないベクターを導入した細胞をいう。コントロール細胞は、当該ポリヌクレオチドを含むベクターを導入した形質転換細胞の比較として用いる。好ましくは、当該C4ジカルボン酸生産能の向上率は、該形質転換細胞によるC4ジカルボン酸の生産速度が最大となる時点における、各細胞のC4ジカルボン酸生産能に基づいて計算される。したがって、本明細書において、「C4ジカルボン酸生産能がX%以上向上した形質転換細胞」とは、上記式で計算されるC4ジカルボン酸生産能の向上率がX%以上である形質転換細胞をいい、また細胞における「C4ジカルボン酸生産能のX%以上の向上」とは、上記式で計算される該細胞のC4ジカルボン酸生産能の向上率がX%以上であることを意味する。
(2.1.新規ポリペプチド)
一実施形態において、本発明は、配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
別の一実施形態において、本発明は、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号1で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。好ましい実施形態において、上記本発明のポリヌクレオチドは、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は当該配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる、カーボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
当該ポリヌクレオチドを発現可能なように導入する、又は当該ポリヌクレオチドの発現を強化する手段としては、例えば、制御領域、好ましくは強制御領域(野生型に比較し発現を強化できる制御領域)と作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター又はDNA断片を宿主細胞に導入すること、或いは宿主細胞のゲノム上で、強制御領域と本発明のポリヌクレオチドとを作動可能に連結して配置すること(例えば、親細胞のゲノム上の本発明のポリヌクレオチドの制御領域配列を強制御領域に置換すること)、などが挙げられる。
上記本発明の形質転換細胞は、本発明のポリペプチドの発現量が向上しており、細胞内のカーボニックアンヒドラーゼ活性が強化されている。これにより、該形質転換細胞は、C4ジカルボン酸生産能が向上している。例えばポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片を含有する形質転換細胞は、その宿主細胞(親細胞)と比較して、C4ジカルボン酸生産能が好ましくは5%以上、より好ましくは10%以上、さらに好ましくは15%以上向上している。
本発明の形質転換細胞は、C4ジカルボン酸生産能が向上している。したがって、本発明はまた、上記本発明の形質転換細胞を培養することを含むC4ジカルボン酸の製造方法を提供する。該本発明の製造方法により製造されるC4ジカルボン酸としては、フマル酸、リンゴ酸、及びコハク酸が挙げられ、好ましくはフマル酸及びリンゴ酸、より好ましくはフマル酸である。
形質転換した糸状菌の胞子を、例えば、無機寒天培地(組成例:2%グルコース、0.1%硫酸アンモニウム、0.06%リン酸2水素カリウム、0.025%硫酸マグネシウム・7水和物、0.009%硫酸亜鉛・7水和物、1.5%寒天、いずれも濃度は%(w/v))、PDA培地、等の培地に接種し、10〜40℃、好ましくは27〜30℃にて、7〜10日間静置培養を行なうことにより胞子を形成させ、次いで生理食塩水などに懸濁することで、胞子懸濁液を調製することができる。胞子懸濁液には菌糸体が含まれていても、含まれていなくてもよい。
工程Aで得られた胞子懸濁液を、培養液に接種して培養し、胞子を発芽させて菌糸体を得る。培養液に接種する糸状菌の胞子数は、1×102〜1×108個−胞子/mL−培養液、好ましくは1×102〜5×104個−胞子/mL−培養液、より好ましくは5×102〜1×104個−胞子/mL−培養液、さらに好ましくは1×103〜1×104個−胞子/mL−培養液である。培養液には、市販の培地、例えば、PDB培地、LB培地、NB培地、SB培地、SD培地等が利用できる。該培養液には、発芽率と菌体生育の観点から、炭素源としてグルコース、キシロースなどの単糖、シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖、又はデンプン等の多糖;グリセリン、クエン酸などの生体成分;窒素源として硫酸アンモニウム、尿素、アミノ酸等;その他無機物としてナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類、を適宜添加することができる。単糖、オリゴ糖、多糖及びグリセリンの好ましい濃度は0.1〜30%(w/v)、クエン酸の好ましい濃度は0.01〜10%(w/v)、硫酸アンモニウム、尿素及びアミノ酸の好ましい濃度は0.01〜1%(w/v)、無機物の好ましい濃度は0.0001〜0.5%(w/v)である。上記培養液に胞子懸濁液を接種し、好ましくは80〜250rpm、より好ましくは100〜170rpmで攪拌しながら、25〜42.5℃の培養温度制御下で、好ましくは24〜120時間、より好ましくは48〜72時間培養する。培養に供する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、200mL容バッフル付フラスコの場合は50〜100mL程度、500mL容バッフル付フラスコの場合は100〜300mL程度であればよい。この培養により、接種した胞子は発芽し、菌糸体へと成長する。
C4ジカルボン酸生産能向上の観点から、工程B1で得られた菌糸体をさらに培養して増殖させる工程(工程B2)を行うことが好ましい。工程B2で使用する増殖用の培養液は特に限定されないが、通常使用されるグルコースを含む無機培養液であればよく、例えば、7.5〜30%グルコース、0.05〜2%硫酸アンモニウム、0.03〜0.6%リン酸2水素カリウム、0.01〜0.1%硫酸マグネシウム・7水和物、0.005〜0.05%硫酸亜鉛・7水和物、及び3.75〜20%炭酸カルシウム(いずれも濃度は%(w/v))を含有する培養液等が挙げられる。当該培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、500mL容三角フラスコの場合は50〜300mL、好ましくは100〜200mLであればよい。この培養液に、工程B1で培養した菌体を、湿重量として1〜6g−菌体/100mL−培養液、好ましくは3〜4g−菌体/100mL−培養液となるよう接種し、100〜300rpm、好ましくは170〜230rpmで攪拌しながら、25〜42.5℃の培養温度制御下で、12〜120時間、好ましくは24〜72時間培養する。
上記の手順(工程B1又はB2)で得られた糸状菌の菌糸体を培養して、当該菌にC4ジカルボン酸を生産させる。該培養の条件は、上述した通常の糸状菌の培養条件に従えばよい。培地の量は、200mL容三角フラスコの場合は20〜80mL程度、500mL容三角フラスコの場合は50〜200mL程度、30Lジャーファーメンターの場合は10L〜15L程度とすることができるが、培養容器にあわせて適宜調整すればよい。培地に対する工程B1又はB2で得られた菌体の接種量は、好ましくは湿重量として5g〜90g−菌体/100mL−培地、より好ましくは5g〜50g−菌体/100mL−培地であり得る。好適には、培養は、100〜300rpm、好ましくは150〜230rpmで攪拌しながら、25〜45℃の温度下で、2時間〜240時間、好ましくは12時間〜120時間行われる。ジャーファーメンターを用いる場合は、通気は好ましくは0.05〜2vvm、より好ましくは0.1〜1.5vvmにて行う。
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
配列番号2で示されるアミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらにより好ましくは98%以上、なお好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列であるか;又は
配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個以上10個以下、好ましくは1個以上8個以下、より好ましくは1個以上5個以下、さらに好ましくは1個以上3個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列である、〔1〕記載のポリペプチド。
配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個以上30個以下、好ましくは1個以上24個以下、より好ましくは1個以上15個以下、さらに好ましくは1個以上9個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列である、〔7〕記載のポリヌクレオチド。
好ましくはリゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)又はリゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)であり、
より好ましくはリゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)である、〔17〕記載の形質転換細胞。
好ましくはリゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)又はリゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)であり、
より好ましくはリゾプス・デレマー(Rhizopus delemar)である、〔32〕記載の方法。
(1)ゲノム抽出
PDA培地にRhizopus delemar JCM(Japan Collection of Microorganisms/理研)5557株(以降、5557株と表記)の胞子を植菌後、30℃で5日間培養を行った。培養後、菌体を3mL用メタルコーン(安井器械)とともに3mL破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素中で10分間以上凍結させた。その後、マルチビーズショッカー(安井器械)を用いて1700rpmで10秒間菌体の破砕を行った。破砕後の容器にTE Buffer(pH8.0)(ニッポンジーン)を400μL加え転倒混和し、250μLを1.5mLチューブに移した。該菌体溶液から、“Genとるくん(酵母用)”(タカラバイオ)を用いて、プロトコールに従いゲノム抽出を行った。得られたゲノム溶液50μLに対し、RNaseA(ロシュ)を1μL添加し、37℃で1時間反応させた。反応後、等量のフェノールクロロホルムを加え、タッピングにより混和した後、4℃、14500rpmで5分間遠心し、上清を新しい1.5mLチューブに移した。再度フェノールクロロホルム処理を繰り返し、次いでエタノール沈殿を行い、5557株の精製ゲノム溶液を得た。
(i)total RNA抽出
5557株の菌体6g−湿重量を、液体培地40mL(0.1g/L(NH4)2SO4、0.6g/L KH2PO4、0.25g/L MgSO4・7H2O、0.09g/L ZnSO4・7H2O、50g/L 炭酸カルシウム、100g/Lグルコース)に植菌し、35℃、170rpmで8時間培養した。培養液中から菌体をろ過、回収し、0.85%生理食塩水100mLで2回洗浄を行った。洗浄後、吸引濾過により余分な水分を取り除いた後、0.3gを量りとり3mL用メタルコーン(安井器械)とともに3mL破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素に投入し、凍結させた。得られた凍結菌体を、マルチビーズショッカー(安井器械)を用いて1700rpmで10秒間破砕した。破砕後の菌体にRLT bufferを500μL添加し、転倒混和後、450μLをRNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)に供し、total RNA抽出を行った。得られたRNA溶液40μLに1μLのDNaseI(TaKaRa)及び5μLの10×DNaseI buffer(USB Corporation)を添加し、RNase free waterで50μLにフィルアップした後、37℃で30分以上反応させて溶液中の残存DNAを除去した。DNaseIをさらに1μL追加し、37℃で30分間反応させた後にフェノール/クロロホルム抽出を行い、次いでエタノール沈殿を行った。沈殿を50μLの滅菌水に溶解し、Qubit(Life Technologies)を用いてRNA溶液の濃度及び純度を測定した。また、該RNA溶液を適宜希釈し、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent)及びRNA6000 Pico Kit(Agilent)を用いて抽出したRNAの検定を行った。RNAの分解度指標である「RNA Integrity Number(RIN値)」が6.0以上であることを確認し、得られたRNA溶液をtotal RNAとして取得した。
cDNA合成は、SuperScriptIII First−Strand Synthesis SuperMix for qRT−PCR(Invitrogen)を用いて行った。すなわち、(i)で得られたRNA溶液1μgをDEPC水で8μLにフィルアップした後、10μLの2×RT Reaxtion Mixと、2μLのRT Enzyme Mixを添加し、穏やかに混ぜ、25℃で10分間、50℃で30分間、85℃で5分間反応させた。反応後の溶液に1μLのRNaseHを加え37℃で20分間反応させ、これをcDNA溶液とした。
(i)pUC18へのtrpC遺伝子領域の導入
上記(1)で得られた5557株のゲノムDNAを鋳型に、trpC遺伝子(配列番号3)を含むDNA断片を、プライマーoJK162(配列番号4)及びoJK163(配列番号5)を用いたPCRにて合成した。次に、プラスミドpUC18を鋳型に、プライマーoJK164(配列番号6)及びoJK165(配列番号7)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。以上の2断片をIn−Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結しプラスミドpUC18−trpCを構築した。
上記(1)で得られた5557株のゲノムDNAを鋳型に、ADH1のプロモーター配列(配列番号8)を含むDNA断片とターミネーター配列(配列番号9)を含むDNA断片とを、それぞれプライマーoJK202(配列番号10)及びoJK204(配列番号11)、ならびにoJK205(配列番号12)及びoJK216(配列番号13)を用いたPCRにて増幅した。次に、(i)で得られたプラスミドpUC18−trpCを鋳型に、プライマーoJK210(配列番号14)及びoJK211(配列番号15)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。以上の3断片を(i)と同様の手順で連結してプラスミドpUC18−trpC−Padh−Tadhを構築した。得られたプラスミドには、trpC遺伝子領域の下流にADH1プロモーター及びターミネーターが順に配置されている。さらにADH1ターミネーターの下流にはNot I制限酵素認識配列が配置されている。
配列番号1で示される遺伝子(以下、RdCA1Sと称する)を含むプラスミドを人工遺伝子合成により合成し、プライマーNK−035(配列番号16)及びNK−036(配列番号17)を用いたPCRにて増幅した。次に、(ii)で得られたプラスミドpUC18−trpC−Padh−Tadhを鋳型に、プライマーNK−011(配列番号18)及びNK−012(配列番号19)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。上記2断片を(i)と同様の手順で連結してプラスミドpUC18−trpC−Padh−RdCA1S−Tadhを構築した。得られたプラスミドには、ADHプロモーターとターミネーターの間に配列番号1で示されるRdCA1S遺伝子が挿入されている。また、配列番号22で示される遺伝子(以下、RdCA1Lと称する)を含むプラスミドを人工遺伝子合成により合成し、プライマーPadh−RdCAfull F(配列番号24)及びRdCA−Tadh R2(配列番号25)を用いたPCRにて増幅した。次に、(ii)で得られたプラスミドpUC18−trpC−Padh−Tadhを鋳型に、プライマーRdPADH R(配列番号26)及びRdTADH F(配列番号27)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。上記2断片を(i)と同様の手順で連結してプラスミドpUC18−trpC−Padh−RdCA1L−Tadhを構築した。
(i)トリプトファン栄養要求性株の作製
遺伝子導入の宿主細胞として用いたトリプトファン栄養要求性株は、5557株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設(TIARA)において行った。照射は、AVFサイクロトロンを用いて12C5+を加速し、220MeVのエネルギーで100〜1250Gray照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、トリプトファン栄養要求性を示すRhizopus delemar 02T6株(以降、02T6株と表記)を取得した。02T6株は、trpC遺伝子コーディング領域(配列番号3)全長2298bp中の2093番目が一塩基欠損している。
上記(3)で作製したプラスミドベクターpUC18−trpC−Padh−Tadh、pUC18−trpC−Padh−RdCA1S−Tadh及びpUC18−trpC−Padh−RdCA1L−Tadhを用いて、大腸菌DH5α株(ニッポンジーン)をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。得られた形質転換細胞を37℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBamp液体培地(Bacto Trypton 1%、Yeast Extract 0.5%、NaCl 1%,アンピシリンナトリウム50μg/mL)2mLに接種し、37℃で一晩培養した。この培養液よりハイピュアプラスミドアイソレーションキット(ロシュライフサイエンス)を用いて各プラスミドベクターの精製を行った。
(ii)で得られたプラスミドベクターpUC18−trpC−Padh−Tadh、pUC18−trpC−Padh−RdCA1S−Tadh及びpUC18−trpC−Padh−RdCA1L−Tadhの各DNA溶液(1μg/μL)10μLを金粒子溶液(60mg/mL)100μLに加え混合した後、0.1Mスペルミジンを40μL加え、ボルテックスでよく攪拌した。さらに2.5M CaCl2を100μL加え、ボルテックスで1分間攪拌し、次いで6000rpmで30秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に70%EtOHを200μL加え、30秒間ボルテックスで攪拌した後、6000rpmで30秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を100μLの100%EtOHで再懸濁した。
(1)菌株の培養
(i)菌糸体の調製
500mL用バッフル付三角フラスコ(旭硝子)に、ソルビタンモノラウレート(レオドールSP−L10(花王))を最終濃度で0.5%(v/v)添加した200mLのSD/−Trp培地(Clontech)およびPDB培地(ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー)を供し、実施例1で調製したCA1株S及び5557株の胞子液を1×103個−胞子/mL−培地となるようにそれぞれ接種後、27℃にて3日間、170rpmで攪拌培養した。得られた培養物を予め滅菌処理したメッシュ網目250μmのステンレスふるい(アズワン)を用いてろ過し、菌体をフィルター上に回収した。
500mL容三角フラスコに供した無機培養液100mL(0.1g/L(NH4)2SO4、0.6g/L KH2PO4、0.25g/L MgSO4・7H2O、0.09g/L ZnSO4・7H2O、50g/L炭酸カルシウム、100g/Lグルコース)に、(i)で回収した湿菌体5.0〜8.0gを接種し、27℃で約40時間、220rpmにて攪拌培養した。得られた培養物を、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー(MILLIPORE)を用いてろ過し、フィルター上に菌体を回収した。さらにこのフィルターホルダー上で、200mLの生理食塩水で菌体を洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。
上記(1)で得られたCA1S株及び5557株の湿菌体6.0gを、200mL容三角フラスコに供した無機培養液40mL(0.0175g/L(NH4)2SO4、0.06g/L KH2PO4、0.375g/L MgSO4・7H2O、0.135g/L ZnSO4・7H2O、50g/L炭酸カルシウム、100g/Lグルコース)に植菌し、35℃、170rpmで24時間攪拌培養した。得られた培養物を、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー(MILLIPORE)を用いてろ過し、フィルター上に菌体を回収した。さらにこのフィルターホルダー上で、200mLの生理食塩水で菌体を洗浄し、生理食塩水を吸引ろ過して除去し、菌体を0.3gずつ−80℃にて凍結した。凍結菌体をマルチビーズショッカーおよびメタルコーン(安井器械)を用いて破砕した。ここに50mM Tris−HClバッファー(pH8.0)1mLを加えて再度破砕し、15000rpm・4℃にて5分間遠心分離した後、上清をAmiconUltra−0.5(3kDa、ミリポア)を用いて濃縮・洗浄し菌体破砕液とした。
上記(2)で得られたCA1S株及び5557株の菌体破砕液を10μL添加した96穴アッセイプレート(イワキ)に、120μLの反応液(終濃度50mM Tris−HCl pH8.0、50mMNa2SO4、0.004%フェノールレッド)を加え、ドライアイスを30分間浸漬させたCO2飽和水を70μL添加することで反応を開始した。30℃における557nmの吸光度が0.35を下回るまでの時間を基準とし、文献(C.S. Gai et al., AMB Express 2014, 4, 2−13.)に従って活性値(U/菌体湿重量g)を算出した。解析結果を表3に示す。野生株である5557株のカーボニックアンヒドラーゼ活性と比較して、CA1S株ではカーボニックアンヒドラーゼ活性が22倍に向上した。
(1)菌株の培養
(i)菌糸体の調製
500mL用バッフル付三角フラスコ(旭硝子)に、ソルビタンモノラウレート(レオドールSP−L10(花王))を最終濃度で0.5%(v/v)添加した200mLのSD/−Trp培地(Clontech)を供し、実施例1で調製したCA1S株、CA1L株及びNC株の胞子液を1×103個−胞子/mL−培地となるように接種後、27℃にて3日間、170rpmで攪拌培養した。得られた培養物を予め滅菌処理したメッシュ網目250μmのステンレスふるい(アズワン)を用いてろ過し、菌体をフィルター上に回収した。
500mL用バッフル付三角フラスコ(旭硝子)に、ソルビタンモノラウレート(レオドールSP−L10(花王))を最終濃度で0.5%(v/v)添加した200mLのSD/−Trp培地(Clontech)を供し、実施例1で調製したCA1株及びNC株の胞子液を1×103個−胞子/mL−培地となるように接種後、27℃にて3日間、170rpmで攪拌培養した。得られた培養物を予め滅菌処理したメッシュ網目250μmのステンレスふるい(アズワン)を用いてろ過し、菌体をフィルター上に回収した。
実施例2(1)(ii)と同様の条件で菌糸体を増殖させた。
上記(1)で得られたCA1S株、CA1L株及びNC株の湿菌体6.0gを、200mL容三角フラスコに供した無機培養液40mL(0.0175g/L(NH4)2SO4、0.06g/L KH2PO4、0.375g/L MgSO4・7H2O、0.135g/L ZnSO4・7H2O、50g/L炭酸カルシウム、100g/Lグルコース)に植菌し、35℃、170rpmで攪拌培養した。培養8時間後に、菌体を含まない培養上清を回収し、後述する参考例1に記載の手順にてC4ジカルボン酸(フマル酸、リンゴ酸)の定量を行った。求めた各C4ジカルボン酸の量に基づいて、下記式に従いCA1S株およびCA1L株における各C4ジカルボン酸の生産能向上率を算出した。
向上率(%)
=(CA1S株およびCA1L株における生産速度/
NC株および5557株における生産速度)×100−100
結果を表5に示す。RdCA1遺伝子を導入されていないNC株と比較して、CA1S株では、リンゴ酸が18%およびフマル酸が28%の生産能の向上が観察された。一方、CA1L株では5557株と比較してフマル酸生産能の向上は観察されなかった。
培養上清中のC4ジカルボン酸(フマル酸、リンゴ酸及びコハク酸)の定量は、HPLCにより行った。
HPLC分析に供する培養上清は、予め37mM硫酸にて適宜希釈した後、DISMIC−13cp(0.20μmセルロースアセテート膜、ADVANTEC)又はアクロプレップ96フィルタープレート(0.2μmGHP膜、日本ポール)を用いて不溶物の除去を行なった。
HPLCの装置は、LaChrom Elite(日立ハイテクノロジーズ)を用いた。分析カラムには、ICSep ICE−ION−300 Guard Column Cartride(4.0mmI.D.×2.0cm、TRANSGENOMIC)を接続した有機酸分析用ポリマーカラムICSep ICE−ION−300(7.8mm I.D.×30cm、TRANSGENOMC)を用い、溶離液は10mM硫酸、流速0.5mL/分、カラム温度50℃の条件にて溶出を行なった。各C4ジカルボン酸の検出には、UV検出器(検出波長210nm)を用いた。濃度検量線は、標準試料〔フマル酸(販売元コード063−00655、和光純薬工業)、リンゴ酸(販売元コード135−00562、和光純薬工業)、コハク酸(販売元コード194−04335、和光純薬工業)〕を用いて作成した。それぞれの濃度検量線に基づいて、各成分の定量を行なった。
Claims (19)
- 配列番号2で示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、カーボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチド。
- 前記配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個以上10個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列である、請求項1記載のポリペプチド。
- 細胞のC4ジカルボン酸生産能向上機能を有する、請求項1又は2記載のポリペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項4記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列が、配列番号1で示されるヌクレオチド配列に対して1個以上30個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列である、請求項5記載のポリヌクレオチド。
- cDNA又は化学合成DNAである、請求項4〜6のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
- 外来の請求項4〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換細胞。
- 請求項4〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチドの発現が強化された形質転換細胞。
- 前記細胞が微生物細胞である、請求項8又は9記載の形質転換細胞。
- 前記微生物が糸状菌である、請求項10記載の形質転換細胞。
- 糸状菌がリゾプス属菌である、請求項11記載の形質転換細胞。
- C4ジカルボン酸生産能が向上している、請求項8〜12のいずれか1項記載の形質転換細胞。
- C4ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸、である、請求項13記載の形質転換細胞。
- 請求項8〜14のいずれか1項記載の形質転換細胞を培養することを含む、C4ジカルボン酸の製造方法。
- 前記培養物からC4ジカルボン酸を回収することをさらに含む、請求項15記載の製造方法。
- 前記C4ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸である、請求項15又は16記載の製造方法。
- 請求項4〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するか、又は請求項4〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチドの発現を強化することを含む、宿主細胞におけるC4ジカルボン酸生産能の向上方法。
- C4ジカルボン酸がフマル酸、リンゴ酸又はコハク酸である、請求項18記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016129167 | 2016-06-29 | ||
JP2016129167 | 2016-06-29 | ||
PCT/JP2017/022943 WO2018003641A1 (ja) | 2016-06-29 | 2017-06-22 | C4ジカルボン酸の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018003641A1 JPWO2018003641A1 (ja) | 2019-04-18 |
JP6944748B2 true JP6944748B2 (ja) | 2021-10-06 |
Family
ID=60786896
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018525105A Active JP6944748B2 (ja) | 2016-06-29 | 2017-06-22 | C4ジカルボン酸の製造方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10590442B2 (ja) |
JP (1) | JP6944748B2 (ja) |
CN (1) | CN109415720B (ja) |
WO (1) | WO2018003641A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117143744B (zh) * | 2023-08-29 | 2024-03-26 | 四川轻化工大学 | 一种分枝横梗霉及其在制备黄水酯化液中的应用 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2158323A4 (en) | 2007-05-18 | 2011-06-22 | Microbia Prec Engineering Inc | PRODUCTION OF ORGANIC ACID BY PILZ CELLS |
EP2304039B1 (en) | 2008-06-17 | 2019-08-21 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the biosynthesis of fumarate, malate, and acrylate |
WO2010111344A2 (en) * | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Microbia, Inc. | Methods and microorganisms for production of c4-dicarboxylic acids |
DK2769985T3 (da) * | 2010-06-21 | 2018-01-29 | Novozymes Inc | Polypeptider fra Aspergillus aculeatus med C4-dicarboxylsyre-transportøraktivitet samt polynukleotider, som koder for samme |
CN103917649A (zh) | 2011-08-19 | 2014-07-09 | 诺维信股份有限公司 | 用于生产c4-二羧酸的重组微生物 |
WO2014018755A1 (en) * | 2012-07-25 | 2014-01-30 | Cargill Incorporated | Yeast cells having nadp(h)-dependent reductive tca pathway from pyruvate to succinate |
CN103013843A (zh) | 2012-12-19 | 2013-04-03 | 江南大学 | 一种高产延胡索酸米根霉工程菌及其应用 |
BR112017013748A2 (pt) | 2014-12-23 | 2018-03-13 | Genomatica Inc | método de produção & processamento de diaminas |
JP6637712B2 (ja) | 2015-10-13 | 2020-01-29 | 花王株式会社 | C4ジカルボン酸の製造方法 |
CN108138174A (zh) | 2015-10-28 | 2018-06-08 | 花王株式会社 | C4二羧酸的制造方法 |
JP6859086B2 (ja) | 2016-12-01 | 2021-04-14 | 花王株式会社 | 糸状菌変異株及びそれを用いたc4ジカルボン酸の製造方法 |
-
2017
- 2017-06-22 JP JP2018525105A patent/JP6944748B2/ja active Active
- 2017-06-22 US US16/313,547 patent/US10590442B2/en active Active
- 2017-06-22 CN CN201780040866.7A patent/CN109415720B/zh active Active
- 2017-06-22 WO PCT/JP2017/022943 patent/WO2018003641A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190316159A1 (en) | 2019-10-17 |
WO2018003641A1 (ja) | 2018-01-04 |
JPWO2018003641A1 (ja) | 2019-04-18 |
US10590442B2 (en) | 2020-03-17 |
CN109415720B (zh) | 2021-11-26 |
CN109415720A (zh) | 2019-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Brown et al. | Identification of a 12-gene fusaric acid biosynthetic gene cluster in Fusarium species through comparative and functional genomics | |
US20160289690A1 (en) | Mortierella alpina recombinant gene expression system and construction method and use thereof | |
CN101287833A (zh) | 酵母和l-乳酸的制造方法 | |
US10435724B2 (en) | Method for producing C4 dicarboxylic acid | |
JP6944748B2 (ja) | C4ジカルボン酸の製造方法 | |
US10787686B2 (en) | Method for producing C4-dicarboxylic acid | |
JP6859086B2 (ja) | 糸状菌変異株及びそれを用いたc4ジカルボン酸の製造方法 | |
JP6671922B2 (ja) | C4ジカルボン酸の製造方法 | |
JP6671923B2 (ja) | C4ジカルボン酸の製造方法 | |
JP6970101B2 (ja) | 変異糸状菌、及びそれを用いたc4ジカルボン酸の製造方法 | |
JP2017121184A (ja) | 変異リゾプス属菌 | |
JP7025932B2 (ja) | 変異リゾプス属菌 | |
JP6276479B2 (ja) | 新規プロモーター | |
JP2006280368A (ja) | 有機酸の製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200331 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210406 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210603 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210617 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210907 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210909 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6944748 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |