JP6939181B2 - Culture container and method for manufacturing the culture container - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養技術に関し、特にスフェア培養に用いられる培養容器に関する。 The present invention relates to a cell culture technique, and more particularly to a culture vessel used for sphere culture.
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、培養容器に細胞と培養液を充填して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
In recent years, in the fields of pharmaceutical production, gene therapy, regenerative medicine, immunotherapy, etc., it has been required to efficiently culture a large amount of cells, tissues, microorganisms, etc. in an artificial environment.
In such a situation, cells and a culture solution are filled in a culture vessel, and a large amount of cells are automatically cultured in a closed system.
また、最近では、ｉＰＳ細胞などの接着細胞を培養容器に接着させることなく、培養容器内で細胞を浮遊させて培養し、スフェア（凝集塊）を形成させることによって、細胞の培養効率を向上させる方法が用いられている。この場合、通常、培養容器内の底面には、細胞が接着しないように、細胞接着抑制剤を塗布（コーティング）しておく必要がある。 Recently, the culture efficiency of cells is improved by suspending and culturing cells in a culture vessel without adhering adherent cells such as iPS cells to the culture vessel to form spheres (aggregates). The method is used. In this case, it is usually necessary to apply (coat) a cell adhesion inhibitor on the bottom surface of the culture vessel so that the cells do not adhere.
ここで、スフェアを形成する培養方法に関して、特許文献１には、細胞接着抑制剤が内面に塗布された、凹部を有する培養基材が提案されている。この培養基材は、リジッドなものであり、細胞接着抑制剤を内面に塗布することによって、スフェアは適切に形成し得ると考えられる。 Here, with respect to the culture method for forming a sphere, Patent Document 1 proposes a culture substrate having a recess in which a cell adhesion inhibitor is applied to the inner surface. This culture substrate is rigid, and it is considered that spheres can be appropriately formed by applying a cell adhesion inhibitor to the inner surface.
一方、細胞を効率的に大量に培養する場合には、容積の大きい培養容器を比較的容易に製造可能な、軟包材からなる培養容器を用いて、閉鎖系で細胞を自動的に培養することが好ましい。
しかしながら、このような軟包材からなる培養容器は、一般にバッグ形状となるため、培養容器内の底面に細胞接着抑制剤を塗布すると、培養容器内の底面と上面が接触することによって、図８に示すように、底面に塗布された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りして、底面から剥がれてしまうという問題があった。
On the other hand, in the case of efficiently culturing a large amount of cells, the cells are automatically cultured in a closed system using a culture vessel made of a soft packaging material, which can relatively easily produce a large-volume culture vessel. Is preferable.
However, since a culture container made of such a soft packaging material generally has a bag shape, when a cell adhesion inhibitor is applied to the bottom surface of the culture container, the bottom surface and the top surface of the culture container come into contact with each other, and FIG. As shown in the above, there is a problem that the film of the cell adhesion inhibitor applied to the bottom surface is settled to the upper surface and peeled off from the bottom surface.
すなわち、このように細胞接着抑制剤の膜が底面から剥がれると、細胞がその細胞接着抑制剤の剥がれた底面部分に接着してしまうため、細胞はスフェアを適切に形成することができなくなり、スフェア培養が阻害されてしまうという問題があった。 That is, when the film of the cell adhesion inhibitor is peeled off from the bottom surface in this way, the cells adhere to the peeled bottom surface portion of the cell adhesion inhibitor, so that the cells cannot form spheres properly, and the spheres cannot be formed properly. There was a problem that the culture was hindered.
そこで、本発明者らは鋭意研究し、培養容器内の底面と上面の基材を特定の条件で加工することによって、細胞接着抑制剤の膜が底面から上面に裏移りしない培養容器を製造することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、培養容器における細胞接着抑制剤を塗布する表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する表面の接触角ヒステリシスよりも大きくなるように、少なくとも細胞接着抑制剤を塗布する表面側に表面処理を施し、かつ、当該表面に細胞接着抑制剤の膜を形成することによって、細胞接着抑制剤の膜が剥がれて対面側に裏移りすることを防止することが可能となった。
Therefore, the present inventors have diligently researched and processed the base materials on the bottom surface and the top surface of the culture vessel under specific conditions to produce a culture vessel in which the film of the cell adhesion inhibitor does not set off from the bottom surface to the top surface. We succeeded in completing the present invention.
That is, at least the surface surface to which the cell adhesion inhibitor is applied is subjected to surface treatment so that the contact angle hysteresis of the surface to which the cell adhesion inhibitor is applied in the culture vessel becomes larger than the contact angle hysteresis of the surface facing the cell adhesion inhibitor. Moreover, by forming a film of the cell adhesion inhibitor on the surface, it is possible to prevent the film of the cell adhesion inhibitor from peeling off and settling to the facing side.
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、スフェア培養のための軟包材からなる培養容器の製造において、培養容器の内面が接触することにより、一方の内面に塗布した細胞接着抑制剤が剥がれて、他方の内面に裏移りしてしまうことを防止可能な培養容器、及び培養容器の製造方法の提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and in the production of a culture vessel made of a soft packaging material for sphere culture, a cell adhesion inhibitor applied to one inner surface by contact with the inner surface of the culture vessel. It is an object of the present invention to provide a culture vessel capable of preventing the culture vessel from peeling off and settling on the other inner surface, and a method for producing the culture vessel.
上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、軟包材からなる培養容器であって、対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも前記第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成された構成としてある。 In order to achieve the above object, the culture vessel of the present invention is a culture vessel made of a soft packaging material, which is provided with a first side surface portion and a second side surface portion facing each other, and has a contact angle hysteresis when water slides down. When defined as forward contact angle-backward contact angle, the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the first side surface portion is larger than the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the second side surface portion. At least the inner surface side of the first side surface portion is subjected to surface treatment, and a film made of a cell adhesion inhibitor is formed on the inner surface side of the first side surface portion.
また、本発明の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、前記フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法としてある。 Further, the method for producing a culture container of the present invention is a method for producing a culture container for sphere culture, in which a part of a film or sheet made of polyolefin is subjected to a hydrophilization treatment, and the film or sheet is hydrophilized. The first side surface portion provided with the surface provided with the above surface on the inner surface side and the second side surface portion facing the first side surface portion are provided, and the contact angle hysteresis is set to the forward contact angle when the water slides down. When defined as the receding contact angle, the culture vessel is formed in which the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the first side surface portion is larger than the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the second side surface portion. This is a method of applying a cell adhesion inhibitor to the inner surface side of the first side surface portion.
また、本発明の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、前記フィルム又はシートの他の一部に前記第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、前記フィルム又はシートの前記第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する前記第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法としてある。 Further, the method for producing a culture vessel of the present invention is a method for producing a culture vessel for sphere culture, in which a part of a film or sheet made of polyolefin is subjected to a first hydrophilization treatment and the film or sheet is subjected to the first hydrophilization treatment. The other part is subjected to a second hydrophilization treatment having a smaller hydrophilization power than the first hydrophilization treatment, and the surface of the film or sheet subjected to the first hydrophilization treatment is on the inner surface side. It is provided with a first side surface portion provided, and a second side surface portion having the second hydrophilized surface facing the first side surface portion on the inner surface side, and has a contact angle hysteresis. When is defined as forward contact angle-backward contact angle at the time of water sliding, the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the first side surface portion is the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the second side surface portion. This is a method of forming a larger culture vessel and applying a cell adhesion inhibitor to the inner surface side of the first side surface portion.
本発明によれば、スフェア培養のための軟包材からなる培養容器の製造において、培養容器の内面が接触することにより、一方の内面に塗布した細胞接着抑制剤が剥がれて、他方の内面に裏移りしてしまうことを防止することが可能となる。 According to the present invention, in the production of a culture vessel made of a soft packaging material for sphere culture, when the inner surfaces of the culture vessels come into contact with each other, the cell adhesion inhibitor applied to one inner surface is peeled off and the other inner surface is exposed. It is possible to prevent set-off.
以下、本発明の培養容器、及び培養容器の製造方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
本実施形態の培養容器は、軟包材からなる培養容器であって、対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成されたことを特徴とする。
Hereinafter, embodiments of the culture vessel of the present invention and the method for producing the culture vessel will be described in detail. However, the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiments.
The culture vessel of the present embodiment is a culture vessel made of a soft packaging material, and includes a first side surface portion and a second side surface portion facing each other, and has a contact angle hysteresis of forward contact angle-backward contact when water slides down. When defined as an angle, at least the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the first side surface portion is larger than the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the second side surface portion. The inner surface side is surface-treated, and a film made of a cell adhesion inhibitor is formed on the inner surface side of the first side surface portion.
まず、静的水接触角と接触角ヒステリシスについて、図１を参照して説明する。
静的水接触角とは、静止した液体の表面が固体壁の表面に接するところで液面と固体面がなす角（図１のθｓ）を意味する。静的水接触角が大きいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強く、静的水接触角が小さいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強いという関係がある。
First, the static water contact angle and the contact angle hysteresis will be described with reference to FIG.
The static water contact angle means the angle (θs in FIG. 1) formed by the liquid surface and the solid surface where the surface of the stationary liquid contacts the surface of the solid wall. When the static water contact angle is large, the hydrophobicity of the surface of the solid wall is relatively strong, and when the static water contact angle is small, the hydrophilicity of the surface of the solid wall is relatively strong.
接触角ヒステリシスとは、水滴が固体壁の表面を滑落するときの前進接触角（θa）と、後退接触角（θr）との差（滑落時ヒステリシス（θa−θr））を意味する。
すなわち、水平に支持した固体壁の表面に水滴を摘下し、固体壁を徐々に傾けて、液滴が転落を開始したときの前進接触角と後退接触角にもとづき算出される。この接触角ヒステリシスは、固体壁の表面の動的な親水性（濡れ性）を示す指標として用いられる。接触角ヒステリシスが大きいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強く、接触角ヒステリシスが小さいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強いという関係がある。
The contact angle hysteresis means the difference between the forward contact angle (θa) when a water droplet slides down the surface of a solid wall and the backward contact angle (θr) (sliding hysteresis (θa−θr)).
That is, it is calculated based on the forward contact angle and the backward contact angle when the water droplet is plucked on the surface of the horizontally supported solid wall, the solid wall is gradually tilted, and the droplet starts to fall. This contact angle hysteresis is used as an index showing the dynamic hydrophilicity (wetting property) of the surface of the solid wall. When the contact angle hysteresis is large, the hydrophilicity of the surface of the solid wall is relatively strong, and when the contact angle hysteresis is small, the hydrophobicity of the surface of the solid wall is relatively strong.
本実施形態の培養容器を構成する軟包材としては、ポリオレフィンを用いることが好ましく、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等を用いることがより好ましい。特に、少なくとも培養容器の第一の側面部の内面側と第二の側面部の内面側を、ポリオレフィンを用いて構成することが好ましい。 As the flexible packaging material constituting the culture vessel of the present embodiment, it is preferable to use polyolefin, and it is more preferable to use polyethylene (PE), cyclic olefin copolymer (COC), or the like. In particular, it is preferable that at least the inner surface side of the first side surface portion and the inner surface side of the second side surface portion of the culture vessel are formed of polyolefin.
第一の側面部の内面側、及び第二の側面部の内面側は、培養容器内の表面を構成し、細胞培養時において、通常、第一の側面部の内面側が底面となるように培養容器を配置して用いられることを想定している。
すなわち、一般的に細胞培養に使用される培養液の比重は細胞の比重よりも小さいため、培養容器を静置させたときに細胞は、下方に沈降する。このため、通常は、第一の側面部の内面側が底面となるように、培養容器が配置される。
一方、仮に、培養液の比重が細胞の比重よりも大きい場合には、培養容器を静置させたときに細胞は上方に集まると考えられるため、第一の側面部の内面側が上面となるように、培養容器を配置することとなる。
The inner surface side of the first side surface portion and the inner surface side of the second side surface portion constitute the surface inside the culture vessel, and are usually cultured so that the inner surface side of the first side surface portion is the bottom surface during cell culture. It is assumed that the container will be placed and used.
That is, since the specific gravity of the culture medium generally used for cell culture is smaller than the specific gravity of the cells, the cells settle downward when the culture vessel is allowed to stand. For this reason, the culture vessel is usually arranged so that the inner surface side of the first side surface portion is the bottom surface.
On the other hand, if the specific gravity of the culture solution is larger than the specific gravity of the cells, it is considered that the cells gather upward when the culture vessel is allowed to stand, so that the inner surface side of the first side surface portion is the upper surface. The culture vessel will be placed in.
本実施形態の培養容器は、一般的にバッグ形状であり、対面する二つの側面部を備えている。そして、これら側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、異なる値を示すように、少なくとも一方の側面部の内面側に、表面処理が施されている。
このとき、培養容器における、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面側（一般的には底面側）の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面側（一般的には上面側）の接触角ヒステリシスよりも、大きくなるように、培養容器の内面に対して表面処理が施される。
表面処理としては、親水化処理を行うことが好ましい。親水化処理の方法としてコロナ処理やエキシマ処理などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
The culture vessel of the present embodiment is generally bag-shaped and includes two facing side surfaces. Then, surface treatment is applied to the inner surface side of at least one side surface portion so that the contact angle hysteresis of the surface on the inner surface side of these side surface portions shows different values.
At this time, in the culture vessel, the contact angle hysteresis on the front surface side (generally the bottom surface side) on which the cell adhesion inhibitor film is formed faces this, and the surface side (generally the bottom surface side) on which the cell adhesion inhibitor film is not formed ( Generally, the inner surface of the culture vessel is surface-treated so as to be larger than the contact angle hysteresis of the upper surface side).
As the surface treatment, it is preferable to perform a hydrophilic treatment. Examples of the hydrophilization treatment method include, but are not limited to, corona treatment and excimer treatment.
具体的には、例えば以下の（Ａ）〜（Ｆ）ようにすることができるが、これらに限定されない。なお、以下において、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面を第一の側面、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面を第二の側面と称する。 Specifically, for example, the following (A) to (F) can be used, but the present invention is not limited to these. In the following, the surface on which the cell adhesion inhibitor film is formed is referred to as the first side surface, and the surface on which the cell adhesion inhibitor film is not formed is referred to as the second side surface.
（Ａ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｂ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｃ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面にコロナ処理を１回行う。
（Ｄ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｅ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面には表面処理を行わない。
（Ｆ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面にエキシマ処理を１回行う。
(A) The first side surface is subjected to one corona treatment, and the second side surface is not surface-treated.
(B) The first side surface is corona-treated three times, and the second side surface is not surface-treated.
(C) The first side surface is subjected to corona treatment three times, and the second side surface is subjected to corona treatment once.
(D) The first side surface is subjected to excimer treatment once, and the second side surface is not subjected to surface treatment.
(E) The first side surface is subjected to excimer treatment three times, and the second side surface is not subjected to surface treatment.
(F) The first side surface is subjected to the excimer treatment three times, and the second side surface is subjected to the excimer treatment once.
また、本実施形態の培養容器では、以下の（ａ）〜（ｋ）ような表面処理方法は行われない。その理由は、これらの表面処理方法によれば、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面側の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面側の接触角ヒステリシスよりも小さくなるか、又は同じになるためである。 Further, in the culture vessel of the present embodiment, the following surface treatment methods (a) to (k) are not performed. The reason is that, according to these surface treatment methods, the contact angle hysteresis on the surface side that forms the film of the cell adhesion inhibitor is opposed to the contact angle hysteresis on the surface side that does not form the film of the cell adhesion inhibitor. This is because it becomes smaller than or equal to.
（ａ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にも表面処理を行わない。
（ｂ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にコロナ処理を１回行う。
（ｃ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にコロナ処理を３回行う。
（ｄ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面にもコロナ処理を１回行う。
（ｅ）第一の側面にコロナ処理を１回行い、第二の側面にコロナ処理を３回行う。
（ｆ）第一の側面にコロナ処理を３回行い、第二の側面にもコロナ処理を３回行う。
（ｇ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にエキシマ処理を１回行う。
（ｈ）第一の側面に表面処理を行わず、第二の側面にエキシマ処理を３回行う。
（ｉ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面にもエキシマ処理を１回行う。
（ｊ）第一の側面にエキシマ処理を１回行い、第二の側面にエキシマ処理を３回行う。
（ｋ）第一の側面にエキシマ処理を３回行い、第二の側面にもエキシマ処理を３回行う。
(A) No surface treatment is applied to the first side surface, and no surface treatment is applied to the second side surface.
(B) The first side surface is not surface-treated, and the second side surface is corona-treated once.
(C) The first side surface is not surface-treated, and the second side surface is corona-treated three times.
(D) The first side surface is subjected to the corona treatment once, and the second side surface is also subjected to the corona treatment once.
(E) The first side surface is subjected to the corona treatment once, and the second side surface is subjected to the corona treatment three times.
(F) The first side surface is subjected to the corona treatment three times, and the second side surface is also subjected to the corona treatment three times.
(G) The first side surface is not surface-treated, and the second side surface is subjected to one excimer treatment.
(H) The first side surface is not surface-treated, and the second side surface is subjected to excimer treatment three times.
(I) The first side surface is subjected to the excimer treatment once, and the second side surface is also subjected to the excimer treatment once.
(J) The first side surface is subjected to the excimer treatment once, and the second side surface is subjected to the excimer treatment three times.
(K) The first side surface is subjected to the excimer treatment three times, and the second side surface is also subjected to the excimer treatment three times.
本実施形態において、細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いても良い。 In the present embodiment, as the cell adhesion inhibitor, phospholipid polymer, polyvinyl alcohol derivative, phospholipid / polymer complex, polyhydroxyethyl methacrylate, polyvinyl alcohol, agarose, chitosan, polyethylene glycol, albumin and the like can be used. .. Moreover, you may use these in combination.
本実施形態の培養容器は、細胞接着抑制剤の膜が形成される側面部の内面側に、複数のウェルが形成されたものとすることも好ましい。本実施形態の培養容器において、このようなウェルを形成することで、細胞を各ウェル内に集めることができるため、例えば、スフェア培養の初期段階における細胞密度を高めることができ、スフェアの形成効率を向上させることが可能となる。 It is also preferable that the culture vessel of the present embodiment has a plurality of wells formed on the inner surface side of the side surface portion where the film of the cell adhesion inhibitor is formed. By forming such wells in the culture vessel of the present embodiment, cells can be collected in each well, so that, for example, the cell density in the initial stage of sphere culture can be increased, and the sphere formation efficiency can be increased. Can be improved.
また、本実施形態の培養容器の製造方法は、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい培養容器を形成し、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布することを特徴とする。 Further, the method for producing a culture container of the present embodiment is a method for producing a culture container for sphere culture, in which a part of a film or sheet made of polyolefin is subjected to a hydrophilization treatment, and the film or sheet is hydrophilized. A first side surface portion having a surface provided with a surface on the inner surface side and a second side surface portion facing the first side surface portion, and a contact angle hysteresis of forward contact angle-backward when the water slides down. When defined as the contact angle, the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the first side surface portion is larger than the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the second side surface portion to form a culture vessel, and the first side surface portion is formed. It is characterized in that a cell adhesion inhibitor is applied to the inner surface side of the portion.
また、本実施形態の培養容器の製造方法を、スフェア培養のための培養容器の製造方法であって、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、フィルム又はシートの他の一部に第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、フィルム又はシートの第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、第一の側面部に対面する第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい培養容器を形成し、第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する方法とすることも好ましい。 Further, the method for producing a culture vessel of the present embodiment is a method for producing a culture vessel for sphere culture, in which a part of a film or sheet made of polyolefin is subjected to the first hydrophilization treatment, and the film or sheet is formed. The other part is subjected to a second hydrophilization treatment having a smaller hydrophilization power than the first hydrophilization treatment, and the first hydrophilized surface of the film or sheet is provided on the inner surface side. It is provided with one side surface portion and a second side surface portion having a second hydrophilized surface facing the first side surface portion on the inner surface side, and has a contact angle hysteresis at the time of water sliding down. When defined as forward contact angle-backward contact angle, a culture vessel is formed in which the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the first side surface portion is larger than the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the second side surface portion. It is also preferable to apply a cell adhesion inhibitor to the inner surface side of the first side surface portion.
すなわち、本実施形態の培養容器の製造方法では、ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施すと共に、このフィルム又はシートを用いて培養容器を製袋することで、接触角ヒステリシスの値が異なる側面部を備えた培養容器を形成する。
具体的には、細胞接着抑制剤の膜を形成する表面側（第一の側面部の内面側、一般的には底面側）の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜を形成しない表面側（第二の側面部の内面側、一般的には上面側）の接触角ヒステリシスよりも、大きい培養容器を形成する。
That is, in the method for producing a culture container of the present embodiment, a part of a film or sheet made of polyolefin is subjected to a hydrophilic treatment, and the culture container is made into a bag using this film or sheet to reduce contact angle hysteresis. Form culture vessels with side surfaces of different values.
Specifically, the cell adhesion inhibitor film in which the contact angle hysteresis on the surface side (inner surface side of the first side surface portion, generally the bottom surface side) forming the cell adhesion inhibitor film faces this. A culture vessel is formed that is larger than the contact angle hysteresis of the surface side (inner surface side of the second side surface portion, generally the upper surface side) that does not form.
そして、このような培養容器の第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布することで、細胞接着抑制剤の膜が容易に剥がれることのない培養容器を製造することが可能となっている。
したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、スフェアを好適に形成可能な培養容器を製造することが可能である。
Then, by applying the cell adhesion inhibitor to the inner surface side of the first side surface portion of such a culture container, it is possible to manufacture a culture container in which the film of the cell adhesion inhibitor does not easily peel off. It has become.
Therefore, according to the method for producing a culture vessel of the present embodiment, it is possible to produce a culture vessel capable of suitably forming a sphere.
以上説明したように、本実施形態の培養容器、及び培養容器の製造方法によれば、培養容器内における、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面の接触角ヒステリシスよりも大きい培養容器を得ることができる。
このような培養容器に塗布された細胞接着抑制剤は、塗布された表面から剥がれて対面側に裏移りすることがないため、スフェア培養を適切に行うことが可能である。
As described above, according to the culture vessel of the present embodiment and the method for producing the culture vessel, the contact angle hysteresis of the surface on which the film of the cell adhesion inhibitor is formed in the culture vessel faces this. It is possible to obtain a culture vessel having a contact angle hysteresis larger than that of the surface on which the film of the cell adhesion inhibitor is not formed.
Since the cell adhesion inhibitor applied to such a culture container does not peel off from the applied surface and set off to the facing side, sphere culture can be appropriately performed.
以下、本発明の実施形態に係る培養容器において、細胞接着抑制剤の膜が形成される表面の接触角ヒステリシスが、これに対面する、細胞接着抑制剤の膜が形成されない表面の接触角ヒステリシスよりも大きければ、細胞接着抑制剤が塗布された表面から剥がれて対面側に裏移りすることがないことを確認するために行った実験について詳細に説明する。 Hereinafter, in the culture vessel according to the embodiment of the present invention, the contact angle hysteresis of the surface on which the cell adhesion inhibitor film is formed is based on the contact angle hysteresis of the surface on which the cell adhesion inhibitor film is not formed facing the contact angle hysteresis. If it is also large, the experiment performed to confirm that the cell adhesion inhibitor does not peel off from the coated surface and set off to the facing side will be described in detail.
（実施例１）
ポリオレフィンからなる長方形のフィルムを準備して、図２に示すように、その左半分側の正方形部分を培養容器における底面と想定し、その右半分側の正方形部分を培養容器における上面と想定した。そして、底面に細胞接着抑制剤を塗布した後、上面を底面に重ね合わせて荷重をかけ、その後、上面を底面から剥離して、細胞接着抑制剤が上面に裏移りしたか否かを目視により判定した。具体的には、以下のように行った。
(Example 1)
A rectangular film made of polyolefin was prepared, and as shown in FIG. 2, the square portion on the left half side was assumed to be the bottom surface in the culture vessel, and the square portion on the right half side was assumed to be the top surface in the culture vessel. Then, after applying the cell adhesion inhibitor to the bottom surface, the upper surface is superposed on the bottom surface to apply a load, and then the upper surface is peeled off from the bottom surface to visually check whether or not the cell adhesion inhibitor has set off to the upper surface. Judged. Specifically, it was carried out as follows.
まず、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してバッチ式コロナ処理装置（春日電機株式会社製、以下同様）を用いてコロナ処理を１回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は７１．９°であり、接触角ヒステリシスは４３．６°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
First, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, as the surface treatment, the bottom surface was subjected to a corona treatment once using a batch type corona treatment device (manufactured by Kasuga Electric Works Ltd., the same applies hereinafter). Further, the upper surface was not surface-treated.
At this time, the static water contact angle of the bottom surface was 71.9 °, and the contact angle hysteresis was 43.6 °. The static water contact angle on the upper surface was 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
静的水接触角及びヒステリシスの測定には、固液界面解析システムＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ ７００（協和界面科学株式会社製）を使用した。
具体的には、静的水接触角（θｓ）は、フィルム上に純水３μｌを滴下して測定した。また、接触角ヒステリシス（θａ−θｒ）は、フィルム上に純水３０μｌを滴下し、１秒毎に１°ずつ測定台を傾け、滑落時の前進接触角（θａ）と後退接触角（θｒ）を接線法により算出して得た。
A solid-liquid interface analysis system DropMaster 700 (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.) was used for measuring the static water contact angle and hysteresis.
Specifically, the static water contact angle (θs) was measured by dropping 3 μl of pure water onto the film. For the contact angle hysteresis (θa−θr), 30 μl of pure water is dropped on the film, the measuring table is tilted by 1 ° every second, and the forward contact angle (θa) and the backward contact angle (θr) at the time of sliding down. Was calculated by the tangential method.
次に、底面に対して、細胞接着抑制剤として０．５％に調製されたリン脂質ポリマー（LIPIDURE（登録商標），日油株式会社）エタノール溶液をバーコーターで塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。
Next, an ethanol solution of a phospholipid polymer (LIPIDURE (registered trademark), NOF CORPORATION) prepared at 0.5% as a cell adhesion inhibitor was applied to the bottom surface with a bar coater to form a film. , The membrane of this cell adhesion inhibitor was stained with Kumasy Blue and dried.
Then, the upper surface was attached to the bottom surface, a load of 10 g / cm 2 was applied, and the mixture was allowed to stand for 1 minute, and then the upper surface was peeled off from the bottom surface.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことにより、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。 As a result, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface did not set off on the upper surface. In this experiment, the hydrophilicity of the bottom surface improved the adhesion between the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor, while the top surface remained hydrophobic, so the cell adhesion inhibitor was set off from the bottom surface to the top surface. It is probable that it did not peel off.
（実施例２）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
(Example 2)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 1, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 1 for other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, as the surface treatment, the bottom surface was subjected to corona treatment three times using a batch type corona treatment device. Further, the upper surface was not surface-treated.
At this time, the static water contact angle of the bottom surface was 54.2 °, and the contact angle hysteresis was 50.3 °. The static water contact angle on the upper surface was 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、裏移りしていなかった。本実験では底面をより強く親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が一層向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。 As a result, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface was not set off. In this experiment, by making the bottom surface more hydrophilic, the adhesion between the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor was further improved, while the top surface remained hydrophobic, so the cell adhesion inhibitor from the bottom surface to the top surface. However, it is probable that it did not set off and did not peel off.
（比較例１）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
(Comparative Example 1)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 1, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 1 for other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, no surface treatment was performed on the bottom surface and the top surface.
At this time, the static water contact angles of the bottom surface and the top surface were 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。 As a result, the film of the cell adhesion inhibitor formed on the bottom surface was largely set off on the upper surface. In this experiment, both the bottom surface and the top surface remained hydrophobic, so it is probable that the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor did not sufficiently adhere to each other, and the cells settled to the top surface and peeled off from the bottom surface.
（比較例２）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理を行わなかった。一方、上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
このとき、底面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。また、上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。
(Comparative Example 2)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 1, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 1 for other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, the bottom surface was not surface-treated. On the other hand, the upper surface was subjected to corona treatment three times as a surface treatment using a batch type corona treatment apparatus.
At this time, the static water contact angle of the bottom surface was 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °. The static water contact angle on the upper surface was 54.2 °, and the contact angle hysteresis was 50.3 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面が疎水性のままである一方、上面が強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。 As a result, the film of the cell adhesion inhibitor formed on the bottom surface was largely set off on the upper surface. In this experiment, the bottom surface remained hydrophobic, while the top surface was strongly hydrophilic, so it is probable that the film of the cell adhesion inhibitor formed on the bottom surface was settled to the top surface and peeled off from the bottom surface.
（比較例３）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を１回施し、上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
このとき、底面の静的水接触角は７１．９°であり、接触角ヒステリシスは４３．６°であった。また、上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。
(Comparative Example 3)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 1, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 1 for other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, the bottom surface was subjected to corona treatment once using a batch type corona treatment device as a surface treatment, and the top surface was subjected to corona treatment three times using a batch type corona treatment device as a surface treatment.
At this time, the static water contact angle of the bottom surface was 71.9 °, and the contact angle hysteresis was 43.6 °. The static water contact angle on the upper surface was 54.2 °, and the contact angle hysteresis was 50.3 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面よりも上面がより強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。 As a result, the film of the cell adhesion inhibitor formed on the bottom surface was largely set off on the upper surface. In this experiment, since the upper surface was more hydrophilic than the bottom surface, it is considered that the film of the cell adhesion inhibitor formed on the bottom surface was settled on the upper surface and peeled off from the bottom surface.
（比較例４）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。
(Comparative Example 4)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 1, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 1 for other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, the bottom surface and the top surface were subjected to corona treatment three times using a batch type corona treatment device as surface treatment.
At this time, the static water contact angles of the bottom surface and the top surface were 54.2 °, and the contact angle hysteresis was 50.3 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に大きく裏移りしていた。本実験では底面も上面も同様に強く親水化されたため、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜が上面に裏移りし、底面から剥離してしまったと考えられる。
このように、比較例２〜４の結果から、上面が強く親水化されていると、細胞接着抑制剤は底面から剥離しやすくなることが分かった。
As a result, the film of the cell adhesion inhibitor formed on the bottom surface was largely set off on the upper surface. In this experiment, both the bottom surface and the top surface were similarly strongly hydrophilic, so it is probable that the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface was set off on the top surface and peeled off from the bottom surface.
As described above, from the results of Comparative Examples 2 to 4, it was found that when the upper surface is strongly hydrophilic, the cell adhesion inhibitor is easily peeled off from the bottom surface.
（実施例３）
フィルムの材料と表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は５５．２°であり、接触角ヒステリシスは４８．８°であった。また、上面の静的水接触角は９７．０°であり、接触角ヒステリシスは２２．６°であった。
(Example 3)
The film material and surface treatment conditions were different from those in Example 1, and the other conditions were the same as in Example 1.
Specifically, a cyclic olefin copolymer (COC) film was used as the film. Then, the bottom surface was subjected to corona treatment three times using a batch type corona treatment device as a surface treatment. Further, the upper surface was not surface-treated.
At this time, the static water contact angle of the bottom surface was 55.2 °, and the contact angle hysteresis was 48.8 °. The static water contact angle on the upper surface was 97.0 °, and the contact angle hysteresis was 22.6 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。 As a result, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface did not set off on the upper surface. In this experiment, the hydrophilicity of the bottom surface improved the adhesion between the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor, while the top surface remained hydrophobic, so the cell adhesion inhibitor was set off from the bottom surface to the top surface. It is probable that it did not peel off.
（比較例５）
表面処理の条件を実施例３と異なるものとし、その他の条件については、実施例３と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は、９７．０°であり、接触角ヒステリシスは２２．６°であった。
(Comparative Example 5)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 3, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 3 for other conditions.
Specifically, a cyclic olefin copolymer (COC) film was used as the film. Then, no surface treatment was performed on the bottom surface and the top surface.
At this time, the static water contact angles of the bottom surface and the top surface were 97.0 °, and the contact angle hysteresis was 22.6 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面にわずかに裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。 As a result, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface was slightly set off on the top surface. In this experiment, both the bottom surface and the top surface remained hydrophobic, so it is probable that the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor did not sufficiently adhere to each other, and the cells settled to the top surface and peeled off from the bottom surface.
（実施例４）
細胞接着抑制剤の種類とそのコーティング方法、及び表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。また、細胞接着抑制剤として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（BIOSURFINE(登録商標)-ＡＷＰ，東洋合成工業株式会社）を使用した。この細胞接着抑制剤を１％の水溶液に調製してバーコーターで底面に塗布した後、波長２５４ｎｍのＵＶを積算光量０．７Ｊ／ｃｍ２で照射して硬化させた。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は５４．２°であり、接触角ヒステリシスは５０．３°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
(Example 4)
The type of cell adhesion inhibitor, its coating method, and the surface treatment conditions were different from those in Example 1, and the other conditions were the same as in Example 1.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Further, as a cell adhesion inhibitor, polyvinyl alcohol having an azide group in the side chain (BIOSURFINE (registered trademark) -AWP, Toyo Gosei Co., Ltd.) was used. This cell adhesion inhibitor was prepared in a 1% aqueous solution, applied to the bottom surface with a bar coater, and then irradiated with UV having a wavelength of 254 nm at an integrated light intensity of 0.7 J / cm 2 to cure. Then, the bottom surface was subjected to corona treatment three times using a batch type corona treatment device as a surface treatment. Further, the upper surface was not surface-treated.
At this time, the static water contact angle of the bottom surface was 54.2 °, and the contact angle hysteresis was 50.3 °. The static water contact angle on the upper surface was 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
すなわち、細胞接着抑制剤の種類を異なるものとした場合でも、底面に親水化処理を施すことによって、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止することができた。
As a result, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface did not set off on the upper surface. In this experiment, the hydrophilicity of the bottom surface improved the adhesion between the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor, while the top surface remained hydrophobic, so the cell adhesion inhibitor was set off from the bottom surface to the top surface. It is probable that it did not peel off.
That is, even when the types of the cell adhesion inhibitor were different, it was possible to prevent the cell adhesion inhibitor from settling from the bottom surface to the top surface by applying the hydrophilic treatment to the bottom surface.
（比較例６）
表面処理の条件を実施例４と異なるものとし、その他の条件については、実施例４と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。また、細胞接着抑制剤として、側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール（BIOSURFINE(登録商標)-ＡＷＰ，東洋合成工業株式会社）を使用した。この細胞接着抑制剤を１％の水溶液に調製してバーコーターで底面に塗布した後、波長２５４ｎｍのＵＶを積算光量０．７Ｊ／ｃｍ２で照射して硬化させた。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
(Comparative Example 6)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 4, and the experiments were conducted in the same manner as in Example 4 with respect to other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Further, as a cell adhesion inhibitor, polyvinyl alcohol having an azide group in the side chain (BIOSURFINE (registered trademark) -AWP, Toyo Gosei Co., Ltd.) was used. This cell adhesion inhibitor was prepared in a 1% aqueous solution, applied to the bottom surface with a bar coater, and then irradiated with UV having a wavelength of 254 nm at an integrated light intensity of 0.7 J / cm 2 to cure. Then, no surface treatment was performed on the bottom surface and the top surface.
At this time, the static water contact angles of the bottom surface and the top surface were 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面にわずかに裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。 As a result, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface was slightly set off on the top surface. In this experiment, both the bottom surface and the top surface remained hydrophobic, so it is probable that the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor did not sufficiently adhere to each other, and the cells settled to the top surface and peeled off from the bottom surface.
（実施例５）
実施例１と同じ条件でフィルムに表面処理を行った後、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を１回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
(Example 5)
After surface-treating the film under the same conditions as in Example 1, the static water contact angle and contact angle hysteresis of the bottom surface and the top surface were measured after 7 days at 50 ° C.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, the bottom surface was subjected to a corona treatment once using a batch type corona treatment device as a surface treatment. Further, the upper surface was not surface-treated.
５０℃で７日間経過後、コロナ処理を１回行った底面の静的水接触角は８７．８°であり、接触角ヒステリシスは４３．９°であった。また、表面処理を行わなかった上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
すなわち、底面に表面処理を施したフィルムを５０℃で７日間保管した結果、底面の静的水接触角は、表面処理を行っていない数値に近い、疎水性を示す数値にまで戻っていることが分かる。これに対して、底面の接触角ヒステリシスは、実施例１と比較して大きな変化は見られなかった。
After 7 days at 50 ° C., the static water contact angle of the bottom surface subjected to one corona treatment was 87.8 °, and the contact angle hysteresis was 43.9 °. The static water contact angle of the upper surface without surface treatment was 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
That is, as a result of storing the film with the surface treatment on the bottom surface at 50 ° C. for 7 days, the static water contact angle on the bottom surface has returned to a value indicating hydrophobicity, which is close to the value without surface treatment. I understand. On the other hand, the contact angle hysteresis of the bottom surface did not change significantly as compared with Example 1.
次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。
Next, in the same manner as in Example 1, a cell adhesion inhibitor was applied to the bottom surface to form a film, and then the film of this cell adhesion inhibitor was stained with Coomassie blue and dried.
Then, the upper surface was attached to the bottom surface, a load of 10 g / cm 2 was applied, and the mixture was allowed to stand for 1 minute, and then the upper surface was peeled off from the bottom surface.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。
すなわち、底面の静的水接触角が疎水性を示す数値にまで戻っていたが、底面の接触角ヒステリシスは親水化された数値を示しており、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
As a result, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface did not set off on the upper surface.
That is, the static water contact angle on the bottom surface returned to a value indicating hydrophobicity, but the contact angle hysteresis on the bottom surface showed a hydrophilic value, and the adhesion between the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor. On the other hand, since the upper surface remained hydrophobic, it is considered that the cell adhesion inhibitor did not set off from the bottom surface to the upper surface and did not peel off.
ここで、静的水接触角は、空気と触れている時の最表層の親水性官能基の量と相関のあるものであるため、経時で官能基が樹脂に潜り込んでしまった結果、その数値が疎水性を示す値にまで変化したと考えられる。
これに対して、接触角ヒステリシスは、最表層と少し内側の親水性官能基の量と相関のあるものであるため、経時で官能基が樹脂に潜り込んでも、その数値がほとんど変化しなかったと考えられる。
そして、このように底面の静的水接触角は疎水性の数値を示すものの、底面の接触角ヒステリシスが親水化された数値を示す場合に、底面は親水化されていると言えることが、上記の通り、明らかとなった。
Here, the static water contact angle correlates with the amount of hydrophilic functional groups on the outermost layer when in contact with air, and as a result, the functional groups sneak into the resin over time. Is considered to have changed to a value indicating hydrophobicity.
On the other hand, since the contact angle hysteresis correlates with the amount of hydrophilic functional groups slightly inside the outermost layer, it is considered that the value hardly changed even if the functional groups sank into the resin over time. Be done.
And although the static water contact angle of the bottom surface shows a hydrophobic value in this way, when the contact angle hysteresis of the bottom surface shows a hydrophilic value, it can be said that the bottom surface is hydrophilic. As you can see, it became clear.
（実施例６）
表面処理の条件を実施例５と異なるものとし、その他の条件については、実施例５と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面に対して、表面処理としてバッチ式コロナ処理装置を用いてコロナ処理を３回施した。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。そして、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
(Example 6)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 5, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 5 with respect to other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, the bottom surface was subjected to corona treatment three times using a batch type corona treatment device as a surface treatment. Further, the upper surface was not surface-treated. Then, after 7 days at 50 ° C., the static water contact angle and contact angle hysteresis of the bottom surface and the top surface were measured.
このとき、コロナ処理を３回行った底面の静的水接触角は８５．３°であり、接触角ヒステリシスは４４．５°であった。また、表面処理を行わなかった上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
すなわち、底面に表面処理を施したフィルムを５０℃で７日間保管した結果、底面の静的水接触角は、表面処理を行っていない数値に近い、疎水性を示す数値にまで戻っていることが分かる。これに対して、底面の接触角ヒステリシスには、大きな変化は見られなかった。
At this time, the static water contact angle of the bottom surface subjected to the corona treatment three times was 85.3 °, and the contact angle hysteresis was 44.5 °. The static water contact angle of the upper surface without surface treatment was 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
That is, as a result of storing the film with the surface treatment on the bottom surface at 50 ° C. for 7 days, the static water contact angle on the bottom surface has returned to a value indicating hydrophobicity, which is close to the value without surface treatment. I understand. On the other hand, no significant change was observed in the contact angle hysteresis of the bottom surface.
次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。
Next, in the same manner as in Example 1, a cell adhesion inhibitor was applied to the bottom surface to form a film, and then the film of this cell adhesion inhibitor was stained with Coomassie blue and dried.
Then, the upper surface was attached to the bottom surface, a load of 10 g / cm 2 was applied, and the mixture was allowed to stand for 1 minute, and then the upper surface was peeled off from the bottom surface.
その結果、実施例５と同様に、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。
すなわち、底面の静的水接触角が疎水性を示す数値にまで戻っていたが、底面の接触角ヒステリシスは親水化された数値を示しており、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
As a result, as in Example 5, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface did not set off on the upper surface.
That is, the static water contact angle on the bottom surface returned to a value indicating hydrophobicity, but the contact angle hysteresis on the bottom surface showed a hydrophilic value, and the adhesion between the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor. On the other hand, since the upper surface remained hydrophobic, it is considered that the cell adhesion inhibitor did not set off from the bottom surface to the upper surface and did not peel off.
（比較例７）
表面処理の条件を実施例５と異なるものとし、その他の条件については、実施例５と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、底面及び上面に対して、表面処理を行わなかった。そして、５０℃で７日間経過後に、底面及び上面の静的水接触角と接触角ヒステリシスを測定した。
このとき、底面及び上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
(Comparative Example 7)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 5, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 5 with respect to other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, no surface treatment was performed on the bottom surface and the top surface. Then, after 7 days at 50 ° C., the static water contact angle and contact angle hysteresis of the bottom surface and the top surface were measured.
At this time, the static water contact angles of the bottom surface and the top surface were 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
次に、実施例１と同様に、底面に対して、細胞接着抑制剤を塗布して膜を形成した後、この細胞接着抑制剤の膜をクマシーブルーにて染色して乾燥させた。
そして、この底面に対して上面を貼り付けて、１０ｇ／ｃｍ２の荷重をかけて1分静置した後、上面を底面から剥離した。
Next, in the same manner as in Example 1, a cell adhesion inhibitor was applied to the bottom surface to form a film, and then the film of this cell adhesion inhibitor was stained with Coomassie blue and dried.
Then, the upper surface was attached to the bottom surface, a load of 10 g / cm 2 was applied, and the mixture was allowed to stand for 1 minute, and then the upper surface was peeled off from the bottom surface.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていた。本実験では底面も上面も共に疎水性のままであるため、底面の基材と細胞接着抑制剤が十分に接着せず、上面に裏移りして、底面から剥離してしまったと考えられる。 As a result, the film of the cell adhesion inhibitor formed on the bottom surface was set off on the upper surface. In this experiment, both the bottom surface and the top surface remained hydrophobic, so it is probable that the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor did not sufficiently adhere to each other, and the cells settled to the top surface and peeled off from the bottom surface.
（実施例７）
表面処理の条件を実施例１と異なるものとし、その他の条件については、実施例１と同様にして、実験を行った。
具体的には、フィルムとして、ポリエチレン（ＰＥ）フィルムを使用した。そして、表面処理として、底面に対してエキシマ照射装置（株式会社エム・ディ・コム製）を用いてエキシマ処理を１回施した。このとき、エキシマ処理の条件は１２Ｖ、照射距離４ｍｍ、テーブル移動速度５ｍｍ／ｓｅｃとした。また、上面に対しては、表面処理を行わなかった。
このとき、底面の静的水接触角は７６．２°であり、接触角ヒステリシスは４１．８°であった。また、上面の静的水接触角は９６．７°であり、接触角ヒステリシスは１８．０°であった。
(Example 7)
The conditions of the surface treatment were different from those of Example 1, and the experiments were carried out in the same manner as in Example 1 for other conditions.
Specifically, a polyethylene (PE) film was used as the film. Then, as the surface treatment, the bottom surface was subjected to an excimer treatment once using an excimer irradiation device (manufactured by MD.com Co., Ltd.). At this time, the conditions of the excimer treatment were 12 V, an irradiation distance of 4 mm, and a table moving speed of 5 mm / sec. Further, the upper surface was not surface-treated.
At this time, the static water contact angle of the bottom surface was 76.2 °, and the contact angle hysteresis was 41.8 °. The static water contact angle on the upper surface was 96.7 °, and the contact angle hysteresis was 18.0 °.
その結果、底面に形成された細胞接着抑制剤の膜は、上面に裏移りしていなかった。本実験では底面を親水化したことによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性が向上し、一方で上面は疎水性のままであるため、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離しなかったと考えられる。
すなわち、親水化処理の方法をコロナ処理とは異なるものとした場合でも、底面に親水化処理を施すことによって、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止することができた。
As a result, the cell adhesion inhibitor film formed on the bottom surface did not set off on the upper surface. In this experiment, the hydrophilicity of the bottom surface improved the adhesion between the base material on the bottom surface and the cell adhesion inhibitor, while the top surface remained hydrophobic, so the cell adhesion inhibitor was set off from the bottom surface to the top surface. It is probable that it did not peel off.
That is, even when the method of the hydrophilization treatment was different from that of the corona treatment, it was possible to prevent the cell adhesion inhibitor from settling from the bottom surface to the top surface by performing the hydrophilic treatment on the bottom surface.
以上の通り、培養容器内の底面のみを親水化するか、又は底面を上面よりも強く親水化することによって、底面の基材と細胞接着抑制剤の密着性を上面の基材と細胞接着抑制剤の密着性よりも相対的に向上させることができ、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りせず、剥離を防止できることが明らかとなった。一方、培養容器内の上面を強く親水化すると、細胞接着抑制剤は底面から剥離しやすくなることが明らかとなった。
また、細胞接着抑制剤の種類を異なるものとした場合でも、培養容器内の底面のみを親水化するか、又は底面を上面よりも強く親水化することにより、底面から上面に細胞接着抑制剤が裏移りすることを防止できることが分かった。
As described above, by making only the bottom surface of the culture vessel hydrophilic or making the bottom surface stronger than the top surface, the adhesion between the bottom surface base material and the cell adhesion inhibitor is suppressed by the top surface base material and cell adhesion inhibitor. It was clarified that the adhesion of the agent could be improved relatively, and that the cell adhesion inhibitor did not set off from the bottom surface to the top surface, and peeling could be prevented. On the other hand, it was clarified that when the upper surface in the culture vessel was strongly hydrophilic, the cell adhesion inhibitor was easily peeled off from the bottom surface.
Even if the types of cell adhesion inhibitors are different, the cell adhesion inhibitor can be applied from the bottom surface to the top surface by hydrophilizing only the bottom surface in the culture vessel or by making the bottom surface more hydrophilic than the top surface. It turned out that it was possible to prevent set-off.
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施例では、培養容器の基材としてポリエチレンと環状オレフィンコポリマーを用いたが、ポリオレフィンであればその他の基材を用いても良い。また、表面処理としては、接触角ヒステリシスの値にもとづき親水化が示されるものであれば、コロナ処理などに限定されず、その他の処理を用いることもできる。さらに、培養容器内の上面及び下面に細胞接着抑制剤の膜を形成するなど適宜変更することが可能である。
It goes without saying that the present invention is not limited to the above embodiments, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
For example, in the above example, polyethylene and a cyclic olefin copolymer were used as the base material of the culture vessel, but other base materials may be used as long as they are polyolefins. Further, the surface treatment is not limited to the corona treatment and the like as long as hydrophilicity is shown based on the value of the contact angle hysteresis, and other treatments can be used. Further, it can be appropriately changed such as forming a film of a cell adhesion inhibitor on the upper surface and the lower surface in the culture vessel.
本発明は、ｉＰＳ細胞などをスフェア培養する場合に好適に利用することが可能である。 The present invention can be suitably used when sphere culturing iPS cells and the like.
Claims (7)
対面する第一の側面部と第二の側面部とを備え、
接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きくなるように、少なくとも前記第一の側面部の内面側に表面処理が施されており、かつ、
前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤からなる膜が形成された
ことを特徴とする培養容器。 A culture container made of soft packaging material
It has a first side surface and a second side surface that face each other.
When the contact angle hysteresis is defined as the forward contact angle-backward contact angle at the time of water sliding, the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the first side surface portion is the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the second side surface portion. At least the inner surface side of the first side surface portion is surface-treated so as to be larger than the contact angle hysteresis.
A culture vessel characterized in that a film made of a cell adhesion inhibitor was formed on the inner surface side of the first side surface portion.
ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に親水化処理を施し、
前記フィルム又はシートの親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、
前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する
ことを特徴とする培養容器の製造方法。 A method for manufacturing a culture vessel for sphere culture.
A part of a film or sheet made of polyolefin is hydrophilized and treated.
It is provided with a first side surface portion having a surface of the film or sheet subjected to the hydrophilization treatment on the inner surface side, and a second side surface portion facing the first side surface portion, and has a contact angle hysteresis. When defined as forward contact angle-backward contact angle when water slides down, the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the first side surface portion is higher than the contact angle hysteresis of the inner surface side surface of the second side surface portion. Form the large culture vessel and
A method for producing a culture vessel, which comprises applying a cell adhesion inhibitor to the inner surface side of the first side surface portion.
ポリオレフィンからなるフィルム又はシートの一部に第一の親水化処理を施すと共に、前記フィルム又はシートの他の一部に前記第一の親水化処理よりも親水化力の小さい第二の親水化処理を施し、
前記フィルム又はシートの前記第一の親水化処理が施された面を内面側に備えた第一の側面部と、前記第一の側面部に対面する前記第二の親水化処理が施された面を内面側に備えた第二の側面部とを備え、かつ、接触角ヒステリシスを水滑落時の前進接触角−後退接触角と定義した場合に、前記第一の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスが、前記第二の側面部の内面側の表面の接触角ヒステリシスより大きい前記培養容器を形成し、
前記第一の側面部の内面側に、細胞接着抑制剤を塗布する
ことを特徴とする培養容器の製造方法。
A method for manufacturing a culture vessel for sphere culture.
A part of the film or sheet made of polyolefin is subjected to the first hydrophilization treatment, and the other part of the film or sheet is subjected to the second hydrophilization treatment having a smaller hydrophilicity than the first hydrophilization treatment. And
The first side surface portion of the film or sheet having the first hydrophilized surface on the inner surface side and the second hydrophilization treatment facing the first side surface portion were performed. When a second side surface portion having a surface on the inner surface side is provided and the contact angle hysteresis is defined as forward contact angle-backward contact angle at the time of water sliding, the surface on the inner surface side of the first side surface portion. Forming the culture vessel in which the contact angle hysteresis of the second side surface portion is larger than the contact angle hysteresis of the surface on the inner surface side of the second side surface portion.
A method for producing a culture vessel, which comprises applying a cell adhesion inhibitor to the inner surface side of the first side surface portion.
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