JP6935101B2

JP6935101B2 - 幹細胞を再樹立する方法

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Publication number: JP6935101B2
Application number: JP2018510685A
Authority: JP
Inventors: 遠藤　仁司; 仁司遠藤; 恭光長尾; 豊花園; 薫冨永; 司大森
Original assignee: Jichi Medical University
Current assignee: Jichi Medical University
Priority date: 2016-04-05
Filing date: 2017-04-05
Publication date: 2021-09-15
Anticipated expiration: 2037-04-05
Also published as: WO2017175876A1; JPWO2017175876A1

Description

本発明は、幹細胞を多段階工程により再樹立する方法に関する。

ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）／ＥＳ細胞（胚性幹細胞）から臓器原基または臓器幹細胞を作製・供給することが、ｉＰＳ細胞などを用いた再生医療の発展に必要である。たとえば、ヒトにｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞より再生したヒト臓器／臓器原基を移植するためには、その細胞をブタやヒツジ等の異種の環境で目的臓器形成に誘導するステップが有効と考えられる。しかしながら、臓器原基／臓器幹細胞をインビトロで作製することは困難であるので、特に異種間のキメラ胚を作製し、キメラ胚より臓器原基または臓器幹細胞を採取する必要がある。そのためには異種間にわたって生着性があり、かつキメラ形成能を維持した高品質の幹細胞を臓器形成の出発細胞とする必要がある。

また、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞からクローン動物またはキメラ動物を作製することは、絶滅危惧種などの希少動物、ペットなどの愛玩哺乳動物、有用な商業動物の保存・再生・維持という観点から有用であると考えられる。この場合は、特に異種間で生着性があり、かつキメラ形成能を維持した高品質の幹細胞を出発細胞とする必要がある。

マウスやラットのＥＳ細胞は、一般にナイーブ型の多能性幹細胞として樹立されており、胚盤胞補完法によるキメラ動物の作製について複数の報告例がある。一方、サル、ヒトなどの動物のｉＰＳ／ＥＳ細胞はコロニーが扁平であるプライム型の特徴を有しており、これを異種の胚盤胞に移植してもキメラを形成することができないか、形成できたとしてもごくわずかな寄与率である。

このように、キメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する方法の重要性は、キメラ胚・キメラ動物の作製の成功率を高めるという観点から、よりいっそう増している。

キメラ形成可能なｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を得ることを目的としたこれまでの報告例の多くは、遺伝子導入等の手段でｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を確立するものであった（非特許文献１）。また、環境因子の添加など培地の改良により、質の高いｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を確立する例も報告されている（非特許文献２）。これらの報告例は、キメラ形成可能なｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞を作製する技術ではあるが、作製されたｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞がヘテロな細胞集団であり、キメラ形成能を持たない細胞が混在している可能性を十分否定できるだけの評価がなされていない。これらの技術は、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞のうちの「キメラ形成可能」な細胞の割合を高める技術であるといえる。

ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞は、一般には一定のばらついた分化度の性状を持つ細胞集団から形成されている。例えばＥＳ細胞全体で極めて少ない分画に全能性を持つ細胞が含まれていることが報告されている（非特許文献１３）。

現状では、「キメラ形成可能」という特性を維持した細胞はｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞樹立時に取得した全細胞のうちの一部に過ぎない。臓器形成等の出発細胞を得るためには、キメラ形成能の獲得性維持の観点から、樹立したｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞をさらに選択して再樹立を行い高品質化する必要がある。

長尾ら（特許文献１）は、特定の遺伝子が変異または欠損し、該遺伝子が関与する機能を喪失した多能性細胞、および該多能性細胞以外の他の多能性細胞を含む２種類以上の細胞を動物の宿主胚に注入することを含む、キメラ動物の作製方法を開示している。特許文献１は、当該生殖細胞を形成できないマウス胚から樹立したＥＳ細胞を他のマウスＥＳ細胞、例えば遺伝子を改変したＥＳ細胞と共培養することにより、他のマウスＥＳ細胞の増殖能が改善することができることを見いだしたことを記載している。

しかしながら、キメラ形成可能な高品質なｉＰＳ／ＥＳ細胞の再樹立を可能にする方法については、現時点で報告例がない。

国際公開ＷＯ２００６／００９２７２号パンフレットＰＣＴ／ＪＰ２０１５／０７８６９９

Ｈａｎｎａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０７：９２２２−９２２７（２０１０）Ｇａｆｎｉ，Ｏ．，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，５０４（７４７９）：２８２−２８６（２０１３）Ｂｏｒｏｖｉａｋ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，１６：５１３（２０１４）Ｄａｎ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐ．３：３４９２（２０１３）ＳｕｅｍｏｒｉＨ．，ｅｔａｌ．，ＤｅｖＤｙｎ．，２２２（２）：２７３−９（２００１）ＴａｋａｄａＴ．，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１１（７）：６３１−５（２００２）ＢａｎＨ．，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳ，１０８（３４）：１４２３４−１４２３９（２０１１）ＣｈａｎＹ．，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，１３：６６３−６７５（２０１３）ＶａｌａｍｅｈｒＢ．，ｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，２：３６６−３８１（２０１４）ＷａｒｅＣ．，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳ，１１１（１２）：４４８４−４４８９（２０１４）ＴｈｅｕｎｉｓｓｅｎＴ．，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，１５：１−１７（２０１４）ＴａｋａｓｈｉｍａＹ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５８：１２５４−１２６９（２０１４）Ｍａｃｆａｒｌａｎ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８７（７４０５）：５７−６３（２０１２）

ヒト等の霊長類にｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞より産生したヒト臓器／臓器原器を移植するためには、その霊長類の細胞をブタ、ヒツジ等の異種の環境で目的臓器形成に誘導するステップが有効である。そのためには、異種間で生着性があり、かつキメラ形成能を維持した高品質の幹細胞を臓器形成の出発材料とする必要がある。

本発明は、幹細胞を再樹立する方法、再樹立された幹細胞、再樹立された幹細胞の利用に関する。

限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。

［態様１］
キメラ形成能を有する幹細胞を多段階工程により再樹立する方法であって、
第一種の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第一の幹細胞とは培養条件の異なる第二種の細胞の宿主胚と共培養する工程を含む再樹立工程を少なくとも２回行い、ここにおいて、第一種の幹細胞を第二種の細胞の宿主胚と共培養する工程において、培養培地は第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地を用いることを含み、そして、
キメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、再樹立されたキメラ形成能を有する幹細胞は、第二種の細胞に適した培養培地、第一種の幹細胞に適した培養培地、あるいは、第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、
ことを含む、前記方法。

［態様２］
異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を、多段階工程により再樹立する方法であって、
第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程を含む再樹立工程を少なくとも２回行い、ここにおいて、第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含み、そして、
異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、再樹立された異種間でキメラ形成能を有する幹細胞は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、
ことを含む、前記方法。

［態様３］
以下の工程：
（ｉ−ａ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養して細胞群を得る、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地である；若しくは
（ｉ−ｂ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）得られた内部細胞塊を培養する、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地である；
（ｖ）工程（ｉｖ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む；
（ｖｉ）工程（ｖ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；
（ｖｉｉ）工程（ｖｉｉ）で得られた内部細胞塊を培養し、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、培養培地は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれであってもよい；
を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種である、
態様２に記載の方法。

［態様４］
工程（ｉｉ）及び／又は工程（ｖ）の第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養工程において、混合培地中での共培養後、培地を第一の哺乳類の種に適した培養培地に変更してさらに共培養を行う、ことを含む、態様３に記載の方法。

［態様５］
さらに、工程（ｖｉｉ）で再樹立した幹細胞について、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）を繰り返すことを含む、態様３又は４に記載の方法。

［態様６］
第一の哺乳類の種が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル及びヒトからなる群より選択される、態様２−５のいずれか１項に記載の方法。

［態様７］
第一の哺乳類の種が、霊長目に属する種である、態様２−５のいずれか１項に記載の方法。

［態様８］
第二の哺乳類の種が、マウス、ラット、ウサギ及びブタからなる群より選択される、態様２−７のいずれか１項に記載の方法。

［態様９］
第一の哺乳類の種がサルであり、第二の哺乳類の種がマウスである、態様２−８のいずれか１項に記載の方法。

［態様１０］
多能性幹細胞が、以下：ＥＳ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、及び生殖細胞（ＥＧ細胞）からなる群より選択され、そして、複能性幹細胞が以下：栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉系幹細胞、からなる群より選択される、態様２−９のいずれか１項に記載の方法。

［態様１１］
第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、態様２−１０のいずれか１項に記載の方法。

［態様１２］
高品質な多能性幹細胞が、ナイーブ型の多能性幹細胞である、態様３−１１のいずれか１項に記載の方法。

［態様１３］
宿主胚が、受精卵由来胚又は人工操作胚からなる群より選択される、態様１−１２のいずれか１項に記載の方法。

［態様１４］
工程（ｉｉ）、工程（ｖ）が、各々工程（ｉ）、工程（ｉｖ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の受精卵由来胚または４倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う、態様２−１３のいずれか１項に記載の方法。

［態様１５］
第一の哺乳類の種に適した培養培地が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含むことを特徴とする、態様２−１４のいずれか１項に記載の方法。

［態様１６］
第二の哺乳類の種に適した培養培地が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含まないことを特徴とする、態様２−１５のいずれか１項に記載の方法。

［態様１７］
第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞ではなく、そして第二の哺乳類の種はヒトではない、態様２ないし１６のいずれか１項に記載の方法。

［態様１８］
多能性幹細胞もしくは複能性幹細胞から再樹立した、霊長目の動物の幹細胞であって、以下：
・均一化されている；
・キメラ形成可能である；
・細胞集合体を形成可能である；および
・内部細胞塊のニッチ環境に親和性が高い；
からなる群より選択される特徴の１以上を有する、前記細胞。

［態様１９］
態様１ないし１７に記載の方法により再樹立した、態様１８に記載の細胞。

［態様２０］
以下：
・第二種の哺乳類の種に適した培地で培養可能である；および
・第二の哺乳類の種由来の宿主胚に同調しやすい
からなる群より選択される特徴の１以上を有する、態様１９に記載の細胞。

［態様２１］
細胞を用いた薬効評価または病態解析を行う方法であって、以下：
（ｉ）細胞を得る工程：ここで当該細胞は、（Ａ）態様１ないし１７のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞であるか、（Ｂ）態様１ないし１７のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞であり、ここで当該体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの方法により得られるものである：
（ａ）態様１ないし１７のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、そして当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
（ｂ）（ａ）で得られたキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る；
（ｃ）態様１ないし１７のいずれか１項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う工程；
を含む、前記方法。

本発明の多段階再樹立法により、キメラ形成能を有する高品質な幹細胞を効率良く取得することが可能になった。本発明は特に、異種間でキメラ形成可能な高品質な幹細胞を効率良く取得することを可能にするものである。本発明の方法は、培養条件が異なる同種間の異なる幹細胞においても、広く適用可能である。

［図１］図１は、本発明の多段階再樹立法の一態様の模式図を示す。サルＥＳ細胞の再樹立の過程で、段階的に適宜培地を変更する。特に宿主胚における胚培養液を至適化する。
［図２］図２は、多段階再樹立の前後のサルＥＳ細胞の顕微鏡写真図である。サル用ＥＳ培地で継代培養したサルＥＳ細胞を、Ｘ１０倍またはＸ２０倍の対物レンズを用いて蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒＤ１ｓｙｓｔｅｍ，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で観察した。二段階再樹立後のＥＳ細胞は、緑色蛍光を示し、良好な形状と大きさのコロニーを形成した。
上段：透過像
中段：ＧＦＰ蛍光像
下段：重ね合わせ像
［図３］図３は、多段階再樹立されたサルＥＳ細胞をさらにマウス用培地で継代培養し、マウス用培地への適応を調べた結果である。サル用ＥＳ培地を用いて培養した二段階再樹立後のサルＥＳ細胞を、マウス用ＥＳ培地にて５代継代培養した。得られた細胞を蛍光顕微鏡にて観察したところ、良好な形状と大きさのコロニーの形態を維持していた。
上段：透過像
中段：ＧＦＰ蛍光像
下段：重ね合わせ像
［図４］図４は、サルＥＳ細胞の細胞移植により形成されたテラトーマのＨＥ染色組織像を調べた結果である。多段階再樹立後のサルＥＳ細胞を、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの睾丸に移植したところ、テラトーマが形成された。これを固定後ＨＥ染色したのち顕微鏡にて観察した像を示す。
Ａ．偽重層円柱上皮または単層円柱上皮で内張された管腔構造からなる上皮組織（内胚葉）（矢頭）がみられ、その周囲にはコラーゲンを産生する繊維性結合組織（中胚葉）（＊）が存在する。
Ｂ．ロゼット構造を呈する神経上皮組織（外胚葉）（矢印）と神経膠細胞（外胚葉）（＊）が見られる。
Ｃ．主に単層円柱上皮で内張された管腔構造からなる上皮組織（内胚葉）（矢頭）がみられ、その周囲には筋組織（中胚葉）（＊）が存在する。
Ｄ．ロゼット構造を呈する神経上皮組織（外胚葉）（矢印）が存在している。黒褐色のメラニン色素を有する神経上皮組織（外胚葉）（二重矢印）が認められる。
［図５］図５は、テラトーマの由来が多段階再樹立されたサルＥＳ細胞であることを確認するために、テラトーマ組織からＤＮＡを抽出し、サルＥＳ細胞由来であるｎｅｏ耐性遺伝子およびサル由来遺伝子であるβ２マイクログロブリン（β２ＭＧ）の存在をＰＣＲにて検出した結果である。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果、テラトーマ由来ＤＮＡに、３４０ｂｐ長のｎｅｏ耐性遺伝子のＰＣＲ産物（左図）、および１３３ｂｐ長のサルβ２ＭＧ遺伝子のＰＣＲ産物（右図）を検出した。
［図６］図６は、サルＥＳ細胞の再樹立前および再樹立後の各細胞における遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリングの結果を示した図である。
［図７Ａ］図７Ａは、再樹立前後における山中４因子の内因性遺伝子及びＮＡＮＯＧの遺伝子発現レベルを示した図である。図７Ａは各遺伝子のＦＰＫＭ値を示したものである。
［図７Ｂ］図７Ｂは、再樹立前後における山中４因子の内因性遺伝子及びＮＡＮＯＧの遺伝子発現レベルを示した図である。図７Ｂは、再樹立前後の遺伝子発現量の変化をｌｏｇ_２値で示したものである。
［図７Ｃ］図７Ｃは、再樹立前後における山中４因子の内因性遺伝子及びＮＡＮＯＧの遺伝子発現レベルを示した図である。図７Ｃは、それぞれのＦＰＫＭ値、ｌｏｇ_２値および有意の有無をまとめたものである。
［図８］図８は、ナイーブ型多能性（ｎａｉｖｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、コア型多能性（ｃｏｒｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、プライム型多能性（ｐｒｉｍｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、中胚葉／原始線条（Ｍｅｓｏｄｅｒｍ／ｐｒｉｍｉｔｉｖｅｓｔｅａｋ）の各特性に関する遺伝子の発現についてサルＥＳ細胞の再樹立の前後で比較した図である。上段：各遺伝子のＦＰＫＭ値；下段：再樹立前後の遺伝子発現量の変化のｌｏｇ_２値。

以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

なお、本出願人、本発明者の先願であるＰＣＴ／ＪＰ２０１５／０７８６９９（２０１５年１０月２日出願）に記載の内容は、適宜本明細書に援用される。

＜定義＞
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。

本明細書において、「幹細胞」とは、自己複製能と分化能を有する細胞である。ここで、自己複製能とは自分と同じ能力を持った細胞を複製する能力をいい、分化能とは異なる機能を持つ複数の細胞に分化する能力をいう。

本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」とは、幹細胞であって、個体を形成するすべての細胞種へ分化可能な能力を有する細胞である。多能性幹細胞には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）等が含まれる。

本明細書において「複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」とは、幹細胞であって、複数の細胞種へ分化し得る能力を有する細胞である。複能性幹細胞には、栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および、間葉系幹細胞、などが含まれる。

本明細書において「多能性幹細胞等」と記載する場合、当該表現は多能性幹細胞および複能性幹細胞を含むものと理解される。

キメラ胚／キメラ動物の作製は、多能性幹細胞等をホスト（別の個体）の受精卵由来胚又は発生工学的に作製した人工操作胚（４倍体胚など）等に移植し、発生させることにより行われる。キメラ胚は、移植された多能性幹細胞等が、生じるホストの胚体の全部または一部より作製される。キメラ動物は、移植された多能性幹細胞等が、生まれてくる個体の一部となることにより作製される。

本明細書において、幹細胞が「キメラ形成能を有する」または「キメラ形成可能である」とは、幹細胞がホストの受精卵由来胚および発生工学的に作製した人工操作胚等に移植された場合に、生じるホストの胚体の全部もしくは一部、または生まれてくる個体中の様々な臓器の一部となる能力を、当該幹細胞が有することを意味する。あるいは、本明細書において幹細胞が「キメラ形成能を有する」または「キメラ形成可能である」という用語は、幹細胞がホストの受精卵由来胚又は人工操作胚等に移植された場合に、移植された多能性幹細胞等が内部細胞塊（ＩＣＭ）の一部を構成する能力、すなわちＩＣＭに寄与する能力を、当該幹細胞が有することを意味する用語としても用いられる。しかし幹細胞、胚の発生時期、移植場所および寄与する場所を限定するものではない。また、上記説明からも理解される通り、「キメラ形成能」とは、キメラの「個体」を形成する能力のみを限定的に意味するものではない。
ここで、当該移植される幹細胞が由来する種とホストの種が異種である場合、特に「異種間でキメラ形成可能である」という。

本明細書において「異種」または「異なる種である」とは、動物種が異なることをいう。特に言及しなければ、「異種」または「異なる種である」とは、属レベル以上で動物種が異なることをいう。

本明細書において「同種」とは、同じ動物種に属することを意味する。特に言及しなければ、「同種」の範囲には、種のレベルで同じ動物種に属するもののみならず、属のレベルで同じ動物種に属する「同属異種」も含まれる。

本明細書において、多能性幹細胞等が「高品質」であるとは、当該多能性幹細胞等が「ナイーブ型」であることを意味する。多能性幹細胞等が「ナイーブ型」であるとは、多能性幹細胞等が、ドーム型のコロニーを形成する、キメラ形成能を有する、および、***・卵子などの生殖細胞系列に分化可能である、からなる群より選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは３つすべての性質を有することを意味する。

本明細書において「宿主胚」とは、キメラ胚／キメラ動物を作製する際に、多能性幹細胞を移植する、ホストとなる動物の胚を意味する。

＜幹細胞を多段階工程により再樹立する方法＞
本発明は、キメラ形成能を有する幹細胞を多段階工程により再樹立する方法を提供する。

第一種の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第一の幹細胞とは培養条件の異なる第二種の細胞の宿主胚と共培養する工程を含む再樹立工程を少なくとも２回行い、ここにおいて、第一種の幹細胞を第二種の細胞の宿主胚と共培養する工程において、培養培地は第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地を用いることを含み、そして、
キメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、再樹立されたキメラ形成能を有する幹細胞は、第二種の細胞に適した培養培地、第一種の幹細胞に適した培養培地、あるいは、第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、
ことを含む。

本発明の方法では、第二種の宿主胚との共培養を含む再樹立工程を少なくとも２回行うが、再樹立工程に用いる培地を、第一種の幹細胞に適した培養培地から第二の細胞に適した培養培地へと多段階的に培地組成を変更していくことを特徴とする。第一種の幹細胞を第二種の細胞の宿主胚と共培養する工程の少なくとも一時期において、培養培地は、第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地を用いる。用いる混合培地は、再樹立の段階に応じて適宜至適化される。得られた再樹立細胞は、キメラ形成能を有し、そして、第二種の細胞に適した培養培地、第一種の幹細胞に適した培養培地、あるいは、第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、という特徴を有する。好ましくは、第二種の細胞に適した培養培地が用いられる。

本発明において、第一種の細胞と第二種の細胞とは、細胞の培養条件が実質的に相違する。例えば、第一種の細胞と第二種の細胞の由来する種が異なる「異種」である場合が含まれる。

同種であっても、例えば、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）等、「複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」の栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞、および、間葉系幹細胞等は、各細胞の種類に応じて培養条件が異なる。例えば、特に、ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞、ＥＧ細胞、ＴＳ細胞、ＥｐｉＳ細胞、ｍＧＳ細胞は、培養条件が異なる。このような場合も本発明を提供可能である。

以下、本明細書において、第一種の細胞と第二種の細胞の由来する動物の種が異なる「異種」である場合を、第一種の細胞と第二種の細胞の例として説明する。

本発明は、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を多段階工程により再樹立する方法を提供する。

本発明の方法は、
第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程を含む再樹立工程を少なくとも２回行い、ここにおいて、第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含み、そして、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、再樹立された異種間でキメラ形成能を有する幹細胞は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、
ことを含む。

本発明の方法では、第二種の宿主胚との共培養を含む再樹立工程を少なくとも２回行うが、再樹立工程に用いる培地を、第一の哺乳類の種に適した培養培地から第二の哺乳類の種に適した培養培地へと多段階的に培地組成を変更していくことを特徴とする。第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程の少なくとも一時期において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いる。用いる混合培地は、再樹立の段階に応じて適宜至適化される。得られた再樹立細胞は、異種間でキメラ形成能を有し、そして、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれの培養培地でも培養可能である、という特徴を有する。好ましくは、第二の哺乳類の種に適した培養培地が用いられる。

本発明の方法の工程
非限定的に、本発明の方法は、一態様において以下の工程を含む。
（ｉ−ａ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養して細胞群を得る、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地である；若しくは
（ｉ−ｂ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）得られた内部細胞塊を培養する、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地である；
（ｖ）工程（ｉｖ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む；
（ｖｉ）工程（ｖ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；
（ｖｉｉ）工程（ｖｉｉ）で得られた内部細胞塊を培養し、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、培養培地は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれであってもよい；
を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種である。

工程（ｉ）において、第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞と第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞とを含む、細胞群を得る。
（ｉ−ａ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養して細胞群を得る、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地である；若しくは
（ｉ−ｂ）第一の哺乳類の種由来の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る。

好ましくは、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養する（工程（ｉ−ａ））。工程（ｉ−ｂ）は、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて、特に共培養をすることなく、そのまま工程（ｉｉ）の宿主胚との共培養に供する態様である。

本発明の方法において、哺乳動物の種類は特に限定されない。好ましくは、第一の哺乳類の種は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル及びヒトからなる群より選択される。好ましくは、サル又はヒトである。あるいは、好ましくは、第一の哺乳類の種は、霊長目に属する種である。

「霊長目」は、哺乳綱に含まれる目でサル目とも呼ばれ、キツネザル下目、ロリス下目を含む曲鼻猿亜目（原猿類）と、それ以外の直鼻猿亜目（真猿類）に分かれる。直鼻猿亜目（真猿類）は、ヒト科、オラウータン科、テナガザル科、オナガザル科、マーモセット科、オマキザル科、メガネザル科等を含む、霊長目（サル目）には、約２２０種が含まれる。生物学的にはヒトは霊長目（サル目）の１種であるが、一般的にサル目からヒトを除いた総称を「サル」と呼称する。本明細書においても同様である。

本発明においては、再樹立工程に用いる培地を、第一の哺乳類の種に適した培養培地から第二の哺乳類の種に適した培養培地へと多段階的に培地組成を変更していくことを特徴とする。よって、第二の哺乳類の種は、その培養培地が第一の哺乳類の種に適した培養培地とは実質的に異なるものであることが望ましい。非限定的には、第二の哺乳類の種は、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ及びブタからなる群より選択される。

より好ましくは、第一の哺乳類の種がサルであり、第二の哺乳類の種がマウスである。

好ましくは、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞ではなく、そして第二の哺乳類の種はヒトではない。

「多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、クローン胚由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、及び生殖細胞（ＥＧ細胞）からなる群より選択される。そして「複能性幹細胞」は、栄養芽幹細胞（ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、および、造血幹細胞、神経幹細胞、および、間葉系幹細胞、からなる群より選択される。好ましい態様において、第一の哺乳類の種由来の「多能性幹細胞または複能性幹細胞」は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。

第二の哺乳類の種由来の「高品質な多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、あるいはこれらの細胞の内部細胞塊を含む。「高品質な多能性幹細胞」は、好ましくはＥＳ細胞である。高品質な多能性幹細胞は、好ましくは、ナイーブ型の多能性幹細胞である。

工程（ｉ）において、細胞群を得た後に、工程（ｉｉ）の宿主胚との共培養の前に、得られた細胞群から、細胞集合体を形成し、かつ、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する、ことを行っても良い。この工程はすなわち、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞とともにコロニー形成（特にナイーブコロニー形成）する第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞を含む細胞群を選別する工程である。このように、幹細胞が、ＥＳ細胞とともにコロニー形成する場合、当該幹細胞について「コロニー形成に寄与する幹細胞」と表現することがある。第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞とともにコロニー形成（特にナイーブコロニー形成）する第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞等に由来する幹細胞を含む細胞群の選別は、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞等を選別前に適切な選抜マーカーで標識しておき、当該選抜マーカーを含むコロニーを選別することにより行うことができる。あるいは、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞を適切な選抜マーカーで標識しておき、当該選抜マーカーを含まないコロニーを第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞等を含む細胞群として識別することもできる。適切な選抜マーカーの例として、クサビラオレンジ（ｈｕＫＯ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｃｌｏｖｅｒ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、等が挙げられる。識別は、蛍光、発光、染色等による識別、または、薬剤耐性遺伝子等による薬剤選択により行うことができる。

次いで、上記の方法の工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する。工程（ｉｉ）の細胞群と第二の哺乳類の種由来の宿主胚との共培養により、キメラ胚が作製される。そして、工程（ｉｉ）の共培養では、内部細胞塊（ＩＣＭ）が得られる初期胚盤胞の段階までキメラ胚を培養する。本発明において、第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程の全部又は一部において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む。

好ましい態様において、当該工程の共培養は、工程（ｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う。マイクロインジェクションは、宿主胚に細胞（幹細胞など）を移植することによりキメラ胚を作製する方法である。アグリゲーションは、宿主胚として桑実胚期までの初期胚を用い、これに幹細胞等を接触・集合させてキメラ胚を作製する方法である。より好ましくは、工程（ｉｉ）の共培養は、工程（ｉｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚にマイクロインジェクションして共培養することにより行う。

宿主胚は、特に限定されるものではない。受精卵由来胚、４倍体胚（テトラプロイド胚）などの人工操作胚等が含まれる。好ましい態様において、宿主胚は、受精卵由来胚または４倍体胚の初期胚である。

初期胚は、２細胞期胚から胚盤胞期胚までの胚を意味する。

４倍体胚は、野生型の２細胞期の割球を電気的に融合させて作製した胚である。４倍体胚を用いて多能性幹細胞と共培養することによりキメラ胚を作製すると、４倍体細胞は胚体自体には寄与できないが、胎盤などの胚体外組織には寄与できるという性質があるため、得られる胚体または個体は前記の多能性幹細胞にほぼ１００％由来するものとなる。

好ましくは、上記の方法の工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の受精卵由来胚または４倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行われる。さらに好ましくは、上記の方法の工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の受精卵由来胚または４倍体胚にマイクロインジェクションして共培養することにより行われる。

次いで、工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する。内部細胞塊の分離は、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。好ましくは、内部細胞塊の分離は、顕微鏡手術法または免疫手術法にて行う。胚の状態を観察しながら内部細胞塊を取り出すには顕微鏡手術法が優れている。一方、免疫手術（Ｓｏｌｔｅｒ，Ｄ．ａｎｄＫｎｏｗｌｅｓｓ，Ｂ．Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２（１２）：５０９９−５１０２（１９７５））は、顕微鏡手術法よりも機械的損傷が少なく、胚盤胞の内部細胞塊を単離するのに優れている。どちらを用いてもよい。

工程（ｉｖ）−（ｖｉ）において、工程（ｉ）（具体的には工程（ｉ−ａ））−工程（ｉｉｉ）の再樹立工程を繰り返し、２回目の再樹立工程を行う。

本発明の方法では、第二種の宿主胚との共培養を含む再樹立工程を少なくとも２回行うが、再樹立工程に用いる培地を、第一の哺乳類の種に適した培養培地から第二の哺乳類の種に適した培養培地へと多段階的に培地組成を変更していくことを特徴とする。用いる混合培地は、再樹立の段階に応じて適宜至適化される。

最終的に、工程（ｖｉｉ）において、工程（ｖｉｉ）で得られた内部細胞塊を培養し、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞が再樹立される。ここにおいて、培養培地は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれであってもよい。好ましくは、第二の哺乳類の種に適した培養培地である。

さらに、工程（ｖｉｉ）で再樹立した幹細胞について、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）を繰り返してもよい。

工程（ｉｉｉ）、工程（ｖｉ）で宿主胚から分離された内部細胞塊について、工程（ｉｖ）、工程（ｖｉｉ）の培養を行うに際し、工程（ｖｉ）で得た内部細胞塊から第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞をクローニングすることを行っても良い。

内部細胞塊からの多能性幹細胞等のクローニングは当業者に公知の手法を用いて行うことができる。クローニングした細胞が、第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞に由来する幹細胞であることは、例えば、工程（ｉｉ）の前に適切な選抜マーカーで標識しておくことで識別可能である。あるいは、工程（ｉｉ）を行う前に宿主胚を適切な選抜マーカーで標識しておき、当該選抜マーカーを含まない細胞を第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞として識別し、クローニングすることもできる。適切な選抜マーカーの例として、クサビラオレンジ（ｈｕＫＯ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｃｌｏｖｅｒ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ＤＴ−Ａ遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、等が挙げられる。識別は、蛍光、発光、染色等による識別、または、薬剤耐性遺伝子等による薬剤選択により行うことができる。

例えば、クサビラオレンジ（ｈｕＫＯ）で標識された多能性幹細胞等をクローニングする場合は、以下のようにして行うことができる。胚盤胞を顕微鏡下で胚盤胞ごと除去するか、顕微鏡手術でその部分を取り除く。あるいは顕微鏡手術または免疫手術で内部細胞塊だけを取り出し、４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養する。播種後増殖してきた内部細胞塊から良好な形態をし、蛍光顕微鏡にて赤色蛍光を有することを確認したモザイク状態のものだけを、増殖能と形態を指標に目視で選別しピックアップする。また、栄養膜様細胞、上皮様細胞、内胚葉様細胞等の形態を示すコロニーおよび細胞は取り除く。トリプシン処理して細胞塊を分散し、いくつかの新たな細胞塊に分解後、新しく準備したフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養する。播種後、さらに新しく形成されたコロニーから、蛍光顕微鏡にて赤色蛍光を有することを確認して状態の良いコロニー選抜をする。次に分散させるときはさらに少数の細胞数の細胞塊にまで分散させ、何度か工程を繰り返し多能性細胞だけのコロニーとする。

工程（ｉｖ）の２段階目の再樹立を行う際は、工程（ｉ）と同様に、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞を加えても良いが、加えなくても良い。工程（ｉ）−（ｉｉｉ）の１段階目の再樹立を経て、マウスＩＣＭから一緒にマウスＥＳ細胞が樹立され、既に共培養の状態になっているからである。

培養培地
本発明の方法では、第二種の宿主胚との共培養を含む再樹立工程を少なくとも２回行うが、再樹立工程に用いる培地を、第一の哺乳類の種に適した培養培地から第二の哺乳類の種に適した培養培地へと多段階的に培地組成を変更していくことを特徴とする。第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程の少なくとも一時期において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いる。用いる混合培地は、再樹立の段階に応じて適宜至適化される。

再樹立の開始段階、即ち工程（ｉ）の段階ではドナー種である第一の哺乳類の種由来のナイーブ型の多能性幹細胞または複能性幹細胞の培養に適した条件、特に、第一の哺乳類の種に適した培養培地を用いる。

当業者は、ドナー種である第一の哺乳類の種に応じて適宜適した培地を適用可能である。例えば、第一の哺乳類の種がヒトの場合、非限定的にリプロセル社（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ社）よる販売されている霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地、ＲＣＨＥＭＤ００１、ＲＣＨＥＭＤ００１Ａ、ＲＣＨＥＭＤ００１Ｂ等を使用することが可能である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｈｅｓ−ｉｐｓｃ／ｍｅｄｉｕｍ）。ヒト用培養培地は例えば、ｂＦＧＦを含む。

例えば、第一の哺乳類の種がサルの場合、非限定的に、例えば、前記リプロセル社（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ社）よる販売されている霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地に、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴｅＳＲ２（ＳＴ−０５８６０，ＳＴ−０５８８０）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｒｉｔａｓｔｋ．ｃｏ．ｊｐ／ｎｅｗｓ．ｐｈｐ？ｉｄ＝４４６）を加えたものを用いることができる。ＴｅＳＲ２（ＳＴ−０５８６０，ＳＴ−０５８８０）は、フィーダー細胞フリー、非ヒト由来成分フリー、毒劇物フリーという特徴を有する、ヒトを含む霊長類用のＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地である。

サル用培地とヒト用培地は特に区別されず、いずれかに使用可能な培地は他方にも使用可能である。サル用培地とヒト用培地は、ｂＦＧＦやＴＧＦβを添加する場合、またＢＭＰｉ，ＲＯＣＫｉ，ＢＲＡＦｉ，ＳＲＣｉ，アクチビン等を適宜添加する場合がある。例えば、以下の組成の培地を第一の哺乳類の種がサル又はヒトの場合に使用可能である。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
Ｎ２ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ社）
ＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）ＭＥＫ１／２阻害剤
ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）ＧＳＫ３阻害剤
フォルスコリン（Ｓｉｇｍａ社）ＡＣ（アデニル酸シクラーゼ）活性化剤
ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ社）
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤
Ｇｏ６９８３（Ｓｉｇｍａ社）ＰＫＣ阻害剤

その他、例えばヒト又はサルのｉＰＳ細胞の培養培地としては、例えば以下の表１のものを用いることが可能である。

当業者は、ドナー種である第二の哺乳類の種に応じて適宜適した培地を適用可能である。例えば、第二種の哺乳類がマウスＥＳ細胞、ナイーブ型ブタｉＰＳ細胞の場合、以下の組成の培養液を用いることができる。

マウスＥＳ細胞の培養組成の例：
８０％（ｖ／ｖ）Ｄ−ＭＥＭ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸溶液、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０^３Ｕ／ｍＬｍＬＩＦ（Ｗａｋｏ）または１ｘｒｈＬＩＦ（Ｗａｋｏ）を含む培養液
ナイーブ型ブタｉＰＳ細胞の培地組成の例：
８２％（ｖ／ｖ）Ｄ−ＭＥＭ、１５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ−Ｉ（ＧＩＢＣＯ）、１ｘｒｈＬＩＦ（Ｗａｋｏ）、１０μＭＦｏｒｓｋｏｌｉｎを含む培養液

最終的に臓器／臓器原器形成を目的とするドナー種である第一の哺乳類の種（例えば、ヒト、サル等の霊長目）に適した培養培地は、宿主胚を提供する第二の哺乳類の種（ブタ、マウス等）に適した培養培地と比較して、成分が多く組成が複雑である。第一の哺乳類の種に適した培養培地の組成の例と第二の哺乳類の種に適した培養培地の例の組成の例を比較した。

表１、表２に示された通り、一態様において、第一の哺乳類の種に適した培養培地は、好ましくは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びサイクリン依存性ナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含む。一方、一態様において、第二の哺乳類の種に適した培養培地は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含まない。

再樹立工程に用いる培地を、第一の哺乳類の種に適した培養培地から第二の哺乳類の種に適した培養培地へと多段階的に培地組成を変更していく。第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程の少なくとも一時期において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いる。宿主胚と共培養には、一義的には、宿主胚が由来する第二の哺乳類の種の培養に適した培養培地を用いた培養が必要と考えられる。しかしながら、第二の哺乳類の種の培養に適した培養培地のみでは、第一の哺乳類の種由来の幹細胞が効率良く共培養されにくい。そこで、本発明においては、第二の哺乳類の種に適した培養培地に第一の哺乳類の種に適した培養培地を適宜加えた混合培地を使用（胚培養液の至適化）することを特徴とする。混合培地の使用により、第二の哺乳類の種由来の宿主胚における共培養において、第一の哺乳類由来の幹細胞を含む細胞塊が効率良く形成され、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞の再樹立が可能となる。

１回目の再樹立において初めて第二の哺乳類の種由来の宿主胚における共培養を行う工程（工程（ｉｉ））において、第一の哺乳類の種に適した培養培地を第二の哺乳類の種に適した培養培地に対し、非限定的に、好ましくは約１０／１−１／１０の範囲で、より好ましくは約２／１−１／２の範囲で加える。

２回目の再樹立において第二の哺乳類の種由来の宿主胚における共培養を行う工程（工程（ｖ））において、第一の哺乳類の種に適した培養培地を加える割合をさらに増加させることが可能であり、第一の哺乳類の種に適した培養培地を第二の哺乳類の種に適した培養培地に対し、非限定的に、好ましくは約１００：１−１：１００の範囲で、より好ましくは約１０：１−１：１０の範囲で加えたものを使用可能である。

培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地は、血清または代用血清の有無、各種阻害剤の有無、各種増殖因子の有無、その他の微量成分の有無等により適宜調製されうる。

工程（ｉｉ）及び／又は工程（ｖ）の第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養工程において、混合培地中での共培養後、培地を第一の哺乳類の種に適した培養培地に変更してさらに共培養を行ってもよい。

工程（ｉｉｉ）において、宿主胚から分離された内部細胞塊を培養する（工程（ｉｖ））。工程（ｉｖ）における培養培地は、工程（ｉ）と異なり、第一の哺乳類の種に適した培養培地ではなく、第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を使用可能となる。この場合、第一の哺乳類の種に適した培養培地を第二の哺乳類の種に適した培養培地に対し、非限定的に、好ましくは約１：３−３：１の範囲で、より好ましくは約１：２−２：１の範囲で加えたものを使用可能である。

２回目の再樹立時、再樹立後（工程（ｖｉｉ））における培養培地は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれであってもよい。好ましくは、第二の哺乳類の種に適した培養培地である。即ち、本発明の方法により再樹立された幹細胞は、レシピエントの培養条件に馴化可能である。混合培地における第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の比率も適宜選択可能である。

＜多能性幹細胞もしくは複能性幹細胞から再樹立した幹細胞＞
本発明は、多能性幹細胞もしくは複能性幹細胞から再樹立した、霊長目の動物の幹細胞も提供する。本発明の幹細胞は、以下：
・均一化されている；
・キメラ形成可能、特に異種間でキメラ形成可能である；
・細胞集合体を形成可能である；および
・内部細胞塊のニッチ環境に親和性が高い；
からなる群より選択される特徴の１以上を有する。好ましくは、上記性質の２以上、３以上、全部を有する。

「均一化されている」とは、元々の細胞群が、より未分化な状態から比較的分化が進行した状態までの複数の性質を有する細胞が混在していた細胞群から、再樹立などにより、より性質の近似な細胞からなる細胞群へ変更された、ということを意味する。

「キメラ形成可能」、「異種間でキメラ形成可能」とは、＜定義＞の項目において記載した通りである。

「細胞集合体を形成可能である」とは、異なる細胞群の共培養という条件下で培養した場合に、細胞集合体を形成出来る能力を有する、または細胞同士が接着する、または細胞同士が同所に存在することが可能である、ということを意味する。

「内部細胞塊のニッチ環境に親和性が高い」とは、内部細胞塊のニッチな環境、即ち、周辺近辺の状況に幹細胞が合わせて生存する能力が高いことを意味する。

本発明の実施例において、再樹立された幹細胞のコロニー形状はきれいでかつ大きなドーム状を示し、テラトーマ形成実験にて三葉分化を示す多様性が確認された。さらに、テラトーマの由来をＰＣＲで確認したところ、サルＥＳ細胞（第一の哺乳類ＥＳ細胞）に導入されたマーカー遺伝子の存在が確認された。

本発明の幹細胞は、さらに、以下：
・第二種の哺乳類の種に適した培地で培養可能である；および
・第二の哺乳類の種由来の宿主胚に同調しやすい
からなる群より選択される特徴の１以上を有する。好ましくは、上記２つの条件の双方を意味する。

「第二種の哺乳類の種に適した培地で培養可能である」とは、非限定的に、例えば、第二種の哺乳類の種に適した培地で培養した場合に、５回の継代以上生存可能である、例えばテラトーマ実験により確認されるように多能性を維持している、ドーム状のコロニーの形態を維持することが可能であるなどの要件のいずれかを具備することを意味する。

「第二の哺乳類の種由来の宿主胚に同調しやすい」とは、本発明の再樹立された幹細胞を、ドナー種（第一の哺乳類の種）とは異種のレシピエント種（第二の哺乳類の種）由来の宿主胚において共培養した場合に、本発明の幹細胞の細胞周期が宿主胚の細胞の細胞周期に揃いやすい、ことを意味する。

本発明の方法により再樹立された異種間でキメラ形成能を有する幹細胞は、特に限定されないが、以下の用途に利用され得る。

本発明のキメラ形成能を有する幹細胞を利用して、胚盤胞補完法によりキメラ動物を作製することで、当該幹細胞に由来する臓器／臓器原基を形成することができる。このような臓器／臓器原基は再生医療において有用である。

また、本発明のキメラ形成能を有する幹細胞を用いて胚盤胞補完法によりキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞および体性細胞を得ることができる。また、当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞および体性細胞を得ることもできる。あるいは、本発明のキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞および体性細胞を得ることもできる。これらの体性幹細胞、臓器前駆細胞および体性細胞は、薬効評価や病態解析に用いるために有用である。本発明のキメラ形成能を有する幹細胞は、キメラ形成能を維持した高品質な幹細胞であるので、当該細胞を出発細胞として効率よくキメラ胚／キメラ動物の作製を行ったり分化させたりすることができる。

あるいは、本発明のキメラ形成能を有する幹細胞を利用して、テトラプロイドレスキュー法により、当該幹細胞が伝播された動物を作製することもできる。テトラプロイドレスキュー法は、４倍体胚にｉＰＳ／ＥＳ細胞等を注入することにより、４倍体細胞は胎盤へと発生し、ｉＰＳ／ＥＳ細胞等のみが個体へと発生することを利用した方法である（Ｎａｇｙ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１０，８１５−８２１（１９９０））。このような動物の作製法は、絶滅危惧種などの希少動物、ペットなどの愛玩哺乳動物、有用な商業動物の保存、再生、および／または維持に有効である。

＜細胞を用いた薬効評価または病態解析を行う方法＞
本出願は、さらに、記の再樹立方法によって得られるキメラ形成可能な幹細胞、または当該キメラ形成可能な幹細胞を分化させて得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞、を用いて薬効評価または病態解析を行う方法を提供する。

本発明の方法は、以下：
（ｉ）細胞を得る工程：ここで当該細胞は、（Ａ）本発明の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞であるか、（Ｂ）態様１ないし１７のいずれか１つに記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞であり、ここで当該体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの方法により得られるものである：
（ａ）態様１ないし１７のいずれか１つに記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、そして当該キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
（ｂ）（ａ）で得られたキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る；
（ｃ）態様１ないし１７のいずれか１つに記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う工程；
を含む、前記方法。

上記の方法の工程（ｉ）において、（Ａ）の「キメラ形成能を有する幹細胞」は、上記「幹細胞を多段階工程により再樹立する方法」によって、多能性幹細胞または複能性幹細胞から再樹立して得ることができる。

上記の方法の工程（ｉ）において、（Ｂ）の「キメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞」は、まず、「キメラ形成能を有する幹細胞」を（Ａ）と同様にして得た後、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの方法を行うことにより得ることができる。
（ａ）の方法は、キメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔を作製し、そして当該キメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る、というものである。キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔の作製方法は、上記「定義」の項目においてキメラ胚／キメラ動物の作製について記載した方法により行うことができる。キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔から体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得るためには当該細胞を分取・樹立することにより行う。キメラ胚またはキメラ胎児／胎仔からの体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞の分取・樹立は、当業者が通常用いる方法により適宜行うことができる。
（ｂ）の方法は、（ａ）で得られたキメラ胚またはキメラ胎児／胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る、というものである。体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性幹細胞を得る方法は、当業者が通常用いる方法により適宜行うことができる。
（ｃ）の方法は、キメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る、というものである。キメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させて、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る方法は、当業者が多能性幹細胞をインビトロで分化させるために通常用いる方法により適宜行うことができる。

上記の方法の工程（ｉ）において得られる「体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞」は、例えば、心臓、神経、腎臓、肝臓、膵臓、骨格筋、血球系細胞、等に関連する細胞であるが、特に限定されない。

上記の方法の工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う。薬効評価または病態解析は、細胞を用いた検査方法であれば特に限定されない。当業者が通常用いる方法により、適宜行うことができる。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例１ＥＳ細胞を用いた多段階再樹立法
本実施例は、ＥＳ細胞を用いた多段階再樹立法を記載する。サルＥＳ細胞（ｓＥＳＣｓ）は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来で、マーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を導入した細胞株（ＣＭＫ６Ｇ）（非特許文献５，６）で、さらに、ヒトｎａｎｏｇを発現する温度感受性センダイウイルス（ＳｅＶ１８＋ｈＮＡＮＯＧ／ＴＳ７ｄＦ）（非特許文献７）を導入したものを用いて、多段階の再樹立法を実施した。

具体的には先ず、このＥＳ細胞を、サルＥＳ用培地［３５．９％（ｖ／ｖ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、４８％（ｖ／ｖ）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｎ２ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１μＭＰＤ０３２５９０１、１μＭＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭフォルスコリン、２０ｎｇ／ｍＬヒトＬＩＦ、５μＭケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、５μＭＧｏ６９８３］を用いて、マウスＥＳ細胞とともに共培養を行った。マウスＥＳ細胞の細胞塊とともに凝集してきたサルＥＳ細胞を選別した（工程（ｉ））。

得られたサルＥＳ細胞をマウス４倍体胚盤胞（ＭＣＨ）４０個にマイクロインジェクションした後、マウス用培地［８０％（ｖ／ｖ）Ｄ−ＭＥＭ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸溶液、０．１ｍＭ２−ＭＥ、１ｘＮＥＡＡ、１０^３Ｕ／ｍＬｍＬＩＦ］に上記サル用ＥＳ培養液を１：１の割合で加えたマウス初期胚培養条件（ｍｗｍ培養液、５％ＣＯ_２、３７℃）で１日共培養した（工程（ｉｉ））。

異常形状をしているもの、ＩＣＭ以外にサルＥＳ胞がある胚盤胞を顕微鏡下で除去し、良好な胚だけを４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養した。培養液は、サル用ＥＳ培養液を用いた。

播種後増殖してきたＩＣＭから良好な形熊をし、蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒＤ１ｓｙｓｔｅｍ，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）にて緑色蛍光を有することを確認したモザイク状態のものだけを、増殖能や良好なコロニーの形態を指標に目視で選別しピックアップした。０．０２５％トリプシン／０．１ｍＭＥＤＴＡ処理し、細胞塊を分散した（工程（ｉｉｉ））。その後、新しく準備した４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養した。培養液は、サル用培地をマウス用培地に２：１の割合で加えたものを用いた。

播種後、さらに新しく形成されたコロニーから、蛍光顕微鏡にて緑色蛍光を有することを確認し、状態の良いコロニーを選抜し培養した。これを第一段階の再樹立後のサルＥＳ細胞とした。当該の第一段階再樹立サルＥＳ細胞は、培養する際、サル用培地をマウス用培地と例えば１：１で混合した混合培養液にて培養することが可能となり、良好な増殖性とコロニーの形状を維持した（工程（ｉｖ））。

当該の第一段階再樹立サルＥＳ細胞を、僅かなマウスＩＣＭ由来のマウス４ＮＥＳ細胞とマウスＩＣＭ寄与したマウスＥＳ細胞とともに、サル用培地をマウス用培地に２：１の割合で加えた混合培養液を用いて共培養を行い、増殖能や形態の良いコロニーを選別した。

このサルＥＳ細胞をマウス４倍体胚盤胞（ＭＣＨ）３０個にマイクロインジェクションした後、サル用培地をマウス初期胚培養用培地に１：１０の割合で加えたマウス初期胚培養条件（ｍｗｍ培養液、５％ＣＯ_２、３７℃）で１日共培養した（工程（ｖ））。異常形状をしているもの、ＩＣＭ以外にサルＥＳ細胞がある胚盤胞を顕微鏡下で除去し、良好な胚だけを４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移し、サル用培地をマウス用培地に２：１の割合で加えた混合培養液を用いて培養した。播種後増殖してきたＩＣＭから良好な形態をし、蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒＤ１ｓｙｓｔｅｍ，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）にて緑色蛍光を有することを確認したモザイク状態のものだけを、増殖能や形態を指標に目視で選別しピックアップした。

第二段階再樹立後のサルＥＳ細胞は、再樹立前に比べＩＣＭへの寄与率が格段に増加した。０．０２５％トリプシン／０．１ｍＭＥＤＴＡ処理し、細胞塊を分散した（工程（ｖｉ））。その後、新しく準備した４穴プレートのフィーダー細胞上にそれぞれ別々に移して培養した。培養液はサル用培地を用いた。

播種後、さらに新しく形成されたコロニーから、蛍光顕微鏡にて緑色蛍光を有することを確認して状態の良いコロニーを選抜しネオマイシン添加（５００μｇ／ｍｌ）培地で培養した。これを第二段階再樹立後のサルＥＳ細胞とした（工程（ｖｉｉ））（図２）。

二段階再樹立後のサルＥＳ細胞は、混合培養液にて再樹立を実施したが、２阻害薬を添加した改変マウス用培養液［８０％（ｖ／ｖ）Ｄ−ＭＥＭ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸溶液、０．１ｍＭ２−ＭＥ、１ｘＮＥＡＡ、１０^３Ｕ／ｍＬｈＬＩＦ、１μＭＰＤ０３２５９０１、１μＭＣＨＩＲ９９０２１］においても良好な増殖能を保持し、形状と大きさの良好なコロニーの形成が可能であった（図３上段）。

実施例２二段階再樹立後のＥＳ細胞の多能性の検討
本実施例において、二段階再樹立後のサルＥＳ細胞の多能性を、テラトーマ形成実験にて検討した。

二段階再樹立後のサルＥＳ細胞をＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの睾丸に移植したところ、約３ヶ月後に睾丸部に大きな腫瘤が形成された。解剖後、腫瘍部分を４％パラホルムアルデヒド固定液にて固定後、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色標本を作製した。組織学的検討の結果、外胚葉としてロゼッタ構造を呈する神経上皮組織や神経膠組織、メラニン色素を含有する神経上皮組織、内胚葉として偽重層円柱上皮または単層円柱上皮で内張された管腔構造からなる上皮組織、中胚葉としてコラーゲンを産生する繊維性結合組織や筋組織が認められる（図３中段、下段）。以上、二段階再樹立後のサルＥＳ細胞から、外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の組織が形成されたことが確認された。

実施例３テラトーマのサルＥＳ細胞由来の確認
本実施例では、実施例２で形成されたテラトーマの由来が確かにサルＥＳ細胞であることを確認した。具体的には、テラトーマ組織からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにてサルＥＳ細胞由来であるｎｅｏ遺伝子およびサル由来遺伝子であるβ２マイクログロブリン（β２ＭＧ）の検出を試みた。

先ず、テラトーマ組織の一部を採取し、プロテアーゼ処理を実施した後ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法にて先ずサルＥＳ細胞に導入されたマーカー遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を検出した。ｎｅｏ遺伝子の検出には、以下の配列番号１及び２のプライマーセット、並びにｒＴａｑを用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３５サイクル実施した。
プライマーセット
５’−ＡＧＣＣＧＧＴＣＴＴＧＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣ−３’（配列番号１）および
５’−ＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号２）

またサルβ２ミクログロブリン（β２ＭＧ）遺伝子の検出には、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲを用いた。一回目の増幅には、以下の配列番号３及び４のプライマーセット、並びにｒＴａｑを用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル実施した。
５’−ＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧ−３’（配列番号３）および
５’−ＧＧＴＴＣＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＴＣ−３’（配列番号４）

二回目の増幅には、以下の配列番号５及び６のプライマーセット、並びにｒＴａｑを用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を２５サイクル実施した。
５’−ＧＴＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧ−３’（配列番号５）および
５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡＧ−３’（配列番号６）

ＰＣＲの特異性は高く、ｎｅｏ遺伝子およびサルβ２ＭＧ遺伝子は、陰性コントロールであるマウス肝臓とＢ６マウスｔａｉｌのＤＮＡでは検出せず、テラトーマ組織および再樹立後のサルＥＳ細胞でのみ検出された（図５）。以上から、テラトーマはｎｅｏ遺伝子を保有するサルＥＳ細胞由来であることが確認された。即ち、再樹立したサルＥＳ細胞は、三葉に分化したテラトーマを形成し多能性を有することを示した。

以上、霊長類の多能性幹細胞において、形状のきれいなドーム型のコロニーを形成させ、三葉分化能を有する多能性を維持するのに、多段階再樹立法が有効であることが示された。なお、多段階再樹立後の多能性幹細胞が、マウス用培地にて培養可能な形質を獲得したことは、マウス等の異種間キメラ胚形成において有利であり、また多能性幹細胞の維持・増幅の点において費用や簡便性の観点からも有利である。

実施例４再樹立前及び後の細胞における遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリング
再樹立前のサルＥＳ細胞（ｓＥＳｃｅｌｌ）の培養用デッシュ３枚、再樹立後のサルＥＳ細胞（Ｒｅ−ｓＥＳｃｅｌｌ）の培養用デッシュ３枚から、各々ＲＮＡ抽出を行った。

各細胞より抽出したＲＮＡについて、イルミナ社ＨｉＳｅｑ２０００を用いてＲＮＡ−Ｓｅｑを行い、アカゲザルのトランスクリプトームのパイプラインでマッピングした結果、１８，３３９の遺伝子数を同定した。サンプル間比較の組合せで検定された遺伝子の発現量をＦＰＫＭ（ＦｒａｇｍｅｎｔｓＰｅｒＫｉｌｏｂａｓｅｏｆｅｘｏｎｐｅｒＭｉｌｌｉｏｎｍａｐｐｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ）値で示し、群平均法にてクラスタリングを行い、キャンベラ（ｃａｎｂｅｒｒａ）アルゴリズムにて距離を測定した。

サルＥＳ細胞の再樹立前および再樹立後の各細胞における遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリングの結果を、図６に示す。再樹立前の細胞と再樹立後の細胞で、各々の遺伝子発現プロファイルは大きく２つの群にグループ化された。即ち、再樹立後の細胞の遺伝子発現プロファイルは、再樹立前のものとは異なり、特定の遺伝子発現パターンを示すことが明らかになった。

実施例５再樹立サルＥＳ細胞中の山中４因子およびＮＡＮＯＧの発現
実施例４で得られた再樹立前のサルＥＳ細胞（ｓＥＳ１、ｓＥＳ２、ｓＥＳ３）、及び、再樹立後のサルＥＳ細胞（Ｒｅ＿ｓＥＳ１、Ｒｅ＿ｓＥＳ２、Ｒｅ＿ｓＥＳ３）について、山中４因子に相当するサルの内在性遺伝子（ＰＡＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ）および多能性維持に重要なＮＡＮＯＧ遺伝子の、再樹立前後による遺伝子発現量の変化を、ＦＰＫＭ値の変化に基づいて検討した。結果を図７に示す。図７Ａは各遺伝子のＦＰＫＭ値、そして図７Ｂは、再樹立前後の遺伝子発現量の変化をｌｏｇ_２値で示したものである。図７Ｃは、それぞれのＦＰＫＭ値、ｌｏｇ_２値および有意の有無をまとめたものである。再樹立後のサルＥＳ細胞では、内因性の山中４因子であるＰＡＵ５Ｆ１（Ｏｃｔ４）、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣの遺伝子発現量は有意に増加した。また、多能性維持に必要なＮＡＮＯＧの発現量も有意に増加した。以上から、再樹立後のサルＥＳ細胞では、多能性維持に重要な内因性遺伝子の発現上昇が認められた。

実施例６再樹立サルＥＳ細胞における遺伝子発現パターン
実施例６で得られたＲＮＡ−Ｓｅｑの結果から、ナイーブ型多能性（ｎａｉｖｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、コア型多能性（ｃｏｒｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、プライム型多能性（ｐｒｉｍｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、中胚葉／原始線条（Ｍｅｓｏｄｅｒｍ／ｐｒｉｍｉｔｉｖｅｓｔｅａｋ）の各特性に関する遺伝子の発現についてサルＥＳ細胞の再樹立の前後で比較した結果を図８に示す。上段は各遺伝子のＦＰＫＭ値、そして下段は、再樹立前後の遺伝子発現量の変化をｌｏｇ_２値で示したものである。再樹立により、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＤＰＰＡ３、ＺＦＰ４２、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１４等のナイーブ型多能性（ｎａｉｖｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の特性に関する遺伝子、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＧＤＦ３、ＳＡＬＬ４、ＵＴＦ１、ＦＧＦ４等のコア型多能性（ｃｏｒｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の特性に関する遺伝子の発現量が増加した。一方、プライム型多能性（ｐｒｉｍｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の特性に関するＬＥＦ１、ＣＥＲ１の発現量、および中胚葉／原始線条（Ｍｅｓｏｄｅｒｍ／ｐｒｉｍｉｔｉｖｅｓｔｅａｋ）の特性に関するＥＯＭＥＳ、ＭＳＸ１の遺伝子発現量は減少した。以上から、再樹立によってサルＥＳ細胞が、より高品質な多能性幹細胞の状態になったことが理解される。
ＤＰＰＡ３＝ＳＴＥＬＬＡ
ＺＦＰ４２＝ＲＥＸ１＝ＺＮＦ７５４
ＰＲＤＭ１４＝メチルトランスフェラーゼ活性
ＫＬＦ４＝Ｋｒｕｅｐｐｅｌ様因子４
［配列表］

Claims

異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を、多段階工程により再樹立する方法であって、
以下の工程：
（ｉ−ａ）第一の哺乳類の種由来の多能性（pluripotent）幹細胞または複能性（multipotent）幹細胞を、第二の哺乳類の種由来のナイーブ型の多能性幹細胞と共培養して細胞群を得る、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地である
（ｉｉ）工程（ｉ−ａ）で得られた細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）得られた内部細胞塊を培養する、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地である；
（ｖ）工程（ｉｖ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む；
（ｖｉ）工程（ｖ）で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する；
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られた内部細胞塊を培養し、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、培養培地は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれであってもよい；
を含み、
ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種であり、
ここで、前記第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、そして、前記第二の哺乳類の種由来のナイーブ型の多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、あるいはこれらの細胞の内部細胞塊であり、そして、
ここで、第二の哺乳類の種はヒトではない、
前記方法。
工程（ｉｉ）及び／又は工程（ｖ）の第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養工程において、混合培地中での共培養後、培地を第一の哺乳類の種に適した培養培地に変更してさらに共培養を行う、ことを含む、請求項１に記載の方法。
さらに、工程（ｖｉｉ）で再樹立した幹細胞について、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）を繰り返すことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
第一の哺乳類の種が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル及びヒトからなる群より選択される、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
第一の哺乳類の種が、霊長目に属する種である、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
第二の哺乳類の種が、マウス、ラット、ウサギ及びブタからなる群より選択される、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
第一の哺乳類の種がサルであり、第二の哺乳類の種がマウスである、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
宿主胚が、受精卵由来胚又は人工操作胚からなる群より選択される、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｉｉ）、工程（ｖ）が、各々工程（ｉ−ａ）、工程（ｉｖ）の細胞群を第二の哺乳類の種由来の受精卵由来胚または４倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
第一の哺乳類の種に適した培養培地が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含むことを特徴とする、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
第二の哺乳類の種に適した培養培地が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含まないことを特徴とする、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞ではない、請求項１−１１のいずれか１項に記載の方法。