JP6935101B2 - 幹細胞を再樹立する方法 - Google Patents
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Description
キメラ形成能を有する幹細胞を多段階工程により再樹立する方法であって、
第一種の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を、第一の幹細胞とは培養条件の異なる第二種の細胞の宿主胚と共培養する工程を含む再樹立工程を少なくとも2回行い、ここにおいて、第一種の幹細胞を第二種の細胞の宿主胚と共培養する工程において、培養培地は第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地を用いることを含み、そして、
キメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、再樹立されたキメラ形成能を有する幹細胞は、第二種の細胞に適した培養培地、第一種の幹細胞に適した培養培地、あるいは、第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、
ことを含む、前記方法。
異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を、多段階工程により再樹立する方法であって、
第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程を含む再樹立工程を少なくとも2回行い、ここにおいて、第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含み、そして、
異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、再樹立された異種間でキメラ形成能を有する幹細胞は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、
ことを含む、前記方法。
以下の工程:
(i−a)第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養して細胞群を得る、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地である;若しくは
(i−b)第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る;
(ii)工程(i)で得られた細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む;
(iii)工程(ii)で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する;
(iv)工程(iii)得られた内部細胞塊を培養する、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地である;
(v)工程(iv)の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む;
(vi)工程(v)で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する;
(vii)工程(vii)で得られた内部細胞塊を培養し、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、培養培地は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれであってもよい;
を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種である、
態様2に記載の方法。
工程(ii)及び/又は工程(v)の第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養工程において、混合培地中での共培養後、培地を第一の哺乳類の種に適した培養培地に変更してさらに共培養を行う、ことを含む、態様3に記載の方法。
さらに、工程(vii)で再樹立した幹細胞について、工程(v)〜(vii)を繰り返すことを含む、態様3又は4に記載の方法。
第一の哺乳類の種が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル及びヒトからなる群より選択される、態様2−5のいずれか1項に記載の方法。
第一の哺乳類の種が、霊長目に属する種である、態様2−5のいずれか1項に記載の方法。
第二の哺乳類の種が、マウス、ラット、ウサギ及びブタからなる群より選択される、態様2−7のいずれか1項に記載の方法。
第一の哺乳類の種がサルであり、第二の哺乳類の種がマウスである、態様2−8のいずれか1項に記載の方法。
多能性幹細胞が、以下:ES細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、クローン胚由来ES細胞(ntES細胞)、及び生殖細胞(EG細胞)からなる群より選択され、そして、複能性幹細胞が以下:栄養芽幹細胞(TS細胞)、エピブラスト幹細胞(EpiS細胞)、多能性生殖細胞(mGS細胞)、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉系幹細胞、からなる群より選択される、態様2−9のいずれか1項に記載の方法。
第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞が、ES細胞またはiPS細胞である、態様2−10のいずれか1項に記載の方法。
高品質な多能性幹細胞が、ナイーブ型の多能性幹細胞である、態様3−11のいずれか1項に記載の方法。
宿主胚が、受精卵由来胚又は人工操作胚からなる群より選択される、態様1−12のいずれか1項に記載の方法。
工程(ii)、工程(v)が、各々工程(i)、工程(iv)の細胞群を第二の哺乳類の種由来の受精卵由来胚または4倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う、態様2−13のいずれか1項に記載の方法。
第一の哺乳類の種に適した培養培地が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、MEK阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含むことを特徴とする、態様2−14のいずれか1項に記載の方法。
第二の哺乳類の種に適した培養培地が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、MEK阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含まないことを特徴とする、態様2−15のいずれか1項に記載の方法。
第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞はヒトES細胞ではなく、そして第二の哺乳類の種はヒトではない、態様2ないし16のいずれか1項に記載の方法。
多能性幹細胞もしくは複能性幹細胞から再樹立した、霊長目の動物の幹細胞であって、以下:
・均一化されている;
・キメラ形成可能である;
・細胞集合体を形成可能である;および
・内部細胞塊のニッチ環境に親和性が高い;
からなる群より選択される特徴の1以上を有する、前記細胞。
態様1ないし17に記載の方法により再樹立した、態様18に記載の細胞。
以下:
・第二種の哺乳類の種に適した培地で培養可能である;および
・第二の哺乳類の種由来の宿主胚に同調しやすい
からなる群より選択される特徴の1以上を有する、態様19に記載の細胞。
細胞を用いた薬効評価または病態解析を行う方法であって、以下:
(i)細胞を得る工程:ここで当該細胞は、(A)態様1ないし17のいずれか1項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞であるか、(B)態様1ないし17のいずれか1項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞であり、ここで当該体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞は、以下の(a)〜(c)のいずれかの方法により得られるものである:
(a)態様1ないし17のいずれか1項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児/胎仔を作製し、そして当該キメラ胚またはキメラ胎児/胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る;
(b)(a)で得られたキメラ胚またはキメラ胎児/胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る;
(c)態様1ないし17のいずれか1項に記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る;
(ii)工程(i)で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う工程;
を含む、前記方法。
[図2]図2は、多段階再樹立の前後のサルES細胞の顕微鏡写真図である。サル用ES培地で継代培養したサルES細胞を、X10倍またはX20倍の対物レンズを用いて蛍光顕微鏡(Axio Observer D1 system, Carl Zeiss)で観察した。二段階再樹立後のES細胞は、緑色蛍光を示し、良好な形状と大きさのコロニーを形成した。
上段:透過像
中段:GFP蛍光像
下段:重ね合わせ像
[図3]図3は、多段階再樹立されたサルES細胞をさらにマウス用培地で継代培養し、マウス用培地への適応を調べた結果である。サル用ES培地を用いて培養した二段階再樹立後のサルES細胞を、マウス用ES培地にて5代継代培養した。得られた細胞を蛍光顕微鏡にて観察したところ、良好な形状と大きさのコロニーの形態を維持していた。
上段:透過像
中段:GFP蛍光像
下段:重ね合わせ像
[図4]図4は、サルES細胞の細胞移植により形成されたテラトーマのHE染色組織像を調べた結果である。多段階再樹立後のサルES細胞を、NOD−Scidマウスの睾丸に移植したところ、テラトーマが形成された。これを固定後HE染色したのち顕微鏡にて観察した像を示す。
A.偽重層円柱上皮または単層円柱上皮で内張された管腔構造からなる上皮組織(内胚葉)(矢頭)がみられ、その周囲にはコラーゲンを産生する繊維性結合組織(中胚葉)(*)が存在する。
B.ロゼット構造を呈する神経上皮組織(外胚葉)(矢印)と神経膠細胞(外胚葉)(*)が見られる。
C.主に単層円柱上皮で内張された管腔構造からなる上皮組織(内胚葉)(矢頭)がみられ、その周囲には筋組織(中胚葉)(*)が存在する。
D.ロゼット構造を呈する神経上皮組織(外胚葉)(矢印)が存在している。黒褐色のメラニン色素を有する神経上皮組織(外胚葉)(二重矢印)が認められる。
[図5]図5は、テラトーマの由来が多段階再樹立されたサルES細胞であることを確認するために、テラトーマ組織からDNAを抽出し、サルES細胞由来であるneo耐性遺伝子およびサル由来遺伝子であるβ2 マイクログロブリン(β2MG)の存在をPCRにて検出した結果である。PCR産物をアガロースゲル電気泳動した結果、テラトーマ由来DNAに、340bp長のneo耐性遺伝子のPCR産物(左図)、および133bp長のサルβ2MG遺伝子のPCR産物(右図)を検出した。
[図6]図6は、サルES細胞の再樹立前および再樹立後の各細胞における遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリングの結果を示した図である。
[図7A]図7Aは、再樹立前後における山中4因子の内因性遺伝子及びNANOGの遺伝子発現レベルを示した図である。図7Aは各遺伝子のFPKM値を示したものである。
[図7B]図7Bは、再樹立前後における山中4因子の内因性遺伝子及びNANOGの遺伝子発現レベルを示した図である。図7Bは、再樹立前後の遺伝子発現量の変化をlog2値で示したものである。
[図7C]図7Cは、再樹立前後における山中4因子の内因性遺伝子及びNANOGの遺伝子発現レベルを示した図である。図7Cは、それぞれのFPKM値、log2値および有意の有無をまとめたものである。
[図8]図8は、ナイーブ型多能性(naive pluripotency)、コア型多能性(core pluripotency)、プライム型多能性(primed pluripotency)、中胚葉/原始線条(Mesoderm/primitive steak)の各特性に関する遺伝子の発現についてサルES細胞の再樹立の前後で比較した図である。上段:各遺伝子のFPKM値;下段:再樹立前後の遺伝子発現量の変化のlog2値。
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
ここで、当該移植される幹細胞が由来する種とホストの種が異種である場合、特に「異種間でキメラ形成可能である」という。
本発明は、キメラ形成能を有する幹細胞を多段階工程により再樹立する方法を提供する。
キメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、再樹立されたキメラ形成能を有する幹細胞は、第二種の細胞に適した培養培地、第一種の幹細胞に適した培養培地、あるいは、第一種の幹細胞に適した培養培地と第二種の細胞に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、
ことを含む。
第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程を含む再樹立工程を少なくとも2回行い、ここにおいて、第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含み、そして、 異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、再樹立された異種間でキメラ形成能を有する幹細胞は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地、のいずれの培養培地でも培養可能である、
ことを含む。
非限定的に、本発明の方法は、一態様において以下の工程を含む。
(i−a)第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養して細胞群を得る、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地である;若しくは
(i−b)第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る;
(ii)工程(i)で得られた細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む;
(iii)工程(ii)で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する;
(iv)工程(iii)得られた内部細胞塊を培養する、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地である;
(v)工程(iv)の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む;
(vi)工程(v)で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する;
(vii)工程(vii)で得られた内部細胞塊を培養し、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、培養培地は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれであってもよい;
を含み、ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種である。
(i−a)第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と共培養して細胞群を得る、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地である;若しくは
(i−b)第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を、第二の哺乳類の種由来の高品質な多能性幹細胞と合わせて細胞群を得る。
本発明の方法では、第二種の宿主胚との共培養を含む再樹立工程を少なくとも2回行うが、再樹立工程に用いる培地を、第一の哺乳類の種に適した培養培地から第二の哺乳類の種に適した培養培地へと多段階的に培地組成を変更していくことを特徴とする。第一の哺乳類の種由来の幹細胞を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する工程の少なくとも一時期において、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いる。用いる混合培地は、再樹立の段階に応じて適宜至適化される。
DMEM/F12 (Invitrogen社)
Neurobasal (Invitrogen社)
N2 supplement (Invitrogen社)
B27 supplement (Invitrogen社)
GlutaMAX (Invitrogen社)
非必須アミノ酸(NEAA)溶液 (Invitrogen社)
2−メルカプトエタノール(2−ME) (Invitrogen社)
ペニシリン/ストレプトマイシン (Invitrogen社)
ウシ血清アルブミン(BSA) (Sigma社)
PD0325901 (Stemgent社) MEK1/2阻害剤
CHIR99021 (Stemgent社) GSK3阻害剤
フォルスコリン (Sigma社) AC(アデニル酸シクラーゼ)活性化剤
ヒトLIF(hLIF) (Millipore社)
ケンパウロン(Kenpaullone) (Sigma社)
サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤
Go6983 (Sigma社) PKC阻害剤
80%(v/v) D−MEM、20%(v/v) FCS、1 mMピルビン酸溶液、0.1mM 2−メルカプトエタノール、1xMEM非必須アミノ酸溶液、103U/mL mLIF(Wako)または1xrhLIF(Wako)を含む培養液
ナイーブ型ブタiPS細胞の培地組成の例:
82%(v/v) D−MEM、15%(v/v) FCS、0.1mM 2−メルカプトエタノール、1xMEM非必須アミノ酸溶液、1x GlutaMAXTM−I(GIBCO)、1xrhLIF(Wako)、10μM Forskolinを含む培養液
本発明は、多能性幹細胞もしくは複能性幹細胞から再樹立した、霊長目の動物の幹細胞も提供する。本発明の幹細胞は、以下:
・均一化されている;
・キメラ形成可能、特に異種間でキメラ形成可能である;
・細胞集合体を形成可能である;および
・内部細胞塊のニッチ環境に親和性が高い;
からなる群より選択される特徴の1以上を有する。好ましくは、上記性質の2以上、3以上、全部を有する。
・第二種の哺乳類の種に適した培地で培養可能である;および
・第二の哺乳類の種由来の宿主胚に同調しやすい
からなる群より選択される特徴の1以上を有する。好ましくは、上記2つの条件の双方を意味する。
本出願は、さらに、記の再樹立方法によって得られるキメラ形成可能な幹細胞、または当該キメラ形成可能な幹細胞を分化させて得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞、を用いて薬効評価または病態解析を行う方法を提供する。
(i)細胞を得る工程:ここで当該細胞は、(A)本発明の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞であるか、(B)態様1ないし17のいずれか1つに記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞を分化させることにより得た体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞であり、ここで当該体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞は、以下の(a)〜(c)のいずれかの方法により得られるものである:
(a)態様1ないし17のいずれか1つに記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児/胎仔を作製し、そして当該キメラ胚またはキメラ胎児/胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る;
(b)(a)で得られたキメラ胚またはキメラ胎児/胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る;
(c)態様1ないし17のいずれか1つに記載の方法により再樹立したキメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る;
(ii)工程(i)で得た細胞を用いて薬効評価または病態解析を行う工程;
を含む、前記方法。
(a)の方法は、キメラ形成能を有する幹細胞からキメラ胚またはキメラ胎児/胎仔を作製し、そして当該キメラ胎児/胎仔由来の体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る、というものである。キメラ胚またはキメラ胎児/胎仔の作製方法は、上記「定義」の項目においてキメラ胚/キメラ動物の作製について記載した方法により行うことができる。キメラ胚またはキメラ胎児/胎仔から体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得るためには当該細胞を分取・樹立することにより行う。キメラ胚またはキメラ胎児/胎仔からの体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞の分取・樹立は、当業者が通常用いる方法により適宜行うことができる。
(b)の方法は、(a)で得られたキメラ胚またはキメラ胎児/胎仔由来の体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性細胞を得る、というものである。体性幹細胞をインビトロで分化させて臓器前駆細胞または体性幹細胞を得る方法は、当業者が通常用いる方法により適宜行うことができる。
(c)の方法は、キメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させることにより、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る、というものである。キメラ形成能を有する幹細胞をインビトロで分化させて、体性幹細胞、臓器前駆細胞、または体性細胞を得る方法は、当業者が多能性幹細胞をインビトロで分化させるために通常用いる方法により適宜行うことができる。
本実施例は、ES細胞を用いた多段階再樹立法を記載する。サルES細胞(sESCs)は、カニクイザル(Macaca fascicularis)由来で、マーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)とネオマイシン耐性遺伝子(neo)を導入した細胞株(CMK6G)(非特許文献5,6)で、さらに、ヒトnanogを発現する温度感受性センダイウイルス(SeV18+hNANOG/TS7dF)(非特許文献7)を導入したものを用いて、多段階の再樹立法を実施した。
本実施例において、二段階再樹立後のサルES細胞の多能性を、テラトーマ形成実験にて検討した。
本実施例では、実施例2で形成されたテラトーマの由来が確かにサルES細胞であることを確認した。具体的には、テラトーマ組織からDNAを抽出し、PCRにてサルES細胞由来であるneo遺伝子およびサル由来遺伝子であるβ2 マイクログロブリン(β2MG)の検出を試みた。
プライマーセット
5’−AGC CGG TCT TGT CGA TCA GGA TGA TC−3’(配列番号1)および
5’−CTC GTC AAG AAG GCG ATA GAA GGC−3’(配列番号2)
5’−CAG GTT TAC TCA CGT CAT CCA G−3’(配列番号3)および
5’−GGT TCA CAC GGC AGG CAT ACT C−3’(配列番号4)
5’−GTC TGG GTT TCA TCC ATC CG−3’(配列番号5)および
5’−GGT GAA TTC AGT GTA GTA CAA G−3’(配列番号6)
再樹立前のサルES細胞(sES cell)の培養用デッシュ3枚、再樹立後のサルES細胞(Re−sES cell)の培養用デッシュ3枚から、各々RNA抽出を行った。
実施例4で得られた再樹立前のサルES細胞(sES1、sES2、sES3)、及び、再樹立後のサルES細胞(Re_sES1、Re_sES2、Re_sES3)について、山中4因子に相当するサルの内在性遺伝子(PAU5F1(Oct4)、KLF4、SOX2、MYC)および多能性維持に重要なNANOG遺伝子の、再樹立前後による遺伝子発現量の変化を、FPKM値の変化に基づいて検討した。結果を図7に示す。図7Aは各遺伝子のFPKM値、そして図7Bは、再樹立前後の遺伝子発現量の変化をlog2値で示したものである。図7Cは、それぞれのFPKM値、log2値および有意の有無をまとめたものである。再樹立後のサルES細胞では、内因性の山中4因子であるPAU5F1(Oct4)、KLF4、SOX2、MYCの遺伝子発現量は有意に増加した。また、多能性維持に必要なNANOGの発現量も有意に増加した。以上から、再樹立後のサルES細胞では、多能性維持に重要な内因性遺伝子の発現上昇が認められた。
実施例6で得られたRNA−Seqの結果から、ナイーブ型多能性(naive pluripotency)、コア型多能性(core pluripotency)、プライム型多能性(primed pluripotency)、中胚葉/原始線条(Mesoderm/primitive steak)の各特性に関する遺伝子の発現についてサルES細胞の再樹立の前後で比較した結果を図8に示す。上段は各遺伝子のFPKM値、そして下段は、再樹立前後の遺伝子発現量の変化をlog2値で示したものである。再樹立により、KLF4、KLF5、DPPA3、ZFP42、TFCP2L1、PRDM14等のナイーブ型多能性(naive pluripotency)の特性に関する遺伝子、NANOG、SOX2、POU5F1、GDF3、SALL4、UTF1、FGF4等のコア型多能性(core pluripotency)の特性に関する遺伝子の発現量が増加した。一方、プライム型多能性(primed pluripotency)の特性に関するLEF1、CER1の発現量、および中胚葉/原始線条(Mesoderm/primitive steak)の特性に関するEOMES、MSX1の遺伝子発現量は減少した。以上から、再樹立によってサルES細胞が、より高品質な多能性幹細胞の状態になったことが理解される。
DPPA3 = STELLA
ZFP42 = REX1 = ZNF754
PRDM14 = メチルトランスフェラーゼ活性
KLF4 =Krueppel様因子4
[配列表]
Claims (12)
- 異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を、多段階工程により再樹立する方法であって、
以下の工程:
(i−a)第一の哺乳類の種由来の多能性(pluripotent)幹細胞または複能性(multipotent)幹細胞を、第二の哺乳類の種由来のナイーブ型の多能性幹細胞と共培養して細胞群を得る、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地である
(ii)工程(i−a)で得られた細胞群を、第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む;
(iii)工程(ii)で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する;
(iv)工程(iii)得られた内部細胞塊を培養する、ここにおいて、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地である;
(v)工程(iv)の細胞群を第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養する、ここにおいて、培養培地として第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地を用いることを含む;
(vi)工程(v)で共培養した宿主胚から内部細胞塊を分離する;
(vii)工程(vi)で得られた内部細胞塊を培養し、異種間でキメラ形成能を有する幹細胞を再樹立する、ここにおいて、培養培地は、第二の哺乳類の種に適した培養培地、第一の哺乳類の種に適した培養培地、あるいは、培養培地は第一の哺乳類の種に適した培養培地と第二の哺乳類の種に適した培養培地の混合培地のいずれであってもよい;
を含み、
ここで当該第一の哺乳類の種と当該第二の哺乳類の種は異なる種であり、
ここで、前記第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞または複能性幹細胞が、ES細胞またはiPS細胞であり、そして、前記第二の哺乳類の種由来のナイーブ型の多能性幹細胞は、ES細胞、iPS細胞、あるいはこれらの細胞の内部細胞塊であり、そして、
ここで、第二の哺乳類の種はヒトではない、
前記方法。 - 工程(ii)及び/又は工程(v)の第二の哺乳類の種由来の宿主胚と共培養工程において、混合培地中での共培養後、培地を第一の哺乳類の種に適した培養培地に変更してさらに共培養を行う、ことを含む、請求項1に記載の方法。
- さらに、工程(vii)で再樹立した幹細胞について、工程(v)〜(vii)を繰り返すことを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 第一の哺乳類の種が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル及びヒトからなる群より選択される、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法。
- 第一の哺乳類の種が、霊長目に属する種である、請求項1−4のいずれか1項に記載の方法。
- 第二の哺乳類の種が、マウス、ラット、ウサギ及びブタからなる群より選択される、請求項1−5のいずれか1項に記載の方法。
- 第一の哺乳類の種がサルであり、第二の哺乳類の種がマウスである、請求項1−6のいずれか1項に記載の方法。
- 宿主胚が、受精卵由来胚又は人工操作胚からなる群より選択される、請求項1−7のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(ii)、工程(v)が、各々工程(i−a)、工程(iv)の細胞群を第二の哺乳類の種由来の受精卵由来胚または4倍体胚にマイクロインジェクションまたはアグリゲーションして共培養することにより行う、請求項1−8のいずれか1項に記載の方法。
- 第一の哺乳類の種に適した培養培地が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、MEK阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含むことを特徴とする、請求項1−9のいずれか1項に記載の方法。
- 第二の哺乳類の種に適した培養培地が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、MEK阻害剤及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、阻害剤を含まないことを特徴とする、請求項1−10のいずれか1項に記載の方法。
- 第一の哺乳類の種由来の多能性幹細胞はヒトES細胞ではない、請求項1−11のいずれか1項に記載の方法。
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