JP6925608B2 - Cross-section processing observation method, cross-section processing observation device - Google Patents
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Description
本発明は、集束イオンビームによって形成した試料の特定観察対象物を含む特定部位に向けて電子ビームを照射して断面像を取得し、特定観察対象物の３次元立体像を構築する断面加工観察方法、断面加工観察装置に関するものである。 In the present invention, a cross-sectional processing observation is performed to obtain a cross-sectional image by irradiating a specific site including a specific observation object of a sample formed by a focused ion beam with an electron beam to obtain a three-dimensional stereoscopic image of the specific observation object. It relates to a method and a cross-section processing observation device.
例えば、半導体デバイス等の試料の内部構造を解析したり、立体的な観察を行ったりする手法の１つとして、集束イオンビーム（Focused Ion Beam;ＦＩＢ）鏡筒と電子ビーム（Electron Beam；ＥＢ）鏡筒を搭載した複合荷電粒子ビーム装置を用いて、ＦＩＢによる断面形成加工と、その断面をＥＢ走査による走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Mi
croscope；ＳＥＭ）観察を繰り返して、対象試料の断面像を複数枚取得した後、これら複数の断面像を重ね合わせて試料の３次元立体像を構築する断面加工観察方法が知られている（例えば、特許文献１）。
For example, as one of the methods for analyzing the internal structure of a sample such as a semiconductor device or performing three-dimensional observation, a focused ion beam (FIB) lens barrel and an electron beam (EB) are used. Using a composite charged particle beam device equipped with a lens barrel, cross-section forming by FIB and scanning electron microscope (Scanning Electron Mi) by EB scanning the cross section
A cross-sectional processing observation method is known in which a plurality of cross-sectional images of a target sample are obtained by repeating croscope (SEM) observation, and then the plurality of cross-sectional images are superposed to construct a three-dimensional stereoscopic image of the sample (for example). , Patent Document 1).
この断面加工観察方法は、ＦＩＢによる断面形成加工をＣｕｔと称し、ＥＢによる断面観察をＳｅｅと称して、ＣｕｔとＳｅｅを繰り返して３次元画像を構築する一連の手法がＣｕｔ＆Ｓｅｅとして知られている。この手法では、構築した３次元立体像から、対象試料の立体的な形体を様々な方向から見ることができる。更に、対象試料の任意の断面像を再現することができるという、他の方法にはない利点を有している。 In this cross-section processing observation method, cross-section formation processing by FIB is referred to as Cut, cross-section observation by EB is referred to as See, and a series of methods for constructing a three-dimensional image by repeating Cut and See is known as Cut & See. In this method, the three-dimensional shape of the target sample can be seen from various directions from the constructed three-dimensional image. Furthermore, it has an advantage that other methods do not have, that is, it is possible to reproduce an arbitrary cross-sectional image of the target sample.
具体的な一例として、試料に対してＦＩＢを照射してエッチング加工を行い、試料の断
面を露出させる。続いて、露出させた断面をＳＥＭ観察して断面像を取得する。続いて、
再度エッチング加工を行って、次の断面を露出させた後、ＳＥＭ観察により２枚目の断面
像を取得する。このように、試料の任意の方向に沿ってエッチング加工とＳＥＭ観察とを
繰り返して、複数枚の断面像を取得する。そして、最後に、取得した複数枚の断面像を重
ね合わせることによって、試料の内部を透過させた３次元立体像を構築する方法が知られている。
As a specific example, the sample is irradiated with FIB and etched to expose the cross section of the sample. Subsequently, the exposed cross section is observed by SEM to obtain a cross-sectional image. continue,
After etching again to expose the next cross section, a second cross-sectional image is obtained by SEM observation. In this way, etching processing and SEM observation are repeated along an arbitrary direction of the sample to obtain a plurality of cross-sectional images. Finally, there is known a method of constructing a three-dimensional stereoscopic image in which the inside of the sample is transmitted by superimposing a plurality of acquired cross-sectional images.
しかしながら、例えば、観察対象の試料が細胞などの生体試料である場合、パラフィンなどの包埋剤によって包埋して包埋ブロックに固定されている。こうした生体試料を加工観察対象にして、対象試料中に分散する微小な細胞などの特定観察対象物だけを選択的に高分解能の３次元立体像を構築する場合、包埋ブロックをＦＩＢやＥＢによって観察すると、包埋ブロックの表層だけの観察となり、対象試料（包埋ブロック）中に分散する細胞などの特定観察対象物の存在位置を特定することができない。このため、特定観察対象物が点在する試料に対して上述したＣｕｔ＆Ｓｅｅ手法を適用すると、ＦＩＢによる加工領域を試料全体に設定し、試料全体を対象にＣｕｔとＳｅｅを繰り返し行い、特定観察対象物を加工断面内に出現させる必要があり、観察に膨大な時間を要するという課題があった。 However, for example, when the sample to be observed is a biological sample such as a cell, it is embedded with an embedding agent such as paraffin and fixed to the embedding block. When such a biological sample is used as a processing observation target and a high-resolution three-dimensional stereoscopic image is selectively constructed only on a specific observation target such as minute cells dispersed in the target sample, the embedding block is formed by FIB or EB. When observing, only the surface layer of the embedding block is observed, and the existence position of a specific observation object such as cells dispersed in the target sample (embedding block) cannot be specified. Therefore, when the above-mentioned Cut & See method is applied to a sample in which specific observation objects are scattered, a processing region by FIB is set for the entire sample, and Cut and See are repeatedly performed for the entire sample to perform the specific observation object. It is necessary to make the sample appear in the processed cross section, and there is a problem that it takes an enormous amount of time for observation.
また、こうした試料全体を対象にＣｕｔとＳｅｅを繰り返し行うと、生成される断面画像も膨大な数になる。このため、特定観察対象物の３次元立体像を生成するには、こうした多量の断面像の中から、特定観察対象物を含む部位の断面像だけを抽出して３次元立体像を構築するという、非効率で時間のかかる手順が必要になるという課題もある。特に、生体試料の場合、その多くは特定観察対象物のサイズが微小であり、これを高精度な３次元立体像にするためには、ＦＩＢによる加工間隔をできる限り狭くして、広い視野でのＳＥＭ観察を繰り返す必要がある。そのため、試料全体で大量の断面像を取得することになるが、特定観察対象物を含む特定部位以外の断面像は不要であり、こうした不要な断面像を処理したり一時保存するために画像処理装置に過剰な負荷がかかるという課題もある。 Further, when Cut and See are repeatedly performed on the entire sample, the number of cross-sectional images generated becomes enormous. Therefore, in order to generate a three-dimensional stereoscopic image of a specific observation object, only a cross-sectional image of a part including the specific observation object is extracted from such a large number of cross-sectional images to construct a three-dimensional stereoscopic image. There is also the problem that inefficient and time-consuming procedures are required. In particular, in the case of biological samples, the size of the specific observation object is very small in most cases, and in order to obtain a highly accurate three-dimensional image, the processing interval by the FIB is made as narrow as possible to widen the field of view. It is necessary to repeat the SEM observation of. Therefore, a large amount of cross-sectional images are acquired for the entire sample, but a cross-sectional image other than a specific part including a specific observation object is unnecessary, and image processing is performed to process or temporarily store such an unnecessary cross-sectional image. There is also the problem that the device is overloaded.
更に、特定観察対象物が試料に含まれていない場合は、長時間を要して行った試料全体のＣｕｔとＳｅｅによる観察が全て無駄になってしまうという、効率的に観察を行う際の障害もあった。 Furthermore, if the specific observation object is not included in the sample, all the observations by Cut and See of the entire sample, which took a long time, are wasted, which is an obstacle in efficient observation. There was also.
本発明は、前述した事情に鑑みてなされたものであって、試料に含まれる特定観察対象物を含む特定部位だけを迅速に、かつ効率的に観察を可能にして、特定観察対象物の３次元立体像を容易にできる断面加工観察方法および断面加工観察装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and enables quick and efficient observation of only a specific part including a specific observation object contained in a sample, so that the specific observation object 3 It is an object of the present invention to provide a cross-section processing observation method and a cross-section processing observation device capable of easily forming a three-dimensional stereoscopic image.
上記課題を解決するために、本発明のいくつかの態様は、次のような断面加工観察方法、断面加工観察装置を提供した。
すなわち、本発明の断面加工観察方法は、観察対象の試料全体を光学顕微鏡で観察して、前記試料に含まれる特定観察対象物の前記試料内におけるおおよその３次元位置座標情報を取得する位置情報取得工程と、前記３次元位置座標情報に基づいて、前記試料のうち前記特定観察対象物が存在する特定部位に向けて集束イオンビームを照射して、該特定部位の断面を露出させる断面加工工程と、前記断面に電子ビームを照射して、前記特定観察対象物を含む所定の大きさの領域の画像を取得する断面像取得工程と、前記断面加工工程および前記断面像取得工程を所定間隔で所定方向に沿って複数回繰返し行い、取得した複数の前記画像から前記特定観察対象物を含む３次元立体像を構築する立体像生成工程と、を有することを特徴とする。
In order to solve the above problems, some aspects of the present invention provide the following cross-section processing observation method and cross-section processing observation device.
In other words, cross-section processing and observation method of the present invention is to observe the entire sample to be observed with an optical microscope, to obtain an approximate three-dimensional position coordinate information within said sample of a particular observation object contained in the sample position Based on the information acquisition process and the three-dimensional position coordinate information, cross-sectional processing that irradiates a focused ion beam toward a specific part of the sample in which the specific observation object exists to expose the cross section of the specific part. The step, the cross-sectional image acquisition step of irradiating the cross section with an electron beam to acquire an image of a region of a predetermined size including the specific observation object, and the cross-sectional processing step and the cross-sectional image acquisition step are performed at predetermined intervals. in repeated a plurality of times along a predetermined direction, and having a three-dimensional image generating step of constructing a three-dimensional image including the specific observation object from a plurality of pre-outs image obtained, the.
本発明の断面加工観察方法は、観察対象の試料を予め光学顕微鏡筒で観察して、特定観察対象物が存在するＸＹＺ方向の位置座標情報を取得し保存する。光学顕微鏡筒によるＺ（深さ）方向の位置座標は、光学顕微鏡筒として共焦点実体顕微鏡を用いて、ＸＹ位置座標を固定して焦点位置を変えながら観察することによって得られる。 In the cross-sectional processing observation method of the present invention, the sample to be observed is observed in advance with an optical microscope tube, and the position coordinate information in the XYZ direction in which the specific observation object is present is acquired and stored. The position coordinates in the Z (depth) direction by the optical microscope tube are obtained by observing while changing the focal position by fixing the XY position coordinates using a confocal stereomicroscope as the optical microscope tube.
こうして得られた特定観察対象物の３次元座標情報に基づいて、観察対象の試料をＦＩＢによって断面露出加工を行なう。この時、特定観察対象物が存在しない領域は、ＦＩＢによって加工間隔を広げて短時間で加工し、断面像も特に取得することはない。そして、位置座標情報によって特定観察対象物を含む特定部位に到達したら、予め定めた狭い間隔で試料を加工し、加工した断面のうち特定観察対象物を含む領域のＳＥＭ断面像を取得する。 Based on the three-dimensional coordinate information of the specific observation object thus obtained, the sample to be observed is subjected to cross-section exposure processing by FIB. At this time, the region where the specific observation object does not exist is processed in a short time by widening the processing interval by the FIB, and the cross-sectional image is not particularly acquired. Then, when the specific portion including the specific observation object is reached by the position coordinate information, the sample is processed at a predetermined narrow interval, and the SEM cross-sectional image of the region including the specific observation object in the processed cross section is acquired.
そして、ＦＩＢの加工位置とＳＥＭ画像をセットで保存する。特定観察対象物を含んだ特定部位の画像データの取得が完了したら、断面像の取得と狭い間隔のＦＩＢ加工を終了し、次の特定部位に接近するまで広い間隔で短時間にＦＩＢ加工する。こうして全ての特定部位の断面像の取得ができたら加工を終了する。または、加工間隔を一定として対象物がない領域は断面像を取得せず、対象物がある領域で断面像を取得する。これにより、所望の情報を効率よく取得することができる。 Then, the processing position of the FIB and the SEM image are saved as a set. When the acquisition of the image data of the specific part including the specific observation object is completed, the acquisition of the cross-sectional image and the FIB processing at a narrow interval are completed, and the FIB processing is performed at a wide interval in a short time until the next specific part is approached. When the cross-sectional images of all the specific parts can be obtained in this way, the processing is completed. Alternatively, the cross-sectional image is not acquired in the region where the processing interval is constant and there is no object, but the cross-sectional image is acquired in the region where the object is present. Thereby, desired information can be efficiently acquired.
このように、本発明の断面加工観察方法によれば、光学顕微鏡筒による光学的な観察で特定観察対象物の存在する座標位置を把握しておくことによって、迅速に、かつ効率的に特定観察対象物を含む特定部位の観察を行い、特定観察対象物の３次元立体像を容易に得ることを可能にする。 As described above, according to the cross-sectional processing observation method of the present invention, by grasping the coordinate position where the specific observation object exists by optical observation with the optical microscope tube, the specific observation can be performed quickly and efficiently. By observing a specific part including an object, it is possible to easily obtain a three-dimensional stereoscopic image of the specific observation object.
本発明では、前記特定観察対象物は複数種類設定され、それぞれの特定観察対象物ごとに前記断面加工工程を行うことを特徴とする。
また、本発明では、前記光学顕微鏡として、共焦点実体顕微鏡を用いることを特徴とする。
The present invention is characterized in that a plurality of types of the specific observation object are set, and the cross-section processing step is performed for each specific observation object.
Further, the present invention is characterized in that a confocal stereomicroscope is used as the optical microscope.
また、本発明では、前記断面像取得工程において、前記断面のエネルギー分散型Ｘ線検出により前記特定観察対象物を含む前記特定部位の断面組成像を更に取得し、前記立体像生成工程において、取得した複数の前記断面組成像から前記特定観察対象物を含む３次元立体組成像を構築することを特徴とする。 Further, in the present invention, in the cross-sectional image acquisition step, a cross-sectional composition image of the specific portion including the specific observation object is further acquired by energy-dispersed X-ray detection of the cross section, and is acquired in the stereoscopic image generation step. It is characterized in that a three-dimensional three-dimensional composition image including the specific observation object is constructed from the plurality of cross-sectional composition images.
本発明の断面加工観察装置は、特定観察対象物を含む試料を載置する試料台と、前記試料に集束イオンビームを照射する集束イオンビーム鏡筒と、前記試料に電子ビームを照射する電子ビーム鏡筒と、前記試料を光学的に観察する光学顕微鏡筒と、前記試料から発生する二次電子を検出する二次電子検出器又は反射電子を検出する反射電子検出器と、前記光学顕微鏡筒によって前記試料内における前記特定観察対象物の存在位置を特定して、前記試料のうち前記特定観察対象物が存在する特定部位に向けて前記集束イオンビーム鏡筒から集束イオンビームを照射して断面を露出させ、前記断面に前記電子ビーム鏡筒から電子ビームを照射して前記特定観察対象物を含む所定の大きさの領域の画像を取得させ、前記画像から前記特定観察対象物を含む特定部位の３次元立体像を構築する制御部と、を備えたことを特徴とする。 The cross-sectional processing observation apparatus of the present invention includes a sample table on which a sample containing a specific observation object is placed, a focused ion beam lens barrel that irradiates the sample with a focused ion beam, and an electron beam that irradiates the sample with an electron beam. By the lens barrel, an optical microscope barrel for optically observing the sample, a secondary electron detector for detecting secondary electrons generated from the sample, a reflected electron detector for detecting reflected electrons, and the optical microscope barrel. The position of the specific observation object in the sample is specified, and the focused ion beam is irradiated from the focused ion beam barrel toward the specific part of the sample in which the specific observation object is present to obtain a cross section. It is exposed, and the cross section is irradiated with an electron beam from the electron beam lens barrel to acquire an image of a region of a predetermined size including the specific observation object, and the image of the specific portion including the specific observation object is obtained. It is characterized by having a control unit for constructing a three-dimensional stereoscopic image.
本発明の断面加工観察装置によれば、試料内で特定観察対象物を含む特定部位のおおよその位置座標を光学顕微鏡筒によって予め把握できるため、集束イオンビーム鏡筒による試料の加工時に、特定部位に迅速に接近して、特定部位以外の領域は粗く、特定部位は細かく集束イオンビーム筒で加工を行うことができる。これにより、特定観察対象物を含む特定部位の高分解能の断面像を、短時間で迅速に得ることができる。 According to the cross-sectional processing observation device of the present invention, the approximate position coordinates of the specific part including the specific observation object in the sample can be grasped in advance by the optical microscope tube, so that the specific part is processed when the sample is processed by the focused ion beam lens barrel. The region other than the specific region is rough, and the specific region can be finely processed with a focused ion beam tube. As a result, a high-resolution cross-sectional image of a specific part including a specific observation object can be quickly obtained in a short time.
また、本発明の断面加工観察装置によれば、集束イオンビーム鏡筒によって形成された試料断面のうち、特定観察対象物を含む特定部位だけに、電子ビーム鏡筒から電子ビームを照射して断面像のデータを取得するため、試料全域に渡って断面像を得る従来の観察装置と比較して、保存する断面像のデータ容量が格段に削減され、低コストに断面加工観察装置を構成することができる。
更に、特定観察対象物を含む特定部位の電子ビームによる断面像取得の際には、高分解能で画像化することで、試料全域に渡って断面像を得る従来の観察装置と比較して、より解像度の高い３次元立体像を生成することが可能になる。
Further, according to the cross-section processing observation apparatus of the present invention, among the cross-sections of the sample formed by the focused ion beam barrel, only a specific part including the specific observation object is irradiated with an electron beam from the electron beam barrel to form a cross-section. In order to acquire image data, the data capacity of the cross-sectional image to be stored is significantly reduced compared to the conventional observation device that obtains a cross-sectional image over the entire sample, and a cross-section processing observation device can be configured at low cost. Can be done.
Furthermore, when acquiring a cross-sectional image with an electron beam of a specific part including a specific observation object, it is possible to obtain a cross-sectional image over the entire sample by imaging with high resolution, as compared with a conventional observation device. It becomes possible to generate a three-dimensional stereoscopic image with high resolution.
また、本発明では、前記試料から発生する特性Ｘ線を検出するＥＤＳ検出器を備え、前記制御部は、前記特定部位の３次元立体組成像を構築することを特徴とする。 Further, the present invention is characterized in that an EDS detector for detecting characteristic X-rays generated from the sample is provided, and the control unit constructs a three-dimensional three-dimensional composition image of the specific portion.
本発明によれば、特定観察対象物を含む特定部位の加工を短時間で高精度に行うことができ、これにより、特定観察対象物の高分解能な３次元立体像を容易に、かつ迅速に生成することが可能になる。 According to the present invention, it is possible to process a specific part including a specific observation object with high accuracy in a short time, thereby easily and quickly producing a high-resolution three-dimensional stereoscopic image of the specific observation object. It becomes possible to generate.
以下、図面を参照して、本発明の断面加工観察方法、断面加工観察装置について説明する。なお、以下に示す各実施形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、本発明の特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。 Hereinafter, the cross-section processing observation method and the cross-section processing observation device of the present invention will be described with reference to the drawings. It should be noted that each of the embodiments shown below is specifically described in order to better understand the gist of the invention, and is not limited to the present invention unless otherwise specified. In addition, the drawings used in the following description may be shown by enlarging the main parts for convenience in order to make the features of the present invention easy to understand, and the dimensional ratios of the respective components are the same as the actual ones. Is not always the case.
（断面加工観察装置：第一実施形態）
図１は、第一実施形態の断面加工観察装置を示す概略構成図である。
本実施形態の断面加工観察装置１０は、集束イオンビーム（ＦＩＢ）鏡筒１１と、電子ビーム（ＥＢ）鏡筒１２と、光学顕微鏡（ОМ）筒１３と、ステージ（試料台）１５を備えた試料室１４とを、少なくとも有している。集束イオンビーム鏡筒１１、電子ビーム鏡筒１２、および光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３は、試料室１４にそれぞれ固定されている。
(Cross-section processing observation device: first embodiment)
FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing a cross-section processing observation device of the first embodiment.
The cross-section
集束イオンビーム鏡筒１１、電子ビーム鏡筒１２、および光学顕微鏡筒１３は、ステージ１５に載置された試料Ｓに向けて、集束イオンビーム（ＦＩＢ）２１、電子ビーム（ＥＢ）２２、および可視光（ＶＬ）２３をそれぞれ照射可能に配置されている。
The focused
集束イオンビーム鏡筒１１から照射される集束イオンビーム２１と、電子ビーム鏡筒１２から照射される電子ビーム２２とが試料Ｓ上でそれぞれ直交するように、集束イオンビーム鏡筒１１と電子ビーム鏡筒１２とを配置すると、加工された断面に対し垂直に電子ビームを照射でき、高い分解能の断面像が取得できるので、より好ましい。
Focused
ここで、試料Ｓの一例としては、樹脂等で包埋された生体試料が挙げられる。こうした生体試料に含まれる（内包された）例えば細胞などを特定観察対象物（注目部分）として観察者が特に注目して観察する。試料が透明性がある生体試料である場合、金属等の一般材料とは異なり、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３で生体試料の内部を観察することができるため、注目部の存在位置を確認できる。 Here, as an example of the sample S, a biological sample embedded in a resin or the like can be mentioned. The observer pays particular attention to observing, for example, cells contained (encapsulated) in such a biological sample as a specific observation object (part of interest). When the sample is a transparent biological sample, unlike general materials such as metals, the inside of the biological sample can be observed with an optical microscope tube (optical microscope) 13, so that the position of the attention portion can be confirmed. ..
光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３は、電子ビーム２２の照射方向とほぼ同じ方向で観察できるように配置されている。なお、光学顕微鏡筒１３の一部または全部は、試料室１４内に収容されていてもよいし、試料室１４とは別に配置された他の試料室に配置されていても良い。いずれの場合でも、電子ビームの照射方向とほぼ同じ方向で観察できるように配置することが好ましい。
The optical microscope cylinder (optical microscope) 13 is arranged so that it can be observed in substantially the same direction as the irradiation direction of the
光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３は、例えば、光源にレーザ光源を備えた共焦点実体顕微鏡を用いることが特に好適である。共焦点実体顕微鏡は、試料Ｓの高さ（深さ）方向（光学顕微鏡の光軸に沿った方向）に高分解能で画像化できる。共焦点実体顕微鏡は、表面に微小な凹凸がある試料について、その凹凸を画像化することに用いられることが大半であるが、本実施形態では、試料Ｓの内部の構造について、深さ方向に沿って高分解能の画像を取得するために用いる。 For the optical microscope cylinder (optical microscope) 13, for example, it is particularly preferable to use a confocal stereomicroscope provided with a laser light source as the light source. The confocal stereomicroscope can image the sample S in the height (depth) direction (direction along the optical axis of the optical microscope) with high resolution. A confocal stereomicroscope is mostly used to image a sample having minute irregularities on its surface, but in the present embodiment, the internal structure of the sample S is oriented in the depth direction. It is used to acquire a high-resolution image along the line.
例えば、生体試料など透明性がある試料Ｓでは、レーザ光は透過し、試料Ｓ内にレーザ光を透過しない異物や組織があれば、それらが画像化できる。なお、周知のように、試料ＳのＸＹ面画像情報は、Ｘ軸とＹ軸それぞれの方向に沿って試料Ｓ上を２次元走査する走査機構によってレーザ走査でなされ、試料の高さ（深さ）方向（Ｚ軸）の情報は、輝度が最大の時のＺ位置（試料Ｓの高さ情報）を取り込むことで３次元画像が取得される。 For example, in a transparent sample S such as a biological sample, the laser beam is transmitted, and if there is a foreign substance or tissue in the sample S that does not transmit the laser beam, they can be imaged. As is well known, the XY plane image information of the sample S is performed by laser scanning by a scanning mechanism that two-dimensionally scans the sample S along the respective directions of the X-axis and the Y-axis, and the height (depth) of the sample is obtained. As for the information in the direction (Z axis), a three-dimensional image is acquired by capturing the Z position (height information of the sample S) when the brightness is maximum.
但し、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３によって得られた画像では、画像化された特定観察対象物の背後の構造は、その特定観察対象物が不透明であるために知ることができない。このように、レーザ光が反射した最上面の形状しか知ることができないが、特定観察対象物が存在する面内位置情報（ＸＹ座標）と深さ位置情報（Ｚ座標）が得られるため、Ｃｕｔ＆Ｓｅｅ操作で、特定観察対象物が試料Ｓ内の何れに存在するかの目安を立てることができる。 However, in the image obtained by the optical microscope tube (optical microscope) 13, the structure behind the imaged specific observation object cannot be known because the specific observation object is opaque. In this way, only the shape of the uppermost surface on which the laser beam is reflected can be known, but since the in-plane position information (XY coordinates) and the depth position information (Z coordinates) where the specific observation object exists can be obtained, Cut & Seee By the operation, it is possible to establish a guideline as to where the specific observation object exists in the sample S.
一方、集束イオンビーム２１や電子ビーム２２を用いた観察の場合、試料Ｓに透明性がある場合でも、試料Ｓの最表面の形態情報しか得られないの。よって、試料Ｓの内部に特定観察対象物が存在すると事前に分かっていたとしても、その存在位置（座標）を明らかにできない。また、光学顕微鏡画像とＳＥＭ画像のコントラストの違いによってＳＥＭ画像では注目部を把握しにくい場合がある。
On the other hand, in the case of observation using the
そこで、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３を用いた光学顕微鏡観察によって、特定観察対象物を含む試料Ｓ内の小領域である特定部位の座標を、試料ＳのＣｕｔ作業（断面加工工程）に先立って取得できる。そして、この特定観察対象物を含む特定部位の座標に基づいてＣｕｔ作業（断面加工工程）を進めるが、露出した断面について電子ビーム２１によるＳＥＭ画像の取得領域を確実にするために、断面に光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３と電子ビーム２１で共通に認識できる特徴的な形態があれば、これを基準点として相対的位置関係から特定観察対象物の位置（座標）を特定することができる。
Therefore, by observing with an optical microscope using an optical microscope tube (optical microscope) 13, the coordinates of a specific part, which is a small region in the sample S including the specific observation object, are set prior to the Cut operation (cross-section processing step) of the sample S. Can be obtained. Then, the Cut operation (cross-section processing step) is carried out based on the coordinates of the specific part including the specific observation object, but in order to ensure the acquisition region of the SEM image by the
ステージ１５は、ステージ制御部１９によって制御され、試料Ｓを載置すると共に、ＸＹＺの各方向の移動、傾斜が可能であり、これによって、試料Ｓを任意の向きに調整することができる。
The
断面加工観察装置１０は、更に集束イオンビーム（ＦＩＢ）制御部１６と、電子ビーム（ＥＢ）制御部１７と、光学顕微鏡（ОМ）制御部１８とをそれぞれ備えている。集束イオンビーム制御部１６は、集束イオンビーム鏡筒１１を制御し、集束イオンビーム２１を任意のタイミングで照射させる。電子ビーム制御部１７は、電子ビーム鏡筒１２を制御し、電子ビーム２２を任意のタイミングで照射させる。
The cross-section
光学顕微鏡制御部１８は、光学顕微鏡筒１３を制御して、光学焦点の位置を移動させつつ、移動の都度、試料Ｓの観察画像を取得し、記憶する。焦点位置は光学顕微鏡筒１３の光軸に沿って、徐々に光学顕微鏡筒１３に接近させるか、遠ざけるかの一方向に微動と停止を繰り返して、停止時に試料Ｓの画像を取得する。また、光学顕微鏡筒１３の焦点位置を固定して、ステージ１５をステージ制御部１９によって上下一方向に微動させ、光学顕微鏡画像を取得しても良い。
The optical
断面加工観察装置１０は、更に二次電子検出器２０を備えている。二次電子検出器２０は、集束イオンビーム２１または電子ビーム２２を試料Ｓに照射し、試料Ｓから発生した二次電子を検出する。
The cross-section
なお、二次電子検出器２０に代えて、または二次電子検出器２０に加えて更に反射電子検出器（図示略）を設ける構成も好ましい。反射電子検出器は、電子ビームが試料Ｓで反射した反射電子を検出する。こうした反射電子によって、試料Ｓの断面像を取得することができる。
It is also preferable to provide a backscattered electron detector (not shown) in place of the
断面加工観察装置１０は、試料Ｓの断面の観察像を形成する像形成部２４と、観察像を表示する表示部２５とを備えている。像形成部２４は、電子ビーム２２を走査させる信号と、二次電子検出器２０で検出された二次電子の信号とからＳＥＭ像を形成する。表示部２５は像形成部２４で得られたＳＥＭ像を表示する。表示部２５は、例えばディスプレイ装置から構成されていればよい。
The cross-section
断面加工観察装置１０は、更に制御部２６と、入力部２７とを備える。オペレータは断面加工観察装置１０の各種制御条件を、入力部２７を介して入力する。入力部２７は、入力された情報を制御部２６に送信する。制御部２６は、集束イオンビーム制御部１６、電子ビーム制御部１７、光学顕微鏡制御部１８、ステージ制御部１９、像形成部２４などに制御信号を出力し、断面加工観察装置１０全体の動作を制御する。
The cross-section
（断面加工観察装置：第二実施形態）
上述した第一実施形態では光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３の一部または全部が試料室１４内にある構成について説明したが、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３を試料室１４の外部に設置してもよい。
図６は、本発明の第二実施形態の断面加工観察装置を示す概略構成図である。なお、第一実施形態と同様の構成には同一の番号を付し、重複する説明を省略する。断面加工観察装置３０は、試料室１４の外部に第二試料室３４が形成され、この第二試料室３４に光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）３３が配置されている。
(Cross-section processing observation device: second embodiment)
In the first embodiment described above, a configuration in which a part or all of the optical microscope tube (optical microscope) 13 is inside the
FIG. 6 is a schematic configuration diagram showing a cross-section processing observation device according to a second embodiment of the present invention. The same configuration as that of the first embodiment is assigned the same number, and duplicate description will be omitted. In the cross-sectional
光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）３３の一部または全部が設置された第二試料室３４は、内部が真空または大気圧にされる。集束イオンビームや電子ビームが照射される試料室１４は、内部が真空でなければならないが、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）３３の設置環境は大気圧下でも差支えないので、第二試料室３４を大気圧環境にすることで、真空となる試料室１４の容積を小さくでき、真空排気の効率を高めることができる。
The inside of the
試料室１４と第二試料室３４との間の試料Ｓの移動は、試料Ｓを載置する試料ホルダ３５と共に搬送棒３６によって行なう。移動に際しては、搬送棒３６を試料ホルダ３５に固定して気密扉（バルブ）３７を開けた後、第二試料室３４のステージ３８から外した試料ホルダ３５を搬送棒３６によって試料室１４に押し込み、試料室１４内のステージ１５上に試料ホルダ３５を固定する。
The movement of the sample S between the
試料室１４のステージ１５と、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）３３を備えた第二試料室３４のステージ３８は、それぞれステージ制御部３９ａ、３９ｂによって制御される。ステージ１５、３８での座標情報は制御部２６に保存され、第二試料室３４のステージ３８で得られた座標情報に基づいて、試料室１４のステージ１５を連動させることができる。なお、図６では、集束イオンビーム制御部や電子ビーム制御部などの記載を省略しているが、図１同様の構成である。
The
（断面加工観察装置：第三実施形態）
上述した第二実施形態では光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３を試料室１４とは別に設けた第二試料室３４配置した構成について説明したが、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３を設置する試料室を形成しなくてもよい。
図７は、本発明の第三実施形態の断面加工観察装置を示す概略構成図である。なお、第二実施形態と同様の構成には同一の番号を付し、重複する説明を省略する。断面加工観察装置４０は、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）４３が試料室１４の外部に独立して配置されてるいる。そして、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）４３で得た試料Ｓ内の特定観察対象物（注目部分）の座標を、集束イオンビーム制御部や電子ビーム制御部（図１を参照）でも読み取れるように、一部共通化された制御部４６を有する。試料室１４の外部に独立して光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）４３を設けることにより、例えば、それぞれを別室に設置して作業を行なうなど、機器の設置面での自由度が高められる。
(Cross-section processing observation device: third embodiment)
In the second embodiment described above, the configuration in which the
FIG. 7 is a schematic configuration diagram showing a cross-section processing observation device according to a third embodiment of the present invention. The same number will be assigned to the same configuration as in the second embodiment, and duplicate description will be omitted. In the cross-section
（断面加工観察装置：第四実施形態）
図１０は、本発明の第四実施形態の断面加工観察装置を示す概略構成図である。なお、第一実施形態と同様の構成には同一の番号を付し、重複する説明を省略する。断面加工観察装置５０は、電子ビーム（ＥＢ）を試料Ｓに照射した際に、試料Ｓから生じたＸ線を検出するＥＤＳ検出器５１と、このＥＤＳ検出器５１を制御するＥＤＳ制御部５２とを備えている。試料Ｓから発生するＸ線は、試料Ｓを構成する物質ごとに特有の特性Ｘ線を含み、こうした特性Ｘ線によって、試料Ｓを構成する物質（組成）を特定することができる。
(Cross-section processing observation device: Fourth embodiment)
FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing a cross-sectional processing observation device according to a fourth embodiment of the present invention. The same configuration as that of the first embodiment is assigned the same number, and duplicate description will be omitted. The cross-section processing observation device 50 includes an
像形成部２４は、電子ビーム２２の走査信号と、ＥＤＳ検出器５１で検出した特性Ｘ線の信号とから、試料Ｓの特定断面の組成像を形成する。制御部２６は、複数の組成像に基づいて３次元立体組成像を構築する。なお、組成像（ＥＤＳ像）とは、検出した特性Ｘ線のエネルギーから各電子ビーム照射点における試料Ｓの物質を特定し、電子ビーム２２の照射領域の物質の分布を示したものである。
The
第四実施形態の断面加工観察装置５０を用いることにより、試料Ｓにおける特定部位の３次元組成マップを構築することができる。なお、こうした第四実施形態の断面加工観察装置５０を用いて３次元組成マップを構築する方法は、後述する断面加工観察方法の第四実施形態で説明する。 By using the cross-section processing observation device 50 of the fourth embodiment, it is possible to construct a three-dimensional composition map of a specific part in the sample S. A method of constructing a three-dimensional composition map using the cross-section processing observation device 50 of the fourth embodiment will be described in the fourth embodiment of the cross-section processing observation method described later.
なお、第四実施形態の断面加工観察装置５０では、ＥＤＳ検出器５１とともに光学顕微鏡筒１３や二次電子検出器２０も備えているが、光学顕微鏡筒１３や二次電子検出器２０を省略することもできる。
The cross-sectional processing observation device 50 of the fourth embodiment includes the
（断面加工観察方法：第一実施形態）
次に、上述した断面加工観察装置を用いた、本発明の第一実施形態の断面加工観察方法を、図１、図２を参照しつつ説明する。
図２は、断面加工観察方法の一実施形態を段階的に示したフローチャートである。
まず、対象とする試料Ｓを光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３によって観察して、試料Ｓ内に含まれる特定観察対象物（注目部分）の位置（ＸＹＺ座標）情報を取得する（位置情報取得工程Ｓ１０）。試料Ｓは、例えば生体試料である。対象となる試料Ｓは、予め樹脂などで包埋して固定され、また、乾燥、脱水などの処理がなされている。こうした包埋作業や脱水作業などの生体試料作製工程は、公知の技術を用いればよい。
(Cross-section processing observation method: first embodiment)
Next, the cross-section processing observation method of the first embodiment of the present invention using the cross-section processing observation device described above will be described with reference to FIGS. 1 and 2.
FIG. 2 is a flowchart showing one embodiment of the cross-section processing observation method step by step.
First, the target sample S is observed with an optical microscope tube (optical microscope) 13, and the position (XYZ coordinates) information of the specific observation target (attention portion) contained in the sample S is acquired (position information acquisition step). S10). Sample S is, for example, a biological sample. The target sample S is embedded and fixed in advance with a resin or the like, and has been subjected to treatments such as drying and dehydration. A known technique may be used for the biological sample preparation steps such as the embedding work and the dehydration work.
このような処理をされた試料ＳをＳＥＭ観察すると、試料Ｓの表面の画像は取得できるが試料Ｓの内部の画像は取得できない。しかし、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３によって観察すると、生物など透明性がある試料Ｓでは光は透過し、試料Ｓ内に光を透過しない異物や組織などの特定観察対象物（注目部分）は、コントラストの違いによって可視化できる。 When the sample S treated in this way is observed by SEM, an image of the surface of the sample S can be obtained, but an image of the inside of the sample S cannot be obtained. However, when observed with an optical microscope tube (optical microscope) 13, light is transmitted in the transparent sample S such as a living body, and a specific observation object (part of interest) such as a foreign substance or a tissue that does not transmit light is present in the sample S. , Can be visualized by the difference in contrast.
図３（Ａ）は、試料Ｓを光学顕微鏡筒１３によって観察した際の光学顕微鏡画像（模式図）である。試料Ｓの表面から所定の深さまで焦点位置を変えて観察した画像の投影図であり、視野内に現れた特定観察対象物（注目部分）Ｃ１、Ｃ２を１枚の画面に表示している。光学顕微鏡画像のＸＹ座標を図３Ａの左下に記載した座標系として、特定観察対象物Ｃ１のほぼ中心座標が（Ｘ１，Ｙ１）で、特定観察対象物Ｃ２のほぼ中心座標が（Ｘ２，Ｙ２）である。
FIG. 3A is an optical microscope image (schematic diagram) when the sample S is observed by the
図３（Ｂ）は、図３（Ａ）と同一の試料Ｓの同じ視野について、深さ方向を示す光学顕微鏡画像（模式図）である。試料の深さ方向をＺ座標とし、試料Ｓの表面Ｚ０から観察底面Ｚｎまでを表示している。光学顕微鏡筒１３の焦点を表面から順次、試料Ｓの内部（深さ方向Ｚ）に向かうように調整し、各焦点位置での光学顕微鏡画像をその時のＺ座標と共に制御部２６に記憶させる。
FIG. 3B is an optical microscope image (schematic diagram) showing the depth direction of the same field of view of the same sample S as in FIG. 3A. The depth direction of the sample is the Z coordinate, and the area from the surface Z0 of the sample S to the observation bottom surface Zn is displayed. The focal point of the
そして、光学顕微鏡筒１３による光学顕微鏡画像（平面像）の取得を試料Ｓの表面から所定の観察底面Ｚｎまで繰り返し行なう。こうして得られた複数の光学顕微鏡画像（平面像）を合成（画像処理）することで、試料Ｓの３次元画像が再生され、試料Ｓにおける特定観察対象物（注目部分）Ｃ１，Ｃ２の深さ方向Ｚの存在位置（座標）を把握することができる。このように、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３を用いて、ＸＹ座標を固定して光学焦点位置を変えながら試料Ｓを観察することで、特定観察対象物（注目部分）の試料Ｓ内における、おおよその３次元座標を明らかにすることができる。
Then, the acquisition of the optical microscope image (planar image) by the
次に、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３によって得られた特定観察対象物（注目部分）のＸＹ座標情報を基に、集束イオンビーム鏡筒１１から集束イオンビーム２１を照射して、対象となる試料Ｓの断面形成加工を行なう（断面加工工程Ｓ１１）。
図４（Ａ）は、図３（Ａ）に示した特定観察対象物Ｃ１と特定観察対象物Ｃ２について、ＳＥＭ画像の取得領域となる特定部位（画像取得領域）を示す模式図である。図４（Ａ）の場合、特定観察対象物Ｃ１の画像取得領域（特定部位）は、特定観察対象物Ｃ１のほぼ中心座標である（Ｘ１，Ｙ１）を中心に、特定観察対象物の最外端部から所定の距離を加えた長さを一辺ΔＸ１、ΔＹ１とする矩形領域としている。同様に、特定観察対象物Ｃ２の画像取得領域は、座標（Ｘ２，Ｙ２）を中心に、特定観察対象物の最外端部から所定の距離を加えた長さを一辺ΔＸ２、ΔＹ２とする矩形領域としている。
Next, based on the XY coordinate information of the specific observation object (part of interest) obtained by the optical microscope tube (optical microscope) 13, the
FIG. 4A is a schematic diagram showing specific parts (image acquisition areas) serving as SEM image acquisition areas for the specific observation object C1 and the specific observation object C2 shown in FIG. 3A. In the case of FIG. 4A, the image acquisition region (specific part) of the specific observation object C1 is the outermost part of the specific observation object, centered on (X1, Y1), which is approximately the center coordinates of the specific observation object C1. The length obtained by adding a predetermined distance from the end portion is defined as a rectangular region having one side ΔX1 and ΔY1. Similarly, the image acquisition region of the specific observation object C2 is a rectangle whose sides are ΔX2 and ΔY2, with the coordinates (X2, Y2) as the center and the length obtained by adding a predetermined distance from the outermost end of the specific observation object. It is an area.
この所定の長さとは、特定観察対象物を含む領域を３次元表示した時の余裕領域であり、この余裕領域が過剰に大きいと特定観察対象物の３次元像が小さくなり、余裕が無さ過ぎると断面の表示方向によっては、見にくくなる場合があるので、操作者は事前にこの余裕領域を特定観察対象物の見え方に応じて適切に定めておけば良い。例えば、特定観察対象物の投影図のＸＹ方向のそれぞれの長さの約１０％増を画像取得範囲とすれば良い。 This predetermined length is a margin area when the area including the specific observation object is displayed in three dimensions, and if this margin area is excessively large, the three-dimensional image of the specific observation object becomes small and there is no margin. If it exceeds the limit, it may be difficult to see depending on the display direction of the cross section. Therefore, the operator may appropriately determine this margin area in advance according to the appearance of the specific observation object. For example, the image acquisition range may be an increase of about 10% in each length of the projection drawing of the specific observation object in the XY directions.
図４（Ｂ）は、試料Ｓの深さ方向Ｚの投影図であり、この画像から集束イオンビーム２１によって狭い間隔で試料Ｓの断面を露出する加工領域を決定する。ここで、図４（Ｂ）において、特定観察対象物Ｃ１が観察視野に現れる出現位置（特定観察対象物の上部）をＺ１１、特定観察対象物Ｃ１が観察視野から消える消滅位置（特定観察対象物の下部）をＺ１２とし、同様に特定観察対象物Ｃ２の出現位置Ｚ２１、特定観察対象物Ｃ２の消滅位置をＺ２２とする。
FIG. 4B is a projection drawing of the sample S in the depth direction Z, and from this image, a processing region for exposing the cross section of the sample S at narrow intervals is determined by the
集束イオンビーム２１により試料Ｓを密な間隔で薄く加工する範囲は、例えば、特定観察対象物の出現座標と消滅位置に、予め定めた長さを加えた長さと決める。所定の長さとは、特定観察対象物を含む部分を３次元表示した時の余裕領域であり、Ｚ方向についても、例えば、特定観察対象物Ｃ１のＺ方向長さ（Ｚ１２−Ｚ１１）の１０％を余裕領域とし、Ｚ座標Ｚ１１の上部、Ｚ座標Ｚ１２の下部にこの余裕領域を加えたＺ座標Ｚ１ＡからＺ１Ｂまでを加工領域とする。特定観察対象物Ｃ２についても同様に、Ｚ座標Ｚ２ＡからＺ２Ｂまでを集束イオンビーム２１により試料Ｓを密な等間隔で加工する断面加工範囲とする。
The range in which the sample S is thinly processed by the
こうした集束イオンビーム２１による試料Ｓの加工間隔は、なるべく狭い方が特定観察対象物の構築した３次元像のＺ方向の分解能が高くなる。反面、特定観察対象物がＺ方向に極端に長い場合は、ＳＥＭ画像の取得枚数が多くなり、蓄積される画像データが大きくなる。このため、特定観察対象物の大きさを光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３による観察で予め把握しておき、蓄積される画像データ容量と構築される特定観察対象物の３次元像に必要とされる分解能を予め検討したうえで、集束イオンビーム２１による加工間隔を定めることが好ましい。
The narrower the processing interval of the sample S by the
こうした狭い間隔での加工範囲の外側のＺ座標のＺ０からＺ１Ａ，Ｚ１ＢからＺ２Ａ、Ｚ２ＢからＺｎの間は、粗い間隔で短時間に集束イオンビーム２１による断面加工を行えば良い。また、この領域では、特定観察対象物が存在しないことが分かっているため、ＳＥＭ画像を敢えて取得する必要はない。これにより、試料Ｓの断面加工の時間短縮とＳＥＭ画像の記憶容量の削減を図ることができる。または、一定の間隔で断面加工を行い、特定観察対象物が存在する場合に画像取得し、対象物が存在しない場合は画像取得しないとすることによっても時間短縮及び記憶容量の削減をすることができる。
Cross-section processing by the
次に、加工した試料Ｓの断面のうち、特定観察対象物を含む特定部位のＳＥＭ画像を取得し、断面位置情報と共に保存する（断面像取得工程Ｓ１２）。光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３による観察で得られた特定観察対象物の存在位置の座標を基に、特定観察対象物の座標を含む小領域である特定部位のＳＥＭ画像を取得する。そして、集束イオンビーム２１による加工位置とＳＥＭ画像、断面内のＸＹ座標（例えばＳＥＭ画像中心の座標）をセットで保存する。例えば、１つの断面に複数の特定観察対象物が存在する場合、それぞれの特定観察対象物を含む特定部位のＳＥＭ画像を取得する。
Next, among the cross-sections of the processed sample S, an SEM image of a specific part including a specific observation object is acquired and stored together with the cross-sectional position information (cross-sectional image acquisition step S12). Based on the coordinates of the existence position of the specific observation object obtained by the observation with the optical microscope cylinder (optical microscope) 13, an SEM image of a specific part which is a small area including the coordinates of the specific observation object is acquired. Then, the processing position by the
次に、特定観察対象物の画像取得が完了したかを判断する（Ｓ１３）。集束イオンビーム２１による加工が予め定めた加工終了のＺ座標（例えばＺ１Ｂ）に達したかの判断を行う。そして、所定の到達位置に達したと判断されたら、特定観察対象物を含む特定部位の画像データの取得を完了させる。
Next, it is determined whether or not the image acquisition of the specific observation object is completed (S13). It is determined whether or not the processing by the
そして、画像取得と狭い間隔での集束イオンビーム２１による加工を終了し、次の特定観察対象物の存在する領域に接近するまで、広い間隔で集束イオンビーム２１による断面加工を行う。また、次の特定観察対象物が無ければ加工を終了する。
Then, the image acquisition and the processing by the
このように、光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３を用いた観察によって、予め試料内の特定観察対象物の存在位置（座標）が把握できるため、特定観察対象物を含む特定部位に達するまでの加工を、広い加工幅で迅速に行なうことができる。また、特定観察対象物の存在しない部分での画像取得を行わないので、観察時間を最小限にするとともに、画像の記憶領域を小さくすることができる。また、断面の情報をより詳細に取得することができる。また、加工幅を一定としても画像取得の有無を設定できるので時間も記憶領域も小さくすることができる。 In this way, by observing with the optical microscope tube (optical microscope) 13, the existing position (coordinates) of the specific observation object in the sample can be grasped in advance, so that the processing until the specific part including the specific observation object is reached. Can be performed quickly with a wide processing width. Further, since the image is not acquired in the portion where the specific observation object does not exist, the observation time can be minimized and the storage area of the image can be reduced. In addition, cross-sectional information can be obtained in more detail. Further, even if the processing width is constant, the presence or absence of image acquisition can be set, so that the time and storage area can be reduced.
次に、断面位置情報と画像データを利用して、特定観察対象物の３次元像を構築する（立体像生成工程Ｓ１４）。ここでは、例えば、コンピュータ（制御部２６）を用いて、特定観察対象物を含む特定部位の複数の断面像から、画像処理プログラムによって特定観察対象物の３次元立体像を生成（構築）する。 Next, a three-dimensional image of the specific observation object is constructed by using the cross-sectional position information and the image data (three-dimensional image generation step S14). Here, for example, a computer (control unit 26) is used to generate (construct) a three-dimensional stereoscopic image of the specific observation object from a plurality of cross-sectional images of the specific portion including the specific observation object by an image processing program.
立体像生成工程Ｓ１４によって得られた特定観察対象物の３次元立体像は、特定観察対象物を任意の視点から自在に観察することができ、また、任意の断面像を再生することもできるため、例えば、細胞の内部構造をＳＥＭの分解能で観察することが可能になる。 Since the three-dimensional stereoscopic image of the specific observation object obtained in the stereoscopic image generation step S14 can freely observe the specific observation object from an arbitrary viewpoint and can reproduce an arbitrary cross-sectional image. For example, it becomes possible to observe the internal structure of a cell with SEM resolution.
上述した断面加工観察方法の変形例として、図５のフローチャートに示すように、特定観察対象物のＳＥＭ画像の取得完了後に、更に、３次元立体像構築をすべき特定観察対象物が存在するか否かの断定工程（Ｓ１５）を設けることも好ましい。 As a modification of the cross-section processing observation method described above, as shown in the flowchart of FIG. 5, is there a specific observation object for which a three-dimensional stereoscopic image should be constructed after the acquisition of the SEM image of the specific observation object is completed? It is also preferable to provide a step (S15) for determining whether or not to do so.
上述した実施形態では、特定観察対象物（注目部分）が２つある場合を挙げて説明した。光学顕微鏡観察の結果、特定観察対象物がＣ１のみであると決めれば、集束イオンビーム２１による断面加工が、Ｚ座標Ｚ１Ｂに達した時点が加工は終了する。しかし、図３、図４のように特定観察対象物が複数個ある場合、図５に示すフローチャートに従い、集束イオンビーム２１による断面加工が狭い間隔の加工を終えた時点（Ｚ座標Ｚ１Ｂに達した時点）で、次に、他の特定観察対象物の有無の判断を下す（Ｓ１５）。そして、他の特定観察対象物が存在する場合には、断面加工工程Ｓ１１と断面像取得工程Ｓ１２とを繰り返し実行する。また、他の特定観察対象物が無い場合には、特定観察対象物の立体像生成工程Ｓ１４によって３次元立体像を生成する。
In the above-described embodiment, the case where there are two specific observation objects (parts of interest) has been described. As a result of optical microscope observation, if it is determined that the specific observation object is only C1, the processing is completed when the cross-sectional processing by the
（断面加工観察方法：第二実施形態）
上述した第一実施形態では、特定観察対象物（注目部分）が複数存在する最も簡単な例として、互いに離れて存在して、或る断面には１つの特定観察対象物しか現れない例について説明したが、本発明はこれに限定されるものでは無い。
本実施形態は、複数の特定観察対象物（注目部分）が同一のＸＹ面内（同じＺ座標）に共存する場合で、こうした試料の観察にも本発明を適用することができる。
図８は、対象となる試料を予め光学顕微鏡で観察して得られた画像情報から作成した、ＸＹ面の断面（Ｚ視点）とＸＺ面（Ｙ視点）の投影図（模式図）である。なお、図８において、図２と同じ符号は同一の構成であり、重複する説明は省略する。
(Cross-section processing observation method: second embodiment)
In the first embodiment described above, as the simplest example in which a plurality of specific observation objects (parts of interest) exist, an example in which they exist apart from each other and only one specific observation object appears in a certain cross section will be described. However, the present invention is not limited to this.
In the present embodiment, when a plurality of specific observation objects (parts of interest) coexist in the same XY plane (same Z coordinate), the present invention can be applied to the observation of such a sample.
FIG. 8 is a projection drawing (schematic diagram) of a cross section (Z viewpoint) and an XZ plane (Y viewpoint) of the XY plane, which is created from image information obtained by observing the target sample with an optical microscope in advance. Note that, in FIG. 8, the same reference numerals as those in FIG. 2 have the same configuration, and duplicate description will be omitted.
本実施形態では、特定観察対象物Ｃ３、Ｃ４が同じＺ座標に共存し、片方の特定観察対象物が他方に比べて小さい。加工断面がＺ座標Ｚ３１に達した時、特定観察対象物Ｃ３が断面に出現する。この時、上述した方法と同様に、特定観察対象物Ｃ３について予め定めた観察領域である特定部位のＳＥＭ像を取得し始め、かつ、予め定めたタイミングと間隔で集束イオンビーム２１による断面加工を開始する。
In the present embodiment, the specific observation objects C3 and C4 coexist at the same Z coordinate, and one specific observation object is smaller than the other. When the processed cross section reaches the Z coordinate Z31, the specific observation object C3 appears in the cross section. At this time, similarly to the method described above, the SEM image of the specific portion, which is the observation region defined in advance, is started to be acquired for the specific observation object C3, and the cross-section is processed by the
特定観察対象物Ｃ３について加工と画像取得とを進める途中で、加工断面がＺ座標Ｚ４１に達した時、別の特定観察対象物Ｃ４が出現する。特定観察対象物Ｃ４は事前の光学顕微鏡観察で、Ｚ方向に長い対象物であることが予め分かっている。図８に示す例では、Ｚ座標Ｚ４１からＺ座標Ｚ３２は特定観察対象物Ｃ３と特定観察対象物Ｃ４とが同一断面に露出していることになる。 When the processed cross section reaches the Z coordinate Z41 in the middle of processing and image acquisition for the specific observation object C3, another specific observation object C4 appears. It is known in advance that the specific observation object C4 is an object long in the Z direction by observation with an optical microscope in advance. In the example shown in FIG. 8, the Z coordinate Z41 to the Z coordinate Z32 mean that the specific observation object C3 and the specific observation object C4 are exposed in the same cross section.
Ｚ座標Ｚ４１からＺ座標Ｚ３２の間の集束イオンビーム２１による断面加工間隔は、特定観察対象物Ｃ３に対応した間隔で集束イオンビーム２１による断面加工を行なうが、特定観察対象物Ｃ３が消滅したＺ座標Ｚ３２以降も同一の加工間隔でＺ座標Ｚ４２まで加工を継続させる。同一の特定観察対象物の加工間隔を途中で変えると、最終的に構築した３次元立体像に視覚的な違和感が生じるためである。また、特定観察対象物Ｃ３と特定観察対象物Ｃ４との３次元立体像を比較するような場合でも、同一の加工間隔にすることで、Ｚ方向を同じ分解能で比較することができる。
The cross-sectional processing interval by the
このようにして、特定観察対象物Ｃ３と特定観察対象物Ｃ４の画像と、加工間隔の情報を保存することでこれらの情報から、特定観察対象物Ｃ３と特定観察対象物Ｃ４の３次元立体像を構築することができる。 In this way, by storing the images of the specific observation object C3 and the specific observation object C4 and the information of the processing interval, the three-dimensional stereoscopic image of the specific observation object C3 and the specific observation object C4 is obtained from these information. Can be built.
（断面加工観察方法：第三実施形態）
上述した第一実施形態では、特定観察対象物（注目部分）が１つの曲線に沿って存在する例について説明したが、本発明は、特定観察対象物が複数に枝分かれしている場合でも適用できる。また、複数の特定観察対象物が合体する場合でも適用できる。
図９は、対象となる試料を予め光学顕微鏡で観察して得られた、ＸＹ面の断面（Ｚ方向視点）とＸＺ面（Ｙ方向視点）の投影図（模式図）である。なお、図９において、図２と同じ符号は同一の構成であり、重複する説明は省略する。
(Cross-section processing observation method: Third embodiment)
In the first embodiment described above, an example in which the specific observation object (part of interest) exists along one curve has been described, but the present invention can be applied even when the specific observation object is branched into a plurality of branches. .. It can also be applied when a plurality of specific observation objects are united.
FIG. 9 is a projection drawing (schematic view) of a cross section of the XY plane (viewpoint in the Z direction) and a plane of XZ (viewpoint in the Y direction) obtained by observing the target sample with an optical microscope in advance. Note that, in FIG. 9, the same reference numerals as those in FIG. 2 have the same configuration, and duplicate description will be omitted.
特定観察対象物Ｃ５はＹ字のように途中で枝分かれした形状であり、それぞれの枝部の太さが一定でないことが、予め光学顕微鏡による観察で把握されている。ここで、枝部を図９のようにそれぞれＣ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ５ｃとする。 The specific observation object C5 has a shape that branches in the middle like a Y shape, and it is known in advance by observation with an optical microscope that the thickness of each branch is not constant. Here, the branches are C5a, C5b, and C5c, respectively, as shown in FIG.
まず、試料Ｓの表面（Ｚ座標Ｚ０）から集束イオンビーム２１によって断面を作製し始め、Ｚ座標Ｚ５ａ１で特定観察対象物Ｃ５の枝部Ｃ５ａが出現する。予め定めた集束イオンビーム２１の加工間隔とＳＥＭ観察領域によって、加工と観察を続ける。試料Ｓの加工断面がＺ座標Ｚ５ｂ１に達した時、特定観察対象物Ｃ５の枝部Ｃ５ｂが出現する。
First, a cross section is started to be formed from the surface of the sample S (Z coordinate Z0) by the
この時、加工断面には、枝部Ｃ５ａと枝部Ｃ５ｂが共存している。枝部Ｃ５ａと枝部Ｃ５ｂが合体するＺ座標Ｚ５ｃ１までは、枝部Ｃ５ａと枝部Ｃ５ｂが同じ断面に共存する場合、それぞれの特定観察対象物の大きさに合わせて予め定めた観察領域（特定部位）に従って、ＳＥＭ画像を取得する。集束イオンビーム２１の加工間隔は、最初に出現した特定観察対象物の大きさに従い、特定観察対象物が消滅するまで維持することが望ましい。
At this time, the branch portion C5a and the branch portion C5b coexist on the processed cross section. Up to the Z coordinate Z5c1 where the branch C5a and the branch C5b are united, when the branch C5a and the branch C5b coexist in the same cross section, a predetermined observation area (specific) is set according to the size of each specific observation object. The SEM image is acquired according to the site). It is desirable that the processing interval of the
また、ＳＥＭによる観察領域は、特定観察対象物の断面積に応じて適宜変更しても構わない。図９の場合、Ｚ座標Ｚ５Ｃ１からＺ座標Ｚ５２の間は枝部Ｃ５ｃの断面積は徐々に小さくなるが、枝部Ｃ５ｃの断面積に応じて、予め定めた基準に合わせて観察領域をその都度、変更しても良い。これによって、特定観察対象物が存在しない領域の画像データ量を削減することができる。また、本実施形態の断面加工観察方法によれば、特定観察対象物の形状が不定形であっても、試料内の特定観察対象物を高分解能で３次元立体表示することができ、かつ、記録される画像データ容量を削減することができる。また、加工条件、観察条件が異なる複数の特定観察対象物が合体する場合は、加工間隔が密な方、分解能が高い方にそれぞれ合わせる。これにより複数の対象物が合体する場合でも、自動的に所望の条件の観察情報を取得することができる。 Further, the observation area by SEM may be appropriately changed according to the cross-sectional area of the specific observation object. In the case of FIG. 9, the cross-sectional area of the branch portion C5c gradually decreases between the Z coordinate Z5C1 and the Z coordinate Z52, but the observation area is set each time according to a predetermined standard according to the cross-sectional area of the branch portion C5c. , May be changed. As a result, the amount of image data in the area where the specific observation object does not exist can be reduced. Further, according to the cross-section processing observation method of the present embodiment, even if the shape of the specific observation object is indefinite, the specific observation object in the sample can be three-dimensionally displayed with high resolution in three dimensions. The amount of recorded image data can be reduced. In addition, when a plurality of specific observation objects having different processing conditions and observation conditions are combined, the processing interval is adjusted to the one with the denser processing interval and the one with the higher resolution, respectively. As a result, even when a plurality of objects are united, observation information under desired conditions can be automatically acquired.
（断面加工観察方法：第四実施形態）
図１０に示した断面加工観察装置を用いた、本発明の断面加工観察方法の第四実施形態を、図１０〜図１４を参照しつつ説明する。
図１１、図１２、図１３、図１４は、本発明の断面加工観察方法の第四実施形態における観察手順を段階的に示した説明図である。
まず、Ｘ線ＣＴ装置において、試料ＳのＸ線ＣＴ画像を得る。
(Cross-section processing observation method: Fourth embodiment)
A fourth embodiment of the cross-section processing observation method of the present invention using the cross-section processing observation device shown in FIG. 10 will be described with reference to FIGS. 10 to 14.
11, FIG. 12, FIG. 13, and FIG. 14 are explanatory views showing step by step the observation procedure in the fourth embodiment of the cross-section processing observation method of the present invention.
First, an X-ray CT image of sample S is obtained in an X-ray CT apparatus.
そして、図１１に示すように、この試料ＳのＸ線ＣＴ画像を観察して、試料Ｓ内に含まれる特定観察対象物（注目部分）Ｃ１１を含む試料Ｓ内の小領域である特定部位（関心領域）Ｑを決定し、その３次元位置座標（ＸＹＺ座標）情報を取得する（位置情報取得工程）。 Then, as shown in FIG. 11, by observing the X-ray CT image of the sample S, a specific portion (a specific portion) which is a small region in the sample S including the specific observation object (attention portion) C11 contained in the sample S (the specific portion). The region of interest) Q is determined, and the three-dimensional position coordinate (XYZ coordinate) information thereof is acquired (position information acquisition step).
次に、特定部位Ｑの３次元位置座標情報に基づいて、特定観察対象物Ｃ１１が存在する特定部位Ｑに向けて、集束イオンビーム鏡筒１１から集束イオンビーム２１を照射して、試料Ｓの特定部位Ｑの断面形成加工を行なう（断面加工工程）。こうした集束イオンビーム２１による試料Ｓの断面形成加工の詳細は、第一実施形態と同様である。
Next, based on the three-dimensional position coordinate information of the specific part Q, the
そして、所定の間隔ごとに加工した試料Ｓの断面のうち、特定観察対象物Ｃ１１を含む特定部位Ｑに向けて電子ビーム（ＥＢ）鏡筒１２から電子ビーム（ＥＢ）２２を照射して、試料Ｓの特定部位Ｑから発生した特性Ｘ線をＥＤＳ検出器５１で検出する。そして、図１２に示すように、試料Ｓの各断面ごとに断面組成像を構築する。この時、特定部位Ｑのある断面全体の組成像と、特定観察対象物Ｃ１１を含む小領域の高分解能の組成像とを取得することができる。
Then, among the cross sections of the sample S processed at predetermined intervals, the electron beam (EB) 22 is irradiated from the electron beam (EB)
例えば、図１２に示す例では、特定部位Ｑに３つの断面Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３を予め設定して、このそれぞれの断面を集束イオンビーム２１によって加工する。そして、断面Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３のそれぞれにおいて、断面全体の組成像Ｋ１ａ，Ｋ２ａ，Ｋ３ａと、特定観察対象物Ｃ１１を含む小領域の高分解能断面組成像Ｋ１ｂ，Ｋ２ｂ，Ｋ３ｂを取得する。図１２の例では、矩形に設定された特定部位Ｑの断面Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３において、断面全体の組成像Ｋ１ａ，Ｋ２ａ，Ｋ３ａには、成分Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３の中に特定観察対象物（注目部分）Ｃ１１がある。そして、高分解能断面組成像Ｋ１ｂ，Ｋ２ｂ，Ｋ３ｂによれば、特定観察対象物Ｃ１１は、成分Ｇ４，Ｇ５，Ｇ６から構成されている。
For example, in the example shown in FIG. 12, three cross sections F1, F2, and F3 are preset in the specific portion Q, and each cross section is processed by the
なお、こうした特定部位Ｑの各加工断面においては、断面全体の断面組成像だけを取得してもよく、また、２つ以上の特定観察対象物がある場合には、２箇所以上の高分解能断面組成像を取得することもできる。また、特定部位Ｑの全ての加工断面で断面組成像を取得しても、あるいは、特定の断面だけ、選択的に断面組成像を取得してもよい。 In each processed cross section of the specific portion Q, only the cross-sectional composition image of the entire cross section may be acquired, and when there are two or more specific observation objects, two or more high-resolution cross sections are obtained. It is also possible to obtain a composition image. Further, the cross-sectional composition image may be acquired for all the processed cross sections of the specific portion Q, or the cross-sectional composition image may be selectively acquired only for the specific cross section.
以上の様な工程によって、例えば、図１３に示すように、特定部位Ｑの３つの断面Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３において、断面全体の組成像Ｋ１ａ，Ｋ２ａ，Ｋ３ａと、特定観察対象物Ｃ１１を含む小領域の高分解能断面組成像Ｋ１ｂ，Ｋ２ｂ，Ｋ３ｂが得られる。 By the above steps, for example, as shown in FIG. 13, in the three cross sections F1, F2, F3 of the specific portion Q, the composition images K1a, K2a, K3a of the entire cross section and the small object including the specific observation object C11 are included. High-resolution cross-sectional composition images K1b, K2b, and K3b of the region can be obtained.
次に、試料Ｓの断面位置情報と、それぞれの断面Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３での組成像Ｋ１ａ，Ｋ２ａ，Ｋ３ａと、高分解能断面組成像Ｋ１ｂ，Ｋ２ｂ，Ｋ３ｂとを利用して、図１４に示すような特定観察対象物を含む特定部位Ｑの３次元立体組成像Ｒを構築する（立体像生成工程）ここでは、例えば、コンピュータ（制御部２６）を用いて、画像処理プログラムによって特定観察対象物を含む特定部位Ｑの３次元立体組成像を生成（構築）する。 Next, FIG. 14 shows the cross-sectional position information of the sample S, the composition images K1a, K2a, and K3a in the respective cross-sections F1, F2, and F3, and the high-resolution cross-sectional composition images K1b, K2b, and K3b. A three-dimensional three-dimensional composition image R of a specific part Q including such a specific observation object is constructed (three-dimensional image generation step). Here, for example, a computer (control unit 26) is used by an image processing program to construct a specific observation object. A three-dimensional three-dimensional composition image of a specific part Q including the above is generated (constructed).
立体像生成工程によって得られた３次元立体組成像Ｒは、特定部位Ｑ全体の成分を示す立体組成像と、特定観察対象物を高分解能で分析した高分解能立体組成像とを合成したものからなる。 The three-dimensional composition image R obtained by the three-dimensional image generation step is obtained by synthesizing a three-dimensional composition image showing the components of the entire specific part Q and a high-resolution three-dimensional composition image obtained by analyzing a specific observation object with high resolution. Become.
以上のように、それぞれの加工断面において特性Ｘ線をＥＤＳ検出器５１で検出することにより断面組成像を取得することで、特定観察対象物を含む特定部位Ｑの３次元立体組成像Ｒを得ることができる。
As described above, by acquiring the cross-sectional composition image by detecting the characteristic X-rays in each processed cross section with the
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。 Although some embodiments of the present invention have been described, these embodiments are presented as examples and are not intended to limit the scope of the invention. These embodiments can be implemented in various other forms, and various omissions, replacements, and changes can be made without departing from the gist of the invention. These embodiments and modifications thereof are included in the scope and gist of the invention, as well as in the scope of the invention described in the claims and the equivalent scope thereof.
１０ 断面加工観察装置
１１ 集束イオンビーム（ＦＩＢ）鏡筒
１２ 電子ビーム（ＥＢ）鏡筒
１３ 光学顕微鏡筒（光学顕微鏡）１３
２６ 制御部
５１ ＥＤＳ検出器
10 Cross-section
26
Claims (6)
前記３次元位置座標情報に基づいて、前記試料のうち前記特定観察対象物が存在する特定部位に向けて集束イオンビームを照射して、該特定部位の断面を露出させる断面加工工程と、
前記断面に電子ビームを照射して、前記特定観察対象物を含む所定の大きさの領域の画像を取得する断面像取得工程と、
前記断面加工工程および前記断面像取得工程を所定間隔で所定方向に沿って複数回繰返し行い、取得した複数の前記画像から前記特定観察対象物を含む３次元立体像を構築する立体像生成工程と、を有することを特徴とする断面加工観察方法。 The entire sample to be observed by observing with an optical microscope, a position information acquisition step of acquiring the approximate three-dimensional position coordinate information within said sample of a particular observation object contained in the sample,
Based on the three-dimensional position coordinate information, a cross-section processing step of irradiating a specific portion of the sample in which the specific observation object is present with a focused ion beam to expose the cross section of the specific portion.
A cross-sectional image acquisition step of irradiating the cross-section with an electron beam to acquire an image of a region of a predetermined size including the specific observation object, and a cross-sectional image acquisition step.
The cross section processing step and the cross-sectional image acquisition process repeated several times along a predetermined direction at a predetermined interval, generating stereoscopic images to construct a three-dimensional image including the specific observation object from a plurality of pre-outs image acquired A method for observing cross-section processing, which comprises a process.
前記立体像生成工程において、取得した複数の前記断面組成像から前記特定観察対象物を含む３次元立体組成像を構築することを特徴とする請求項１または２記載の断面加工観察方法。 In the cross-sectional image acquisition step, a cross-sectional composition image of the specific portion including the specific observation object is further acquired by energy dispersion type X-ray detection of the cross section.
The cross-section processing observation method according to claim 1 or 2, wherein a three-dimensional three-dimensional composition image including the specific observation object is constructed from the plurality of acquired cross-section composition images in the three-dimensional image generation step.
前記試料に集束イオンビームを照射する集束イオンビーム鏡筒と、
前記試料に電子ビームを照射する電子ビーム鏡筒と、
前記試料を光学的に観察する光学顕微鏡筒と、
前記試料から発生する二次電子を検出する二次電子検出器又は反射電子を検出する反射電子検出器と、
前記光学顕微鏡筒によって前記試料内における前記特定観察対象物の存在位置を特定して、前記試料のうち前記特定観察対象物が存在する特定部位に向けて前記集束イオンビーム鏡筒から集束イオンビームを照射して断面を露出させ、前記断面に前記電子ビーム鏡筒から電子ビームを照射して前記特定観察対象物を含む所定の大きさの領域の画像を取得させ、前記画像から前記特定観察対象物を含む特定部位の３次元立体像を構築する制御部と、
を備えたことを特徴とする断面加工観察装置。 A sample table on which a sample containing a specific observation object is placed, and
A focused ion beam lens barrel that irradiates the sample with a focused ion beam,
An electron beam lens barrel that irradiates the sample with an electron beam,
An optical microscope tube for optically observing the sample and
A secondary electron detector that detects secondary electrons generated from the sample or a backscattered electron detector that detects backscattered electrons,
The position of the specific observation object in the sample is specified by the optical microscope cylinder, and the focused ion beam is emitted from the focused ion beam lens barrel toward the specific part of the sample in which the specific observation object is present. The cross section is exposed by irradiation, and the cross section is irradiated with an electron beam from the electron beam lens barrel to acquire an image of a region of a predetermined size including the specific observation object, and the specific observation object is obtained from the image . A control unit that constructs a three-dimensional stereoscopic image of a specific part including
A cross-section processing observation device characterized by being equipped with.
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