JP6923866B2 - 新規セレンテラジン化合物及びその用途 - Google Patents
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Description
一般式[I]
R1は、水素又は水酸基、
R2は、
(1) -O-(CH2)n-R3 ここで、nは2〜5の整数、R3は、水酸基、メトキシ基、メチル基又はアジド基、又は
(2) 炭素数1若しくは2のアルキル基
である化合物。
試薬は和光純薬、関東化学、東京化学、またはシグマアルドリッチから購入し精製せずそのまま用いた。セレンテラジン誘導体合成の際、シリカカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル (Merck社製1.07734.9025, silica gel 60 (0.063-0.200 mm), カラムクロマトグラフィー用 (70-230 mesh ASTM))を用いた。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、YAMAZEN社のYFLC-Al-560 クロマトグラフィーを用いた。また高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、日本分析工業株式会社のLC-918 リサイクル分注HPLC、ジーエルサイエンス社製Inertsil ODS-3分析カラム(C18, 5 μm, 20×250 mm)を用いて行った。1H-NMRまた13C-NMRはJEOL社のECA500を用いて内部標準としてテトラメチルシラン (TMS, 0 ppm)を用いた。また結合定数(J)はHzで示した。略号s, d, t, q, m, 及びbrはそれぞれ単重線、二重線、三重線、四重線、多重線、及び幅広線を示す。
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた(2-ブロモエトキシ(tert-ブチル)ジメチルシラン (812.0 mg, 3.4 mmol, 1.5 eq.)、ヨウ化カリウム (20 mg, 0.1 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で24時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2)にて精製し、Tert-ブチルジメチル(2-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)エトキシ)シランを白色固体としてえた (307.0 mg, 36%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (150.0 mg, 0.56 mmol, 1 eq.)、 tert-ブチルジメチル(2-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)エトキシ)シラン (307.0 mg, 0.8 mmol, 1.4 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (12 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (225.0 mg, 92%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.06 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (47.9 mg, 0.13 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で5時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣を逆相HPLCカラムクロマトグラフィー(溶離液:メタノール/水=6/4 + 0.1%ギ酸)にて精製し、6-Al2OH-CTZを黄色個体として得た (12.8 mg, 45%)。
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた(3-ブロモプロポキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン (690.0 mg, 2.7 mmol, 1.2 eq.)、ヨウ化カリウム (20 mg, 0.1 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で13時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2)にて精製し、tert-ブチルジメチル(3-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)プロポキシ)シランを白色固体として得た (489.3 mg, 63%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (308.0 mg, 1.16 mmol, 1 eq.)、 tert-ブチルジメチル(3-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)プロポキシ)シラン (702.29 mg, 1.85 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (12 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(18時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (478.9 mg, 91%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.06 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (48.2 mg, 0.13 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で5.5時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣を逆相HPLCカラムクロマトグラフィー(溶離液:メタノール/水=6/4 + 0.1%ギ酸)にて精製し、6-Al3OH-CTZを黄色個体として得た (6.55 mg, 20%)。
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた(4-ブロモブトキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン (721.6 mg, 2.7 mmol, 1.2 eq.)、ヨウ化カリウム (20 mg, 0.1 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で13時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2)にて精製し、tert-ブチルジメチル(4-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)ブトキシ)シランを白色固体として得た (881 mg, 95%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (180.0 mg, 0.68 mmol, 1 eq.)、 tert-ブチルジメチル(4-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)ブトキシ)シラン (443.0 mg, 1.09 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (10 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(15時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ブトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (303.5 mg, 96%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ブトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.06 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (48.5 mg, 0.13 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で7時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣を逆相HPLCカラムクロマトグラフィー(溶離液:アセトニトリル/水=1/1 + 0.1%ギ酸)にて精製し、6-Al4OH-CTZを黄色個体として得た (6.96 mg, 20%)。
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた((5-ブロモペンチル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン (759.5 mg, 2.7 mmol, 1.2 eq.)、ヨウ化カリウム (20 mg, 0.1 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で7時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=9/1→8/2)にて精製し、tert-ブチルジメチル((5-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)ペンチル)オキシ)シランを白色固体として得た (916 mg, 96%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (180.0 mg, 0.68 mmol, 1 eq.)、 tert-ブチルジメチル((5-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)ペンチル)オキシ)シラン (458.0 mg, 1.09 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (10 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-((5-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ペンチル)オキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (253.0 mg, 52%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-((5-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ペンチル)オキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (34.5 mg, 0.07 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (55.8 mg, 0.15 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で5時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣を逆相HPLCカラムクロマトグラフィー(溶離液:メタノール/水=1/1 + 0.1%ギ酸)にて精製し、6-Al5OH-CTZを黄色個体として得た (8.77 mg, 21%)。
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (300.0 mg, 1.3 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (246 mg, 1.7 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた1-ブロモ-3-メトキシプロパン (416.2 mg, 2.7 mmol, 2 eq.), ヨウ化カリウム (12 mg, 0.06 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で一晩(19時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=9/1)にて精製し、2-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色個体として得た (287.3 mg, 73%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (100.0 mg, 0.3 mmol, 1 eq.)、 2-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (176.9 mg, 0.6 mmol, 2 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (6 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (1.6 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=7/3→1/1)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (127.3 mg, 96%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (35.0 mg, 0.1 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (70.5 mg, 0.2 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で6時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Al3OMe-CTZを黄色個体として得た (18.2 mg, 52%)。
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (1.0 g, 4.5 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (0.82 g, 5.9 mmol, 1.3 eq. )をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた1,2-ジブロモエタン (4.1 g, 22.7 mmol, 22.7 eq.)、ヨウ化カリウム (0.02 g, 0.1 mmol, 0.02 eq.)を加え、70℃で一晩(16時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を塩化メチレンで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム→クロロホルム/メタノール=49/1)にて精製し、2-(4-(2-ブロモエトキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色個体として得た (359.0 mg, 24%)。
窒素雰囲気下、2-(4-(2-ブロモエトキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (350 mg, 1.0 mmol, 1.0 eq.)をN,N-ジメチルホルムアミド (10 ml)に溶解させ、これにアジ化ナトリウム (83 mg, 1.2 mmol, 1.2 eq.)を加え、100℃で1時間撹拌した。反応終了後、トルエンで抽出、蒸留水と飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。2-(4-(2-アジドエトキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色個体として得た (299.0 mg, 97%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (250.0 mg, 0.9 mmol, 1 eq.)、 2-(4-(2-アジドエトキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (358.0 mg, 1.2 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (6 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (2.0 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(17時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム/酢酸エチル=19/1→9/1)にて精製し、5-(4-(2-アジドエトキシ)フェニル)-3-ベンジルピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (122.0 mg, 50%)。
アルゴン雰囲気下、5-(4-(2-アジドエトキシ)フェニル)-3-ベンジルピラジン-2-アミン (121.0 mg, 0.3 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (197.0 mg, 0.5 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (10 ml)、milliQ (1.0 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.5 ml)を加え、80℃で一晩(15時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール=20/1)にて精製し、6-Al2N3-CTZを黄色個体として得た (29.0 mg, 17%)。
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた1-ブロモブタン (622.6 mg, 4.5 mmol, 2 eq.)、ヨウ化カリウム (0.02 g, 0.1 mmol, 0.02 eq.)を加え、70℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。2-(4-ブトキシフェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色固体状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (100.0 mg, 0.3 mmol, 1 eq.)、2-(4-ブトキシフェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (167.0 mg, 0.4 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (6 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (2.0 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(13時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=4/1→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-ブトキシフェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (121.6 mg, 96%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-ブトキシフェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.08 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (63.4 mg, 0.17 mmol, 2.0 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で6時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Alkyl3-CTZを黄色個体として得た (12.8 mg, 30%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (100.0 mg, 0.3 mmol, 1 eq.)、 2-(4-エチルフェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (140.4 mg, 0.6 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (6 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (1.6 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-エチルフェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (100.4 mg, 0.3 mmol, 91%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-エチルフェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.1 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (72.6 mg, 0.20 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩(21時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Ethyl-CTZを黄色個体として得た (9.6 mg, 21%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (166.0 mg, 0.6 mmol, 1 eq.)、 2-(4-(メトキシメチル)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (249.5 mg, 1.0 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (12 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(13時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=1/2→1/1)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(メトキシメチル)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (169.5 mg, 0.5 mmol, 88%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(メトキシメチル)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.09 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (69.2 mg, 0.19 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で4時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Ether-CTZを黄色個体として得た (13.8 mg, 31%)。
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (123.91 mg, 0.4 mmol, 1 eq.)、 p-トリルボロン酸 (102.02 mg, 0.7 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (12 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(19時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=4/1→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(p-トリル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (123.97 mg, 96%)。
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(p-トリル)ピラジン-2-アミン (32.6 mg, 0.11 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (83.68 mg, 0.23 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で21時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1→10/1)にて精製し、6-Methyl-CTZを黄色個体として得た (23.12 mg, 50%)。
天然のレニラルシフェラーゼ(RLuc)の配列(商品名pGL4.75、Promega社より販売)を含むベクター(pcDNA3.1(+)、Invitrogen社より市販)またはその誘導体であるRLuc8並びにRLuc8.6-535の配列(文献Loening,A.M.et al.,Nat.Methids,2007,4,641-643.)を含むベクター(商品名pcDNA3.1(+)、Invitrogen社より市販)を用いてCOS7細胞中に酵素を発現させた。PromegaのRenilla Luciferase Buffer (E291A)を用いて細胞を溶解し、その溶出液を酵素溶液としてそのまま用いた。発光基質は、天然のセレンテラジン (Nanolight technology社製)、6-Al2OH-CTZ、6-Al2OH2H-CTZ、6-Al3OH-CTZ、6-Al3OH2H-CTZ、6-Al4OH-CTZ、6-Al4OH2H-CTZ、6-Al5OH-CTZ、6-Al5OH2H-CTZ、6-Al3OMe-CTZ、6-Al3OMe2H-CTZ、6-Alkyl3-CTZ、6-Alkyl3-2H-CTZ、6-Methoxy-CTZ、6-Methoxy-2H-CTZ、6-Ethyl-CTZ、6-Ethyl-2H-CTZ、6-Methyl-CTZ、6-Methyl-2H-CTZ、6-Ether-CTZ(比較化合物)、6-Ether-2H-CTZ(比較化合物)また既存のブルーシフト型誘導体DeepBlueC (商品名、Nanolight technology社製)を比較対象として用いた。生物発光測定はPromega社のRenilla Luciferase Assay System (Cat.No. E2810)のプロトコルに従って行った。発光基質をメタノールに溶解させ、2 mMの溶液とした。これをPBS buffer (pH7.4)で2 μMに希釈、これを基質溶液とした。この溶液200 μLに対してRLuc、RLuc8またはRLuc8.6-535を含む細胞溶出液4μLを加え、発光反応を開始した。発光輝度はベルトールド社製Lumat LB9507にて1秒間測定し、最大発光強度値(I)で示した。また天然のセレンテラジンのRLuc8における発光強度を1.0と規格化し、生物発光強度の比較を行った。結果を図1及び下記表2に示す。
上記生物発光輝度測定方法と同様に、Promega社のRenilla Luciferase Assay System (Cat.No. E2810)のプロトコルに従って発光スペクトル測定を行った。発光スペクトルはATTO社製LumiFLを用いて行った。最大発光波長は最大発光強度を1.0として規格化する事で求めた。
GLuc、RLuc8.6-535または人工生物発光酵素ALuc群(ALuc16, ALuc22, ALuc23, ALuc34)の配列(文献Kim S.B. et al.,Bioconjugate Chem.,2013,24,2067-2075.,Kim S.B. et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2014,448,418-423., Kim S.B. et al.,Anal.Sci.,2015,31,1-6., Kim S.B. et al.,Bioconjugate Chem.,27,354-362.)を含むベクター(pcDNA3.1(+)、Invitrogen社より市販)を用いてCOS7細胞中に酵素を発現させた。Promega社のRenilla Luciferase Buffer (E291A)を用いて細胞を溶解し、その溶出液を酵素溶液としてそのまま用いた。発光基質は、天然のセレンテラジン (Nanolight technology社製)並びに6-Al2N3-CTZ(実施例17)を用いた。生物発光測定はPromega社のRenilla Luciferase Assay System (Cat.No. E2810)のプロトコルに従って行った。発光基質をメタノールに溶解させ、1 mMの溶液とした。これをPromega bufferで1 μMに希釈、これを基質溶液とした。この溶液40 μLに対してRLuc8.6-535, ALuc16, ALuc22, ALuc23並びにALuc34を含む細胞溶出液10μLを加え、発光反応を開始した。富士フィルム社製LAS-4000を用いて酵素反応開始後0分後、20分後の発光輝度を測定した。結果を図3に示す。また、図3に示す生物発光強度結果より、NCTZ/ALuc34の発光輝度を100%と規格化し、下記表4−1及び表4−2にまとめた。
上記生物発光輝度測定方法と同様に、Promega社のRenilla Luciferase Assay System (Cat.No. E2810)のプロトコルに従って発光スペクトル測定を行った。発光スペクトルはATTO社製LumiFLを用いて行った。最大発光波長は最大発光強度を1.0として規格化する事で求めた。結果を下記表5及び図4に示す。
Claims (5)
- R1が-OH、R2が-O-(CH2)3-OHである請求項3記載の発光基質。
- R1が-OH、R2が-O-(CH2)2-N3である請求項3記載の発光基質。
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