JP6912888B2 - シマツナソおよびコウマ由来のホメオボックス−ロイシンジッパータンパク質hat22(hd−zipタンパク質22)をコードするヌクレオチド配列および使用方法 - Google Patents
シマツナソおよびコウマ由来のホメオボックス−ロイシンジッパータンパク質hat22(hd−zipタンパク質22)をコードするヌクレオチド配列および使用方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2013年11月25日に出願された米国仮出願第61/908,444号の利益を主張し、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、分子生物学の分野、ならびにホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節することにより植物の繊維長、草丈、および/またはバイオマスを増加させるか、または増強するための方法に関する。より具体的には、本発明は、2種のジュート植物、すなわち、シマツナソ(「C.olitorius」)およびコウマ(「C.capsularis」)から単離されたホメオボックス−ロイシンジッパータンパク質HAT22の相同体、ならびにホメオボックス−ロイシンジッパータンパク質HAT22をコードする遺伝子の発現を調整することによりジュートにおける繊維長、草丈、および/または植物バイオマスを増加させるためのそれらの適用を提供する。
(i)植物または植物細胞において、ホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22ポリペプチドをコードする核酸あるいはホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22ポリペプチドをコードする核酸を含み、かつ/またはそれからなる遺伝子構築物を導入し、発現することと、
(ii)繊維細胞の成長および発育を促進するための条件下で植物細胞を栽培することと、を含む。
a)配列番号2に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、および
b)配列番号2に記載のヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含む。
a)配列番号5に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、および
b)配列番号5に記載のヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含む。
a)配列番号2または配列番号5に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、および
b)配列番号2または配列番号5に記載のヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択され、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現されて、植物シマツナソおよびコウマにおけるホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22ポリペプチドの相同体を産生することができる。
a)配列番号2または配列番号5に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、および
b)配列番号2または配列番号5に記載のヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択され、前記形質転換体は、ホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22ポリペプチドの相同体を産生する。
a)植物細胞にポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子構築物を導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、i)配列番号2または配列番号5に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子、およびii)配列番号2または配列番号5に記載のヌクレオチド配列と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子からなる群から選択される、ステップと、
b)ポリペプチドを発現するステップであって、前記ポリペプチドが、i)配列番号3または配列番号6に記載のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチド、およびii)配列番号3または配列番号6に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される、ステップと、
c)植物成長および発育を促進するための条件下で前記植物細胞を栽培するステップと、を含む。本発明により提供される配列はまた、酵素がより良好に需要過程を行うことができる特徴を有する新規の酵素の合理的改変または設計のための準備的材料としても使用することができる。
研究に使用されるプライマーは、手で処理したトランスクリプトームから設計されるか、または完全ORFを用いて手動で配列を選択するか、または同様の遺伝子が他の植物から首尾よく単離されたデータベースを使用することにより、シマツナソおよびコウマの特定の実施形態に限定される本発明(nvention)から設計された。トランスクリプトームから得られたヌクレオチド配列の比較バイオインフォマティクス分析は、関連遺伝子の相同体を特定するために、および遺伝子の適切な特定のために、NCBI BLAST、BLASTP、RPS−BLAST、BLASTX、およびPSI−BLASTを用いて実行された。複数の配列が「遺伝子プール」から見出されたときはいつでも、ヌクレオチド配列アラインメントが、clustalWバージョン1.82を通して行われた。次いで、このアラインメントが編集された。遺伝子特異的なプライマー(順方向および逆方向の両方)が、手動でまたはPrimer 3 plus toolを通して選択され、これらのプライマーはカスタム合成された。
PCRのためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド配列
Chomczynski PおよびSacchi Nにより前述されるような、チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出法によるRNA単離の単一ステップ法で、全RNAは、MS培地上に成長した3日齢の苗から単離された(Anal Biochem 1987,162:156−159)。RNAの質または完全性は、アガロースゲル電気泳動により確認し、標準手順によりThermo Scientific Nano Drop 2000を用いて定量化した。cDNAの第1の鎖は、製造業者の説明書に従って、SuperScript III逆転写酵素(Invitrogen)を用いて合成した。遺伝子は、遺伝子特異的なプライマーを用いて、PCRによりcDNAから増幅した。PCR反応物(50μL)は、1μLのcDNA、20pモルの各プライマー、5μLの10X PCR緩衝液、5μLの2.5mM dNTP混合、および1.0単位のPfuTaq DNAポリメラーゼを含有した。PCRは、Thermal Cycler(Applied Biosystems)において、約95℃で約5分間の初期変性、続いて、約95℃で約30秒間の35サイクルの変性、約58℃で約30秒間のアニーリング、約72℃で約1分間の伸長、約72℃で約7分間の最終伸長、の条件を用いて行った。PCR産物は、1X TAE緩衝液を用いた1% アガロースゲルにより分析し、アンプリコンは、製造業者の説明書に従って、QIAGENゲル抽出キットを用いてゲルから溶出した。精製されたPCR産物は、pCR(登録商標)8/GW/TOPO(登録商標)TAクローニングキット(Invitrogen)に連結させ、コンピテント大腸菌細胞(Invitrogen)に形質転換した。プラスミドは、QIAprip Spin Miniprepキット(QIAGEN)を用いて推定上のコロニーから単離し、続いて、Choeにより前述されるように、製造(manufacturerays)齢の苗をMS培地上で成長させ、遺伝子特異的なプライマーおよび陽性プラスミドを配列決定に曝した。
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、BLASTNおよびBLASTPプログラムにより分析された。他の植物から報告された配列は、ClustalWでアラインされた。系統活性的分析は、近接結合(NJ)を用いて行われた。
繊維の生合成においてホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22の自動代謝経路の再構成を示す役割は、Arbidopsisゲノムと比較してシマツナソおよびコウマに予測されたタンパク質からオルソログを特定することにより構成された。シマツナソおよびコウマゲノム内にコードされたホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22に触媒された酵素反応は、Pathway Studio用のResnet−Plant3.0データベースおよび代謝経路データベースから入手可能な酵素反応を用いて構成された。
本明細書で引用される、米国特許、米国公開特許出願、および公開PCT出願のすべては、これにより参照により組み込まれる。
本発明のいくつかの実施形態が本明細書で記載および説明されてきたが、当業者は、本明細書に記載される機能を行い、かつ/あるいは結果および/または利点のうちの1つ以上を得るための種々の他の手段および/または構造を容易に認識するであろう。そして、そのような変形および/または修正の各々が本発明の範囲内にあると見なされる。当業者は、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、あるいは確認することができるであろう。そのため、前述の実施形態は単なる例として提示されていること、および添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、本発明を具体的に記載および請求されているものとは別の方法で実施することができることを理解すべきである。
Claims (7)
- 植物シマツナソまたはコウマ由来の単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号2または5に記載のヌクレオチド配列からなり、かつ前記ポリヌクレオチドがホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記植物シマツナソが、品種O−4である、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記植物コウマが、品種CVL−1である、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列が、配列番号2の配列である、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列が、配列番号5の配列である、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項1−5のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子構築物であって、
前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞において発現されて、前記植物シマツナソまたはコウマにおけるホメオボックス−ロイシンジッパーHAT22ポリペプチドの相同体を産生することができる、組換え遺伝子構築物。 - 請求項1−5のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーター領域をさらに含み、前記プロモーターが、前記ポリヌクレオチドの転写または発現を増強する、請求項6に記載の組換え遺伝子構築物。
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