JP6905464B2

JP6905464B2 - 上皮増殖因子受容体遺伝子の細胞外ドメインｉｉｉ内の変異

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Inventors: バルデッリ，アルベルト; アレーナ，サブリナ; ビラドット，クラーラモンタグ; メストレス，ホアンアルバネイ; ゲリン，アナロヴィーラ; パリシオ，ベアトリスベッロシッロ; マッセグ，アルバダルマサス
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Description

本発明は、モノクローナル抗体治療に対する応答性を判定するためのマーカーとしてのヒト上皮増殖因子受容体遺伝子の新規な変異に関する。

上皮成長因子受容体遺伝子（ＥＧＦＲ）は、４種の密接に関連した受容体チロシンキナーゼ：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む、受容体の上皮成長因子ファミリー（ＥｒｂＢファミリー）に属する膜貫通チロシンキナーゼ受容体である。リガンドが結合すると、ＥＧＦＲは、アポトーシス、細胞成長、血管形成、及び転移等の重要な発癌性事象を調節する細胞内シグナル伝達経路、主にＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫカスケード及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を活性化する。ＥＧＦＲの異常活性化又は過剰発現は、いくつかの種類の癌において報告されている（即ち、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎＪ、ＢａｓｅｌｇａＪら、「Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒ」、ＳｅｍｉｎＯｎｃｏｌ−２００６、Ｖｏｌ．３３、ｐｐ．：３６９−３８）。ＥＧＦＲ遺伝子における変異は肺癌で説明されている。このような変異の例は、例えばＬｙｎｃｈＴＪら、「Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓｏｆｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｔｏｇｅｆｉｔｉｎｉｂ」、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ−２００４、Ｖｏｌ．３５０、ｐｐ：２１２９−２１３９の文献に開示されている。

転移性（ｍｅｔａｓｔａｓｉｃ）結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）は、西洋の国々の世界における癌による死亡のうち２番目に主な原因である。

ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩに対するモノクローナル抗体（ｍｏＡｂ）、例えばセツキシマブ及びパニツムマブに基づいた治療は、ｍＣＲＣを患っている患者に顕著な生存利益を与え、現在、これらの患者についての治療レジメン、即ち単独で又は他の抗悪性腫瘍薬と併用してのいずれかでの標準的な成分になっている。これらのｍｏＡｂのうちの１つである、セツキシマブ（アービタックス）はまた、白金ベースの化学療法剤と併用して、頭頸部癌としても指定されている頭頸部の扁平上皮細胞癌腫を患っている患者の治療のために示されている。

ｍｏＡｂは癌細胞で発現された異質の抗原に結合する。一旦結合すると、癌細胞は患者の免疫系による破壊のために標識化される。癌細胞を標的化することに加えて、ｍｏＡｂは腫瘍成長に必要な他の細胞種類及び分子に対して作用するように設計することができる。例えば、抗体は成長因子を中和することができるので、腫瘍増殖を阻害し得る。殆どどのような細胞外／細胞表面標的（癌細胞など）にも特異的なｍｏＡｂを作製することが可能である。要約すると、ｍｏＡｂは、悪性腫瘍細胞を破壊し、特異的細胞受容体を遮断することにより腫瘍成長を防止することに使用することができる。治療的ｍｏＡｂであるセツキシマブ及びパニツムマブはＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲにより駆動される細胞内シグナル伝達経路（すなわち、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫカスケードおよびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路）の活性化を防止する。

ｍＣＲＣを患っている全ての患者が、ｍｏＡｂを含む治療レジメンに応答するとは限らない。このような治療に対する、ｍＣＲＣを患っている患者の応答の欠如は一次性である可能性があり、即ち抗ＥＧＦＲｍｏＡｂ治療の開始以来、一次耐性として知られている。更に、抗ＥＧＦＲｍｏＡｂに対して最初に応答する全てのｍＣＲＣ患者は、二次耐性、即ち抗ＥＧＦＲｍｏＡｂに対する獲得耐性を常に生じる。両方の場合、結果は治療の失敗に終わる。ｍＣＲＣ患者におけるこのような治療耐性の獲得の一因となるメカニズムはまだ知られていない。

ＫＲＡＳ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログとしても知られている）は、ＥＧＦＲ下流エフェクターであり、及び抗ＥＧＦＲｍｏＡｂに対する一次抵抗のマーカーである。ＫＲＡＳはｍＣＲＣ患者の治療の最適化に対して顕著に影響を与える。結腸直腸腫瘍の４０パーセントはＫＲＡＳ遺伝子における変異を保有しており、これらの患者は抗ＥＧＦＲｍｏＡｂから利益を受けない。現在の臨床診療において、抗ＥＧＦＲｍｏＡｂ治療を考慮されている全てのｍＣＲＣ患者はＫＲＡＳ試験を受けるべきであり、ＫＲＡＳ変異が検出される場合、患者はセツキシマブ又はパニツムマブ治療から除外されるべきである。

抗−ＥＧＦＲＭｏＡｂｓに対する一次耐性のマーカーとしてのＫＲＡＳ変異の使用、更に最近ではＮＲＡＳ（神経芽腫Ｒａｓウイルス癌遺伝子同族体）変異の使用は、ｍＣＲＣ患者の治療の最適化に対する重要なステップを意味するが、抗−ＥＧＦＲｍｏＡｂに対する獲得耐性の根底にある分子変化の理解は、現在においてこれらの薬物の臨床的利益を改善するための決定的な問題である。最近、患者における二次耐性（獲得耐性）のメカニズムが解明されてきている。最も一般的な事象は、Ｍｉｓａｌｅら、「ＥｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆＫＲＡＳｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｎｔｉ−ＥＧＦＲｔｈｅｒａｐｙｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ」Ｎａｔｕｒｅ−２０１２、Ｖｏｌ．Ｎｏ．４８６、ｐｐ．：５３２−５３６から推定されるように、症例の約５０％におけるＫＲＡＳ変異又は遺伝子増幅の出現である。

二次耐性の他のメカニズムとしては、Ｍｏｎｔａｇｕｔら、「ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇｃｅｔｕｘｉｍａｂｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ」、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ−２０１２、Ｖｏｌ．Ｎｏ．１８、ｐｐ．：２２１−２２３に示されているように、セツキシマブのＥＧＦＲへの結合を阻止するＥＧＦＲの細胞外ドメインにおける変異の獲得がある。変異は、ＥＧＦＲ遺伝子の細胞外部分の多型であり、コード化タンパク質のドメインＩＩＩでアミノ酸置換Ｓ４９２Ｒをもたらす。

モノクローナル抗体のＥＧＦＲエピトープとの相互作用を研究する目的で、いくつかの報告は重要なエピトープのマッピングに向けられている。これらの報告は、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩにおける部位特異的突然変異誘発によって得られた変異のデータを提供する。これらの報告の一例は、Ｖｏｉｇｔら、「ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＤｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒＥｐｉｔｏｐｅｓＴａｒｇｅｔｅｄｂｙＰａｎｉｔｕｍｕｍａｂａｎｄＣｅｔｕｘｉｍａｂ」、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ−２０１２、Ｖｏｌ．Ｎｏ．１４（１１）、ｐｐ．：１０２３−１０３１である。この文献は、部位突然変異誘発アッセイのプロトコール及び手段に従って、野生型アミノ酸がアラニンによって殆ど変異された突然変異を開示している。Ｖｏｉｇｔは、アラニンスキャニングアプローチによるセツキシマブ又はパニツムマブ結合にとって決定的に重要であると定義された残基は、機能的な影響なしにインビボで他のアミノ酸に変異している可能性があるため、部位突然変異誘発からのインビトロデータはインビボで有意ではない可能性があると結論付けている。したがって、部位突然変異誘発によって同定された定義されたエピトープの重要な位置は、インビボで有意な突然変異（特定のアミノ酸の交換）を示唆していない。

ＳｅｍｉｎＯｎｃｏｌ−２００６、Ｖｏｌ．３３、ｐｐ．：３６９−３８ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ−２００４、Ｖｏｌ．３５０、ｐｐ：２１２９−２１３９Ｎａｔｕｒｅ２０１２、Ｖｏｌ．Ｎｏ．４８６、ｐｐ．：５３２−５３６ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１２、Ｖｏｌ．Ｎｏ．１８、ｐｐ．：２２１−２２３Ｎｅｏｐｌａｓｉａ２０１２、Ｖｏｌ．Ｎｏ．１４（１１）、ｐｐ．：１０２３−１０３１

抗ＥＧＦＲ薬、即ちセツキシマブ及びパニツムマブで治療される結腸直腸癌患者では、薬物耐性が大きな問題となる。耐性の分子メカニズムの解明は大きな目標であるが、これは応答性を予測するマーカーとしての有意な変異又は他の遺伝子変異の検出を意味し、それと同時に、耐性（二次耐性）を獲得したことにより特定の医療レジメンを改変しなければならないかどうかを決定することを意味する。要約すると、最新技術は、ｍＣＲＣ患者の抗ＥＧＦＲｍｏＡｂ療法に対する一次及び二次耐性を検出するための有用な手段を提供するが、異なる変異を有する患者をカバーするために、又は耐性分子メカニズムの異なる発展をカバーするために、追加又は他の耐性を予測するバイオマーカーを同定することが必要である。

本発明者らは、癌治療に使用されるある種のｍｏＡｂによる治療に対する耐性と相関する、ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ドメインＩＩＩ）中の新規な変異を同定した。変異は、ＥＧＦＲタンパク質の４５１位におけるアルギニンのシステインへのアミノ酸置換；ＥＧＦＲタンパク質の４６４位におけるセリンのロイシンへのアミノ酸置換；ＥＧＦＲタンパク質の４６５位におけるグリシンのアルギニンへのアミノ酸置換；ＥＧＦＲタンパク質の４６７位におけるリシンのスレオニンへのアミノ酸置換をもたらす。

野生型のヒトＥＧＦＲタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有し；本明細書において、変異はＲ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＫ４６７Ｔとして知られる。変異は、抗ＥＧＦＲモノクローナルで治療した後、ｍＣＲＣを有する患者において、単独で、又は他のものと組み合わせて検出することができる。

これらの変異の全ては、セツキシマブ結合エピトープの特定のアミノ酸配列断片に位置する。即ち、これらの変異は、配列番号２の４５０位のアミノ酸から４７０位のアミノ酸の断片中に位置し、この配列番号２はヒトＥＧＦＲの野生型のアミノ酸コンセンサス配列に相当する。セツキシマブ結合エピトープのアミノ酸配列断片を、本明細書において配列番号１２（ＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣ））ともいう。興味深いことに、本発明者らは、この断片が、多くの抗ＥＧＦＲｍｏＡｂ治療による実際の障害（即ち、有効性をもたらさない）につながる特定の多くのアミノ酸置換（突然変異）を含むことを発見した。上記のように、抗ＥＧＦＲｍｏＡｂ結合部位をマッピングする際に変異誘発によって多くのアミノ酸位置が重要な位置として決定されているが、マッピングアッセイは治療に対する耐性を決定するために決定的ではないことも知られている。

従って、本発明者らは、治療の実際の効果を有する、多くの変異点を含むか要約するＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩの断片を初めて提供する。この断片（配列番号１２）中の配列を分析又は決定することにより、抗ＥＧＦＲｍｏＡｂを含む治療に対する耐性の可能性のある患者の多くを検出する利点がもたらされる。広く使用されている抗ＥＧＦＲｍｏＡｂ、セツキシマブに対して耐性をもたらす配列番号１２（ＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣ）内のアミノ酸の例は、太字で記載されている。

これらの変異は全て、最終的に配列番号２のＥＧＦＲタンパク質をコードするヒトＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のエクソン１２内に位置する。更に、それらの全ては、野生型アミノ酸の嵩高いアミノ酸（即ち、場合によって末端アミノ基を有する、分岐又は非分岐Ｃ１−Ｃ４炭化水素からなる側鎖を有するもの）、及び／又は極性若しくは荷電アミノ酸への変換に関する。具体的には、変異の大部分が、末端アミノ（−ＮＨ_２）を含む側鎖を有する極性及び／又は荷電アミノ酸の変換に関する。より詳細には、突然変異の２つは、末端アミノ（−ＮＨ_２）を含む側鎖を有するアミノ酸の変換に関する。更に、変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔは、末端アミノ（−ＮＨ_２）を含む側鎖を有するアミノ酸の、酸素族からの原子を有する基を含む炭水化物側鎖、即ち−ＯＨ及び−ＳＨを含む極性アミノ酸への置換を含み、それらは下記に示すような類似の鎖サイズを有する。

従って、本発明者らは、末端アミノ（−ＮＨ_２）を含む塩基性アミノ酸が変化するヒトＥＧＦＲのドメインＩＩＩ内での変異と、癌治療に使用されるある種のｍｏＡｂによる治療に対する耐性を示すこととの関連を初めて示した。より詳細には、この関連は、これらの塩基性アミノ酸が、システイン及びスレオニンから選択される特定の極性アミノ酸に変化する場合に見られる。

更に、極性又は中性のアミノ酸が、荷電又は中性の嵩高いアミノ酸で置換されている上記の配列番号１２のアミノ酸の変化は、癌治療で使用されるある種のｍｏＡｂによる治療に対する耐性を示すこととも関連する。これは、例えば、変異Ｓ４６４Ｌ及び変異Ｇ４６５Ｒの場合である。

特定の変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔが、配列番号１で定義されるペプチド配列を含む変異タンパク質において検出される。

更に、上記変異並びに変異Ｓ４６４Ｌ及びＧ４６５Ｒは、配列番号１３で定義されるペプチド配列を含む変異タンパク質中に検出される。

次いで、これらのマーカーを用いて、抗−ＥＧＦＲ療法に対する獲得耐性メカニズムの進化を追跡することができる。獲得耐性の検出は、疾患の進行の追跡調査に沿って別の治療アプローチ又は医療レジメンを提案するための有用なツールとなり得る。

従って、第１の態様では、本発明は、１７〜１００アミノ酸長を有し、配列番号１３の配列を含むペプチド配列に関する。
Ｘ^１ＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＸ^４Ｘ^５ＮＸ^２
式中、Ｘ^１はＲ及びＣから選択され；
Ｘ^４はＳ及びＬから選択され；
Ｘ^５はＧ及びＲから選択され；
Ｘ^２はＫ及びＴから選択され；並びに
Ｘ^１、Ｘ^４、Ｘ^５、及びＸ^２の少なくとも１つは、それぞれＣ、Ｌ、Ｒ、又はＴである。

配列番号１３は上記変異のいずれかであるが、Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、又はＫ４６７Ｔの少なくとも１つを包含する。

特定の実施形態では、本発明は、１７〜１００アミノ酸長を有し、配列番号１の配列を含むペプチド配列に関する。

Ｘ^１ＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＸ^２

式中、
Ｘ^１はＲ及びＣから選択され；
Ｘ^２はＫ及びＴから選択され；
Ｘ^１がＣである場合、Ｘ^２は、Ｋ及びＴから独立して選択され、Ｘ^１がＲである場合、Ｘ^２はＴである。

配列番号１は、上記変異のいずれかであるが、Ｒ４５１Ｃ又はＫ４６７Ｔの少なくとも１つを包含する。言い換えると、Ｘ^１及びＸ^２は示された意味を有するが、但し、Ｘ^１又はＸ^２の少なくとも１つは、それぞれ変異型Ｃ若しくはＴであるか；あるいは、Ｘ^１及びＸ^２のいずれも変異型Ｃ及びＴである。

この配列番号１は、配列番号２のヒトＥＧＦＲタンパク質に由来する。従って、配列番号１は、示された突然変異の少なくとも１つを含む、ヒトタンパク質配列の断片である。それ故、１００までのアミノ酸の休止は、配列番号２のタンパク質配列に位置するものであり、前記配列番号１に隣接するか、または配列番号１のＣ末端に連結された配列であり、アミノ酸Ｘ^２によって定義される。

有利には、これらの突然変異（Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、又はＫ４６７Ｔ）は、抗−ＥＧＦＲｍｏＡｂ療法に対する耐性又は一次耐性を獲得していると疑われる対象の試料において試験することができる代替物を意味する。従って、対象の試料中に存在していても存在しなくてもよい他の変異に加え、配列番号１（Ｒ４５１Ｃ又はＫ４６７Ｔ）又は配列番号１３（Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、又はＫ４６７Ｔ）で提案された変異は、他の手段では検出できない可能性のある耐性対象を検出するのに役立つ。特に、変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔは、ある種の抗−ＥＧＦＲｍｏＡｂ療法が依然として許容的（又は効率的）であることを示すさらなる利点を暗示する。特に、変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔはパニツムマブに対して許容的である。このことは、これらの２つの変異の少なくとも１つが検出された場合、少なくともパニツムマブ治療が推奨されることを意味する。

第２の態様では、本発明は、配列番号１又は配列番号１３をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。

配列番号１又は配列番号１３を含む単離されたペプチドは、癌治療の分野で非常に関心のあるＥＧＦＲタンパク質の変異型の検出をもたらす重要な生成物である。これらのタンパク質の変異型はまた、配列番号１又は配列番号１３をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドの形態で検出可能である。

配列番号１又は配列番号１３をコードするオリゴヌクレオチドは、これらの変異部位におけるコドン縮重（遺伝暗号の重複）を考慮し、前記アミノ酸変化の少なくとも１つをもたらすヌクレオチド変化を含むものである。その結果、これらのオリゴヌクレオチドは、アミノ酸変化をもたらす特定の変異を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。

更に、これら全てのオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号１３を含むペプチド配列中のアミノ酸変化をもたらすヌクレオチド突然変異の存在又は非存在を検出することを可能にする適切なプローブである。

特に、本発明は、ＥＧＦＲタンパク質の４５１位におけるアルギニンのシステインへの；ＥＧＦＲの４６４位におけるセリンのロイシンへの；４６５位におけるグリシンのアルギニンへの；およびＥＧＦＲタンパク質の４６７位におけるリシンのスレオニンへのアミノ酸置換の意外な同定をベースとしている。

アミノ酸変化Ｋ４６７Ｔは、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のヌクレオチド１４００におけるＡ→Ｃの変化の結果である（本明細書においてＡ１４００Ｃとしても知られる）（コドンＡＡＡがＡＣＡに変化する）。アミノ酸変化Ｒ４５１Ｃは、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のヌクレオチド１３５１におけるＣ→Ｔのヌクレオチド変化の結果である（本明細書においてＣ１３５１Ｔ）としても知られる）（コドンＣＧＣがＴＧＣに変化する）。アミノ酸変化Ｓ４６４Ｌは、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のヌクレオチド１３９１におけるＣ→Ｔのヌクレオチド変化の結果である（本明細書においてＣ１３９１Ｔ）としても知られる）（コドンＴＣＡがＴＴＡに変化する）。アミノ酸変化Ｇ４６５Ｒは、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のヌクレオチド１３９３におけるＧ→Ａのヌクレオチド変化の結果である（本明細書においてＧ１３９３Ａ）としても知られる）（コドンＧＧＡがＡＧＡに変化する）。

これら全てのアミノ酸変異は、それらをコードするコドンにおける他の変異の結果である可能性がある。特に、これら全てのヌクレオチド変化は、配列番号２（ヒトＥＧＦＲタンパク質）の４５１位におけるシステイン、配列番号２の４６４位におけるロイシン、配列番号２の４６５位におけるアルギニン、及び配列番号２の４６７位におけるスレオニンへの変異をもたらす。

既に上記に示したように、上記のヌクレオチド変化の各々は、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡ、転写バリアント１配列（ＥＲＢＢ１、ＰＩＧ６１、プロトオンコジーンｃ−ＥｒｂＢ−１、トリ赤芽球性白血病ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）オンコジーンホモログ受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１、又はＨＥＲ１としても示される）を意味する。ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡ、転写バリアント１の配列は、配列番号３（又はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８．３、２０１４年５月１８日に利用可能となった配列およびデータベースリリースのバージョン３）及びその任意のバリアントに対応するものであり、前記バリアントはＥＧＦＲタンパク質をコードする。ＥＧＦＲタンパク質は、そのＥＧＦＲタンパク質の基本構造を維持する配列番号２（２０１４年５月１８日の配列及びデータベースリリースのＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２１９．２バージョン）又はその任意のバリアントに対応する。配列番号２及び３はヒト（ホモサピエンス）由来である。それにもかかわらず、ＥＧＦＲは大部分の哺乳動物において高度に保存されており、この変異点は大部分の哺乳動物において野生型配列中に同じアミノ酸を含む。従って、本発明は、同じ変異を含むが、任意の哺乳動物のＥＧＦＲタンパク質又は遺伝子の配列中に決定される。

本発明の他の態様は、配列番号６（ＣＡＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴ）及び配列番号７（ＴＴＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴ）からなるプライマーのセットである。

このプライマーのセットは、本発明の変異を生じるヌクレオチド変化が位置するＥＧＦＲコード領域の部分を含むゲノム領域を増幅させることを可能にする。従って、それらは本発明者らにより同定される新規アミノ酸変異に関し、意外にも、抗−ＥＧＦＲｍｏＡｂによる治療に対する耐性（獲得又は一次性）をもたらす多くの変異を含む重要な領域として見出された、配列番号１２（ＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣ）と命名された断片をコードするＥＧＦＲコード領域の増幅を可能にする。特に、配列番号６及び７からなるプライマーのセットは、ｍＲＮＡ転写物のバリアント１におけるエクソン１２に至るＥＧＦＲコード領域の増幅を可能にする。このセットは、特に、変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔが最終的に得られるＥＧＦＲタンパク質中に存在する場合に、変異Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＫ４６７Ｔが最終的に得られるＥＧＦＲタンパク質に存在するかどうかを決定することを可能にする。

本発明の他の態様は、配列番号６及び７のプライマーのセット、並びに／又は本発明の第２の態様で定義されたオリゴヌクレオチドからなるプライマーのセットを含むキットである。

このキットは、セツキシマブ治療に対する耐性と関連する、開示された変異を含む可能性のあるＥＧＦＲ遺伝子の領域を増幅するプライマーを含むので、このキットは、配列番号１３の変異（Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＫ４６７Ｔ）、より具体的には、配列番号１、又はそれを含む任意のアミノ酸配列の変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔ、の存在を容易かつ迅速に検出するための有用なツールである。

また、本発明の他の態様は、抗−ＥＧＦＲモノクローナル抗体を含む治療レジメンに対する対象の応答性の予測に使用するための上記に定義したキットである。あるいは、抗−ＥＧＦＲモノクローナル抗体を含む治療レジメンに対する対象の応答性を予測するための上記に定義したキットの使用である。

更に、本発明はまた、インビトロで、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む対象治療レジメンの応答性を予測する方法であって、（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料において、配列番号２のヒトＥＧＦＲのコンセンサス野生型アミノ酸配列のアミノ酸４５０からアミノ酸４７０の断片である、配列番号１２で定義される断片中に変異が存在するか存在しないかを決定し、（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意の変異の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けるか、又は工程（ｉ）における変異の非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性と関連付けることを含む、方法に関する。

従って、配列番号１２は、ヒトＥＧＦＲの野生型アミノ酸断片（又は配列）に相当し、コンセンサス野生型アミノ酸配列に関する変異は、抗ＥＧＦＲｍｏＡｂ治療の予測に関するＥＧＦＲの重要な断片として発見された、この配列番号１２内で決定される。この配列番号１２はまた、単離されたペプチドとして本発明の一部（ＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣ）を形成する。

本発明はまた、インビトロで、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む対象治療レジメンの応答性を予測する方法であって、（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料中における、以下のアミノ酸の少なくとも１つ、即ち配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステイン；配列番号２のアミノ酸配列の４６４位におけるロイシン；配列番号２のアミノ酸配列の４６５位におけるアルギニン；配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を決定し；（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意のアミノ酸の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けるか、あるいは工程ｉ）におけるこれらのアミノ酸の全ての非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性と関連付けることを含む、方法に関する。

更に、特定の実施形態では、本発明はまた、インビトロで、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む対象治療レジメンの応答性を予測する方法であって、（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料中における、以下のアミノ酸の少なくとも１つ、即ち配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステイン；及び配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を決定し；（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意のアミノ酸の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けるか、あるいは工程ｉ）におけるこれらのアミノ酸の全ての非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性と関連付けることを含む、方法に関する。

このインビトロ方法は、最終的に配列番号２のＥＧＦＲタンパク質をコードするヒトＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のエクソン１２中に、末端アミノ（−ＮＨ_２）を含む側鎖を有するアミノ酸の、酸素族からの原子を有する基を含む炭水化物側鎖を含む極性アミノ酸への変化をもたらす野生型遺伝子中でのヌクレオチドの変化があるかどうかを検出することを包含する。

インビトロでセツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性を予測する方法の実施は、対象にとってより適切な治療に適応し、無駄な時間を招く不適当又は役に立たない治療的アプローチを回避するという利点を暗示し、特に対象が癌に罹患している場合には、対象及び治療の成功にとって不可欠な側面である。

更に、これらの突然変異のいずれかの検出は、セツキシマブ治療に対する二次的耐性が、最初にＥＧＦＲ遺伝子に突然変異を有していない対象において発生しているか否かを決定することを可能にする。

従って、本発明の他の態様は、インビトロで、セツキシマブを含む治療レジメンに対する獲得耐性を判定するための方法であって、（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料中における、以下のアミノ酸の少なくとも１つ、即ち配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステイン、配列番号２のアミノ酸配列の４６４位におけるロイシン、配列番号２のアミノ酸配列の４６５位におけるアルギニン、及び配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を決定し；（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意のアミノ酸の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の獲得耐性と関連付けるか、あるいは工程（ｉ）におけるこれらのアミノ酸の全ての非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性耐性と関連付けることを含む、方法に関する。

セツキシマブによる治療後に対象における獲得耐性を決定するこのインビトロの方法により、有利には治療が停止し、更に二次的又は付随するセツキシマブ副作用を回避することが可能になる。更に、できるだけ早く他のアプローチをとることができる。

上述したように、獲得耐性を判定するためのこのインビトロの方法は、最終的に配列番号２のＥＧＦＲタンパク質をコードするヒトＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のエクソン１２中に、末端アミノ（−ＮＨ_２）を含む側鎖を有するアミノ酸の、酸素族からの原子を有する基を含む炭水化物側鎖を含む極性アミノ酸への変化をもたらす野生型遺伝子中でのヌクレオチドの変化があるかどうかを検出することを包含する。このインビトロでの方法は、最終的に配列番号１２のＥＧＦＲタンパク質断片をコードするヒトＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１の少なくともエクソン１２中に、野生型アミノ酸の嵩高いアミノ酸（即ち、分岐又は非分岐Ｃ１−Ｃ４炭化水素からなる側鎖を有し、末端アミノ基を有していてもよいもの）及び／又は極性若しくは荷電アミノ酸への変化をもたらすヌクレオチド変化があるかどうかも検出することを包含する。野生型アミノ酸は、ヒトＥＧＦＲタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列（配列番号２）によるアミノ酸を意味する。

本発明の他の態様は、インビトロで、対象から得た試料中の配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステインの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６４位におけるロイシンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６５位におけるアルギニンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を同定する方法であって、少なくとも４５０位から４７０位において配列番号２の配列を決定することを含む、方法である。

この後の態様は、インビトロで、対象から得た試料において、配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステインの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６４位におけるロイシンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６５位におけるアルギニンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を同定する方法であって、遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段により、４５１及び／又は４６４及び／又は４６５及び／又は４６７位のアミノ酸を決定することを含む方法として明確に説明することができる。

従来のサンガー配列決定（プロットＡ）、及び４５４ＧＳＪｕｎｉｏｒｐｌａｔｆｏｒｍ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）における、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって得られた配列決定の結果の２つの表示のプロット（ｐｌｏｔＢ）である。図１は、２つの試料においてセツキシマブで治療した後のＥＧＦＲ外部ドメインにおける突然変異の獲得を示す。（Ａ）患者＃３１では、治療後の腫瘍試料において、治療前生検では存在しなかったＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４００でＡ→Ｃ置換が得られ、アミノ酸４６７でリシンのスレオニンへの置換が起こった（Ｋ４６７Ｔ）。（Ｂ）患者＃３５では、治療後の腫瘍試料において、ＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド１３５１でＣ→Ｔ置換が検出され、アミノ酸４５１でアルギニンのシステインへの置換が起こった（Ｒ４５１Ｃ）。一次抗体としてセツキシマブ（図２Ａ）又はパニツムマブ（図２Ｂ）と共にインキュベートし、ヒトＩｇＧに対するフィコエリトリンと結合した二次抗体を使用した、トリプシン処理されたＮＩＨ３Ｔ３過剰発現野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）及びＫ４６７ＴＥＧＦＲ変異体のフローサイトメトリー結合分析である。Ｃは計数を意味し、ＦＬ２Ｈは、フィコエリトリン（ＰＥ）蛍光を検出するために使用される５８５±２１の帯域通過を有する蛍光検出の第２のチャネルにおける最大シグナル強度を示し、Ｅは陰性対照を意味する。一次抗体としてセツキシマブ（図３Ａ）又はパニツムマブ（図３Ｂ）と共にインキュベートし、ヒトＩｇＧに対するフィコエリトリンと結合した二次抗体を使用した、トリプシン処理されたＮＩＨ３Ｔ３過剰発現野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）及びＳ４６４ＬＥＧＦＲ変異体のフローサイトメトリー結合分析である。Ｃは計数を意味し、ＦＬ２Ｈは、フィコエリトリン（ＰＥ）蛍光を検出するために使用される５８５±２１の帯域通過を有する蛍光検出の第２のチャネルにおける最大シグナル強度を示し、Ｅは陰性対照を意味する。一次抗体としてセツキシマブ（図４Ａ）又はパニツムマブ（図４Ｂ）と共にインキュベートし、ヒトＩｇＧに対するフィコエリトリンと結合した二次抗体を使用した、トリプシン処理されたＮＩＨ３Ｔ３過剰発現野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）及びＧ４６５ＲＥＧＦＲ変異体のフローサイトメトリー結合分析を示す。Ｃは計数を意味し、ＦＬ２Ｈは、フィコエリトリン（ＰＥ）蛍光を検出するために使用される５８５±２１の帯域通過を有する蛍光検出の第２のチャネルにおける最大シグナル強度を示し、Ｅは陰性対照を意味する。

概して、説明、実施例、及び特許請求の範囲に使用される場合、以下の単語又は語句は示した定義を有する。

最新技術において、また本明細書に使用される「治療レジメン」という用語は、前癌病変、癌、又は癌転移の成長を防止、遅延、停止、又は反転することを目的とする任意の治療を意味する。それには、化学療法、放射線療法、免疫療法、モノクローナル抗体療法、又は他の方法が含まれる。

「応答」とは、腫瘍サイズ又は疾患若しくは疾患進行のエビデンスの測定可能な減少、安定した疾患、無増悪生存の増加若しくは延長、又は毒性の減少から選択される、臨床又は非臨床のいずれかの任意の種類の改善と理解されるが、これらに限定されない。

「無増悪生存」とは、癌が成長しない、治療の間及び後の時間の長さを示す。無増悪生存には、患者が完全な応答又は部分的な応答性を経験している時間の量及び患者が安定した疾患を経験している時間の量が含まれる。

治療に対する「完全な応答」は、腫瘍及び疾患の全てのエビデンスが消失している、査定できるが、測定できない疾患を有している患者として定義される。

治療に対する「部分的な応答」は、完全な応答より少ない応答性をしている患者として定義される。

「抗−ＥＧＦＲモノクローナル抗体（抗−ＥＧＦＲｍｏＡｂ）」とは、ＥＧＦＲ配列タンパク質中のエピトープを認識することのできるモノクローナル抗体及びその断片を意味する。ＥＧＦＲの異なるエピトープを認識する承認されたｍｏＡｂは、セツキシマブ及びパニツムマブであるが、他のｍｏＡｂは、本発明に開示される顔面の癌の治療レジメンにおいて使用することができる。適切な抗体断片としては、特にＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｖ、及びナノボディが挙げられる。

「遺伝子型法」という表現は、遺伝子型を決定するのに適切なこれらの全ての方法及び方法を含み、あるいはそれは、所与の位置におけるヌクレオチドを同定することと同じである。前記方法の例は、サンガー配列決定、パイロシークエンシング、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）、ＤＮＡバイオチップ／マイクロアレイ、及び動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）を包含する。

「タンパク質シークエンシング法」に関しては、タンパク質のアミノ酸配列、並びにタンパク質がとる構造及びタンパク質が任意の非ペプチド分子と複合する程度を決定することを可能にする任意の技術と理解される。アミノ酸組成の決定は、アミノ酸の加水分解又は分離により実施することができる。公知の技術としては、サンガー配列決定、エドマン分解、及び質量分光測定が挙げられる。

反対に示されないなら、ＥＧＦＲ遺伝子、ｍＲＮＡバリアント及びＥＧＦＲタンパク質に関連する全ての配列は、明細書に記載されたデータベース受託番号を有するヒト配列に関する。また、反対に示されないなら、オリゴヌクレオチド配列は５’−３’方向に示され、ペプチド配列は、ペプチド配列を書き込むための規約に従い、ペプチドのＮ末端アミノ酸（アミノ末端、ＮＨ２末端、Ｎ末端、又はアミン末端としても知られている）から出発して示される。

全てのアミノ酸配列及びオリゴヌクレオチドは、適切なペプチド又はオリゴヌクレオチド化学合成に従って合成することができる。ペプチド合成の例としては、固相合成及び液相合成が挙げられ、両者とも一方のアミノ酸のカルボキシル基又はＣ末端をもう一方のアミノ基又はＮ末端にカップリングさせる。９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）及びｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）等の保護基を用いる固相合成では、意図しない反応が回避される。また、ペプチドは、ＤＮＡ組換え技術によって得ることができる。オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト法及び保護された２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）、又は化学的に修飾されたヌクレオシドから誘導されたホスホラミダイトビルディングブロックを用いる固相合成によって得ることができる。また、オリゴヌクレオチドは適切な制限酵素によるＤＮＡ消化に由来し得る。

上記で既に説明したように、先行技術の教示は、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩでの突然変異が、ｍｏＡｂｓ（セツキシマブ及び／又はパニツムマブ）の相互作用の臨界点を位置づけるのに役立つことを示している。それにもかかわらず、これらのデータは特定のエピトープを検出するのに役立つ可能性はあるが、特定のアミノ酸交換のみがこの情報（耐性の情報、一次または二次耐性のいずれか）を包含するので、治療に対する耐性の点で結論付けてはいない。特に、治療に対する獲得耐性は、治療的アプローチを改善し、時間及び努力を浪費することを避けるために非常に重要である。

本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子のコード領域における新規変異に基づいている。本発明の新規変異は、ｍＣＲＣを有する患者のｍｏＡｂに基づく治療に対する応答性を予測するのに有用である。特に、それらは、一次耐性及び二次耐性の出現を予測するのに有用である。

既に上述したように、開示されたヌクレオチドの変化の各々は、配列番号２（ヒトＥＧＦＲタンパク質）の４５１位でのシステインへの、配列番号２の４６４位でのロイシンへの、配列番号２の４６５位でのアルギニンへの、及び配列番号２の４６７位でのスレオニンへの置換をもたらす。これらの全ての特定の突然変異は、この配列番号２のアミノ酸４５０からアミノ酸４７０の断片に位置し、ここで前記断片は配列番号１２と命名されている。

１７〜１００アミノ酸長を有し、配列番号１の配列を含む本発明のペプチドは、変異Ｒ４５１Ｃ又はＫ４６７Ｔのいずれかを含む。

特定の実施形態では、このペプチドは、Ｘ^１がＲであり、Ｘ^２がＴである配列番号１を含む配列；Ｘ^１がＣであり、Ｘ^２がＴである配列番号１を含む配列；及びＸ^１がＣであり、Ｘ^２がＫである配列番号１を含む配列からなる群から選択される。

更に特定の実施形態では、ペプチドは配列番号１、より詳細には、Ｘ^１がＲであり、Ｘ^２がＴである配列番号１；Ｘ^１がＣであり、Ｘ^２がＴである配列番号１；及びＸ^１がＣであり、Ｘ^２がＫである配列番号１からなる群から選択される配列番号１に含まれる。これらの配列は、配列番号８（ＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＴ）、配列番号９（ＣＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＴ）、及び配列番号１０（ＣＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫ）で表わされる。

特定の実施形態では、１７〜１００アミノ酸長を有し、配列番号１の配列を含むペプチドは、配列番号４を更に含む。
ＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＧＫＴＫＩＩＸ^３
（式中、Ｘ^３はＳ及びＲから選択される。）

特定の実施形態では、配列番号１及び配列番号４の両方を含むペプチドは、配列番号１から開始する連続的なアミノ酸配列に相当する。この配列は４２アミノ酸を有し、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１２によって部分的にコードされるＥＧＦＲタンパク質の断片に相当する。これは、配列番号５（Ｘ^１ＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＸ^２ＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＧＫＴＫＩＩＸ^３）で表わされるか、それからなる。

他の特定の実施形態では、１７〜１００アミノ酸長を有し、この配列番号１３の配列を含むペプチドは、配列番号４を更に含む。特定の実施形態では、配列番号１３及び配列番号４の両方を含むペプチドは、配列番号１３から開始する連続的なアミノ酸配列に相当する。それは、４２アミノ酸を有し、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１２によって部分的にコードされるＥＧＦＲタンパク質の断片に相当する。これは、配列番号１４（Ｘ^１ＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＸ^４Ｘ^５ＮＸ^２ＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＧＫＴＫＩＩＸ^３）で表わされるか、それからなる。

実際、この配列番号５は、変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔのいずれか又は全てを含み、更に変異Ｓ４９２Ｒを含む選択肢を包含する。従って、Ｘ^１、Ｘ^２、及びＸ^３は前記と同じ意味を有し、Ｘ^１がＣである場合、Ｘ^２は、ＫおよびＴから独立して選択され、Ｘ^１がＲである場合、Ｘ^２はＴである。

変異Ｓ４９２Ｒは、転移性結腸直腸癌を含む癌におけるｍｏＡｂに対する耐性もまた決定するための重要な突然変異として、Ｍｏｎｔａｇｕｔら（上記）の発明者らによって最初に開示された。

更に、配列番号１４は、変異Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＫ４６７Ｔのいずれか又は全てを含み、更に変異Ｓ４９２Ｒを含む選択肢を包含する。従って、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、及びＸ^５は前記と同じ意味を有するが、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^４、又はＸ^５の少なくとも１つは、それぞれＣ、Ｌ、Ｒ、又はＴである。

他の特定の実施形態では、配列番号１又は配列番号１３を含むペプチド配列は１７〜５０アミノ酸長を有する。他の特定の実施形態では、それは１７〜２５アミノ酸長（即ち１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）を有する。他の最も特定の実施形態では、ペプチド配列は１７アミノ酸長を有する。他の特定の実施形態では、それは、２１アミノ酸長を有し、ロイシン（Ｌ）によりＮ−末端と隣接し、トリペプチドＮ−アスパラギン−ロイシン−システイン−Ｃ（ＮＬＣと省略）によりＣ−末端と隣接する配列番号１又は配列番号１３のいずれかである。

更に、以下の実施例に示すように、本発明者らはまた、転移性結腸直腸癌を含む癌における、ｍｏＡｂに対する耐性をもたらす新規変異、即ち配列番号２（ヒトＥＧＦＲタンパク質）の４９１位のイソロイシンのメチオニンへの変化を検出した。この変異は、本明細書においてＩ４９１Ｍと命名する。アミノ酸変化Ｉ４９１Ｍは、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のヌクレオチド１４７３におけるＡ→Ｇの変化の結果である（本明細書においてＡ１４７３Ｇとしても知られる）（コドンＡＴＡがＡＴＧに変化する）。

本発明で同定された新規変異は代替物であるが、適切な治療選択を確実にするために組み合わせて使用することもできる。

本発明は、配列番号１又は配列番号１３をコードするオリゴヌクレオチドを包含する。配列番号１又は配列番号１３をコードするオリゴヌクレオチドの特定の実施形態では、場合により前記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、前記オリゴヌクレオチドは更に配列番号４をコードし、その結果、他の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号５又は配列番号１４をコードする。特定のオリゴヌクレオチドは、配列番号８〜１０のいずれかの配列をコードするヌクレオチド配列からなる。上述したようなオリゴヌクレオチドは、変異を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。

本発明のキットは、上述したプライマーセットに加え、変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７ＴのいずれかをコードするＥＧＦＲ遺伝子の野生型又は変異形態を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを含む。ＥＧＦＲ遺伝子の変異形態を検出するためのこれらのプローブは、配列番号１、５、８、９、及び１０のいずれかをコードするものから選択されるオリゴヌクレオチドに含まれる。

配列番号１、５、８、９、及び１０のいずれかをコードするものから選択されるオリゴヌクレオチドからなるプローブは、対応する変異点においてコドン縮重のいくつかの選択肢を含むヌクレオチド配列である。

変異Ｒ４５１Ｃの検出のための特定のプローブは、ＥＧＦＲの変異領域に相補的なものであり、本発明の突然変異Ｒ４５１Ｃをもたらすヌクレオチド変化が配置され、遺伝子のコード領域又は相補領域のいずれかである。従って、これらのプローブは変異を有するヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズし、上記の１３５１位のヌクレオチド変化Ｃ→Ｔを検出することを可能にする。

変異Ｋ４６７Ｔの検出のための特定のプローブは、ＥＧＦＲの変異領域に相補的なものであり、本発明の突然変異Ｋ４６７Ｔをもたらすヌクレオチド変化が配置され、遺伝子のコード領域又は相補領域のいずれかである。したがって、これらのプローブは変異を有するヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズし、上記の１４００位のヌクレオチド変化Ａ→Ｃを検出することを可能にする。

キット中の他の特定のオリゴヌクレオチドプローブは、変異Ｓ４６４Ｌ及びＧ４６５ＲのいずれかをコードするＥＧＦＲ遺伝子の野生型又は変異形態を検出するためのものである。

変異Ｓ４６４Ｌの検出のための特定のプローブは、ＥＧＦＲの変異領域に相補的なものであり、本発明の突然変異Ｓ４６４Ｌをもたらすヌクレオチド変化が配置され、遺伝子のコード領域又は相補領域のいずれかである。したがって、これらのプローブは変異を有するヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズし、上記の１３９１位のヌクレオチド変化Ｃ→Ｔを検出することを可能にする。

変異Ｇ４６５Ｒの検出のための他の特定のプローブは、ＥＧＦＲの変異領域に相補的なものであり、本発明の突然変異Ｇ４６５Ｒをもたらすヌクレオチド変化が配置され、遺伝子のコード領域又は相補領域のいずれかである。したがって、これらのプローブは変異を有するヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズし、上記の１３９３位のヌクレオチド変化Ｇ→Ａを検出することを可能にする。

「変異を有するヌクレオチド配列」は、ＤＮＡゲノム構造中のコード鎖又は相補的ＤＮＡ鎖のいずれかであり、及び翻訳されるｍＲＮＡ鎖であると理解されるべきである。

本発明のキットは、場合により上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、ＫＲＡＳ及び／又はＰＩＫ３ＣＡ、及び／又はＢＲＡＦ遺伝子、及び／又はＥＧＦＲ遺伝子中の更なる変異を検出するための試薬を更に含み得る。これらの試薬は、これらの全ての遺伝子における特定の変異、特にセツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む治療レジメンに対する耐性と関連する変異を検出するための特異的プライマーを含む。キットに含まれる他の試薬は、これら全ての遺伝子の野生型又は変異形態のいずれかとハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブに関する。

従って、特定の実施形態では、場合により上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、Ｋａｒａｐｅｔｉｓら、「Ｋ−ｒａｓＭｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄＢｅｎｅｆｉｔｆｒｏｍＣｅｔｕｘｉｍａｂｉｎＡｄｖａｎｃｅｄＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＣａｎｃｅｒ」、ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ−２００８、Ｖｏｌ．３５９、ｐｐ．：１７５７−１７６５で定義されているように、前記キットは、Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ａ；Ｇ１３Ｃ，Ｇ１３Ｄ；Ｇ１３Ｖからなる群から選択されるＫＲＡＳ中の変異を検出するためのツール及び手段（試薬）を含む。これら全ての変異は、２０１１年７月２４からＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４９７６．２（ＧＴＰａｓｅＫＲａｓアイソフォームｂ前駆体と命名された）及び２０１１年７月２４日からＮＰ＿２０３５２４．１（ＧＴＰａｓｅＫＲａｓアイソフォームａ前駆体と命名された）と同定されたＫ−ｒａｓのタンパク質配列のコドン１２及び１３に位置する。他の好ましい実施形態では、キットは、２０１１年７月１７日からＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２０９．２を有するＰＩＫ３ＣＡタンパク質を体系化するＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエクソン９及び２０の変異、並びに／又は２０１１年７月２４日からＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３２４．２と同定されたＢＲＡＦのタンパク質配列のコドン６００に位置するＶ６００Ｅ変異を検出するための試薬を含む。他の好ましい実施形態では、キットは、配列番号２のＥＧＦＲタンパク質中の変異Ｓ４９２Ｒを検出するための手段（試薬）を含む。他の好ましい実施形態では、キットは、配列番号２のＥＧＦＲタンパク質中の変異Ｉ４９１Ｍを検出するための手段（試薬）を含む。

本発明のキットは、特に抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、特にセツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性の予測に使用するためのものである。より具体的には、対象は癌に罹患しており、癌は転移性結腸直腸癌である。

本発明の一態様による本発明は、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む対象治療レジメンの応答性を予測するインビトロ方法であって、（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料中の配列番号２のヒトＥＧＦＲのコンセンサス野生型アミノ酸配列のアミノ酸４５０からアミノ酸４７０の断片である、配列番号１２で定義される断片中に変異が存在するか存在しないかを決定し、（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意の変異の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けるか、あるいは工程（ｉ）における変異の非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性耐性と関連付けることを含む、方法に関する。

インビトロでの方法の特定の実施形態においては、工程（ｉ）において、配列番号１２中に以下の変異；即ち配列番号２の４５１位におけるアルギニンのシステインへの変化；配列番号２の４６４位におけるセリンのロイシンへの変異；配列番号２の４６５位におけるグリシンのアルギニンへの変異、及び配列番号２の４６７位におけるリシンのスレオニンへの変異の少なくとも１つが存在するか存在しないかを決定する。

他の特定の実施形態では、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む対象治療レジメンの応答性を予測するインビトロ方法であって、該方法は、（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料中における、以下のアミノ酸の少なくとも１つ、即ち配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステイン；配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を決定し；（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意のアミノ酸の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けるか、あるいは工程（ｉ）におけるこれらのアミノ酸の全ての非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性と関連付けることを含む。

この特定の実施形態は、対象の試料中に配列番号１が存在するかどうかを決定し、工程（ｉｉ）において、変異Ｒ４５１Ｃ及び／又はＫ４６７Ｔのいずれかの存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けるか、あるいは工程（ｉ）におけるこれらのアミノ酸の全ての非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性と関連付けることを含む。

前記方法の更に特定の実施形態では、場合により上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、あるいは工程（ｉ）の下で、追加的に配列番号４が対象の試料中に存在するかどうかを決定することを包含する。従って、変異Ｒ４５１Ｃ及び／又はＳ４６４Ｌ及び／又はＧ４６５Ｒ及び／又はＫ４６７Ｔが存在するかどうかを決定した後、方法は、変異Ｓ４９２ＲがＥＧＦＲタンパク質中に存在するかどうかをも決定することを含む。

変異Ｓ４９２Ｒの検出は、場合により上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、工程（ｉ）が配列番号２のアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在又は非存在を決定することを更に含み、工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）において同定されたアルギニンの更なる存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付ける、インビトロでの方法の特定の実施形態に関する。

他の特定の実施形態では、場合により上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む対象治療レジメンの応答を予測するインビトロ方法は、工程（ｉ）において、配列番号２のアミノ酸配列の４９１位におけるメチオニンの存在又は非存在を決定し、工程（ｉｉ）において工程（ｉ）で同定されたメチオニンの更なる存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けることを更に含む。

他の特定の実施形態では、場合により上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、工程（ｉ）は、配列番号６及び７からなるプライマーのセットを用いて実施する。

上記のプライマーによる増幅に加えて、特定の実施形態において、工程（ｉ）は遺伝子型法によって実施される。他の最も特定の実施形態では、場合により上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、前記遺伝子型法は、サンガー配列決定、ピロシーケンス、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）、ＤＮＡバイオチップ／マイクロアレイ、及び動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）から選択される。更に最も特定の実施形態は、遺伝子型方法はピロシーケンスである。

ピロシーケンス遺伝子型法の例としては、特に４５４個の高出力ピロシーケンス、合成による配列決定（イルミナ）、及びチェーンターミネーションシーケンス（サンガー配列決定）として知られる次世代配列決定（ＮＧＳ）方法が挙げられる。

また、工程（ｉ）は、増幅された領域の遺伝子型決定方法として野生型又は突然変異点を検出するための特異的プローブを含む。特定のプローブは、配列番号１、配列番号５、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０をコードするオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは全て、変異したＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド配列に相補的である。

インビトロでセツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性を予測する方法は、本発明のＥＧＦＲ遺伝子におけるヌクレオチド変化が検出され得る腫瘍を含む試料中で実施される。ｍＣＲＣの場合、源から得た試料を直接使用してもよく、又は前処理後の試料を使用してもよい。試料は前記腫瘍に隣接する正常組織を更に含んでもよい。従って、ｍＣＲＣの場合、試料は原発性結腸直腸癌生検又はその転移の生検から選択される。言い換えると、試料は、原発性腫瘍及び転移を含む、結腸直腸癌試料由来の生検であってもよい。好ましい実施形態において、転移は肝組織にある。

新規に同定された変異を有する患者は、任意の適切な臨床又は準臨床での無増悪生存の増加又は延長により測定されるように、セツキシマブを含まない治療レジメンに対する応答を示すようである。

好ましい実施形態では、治療レジメンは、セツキシマブ単独であるか、又はイリノテカン、オキサリプラチン及び／若しくは５−フルオロウラシル（５−ＦＵ又は５ＦＵ）に基づいた化学療法レジメンとの併用である。好ましい実施形態では、治療レジメンはパニツムマブ単独であるか、又はイリノテカン、オキサリプラチン及び／又は５−フルオロウラシルに基づいた化学療法レジメンとの併用である。

本発明はまた、癌、好ましくはｍＣＲＣを発症した対象のための治療レジメンを決定及び／又は推奨する方法であって、（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料中における、以下のアミノ酸の少なくとも１つ、即ち配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステイン；及び配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を決定し；（ｉｉ）前記変異が全て存在しない場合に、セツキシマブ又はその組成物の有効量を、前記変異の少なくとも１つが存在する場合にパニツムマブ又はその組成物を前記対象に投与することを推奨することを含む方法を提供する。

本発明は、また、本態様の特定の実施形態では、セツキシマブを含む治療レジメンに対する獲得耐性を判定するためのインビトロ方法であって、（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料中における、以下のアミノ酸の少なくとも１つ、即ち配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステイン及び配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を決定し；（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意のアミノ酸の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の獲得耐性と関連付けるか、あるいは工程（ｉ）におけるこれらのアミノ酸の全ての非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性と関連付けることを含む、方法を包含する。

上記のように、本発明はまた、インビトロで、遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料中における、配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステイン及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を同定する方法を提供する。好ましい実施形態では、インビトロで、配列番号２中のこれらの変異の一方又は両方の存在又は非存在を同定する方法は、遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、配列番号２のアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在又は非存在を同定することを更に含む。

特定の実施形態では、場合により上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、配列番号２のアミノ酸配列の４５１位におけるシステインの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６４位におけるロイシンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６５位におけるアルギニンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２のアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を同定する方法は、遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、配列番号２の配列を４６７位まで決定することにより実施される。好ましい実施態様では、該方法は、配列番号２の４５０〜４７０位まで（配列番号１２）、更に好ましくは４５１〜４６７位までの配列を決定することにより実施される。「位まで配列を決定する」とは、配列決定が、前記配列の１位のオリゴヌクレオチド又はアミノ酸から目的の位置（ヌクレオチド又はアミノ酸）（この特定のケースでは、４６７位のアミノ酸又はこのアミノ酸をもたらすヌクレオチドまで）まで実施されることと理解される。

本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」という用語及びその用語の変形は、他の技術的特徴、付加物、成分、又は工程を除外することを意図していない。更に、「含む」という用語は「からなる」という表現を包含する。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、本明細書を精査すれば当業者に明らかになるであろう、あるいは本発明の実施により習得できる。以下の実施例及び図面は例示の目的で提供され、それらは本発明を限定することを意図するものではない。更に、本発明は、本明細書に記載される特定の及び好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを含む。

実施例１．腫瘍試料および患者

定期的な臨床診療において、セツキシマブに基づく治療後に出現する異種変異の存在について試験を行い、特徴付けるための概念実証アプローチを実施した。２０１０年１月から２０１３年６月まで、ＰａｒｃｄｅＳａｌｕｔＭａｒＢｉｏｂａｎｋ（ＭＡＲＢｉｏｂａｎｃ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）ＨｏｓｐｉｔａｌｄｅｌＭａｒ施設で抗ＥＧＦＲｍｏＡｂで治療された全てのｍＣＲＣの同意患者をこの試験に含めた。３４例の患者において、この試験のために標本を前向きに集め、３例の患者について、過去に採取した連続的な生検を定期的な臨床管理の観点から分析した。この分析では、良好な質のペアの治療前及び治療後生検を有し、ａ）完全応答若しくは部分応答、又はｂ）１６週間を超える安定疾患に続く進行性疾患として定義される抗ＥＧＦＲに基づく治療に対する耐性を獲得した患者のみが含まれていた（７〜９）。応答性は、固形腫瘍の応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、「Ｎｅｗｒｅｓｐｏｎｓｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｃｒｉｔｅｒｉａｉｎｓｏｌｉｄｔｕｍｏｕｒｓ：ｒｅｖｉｓｅｄＲＥＣＩＳＴｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．１）」、ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ２００９、Ｖｏｌ．４５（２）：２２８−２４７）に従って評価した。定期的診断手順の際に得られた腫瘍生検を治療前（初期）試料として使用した。殆どの場合、この試料は定期的な大腸内視鏡検査の際に原発腫瘍から得られた。転移部位からの第２の初期生検は定期的ではなく、病理学的診断に必要でない限り実施されなかった。試験には、この余分な手順に同意した患者において治療が失敗した後の再生検が含まれていた。進行時の再生検は、最も接近可能な病変から得られ、倫理的考慮による患者の関連する合併症の潜在的危険性はより低くなる。血清試料は、セツキシマブに基づく治療の開始前及び進行時に収集した。治療後に生検試料において変異が検出された場合には、その同じ患者由来の血清試料をその特定の変異について分析した。本試験では、直接配列決定によるＥＧＦＲＳ４９２Ｒ、ＫＲＡＳエクソン２、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ、及びＰＩＫ３ＣＡ変異についてすでに評価された９例（患者＃２１〜＃２８および患者＃３６）が含まれ、最新の試験では、ディープシーケンシング技術を用いて、報告された変異（Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔ）を分析した。生物学的試料は、ＰａｒｃｄｅＳａｌｕｔＭａｒＢｉｏｂａｎｋ（ＭＡＲＢｉｏｂａｎｃ）から入手した。本試験は、地方倫理委員会（ＣＥＩＣ−２０１２／４７４１／Ｉ）の承認を得ている。全ての参加患者は書面によるインフォームドコンセントに署名した。

ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＥＧＦＲの配列決定のために、腫瘍試料からのＤＮＡ抽出をＤｉａｚら（「ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔａｒｇｅｔｅｄＥＧＦＲｂｌｏｃｋａｄｅｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｓ」、Ｎａｔｕｒｅ−２０１２、ＶｏｌＮｏ．４８６、ｐｐ．：５３７−４０）によって既に記載されているようにして実施した。ＫＲＡＳ（エクソン２、３、及び４）、ＢＲＡＦ（エクソン１５）、ＮＲＡＳ（エクソン２及び３）、ＰＩＫ３ＣＡ（エクソン９及び２０）、並びにおＥＧＦＲ（エクソン１２、１３）の変異分析は、製造業者の説明書に従い、ＢｉｇＤｙｅｖ３．１（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いたサンガー配列決定により実施し、３５００ＤｘＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。全てのケースは、ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）４５４ＧＳＪｕｎｉｏｒプラットフォーム（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたピロシーケンスによってスクリーニングした。更に、処理されて質で選別された読取りデータを、ＧＳＡｍｐｌｉｃｏｎＶａｒｉａｎｔＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェアバージョン２．５ｐ１（Ｒｏｃｈｅ）を用いて分析した。特定のアッセイが利用可能である場合、ＮＧＳによって検出された変異は、競合的対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ（ＣＡＳＴ−ＰＣＲ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって確認された。

ＥＧＦＲ配列のためのプライマーは、上記に開示され、配列番号６及び７に含まれるプライマーのセットによって定義されたものであった。配列番号６及び配列番号７の対は、変異Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７Ｔ、並びにいくつかのイントロン隣接領域を含み得るエクソン１２を完全増幅するのに役立った。この配列は、配列番号１１：
ｃａａａｇｔｔｔｔｃａｇｇｇａｔａｃａｔｔｇｔｔｔｔｔａｔａｔｔｔｔｃａｃｃａｃａｔｇａｔｔｔｔｔｃｔｔｃｔｃｔｃｃａａｔｇｔａｇＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡｇｔａａｇｔｃａｃｃｇｃｔｔｔｃｔｇｔｔｔａｇｔｔｔａｔｇｇａｇｔｔｇｇｔｔｃｔａａｔｇｇｇｔｃｃｔｔｔａｔｔｔｇｔａｔｔｔａｇａａｔａｔｔｇａａｇｇｇｃｔａｔｔｃｃｃａｔｔｔａａ；
（式中、下線を引いたヌクレオチドは、一連のプライマーに対して同一（配列番号６に対して）又は相補的（配列番号７に対して）な配列に相当し、大文字はエクソン１２に相当し、小文字はイントロン断片である）により表わされる。

増幅は以下の条件：即ち、９５oＣで１０分間；９５oＣで１分間を４０サイクル、６０oＣで１分３０秒、及び７２oＣで１分間；７２℃で１０分間の最後の伸長で実施した。

また、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を実施した。ＦＩＳＨは、突然変異の解析後に十分な残存物質が存在する場合にいつでも実施した。ＥＧＦＲの増幅は、既に開示されているようにして（例えば、Ｓａｌｉｄｏら、「ＩｎｃｒｅａｓｅｄＡＬＫｇｅｎｅｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｒｅｆｒｅｑｕｅｎｔｉｎｎｏｎ−ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ」、ＪＴｈｏｒａｃＯｎｃｏｌ−２０１１、Ｖｏｌ．Ｎｏ．６、ｐｐ．：２１−７のような文献）、ＬＳＩＥＧＦＲ／ＣＥＰ７プローブ（ＡｂｂｏｔｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｃ．、ＤｅｓＰｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）を用いた蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって評価した。ＫＲＡＳの増幅は、ＫＲＡＳ／ＣＥＰ１２プローブ（Ａｂｎｏｖａ）を用いた二重色ＦＩＳＨアッセイを用いて分析した。分析した５０個の核の少なくとも１０％の試料において、ＫＲＡＳ／ＣＥＰ１２比が３より大きいとスコア化された。第１２染色体の平均数が細胞あたり２．５又は４を超えた場合に、このケースは、それぞれポリソーム又は高ポリソームと考えられた。

実施例２Ｒ４５１Ｃ及びＫ４６７ＴＥＧＦＲ変異の存在及びセツキシマブに対する耐性獲得

ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）４５４ＧＳＪｕｎｉｏｒｐｌａｔｆｏｒｍ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の２つの異なるディスプレイのプロットである図１に示すように、一部の患者はセツキシマブ治療後にＥＧＦＲ外部ドメインに変異を獲得した。図１（Ａ）は、治療後の腫瘍試料が、治療前生検では存在しなかったＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４００にＡ→Ｃ置換を獲得し、アミノ酸４６７位でのリシンのスレオニンへの置換を引き起こした（Ｋ４６７Ｔ）患者＃３１を示す。この置換は、遺伝子型決定法によって検出され、この位置のダブルピック（バンドまたはカーブ）によって視覚化（矢印）される。下方のピックはＣヌクレオチドに相当する。

別の側面では、図１（Ｂ）では、患者＃３５からのシーケンシングプロセスの表示（参照からの参照）が示されており、ＥＧＦＲ遺伝子のヌクレオチド１３５１のＣ→Ｔ置換が治療後の試料において検出され、アミノ酸４５１におけるアルギニンのシステインへの置換をもたらす（Ｒ４５１Ｃ）。置換はまた矢印でマークされ、この場合、変化は負の値で視覚化される。

実施例３配列番号１２（配列番号２のアミノ酸４５０からアミノ酸４７０の断片）の変異は、セツキシマブ治療に対する耐性に関与している。

３Ａ：ＣＲＣ細胞モデルにおけるＥＧＦＲ外部ドメイン変異およびセツキシマブ耐性獲得

ＣＲＣ細胞における耐性の獲得が、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＮＲＡＳ活性化突然変異の出現と関連することは、以前に報告されている。ＥＧＦＲ遮断に対する耐性の更なるメカニズムを見つけるために、セツキシマブに対して非常に感受性の高い５つのＣＲＣ細胞株（ＤｉＦｉ、ＬＩＭ１２１５、ＨＣＡ−４６、ＮＣＩＨ５０８、ＯＸＣＯ−２およびＣＣＫ８１）を利用した。これらの細胞株は、全てＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＰＩＫ３ＣＡの野生型であるが、ｐ．Ｅ５４５ＫＰＩＫ３ＣＡ変異を示すＮＣＩＨ５０８は例外である。全体として、これらの細胞モデルは、抗ＥＧＦＲ療法に応答する可能性が高いＣＲＣ患者からの腫瘍の分子的特徴を概括している。各系統について、少なくとも５００万個の細胞を、耐性集団が出現するまでセツキシマブに連続的に曝した。耐性獲得の基礎となる分子メカニズムの意味を明確にするために、ＥＧＦＲシグナル伝達経路（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ）の調節に関与する遺伝子のサンガー配列決定を最初に行った。以前の報告によれば、耐性集団はＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＮＲＡＳ変異を示す場合があった（Ｍｉｓａｌｅら「Ｂｌｏｃｋａｄｅｏｆｅｇｆｒａｎｄｍｅｋｉｎｔｅｒｃｅｐｔｓｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｎｔｉ−ｅｇｆｒｔｈｅｒａｐｉｅｓｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ」、ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ− ２０１４；６：２２４ｒａ２２６を参照されたい）。これらの対立遺伝子の全ては耐性細胞内で検出されたが、それらが由来する対応の親集団では検出されなかった。重要なことに、いくつかの場合においては、耐性細胞集団に複数の遺伝子改変が同時に存在しており、そのポリクローナル状態を示した。したがって、個々のクローンの分子的特徴を評価するために、ＬＩＭ１２１５及びＣＣＫ８１の限定細胞希釈を行い、その後、これらの細胞株はこの手順に従う。次いで、単一のクローンを候補遺伝子（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ）についてサンガー配列決定に供した。次いで、候補遺伝子（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、及びＰＩＫ３ＣＡ）について、単一のクローンをサンガー配列決定に供した。注目すべきことに、クローンの変異プロファイリングにより、３種の新規なＥＧＦＲバリアント：Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＩ４９１Ｍが同定された。変異Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒは、実施例２の変異（Ｒ５４１Ｃ及びＫ４６７Ｔ）とともに、配列番号１２（セツキシマブ結合エピトープの一部を定義する断片）中に位置する。耐性誘導体がポリクローナルであり、サンガー配列決定法の感度に制限があることを考慮すると、細胞集団の２０％未満に存在するバリアントは検出されなかった可能性があると想定された。低頻度で存在する変異を同定するために、１：２００００の変異／野生型感受性を有することが知られているドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用した。ｄｄＰＣＲプローブを設計し、対照の変異体ＤＮＡを用いて個別に検証し、腫瘍生検又は細胞株で以前に同定されたＥＧＦＲバリアントを検出した。この分析により、耐性細胞集団においてサンガー配列決定により検出されなかった３種の新規なＥＧＦＲバリアント（Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＩ４９１Ｍ）の存在が明らかになった。十分な材料が残っていないため、ｄｄＰＣＲは組織試料中で実施することができなかった。全体的に、セツキシマブに対する耐性を獲得した細胞株の変異の状況は、セツキシマブ治療で再発した腫瘍の分子プロファイルを要約している。

ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＥＧＦＲアッセイ（ＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）ｄｄＰＣＲ（商標）変異アッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ及び特注設計品）を用いたｄｄＰＣＲ（商標）ＳｕｐｅｒｍｉｘｆｏｒＰｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。ｄｄＰＣＲを製造業者のプロトコールに従って実施し、その結果を、全ての（変異体＋野生型）ＤＮＡ対立遺伝子に対する変異ＤＮＡ対立遺伝子の割合又は分数存在量として報告した。８〜１０μｌのＤＮＡ鋳型を１０μｌのｄｄＰＣＲ（商標）ＳｕｐｅｒｍｉｘｆｏｒＰｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及び２μｌのプライマー／プローブ混合物に添加した。この２０μｌの試料を７０μｌのＤｒｏｐｌｅｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＯｉｌｆｏｒＰｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に加え、液滴を生成するために使用した。次いで、９５℃で５分間、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間を４０サイクル、続いて９８℃で１０分間（ランプ速度２℃／秒）の条件で液滴を熱サイクルさせた。次いで、ＦＡＭおよびＨＥＸプローブの蛍光測定のために、試料をＱＸ２００（商標）液滴リーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。陽性及び陰性対照に基づいてゲーティングを実施し、変異集団を同定した。野生型ＤＮＡバックグラウンドにおける突然変異型ＤＮＡの分数存在量を、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて各試料について計算した。各試料について複数回の複製（最低４回）を実施した。細胞株由来の正常の対照ｇＤＮＡおよびＤＮＡ鋳型を含まない（水）対照のｄｄＰＣＲ分析を、全ての試料と並行して実施したが、汚染のない対照として複数回の複製を再度行った。ＥＧＦＲプローブ及びプライマー配列は、要求に応じて入手可能である。

本明細書で利用される細胞培養及び耐性細胞の作製は、既に以前に開示されている（ＭｉｓａｌｅＳらＥｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆＫＲＡＳｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｎｔｉ−ＥＧＦＲｔｈｅｒａｐｙｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８６：５３２−６；ＭｉｓａｌｅＳ、ＡｒｅｎａＳらＢｌｏｃｋａｄｅｏｆＥＧＦＲａｎｄＭＥＫｉｎｔｅｒｃｅｐｔｓｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｎｔｉ−ＥＧＦＲｔｈｅｒａｐｉｅｓｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１４；６：２２４ｒａ２６を参照されたい）。５％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）を補充したＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＣＣＫ８１細胞を培養し、３７℃及び５％ＣＯ_２空気インキュベーター（ａｉｒｉｎｃｕｂａｔｏｒ）中で増殖させた。ＣＣＫ８１セツキシマブ耐性誘導体は、６ヶ月間、セツキシマブの投与量を６８０ｎＭから１．４μＭまで段階的に増加させることによって得られた。

３Ｂ：Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＫ４６７ＴＥＧＦＲ変異の存在、並びにセツキシマブに対する耐性

本発明のＳ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＫ４６７ＴＥＧＦＲ変異が、セツキシマブに対して観察された耐性に関与しているかどうかを確認するために、全長の野生型ＥＧＦＲ及びＳ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、又はＫ４６７ＴＥＧＦＲ突然変異のいずれかを、検出可能な内在性ＥＧＦＲ発現を欠く培養ＮＩＨ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞株中で異所的に発現させた。

トランスフェクト細胞中、セツキシマブ又はパニツムマブの存在下で、ＥＧＦＲをその天然リガンドＥＧＦで刺激した。抗体結合は、フィコエリトリン（ＰＥ）と結合したヒトＩｇＧに対する二次抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析した。空のベクターを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を陰性対照（ＥＭＰＴＹ）として使用した。抗体に結合する細胞の割合を、図２〜４の二次元ドットプロットに示す。図２〜４では、蛍光検出のＦＬ２Ｈチャネルにおける細胞カウント（「カウント」のＣ、Ｙ軸）を、セツキシマブを用いたアッセイ（図２Ａ、３Ａおよび４Ａ）、パニツムマブを用いたアッセイ（図２Ｂ、３Ｂおよび４Ｂ）についてプロットした。

野生型ＥＧＦＲ細胞（図２〜４Ａ／Ｂ中、ＥＧＦＲＷＴ）では、セツキシマブ及びパニツムマブはいずれもＥＧＦＲの活性化を阻害したが、Ｋ４６７Ｔ変異（図２Ａ／Ｂ中、ＥＧＦＲ＿Ｋ４６７Ｔ）、Ｓ４６４Ｌ（図３Ａ／Ｂ中、ＥＧＦＲ＿Ｓ４６４Ｌ）、及びＧ４６５Ｒ（図４Ａ／Ｂ中、ＥＧＦＲ＿Ｇ４６５Ｒ）を有する細胞では、パニツムマブは、ＥＧＦが誘発するＥＧＦＲの活性化を効率的に遮断したが、セツキシマブは遮断しなかった。ＥＭＰＴＹは陰性対照（ＥＧＦＲ非発現細胞）である。ＤＮＡ構築物、ｐＬＸ３０１−ＥＧＦＲＷＴ構築物については、Ｃ．Ｓｕｎ博士及びＲ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ教授（ＮＫＩ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）からの寄贈物がｐＬＸ３０１（Ａｄｄｇｅｎｅ（登録商標））から構築された。鋳型ＤＮＡとしてｐＬＸ３０１−ＥＧＦＲＷＴプラスミドを有するＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ部位特異的突然変異誘発キットを用いて、４点突然変異（Ｒ４５１Ｃ、Ｓ４６４Ｌ、Ｇ４６５Ｒ、及びＫ４６７Ｔ）を含むＥＧＦＲ変異体を構築した。変異の存在は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

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- Salido et al., "Increased ALK gene copy number and amplification are frequent in non-small cell lung cancer", J Thorac Oncol - 2011, Vol. No. 6, pp.:21-7.
- Diaz et al. "The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers", Nature-2012, Vol No. 486, pp.:537-40.
- Misale et al. "Blockade of egfr and mek intercepts heterogeneous mechanisms of acquired resistance to anti-egfr therapies in colorectal cancer", Sci Transl Med- 2014;6:224ra226.

Claims

癌に罹患した対象から得た試料中、配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６４位におけるロイシンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６５位におけるアルギニンの存在又は非存在；及び／又は配列番号２に対応するアミノ酸配列の４６７位におけるスレオニンの存在又は非存在を同定する、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性の予測に使用するためのキットであって、
前記キットは、配列番号６（ＣＡＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴ）及び配列番号７（ＴＴＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴ）からなるプライマーセットを含む、キット。
更に、ＫＲＡＳ及び／又はＰＩＫ３ＣＡ、及び／又はＢＲＡＦ遺伝子の変異、及び／又はＥＧＦＲ遺伝子内の追加の変異を検出するための試薬を含む、請求項１に記載のキット。
インビトロで、セツキシマブ及び／又はパニツムマブを含む治療レジメンに対する癌に罹患した対象の応答性を予測する方法であって、
（ｉ）遺伝子型法、及び／又はタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって、対象から得た試料において、以下の変異の少なくとも１つが存在するか存在しないかを決定し：
配列番号２の４６４位におけるセリンのロイシンへの変異；
配列番号２の４６５位におけるグリシンのアルギニンへの変異；及び／又は
配列番号２の４６７位におけるリシンのスレオニンへの変異；
（ｉｉ）工程（ｉ）において同定された任意の変異の存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付けるか、又は工程（ｉ）における変異の非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答性と関連付けることを含む、方法。
工程（ｉ）を、請求項１又は２に記載のキットを用いて実施する、請求項３に記載のインビトロでの方法。
工程（ｉ）が配列番号２に対応するアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在又は非存在を決定することを更に含み、工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）において同定されたアルギニンの更なる存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の耐性と関連付ける、請求項３又は４に記載のインビトロでの方法。