JP6897724B2 - 細胞培養液回収フィルタユニット、細胞培養液回収方法、及び細胞培養液回収キット - Google Patents

細胞培養液回収フィルタユニット、細胞培養液回収方法、及び細胞培養液回収キット Download PDF

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Description

本発明は、細胞培養液回収フィルタユニット、細胞培養液回収方法、及び細胞培養液回収キットに関する。
細胞（培養細胞）が増殖を行うためには、栄養源となる培地が必要となる。この培地は、一定期間毎に交換する必要がある。培地を交換する方法としては、例えば、遠心分離を用いる方法が知られている（特許文献１参照）。
遠心分離を用いて培地を交換する方法は、例えば、以下のようにして行われる。
まず、培地の交換対象となる容器内の細胞を含む細胞培養液を複数の遠沈管に分注する。次いで、各遠沈管を遠心分離機にかけ、各遠沈管の底部に細胞を集める。次いで、各遠沈管内の細胞培養液の一部である上清液を回収する。次いで、各遠沈管に残った細胞を含む細胞培養液を容器に戻す。次いで、新しい細胞培養液を容器に入れる。これにより、容器内の培地の交換が完了する。
特開２００４−１０５１３９号公報
前記遠心分離を用いて培地を交換する方法においては、細胞培養液の一部である上清液を回収する工程が作業者（人）によって行われている。このため、作業者によっては、上清液のみならず、細胞まで回収してしまい、容器内の細胞の残存率が減ってしまうことが起こり得る。すなわち、作業者によって、細胞の残存率に大きなバラツキがある。また、細胞培養液の回収に要する時間も長くなる。
本発明の目的は、前記課題を解決することにあって、細胞の残存率のバラツキを抑えるとともに、細胞培養液の回収に要する時間を短縮することができる、細胞培養液回収フィルタユニット、細胞培養液回収方法、及び細胞培養液回収キットを提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明の一態様に係る細胞培養液回収フィルタユニットによれば、細胞培養液に含まれる細胞を濾過する金属製多孔膜と、
前記金属製多孔膜の外周部を保持する保持部材と、
前記細胞培養液の流路となる中空部分が前記金属製多孔膜の主面の少なくとも一部と対向するように前記保持部材に接続された管状部材と、
を備える。
また、本発明の一態様に係る細胞培養液回収方法は、細胞培養液に含まれる細胞を濾過する金属製多孔膜と、前記金属製多孔膜の外周部を保持する保持部材と、前記細胞培養液の流路となる中空部分が前記金属製多孔膜の主面の少なくとも一部と対向するように前記保持部材に接続された管状部材とを備える細胞培養液回収フィルタユニットを、細胞を含む細胞培養液が入れられた容器内に配置するフィルタユニット配置工程と、
前記容器内の細胞培養液を、前記金属製多孔膜を通じて前記流路内に取り込み、前記容器の外部で回収する回収工程と、
を含む。
本発明の一態様に係る細胞培養液回収フィルタユニット及び細胞培養液回収方法によれば、細胞の残存率のバラツキを抑えるとともに、細胞培養液の回収に要する時間を短縮することができる。
本発明の実施の形態に係る細胞培養液回収フィルタユニットの概略構成を示す斜視図である。 図１の細胞培養液回収フィルタユニットの分解斜視図である。 図１の細胞培養液回収フィルタユニットの分解断面図である。 図１の細胞培養液回収フィルタユニットの組立断面図である。 図４の一部拡大断面図である。 金属製多孔膜の概略構成を示す一部拡大斜視図である。 金属製多孔膜の変形例の概略構成を示す一部拡大平面図である。 金属製多孔膜の概略構成を示す平面図である。 細胞培養液回収及び交換方法の一例を示す概略図である。 細胞培養液回収及び交換方法の変形例を示す概略図である。 図１の細胞培養液回収フィルタユニットを用いて容器内の細胞培養液を交換したときの細胞の残存率、交換時間を示す表であって、比較例として遠心分離機を用いて容器内の細胞培養液を交換したときの細胞の残存率、交換時間も示す表である。 遠心分離機を用いて細胞を含む細胞培養液を交換する工程を示す概略図である。 図１２Ａに続く工程を示す概略図である。 図１２Ｂに続く工程を示す概略図である。 図１２Ｃに続く工程を示す概略図である。 図１２Ｄに続く工程を示す概略図である。 図１２Ｅに続く工程を示す概略図である。
本発明の一態様に係る細胞培養液回収フィルタユニットは、
細胞培養液に含まれる細胞を濾過する金属製多孔膜と、
前記金属製多孔膜の外周部を保持する保持部材と、
前記細胞培養液の流路となる中空部分が前記金属製多孔膜の主面の少なくとも一部と対向するように前記保持部材に接続された管状部材と、
を備える。
この構成によれば、細胞培養液に含まれる細胞を濾過する金属製多孔膜を備えているので、金属製多孔膜によって細胞を濾過して容器内に残し、細胞培養液のみを培養液流路を通じて回収することが可能になる。これにより、細胞の残存率のバラツキを抑えることができ、高い残存率を実現することもできる。また、金属製多孔膜は、例えば樹脂製多孔膜などに比べて細胞が付着し難い性質を有するので、細胞によって膜の孔が閉塞されることにより細胞培養液の回収が阻害されることを抑えることができる。従って、細胞培養液の回収に要する時間を短縮することができる。
なお、前記保持部材は、前記金属製多孔膜の外周部を挟持する第１枠部材及び第２枠部材を備え、前記金属製多孔膜の外周部は、第１曲げ部と第２曲げ部とを有するとともに、前記第１曲げ部と前記第２曲げ部との間に筋状凸部を有するように前記第１枠部材と前記第２枠部材とに挟持されることが好ましい。この構成によれば、金属製多孔膜が第１曲げ部と第２曲げ部との間に筋状凸部を有することによって、第１枠部材及び第２枠部材と金属製多孔膜の外周部との間の摩擦力を増加させることができる。これにより、細胞培養液の回収を、高流速で行ったとしても、枠部材から金属製多孔膜の脱落を防ぐことができる。そのため、細胞培養液を短時間で回収できるようになる。
また、前記筋状凸部は、前記第１曲げ部と前記第２曲げ部との間に複数設けられ、複数の前記筋状凸部は、不規則な向きに配置されることが好ましい。この構成によれば、第１枠部材及び第２枠部材と金属製多孔膜の外周部との間の摩擦力を増加させることができ、金属製多孔膜に対する第１枠部材及び第２枠部材の保持力を一層向上させることができる。
また、前記保持部材の前記管状部材から離れる側の主面には、当該保持部材の厚み方向に突出する環状の凸部が設けられ、前記金属製多孔膜は、前記凸部の内側に配置されることが好ましい。この構成によれば、容器の底部により近い位置に金属製多孔膜を配置することができ、金属製多孔膜の下方の主面まで液面を低下させることができる。そのため、細胞の残存率を低下させることなく、細胞培養液の回収量を多くすることができる。また、容器の底部により近い位置に金属製多孔膜を配置することで、金属製多孔膜により多くの液量が接することになるので、細胞が金属製多孔膜に付着しても洗い流されて目詰まりし難くすることができる。また、細胞培養液の回収後に、金属製多孔膜を介して細胞培養液を供給する際、金属製多孔膜に付着した細胞が、細胞培養液の通過時に、金属製多孔膜から脱離しやすくなり、目詰まりを一層抑えることができる。その結果、作業時間の短縮化を図ることができる。また、目詰まりによる管状部材内の圧力上昇を抑えることができ、細胞へのストレスを低減することができる。
また、前記金属製多孔膜は、前記保持部材の凸部の先端部で画定される開口面に対して面一又は略面一になるように配置されることが好ましい。この構成によれば、容器の底部により一層近い位置に金属製多孔膜を配置することができ、細胞の残存率を低下させることなく、細胞培養液の回収量を多くすることができる。また、細胞による金属製多孔膜の目詰まりを抑えて、作業時間の短縮化を図るとともに、細胞へのストレスを低減することができる。
本発明の一態様に係る細胞培養液回収方法は、細胞培養液に含まれる細胞を濾過する金属製多孔膜と、前記金属製多孔膜の外周部を保持する保持部材と、前記細胞培養液の流路となる中空部分が前記金属製多孔膜の主面の少なくとも一部と対向するように前記保持部材に接続された管状部材とを備える細胞培養液回収フィルタユニットを、細胞を含む細胞培養液が入れられた容器内に配置するフィルタユニット配置工程と、
前記容器内の細胞培養液を、前記金属製多孔膜を通じて前記流路内に取り込み、前記容器の外部で回収する回収工程と、
を含む。
この方法によれば、金属製多孔膜を通じて容器内の細胞培養液を吸引するようにしているので、金属製多孔膜によって細胞を濾過して容器内に残し、細胞培養液のみを培養液流路を通じて回収することが可能になる。これにより、細胞の残存率のバラツキを抑えることができる。また、金属製多孔膜は、例えば樹脂製多孔膜などに比べて細胞が付着し難い性質を有するので、細胞によって膜の孔が閉塞されることにより細胞培養液の回収が阻害されることを抑えることができる。従って、細胞培養液の回収に要する時間を短縮することができる。
なお、前記回収工程の後、新しい細胞培養液を前記容器の内部に供給する供給工程を更に含んでもよい。この方法によれば、容器内の細胞培養液を新たな細胞培養液に交換することができる。
また、前記供給工程において、前記新しい細胞培養液は、前記流路を流れ、前記金属製多孔膜を通じて前記容器内に供給されてもよい。この方法によれば、仮に金属製多孔膜上に細胞が付着した場合でも、当該細胞を新しい細胞培養液の圧力で金属製多孔膜から離す（いわゆる、逆洗する）ことができる。その結果、細胞培養液の交換に要する時間を短縮することができる。
また、前記供給工程の後、前記容器内の細胞培養液を、前記金属製多孔膜を通じて前記流路内に取り込み、前記容器の外部で回収する再回収工程を更に含んでもよい。この方法によれば、同一の金属製多孔膜を用いて細胞培養液の回収を連続的に行うことができる。
また、本発明の一態様に係る細胞培養液回収キットは、前記細胞培養液回収方法に用いるための細胞培養液回収キットであって、前記細胞培養液回収フィルタユニットを備える。この構成によれば、細胞の残存率のバラツキを抑えるとともに、細胞培養液の回収に要する時間を短縮することができる。
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。
（実施の形態）
図１は、本発明の実施の形態に係る細胞培養液回収フィルタユニットの概略構成を示す斜視図である。図２は、図１の細胞培養液回収フィルタユニットの分解斜視図である。図３は、図１の細胞培養液回収フィルタユニットの分解断面図である。図４は、図１の細胞培養液回収フィルタユニットの組立断面図である。図５は、図４の一部拡大断面図である。
図１及び図２に示すように、本実施の形態に係る細胞培養液回収フィルタユニット１は、金属製多孔膜２と、金属製多孔膜２の外周部を保持する保持部材３と、保持部材３に接続された管状部材４とを備えている。
保持部材３は、図３〜図５に示すように金属製多孔膜２の外周部２Ａを保持するように構成されている。本実施の形態において、保持部材３は、第１枠部材３１と、第２枠部材３２とを備えている。第１枠部材３１と第２枠部材３２とは、それらの間で金属製多孔膜２の外周部２Ａを挟持可能に構成されている。
より具体的には、第１枠部材３１は、環状の平板部３１ａと、中央の貫通穴３１ｂの周囲の部分が管状部材４から離れる側に突出する環状の凸部３１ｃとを備えている。平板部３１ａの直径は、例えば１８ｍｍである。平板部３１ａの厚さは、例えば１．５ｍｍである。凸部３１ｃの高さは、例えば、１．５ｍｍである。
環状の凸部３１ｃの内面には、貫通穴３１ｂの中央側に突出する環状のフランジ部３１ｄが形成されている。フランジ部３１ｄは、例えば、凸部３１ｃの頂部から０．１ｍｍだけ平板部３１ａ側に離れた位置に設けられている。フランジ部３１ｄは、管状部材４側に傾斜面３１ｅが形成されるように、貫通穴３１ｂの中央側の先端部３１ｆの厚みが薄く形成されている。フランジ部３１ｄの凸部３１ｃ側の厚みは、例えば０．３ｍｍである。フランジ部３１ｄの先端部３１ｆの厚みは、例えば０．２ｍｍである。傾斜面３１ｅの傾斜角度は、例えば４５度である。
第２枠部材３２は、環状の平板部３２ａと、中央の貫通穴３２ｂの周囲の部分が管状部材４から離れる側に突出する環状の凸部３２ｃと、中央の貫通穴３２ｂの周囲の部分が管状部材４側に突出する環状の凸部３２ｄを備えている。平板部３２ａの直径は、例えば１８ｍｍである。平板部３２ａの厚さは、例えば１．５ｍｍである。凸部３２ｄの高さは、例えば、１．５ｍｍである。
凸部３２ｃは、第１枠部材３１の貫通穴３１ｂに挿入できるように、当該貫通穴３１ｂの直径よりもやや小さい外径を有している。凸部３２ｃの先端部３２ｆは、フランジ部３１ｄの管状部材４側の形状に対応するように形成されている。すなわち、先端部３２ｆには、傾斜面３１ｅに対応する傾斜面３２ｅが形成されている。
金属製多孔膜２は、図４に示すように、第１枠部材３１のフランジ部３１ｄと第２枠部材３２の凸部３２ｃの先端部３２ｆとの間で、傾斜面３１ｅ及び傾斜面３２ｅに沿うように外周部２Ａを挟持されることにより、面方向に張力を有する状態で保持される。また、金属製多孔膜２は、保持部材３の厚み方向の中心面Ｓ１に対して当該厚み方向にずれた位置で外周部２Ａを挟持されている。本実施の形態において、金属製多孔膜２は、環状の凸部３１ｃの内側に配置されている。また、金属製多孔膜２は、環状の凸部３１ｃの先端部で画定される開口面Ｓ２に対して略面一になるように配置されている。
第１枠部材３１の平板部３１ａには、図３に示すように、厚み方向に貫通する複数の貫通孔３１ｇが設けられている。複数の貫通孔３１ｇは、平板部３１ａの周方向に一定間隔で設けられている。同様に、第２枠部材３２の平板部３２ａには、厚み方向に貫通する複数の貫通孔３２ｇが設けられている。複数の貫通孔３２ｇは、複数の貫通孔３１ｇに対応するように、平板部３２ａの周方向に一定間隔で設けられている。第１枠部材３１の貫通穴３１ｂに第２枠部材３２の凸部３２ｃが挿入された状態で、各貫通孔３１ｇ，３２ｇにネジなどの締結部材（図示せず）が挿入されることで、第１枠部材３１と第２枠部材３２とが互いに固定される。
管状部材４は、第２枠部材３２の凸部３２ｄに嵌合可能な嵌合部４ａを備えている。管状部材４は、第２枠部材３２の凸部３２ｄの外周面に嵌合部４ａが嵌合することにより、第２枠部材３２に着脱自在に取り付けられる。管状部材４には、細胞培養液の流路となる中空部分４ｂが形成されている。管状部材４は、当該中空部分４ｂが金属製多孔膜２の主面の少なくとも一部と対向するように第２枠部材３２に接続される。これにより、中空部分４ｂを細胞培養液の流路として金属製多孔膜２を通過した細胞培養液を回収することができる。
第１枠部材３１、第２枠部材３２、及び管状部材４の材料としては、例えば、ジュラルミン、アルミニウム、ステンレス（ＳＵＳ）などの金属や、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリエーテルイミド、などの樹脂が挙げられる。
図６は、金属製多孔膜２の概略構成を示す一部拡大斜視図である。金属製多孔膜２は、細胞培養液に含まれる細胞を濾過するものである。金属製多孔膜２は、細胞培養液に含まれる細胞を濾過するものである。細胞は、例えば、スフェロイドである。
金属製多孔膜２は、図６に示すように、互いに対向する一対の主面２１ａ，２１ｂを有している。金属製多孔膜２には、両主面２１ａ，２１ｂを貫通する複数の貫通孔２１ｃが設けられている。貫通孔２１ｃは、細胞培養液から細胞を分離するものである。貫通孔２１ｃの形状及び寸法は、細胞の形状、大きさに応じて適宜設定されるものである。貫通孔２１ｃは、例えば、等間隔又は周期的に配置される。貫通孔２１ｃの形状は、例えば、金属製多孔膜２の主面２１ａ側から見て正方形である。貫通孔２１ｃは、正方格子状に配列されている。貫通孔２１ｃのサイズは、例えば、縦０．１μｍ以上６００μｍ以下、横０．１μｍ以上６００μｍ以下である。貫通孔２１ｃ間の間隔は、例えば、貫通孔２１ｃの開口径の１倍よりも大きく１０倍以下であり、より好ましくは３倍以下である。また、金属製多孔膜２における貫通孔２１ｃの開口率は、例えば、１０％以上である。なお、貫通孔２１ｃの形状は、例えば、図７に示すように、金属製多孔膜２の主面２１ａ側から見て正六角形であってもよい。また、貫通孔２１ｃは、ハニカム構造に配列されてもよい。
金属製多孔膜２の材料としては、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、ステンレス鋼、パラジウム、チタン、コバルト、これらの合金、及びこれらの酸化物が挙げられる。金属製多孔膜２の寸法は、例えば、直径６ｍｍである。金属製多孔膜２の厚さは、例えば０．１μｍ以上１００μｍ以下であり、好ましくは、０．１μｍ以上５０μｍ以下である。金属製多孔膜２の外形は、例えば、円形、楕円形、又は多角形のいずれかである。本実施の形態においては、金属製多孔膜２の外形は、円形とする。金属製多孔膜２の外周部には、貫通孔２１ｃが設けられても、貫通孔２１ｃが設けられなくてもよい。
また、本実施の形態において、金属製多孔膜２の外周部２Ａは、図５に示すように、第１曲げ部２ａと第２曲げ部２ｂとを有するように、第１枠部材３１の傾斜面３１ｅと第２枠部材３２の傾斜面３２ｅとにより挟持されている。また、金属製多孔膜２の外周部２Ａは、図８に示すように、第１曲げ部２ａと第２曲げ部２ｂとの間に筋状凸部２ｃを有するように挟持されている。ここで、筋状凸部２ｃとは、金属製多孔膜２の厚みの０．１倍以上２倍以下の高さをもって金属製多孔膜２の一方の主面が突出している部位をいう。この筋状凸部２ｃによって、第１枠部材３１及び第２枠部材３２と金属製多孔膜２の外周部２Ａとの間の摩擦力を増加させることができる。
また、筋状凸部２ｃは、図８に示すように、第１曲げ部２ａと第２曲げ部２ｂとの間に複数設けられ、複数の筋状凸部２ｃは、不規則な向きに配置されている。この構成により、第１枠部材３１及び第２枠部材３２と金属製多孔膜２の外周部２Ａとの間の摩擦力を増加させることができ、金属製多孔膜２に対する第１枠部材３１及び第２枠部材３２の保持力を一層向上させることができる。
なお、筋状凸部２ｃは、例えば、金属製多孔膜２のしわにより形成されてもよい。ここで、「しわ」とは、金属製多孔膜２がたるんだり、縮んだりしてできる細かい筋目をいう。この場合、金属製多孔膜２自体で筋状凸部２ｃを構成することができ、筋状凸部２ｃとなる部材を別途設ける必要性を無くすことができる。
次に、本実施の形態に係る細胞培養液回収フィルタユニット１を用いて、細胞培養液を回収及び交換する方法について説明する。図９は、細胞培養液回収及び交換方法の一例を示す概略図である。
まず、図９に示すように、細胞培養液回収フィルタユニット１を、細胞ＣＥを含む細胞培養液ＣＣＳが入れられた容器５内に配置する（フィルタユニット配置工程）。より具体的には、金属製多孔膜２が細胞培養液ＣＣＳ内に位置するように、管状部材４の一端部を容器５内に配置する。
また、このとき、管状部材４の他端部はポンプＰ１に接続する。ポンプＰ１には、容器５内から回収された細胞培養液ＣＣＳを培養液回収容器６２内に流すための回収管６１を接続する。また、容器５内に新たな細胞培養液ＣＣＳを供給するために、供給管７１の一端部を容器５内に配置する。供給管７１の他端部はポンプＰ２に接続する。ポンプＰ２には、培養液蓄積容器７２から新たな細胞培養液ＣＣＳを吸引するための吸引管７３を接続する。容器５は、瓶形状を有し、開口部を塞ぐ蓋体５１を備えている。管状部材４及び供給管７１は、蓋体５１を貫通するように設けられている。
次いで、ポンプＰ１を駆動させ、金属製多孔膜２を通じて容器５内の細胞培養液ＣＣＳを吸引し、管状部材４を通じて細胞培養液ＣＣＳを容器５の外部にある培養液回収容器６２で回収する（回収工程）。このとき、容器５内の細胞ＣＥは、金属製多孔膜２によって濾過されるので、容器５内に残り、細胞培養液ＣＣＳのみが管状部材４及び回収管６１を通じて培養液回収容器６２に回収される。
次いで、ポンプＰ２を駆動させ、培養液蓄積容器７２内の新たな細胞培養液ＣＣＳを吸引管７３及び供給管７１を通じて容器５内に供給する（供給工程）。これにより、容器５内の細胞培養液ＣＣＳを交換して、新たな培地を作製することができる。
次いで、予め決められた期間の経過後、ポンプＰ１を駆動させ、金属製多孔膜２を通じて容器５内の細胞培養液ＣＣＳを吸引し、管状部材４を通じて細胞培養液ＣＣＳを容器５の外部にある培養液回収容器６２で回収する（再回収工程）。
次いで、ポンプＰ２を駆動させ、培養液蓄積容器７２内の新たな細胞培養液ＣＣＳを吸引管７３及び供給管７１を通じて容器５内に供給する（再供給工程）。これにより、容器５内の細胞培養液ＣＣＳを再度交換して、新たな培地を作製することができる。
本実施の形態によれば、細胞培養液回収フィルタユニット１が金属製多孔膜２を備えているので、金属製多孔膜２によって細胞ＣＥを濾過して容器５内に残し、細胞培養液ＣＣＳのみを培養液流路（管状部材４及び回収管６１）を通じて回収することが可能になる。これにより、容器５内の細胞ＣＥの残存率のバラツキを抑えることができる。
また、金属製多孔膜２は、例えば樹脂製多孔膜などに比べて細胞ＣＥが付着し難い性質を有するので、細胞ＣＥによって膜の孔が閉塞されることにより細胞培養液ＣＣＳの回収が阻害されることを抑えることができる。従って、細胞培養液ＣＣＳの回収に要する時間を短縮することができる。
また、金属製多孔膜２は、例えば樹脂製多孔膜などに比べて機械的剛性が高いので、細胞培養液ＣＣＳ内に常時浸漬させたり、高圧力を掛けたりしても、寸法が変化することを抑えることができる。従って、ポンプＰ１，Ｐ２の駆動を制御することによって、細胞培養液回収及び交換を自動化するとともに繰り返し行うことが可能になる。
また、本実施の形態によれば、細胞培養液回収及び交換時に容器５の蓋体５１を外す必要がないので、雑菌等が混入しないように容器５内をほぼ密閉空間にすることができる。
また、本実施の形態によれば、保持部材３が金属製多孔膜２の外周部２Ａを挟持する第１枠部材３１及び第２枠部材３２を備えている。また、金属製多孔膜２の外周部２Ａは、第１曲げ部２ａと第２曲げ部２ｂとを有するとともに、第１曲げ部２ａと第２曲げ部２ｂとの間に筋状凸部２ｃを有するように第１枠部材３１と第２枠部材３２とに挟持されている。この構成によれば、金属製多孔膜２が第１曲げ部２ａと第２曲げ部２ｂとの間に筋状凸部２ｃを有することによって、第１枠部材３１及び第２枠部材３２と金属製多孔膜２の外周部２Ａとの間の摩擦力を増加させることができる。これにより、細胞培養液ＣＣＳの回収を、高流速で行ったとしても、第１枠部材３１と第２枠部材３２との間から金属製多孔膜２が脱落することを防ぐことができる。そのため、細胞培養液ＣＣＳを短時間で回収できるようになる。
また、本実施の形態によれば、筋状凸部２ｃは、第１曲げ部２ａと第２曲げ部２ｂとの間に複数設けられ、複数の筋状凸部２ｃは、不規則な向きに配置されている。この構成によれば、第１枠部材３１及び第２枠部材３２と金属製多孔膜２の外周部２Ａとの間の摩擦力を増加させることができ、金属製多孔膜２に対する第１枠部材３１及び第２枠部材３２の保持力を一層向上させることができる。
また、本実施の形態によれば、保持部材３の管状部材４から離れる側の主面３ａには、環状の凸部３１ｃが設けられ、金属製多孔膜２は、凸部３１ｃの内側に配置されている。この構成によれば、容器５の底部により近い位置に金属製多孔膜２を配置することができ、細胞ＣＥの残存率を低下させることなく、細胞培養液ＣＣＳの回収量を多くすることができる。金属製多孔膜２の下方の主面まで液面を低下させることができる。そのため、細胞ＣＥの残存率を低下させることなく、細胞培養液ＣＣＳの回収量を多くすることができる。また、容器５の底部により近い位置に金属製多孔膜２を配置することで、金属製多孔膜２により多くの液量が接することになるので、細胞が金属製多孔膜２に付着しても洗い流されて目詰まりし難くすることができる。また、細胞培養液の回収後に、金属製多孔膜２を介して細胞培養液ＣＣＳを供給する際、金属製多孔膜２に付着した細胞ＣＥが、細胞培養液ＣＣＳの通過時に、金属製多孔膜２から脱離しやすくなり、目詰まりを一層抑えることができる。その結果、作業時間の短縮化を図ることができる。また、目詰まりによる管状部材４内の圧力上昇を抑えることができ、細胞へのストレスを低減することができる。
また、本実施の形態によれば、金属製多孔膜２は、保持部材３の凸部３１ｃの先端部３１ｆで画定される開口面に対して面一又は略面一になるように配置されている。容器５の底部により一層近い位置に金属製多孔膜２を配置することができ、細胞ＣＥの残存率を低下させることなく、細胞培養液ＣＣＳの回収量を多くすることができる。また、細胞による金属製多孔膜２の目詰まりを抑えて、作業時間の短縮化を図るとともに、細胞へのストレスを低減することができる。
また、本実施の形態によれば、回収工程の後に供給工程を行うので、容器５内の細胞培養液を新たな細胞培養液に交換することができる。
また、本実施の形態によれば、供給工程の後に再回収工程を行うので、同一の金属製多孔膜２を用いて細胞培養液ＣＣＳの回収を連続的に行うことができる。
なお、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その他種々の態様で実施できる。例えば、前記では、管状部材４の嵌合部４ａが第２枠部材３２の凸部３２ｄに嵌合することで、管状部材４が第２枠部材３２に取り付けられるものとしたが、本発明はこれに限定されない。例えば、管状部材４の嵌合部４ａ及び第２枠部材３２の凸部３２ｄのいずれか一方に雄ねじを設けるとともにいずれか他方に雌ねじを設けて、ネジ止めするように構成してもよい。また、例えば、第２枠部材３２に係止爪（例えば、フック状の爪部）を設けるとともに、管状部材４に受け部（例えば、フック状の爪部が係合可能な孔部）を設け、係止爪と受け部とが嵌合するように構成してもよい。
また、前記では、ポンプＰ１の駆動により、金属製多孔膜２を通じて容器５内の細胞培養液ＣＣＳを吸引し、管状部材４を通じて細胞培養液ＣＣＳを容器５の外部にある培養液回収容器６２で回収するようにしたが、本発明はこれに限定されない。容器５内の細胞培養液ＣＣＳを、金属製多孔膜２を通じて管状部材４内に取り込み、容器５の外部で回収するようにすればよい。例えば、容器５内の細胞培養液ＣＣＳを、管状部材４内に吸引するのではなく、金属製多孔膜２を通じて管状部材４内へ圧送するようにしてもよい。
また、前記では、供給工程において、培養液蓄積容器７２内の新たな細胞培養液ＣＣＳを供給管７１を通じて容器５内に供給するようにしたが、本発明はこれに限定されない。例えば、図１０に示すように、管状部材４の他端部を分岐させて、ポンプＰ１，Ｐ２にそれぞれ接続するようにしてもよい。この構成によれば、培養液蓄積容器７２内の新たな細胞培養液ＣＣＳが管状部材４を流れ、金属製多孔膜２を通じて容器５内に供給することができる。その結果、仮に金属製多孔膜２上に細胞ＣＥが付着した場合でも、当該細胞ＣＥを新しい細胞培養液ＣＣＳの圧力で金属製多孔膜２から容易に離す（いわゆる、逆洗する）ことができ、細胞培養液ＣＣＳの交換に要する時間を短縮することができる。なお、この場合、容器５内から回収された細胞培養液ＣＣＳと新たな細胞培養液ＣＣＳとが混合しないように、管状部材４には、図１０に示すようにバルブＶ１，Ｖ２が設けられることが好ましい。
また、前記では、容器５が瓶形状を有するものとしたが、本発明はこれに限定されない。例えば、容器５は、ビーカーのような容器であってもよいし、点滴バッグのような樹脂製の容器であってもよい。容器５は、細胞培養液を収容できるものであればよい。
また、図９及び図１０では、培養液回収容器６２及び培養液蓄積容器７２がビーカーであるものとして示したが、本発明はこれに限定されない。培養液回収容器６２及び培養液蓄積容器７２は、容器５と同様に瓶形状を有し、開口部を塞ぐ蓋体を備えるように構成されてもよい。この構成によれば、細胞ＣＥ及び細胞培養液ＣＣＳを外気に触れないように密閉した状態で、細胞培養液ＣＣＳの回収及び交換を行うことができる。その結果、細胞ＣＥ及び細胞培養液ＣＣＳが汚染される可能性を抑えることができる。
なお、本実施の形態に係る細胞培養液回収方法に用いるための細胞培養液回収キットは、細胞培養液回収フィルタユニット１を備えていればよい。また、当該細胞培養液回収キットは、容器５を更に備えてもよい。
次に、容器内の細胞培養液ＣＣＳの交換作業に要する時間及び容器内の細胞ＣＥの残存率を検証するために行った実験結果について説明する。図１１は、本実施の形態に係る細胞培養液回収フィルタユニット１を用いて容器５内の細胞培養液を交換したときの細胞ＣＥの残存率、交換時間を示す表である。また、図１１には、比較例として、遠心分離機を用いて容器内の細胞培養液ＣＣＳを交換したときの細胞ＣＥの残存率、交換時間も示されている。
ここでは、実験の為、ウェル数が９６個、ウェルの底形状がＵ字型である細胞培養マルチプレート（住友ベークライト社製）を用いてｒａｓ遺伝子を導入したＮＩＮ３Ｔ３細胞を培養し、２７０個以上のスフェロイドを作製した。また、各スフェロイドの直径が約６００μｍになるように培養時間を調整した。このようにして作製したスフェロイドを細胞ＣＥとして細胞培養液ＣＣＳに混合した。細胞培養液ＣＣＳとしては、ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を１％、ウシ胎児血清を５％含むダルベッコ変法イーグル培地ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ナカライテスク社製：０８４５８−４５）を用いた。３０個のスフェロイドを含む２００ｍＬの細胞培養液ＣＣＳを入れた容器５を複数用意するとともに、６０個のスフェロイドを含む２００ｍＬの細胞培養液ＣＣＳを入れた容器５を複数用意した。
また、金属製多孔膜２として、図７に示す構造を有する金属製多孔膜（孔径（六角形の対向する辺の距離）：１００μｍ、線幅：１３μｍ、開口率：７８％、ハニカム構造）と、図６に示す構造を有する金属製多孔膜（孔径（正方形の一辺の長さ）：２００μｍ、線幅：７５μｍ、開口率：５３％、正方格子状）を用いた。各金属製多孔膜を通じて、３０個又は６０個のスフェロイドを含む２００ｍＬの細胞培養液ＣＣＳを容器５内から１９０ｍＬ吸引した（図９参照）。このとき、ポンプＰ１の出力は、１００ｍＬ／ｍｉｎとした。その後、培養液蓄積容器７２から容器５へ新たな細胞培養液ＣＣＳを供給し、容器５内の細胞培養液ＣＣＳの総量を２００ｍＬにした。この容器５内の細胞培養液ＣＣＳを、金属製多孔膜（孔径：５０μｍ）で濾過し、当該金属製多孔膜上に残った細胞ＣＥを顕微鏡で確認した。その結果が図１１に示されている。
図１１に示すように、金属製多孔膜（孔径：１００μｍ）を備える細胞培養液回収フィルタユニットを用いて３０個のスフェロイドを含む細胞培養液ＣＣＳの交換作業を２回行ったところ、容器５内の細胞ＣＥの残存率は８６．７％、６３．３％であった。交換作業時間は２分４６秒，２分３５秒であった。また、金属製多孔膜（孔径：１００μｍ）を備える細胞培養液回収フィルタユニットを用いて６０個のスフェロイドを含む細胞培養液ＣＣＳの交換作業を２回行ったところ、容器５内の細胞ＣＥの残存率は９０．０％，８８．３％であった。交換作業時間は２分５２秒，２分４１秒であった。
また、金属製多孔膜（孔径：２００μｍ）を備える細胞培養液回収フィルタユニットを用いて３０個のスフェロイドを含む細胞培養液ＣＣＳの交換作業を２回行ったところ、容器５内の細胞ＣＥの残存率は９０％，９６．７％であった。交換作業時間は２分４５秒，２分３７秒であった。また、金属製多孔膜（孔径：２００μｍ）を備える細胞培養液回収フィルタユニットを用いて６０個のスフェロイドを含む細胞培養液ＣＣＳの交換作業を２回行ったところ、容器５内の細胞ＣＥの残存率は７５．０％，９６．７％であった。交換作業時間は３分００秒，２分４２秒であった。
また、比較例として、遠心分離機を用いて図１２Ａ〜図１２Ｆに示す実験を行った。
まず、前記と同様にして、３０個又は６０個のスフェロイドを含む２００ｍＬの細胞培養液ＣＣＳを入れた容器５Ａを複数用意した。
次いで、図１２Ａに示すように、容器５Ａ内の細胞培養液ＣＣＳを、４０ｍＬずつ、５本の遠沈管１０１に分注した。
次いで、図１２Ｂに示すように、各遠沈管１０１に対して遠心分離機１０２により、１０００ｒｐｍの回転数で５分間、遠心力をかけた。
次いで、図１２Ｃに示すように、各遠沈管１０１内の細胞培養液ＣＣＳの一部である上清液を廃棄容器１０３に廃棄した。
次いで、図１２Ｄに示すように、各遠沈管１０１内に残った細胞ＣＥを含む細胞培養液ＣＣＳを容器５Ａ内に戻した。
次いで、図１２Ｅに示すように、各遠沈管１０１内に１０ｍＬの新たな細胞培養液ＣＣＳを入れて各遠沈管１０１内を洗い込みし、当該洗い込み後の細胞培養液ＣＣＳを容器５Ａに入れた。
次いで、図１２Ｆに示すように、容器５Ａに新たな細胞培養液ＣＣＳを入れて、容器５Ａ内の細胞培養液ＣＣＳの総量を２００ｍＬにした。この容器５Ａ内の細胞培養液ＣＣＳを、金属製多孔膜（孔径：５０μｍ）で濾過し、当該金属製多孔膜上に残った細胞ＣＥを顕微鏡で確認した。その結果が図１１に示されている。
図１１に示すように、遠心分離機１０２を用いて３０個のスフェロイドを含む細胞培養液ＣＣＳの交換作業を２回行ったところ、容器５Ａ内の細胞ＣＥの残存率は５３．３％，３０．０％であった。交換作業時間は２２分１２秒，１７分５３秒であった。また、遠心分離機１０２を用いて６０個のスフェロイドを含む細胞培養液ＣＣＳの交換作業を２回行ったところ、容器５Ａ内の細胞ＣＥの残存率は９０．０％，９６．３％であった。交換作業時間は２１分４４秒，１７分１４秒であった。
以上の実験結果から、本実施の形態に係る細胞培養液回収フィルタユニット１によれば、細胞ＣＥの残存率のバラツキを抑えられる（６３．５％〜９６．７％→３０．０％〜９６．３％）ことが確認された。また、本実施の形態に係る細胞培養液回収フィルタユニット１によれば、細胞培養液ＣＣＳの回収に要する時間を大幅に短縮できることが確認された。
なお、細胞培養の分野においては、細胞からの分泌物を含む培養液を活用することがある。当該培養液は、例えば、細胞を一定期間培養液に浸漬した後、細胞のみを回収し、回収した細胞を再び一定期間浸漬するという動作を繰り返すことにより作製される。この培養液を作製する際に、本実施の形態に係る細胞培養液回収フィルタユニット（以下、フィルタユニットと略す）１を用いることで、より多くの量の培養液を生成することができる。
以下に、本実施の形態に係るフィルタユニット１を用いて培養液を生成した実験結果について説明する。
まず、ＣＨＯ−ＲＤ細胞を１０５個／ｍＬの濃度で含む１リットルの無血清培地を、１リットルの培養容器に投入して条件培地を作製した。この培養容器内には、本実施の形態に係るフィルタユニット１を配置した。ここでは、管状部材４として、シリコン製ホース（内径６ｍｍ）を用いた。また、金属製多孔膜２として、図６に示す構造を有するニッケル製の金属製多孔膜（露出部分の直径：６ｍｍ、厚さ：１．２μｍ、孔径（正方形の一辺の長さ）：２．６μｍ、線径１．０μｍ、開口率５２％、正方格子）を用いた。管状部材４の中間付近には、チュービングポンプを接続した。培養容器の外側に位置する管状部材４の一端部は、閉鎖された１リットルの回収容器内に配置した。この状態で、２日間放置して培養容器内の細胞を培養した。
その後、チュービングポンプを作動させて、０．９リットルの条件培地を培養容器から回収容器に移動させた。このときのチュービングポンプの作動時間は３０分とした。
その後、培養容器からフィルタユニット１を取り出すとともに、培養容器内に残った１００ｍＬの液体を取り出し、液体内の細胞の数をセルカウンターによって測定した。
その結果、液体内の細胞濃度は１０７個／ｍＬであった。また、培養容器から取り出したフィルタユニット１の表面を顕微鏡で観察したところ、当該表面に存在する細胞は少数であった。
以下に、比較例に係るフィルタユニットを用いて培養液を作製した実験結果について説明する。
比較例に係るフィルタユニットが本実施の形態に係るフィルタユニット１と異なる点は、金属製多孔膜２に代えて樹脂製多孔膜（孔径（円形孔の直径）：３．０μｍ、開口率２０％、ランダム配置）を用いた。それ以外の構成は同一とした。
まず、前記条件培地を投入した培養容器内に、比較例に係るフィルタユニットを配置し、培養容器の外側に位置する管状部材の一端部を閉鎖された１リットルの回収容器内に配置した。この状態で、２日間放置して培養容器内の細胞を培養した。
その後、チュービングポンプを作動させて、０．９リットルの条件培地を培養容器から回収容器に移動させた。このときのチュービングポンプの作動時間は１２０分とした。
その後、培養容器から比較例に係るフィルタユニットを取り出すとともに、培養容器内に残った１００ｍＬの液体を取り出し、液体内の細胞の数をセルカウンターによって測定した。
その結果、液体内の細胞濃度は５×１０４個／ｍＬであった。また、培養容器から取り出した比較例に係るフィルタユニットの表面を顕微鏡で観察したところ、当該表面に存在する細胞は多数であった。
以上の実験結果から、比較例に比べて本実施の形態に係るフィルタユニット１を用いた方が、培養容器内に残った液体の細胞濃度を約２００倍高くできることが分かる。すなわち、本実施の形態に係るフィルタユニット１を用いることで、培養液の生産をより継続して行うことができ、より多くの量の培養液を生成することができる。このことは、培養液の生成に用いる細胞の希少性が高い場合に特に効果的である。
なお、比較例に比べて本実施の形態に係るフィルタユニット１を用いた方が培養容器内に残った液体の細胞濃度が高いのは、金属製多孔膜に常に多くの液量が接し、細胞が金属製多孔膜に付着しても洗い流されて目詰まりし難くなるためと考えられる。また、比較例に比べて本実施の形態に係るフィルタユニット１を用いた方が、培養液の移動に要する圧力が低くなるため、細胞による目詰まりが低減されると考えられる。特に、管状部材の中空部分に多孔膜を設けた場合、多孔膜による圧力損失だけでなく、管状部材による圧力損失も発生する。このため、樹脂製多孔膜を用いる比較例に係るフィルタユニットでは、目詰まりの発生時点から管状部材内の圧力が極端に高くなり、細胞による目詰まりがより酷くなると考えられる。そのため、本実施例によって短時間での作業が可能となり、細胞へのストレスも低減できる。また、本実施の形態に係るフィルタユニット１のように金属製多孔膜を用いることで、培養液の吸引を停止した際に、当該金属製多孔膜に付着した細胞が液体中に離脱し易くなり、培養容器中の細胞の減少が少なくなると考えられる。
本発明は、添付図面を参照しながら好ましい実施形態に関連して充分に記載されているが、この技術の熟練した人々にとっては種々の変形や修正は明白である。そのような変形や修正は、添付した請求の範囲による本発明の範囲から外れない限りにおいて、その中に含まれると理解されるべきである。
本発明に係る細胞培養液回収フィルタユニットは、細胞の残存率のバラツキを抑えるとともに、細胞培養液の回収に要する時間を短縮することができるので、細胞培養液の回収及び交換に有用である。
１ 細胞培養液回収フィルタユニット
２ 金属製多孔膜
２Ａ 外周部
２ａ 第１曲げ部
２ｂ 第２曲げ部
２ｃ 筋状凸部
３ 保持部材
３ａ，３ｂ 主面
４ 管状部材
４ａ 嵌合部
４ｂ 中空部分
５，５Ａ 容器
２１ａ，２１ｂ 主面
２１ｃ 貫通孔
３１ 第１枠部材
３１ａ 平板部
３１ｂ 貫通穴
３１ｃ 凸部
３１ｄ フランジ部
３１ｅ 傾斜面
３１ｆ 先端部
３１ｇ 貫通孔
３２ 第２枠部材
３２ａ 平板部
３２ｂ 貫通穴
３２ｃ 凸部
３２ｄ 凸部
３２ｅ 傾斜面
３２ｆ 先端部
３２ｇ 貫通孔
５１ 蓋体
６１ 回収管
６２ 培養液回収容器
７１ 供給管
７２ 培養液蓄積容器
７３ 吸引管
１０１ 遠沈管
１０２ 遠心分離機
１０３ 廃棄容器
Ｐ１，Ｐ２ ポンプ

Claims (9)

  1. 細胞培養液に含まれる細胞を濾過する金属製多孔膜と、
    前記金属製多孔膜の外周部を保持する保持部材と、
    前記細胞培養液の流路となる中空部分が前記金属製多孔膜の主面の少なくとも一部と対向するように前記保持部材に接続された管状部材と、
    を備え、
    前記保持部材は、第１枠部材と第２枠部材とを備え、
    前記第１枠部材は、前記保持部材の厚み方向において、前記第２枠部材側とは反対側に突出する環状の凸部と、
    前記第２枠部材は、前記保持部材の厚み方向において、前記第１枠部材側に突出する環状の第１凸部と、前記管状部材側に突出する環状の第２凸部とを有し、
    前記金属製多孔膜は、前記第１枠部材の凸部と前記第２枠部材の第１凸部との間に設けられ、
    前記管状部材は、前記第２凸部に嵌合可能な嵌合部を備え、前記第２凸部の外周面に前記嵌合部が嵌合することにより、前記保持部材に着脱自在に取り付けられる、
    細胞培養液回収フィルタユニット。
  2. 前記金属製多孔膜は、前記第１枠部材の環状の凸部の内側に配置されている、請求項１に記載の細胞培養液回収フィルタユニット。
  3. 上方に開口部を有する容器と、
    前記開口部を塞ぐ蓋体と、
    前記容器と前記蓋体とで囲まれた空間内に配置される請求項１又は２に記載の細胞培養液回収フィルタユニットと、
    を備える、細胞培養液回収システム。
  4. 請求項３に記載の細胞培養液回収システムを用いた、細胞培養液回収方法。
  5. 細胞を含む細胞培養液が入れられた前記容器と前記蓋体とで囲まれた空間内に前記金属製多孔膜を配置するとともに、前記蓋体を貫通するように前記管状部材を配置するフィルタユニット配置工程と、
    前記容器内の細胞培養液を、前記金属製多孔膜を通じて前記流路内に取り込み、前記容器の外部で回収する回収工程と、
    を含む、請求項４に記載の細胞培養液回収方法。
  6. 前記回収工程の後、新しい細胞培養液を前記容器内に供給する供給工程を更に含む、請求項５に記載の細胞培養液回収方法。
  7. 前記供給工程において、前記新しい細胞培養液は、前記流路を流れ、前記金属製多孔膜を通じて前記容器内に供給される、請求項６に記載の細胞培養液回収方法。
  8. 前記供給工程の後、前記容器内の細胞培養液を、前記金属製多孔膜を通じて前記流路内に取り込み、前記容器の外部で回収する再回収工程を更に含む、請求項６又は７に記載の細胞培養液回収方法。
  9. 請求項４〜８のいずれか１つに記載の細胞培養液回収方法に用いるための細胞培養液回収キットであって、
    前記細胞培養液回収フィルタユニットを備える、細胞培養液回収キット。
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