JP6895819B2 - 液体クロマトグラフィ装置 - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフィ装置に関する。

下記特許文献１には、希釈した血液試料をカラムに保持させ、硫酸ナトリウムの濃度が異なる３種類の溶離液をバルブにより切り替えることで、硫酸ナトリウムの濃度が順次上昇するように溶離液をカラムに供給する測定装置が開示されている。この測定装置では、順次カラムから溶出するヘモグロビンを検出器で連続的に検出し、全ヘモグロビン含量に対する不安定型ヘモグロビンＡｌｃの割合から試料中のグルコース濃度を算出する。また、検出器では、ヘモグロビンの吸収極大波長である４１５ｎｍの光を照射し、吸光度を検出することで、全ヘモグロビンの量および不安定型ヘモグロビンＡｌｃの量等を算出する。

下記非特許文献１には、高速液体クロマトグラフィーに関する技術が示されている。その中には、屈折率効果によるバックグランド信号に関する問題を改良するためのフローセルの構造としてフローセルの内径を大きくしたり、フローセルの内径を出口側に向かって大きくすることが記載されている。

特許第４１４４１１７号公報

南原利夫、池川信夫編著「最新 高速液体クロマトグラフィー 理論編」廣川書店、１７２〜１７４頁、発行：昭和６３年（１９８８年）１月１５日

上記特許文献１に記載の測定装置では、検出器の構成が明確には記載されていないが、例えば、溶離液はカラムを通り、その後、分離された成分と共に検出器のフローセルを通る。フローセルの流路は、例えば、内径が１ｍｍ程度とされており、細いものが多い。

このように、流路の内径が１ｍｍ程度の細いフローセルを溶離液が通ると、フローセルの壁面にも光が当たり、吸収される光があったり、反射して出力される光もある。このとき、溶離液の濃度が大きく変われば、濃度が異なる２種類の溶離液の界面でレンズ効果が起き、流路を透過する光の屈折率が変わることによって、フローセルの壁面で吸収される光の量と、反射される光の量の比率が変わる。この現象により、例えば、光源の像（例えば、光源がランプであればフィラメント、光源がＬＥＤであればチップの形やワイヤボンディングの影）が、受光部に入ったり、外れたりすることになり、検出される光量が変わることになる。

これにより、同じ溶離液を用いていても、異なる溶離液に切り替えた前後でクロマトグラムのベースラインが乱れることがある。ベースラインが変化すると、検出すべき成分の面積が変わることがある。

一方、上記非特許文献１に記載の構造では、フローセルの内径を大きくし、又は、フローセルの内径を出口側に向かって大きくすることで、クロマトグラムのベースラインの歪みを抑制している。しかし、フローセルの内径を大きくすると、フローセルの内容量が大きくなる。また、フローセルの内径を出口側に向かって大きくすると、フローセルの内容量が大きくなるとともに、フローセルの構造が複雑になる。

本発明は上記事実を考慮し、濃度の異なる溶離液を使用しても、クロマトグラムのベースラインが乱れることを抑制することができる液体クロマトグラフィ装置を得ることが目的である。

本発明の液体クロマトグラフィ装置は、検体から試料の成分を分離するカラムと、２種類以上の溶離液を切り替えて前記カラムに供給する溶離液供給手段と、前記カラムを通過した前記溶離液が導入されると共に前記溶離液に含まれる前記試料の特定成分を検出する検出装置と、を備え、前記検出装置は、前記溶離液が流れる流路を備えたフローセルと、前記フローセルの外部に設けられ、前記流路を流れる前記溶離液に光を照射する光源と、前記フローセルの外部に設けられ、前記フローセルを通過した光を受光する受光部と、前記光源からの光の進行方向における前記受光部との間に設けられた散乱板と、を有する。

本発明の液体クロマトグラフィ装置は、前記受光部は、前記フローセルの外部に設けられ、前記流路に流れる前記溶離液を通過した光を分光するビームスプリッタと、前記ビームスプリッタで分光された光の一の波長の光を透過させる第１バンドパスフィルタと、前記第１バンドパスフィルタを透過した光を受光する第１受光部と、前記ビームスプリッタで分光された光の他の波長の光を透過させる第２バンドパスフィルタと、前記第２バンドパスフィルタを透過した光を受光する第２受光部と、を含んでいてもよい。

本発明の液体クロマトグラフィ装置は、前記散乱板は、前記光源と前記フローセルの前記流路との間に設けられていてもよい。

本発明のクロマトグラフィ装置は、前記散乱板は、前記フローセルの壁部の少なくとも一部を構成していてもよい。

本発明のクロマトグラフィ装置は、前記散乱板は、乳白色とすることで、又は表面の少なくとも一部を粗すことで、前記光をランダムに散らす板状の樹脂、板状のガラス、レンズのいずれか１つにより構成されていてもよい。

本開示の液体クロマトグラフィ装置によれば、濃度の異なる溶離液を使用しても、クロマトグラムのベースラインが乱れることを抑制することができる。

第１実施形態に係る液体クロマトグラフィ装置を示すシステム構成図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置において、六方バルブを回転させた第１状態を示すシステム構成図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置において、六方バルブを回転させた第２状態を示すシステム構成図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置であって、カラムを通過した溶離液Ｌａが流れる状態を示す断面図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置であって、カラムを通過した溶離液Ｌａから溶離液Ｌｂに切り替わる状態を示す断面図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置であって、カラムを通過した溶離液Ｌｂが流れる状態を示す断面図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置であって、カラムを通過した溶離液Ｌｂから溶離液Ｌａに切り替わる状態を示す断面図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置において、１種類の溶離液が流れるときの散乱板による光の経路を模式的に説明する概念図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置において、２種類の溶離液が切り替わるときの散乱板による光の経路を模式的に説明する概念図である。 図１に示す液体クロマトグラフィ装置による散乱板があるときの測定時間と吸光度との関係を示す、ベースラインである。 比較例の液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置において、１種類の溶離液が流れるときの光の経路を模式的に説明する概念図である。 比較例の液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置において、２種類の溶離液が切り替わるときの光の経路を模式的に説明する概念図である。 比較例の液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置において、２種類の溶離液が切り替わるときのサンプル用受光部と参照用受光部における光の経路を模式的に説明する概念図である。 比較例の液体クロマトグラフィ装置による散乱板がないときの測定時間と吸光度との関係を示す、ベースラインである。 散乱板があるときの吸光度から散乱板がないときの吸光度を引いたときの測定時間との関係を示す図である。 第２実施形態の液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置を示す断面図である。 第３実施形態の液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置を示す断面図である。 第４実施形態の液体クロマトグラフィ装置に用いられる検出装置を示す断面図である。

以下、本発明の実施形態について図面に基づいて説明する。なお、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲がある場合は、数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。

〔第１実施形態〕
（液体クロマトグラフィ装置の全体構成）
図１には、第１実施形態の液体クロマトグラフィ装置Ａがシステム構成図にて示されている。本実施形態の液体クロマトグラフィ装置Ａは、試料作製手段１、流路切替バルブ２、送出手段３、流路切替バルブ４、分析部５、および制御手段６を備えている。この液体クロマトグラフィ装置Ａは、たとえば血液などの検体Ｓについて液体クロマトグラフィを行う。

試料作製手段１は、採血管Ｔｓから採取した所定量の検体Ｓを、ボトルＢｄから採取した希釈液Ｌｄによって所定倍率で希釈することにより、液体クロマトグラフィを行う試料を生成する。試料作製手段１は、たとえば採血管Ｔｓから検体Ｓを採取するための針状のノズルや、ボトルＢｄから希釈液Ｌｄを採取する採取管、およびこれらを混合する混合撹拌手段を有する。

流路切替バルブ２は、たとえば六方バルブ２１およびインジェクションループ２２を有する。六方バルブ２１は、ポート２１ａ，２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ，２１ｅ，２１ｆを有しており、インジェクションループ２２に対して回転自在とされている。ポート２１ａ，２１ｂ、ポート２１ｃ，２１ｄ、およびポート２１ｅ，２１ｆは、それぞれが互いに独立した流路で連結されている。図示された状態においては、ポート２１ａが配管Ｐ４に、ポート２１ｂが配管Ｐ３に、ポート２１ｃ、２１ｆがインジェクションループ２２に、ポート２１ｄが配管Ｐ２に、ポート２１ｅが配管Ｐ１を介して試料作製手段１に、それぞれ接続されている。インジェクションループ２２は、一定量の上記試料を蓄えるためのものである。

送出手段３および流路切替バルブ４は、本発明で言う溶離液供給手段を構成している。送出手段３は、ボトルＢａに収容された溶離液（溶媒）Ｌａを流路切替バルブ４へと送出するためのものであり、配管Ｐ５に設けられている。送出手段３は、プランジャーポンプ３１およびダンパ３２からなる。プランジャーポンプ３１は、往復動するプランジャーと逆止弁とを備えた構造であり、定容量型ポンプの一例に相当する。ダンパ３２は、プランジャーポンプ３１によって生じる脈動を緩和する機能を果たす。

流路切替バルブ４は、たとえば六方バルブ４１およびインジェクションループ４２を有する。六方バルブ４１は、ポート４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４１ｄ，４１ｅ，４１ｆを有しており、インジェクションループ４２に対して回転自在とされている。ポート４１ａ，４１ｂ、ポート４１ｃ，４１ｄ、およびポート４１ｅ，４１ｆは、それぞれが互いに独立した流路で連結されている。図示された状態においては、ポート４１ａが配管Ｐ５を介して送出手段３に、ポート４１ｂが配管Ｐ３を介して流路切替バルブ２に、ポート４１ｃ、４１ｆがインジェクションループ４２に、ポート４１ｄが配管Ｐ７に、ポート４１ｅが配管Ｐ６を介して溶離液（溶媒）Ｌｂが収容されたボトルＢｂに、それぞれ接続されている。本実施形態においては、溶離液Ｌｂは、その塩濃度が溶離液Ｌａよりも高い。インジェクションループ４２は、一定量の溶離液Ｌｂを蓄えるためのものである。本実施形態においては、インジェクションループ４２の容量は、たとえば１４２μＬ程度とされている。これは、５秒間に送出手段３によって送出される量に相当する。

分析部５は、配管Ｐ４を介して流路切替バルブ２に接続されており、液体クロマトグラフィによる分析を行う場である。分析部５は、プレフィルター５１、カラム５２、および検出装置５３からなる。プレフィルター５１は、カラム５２に不要物が進入することを防止する。カラム５２は、導入された上記試料を吸着させるための充填材を保持している。この充填材に上記試料を吸着させた後に、カラム５２に溶離液Ｌａを注入させると、吸着された上記試料は溶離液Ｌａによって脱着される。さらに、脱着された上記試料と溶離液Ｌａは脱着液としてカラム５２内を流れて排出される。検出装置５３は、カラム５２から流れる上記脱着液の吸光度を測定することにより上記試料の成分を分析するように構成されている。

制御手段６は、試料作製手段１、流路切替バルブ２、送出手段３、流路切替バルブ４、および分析部５をそれぞれ駆動制御するものであり、たとえばＣＰＵおよびメモリと信号を送受信するためのインターフェースとを備える。制御手段６は、以下に述べる上記試料の分析および次の分析を行うための処理についての制御を行う。

（液体クロマトグラフィ装置の分析の概要）
次いで、液体クロマトグラフィ装置Ａを用いた分析について、図１〜図３を参照しつつ、以下に説明する。

まず、液体クロマトグラフィ装置Ａを、図１に示す分析初期状態とする。図１においては、試料作製手段１において検体Ｓが希釈液Ｌｄによって希釈されることにより試料ＳＬが準備されている。

次いで、図１に示すように、試料ＳＬをインジェクションループ２２へと導入する。この導入は、たとえば配管Ｐ２下流側に配置された吸引ポンプ（図示省略）によって行う。また、このときに、溶離液Ｌｂをインジェクションループ４２へと導入する。この導入は、たとえば配管Ｐ７の下流側に配置された吸引ポンプ（図示省略）によって行う。これらの導入により、インジェクションループ２２には一定量の試料ＳＬが、インジェクションループ４２には一定量の溶離液Ｌｂが、それぞれ蓄えられる。

次いで、図２に示すように、流路切替バルブ２の六方バルブ２１をたとえば反時計回りに６０°回転させる。これにより、ポート２１ａ，２１ｄがインジェクションループ２２に、ポート２１ｂが配管Ｐ４に、ポート２１ｃが配管Ｐ３に、ポート２１ｅが配管Ｐ２に、ポート２１ｆが配管Ｐ１に、それぞれ接続される。この状態で、プランジャーポンプ３１を駆動させることにより送出手段３から溶離液Ｌａを流路切替バルブ４へと送出する。この溶離液Ｌａは、ポート４１ａ，４１ｂおよび配管Ｐ３を介して、流路切替バルブ２へと向かう。そして、溶離液Ｌａとともにインジェクションループ２２に蓄えられた一定量の試料ＳＬが分析部５へと送られる。分析部５においては、検出装置５３によって試料ＳＬに含まれる特定成分の分析がなされる。

この分析の途中または終えた状態においては、たとえばカラム５２には、分析対象となる特定成分以外に、分析対象外であるその他の成分が付着している。これらのその他の成分は、分析中の測定結果に必要なものであり、または、次の分析を阻害するものである。このため、制御手段６は、このその他の成分を溶出や洗浄させるための制御を行う。

すなわち、図３に示すように、流路切替バルブ４の六方バルブ４１をたとえば時計回りに６０°回転させる。これにより、ポート４１ａ，４１ｄがインジェクションループ４２に、ポート４１ｂが配管Ｐ５に、ポート４１ｃが配管Ｐ３に、ポート４１ｅが配管Ｐ７に、ポート４１ｆが配管Ｐ６に、それぞれ接続される。この状態でプランジャーポンプ３１を駆動させることにより、送出手段３から流路切替バルブ４に向けて溶離液Ｌａを送出する。すると、インジェクションループ４２に蓄えられた一定量の溶離液Ｌｂが配管Ｐ３へと送り出される。この溶離液Ｌｂは、配管Ｐ３にあった溶離液Ｌａと送出手段３によって送られてきた溶離液Ｌａとによって挟まれた格好となる。

そして、プランジャーポンプ３１の駆動をさらに継続することにより、一定量の溶離液Ｌｂのすべてがインジェクションループ４２から配管Ｐ３へと送り出される。この後は、送出手段３による溶離液Ｌａの送出を継続することにより、溶離液Ｌｂによってカラム５２に付着したその他の成分を溶出や洗浄し、さらにカラム５２をはじめとする系を溶離液Ｌａによって十分に満たすことにより、カラム５２などを次の分析を行うのに適した塩濃度とする。

上記の液体クロマトグラフィ装置Ａでは、流路切替バルブ４に対して溶離液Ｌａ，Ｌｂが別々のポートから供給され、六方バルブ４１の回転によって、溶離液Ｌａに一定量の溶離液Ｌｂを割り込ませる格好となっている。このため、溶離液Ｌｂが溶離液Ｌａに挟まれた状態で過大な混濁を生じることなくカラム５２へと供給される。その際、カラム５２における塩濃度を急峻に変化させれば、塩濃度が所望濃度（溶離液Ｌａの塩濃度）に復帰するまで、冗長に時間を経過させる必要が無く、液体クロマトグラフィの分析時間を短縮することができる。

（検出装置の構成）
次に、液体クロマトグラフィ装置Ａに用いられる検出装置５３について説明する。

図４〜図７に示すように、検出装置５３は、カラム５２（図１等参照）を通過した溶離液Ｌａ、Ｌｂ（溶離液Ｌａ、Ｌｂと脱着された上記試料とからなる脱着液）に含まれるヘモグロビンを光学的に検出するためのものである。図４〜図７では、検出装置５３の構成を分かりやすくするため、カラム５２から検出装置５３に送られる脱着液を便宜的に溶離液Ｌａ、Ｌｂとして図示している。検出装置５３は、脱着液としての溶離液Ｌａ、Ｌｂが流れる測光用のフローセル７０と、フローセル７０に光を照射する光源７１と、フローセル７０を透過した光を２経路に分光（分割）するビームスプリッタ７２と、受光量を測定する測定用受光系７３および参照用受光系７４と、を有している。さらに、検出装置５３は、光源７１とフローセル７０との間に配置されると共に光源７１からの光を散らす散乱板７６を備えている。

フローセル７０は、測光エリアを規定するためのものである。フローセル７０は、配管Ｐ４の流れ方向の上流側が接続される導入流路７０Ａと、光源７１からの光が通過する流路としての測光流路７０Ｂと、配管Ｐ４（図１等参照）の流れ方向の下流側が接続される排出流路７０Ｃと、を有している。導入流路７０Ａと測光流路７０Ｂと排出流路７０Ｃとは、この順番で連通している。導入流路７０Ａは、カラム５２（図１等参照）から送られる脱着液としての溶離液Ｌａ、Ｌｂを測光流路７０Ｂに導入するためのものであり、カラム５２（図１等参照）に配管Ｐ４を介して接続されている。配管Ｐ４は、一例として、酸素透過性の低い材料、例えばナイロン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンまたはステンレス（ＳＵＳ）などにより形成されている。また、フローセル７０は、例えば、筒状とされている。

測光流路７０Ｂは、測光対象となる脱着液としての溶離液Ｌａ、Ｌｂを流通させ、かつ溶離液Ｌａ、Ｌｂを測光するための場を提供するものであり、直線状に形成されている。この測光流路７０Ｂは、両端部が透明カバー７５により塞がれている。測光流路７０Ｂは、流れ方向と直交する方向の断面が略円形状とされており、一例として、測光流路７０Ｂの内径は１ｍｍ程度とされている。排出流路７０Ｃは、測光流路７０Ｂの溶離液Ｌａ、Ｌｂを排出するためのものであり、配管Ｐ４を介して図示しない廃液槽に接続されている。

光源７１は、測光流路７０Ｂを流通する溶離液Ｌａ、Ｌｂに光を照射するためのものである。この光源７１は、光軸Ｌが測光流路７０Ｂの中心を通過するように、測光流路７０Ｂの端面７０Ｂａ（透明カバー７５）に対面した状態で配置されている。光源７１としては、オキシヘモグロビンの最大吸収波長又はこれに近い４１５〜４２０ｎｍ、および参照波長である５００ｎｍの光を含んだ波長範囲の光を出射可能なもの、例えばハロゲンランプが使用されている。もちろん、光源７１としては、ハロゲンランプ以外のもの、たとえば１または複数のＬＥＤ素子を備えたものを使用することもできる。本実施形態では、光源７１からの光が測定用受光系７３に向けて照射される方向は、測光流路７０Ｂに流通される溶離液Ｌａ、Ｌｂの流れ方向と逆方向となるように設定されている。なお、光源７１からの光が測定用受光系７３に向けて照射される方向は、上記構成に限定するものではなく、例えば、測光流路７０Ｂに流通される溶離液Ｌａ、Ｌｂの流れ方向と同方向となるように設定してもよい。

ビームスプリッタ７２は、光源７１から出射された光のうち、測光流路７０Ｂを透過した光を分光（分割）して測定用受光系７３および参照用受光系７４に入射させるためのものであり、光軸Ｌ上において、４５度傾斜した状態で配置されている。ビームスプリッタ７２としては、ハーフミラーなどの種々のものを使用することができる。

測定用受光系７３は、ビームスプリッタ７２を透過した光のうち、オキシヘモグロビンの最大吸収波長である４２０ｎｍの光を選択的に受光するものであり、光軸Ｌ上に配置されている。この測定用受光系７３は、４２０ｎｍの光を選択的に透過させる第１バンドパスフィルタとしてのバンドパスフィルタ７３Ａと、バンドパスフィルタ７３Ａを透過した光を受光するための第１受光部としての受光素子７３Ｂと、を備えている。受光素子７３Ｂとしては、フォトダイオードを使用することができる。ここで、４２０ｎｍの光は、ビームスプリッタ７２で分光された光の一の波長の光に相当する。

参照用受光系７４は、ビームスプリッタ７２において反射して光路が変えられた光のうち、参照波長である５００ｎｍの光を選択的に受光するものである。この参照用受光系７４は、５００ｎｍの光を選択的に透過させる第２バンドパスフィルタとしてのバンドパスフィルタ７４Ａと、バンドパスフィルタ７４Ａを透過した光を受光するための第２受光部としての受光素子７４Ｂと、を備えている。受光素子７４Ｂとしては、フォトダイオードを使用することができる。ここで、５００ｎｍの光は、ビームスプリッタ７２で分光された光の他の波長の光に相当する。なお、検出装置５３では、ビームスプリッタ７２、測定用受光系７３（バンドパスフィルタ７３Ａと受光素子７３Ｂ）、および参照用受光系７４（バンドパスフィルタ７４Ａと受光素子７４Ｂ）で、本発明の「受光部」が構成されている。

散乱板７６は、光源７１からの光の進行方向における光源７１とビームスプリッタ７２との間に設けられていればよく、本実施形態では、光源７１とフローセル７０の測光流路７０Ｂとの間に設けられている。散乱板７６は、光源７１からの光が透過することで、光をランダムに散乱させ（散らし）、又は拡散させるものである。すなわち、散乱板７６は、拡散板としての機能も有する。検出装置５３では、光源７１からの光が散乱板７６を透過してランダムに散乱又は拡散された状態で、フローセル７０の測光流路７０Ｂに照射されるようになっている。散乱板７６としては、例えば、乳白色の樹脂シート、スリガラス、表面を粗した樹脂シート、複数の細かい筋が形成された樹脂シート又はガラス、複数の細かい開口が形成された樹脂シート又はガラスなどが用いられる。本実施形態では、一例として、散乱板７６は、乳白色の樹脂シートで構成されている。また、本実施形態では、散乱板７６は、１枚の乳白色の樹脂シートで構成されているが、２枚以上の乳白色の樹脂シートを重ね合わせてもよい。散乱板７６の作用については、後に説明する。

制御手段６（図１等参照）には、図示しない演算回路が設けられており、演算回路で、測定用受光系７３の受光素子７３Ｂで受光されたサンプル用の波形と、参照用受光系７４の受光素子７４Ｂで受光された参照用の波形とが測定される。そして、制御手段６の演算部で、サンプル用の波形と参照用の波形とを比較することで、吸光度が算出される。例えば、サンプル用の波形から参照用の波形を引き算することにより、吸光度が算出される（図１０参照）。この吸光度により、脱着液に含まれるグリコヘモグロビンが定量される。

（作用および効果）
次に、本実施形態の検出装置５３を備えた液体クロマトグラフィ装置Ａの作用および効果について説明する。

図４〜図７に示すように、カラム５２（図１等参照）を通過した脱着液としての溶離液Ｌａ、Ｌｂは、配管Ｐ４を介して検出装置５３のフローセル７０に供給される。フローセル７０に対しては、配管Ｐ４および導入流路７０Ａを介して溶離液Ｌａ、Ｌｂが導入され、この溶離液Ｌａ、Ｌｂは測光流路７０Ｂおよび排出流路７０Ｃを通過した後に、配管Ｐ４を介して廃液槽（図示省略）に導かれる。

より具体的には、図４に示すように、まずカラム５２（図１等参照）を通過した脱着液としての溶離液Ｌａが検出装置５３のフローセル７０に供給され、溶離液Ｌａが測光流路７０Ｂを通過する。

次いで、前述のように溶離液Ｌａから溶離液Ｌｂに切り替わることで、図５に示すように、溶離液Ｌａの後に溶離液Ｌｂが検出装置５３のフローセル７０に供給される。これにより、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂとの界面Ｌ１が測光流路７０Ｂを通過する。その後、図６に示されるように、溶離液Ｌｂが測光流路７０Ｂを通過する。

次いで、前述のように溶離液Ｌｂから溶離液Ｌａに切り替わることで、図７に示すように、溶離液Ｌｂの後に溶離液Ｌａが検出装置５３のフローセル７０に供給される。これにより、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂとの界面Ｌ２が測光流路７０Ｂを通過する。その後、図示を省略するが、溶離液Ｌａが測光流路７０Ｂを通過する（図４参照）。

検出装置５３では、図４〜図７に示すように、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂと溶離液Ｌａとがこの順で測光流路７０Ｂを流通する際に、光源７１から散乱板７６を透過した光が溶離液に対して連続的に照射される。その一方で、測光流路７０Ｂを透過した光は、ビームスプリッタ７２において分割された後、測定用受光系７３および参照用受光系７４において受光される。測定用受光系７３では、バンドパスフィルタ７３Ａを透過したオキシヘモグロビンの最大吸収波長である４２０ｎｍの光が受光素子７３Ｂにおいて選択的に受光される。一方、参照用受光系７４では、バンドパスフィルタ７４Ａを透過した参照波長である５００ｎｍの光が受光素子７４Ｂにおいて選択的に受光される。

受光素子７３Ｂ、７４Ｂでの受光結果は、図１に示す制御手段６の演算回路に出力される。演算回路では、測定用受光系７３の受光素子７３Ｂで受光されたサンプル用の波形と、参照用受光系７４の受光素子７４Ｂで受光された参照用の波形により、測定時間に対する吸光度が算出される。より具体的には、この演算回路において、ヘモグロビンのクロマトグラム、グリコヘモグロビンの濃度（ヘモグロビン総量におけるグリコヘモグロビンの割合）が演算される。演算回路での演算結果は、液体クロマトグラフィ装置Ａに設けられた表示パネル（図示省略）に表示され、また自動的あるいは使用者のボタン操作によってプリントアウトされる。

ここで、本実施形態の検出装置５３を備えた液体クロマトグラフィ装置Ａの作用および効果を具体的に説明する前に、図１１〜図１４を用いて、比較例の検出装置２０２を備えた液体クロマトグラフィ装置について説明する。

図１１および図１２には、比較例の検出装置２０２が模式的な概念図にて示されている。図１１および図１２に示されるように、比較例の検出装置２０２では、光源７１から光がフローセル２０４の測光流路７０Ｂに照射されるが、光源７１とフローセル２０４との間に本実施形態のような散乱板は設けられていない。なお、図１１および図１２では、検出装置２０２の構成および作用を分かりやすくするため、ビームスプリッタ７２と、バンドパスフィルタ７３Ａと、参照用受光系７４のバンドパスフィルタ７４Ａおよび受光素子７４Ｂと、を省略している。

図１１に示されるように、フローセル２０４の測光流路７０Ｂに、１種類の溶離液（図１１では、一例として、溶離液Ｌａ）が流通しているときは、測光流路７０Ｂに入射された４２０ｎｍの光は真直ぐに進み、受光素子７４Ｂ付近に到達する。同様に、測光流路７０Ｂに入射された５００ｎｍの光は真直ぐに進み、受光素子７４Ｂ付近に到達する。

これに対し、図１２に示されるように、フローセル２０４の測光流路７０Ｂに、濃度の異なる２種類の溶離液の界面（図１２では、一例として、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂとの界面Ｌ１）が通過するときは、界面Ｌ１でレンズ効果により光の屈折率が変わる。波長が４２０ｎｍと５００ｎｍの光では、界面Ｌ１での屈折率が異なる。これにより、フローセル２０４の測光流路７０Ｂの壁面で吸収される光の量と、反射される光の量の比率が変わるため、受光素子７４Ｂに当たる光の強さが波長によって異なる。その結果、検出装置２０２では、濃度差があるとして検出される。例えば、光源７１の像（例えば、ランプであればフィラメント、ＬＥＤであればチップの形やワイヤボンディングの影）が、受光素子７４Ｂに入ったり、受光素子７４Ｂから外れたりすることにもなり、受光素子７４Ｂで受光される光量が変わることになる。

図１３に示されるように、実際には検出装置２０２は、フローセル２０４の測光流路７０Ｂの光源７１に対して反対側に、ビームスプリッタ７２と、測定用受光系７３のバンドパスフィルタ７３Ａおよび受光素子７３Ｂと、参照用受光系７４のバンドパスフィルタ７４Ａおよび受光素子７４Ｂと、を備えている。フローセル２０４の測光流路７０Ｂに溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂとの界面Ｌ１が通過するときは、光の波長によって、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂとの界面Ｌ１で屈折率が異なる。ビームスプリッタ７２を透過した光のうち、５００ｎｍの光はバンドパスフィルタ７３Ａでブロックされ、４２０ｎｍの光はバンドパスフィルタ７３Ａを透過して受光素子７３Ｂで受光される。また、ビームスプリッタ７２において反射して光路が変えられた光のうち、４２０ｎｍの光はバンドパスフィルタ７４Ａでブロックされ、５００ｎｍの光はバンドパスフィルタ７４Ａを透過して受光素子７４Ｂで受光される。

図１４は、比較例の検出装置２０２を備えた液体クロマトグラフィ装置での溶離液の切り替えによる測定時間と吸光度（ベースラインの変動）との関係を示している。図１４に示されるように、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂでは、濃度が異なるため、光の波長により透過率の差が生じている。このため、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂでの吸光度に差が生じている。また、光の波長によって溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂとの界面Ｌ１（図１３参照）での屈折率が異なることにより、溶離液Ｌａから溶離液Ｌｂに切り替わるときに、吸光度にプラス側に突出するひげ状のノイズ２１０が発生している。同様に、光の波長によって溶離液Ｌｂと溶離液Ｌａとの界面Ｌ２（図７参照）での屈折率が異なることで、溶離液Ｌｂから溶離液Ｌａに切り替わるときに、吸光度にマイナス側に突出するひげ状のノイズ２１２が発生している。ノイズ２１０、２１２の向きが異なるのは、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂの濃度の違いに起因するものである。このため、同じ溶離液を用いていても、異なる溶離液に切り替えた前後でクロマトグラムのベースラインが変動することがある。このようにクロマトグラムのベースラインが乱れると、検出すべき試料の成分の面積が変わり、正確な定量を行うことができない場合がある。

図８および図９には、本実施形態の検出装置５３が模式的な概念図にて示されている。図８および図９に示されるように、検出装置５３では、光源７１とフローセル７０との間に散乱板７６が配置されている。なお、図８および図９では、検出装置５３の構成および作用を分かりやすくするため、ビームスプリッタ７２と、バンドパスフィルタ７３Ａと、参照用受光系７４のバンドパスフィルタ７４Ａおよび受光素子７４Ｂと、を省略している。

図８に示されるように、フローセル７０の測光流路７０Ｂに、１種類の溶離液（図８では、一例として、溶離液Ｌａ）が流通しているときは、光源７１からの光は、散乱板７６を透過することで、ランダムに散乱又は散乱されている。このため、４２０ｎｍと５００ｎｍの波長の光が、測光流路７０Ｂの壁面をランダムに反射し、受光素子７４Ｂ付近に到達する光が広がる。

また、図９に示されるように、フローセル７０の測光流路７０Ｂに、濃度の異なる２種類の溶離液の界面（図９では、一例として、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂとの界面Ｌ１）が通過するときは、界面Ｌ１でレンズ効果により光の屈折率が変わる。このとき、光源７１からの光が散乱板７６を透過することで、既に光がランダムに散乱又は拡散しているため、屈折率に差がある２種類の溶離液が通過しても、受光素子７４Ｂ付近に到達する光の幅に変化がない。

図１０は、本実施形態の検出装置５３を備えた液体クロマトグラフィ装置Ａでの溶離液の切り替えによる測定時間と吸光度との関係を示す、ベースラインである。図１０に示されるように、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂでは、濃度が異なるため、光の波長により透過率の差が生じている。このため、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂでの吸光度に差が生じている。しかし、散乱板７６によりランダムに散乱又は拡散した光がフローセル７０内に入射することにより光の偏りが抑制され、溶離液Ｌａと溶離液Ｌｂとが切り替わるときに、吸光度にひげ状のノイズが発生しない。

図１５には、図１０に示す散乱板７６があるときの吸光度から図１４に示す散乱板がないときの吸光度を引いたときの測定時間と吸光度との関係が示されている。図１５に示されるように、散乱板７６があるときの吸光度と散乱板がないときの吸光度との差分が、ノイズとなっていることが分かる。

上記の液体クロマトグラフィ装置Ａでは、検出装置５３の光源７１からの光の進行方向における光源７１とフローセル７０の測光流路７０Ｂとの間に、透過する光をランダムに散らす散乱板７６が設けられている。これにより、光源７１からの光が散乱板７６を透過することで、光がランダムに散乱又は拡散される。このため、２種類の溶離液Ｌａ、Ｌｂの界面Ｌ１、Ｌ２がそれぞれフローセル７０の測光流路７０Ｂを通過するときに、レンズ効果による測定用の受光素子７３Ｂと参照用の受光素子７４Ｂとに到達する光量がそれぞれ変化することが抑制される。このため、クロマトグラムのベースラインが乱れることが抑制され、試料の特定成分の正確な測定を行うことができる。

また、上記の液体クロマトグラフィ装置Ａでは、散乱板７６は、光源７１とフローセル７０の測光流路７０Ｂとの間に別体で配置されている。したがって、既存の検出装置の光源７１とフローセル７０との間に別体の散乱板７６を配置すればよいため、検出装置５３の製造が容易であり、低コスト化が可能である。

〔他の実施形態〕
図１６には、第２実施形態の液体クロマトグラフィ装置Ａに用いられる検出装置１００が断面図にて示されている。図１６に示されるように、検出装置１００では、図４に示すフローセル７０の光源７１側の透明カバー７５に代えて、フローセル１０２の測光流路７０Ｂにおける光源７１側の端面７０Ｂａを塞ぐように散乱板１０４が設けられている。散乱板１０４は、光源７１からの光の進行方向における光源７１とフローセル１０２の測光流路７０Ｂとの間に設けられており、光源７１からの光をランダムに散らす。散乱板１０４は、フローセル１０２の壁部の一部を構成している。散乱板１０４としては、例えば、乳白色の樹脂シート、スリガラス、表面を粗した樹脂シート又はガラスなどが用いられている。

上記の検出装置１００を備えた液体クロマトグラフィ装置Ａでは、光源７１から光が散乱板１０４を透過することで、光がランダムに散乱又は拡散される。このため、２種類の溶離液Ｌａ、Ｌｂの界面Ｌ１、Ｌ２がそれぞれフローセル１０２の測光流路７０Ｂを通過するときに、レンズ効果による受光素子７３Ｂ、７４Ｂに到達する光量が変化することが抑制される。このため、クロマトグラムのベースラインが乱れることが抑制され、試料の特定成分の正確な測定を行うことができる。

図１７には、第３実施形態の液体クロマトグラフィ装置Ａに用いられる検出装置１１０が断面図にて示されている。図１７に示されるように、検出装置１１０では、図４に示す検出装置５３の散乱板７６に代えて、光源７１からの光の進行方向における光源７１とフローセル７０の測光流路７０Ｂとの間に、光源７１からの光をランダムに散らす別体の散乱板１１２が設けられている。散乱板１１２は、光源７１側の面に複数の細かい筋１１２Ａが形成されたガラス又は樹脂シートで構成されている。

上記の検出装置１１０を備えた液体クロマトグラフィ装置Ａでは、光源７１から光が散乱板１１２を透過することで、光がランダムに散乱又は拡散される。このため、２種類の溶離液Ｌａ、Ｌｂの界面Ｌ１、Ｌ２がそれぞれフローセル７０の測光流路７０Ｂを通過するときに、レンズ効果による受光素子７３Ｂ、７４Ｂに到達する光量が変化することが抑制される。このため、クロマトグラムのベースラインが乱れることが抑制され、試料の特定成分の正確な測定を行うことができる。

図１８には、第４実施形態の液体クロマトグラフィ装置Ａに用いられる検出装置１２０が断面図にて示されている。図１８に示されるように、検出装置１２０では、図４に示すフローセル７０の測光流路７０Ｂの両側を塞ぐ透明カバー７５に代えて、フローセル１２２の測光流路７０Ｂの光源７１側を塞ぐレンズ１２４と、フローセル１２２の測光流路７０Ｂのビームスプリッタ７２側を塞ぐレンズ１２６が設けられている。レンズ１２４は、測光流路７０Ｂの中心側に光を集光させる形状とされており、レンズ１２６は、ビームスプリッタ７２の中心側に光を集光させる形状とされている。また、検出装置１２０には、光源７１からの光の進行方向における光源７１とフローセル１２２の測光流路７０Ｂとの間に、散乱板７６が配置されている。

上記の検出装置１１０を備えた液体クロマトグラフィ装置Ａでは、上記の散乱板７６による効果に加えて、レンズ１２４、１２６により、フローセル１２２の測光流路７０Ｂを透過した光が受光素子７３Ｂ、７４Ｂから外れる光の量を減らすことができる。

〔補足説明〕
なお、上記の第２実施形態では、フローセル１０２の壁部の一部に散乱板１０４が配置されているが（図１６参照）、本発明はこの構成に限定するものではない。例えば、フローセルの壁部の他の一部又はフローセルの壁部の全部を散乱板で構成してもよい。

また、上記の第１〜第４実施形態では、光源７１からの光の進行方向における光源７１とフローセル７０、１０２、１２２の測光流路７０Ｂとの間に散乱板７６、１０２、１１２が配置されているが、本発明はこれらの構成に限定するものではない。例えば、光源７１からの光の進行方向におけるフローセルの測光流路７０Ｂとビームスプリッタ７２との間に散乱板を設ける構成でもよい。

また、上記の第３実施形態では、散乱板１１２の光源７１側の面に複数の細かい筋１１２Ａが形成されているが、本発明はこの構成に限定するものでない。例えば、散乱板の光源７１と反対側の面、又は散乱板の両面に複数の細かい筋が形成されている構成でもよい。

また、上記の第４実施形態では、光源７１からの光の進行方向における光源７１とフローセル１２２のレンズ１２４との間に散乱板７６が設けられているが、本発明はこの構成に限定するものでない。例えば、散乱板７６に代えて、スリガラス、表面を粗した樹脂シート、複数の細かい筋が形成された樹脂シート又はガラス、複数の細かい開口が形成された樹脂シート又はガラスなどの１つを選択した散乱板を用いてもよい。

また、上記の第４実施形態において、散乱板７６を設けずに、レンズ１２４、１２６のどちらか一方、又はレンズ１２４、１２６の両方を散乱板とする構成でもよい。例えば、レンズは、乳白色とすることで、又は表面の少なくとも一部を粗すことで、光を散らす構成としてもよい。

また、上記の第１〜第４実施形態では、光源７１から測定用受光系７３の受光素子７３Ｂまでが略直線状に配置され、光源７１とフローセル７０、１０２、１２２の測光流路７０Ｂとの間に散乱板７６、１０２、１１２を配置したが、本発明はこの構成に限定するものではない。例えば、光源７１からの光がミラー等により反射される場合に、光源７１からの光の進行方向における光源７１と受光部（ビームスプリッタ７２、測定用受光系７３および参照用受光系７４）との間であって、光がミラーにより反射された後に、散乱板を配置する構成でもよい。

また、上記の第１〜第４実施形態では、フローセル７０、１０２、１２２を透過した光を２経路に分光する検出装置を例にして説明したが、本発明はこの構成に限定するものではない。例えば、フローセル７０、１０２、１２２を透過した光を分岐せずに１つの受光系（受光部）で測定を行うものであってもよい。この場合には、光源からの光の進行方向における光源と受光部との間であれば、散乱板をどの位置に設けてもよい。

なお、実施形態を挙げて本発明の実施の形態を説明したが、これらの実施形態は一例であり、要旨を逸脱しない範囲内で種々変更して実施できる。また、本発明の権利範囲がこれらの実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々なる態様で実施し得ることは言うまでもない。

３ 送出手段（溶離液供給手段）
４ 流路切替バルブ（溶離液供給手段）
５２ カラム
５３ 検出装置
７０ フローセル
７０Ｂ 測光流路（流路）
７１ 光源
７２ ビームスプリッタ
７３Ａ バンドパスフィルタ（第１バンドパスフィルタ）
７３Ｂ 受光素子（第１受光部）
７４Ａ バンドパスフィルタ（第２バンドパスフィルタ）
７４Ｂ 受光素子（第２受光部）
７６ 散乱板
１００ 検出装置
１０２ フローセル
１０４ 散乱板
１１０ 検出装置
１１２ 散乱板
１２０ 検出装置
１２２ フローセル
Ａ 液体クロマトグラフィ装置
Ｌａ、Ｌｂ 溶離液
Ｓ 検体
ＳＬ 試料

Claims (5)

1. 検体から試料の成分を分離するカラムと、
   ２種類以上の溶離液を切り替えて前記カラムに供給する溶離液供給手段と、
   前記カラムを通過した前記溶離液が導入されると共に前記溶離液に含まれる前記試料の特定成分を検出する検出装置と、を備え、
   前記検出装置は、
   前記溶離液が流れる流路を備えたフローセルと、
   前記フローセルの外部に設けられ、前記流路に流れる前記溶離液に光を照射する光源と、
   前記フローセルの外部に設けられ、前記フローセルを通過した光を受光する受光部と、
   前記光源からの光の進行方向において、前記光源と前記受光部との間に設けられた散乱板と、
   を有し、
   前記散乱板を通過した光は、光の向きがランダムな状態で前記受光部に到達する液体クロマトグラフィ装置。
2. 検体から試料の成分を分離するカラムと、
   ２種類以上の溶離液を切り替えて前記カラムに供給する溶離液供給手段と、
   前記カラムを通過した前記溶離液が導入されると共に前記溶離液に含まれる前記試料の特定成分を検出する検出装置と、を備え、
   前記検出装置は、
   前記溶離液が流れる流路を備えたフローセルと、
   前記フローセルの外部に設けられ、前記流路に流れる前記溶離液に光を照射する光源と、
   前記フローセルの外部に設けられ、前記フローセルを通過した光を受光する受光部と、
   前記光源からの光の進行方向において、前記光源と前記受光部との間に設けられた散乱板と、
   を有し、
   前記散乱板は、前記フローセルの壁部の少なくとも一部を構成している液体クロマトグラフィ装置。
3. 前記受光部は、
   前記フローセルの外部に設けられ、前記流路に流れる前記溶離液を通過した光を分光するビームスプリッタと、
   前記ビームスプリッタで分光された光の一の波長の光を透過させる第１バンドパスフィルタと、
   前記第１バンドパスフィルタを透過した光を受光する第１受光部と、
   前記ビームスプリッタで分光された光の他の波長の光を透過させる第２バンドパスフィルタと、
   前記第２バンドパスフィルタを透過した光を受光する第２受光部と、
   を含む請求項１又は請求項２に記載の液体クロマトグラフィ装置。
4. 前記散乱板は、前記光源と前記フローセルの前記流路との間に設けられている請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィ装置。
5. 前記散乱板は、乳白色とすることで、又は表面の少なくとも一部を粗すことで、前記光をランダムに散らす板状の樹脂、板状のガラス、レンズのいずれか１つにより構成されている請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィ装置。

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