JP6895662B2 - Fractionation method and capture method of specific cells - Google Patents

Description

本発明は、血液及び体液中の特定細胞（血液又は体液中に存在するがん細胞、幹細胞等）を分画する方法、及び捕捉する方法に関する。 The present invention relates to a method for fractionating specific cells (cancer cells, stem cells, etc. existing in blood or body fluid) in blood and body fluid, and a method for capturing them.

がん細胞が発生するとやがて、血液・体液中に出て来ることが知られており、血液中に出て来たがん細胞は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と呼ばれている。そして、この血中循環腫瘍細胞を調べることによるがんの治療効果の確認、予後寿命、投与前の抗がん剤の効果予測、がん細胞の遺伝子解析を用いた治療方法の検討、等が期待されている。 It is known that when cancer cells develop, they eventually appear in blood and body fluids, and the cancer cells that appear in the blood are called blood circulating tumor cells (CTCs). Then, confirmation of the therapeutic effect of cancer by examining these circulating tumor cells in the blood, prognosis lifespan, prediction of the effect of anticancer drugs before administration, examination of therapeutic methods using gene analysis of cancer cells, etc. Expected.

しかしながら、血中循環腫瘍細胞は非常に数が少なく（数個〜数百個／血液１ｍＬ）、がん細胞を分画及び捕捉することが難しいという問題がある。 However, the number of circulating tumor cells in blood is very small (several to several hundreds / 1 mL of blood), and there is a problem that it is difficult to fractionate and capture cancer cells.

例えば、血中循環腫瘍細胞の捕捉技術として、Ｃｅｌｌ Ｓｅａｒｃｈシステムと呼ばれるものが知られているが、これは、抗原抗体反応（ＥｐＣＡＭ抗体で捕捉）を用いる技術であるため、ＥｐＣＡＭを発現しているがん細胞しか捕捉できず、捕捉可能ながん細胞の種類に制限がある（特許文献１等参照）。 For example, as a technique for capturing blood-circulating tumor cells, a technique called the Cell Search system is known, which expresses EpCAM because it is a technique that uses an antigen-antibody reaction (captured by EpCAM antibody). Only cancer cells can be captured, and the types of cancer cells that can be captured are limited (see Patent Document 1 and the like).

特表２００５−５２３９８１号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-523981

本発明は、前記課題を解決し、特定細胞（ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞を含む多くのがん細胞、末梢血幹細胞等）の分画及び捕捉が可能な特定細胞の分画方法及び捕捉方法を提供することを目的とする。 The present invention solves the above-mentioned problems, and a method for fractionating and capturing specific cells (many cancer cells including cancer cells that do not express EpCAM, peripheral blood stem cells, etc.) and a method for fractionating specific cells. It is intended to provide a capture method.

本発明は、血液又は体液中に含まれる特定細胞の分画方法であって、前記血液又は前記体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、前記遠心分離は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて行われる特定細胞の分画方法に関する。 The present invention is a method for fractionating specific cells contained in blood or body fluid, wherein the blood or body fluid is fractionated by centrifugation to collect specific cells contained in the blood or body fluid, and the said. Centrifugation relates to a method for fractionating specific cells performed using a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface.

前記特定細胞の分画方法において、前記遠心分離により分画し、形成された分画層と、前記分画層の上層及び下層とを回収し、回収する前記上層及び前記下層の厚みが前記分画層の厚みの２．０倍以下であることが好ましい。 In the method for fractionating specific cells, the fractionated layer formed by fractionating by centrifugation and the upper and lower layers of the fractionated layer are collected, and the thickness of the upper layer and the lower layer to be collected is the fraction. It is preferably 2.0 times or less the thickness of the layer.

前記特定細胞の分画方法において、前記遠心分離により分画し、形成された分画線又は分画層と、前記分画線又は前記分画層の上層及び下層とを回収し、回収する前記上層及び前記下層の厚みが５．０ｍｍ以下であることが好ましい。 In the method for fractionating specific cells, the fractionation line or fractionation layer formed by fractionation by centrifugation and the upper and lower layers of the fractionation line or the fractionation layer are collected and recovered. The thickness of the upper layer and the lower layer is preferably 5.0 mm or less.

前記特定細胞の分画方法において、前記遠心分離時に分離液を用いて分画することが好ましい。 In the method for fractionating specific cells, it is preferable to fractionate using a separation solution at the time of centrifugation.

前記特定細胞の分画方法において、前記分離液の密度が１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬであることが好ましい。
前記特定細胞の分画方法において、前記分離液の密度が１．０６０〜１．０８５ｇ／ｍＬであることが好ましい。 In the method for fractionating specific cells, the density of the separation solution is preferably 1.060 to 1.115 g / mL.
In the method for fractionating specific cells, the density of the separation solution is preferably 1.060 to 1.085 g / mL.

前記特定細胞の分画方法において、前記容器は、内表面の少なくとも一部の水の接触角が３０度以下であることが好ましい。 In the method for fractionating specific cells, it is preferable that the contact angle of at least a part of water on the inner surface of the container is 30 degrees or less.

前記特定細胞の分画方法において、前記血液又は前記体液に溶血剤を混合させた後、前記遠心分離を施すことが好ましい。 In the method for fractionating specific cells, it is preferable to mix the hemolytic agent with the blood or the body fluid and then perform the centrifugation.

前記特定細胞の分画方法において、前記血液又は前記体液中の血球細胞同士を凝集させた後、前記遠心分離を施すことが好ましい。 In the method for fractionating specific cells, it is preferable to perform the centrifugation after agglutinating blood cell cells in the blood or the body fluid.

本発明はまた、血液又は体液中に含まれる特定細胞の捕捉方法であって、前記血液又は前記体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、前記遠心分離は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて行われる特定細胞の捕捉方法に関する。 The present invention is also a method for capturing specific cells contained in blood or body fluid, in which the blood or body fluid is fractionated by centrifugation to collect the specific cells contained in the blood or body fluid, and then the specific cells are collected. The specific cells contained in the obtained recovery fluid are captured in a hydrophilic polymer layer, and the centrifugation is performed using a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface of the specific cells. Regarding the capture method.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記遠心分離により分画し、形成された分画層と、前記分画層の上層及び下層とを回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、回収する前記上層及び前記下層の厚みが前記分画層の厚みの２．０倍以下であることが好ましい。 In the method for capturing specific cells, the fractionated layer formed by fractionation by centrifugation and the upper and lower layers of the fractionated layer are recovered, and then the specific cells contained in the obtained recovery liquid are collected. It is preferable that the thickness of the upper layer and the lower layer for capturing and collecting the cells in the hydrophilic polymer layer is 2.0 times or less the thickness of the fractionation layer.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記遠心分離により分画し、形成された分画線又は分画層と、前記分画線又は前記分画層の上層及び下層とを回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、回収する前記上層及び前記下層の厚みが５．０ｍｍ以下であることが好ましい。 In the method for capturing specific cells, the fractionation line or fractionation layer formed by fractionation by centrifugation and the upper and lower layers of the fractionation line or the fractionation layer are collected, and then obtained. It is preferable that the thickness of the upper layer and the lower layer for collecting the specific cells contained in the collected liquid in the hydrophilic polymer layer is 5.0 mm or less.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記遠心分離時に分離液を用いて分画することが好ましい。 In the method for capturing specific cells, it is preferable to fractionate using a separation solution at the time of centrifugation.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記分離液の密度が１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬであることが好ましい。
前記特定細胞の捕捉方法において、前記分離液の密度が１．０６０〜１．０８５ｇ／ｍＬであることが好ましい。 In the method for capturing specific cells, the density of the separation solution is preferably 1.060 to 1.115 g / mL.
In the method for capturing specific cells, the density of the separation solution is preferably 1.060 to 1.085 g / mL.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記容器は、内表面の少なくとも一部の水の接触角が３０度以下であることが好ましい。 In the method for capturing specific cells, it is preferable that the contact angle of at least a part of water on the inner surface of the container is 30 degrees or less.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記血液又は前記体液中に溶血剤を混合させた後、前記遠心分離を施すことが好ましい。 In the method for capturing specific cells, it is preferable to mix the hemolytic agent in the blood or the body fluid and then perform the centrifugation.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記血液又は前記体液中の血球細胞同士を凝集させた後、前記遠心分離を施すことが好ましい。 In the method for capturing specific cells, it is preferable to perform the centrifugation after agglutinating blood cell cells in the blood or the body fluid.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記血液又は前記体液を希釈した後、前記血液又は前記体液中の血球細胞同士を凝集させ、次いで、前記遠心分離を施すことが好ましい。 In the method for capturing specific cells, it is preferable to dilute the blood or the body fluid, then aggregate the blood cell cells in the blood or the body fluid, and then perform the centrifugation.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記血液又は前記体液中の血球細胞同士を凝集させた後、希釈し、次いで、遠心分離を施すことが好ましい。 In the method for capturing specific cells, it is preferable that blood cell cells in the blood or body fluid are aggregated, diluted, and then centrifuged.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記血球細胞同士を凝集させる方法が抗原抗体反応を用いる方法であることが好ましい。 In the method for capturing specific cells, it is preferable that the method for agglutinating blood cell cells is a method using an antigen-antibody reaction.

前記特定細胞の捕捉方法において、特定細胞は、がん細胞であることが好ましい。 In the method for capturing specific cells, the specific cells are preferably cancer cells.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性ポリマーで形成されていることが好ましい。

（式中、Ｒ^１は水素原子又はメチル基、Ｒ^２はアルキル基を表す。ｐは１〜８、ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。） In the method for capturing specific cells, the hydrophilic polymer layer is formed of at least one hydrophilic polymer selected from the group consisting of the polymer represented by the following formula (I) and poly (meth) acryloyl morpholine. It is preferable to have.

(In the formula, R ¹ represents a hydrogen atom or a methyl group, R ² represents an alkyl group. P represents 1 to 8, m represents 1 to 5, and n represents the number of repetitions.)

前記特定細胞の捕捉方法において、前記親水性ポリマー層は、下記式（ＩＩ）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体で形成されていることが好ましい。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、ｐ、ｍは前記と同様。） In the method for capturing specific cells, the hydrophilic polymer layer comprises at least one hydrophilic monomer selected from the group consisting of the compound represented by the following formula (II) and (meth) acryloyl morpholine, and other monomers. It is preferably formed of a copolymer of.

(In the formula, R ¹ , R ² , p, m are the same as above.)

前記特定細胞の捕捉方法において、前記親水性ポリマー層の厚みが１０〜８００ｎｍであることが好ましい。 In the method for capturing specific cells, the thickness of the hydrophilic polymer layer is preferably 10 to 800 nm.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記親水性ポリマー層表面にフィブロネクチンが吸着されていることが好ましい。 In the method for capturing specific cells, it is preferable that fibronectin is adsorbed on the surface of the hydrophilic polymer layer.

本発明によれば、血液又は体液中に含まれる特定細胞の分画方法であって、前記血液又は前記体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、前記遠心分離は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて行われる特定細胞の分画方法等であるので、特定細胞（ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞を含む多くのがん細胞等）を効果的に分画できる。従って、例えば、血液又は体液中からがん細胞等の特定細胞を充分に分画できる。 According to the present invention, it is a method for fractionating specific cells contained in blood or body fluid, and the blood or body fluid is fractionated by centrifugation to collect specific cells contained in the blood or body fluid. Since the centrifugation is a method for fractionating specific cells using a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface, specific cells (cancer cells that do not express EpCAM). Many cancer cells including) can be effectively fractionated. Therefore, for example, specific cells such as cancer cells can be sufficiently fractionated from blood or body fluid.

また、本発明によれば、血液又は体液中に含まれる特定細胞の捕捉方法であって、前記血液又は前記体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、前記遠心分離は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて行われる特定細胞の捕捉方法等であるので、特定細胞（ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞を含む多くのがん細胞等）を効果的に捕捉でき、また、赤血球、白血球、血小板等の血球細胞の粘着・接着を抑制できる。従って、例えば、血液又は体液中からがん細胞等の特定細胞を選択的に捕捉できる。 Further, according to the present invention, it is a method for capturing specific cells contained in blood or body fluid, and the blood or body fluid is fractionated by centrifugation to recover specific cells contained in the blood or body fluid. Then, the specific cells contained in the obtained recovery liquid are captured in a hydrophilic polymer layer, and the centrifugation is performed using a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface. Since it is a method for capturing specific cells, it is possible to effectively capture specific cells (many cancer cells including cancer cells that do not express EpCAM), and blood cell cells such as erythrocytes, leukocytes, and platelets. Adhesion / adhesion can be suppressed. Therefore, for example, specific cells such as cancer cells can be selectively captured from blood or body fluid.

血液又は体液に遠心分離を施す前後を示す模式図の一例である。This is an example of a schematic diagram showing before and after centrifugation of blood or body fluid. 親水性ポリマー層が形成されたウェルを有するマルチウェルプレートの模式図の一例である。This is an example of a schematic diagram of a multi-well plate having wells on which a hydrophilic polymer layer is formed.

本発明の特定細胞の分画方法は、血液又は体液中に含まれる特定細胞の分画方法であって、前記血液又は前記体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、前記遠心分離は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて行われる特定細胞の分画方法である。 The method for fractionating specific cells of the present invention is a method for fractionating specific cells contained in blood or body fluid, and the blood or body fluid is fractionated by centrifugation and contained in the blood or body fluid. The specific cells are collected, and the centrifugation is a method for fractionating specific cells, which is performed using a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface.

また本発明の特定細胞の捕捉方法は、血液又は体液中に含まれる特定細胞の捕捉方法であって、前記血液又は前記体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、前記遠心分離は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて行われる特定細胞の捕捉方法である。 Further, the method for capturing specific cells of the present invention is a method for capturing specific cells contained in blood or body fluid, in which the blood or body fluid is fractionated by centrifugation and specified contained in the blood or body fluid. The cells were collected, and then the specific cells contained in the obtained recovery fluid were captured in a hydrophilic polymer layer, and the centrifugation was performed using a container having a low protein adsorption layer formed on at least a part of the inner surface. This is a method for capturing specific cells.

すなわち、先ず、体等から採取した血液又は体液を、遠心分離処理を施して分画する際に、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて遠心分離することで、採取した血液又は体液に比べ、血球細胞の濃度が減少し、特定細胞が濃縮された試料を分画すると共に、次いで、作製（分画）された試料を親水性ポリマー層に接触させることで、試料中のがん細胞等の特定細胞を該ポリマー層に捕捉する方法である。これにより、赤血球、血小板等の血球細胞の分画・分離が良好になると同時に、容器へのがん細胞等の特定細胞の吸着も抑制され、特定細胞のロス（分画・分離および濃縮の操作に使う容器への特定細胞の吸着などによるロス）が減少する。よって、血球細胞等による細胞接着抑止効果が減じ、親水性ポリマーに対する特定細胞の本来の接着能力が発揮されるので、がん細胞等の特定細胞の捕捉性が大きく向上すると共に、血球細胞の捕捉性が低下し、分画・分離および濃縮の操作でのがん細胞のロスがあり、血球細胞が多い状態では到底発揮し得ないがん細胞の選択的な捕捉効果を奏する。 That is, first, when blood or body fluid collected from a body or the like is subjected to a centrifugation treatment and fractionated, the blood or body fluid is centrifuged by using a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface. By fractionating the sample in which the concentration of blood cell cells is reduced and the specific cells are concentrated as compared with the collected blood or body fluid, and then the prepared (fractionated) sample is brought into contact with the hydrophilic polymer layer. , A method of capturing specific cells such as cancer cells in a sample in the polymer layer. As a result, the fractionation / separation of blood cell cells such as erythrocytes and platelets is improved, and at the same time, the adsorption of specific cells such as cancer cells to the container is suppressed, and the loss of specific cells (operation of fractionation / separation and concentration) is suppressed. Loss due to adsorption of specific cells to the container used for) is reduced. Therefore, the effect of suppressing cell adhesion by blood cells and the like is reduced, and the original ability of the specific cells to adhere to the hydrophilic polymer is exhibited, so that the capture of specific cells such as cancer cells is greatly improved and the capture of blood cells is greatly improved. It has a reduced sex, there is a loss of cancer cells in the operation of fractionation / separation and concentration, and it exerts a selective capture effect of cancer cells that cannot be exerted at all when there are many blood cells.

例えば、先ず、採取した血液又は体液に対して、前記所定の容器を用いた遠心分離処理を施すことで、血液又は体液中の赤血球、白血球、血小板等の血球細胞等を分画・分離（除去）した後、作製されたこれらの濃度が減少し、特定細胞のロスが抑えられた試料を親水性ポリマー層に接触させることにより、特定細胞を選択的に捕捉できる。従って、血液又は体液中のがん細胞等が親水性ポリマー層に、効果的に捕捉される。そして、捕捉されたがん細胞等の数を測定することで、血液又は体液中のがん細胞等の数が判り、がん治療効果の確認等を期待できる。また、捕捉したがん細胞等を培養し、その培養した細胞で抗がん剤等の効き目を確認することで、抗がん剤等の投与前に、体外で抗がん剤等の効き目を確認できると同時に、抗がん剤等の選定にも役立つ。更に、捕捉したがん細胞等を培養し、その培養した細胞で、がん細胞等の各種解析（遺伝子解析、病理解析等）にも使用できる。 For example, first, the collected blood or body fluid is subjected to a centrifugation treatment using the predetermined container to fractionate and separate (remove) blood cell cells such as red blood cells, white blood cells, and platelets in the blood or body fluid. ), The concentration of these produced is reduced, and the specific cells can be selectively captured by contacting the sample in which the loss of the specific cells is suppressed with the hydrophilic polymer layer. Therefore, cancer cells and the like in blood or body fluid are effectively captured by the hydrophilic polymer layer. Then, by measuring the number of captured cancer cells or the like, the number of cancer cells or the like in blood or body fluid can be known, and confirmation of the cancer therapeutic effect can be expected. In addition, by culturing the captured cancer cells, etc. and confirming the efficacy of the anticancer drug, etc. in the cultured cells, the efficacy of the anticancer drug, etc. can be confirmed in vitro before administration of the anticancer drug, etc. At the same time, it is useful for selecting anticancer drugs. Furthermore, the captured cancer cells and the like are cultured, and the cultured cells can be used for various analyzes (gene analysis, pathological analysis, etc.) of the cancer cells and the like.

前記特定細胞の分画方法及び捕捉方法は、血液又は体液中に含まれる特定細胞を分画する方法、及び分画した特定細胞を捕捉する方法である。特定細胞としては、がん細胞（ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞を含む任意のがん細胞、末梢血幹細胞）等が挙げられる。がん細胞としては、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）等が挙げられる。 The specific cell fractionation method and capture method are a method for fractionating specific cells contained in blood or body fluid, and a method for capturing the fractionated specific cells. Specific cells include cancer cells (arbitrary cancer cells including cancer cells that do not express EpCAM, peripheral blood stem cells) and the like. Examples of cancer cells include circulating tumor cells (CTC) in blood.

前記特定細胞の分画方法及び捕捉方法では、血液又は体液に、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いた遠心分離を施し、特定細胞が分画される。 In the method for fractionating and capturing specific cells, blood or body fluid is centrifuged by using a container having a low protein adsorption layer formed on at least a part of the inner surface, and the specific cells are fractionated.

低タンパク質吸着層は、タンパク質の吸着性が低い層であれば特に限定されず、例えば、低タンパク質吸着性ポリマーにより形成される層等が挙げられる。具体的には、アルカリ金属含有モノマー（分子中にアルカリ金属を含むモノマー）、双性イオン性モノマー（双性イオン性基含有化合物：永久陽電荷の中心及び陰電荷の中心を有する化合物）などの低タンパク質吸着性モノマーを重合して得られた低タンパク質吸着性ポリマーにより形成される低タンパク質吸着層等を好適に使用できる。これらのモノマーは、単独で用いても２種以上を併用してもよい。なお、モノマーがアルカリ金属含有モノマー、双性イオン性モノマーに同時に該当する場合、いずれのモノマーにも含まれる。 The low protein adsorption layer is not particularly limited as long as it is a layer having low protein adsorption, and examples thereof include a layer formed of a low protein adsorption polymer. Specifically, alkali metal-containing monomers (monomers containing an alkali metal in the molecule), zwitterionic monomers (zwitterionic group-containing compounds: compounds having a permanent positive charge center and a negative charge center), etc. A low protein adsorption layer formed by a low protein adsorptive polymer obtained by polymerizing a low protein adsorptive monomer can be preferably used. These monomers may be used alone or in combination of two or more. When the monomer corresponds to the alkali metal-containing monomer and the zwitterionic monomer at the same time, it is included in both of the monomers.

アルカリ金属含有モノマーとしては、アクリル酸アルカリ金属塩（アクリル酸ナトリウム、アクリル酸カリウムなど）；メタクリル酸アルカリ金属塩（メタクリル酸ナトリウム、メタクリル酸カリウムなど）；イタコン酸アルカリ金属塩（イタコン酸ナトリウム、イタコン酸カリウムなど）；３−ビニルプロピオン酸アルカリ金属塩（３−ビニルプロピオン酸ナトリウム、３−ビニルプロピオン酸カリウムなど）；ビニルスルホン酸アルカリ金属塩（ビニルスルホン酸ナトリウム、ビニルスルホン酸カリウムなど）；２−スルホエチル（メタ）アクリレートアルカリ金属塩（２−スルホエチル（メタ）アクリル酸ナトリウム、２−スルホエチル（メタ）アクリル酸カリウムなど）；３−スルホプロピル（メタ）アクリレートアルカリ金属塩（３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸ナトリウム、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸カリウムなど）；２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸アルカリ金属塩（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸カリウムなど）；スチレンスルホン酸アルカリ金属塩（スチレンスルホン酸ナトリウム、スチレンスルホン酸カリウムなど）；などが挙げられる。なかでも、３−スルホプロピルメタクリル酸カリウムが好ましい。 Alkali metal-containing monomers include alkali metal acrylate (sodium acrylate, potassium acrylate, etc.); alkali metal methacrylate (sodium methacrylate, potassium methacrylate, etc.); alkali metal itaconate (sodium itaconate, itacon). (Potassium acid acid, etc.); 3-vinylpropionic acid alkali metal salt (3-vinylpropionate sodium, 3-vinylpropionate potassium, etc.); Vinyl sulfonic acid alkali metal salt (sodium vinylsulfonic acid, potassium vinylsulfonate, etc.); 2 − Sulfonyl (meth) acrylate alkali metal salts (2-sulfoethyl (meth) sodium acrylate, 2-sulfoethyl (meth) potassium acrylate, etc.); 3-Sulfopropyl (meth) acrylate alkali metal salts (3-sulfopropyl (meth) ) Sodium acrylate, potassium 3-sulfopropyl (meth) acrylate, etc.); 2-acrylamide-2-methylpropansulfonic acid alkali metal salt (2-acrylamide-2-methylpropanesulfonate sodium, 2-acrylamide-2- (Potassium methylpropane sulfonate, etc.); Alkali metal salts of styrene sulfonic acid (sodium styrene sulfonate, potassium styrene sulfonate, etc.); Of these, 3-sulfopropyl potassium methacrylate is preferable.

双性イオン性モノマーとしては、カルボキシベタイン、スルホベタイン、ホスホベタインなどが挙げられる。また、下記式（１）で示される化合物も挙げられ、なかでも、下記式（２）で表される化合物が好適である。

（式中、Ｒ^１１は−Ｈ又は−ＣＨ_３、Ｘは−Ｏ−、ＮＨ−又はＮ^＋−、ｍは１以上の整数、Ｙは双性イオン性基又はハロゲン基（Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、Ｆ⁻など）を表す。） Examples of the zwitterionic monomer include carboxybetaine, sulfobetaine, and phosphobetaine. Moreover, the compound represented by the following formula (1) is also mentioned, and among them, the compound represented by the following formula (2) is preferable.

^{(Wherein, R 11} is -H or _-CH 3, X is -O-, NH- or ^N + -, m is an integer of 1 or more, Y is zwitterionic group and a halogen group ^(Cl -, Br ^- , F ^−, etc.)

式（１）において、Ｒ^１１は−ＣＨ_３、Ｘは−Ｏ−、ｍは１〜１０の整数が好ましい。Ｙで表される双性イオン性基において、カチオンとしては、テトラアルキルアンモニウムなどの第四級アンモニウム、アニオンとしては、カルボン酸、スルホン酸、ホスフェートなどが挙げられる。 In the formula (1), R ¹¹ is preferably an integer of −CH ₃ , X is preferably an −O−, and m is preferably an integer of 1 to 10. In the zwitterionic group represented by Y, examples of the cation include quaternary ammonium such as tetraalkylammonium, and examples of the anion include carboxylic acid, sulfonic acid and phosphate.

（式中、Ｒ^１１は−Ｈ又は−ＣＨ_３、ｐ及びｑは１以上の整数、Ｙ^１及びＹ^２は反対の電荷を有するイオン性官能基を表す。）

(In the formula, R ¹¹ represents -H or -CH ₃ , p and q are integers of 1 or more, and Y ¹ and Y ² represent ionic functional groups having opposite charges.)

式（２）において、ｐは２以上の整数が好ましく、２〜１０の整数がより好ましい。ｑは１〜１０の整数が好ましく、２〜４の整数がより好ましい。また、好ましいＲ^１１は前記と同様である。Ｙ^１及びＹ^２は、前記カチオン、アニオンと同様である。 In the formula (2), p is preferably an integer of 2 or more, and more preferably an integer of 2 to 10. q is preferably an integer of 1 to 10, and more preferably an integer of 2 to 4. Further, the preferred R ¹¹ is the same as described above. Y ¹ and Y ² are the same as the cations and anions.

前記双性イオン性モノマーの好適な代表例としては、下記式（２−１）〜（２−４）で表される化合物が挙げられる。

（式中、Ｒ^１１は水素原子又はメチル基、ｐ及びｑは１〜１０の整数を示す。） Preferable representative examples of the zwitterionic monomer include compounds represented by the following formulas (2-1) to (2-4).

(In the formula, R ¹¹ represents a hydrogen atom or a methyl group, and p and q represent integers of 1 to 10.)

（式中、Ｒ^１１は水素原子又はメチル基、ｐ及びｑは１〜１０の整数を示す。）

(In the formula, R ¹¹ represents a hydrogen atom or a methyl group, and p and q represent integers of 1 to 10.)

（式中、Ｒ^１１は水素原子又はメチル基、Ｒ^１２は炭素数１〜６の炭化水素基、ｐ及びｑは１〜１０の整数を示す。）

(In the formula, R ¹¹ is a hydrogen atom or a methyl group, R ¹² is a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and p and q are integers of 1 to 10.)

（式中、Ｒ^１１は水素原子又はメチル基、Ｒ^１３、Ｒ^１４及びＲ^１５は、同一若しくは異なって炭素数１又は２の炭化水素基、ｐ及びｑは１〜１０の整数を示す。）

(In the formula, R ¹¹ is a hydrogen atom or a methyl group, R ¹³ , R ¹⁴ and R ¹⁵ are the same or different hydrocarbon groups having 1 or 2 carbon atoms, and p and q are integers of 1 to 10.)

上記式（２−１）で表される化合物としては、ジメチル（３−スルホプロピル）（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アンモニウムベタインなど；式（２−２）で表される化合物としては、ジメチル（２−カルボキシエチル）（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アンモニウムベタインなど；式（２−３）で表される化合物としては、ジメチル（３−メトキシホスホプロピル）（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アンモニウムベタインなど；式（２−４）で表される化合物としては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンなど；が挙げられる。また、双性イオン性モノマーとしては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルカルボキシベタイン、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルスルホベタインなども挙げられる。なかでも、生体適合性が高い、タンパク吸着性が低いという観点から、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が好ましい。 Examples of the compound represented by the above formula (2-1) include dimethyl (3-sulfopropyl) (2- (meth) acryloyloxyethyl) ammonium betaine; and examples of the compound represented by the above formula (2-2) include Dimethyl (2-carboxyethyl) (2- (meth) acryloyloxyethyl) ammonium betaine, etc .; Examples of the compound represented by the formula (2-3) include dimethyl (3-methoxyphosphopropyl) (2- (meth) acryloyl). Oxyethyl) ammonium betaine and the like; examples of the compound represented by the formula (2-4) include 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine and the like. Examples of the zwitterionic monomer include 2- (meth) acryloyloxyethyl carboxybetaine and 2- (meth) acryloyloxyethyl sulfobetaine. Of these, 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) is preferable from the viewpoint of high biocompatibility and low protein adsorption.

低タンパク質吸着性ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、低タンパク質吸着性の観点から、好ましくは１００００〜２０００００、より好ましくは１００００〜１５００００である。なお、本明細書において、Ｍｎは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー（株）製ＧＰＣ−８０００シリーズ、検出器：示差屈折計、カラム：東ソー（株）製のＴＳＫＧＥＬ ＳＵＰＥＲＭＡＬＴＰＯＲＥ ＨＺ−Ｍ）による測定値を基に標準ポリスチレン換算により求めることができる。 The number average molecular weight (Mn) of the low protein adsorptive polymer is preferably 1000 to 20000, more preferably 1000 to 150,000 from the viewpoint of low protein adsorptiveness. In the present specification, Mn is gel permeation chromatography (GPC) (GPC-8000 series manufactured by Toso Co., Ltd., detector: differential refractometer, column: TSKGEL SUPERMALTPORE HZ-M manufactured by Toso Co., Ltd.). It can be obtained by standard polystyrene conversion based on the measured value according to.

前記遠心分離に使用される容器は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成されている。低タンパク質吸着層の膜厚は、好ましくは２０〜１００００ｎｍ、より好ましくは５０〜８００ｎｍ、更に好ましくは５０〜５００ｎｍである。上記範囲内に調整することで、良好なタンパク質に対する低吸着性が得られる。また、低タンパク質吸着層は内表面に多く形成されていることが好ましく、全内面に低タンパク質吸着層が形成されていることが好適である。 The container used for centrifugation has a low protein adsorption layer formed on at least a part of the inner surface. The film thickness of the low protein adsorption layer is preferably 20 to 10000 nm, more preferably 50 to 800 nm, and even more preferably 50 to 500 nm. By adjusting within the above range, low adsorption to good proteins can be obtained. Further, it is preferable that a large amount of the low protein adsorption layer is formed on the inner surface, and it is preferable that the low protein adsorption layer is formed on the entire inner surface.

低タンパク質吸着層は、例えば、（１）低タンパク質吸着性ポリマーを各種溶剤に溶解・分散した低タンパク質吸着性ポリマー溶液・分散液を、容器内部に注入し、所定時間保持、乾燥する方法、（２）該低タンパク質吸着性ポリマー溶液・分散液を容器内表面に塗工（噴霧）する方法、等、公知の手法により、容器内表面の全部又は一部に低タンパク質吸着性ポリマー溶液・分散液をコーティングすることで、低タンパク質吸着性ポリマーにより形成される低タンパク質吸着層が形成される。 The low protein adsorption layer is, for example, (1) a method of injecting a low protein adsorptive polymer solution / dispersion in which a low protein adsorptive polymer is dissolved / dispersed in various solvents into a container, holding the solution for a predetermined time, and drying the solution. 2) Low protein adsorptive polymer solution / dispersion on all or part of the inner surface of the container by a known method such as coating (spraying) the low protein adsorptive polymer solution / dispersion on the inner surface of the container. By coating the above, a low protein adsorption layer formed by the low protein adsorptive polymer is formed.

溶剤、注入方法、塗工（噴霧）方法などは、従来公知の材料及び方法を適用できる。
（１）、（２）の保持、乾燥時間は、容器の大きさ、導入する液種、等により適宜設定すれば良い。保持時間、乾燥温度及び時間は、適宜選択可能である。 Conventionally known materials and methods can be applied to the solvent, injection method, coating (spraying) method, and the like.
The holding and drying times of (1) and (2) may be appropriately set depending on the size of the container, the type of liquid to be introduced, and the like. The holding time, drying temperature and time can be appropriately selected.

溶剤としては、低タンパク質吸着性ポリマーの溶解が可能なものであれば特に限定されず、使用する親水性ポリマーに応じて適宜選択すれば良い。例えば、水、有機溶媒、これらの混合溶媒が挙げられ、有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、メトキシプロパノール等のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、トルエン等が列挙される。 The solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the low protein-adsorbing polymer, and may be appropriately selected depending on the hydrophilic polymer used. Examples thereof include water, an organic solvent, and a mixed solvent thereof. Examples of the organic solvent include alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, and methoxypropanol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; tetrahydrofuran and acetonitrile. , Ethyl acetate, toluene and the like are listed.

遠心分離に用いる容器（内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器）は、特定細胞の回収性の観点から、該容器の内表面の少なくとも一部の水の接触角が３０度以下であることが好ましく、より好ましくは２０度以下、更に好ましくは１０度以下である。
なお、水の接触角は、容器の内表面に蒸留水２μｌを滴下し、３０秒後の接触角をθ／２法（室温）で測定することで測定できる。 The container used for centrifugation (a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface) has a contact angle of at least a part of water on the inner surface of the container of 30 from the viewpoint of recoverability of specific cells. It is preferably less than or equal to 20 degrees, more preferably 20 degrees or less, and even more preferably 10 degrees or less.
The contact angle of water can be measured by dropping 2 μl of distilled water onto the inner surface of the container and measuring the contact angle after 30 seconds by the θ / 2 method (room temperature).

遠心分離は、公知の方法を採用でき、例えば、公知の遠心分離装置で実施できる。
遠心分離は、遠心力２００〜３０００Ｇ（×Ｇ）の条件下で実施することが好ましい。２００Ｇ以上であると、血球細胞の分離が良くなると同時に、特定細胞のロス（赤血球等と同じ分画に入るなどによるロス）が減るため、特定細胞の選択的な捕捉効果を奏する。一方、３０００Ｇ以下であると、特定細胞へのストレスが抑制され、本来の細胞の性質が維持される。より好ましくは３００〜２８００Ｇ、更に好ましくは４００〜２５００Ｇである。 Centrifugation can be carried out by a known method, for example, by a known centrifuge device.
Centrifugation is preferably carried out under the condition of centrifugal force of 200 to 3000 G (xG). When it is 200 G or more, the separation of blood cell cells is improved, and at the same time, the loss of specific cells (loss due to entering the same fraction as red blood cells and the like) is reduced, so that a selective capture effect of specific cells is exhibited. On the other hand, when it is 3000 G or less, stress on specific cells is suppressed and the original cell properties are maintained. It is more preferably 300 to 2800 G, still more preferably 400 to 2500 G.

遠心分離の時間、温度は、血球細胞の分離性等の観点から、適宜設定すれば良く、例えば、１〜１２０分（好ましくは１〜６０分）、２〜４０℃（好ましくは３〜３０℃）の条件で実施すれば良い。 The time and temperature of centrifugation may be appropriately set from the viewpoint of blood cell cell separability and the like. For example, 1 to 120 minutes (preferably 1 to 60 minutes) and 2 to 40 ° C. (preferably 3 to 30 ° C.). ) May be used.

遠心分離では、遠心分離時に分離液を用いて分画することが好ましい。これにより、特定細胞（がん細胞等）等を含む単核球層、赤血球等を含む層、等に好適に分画できる。 In centrifugation, it is preferable to fractionate using a separating solution at the time of centrifugation. This makes it possible to suitably fractionate a mononuclear cell layer containing specific cells (cancer cells, etc.), a layer containing red blood cells, and the like.

密度勾配遠心法に用いられる分離液は、血液中の細胞の分画に適した比重を有し、また細胞を破壊することのない浸透圧及びｐＨを有するよう調製したものであればよい。媒体としては、密度勾配遠心分離法に使用可能な媒体を使用できる。分離液は、２０℃での比重が１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬであることが好ましい。また、分離液のｐＨは、４．５〜７．５が好ましい。 The separation solution used in the density gradient centrifugation may be prepared so as to have a specific gravity suitable for fractionation of cells in blood and an osmotic pressure and pH that do not destroy cells. As the medium, a medium that can be used for the density gradient centrifugation method can be used. The separation liquid preferably has a specific gravity of 1.060 to 1.115 g / mL at 20 ° C. The pH of the separation liquid is preferably 4.5 to 7.5.

代表的な媒体（分離液）としては、スクロース、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンの共重合物）、パーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）が挙げられる。フィコールは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ファルマシアバイオテク（株））、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ アルドリッチ ジャパン（株））、リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（ニコメッド、オスロ（ノルウェー））等；パーコールは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（シグマ アルドリッチ ジャパン（株））等；の製品が市販されている。 Typical vehicles (separation liquids) include sucrose, Ficoll (a copolymer of sucrose and epichlorohydrin), and Percoll (a colloidal silica product having a polyvinylpyrrolidone coating). Ficoll is Filel-Paque PLUS (Pharmacia Biotech Co., Ltd.), Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.), Lymphoprep (Nikomed, Oslo (Norway)), etc .; Percoll is Percoll (Sigma-Aldrich). Products such as Japan Co., Ltd .; are commercially available.

分離液の密度（２０℃）は、特定細胞の回収性の観点から、１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬであることが好ましく、１．０６０〜１．０８５ｇ／ｍＬであることがより好ましい。 The density of the isolate (20 ° C.) is preferably 1.060 to 1.115 g / mL, more preferably 1.060 to 1.085 g / mL, from the viewpoint of recoverability of specific cells.

前記特定細胞の分画方法の好適な態様としては、（１）前記遠心分離により分画し、形成された分画層と、前記分画層の上層及び下層とを回収し、回収する前記上層及び前記下層の厚みが前記分画層の厚みの２．０倍以下である方法、（２）前記遠心分離により分画し、形成された分画線又は分画層と、前記分画線又は前記分画層の上層及び下層とを回収し、回収する前記上層及び前記下層の厚みが５．０ｍｍ以下である方法、等が挙げられる。 Preferable embodiments of the method for fractionating specific cells include (1) collecting the fractionated layer formed by fractionating by centrifugation and the upper and lower layers of the fractionated layer, and collecting the upper layer. And a method in which the thickness of the lower layer is 2.0 times or less the thickness of the fractionation layer, (2) the fractionation line or fractionation layer formed by fractionation by the centrifugation, and the fractionation line or Examples thereof include a method in which the upper layer and the lower layer of the fractionated layer are collected, and the thickness of the upper layer and the lower layer to be collected is 5.0 mm or less.

また前記特定細胞の捕捉方法としては、（３）前記遠心分離により分画し、形成された分画層と、前記分画層の上層及び下層とを回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、回収する前記上層及び前記下層の厚みが前記分画層の厚みの２．０倍以下である方法、（４）前記遠心分離により分画し、形成された分画線又は分画層と、前記分画線又は前記分画層の上層及び下層とを回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、回収する前記上層及び前記下層の厚みが５．０ｍｍ以下である方法、等が挙げられる。 Further, as a method for capturing the specific cells, (3) the fractionated layer formed by fractionating by the centrifugation and the upper and lower layers of the fractionated layer are recovered, and then in the obtained recovered liquid. A method in which the thickness of the upper layer and the lower layer to be collected by capturing the specific cells contained in the above layer in a hydrophilic polymer layer is 2.0 times or less the thickness of the fractionation layer, and (4) fractionation by the centrifugation. , The formed fraction line or fraction layer and the upper layer and the lower layer of the fraction line or the fraction layer are recovered, and then the specific cells contained in the obtained recovery liquid are put into a hydrophilic polymer layer. Examples thereof include a method in which the thickness of the upper layer and the lower layer to be captured and collected is 5.0 mm or less.

図１は、血液又は体液に遠心分離を施す前後を示す模式図の一例である。図１（ａ）は遠心分離前の模式図の一例であり、内表面に低タンパク質吸着層１８が形成された遠心容器（遠沈管）１１内に、分離液１２、試料（血液若しくは体液又はその希釈液）１３が入れられている。一方、図１（ａ）に遠心分離処理を施した後の状態を示す模式図の一例が図１（ｂ）である。図１（ｂ）は、内表面に低タンパク質吸着層１８が形成された遠心容器（遠沈管）１１内において、特定細胞を含む分画層又は分画線１４（単核球層）、分画層又は分画線１４上に上層１５（「上澄み（血小板を含む上澄み）」とも称する）、分画層又は分画線１４下に下層１６（「沈み（分離液を含む沈み）」とも称する）、下層１６下に赤血球を含む層１７、がそれぞれ分画されている状態を示している。 FIG. 1 is an example of a schematic diagram showing before and after centrifugation of blood or body fluid. FIG. 1A is an example of a schematic diagram before centrifugation, in which a separation liquid 12 and a sample (blood or body fluid or a sample thereof) are placed in a centrifuge container (centrifuge tube) 11 having a low protein adsorption layer 18 formed on the inner surface. Diluted liquid) 13 is contained. On the other hand, FIG. 1 (b) is an example of a schematic diagram showing a state after the centrifugation treatment is performed in FIG. 1 (a). FIG. 1B shows a fractionation layer containing specific cells or a fractionation line 14 (mononuclear sphere layer) in a centrifuge vessel (centrifuge tube) 11 in which a low protein adsorption layer 18 is formed on the inner surface. Upper layer 15 (also referred to as "supernatant (supernatant containing platelets)") above the layer or fractionation line 14 and lower layer 16 (also referred to as "sink (sink containing separation solution)" below the fractionation layer or fractionation line 14). , And the layer 17 containing red blood cells under the lower layer 16 are separated from each other.

前記（１）、（３）の態様では、遠心分離により図１（ｂ）のように分画した後、特定細胞を含む分画層又は分画線１４（単核球層）と、上層１５（上澄み）のうち、分画層又は分画線１４との界面から上層方向（図１（ｂ）の上側方向）に分画層１４の厚みｈの最大２．０倍までの厚さの部分（厚み２．０ｈ以下）と、下層１６（沈み）のうち、分画層又は分画線１４との界面から下層方向（図１（ｂ）の下側方向）に分画層１４の厚みｈの最大２．０倍までの厚さの部分（厚み２．０ｈ以下）とを回収する。 In the embodiments of (1) and (3) above, after fractionation as shown in FIG. 1 (b) by centrifugation, a fractionation layer or fractionation line 14 (mononuclear cell layer) containing specific cells and an upper layer 15 are provided. Of the (supernatant), a portion having a thickness of up to 2.0 times the thickness h of the fractionation layer 14 in the upper layer direction (upper direction in FIG. 1B) from the interface with the fractionation layer or the fractionation line 14. The thickness h of the fractionation layer 14 in the lower layer direction (lower direction of FIG. 1B) from the interface between the (thickness 2.0h or less) and the lower layer 16 (sinking) with the fractionation layer or the fractionation line 14. A portion having a thickness of up to 2.0 times (thickness of 2.0 h or less) is collected.

前記（２）、（４）の態様では、遠心分離により図１（ｂ）のように分画した後、特定細胞を含む分画層又は分画線１４（単核球層）と、上層１５（上澄み）のうち、分画層又は分画線１４との界面から上層方向（図１（ｂ）の上側方向）の最大５．０ｍｍまでの厚みの部分（厚み５．０ｍｍ以下）と、下層１６（沈み）のうち、分画層又は分画線１４との界面から下層方向（図１（ｂ）の下側方向）の最大５．０ｍｍまでの厚みの部分（厚み５．０ｍｍ以下）とを回収する。 In the embodiments of (2) and (4) above, after fractionation as shown in FIG. 1 (b) by centrifugation, a fractionation layer or fractionation line 14 (mononuclear cell layer) containing specific cells and an upper layer 15 are provided. Of the (supernatant), a portion (thickness 5.0 mm or less) having a maximum thickness of 5.0 mm in the upper layer direction (upper direction in FIG. 1B) from the interface with the fractionation layer or the fractionation line 14, and the lower layer. Of 16 (sinking), a portion (thickness 5.0 mm or less) having a maximum thickness of 5.0 mm in the lower layer direction (lower direction in FIG. 1B) from the interface with the fractionation layer or the fractionation line 14. To collect.

このような遠心分離による分画、前記回収により、遠心分離では完全には分画されない特定細胞についても、単核球層の上層及び下層の所定部分から回収され、特定細胞をロスなく回収できるようになる。従って、赤血球や血小板が分離、除去され、がん細胞等の特定細胞の濃度を高めた試料を作製できる。 By such fractionation by centrifugation and the above-mentioned recovery, even specific cells that are not completely fractionated by centrifugation can be recovered from predetermined parts of the upper and lower layers of the mononuclear bulb layer so that the specific cells can be recovered without loss. become. Therefore, it is possible to prepare a sample in which red blood cells and platelets are separated and removed to increase the concentration of specific cells such as cancer cells.

前記（１）、（３）の態様では、回収する上層（上澄み）及び下層（沈み）の厚みは、分画層の厚みの２．０倍以下であるが、特定細胞の捕捉性の観点から、好ましくは１．５倍以下、より好ましくは１．２倍以下である。下限は、特定細胞の回収性の観点から、０．１倍以上が好ましく、０．３倍以上がより好ましい。 In the aspects (1) and (3) above, the thickness of the upper layer (supernatant) and the lower layer (sinking) to be collected is 2.0 times or less the thickness of the fractionation layer, but from the viewpoint of capture of specific cells. It is preferably 1.5 times or less, more preferably 1.2 times or less. The lower limit is preferably 0.1 times or more, more preferably 0.3 times or more, from the viewpoint of recoverability of specific cells.

前記（２）、（４）の態様では、回収する上層（血小板を含む上澄み）及び下層（分離液を含む沈み）は５．０ｍｍ以下であるが、特定細胞の捕捉性の観点から、好ましくは３．０ｍｍ以下、より好ましくは２．０ｍｍ以下である。下限は、特定細胞の回収性の観点から、０．５ｍｍ以上が好ましく、１．０ｍｍ以上がより好ましい。 In the embodiments (2) and (4), the upper layer (supernatant containing platelets) and the lower layer (sinking containing the separating solution) to be collected are 5.0 mm or less, but are preferably 5.0 mm or less from the viewpoint of capture of specific cells. It is 3.0 mm or less, more preferably 2.0 mm or less. The lower limit is preferably 0.5 mm or more, more preferably 1.0 mm or more, from the viewpoint of recoverability of specific cells.

前記特定細胞の分画方法は、回収する分画中の赤血球をより少なくする点から、血液又は体液中に溶血剤を混合（添加）させた後、遠心分離を施すことが好ましい。溶血剤は、物理的又は化学的に赤血球に作用し、赤血球を溶解する試薬である。溶血剤としては、従来使用されているものを使用でき、例えば、塩化アンモニウム、合成界面活性剤及びアルコールが挙げられる。 In the method for fractionating specific cells, it is preferable to mix (add) a hemolytic agent in blood or body fluid and then perform centrifugation from the viewpoint of reducing the number of red blood cells in the fraction to be collected. Hemolytic agents are reagents that physically or chemically act on red blood cells to dissolve them. As the hemolytic agent, conventionally used ones can be used, and examples thereof include ammonium chloride, synthetic surfactants, and alcohols.

前記特定細胞の分画方法は、血液又は体液中の血球細胞同士を凝集させた後、遠心分離を施すこと、すなわち、遠心分離前に、先ず血液又は体液中の血球細胞同士を凝集させることが好ましい。血球細胞同士を凝集させる方法は、このような凝集が可能な方法であれば、特に限定されないが、なかでも、抗原抗体反応を利用する方法を好適に使用できる。具体的には、血球凝集反応等の凝集反応法を好適に利用できる。 The method for fractionating specific cells is to aggregate blood cells in blood or body fluid and then perform centrifugation, that is, to first aggregate blood cells in blood or body fluid before centrifugation. preferable. The method for agglutinating blood cell cells is not particularly limited as long as it is a method capable of such agglutination, but among them, a method utilizing an antigen-antibody reaction can be preferably used. Specifically, an agglutination reaction method such as a blood cell agglutination reaction can be preferably used.

このような凝集工程で、血液又は体液に血球凝集反応を利用して細胞同士を凝集させると、その後、作製された凝集物を含むサンプルに遠心分離処理を施した際に、血球細胞を含む凝集物が除去される。従って、親水性ポリマー層に対し、サンプル中に高濃度で残存する特定細胞（がん細胞等）を効果的に捕捉できる。 In such an agglutination step, cells are agglutinated by using a blood cell agglutination reaction in blood or body fluid, and then when the prepared sample containing the agglutination is subjected to a centrifugation treatment, the agglutination containing blood cells is performed. The thing is removed. Therefore, the hydrophilic polymer layer can effectively capture specific cells (cancer cells, etc.) remaining at a high concentration in the sample.

血球細胞同士の凝集には、例えば、赤血球及び白血球凝集抗体試薬（赤血球及び白血球凝集抗体組成物）を好適に使用できる。遠心分離処理時に、比重ががん細胞等の特定細胞に近い一部の白血球の分離が悪くなるが、上記抗体組成物を用いて抗原抗体反応を利用し、赤血球と白血球を結合・凝集させると、特定細胞と比重の異なる赤血球、血小板等だけでなく、白血球と特定細胞の分離も良好になり、特定細胞の接着・捕捉性を向上できる。 For aggregation of blood cell cells, for example, an erythrocyte and leukocyte agglutination antibody reagent (erythrocyte and leukocyte agglutination antibody composition) can be preferably used. During centrifugation, the separation of some leukocytes whose specific gravity is close to that of specific cells such as cancer cells deteriorates. However, when the above antibody composition is used and an antigen-antibody reaction is used to bind and aggregate erythrocytes and leukocytes. , Not only red blood cells, platelets, etc., which have different specific gravity from specific cells, but also leukocytes and specific cells can be separated well, and the adhesion / capture property of specific cells can be improved.

なお、前記血球細胞同士の凝集前に、血液又は体液を希釈し、次いで、遠心分離を施してもよい。希釈方法としては、ヒト血液のｐＨ（約７．４）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝溶液や、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）等の液体培地、を用いる方法があり、具体的には、採取した血液又は体液に緩衝溶液を加えて希釈することや、液体培地に採取した血液又は体液を加えて希釈することができる。希釈により、採取した血液又は体液に比べて、たんぱく質濃度を減少させることができる。 Before agglutination of the blood cell cells, blood or body fluid may be diluted and then centrifuged. As a dilution method, there is a method of using a buffer solution such as pH (about 7.4) phosphate buffered physiological saline (PBS) of human blood or a liquid medium such as DMEM (Dalveco's modified Eagle's medium). Can be diluted by adding a buffer solution to the collected blood or body fluid, or by adding the collected blood or body fluid to a liquid medium. Dilution can reduce protein concentrations compared to collected blood or body fluids.

また、前記血球細胞同士の凝集後に、血液又は体液を希釈し、次いで、遠心分離を施してもよい。希釈方法は同様の方法を採用できる。 Further, after the agglutination of the blood cell cells, the blood or body fluid may be diluted and then centrifuged. A similar dilution method can be adopted.

前記特定細胞の捕捉方法では、既述の特定細胞の分画方法で分画した回収液（分画液）に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉させる。 In the method for capturing specific cells, the hydrophilic polymer layer captures the specific cells contained in the recovery solution (fractionation solution) fractionated by the method for fractionating specific cells described above.

親水性ポリマー層（親水性ポリマーにより形成される層）は、所定の基材に形成できる。
基材としては、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等のアクリル樹脂（ポリアクリル樹脂）、シクロオレフィン樹脂（ポリシクロオレフィン）、カーボネート樹脂（ポリカーボネート）、スチレン樹脂（ポリスチレン）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂、ポリジメチルシロキサン、ソーダ石灰ガラス、ほうケイ酸ガラス等のガラス、等が挙げられる。なかでも、親水性ポリマーのコーティングには、構成材料の親水性が高い方が好ましく、ポリアクリル樹脂やソーダ石灰ガラスが好ましい。 The hydrophilic polymer layer (layer formed by the hydrophilic polymer) can be formed on a predetermined base material.
As the base material, acrylic resin (polyacrylic resin) such as methyl polyacrylate, polymethyl methacrylate, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, cycloolefin resin (polycycloolefin), carbonate resin (polycarbonate), styrene resin ( Polypoly), polyester resin such as polyethylene terephthalate (PET), glass such as polydimethylsiloxane, soda lime glass, and borosilicate glass, and the like. Among them, for the coating of the hydrophilic polymer, it is preferable that the constituent material has high hydrophilicity, and a polyacrylic resin or soda-lime glass is preferable.

親水性ポリマー層（親水性ポリマーにより形成される層）の膜厚は、好ましくは１０〜８００ｎｍ、より好ましくは３０〜５５０ｎｍ、更に好ましくは５０〜４００ｎｍである。上記範囲内に調整することで、良好なタンパク質や細胞に対する低吸着性、がん細胞に対する選択的捕捉性が得られる。 The film thickness of the hydrophilic polymer layer (layer formed by the hydrophilic polymer) is preferably 10 to 800 nm, more preferably 30 to 550 nm, and even more preferably 50 to 400 nm. By adjusting within the above range, good protein and low adsorption to cells and selective capture to cancer cells can be obtained.

親水性ポリマーは、親水性を有するものを適宜選択できる。例えば、１種又は２種以上の親水性モノマーの単独重合体及び共重合体、１種又は２種以上の親水性モノマーと他のモノマーとの共重合体等が挙げられる。前記単独重合体、共重合体としては、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリロイルモルホリン、ポリメタクリロイルモルホリン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等が挙げられる。 As the hydrophilic polymer, a hydrophilic polymer can be appropriately selected. For example, homopolymers and copolymers of one or more kinds of hydrophilic monomers and copolymers of one or more kinds of hydrophilic monomers and other monomers can be mentioned. Examples of the homopolymer and copolymer include polyacrylic acid, polyacrylic acid ester, polymethacrylic acid, polymethacrylic acid ester, polyacryloylmorpholine, polymethacryloylmorpholine, polyacrylamide, and polymethacrylamide.

前記共重合体における親水性モノマーは、親水性基を有する各種モノマーを使用できる。親水性基は、例えば、アミド基、硫酸基、スルホン酸基、カルボン酸基、水酸基、アミノ基、アミド基、オキシエチレン基等、公知の親水性基が挙げられる。 As the hydrophilic monomer in the copolymer, various monomers having a hydrophilic group can be used. Examples of the hydrophilic group include known hydrophilic groups such as an amide group, a sulfate group, a sulfonic acid group, a carboxylic acid group, a hydroxyl group, an amino group, an amide group and an oxyethylene group.

親水性モノマーの具体例としては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メトキシエチル（メタ）アクリレート等のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート）、（メタ）アクリルアミド、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（（メタ）アクリロイルモルホリン等）、などが挙げられる。なかでも、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルモルホリンが好ましく、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートがより好ましく、２−メトキシエチルアクリレートが特に好ましい。 Specific examples of the hydrophilic monomer include (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid ester, alkoxyalkyl (meth) acrylate such as (methoxyethyl (meth) acrylate), and hydroxyalkyl (meth) such as hydroxyethyl (meth) acrylate. ) Acrylate), (meth) acrylamide, (meth) acrylamide derivative having a cyclic group ((meth) acryloylmorpholin, etc.), and the like. Of these, (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid ester, alkoxyalkyl (meth) acrylate, and (meth) acryloyl morpholine are preferable, alkoxyalkyl (meth) acrylate is more preferable, and 2-methoxyethyl acrylate is particularly preferable.

前記共重合体における他のモノマーは、親水性ポリマーの作用効果を阻害しない範囲内で適宜選択すれば良い。例えば、スチレン等の芳香族モノマー、酢酸ビニル、温度応答性を付与できるＮ−イソプロピルアクリルアミドなどが挙げられる。 Other monomers in the copolymer may be appropriately selected within a range that does not interfere with the action and effect of the hydrophilic polymer. For example, aromatic monomers such as styrene, vinyl acetate, N-isopropylacrylamide that can impart temperature responsiveness, and the like can be mentioned.

なかでも、親水性ポリマーとしては、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。

（式中、Ｒ^１は水素原子又はメチル基、Ｒ^２はアルキル基を表す。ｐは１〜８、ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。） Among them, as the hydrophilic polymer, at least one selected from the group consisting of the polymer represented by the following formula (I) and poly (meth) acryloyl morpholine is preferable.

(In the formula, R ¹ represents a hydrogen atom or a methyl group, R ² represents an alkyl group. P represents 1 to 8, m represents 1 to 5, and n represents the number of repetitions.)

前記式（Ｉ）で表されるポリマーとして、例えば、下記式（Ｉ−１）で表されるポリマーを好適に使用できる。

（式中、Ｒ^１は水素原子又はメチル基、Ｒ^２はアルキル基を表す。ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。） As the polymer represented by the formula (I), for example, the polymer represented by the following formula (I-1) can be preferably used.

(In the formula, R ¹ represents a hydrogen atom or a methyl group, R ² represents an alkyl group. M represents 1 to 5, and n represents the number of repetitions.)

Ｒ^２のアルキル基の炭素数は、１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。なかでも、Ｒ^２は、メチル基又はエチル基が特に好ましい。ｐは、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。ｍは、１〜３が好ましい。ｎ（繰り返し単位数）は、１５〜１５００が好ましく、４０〜１２００がより好ましい。 The carbon number of the alkyl group of R ² is 1 to 10 preferably 1 to 5 is more preferable. Of these, R ² is particularly preferably a methyl group or an ethyl group. p is preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3. m is preferably 1 to 3. n (number of repeating units) is preferably 15 to 1500, more preferably 40 to 1200.

また、親水性ポリマーとして、下記式（ＩＩ）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体も好適に使用できる。 Further, as the hydrophilic polymer, a copolymer of at least one hydrophilic monomer selected from the group consisting of the compound represented by the following formula (II) and (meth) acryloyl morpholine and another monomer is also preferable. Can be used.

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、ｐ、ｍは前記と同様。）

(In the formula, R ¹ , R ² , p, m are the same as above.)

前記式（ＩＩ）で表される化合物としては、例えば、下記式（ＩＩ−１）で表される化合物を好適に使用できる。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、ｍは前記と同様。） As the compound represented by the formula (II), for example, a compound represented by the following formula (II-1) can be preferably used.

(In the formula, R ¹ , R ² , and m are the same as above.)

親水性ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、がん細胞に対する選択的吸着性・接着性の観点から、好ましくは８０００〜１５００００、より好ましくは１００００〜６００００、更に好ましくは１２０００〜５００００である。なお、本明細書において、Ｍｎは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー（株）製ＧＰＣ−８０００シリーズ、検出器：示差屈折計、カラム：東ソー（株）製のＴＳＫＧＥＬ ＳＵＰＥＲＭＡＬＴＰＯＲＥ ＨＺ−Ｍ）による測定値を基に標準ポリスチレン換算により求めることができる。 The number average molecular weight (Mn) of the hydrophilic polymer is preferably 8000 to 150,000, more preferably 1000 to 60000, and further preferably 12000 to 50000 from the viewpoint of selective adsorptivity and adhesiveness to cancer cells. In the present specification, Mn is gel permeation chromatography (GPC) (GPC-8000 series manufactured by Toso Co., Ltd., detector: differential refractometer, column: TSKGEL SUPERMALTPORE HZ-M manufactured by Toso Co., Ltd.). It can be obtained by standard polystyrene conversion based on the measured value according to.

親水性ポリマー層の表面の少なくとも一部（一部又は全部）は、水の接触角が３０〜７５度であることが好ましく、３５〜７５度であることがより好ましく、３５〜７０度であることが更に好ましい。所定の水の接触角を有する場合、本発明の効果が良好に得られる。 At least a part (part or all) of the surface of the hydrophilic polymer layer has a water contact angle of preferably 30 to 75 degrees, more preferably 35 to 75 degrees, and 35 to 70 degrees. Is even more preferable. When it has a predetermined water contact angle, the effect of the present invention can be obtained satisfactorily.

親水性ポリマー層は、（１）親水性ポリマーを各種溶剤に溶解・分散した親水性ポリマー溶液・分散液を、基材表面（基材凹部）に注入し、所定時間保持、乾燥する方法、（２）該親水性ポリマー溶液・分散液を基材表面に塗工（噴霧）する方法、等、公知の手法により、基材表面の全部又は一部に親水性ポリマー溶液・分散液をコーティングすることで、親水性ポリマーにより形成されるポリマー層が形成された基材を製造できる。そして、親水性ポリマー層が形成された基材に、必要に応じて他の部品を追加することで、特定細胞の捕捉が可能な装置を製造できる。 The hydrophilic polymer layer is composed of (1) a method of injecting a hydrophilic polymer solution / dispersion in which a hydrophilic polymer is dissolved / dispersed in various solvents into a base material surface (base material recess), and holding and drying for a predetermined time. 2) Coating all or part of the surface of the base material with the hydrophilic polymer solution / dispersion by a known method such as a method of applying (spraying) the hydrophilic polymer solution / dispersion onto the surface of the base material. Therefore, a base material on which a polymer layer formed of a hydrophilic polymer is formed can be produced. Then, by adding other parts to the base material on which the hydrophilic polymer layer is formed as needed, it is possible to manufacture an apparatus capable of capturing specific cells.

溶剤、注入方法、塗工（噴霧）方法などは、従来公知の材料及び方法を適用できる。
（１）、（２）の保持、乾燥時間は、基材の大きさ、導入する液種、等により適宜設定すれば良い。保持時間は、５分〜１０時間が好ましく、１０分〜５時間がより好ましく、１５分〜２時間が更に好ましい。乾燥は、室温（約２３℃）から８０℃で行うことが好ましく、室温から５０℃で行うことがより好ましい。また、減圧して乾燥しても良い。更に、保持して一定時間後、適宜、余分な親水性ポリマー溶液・分散液を排出し、乾燥してもよい。 Conventionally known materials and methods can be applied to the solvent, injection method, coating (spraying) method, and the like.
The holding and drying times of (1) and (2) may be appropriately set depending on the size of the base material, the type of liquid to be introduced, and the like. The holding time is preferably 5 minutes to 10 hours, more preferably 10 minutes to 5 hours, and even more preferably 15 minutes to 2 hours. Drying is preferably carried out at room temperature (about 23 ° C.) to 80 ° C., and more preferably at room temperature to 50 ° C. Further, it may be dried under reduced pressure. Further, after holding for a certain period of time, the excess hydrophilic polymer solution / dispersion may be discharged and dried as appropriate.

溶剤としては、親水性ポリマーの溶解が可能なものであれば特に限定されず、使用する親水性ポリマーに応じて適宜選択すれば良い。例えば、水、有機溶媒、これらの混合溶媒が挙げられ、有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、メトキシプロパノール等のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、トルエン等が列挙される。 The solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the hydrophilic polymer, and may be appropriately selected depending on the hydrophilic polymer used. Examples thereof include water, an organic solvent, and a mixed solvent thereof. Examples of the organic solvent include alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, and methoxypropanol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; tetrahydrofuran and acetonitrile. , Ethyl acetate, toluene and the like are listed.

親水性ポリマー層表面にフィブロネクチンが吸着されていることが好ましい。
該親水性ポリマー層の表面に更にフィブロネクチンが吸着させているため、これに前記回収液（分画液）を接触させることで、がん細胞等の特定細胞が親水性ポリマー層に、より多く吸着・接着される。 It is preferable that fibronectin is adsorbed on the surface of the hydrophilic polymer layer.
Since fibronectin is further adsorbed on the surface of the hydrophilic polymer layer, by contacting the recovery liquid (fractionation liquid) with the fibronectin, specific cells such as cancer cells are more adsorbed on the hydrophilic polymer layer.・ It is glued.

親水性ポリマー層にフィブロネクチンを吸着させる方法は特に限定されず、公知の方法を適用できる。例えば、親水性ポリマー層にフィブロネクチンの緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ等）を公知の方法で接触させ、所定温度で所定時間放置し、必要に応じて洗浄する方法、等で吸着させることができる。温度、時間は適宜設定すればよく、例えば、１０〜６０℃、０．１〜２４時間程度で実施できる。 The method for adsorbing fibronectin on the hydrophilic polymer layer is not particularly limited, and a known method can be applied. For example, a buffer solution of fibronectin (phosphate buffered saline PBS, etc.) is brought into contact with the hydrophilic polymer layer by a known method, left at a predetermined temperature for a predetermined time, and adsorbed by a method of washing if necessary. Can be done. The temperature and time may be appropriately set, and for example, the temperature and time can be set at 10 to 60 ° C. for 0.1 to 24 hours.

親水性ポリマー層上にフィブロネクチンを吸着させるという点から、フィブロネクチン濃度を、好ましくは０．５〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜２５０μｇ／ｍｌに調整した溶液、分散液等を用いることが好適である。上記範囲内の濃度に調整することで、がん細胞等の特定細胞について優れた捕捉性が得られる。 From the viewpoint of adsorbing fibronectin on the hydrophilic polymer layer, it is preferable to use a solution, dispersion, or the like whose fibronectin concentration is preferably adjusted to 0.5 to 500 μg / ml, more preferably 1 to 250 μg / ml. is there. By adjusting the concentration within the above range, excellent capture property for specific cells such as cancer cells can be obtained.

前記特定細胞の捕捉方法では、血液又は体液に遠心分離処理を施し、分画して得られた試料（回収液、血球細胞濃度が低下した試料）を、親水性ポリマー層が形成された基材に接触させることで、試料中の特定細胞を捕捉できる。試料と親水性ポリマー層の接触方法は特に限定されず、接触可能な任意の手法を採用でき、例えば、試料の注入、塗工（噴霧）等が挙げられる。 In the method for capturing specific cells, a substrate on which a hydrophilic polymer layer is formed is obtained by centrifuging blood or body fluid and fractionating a sample (collected solution, sample having decreased blood cell concentration). By contacting with, specific cells in the sample can be captured. The method of contacting the sample with the hydrophilic polymer layer is not particularly limited, and any method capable of contacting the sample can be adopted, and examples thereof include injection and coating (spraying) of the sample.

試料と親水性ポリマー層とを接触させることで、試料に含まれる特定細胞が親水性ポリマー層に捕捉されると共に、血球細胞等の吸着が抑制される。そのため、例えば、試料を接触させた後に所定時間保持し、次いで、洗浄することで、特定細胞を選択的に親水性ポリマー層に捕捉できる。そして、捕捉された特定細胞の数を測定することで、採取した血液又は体液中の特定細胞数が判り、がん治療効果の確認等が期待される。 By bringing the sample into contact with the hydrophilic polymer layer, the specific cells contained in the sample are captured by the hydrophilic polymer layer, and the adsorption of blood cell cells and the like is suppressed. Therefore, for example, the specific cells can be selectively captured in the hydrophilic polymer layer by holding the sample for a predetermined time after contacting the sample and then washing the sample. Then, by measuring the number of captured specific cells, the number of specific cells in the collected blood or body fluid can be known, and it is expected that the cancer therapeutic effect will be confirmed.

前記特定細胞捕捉方法は、例えば、基材として、シングルウェル（シャーレ）、マルチウェルプレート、スライドチャンバー等を用い、必要に応じて他の部品を追加した装置を使用して実施できる。図２は、マルチウェルプレート２の一例を示している。 The specific cell capture method can be carried out, for example, by using a single well (Petri dish), a multi-well plate, a slide chamber or the like as a base material, and using an apparatus in which other parts are added as necessary. FIG. 2 shows an example of the multi-well plate 2.

図２（ａ）（ｂ）のマルチウェルプレート２は、特定細胞を捕捉する目的で使用される器具で、いわゆるマトリクス状にウェル２１が配置されたマルチウェルプレート２である。マルチウェルプレート２は、円形に開口された複数のウェル２１を有している。ウェル２１は、採取した血液又は体液に遠心分離処理を施して分画することで得られた赤血球、白血球、血小板等の濃度を減少させた試料を注入する凹部であり、注入した試料を検査に供することにより、採取した血液又は体液をそのまま検査に供するケースに比べ、特定細胞を効果的に捕捉できる。従って、血液又は体液中の特定細胞の有無の確認、特定細胞数の計測、特定細胞の培養、薬の効き目の確認・選定を実施できる。 The multi-well plate 2 of FIGS. 2 (a) and 2 (b) is an instrument used for the purpose of capturing specific cells, and is a multi-well plate 2 in which wells 21 are arranged in a so-called matrix. The multi-well plate 2 has a plurality of wells 21 opened in a circular shape. The well 21 is a recess for injecting a sample having a reduced concentration of red blood cells, white blood cells, platelets, etc. obtained by centrifuging the collected blood or body fluid and fractionating the collected blood or body fluid, and the injected sample is used for inspection. By providing the blood or body fluid, specific cells can be effectively captured as compared with the case where the collected blood or body fluid is directly used for the test. Therefore, it is possible to confirm the presence or absence of specific cells in blood or body fluid, measure the number of specific cells, culture specific cells, and confirm and select the efficacy of a drug.

図２では、一例として、４行６列の２４個のウェル２１を有する２４ウェルプレートを示しているが、マルチウェルプレート２は、ウェル２１を少なくとも２つ以上有していれば良く、ウェル２１の個数は任意である。２４ウェルプレートの他には、ウェル２１が、６個、９６個、３８４個等の汎用マルチウェルプレートでも良い。 FIG. 2 shows, as an example, a 24-well plate having 24 wells 21 in 4 rows and 6 columns, but the multi-well plate 2 may have at least two wells 21 and is well 21. The number of is arbitrary. In addition to the 24-well plate, a general-purpose multi-well plate having 6, 96, 384 wells 21 may be used.

ウェル２１は非貫通孔であり、マルチウェルプレート２の表面に開口されている。ウェル２１には、開口から、血液又は体液に遠心分離処理を施し、分画して得られた試料が注入される。また、特定細胞の存在を確認した場合、特定細胞を培養するための培養液を注入することも可能である。 The well 21 is a non-through hole and is opened on the surface of the multi-well plate 2. A sample obtained by centrifuging blood or body fluid and fractionating the well 21 is injected through the opening. When the presence of specific cells is confirmed, it is also possible to inject a culture solution for culturing the specific cells.

ウェル２１の開口の直径Ｒ、深さＤは、特に限定されず、通常のマルチウェルプレート２のＲ、Ｄを採用できる。図２では、マルチウェルプレート２の表面及び裏面に対して、ウェル２１の内側面が略垂直であるが、ウェル２１は、内側面が傾斜し、開口から底面にかけて窄まる形状でも良い。また、内側面が傾斜し、開口から底面にかけて拡がる形状でも良い。 The diameter R and depth D of the opening of the well 21 are not particularly limited, and R and D of the ordinary multi-well plate 2 can be adopted. In FIG. 2, the inner surface of the well 21 is substantially perpendicular to the front surface and the back surface of the multi-well plate 2, but the well 21 may have a shape in which the inner surface is inclined and narrows from the opening to the bottom surface. Further, the shape may be such that the inner side surface is inclined and extends from the opening to the bottom surface.

図２では、ウェル２１は円形に開口しているが、ウェル２１の開口形状は任意であり、四角形等、任意の形状に開口したものでもよい。 In FIG. 2, the well 21 is opened in a circular shape, but the opening shape of the well 21 is arbitrary, and may be an arbitrary shape such as a quadrangle.

マルチウェルプレート２は、複数のウェル２１が分離可能なものも使用できる。複数のウェルを有する場合、特定細胞数計測用ウェルと、特定細胞培養用ウェルとに分離使用でき、例えば、計測用ウェルで特定細胞の存在の有無を確認した上で、存在が確認された場合に培養用ウェルで特定細胞を培養し、その細胞で薬の効き目を確認できる。なお、スライドチャンバーは、チャンバーが１個以上１０個以下のものが好適である。 As the multi-well plate 2, a plate in which a plurality of wells 21 can be separated can also be used. When there are a plurality of wells, the wells for measuring the number of specific cells and the wells for culturing specific cells can be used separately. For example, when the presence or absence of specific cells is confirmed in the measurement wells, the presence is confirmed. Specific cells can be cultured in the culture well, and the efficacy of the drug can be confirmed in the cells. The slide chamber preferably has 1 or more and 10 or less chambers.

シングルウェル（シャーレ）、マルチウェルプレート２及びスライドチャンバーにおいて、ウェル２１の内側面は、少なくとも一部に親水性ポリマー層が形成されていることが好ましい。図２（ｂ）は、ウェルの底面及び側面の一部に親水性ポリマー層２２が形成されている例を示している。 In a single well (Petri dish), a multi-well plate 2 and a slide chamber, it is preferable that a hydrophilic polymer layer is formed at least partially on the inner surface of the well 21. FIG. 2B shows an example in which the hydrophilic polymer layer 22 is formed on a part of the bottom surface and the side surface of the well.

ウェル及びチャンバーの構成材料としては、細胞の観察では透明性が高いものがよく、例えば、前述の基材の材料を使用できる。 As the constituent material of the well and the chamber, a material having high transparency in cell observation is preferable, and for example, the above-mentioned base material material can be used.

親水性ポリマー層２２が形成されたウェル２１内に、血液又は体液に遠心分離処理を施して分画し、得られた試料（回収液または回収物を液体培地などに懸濁させた懸濁液）を導入すると、これらに含まれる特定細胞が親水性ポリマー層２２に捕捉されると共に、血球細胞等の吸着が抑制される。そのため、試料の導入後に所定時間保持し、次いで、洗浄することで、特定細胞を選択的に親水性ポリマー層２２に捕捉できる。 In the well 21 on which the hydrophilic polymer layer 22 is formed, blood or body fluid is centrifuged to fractionate, and the obtained sample (recovered liquid or recovered product is suspended in a liquid medium or the like) is suspended. ) Is introduced, the specific cells contained therein are captured by the hydrophilic polymer layer 22, and the adsorption of blood cell cells and the like is suppressed. Therefore, specific cells can be selectively captured in the hydrophilic polymer layer 22 by holding the sample for a predetermined time after introduction and then washing.

前記特定細胞の捕捉方法を用いることで、例えば、特定細胞（ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞も含む多くのがん細胞等）を捕捉できる。また、血液又は体液中から特定細胞を充分に捕捉できると共に、他のタンパク質や細胞の粘着・接着を抑制できるので、特定細胞の選択的な捕捉が可能となる。 By using the specific cell capture method, for example, specific cells (many cancer cells including cancer cells that do not express EpCAM) can be captured. In addition, specific cells can be sufficiently captured from blood or body fluid, and adhesion / adhesion of other proteins and cells can be suppressed, so that specific cells can be selectively captured.

前記特定細胞の捕捉方法において、前記親水性ポリマー層に、予め、血球細胞等を除去した試料（回収液または回収物を液体培地などに懸濁させた懸濁液）を接触させることが好適である。これにより、がん細胞等の特定細胞の選択的捕捉性をより高めることができる。血球細胞等の除去方法としては、前述の遠心分離の他に、膜分離法等、公知の方法も採用できる。 In the method for capturing specific cells, it is preferable to contact the hydrophilic polymer layer with a sample from which blood cells and the like have been removed in advance (a recovered solution or a suspension in which a recovered product is suspended in a liquid medium or the like). is there. This makes it possible to further enhance the selective capture of specific cells such as cancer cells. As a method for removing blood cells and the like, a known method such as a membrane separation method can be adopted in addition to the above-mentioned centrifugation.

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on Examples, but the present invention is not limited to these.

以下の特定細胞の分画方法及び特定細胞の捕捉方法を実施した。なお、実施例ａ及び比較例ａ（特定細胞の分画方法）の結果を表１、実施例Ａ〜Ｃ及び比較例Ａ（特定細胞の捕捉方法）の結果を表２、実施例１〜４及び比較例１−１〜１−３、２〜５（特定細胞の分画方法及び特定細胞の捕捉方法）の結果を表３に示した。 The following specific cell fractionation method and specific cell capture method were carried out. The results of Examples a and Comparative Example a (method for fractionating specific cells) are shown in Table 1, and the results of Examples A to C and Comparative Example A (method for capturing specific cells) are shown in Table 2, Examples 1 to 4. Table 3 shows the results of Comparative Examples 1-1 to 1-3 and 2 to 5 (method for fractionating specific cells and method for capturing specific cells).

〔特定細胞の分画方法〕
（実施例ａ）
染色をしたヒト結腸癌由来上皮細胞（ＨＴ−２９）を全血に５０００００個／血液１ｍＬになる様に懸濁させた（スパイク血）。これに等量のリン酸バッファー溶液を入れて希釈した（希釈スパイク血）。次に、たんぱく質をほとんど吸着しないポリマーであるポリＭＰＣ（ＭＰＣとメタクリル酸ブチル共重合体）でコーティングした１５ｍＬの遠心分離管に、分離液（ＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐ：密度１．０７７±０．００１ｇ／ｍＬ）を入れて、その上に上記希釈スパイク血を入れて、８００Ｇ２０分（室温：約２３℃）の条件で遠心分離を行った。そして、単核球層（分画層、分画線）を分画（回収）した。尚、血液、溶液を計量・排出・注入時に使うピペットチップは、内面をたんぱく質をほとんど吸着しないポリマーである前記ポリＭＰＣでコーティングしたものを使用した。この分画（回収）した溶液中のＨＴ−２９細胞数を血球計算盤でカウントして、回収溶液中の細胞数を計算し、仕込み細胞数との比率を計算して細胞回収率（％）を算出した。 [Method for fractionating specific cells]
(Example a)
Stained human colon cancer-derived epithelial cells (HT-29) were suspended in whole blood to a concentration of 500,000 cells / 1 mL of blood (spiked blood). An equal amount of phosphate buffer solution was added thereto and diluted (diluted spike blood). Next, a separation solution (LymphoPrep: density 1.077 ± 0.001 g / mL) was placed in a 15 mL centrifuge tube coated with poly MPC (MPC and butyl methacrylate copolymer), which is a polymer that hardly adsorbs proteins. The diluted spike blood was put therein, and centrifugation was performed under the condition of 800 G for 20 minutes (room temperature: about 23 ° C.). Then, the mononuclear cell layer (fraction layer, fraction line) was fractionated (recovered). The pipette tip used for measuring, discharging, and injecting blood and solution was a pipette tip whose inner surface was coated with the poly MPC, which is a polymer that hardly adsorbs proteins. The number of HT-29 cells in this fractionated (recovered) solution is counted by a hemocytometer, the number of cells in the recovered solution is calculated, and the ratio to the number of charged cells is calculated to obtain the cell recovery rate (%). Was calculated.

（比較例ａ）
実施例ａで分画時にポリＭＰＣをコーティングしていない遠心管及びピペットチップを使用したこと以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Comparative example a)
The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner as in Example a except that a centrifuge tube and a pipette tip not coated with poly MPC were used at the time of fractionation.

（実施例１）
染色をしたヒト結腸癌由来上皮細胞（ＨＴ−２９）を全血に１００００個／血液１ｍＬになる様に懸濁させた（スパイク血）。これに等量のリン酸バッファー溶液を入れて希釈した（希釈スパイク血）。次に、たんぱく質をほとんど吸着しないポリマーであるポリＭＰＣ（ＭＰＣとメタクリル酸ブチル共重合体）でコーティングした１５ｍＬの遠心分離管に、分離液（ＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐ：密度１．０７７±０．００１ｇ／ｍＬ）を入れて、その上に上記希釈スパイク血を入れて、８００Ｇ２０分（室温：約２３℃）の条件で遠心分離を行った。そして、単核球層（分画層、分画線）と、単核球層の厚みの２．０倍分の厚みの単核球層の直上の上澄み（上層）と、単核球層の厚みの２．０倍分の厚みの単核球層の直下の沈み（下層）とを分画（回収）した。尚、血液、溶液を計量・排出・注入時に使うピペットチップは、内面をたんぱく質をほとんど吸着しないポリマーである前記ポリＭＰＣでコーティングしたものを使用した。この分画（回収）した溶液中のＨＴ−２９細胞数を血球計算盤でカウントして、回収溶液中の細胞数を計算し、仕込み細胞数との比率を計算して細胞回収率（％）を算出した。 (Example 1)
Stained human colon cancer-derived epithelial cells (HT-29) were suspended in whole blood to a concentration of 10000 cells / 1 mL of blood (spiked blood). An equal amount of phosphate buffer solution was added thereto and diluted (diluted spike blood). Next, a separation solution (LymphoPrep: density 1.077 ± 0.001 g / mL) was placed in a 15 mL centrifuge tube coated with poly MPC (MPC and butyl methacrylate copolymer), which is a polymer that hardly adsorbs proteins. The diluted spike blood was put therein, and centrifugation was performed under the condition of 800 G for 20 minutes (room temperature: about 23 ° C.). Then, the mononuclear cell layer (fraction layer, fraction line), the supernatant (upper layer) directly above the mononuclear cell layer having a thickness of 2.0 times the thickness of the mononuclear cell layer, and the mononuclear cell layer. The subsidence (lower layer) directly below the mononuclear bulb layer having a thickness of 2.0 times the thickness was fractionated (recovered). The pipette tip used for measuring, discharging, and injecting blood and solution was a pipette tip whose inner surface was coated with the poly MPC, which is a polymer that hardly adsorbs proteins. The number of HT-29 cells in this fractionated (recovered) solution is counted by a hemocytometer, the number of cells in the recovered solution is calculated, and the ratio to the number of charged cells is calculated to obtain the cell recovery rate (%). Was calculated.

（比較例１−１）
実施例１で分画時にポリＭＰＣをコーティングしていない遠心管及びピペットチップを使用したこと以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Comparative Example 1-1)
The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that a centrifuge tube and a pipette tip not coated with poly MPC were used at the time of fractionation.

（比較例１−２）
比較例１−１で分画の仕方を、単核球層だけを分画した以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Comparative Example 1-2)
The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner as in Comparative Example 1-1 except that only the mononuclear cell layer was fractionated.

（比較例１−３）
比較例１−１で分画の仕方を、単核球層と単核球層の厚みの４．０倍分の厚みの単核球層の直上の上澄み（上層：厚み８．０ｍｍ）と単核球層の厚みの４．０倍分の厚みの単核球層の直下の沈み（下層：厚み８．０ｍｍ）を分画した以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Comparative Example 1-3)
In Comparative Example 1-1, the method of fractionation is as follows: the supernatant directly above the mononuclear cell layer and the mononuclear cell layer having a thickness of 4.0 times the thickness of the mononuclear cell layer (upper layer: thickness 8.0 mm). The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner except that the subsidence (lower layer: thickness 8.0 mm) directly below the mononuclear cell layer having a thickness of 4.0 times the thickness of the nuclear cell layer was fractionated.

（実施例２）
実施例１で分画の仕方を、単核球層と単核球層の厚みの１．０倍分の厚みの単核球層の直上の上澄み（上層）と単核球層の厚みの１．０倍分の厚みの単核球層の直下の沈み（下層）を分画した以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Example 2)
In Example 1, the method of fractionation is as follows: 1 of the thickness of the supernatant (upper layer) directly above the mononuclear cell layer and the thickness of the mononuclear cell layer, which is 1.0 times the thickness of the mononuclear cell layer and the mononuclear cell layer. The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner except that the subsidence (lower layer) directly below the mononuclear bulb layer having a thickness of 0.0 times was fractionated.

（比較例２）
実施例２で分画時にポリＭＰＣをコーティングしていない遠心管及びピペットチップを使用したこと以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Comparative Example 2)
The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner as in Example 2 except that a centrifuge tube and a pipette tip not coated with poly MPC were used at the time of fractionation.

（実施例３）
実施例１で分画の仕方を、単核球層と単核球層の直上の５．０ｍｍの上澄み（上層）と単核球層の直下の５．０ｍｍの沈み（下層）を分画した以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Example 3)
In Example 1, the method of fractionation was divided into a mononuclear cell layer, a 5.0 mm supernatant (upper layer) directly above the mononuclear cell layer, and a 5.0 mm sink (lower layer) directly below the mononuclear cell layer. The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner except for the above.

（比較例３）
実施例３で分画時にポリＭＰＣをコーティングしていない遠心管及びピペットチップを使用したこと以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Comparative Example 3)
The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner as in Example 3 except that a centrifuge tube and a pipette tip not coated with poly MPC were used at the time of fractionation.

（実施例４）
実施例１で、作成したスパイク血に、スパイク血量の１／２０の量の赤血球・白血球凝集抗体試薬であるＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 社製）を、加えて、室温で２０分放置して、凝集させた。これに等量のリン酸バッファー溶液を入れて希釈した（希釈スパイク血）以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Example 4)
To the spiked blood prepared in Example 1, 1/20 of the amount of spiked blood was added with Rosette Sep Human CD45 Depletion Cocktail (manufactured by STEM CELL Technologies) for 20 minutes at room temperature. It was left to agglomerate. The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner except that an equal amount of phosphate buffer solution was added thereto and diluted (diluted spike blood).

（比較例４）
実施例４で分画時にポリＭＰＣをコーティングしていない遠心管及びピペットチップを使用したこと以外は同様にして、細胞回収率（％）を算出した。 (Comparative Example 4)
The cell recovery rate (%) was calculated in the same manner as in Example 4 except that a centrifuge tube and a pipette tip not coated with poly MPC were used at the time of fractionation.

〔特定細胞の捕捉方法〕
（実施例Ａ）
ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を用いて、２−メトキシエチルアクリレートを８０℃で６時間熱重合し、ポリ２−メトキシエチルアクリレートを作製した（分子量Ｍｎ：約１５０００、Ｍｗ：約５００００）。そして、得られたポリ２−メトキシエチルアクリレートの０．２５％メタノール溶液を作製した。
ガラス製のスライドチャンバーに、作製したポリ２−メトキシエチルアクリレート溶液（０．２５質量％）を注入し、乾燥することで、親水性ポリマー層を作製した。
更に、ポリ２−メトキシエチルアクリレートがコーティングされた部分（親水性ポリマー層）にフィブロネクチンを吸着させた。具体的にはフィブロネクチンのＰＢＳ溶液（リン酸緩衝生理食塩水）２００μｇ／ｍｌを作製し、注入し、４０℃１時間放置した後、ＰＢＳ溶液で洗浄することで医療用検査装器具を製造した。
染色をしたヒト結腸癌由来上皮細胞（ＨＴ−２９）を全血に１００個／血液１ｍＬになる様に懸濁させた（スパイク血）。これに等量のリン酸バッファー溶液を入れて希釈した（希釈スパイク血）。次に、たんぱく質をほとんど吸着しないポリマーであるポリＭＰＣ（ＭＰＣとメタクリル酸ブチル共重合体）でコーティングした１５ｍＬの遠心分離管に、分離液（ＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐ：密度１．０７７±０．００１ｇ／ｍＬ）を入れて、その上に上記希釈スパイク血を入れて、８００Ｇ２０分（室温：約２３℃）の条件で遠心分離を行った。そして、単核球層（分画層、分画線）を分画（回収）した。尚、血液、溶液を計量・排出・注入時に使うピペットチップは、内面をたんぱく質をほとんど吸着しないポリマーである前記ポリＭＰＣでコーティングしたものを使用した。この分画（回収）した回収溶液に、リン酸バッファー（ＰＢＳ）溶液を添加して、遠心分離を再度行い、濃縮を行った。遠心分離後の最下層にできた塊をＦＢＳ（ウシ胎児血清）１０％添加液体培地（最初の全血量と同じ液量）で懸濁させた。この懸濁液を用いて、チャンバーに１ｍｌ注入し、３７℃で１時間接着させた。その後、ＰＢＳ溶液で未接着の細胞を洗浄した。また、溶液を遠心分離・計量・排出・注入時に使う遠心管及びピペットチップは、内面をたんぱく質をほとんど吸着しないポリマーであるポリＭＰＣでコーティングしたものを使用した。次いで、蛍光顕微鏡で接着したがん細胞数をカウントした。接着した細胞数と仕込み細胞数との比率を計算して、細胞捕捉率（％）を算出した。 [Method of capturing specific cells]
(Example A)
Using AIBN (azobisisobutyronitrile), 2-methoxyethyl acrylate was thermally polymerized at 80 ° C. for 6 hours to prepare poly2-methoxyethyl acrylate (molecular weight Mn: about 15,000, Mw: about 50,000). Then, a 0.25% methanol solution of the obtained poly2-methoxyethyl acrylate was prepared.
A hydrophilic polymer layer was prepared by injecting the prepared poly2-methoxyethyl acrylate solution (0.25% by mass) into a glass slide chamber and drying the solution.
Further, fibronectin was adsorbed on the portion coated with poly2-methoxyethyl acrylate (hydrophilic polymer layer). Specifically, a PBS solution (phosphate buffered saline) of fibronectin (200 μg / ml) was prepared, injected, left at 40 ° C. for 1 hour, and then washed with the PBS solution to manufacture a medical inspection device.
Stained human colon cancer-derived epithelial cells (HT-29) were suspended in whole blood so as to be 100 cells / 1 mL of blood (spiked blood). An equal amount of phosphate buffer solution was added thereto and diluted (diluted spike blood). Next, a separation solution (LymphoPrep: density 1.077 ± 0.001 g / mL) was placed in a 15 mL centrifuge tube coated with poly MPC (MPC and butyl methacrylate copolymer), which is a polymer that hardly adsorbs proteins. The diluted spike blood was put therein, and centrifugation was performed under the condition of 800 G for 20 minutes (room temperature: about 23 ° C.). Then, the mononuclear cell layer (fraction layer, fraction line) was fractionated (recovered). The pipette tip used for measuring, discharging, and injecting blood and solution was a pipette tip whose inner surface was coated with the poly MPC, which is a polymer that hardly adsorbs proteins. A phosphate buffer (PBS) solution was added to the fractionated (recovered) recovered solution, and centrifugation was performed again to concentrate. The mass formed in the lowermost layer after centrifugation was suspended in a liquid medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) (the same volume as the initial whole blood volume). Using this suspension, 1 ml was injected into the chamber and adhered at 37 ° C. for 1 hour. The unadhered cells were then washed with PBS solution. The centrifuge tube and pipette tip used for centrifuging, weighing, discharging, and injecting the solution used a poly MPC coating on the inner surface, which is a polymer that hardly adsorbs proteins. Then, the number of cancer cells adhered with a fluorescence microscope was counted. The cell capture rate (%) was calculated by calculating the ratio between the number of adhered cells and the number of charged cells.

（実施例Ｂ）
前記ガラス製のスライドチャンバーに、作製したポリ２−メトキシエチルアクリレート溶液（０．２５質量％）を注入し、乾燥することで、親水性ポリマー層を作製し、フィブロネクチンの吸着を行わなかったことに変更した以外は実施例Ａと同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Example B)
The prepared poly2-methoxyethyl acrylate solution (0.25% by mass) was injected into the glass slide chamber and dried to prepare a hydrophilic polymer layer, and fibronectin was not adsorbed. The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example A except that it was changed.

（実施例Ｃ）
前記ガラス製のスライドチャンバーに、作製したポリ２−メトキシエチルアクリレート溶液（０．３５質量％）を注入することに変更した以外は実施例Ａと同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Example C)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example A except that the prepared poly2-methoxyethyl acrylate solution (0.35% by mass) was injected into the glass slide chamber. ..

（比較例Ａ）
前記特定細胞の分画方法の比較例ａで分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例Ａと同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Comparative Example A)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example A except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Comparative Example a of the method for fractionating specific cells.

（実施例１）
ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を用いて、２−メトキシエチルアクリレートを８０℃で６時間熱重合し、ポリ２−メトキシエチルアクリレートを作製した（分子量Ｍｎ：約１５０００、Ｍｗ：約５００００）。そして、得られたポリ２−メトキシエチルアクリレートの０．２５％メタノール溶液を作製した。
ガラス製のスライドチャンバーに、作製したポリ２−メトキシエチルアクリレート溶液（０．２５質量％）を注入し、乾燥することで、医療用検査装器具を製造した。
前記特定細胞の分画方法の実施例１で分画・分離した回収溶液に、リン酸バッファー（ＰＢＳ）溶液を添加して、遠心分離を再度行い、濃縮を行った。遠心分離後の最下層にできた塊をＦＢＳ（ウシ胎児血清）１０％添加液体培地（最初の全血量と同じ液量）で懸濁させた。この懸濁液を用いて、チャンバーに１ｍｌ注入し、３７℃で１時間接着させた。その後、ＰＢＳ溶液で未接着の細胞を洗浄した。次いで、蛍光顕微鏡で接着したがん細胞数をカウントした。接着した細胞数と仕込み細胞数との比率を計算して、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Example 1)
Using AIBN (azobisisobutyronitrile), 2-methoxyethyl acrylate was thermally polymerized at 80 ° C. for 6 hours to prepare poly2-methoxyethyl acrylate (molecular weight Mn: about 15,000, Mw: about 50,000). Then, a 0.25% methanol solution of the obtained poly2-methoxyethyl acrylate was prepared.
A medical inspection device was manufactured by injecting the prepared poly2-methoxyethyl acrylate solution (0.25% by mass) into a glass slide chamber and drying the solution.
A phosphate buffer (PBS) solution was added to the recovered solution fractionated and separated in Example 1 of the method for fractionating specific cells, and centrifugation was performed again to concentrate. The mass formed in the lowermost layer after centrifugation was suspended in a liquid medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) (the same volume as the initial whole blood volume). Using this suspension, 1 ml was injected into the chamber and adhered at 37 ° C. for 1 hour. The unadhered cells were then washed with PBS solution. Then, the number of cancer cells adhered with a fluorescence microscope was counted. The cell capture rate (%) was calculated by calculating the ratio between the number of adhered cells and the number of charged cells.

（比較例１−１）
前記特定細胞の分画方法の比較例１−１で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Comparative Example 1-1)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Comparative Example 1-1 of the method for fractionating specific cells.

（比較例１−２）
前記特定細胞の分画方法の比較例１−２で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Comparative Example 1-2)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Comparative Example 1-2 of the method for fractionating specific cells.

（比較例１−３）
前記特定細胞の分画方法の比較例１−３で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Comparative Example 1-3)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Comparative Example 1-3 of the method for fractionating specific cells.

（実施例２）
前記特定細胞の分画方法の実施例２で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Example 2)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Example 2 of the method for fractionating specific cells.

（比較例２）
前記特定細胞の分画方法の比較例２で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Comparative Example 2)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Comparative Example 2 of the method for fractionating specific cells.

（実施例３）
前記特定細胞の分画方法の実施例３で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Example 3)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Example 3 of the method for fractionating specific cells.

（比較例３）
前記特定細胞の分画方法の比較例３で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Comparative Example 3)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Comparative Example 3 of the method for fractionating specific cells.

（実施例４）
前記特定細胞の分画方法の実施例４で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Example 4)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Example 4 of the method for fractionating specific cells.

（比較例４）
前記特定細胞の分画方法の比較例４で分画・分離した回収溶液に変更した以外は実施例１と同様にして、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Comparative Example 4)
The cell capture rate (%) was calculated in the same manner as in Example 1 except that the recovery solution was changed to the fractionated / separated recovery solution in Comparative Example 4 of the method for fractionating specific cells.

（比較例５）
前記特定細胞の分画方法の比較例１−２と同様にして分画・分離した回収溶液に、リン酸バッファー（ＰＢＳ）溶液を添加して、遠心分離を再度行い、濃縮を行った。遠心分離後の最下層にできた塊をＦＢＳ（ウシ胎児血清）１０％添加液体培地（最初の全血量と同じ液量）で懸濁させた。この懸濁液を用いて、ポリ２−メトキシエチルアクリレートでコーティングしていないガラス製のスライドチャンバーに１ｍｌ注入し、３７℃で１時間接着させた。その後、ＰＢＳ溶液で未接着の細胞を洗浄した。次いで、蛍光顕微鏡で接着したがん細胞数をカウントした。接着した細胞数と仕込み細胞数との比率を計算して、細胞捕捉率（％）を算出した。 (Comparative Example 5)
A phosphate buffer (PBS) solution was added to the recovered solution fractionated and separated in the same manner as in Comparative Example 1-2 of the method for fractionating specific cells, and centrifugation was performed again to concentrate. The mass formed in the lowermost layer after centrifugation was suspended in a liquid medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) (the same volume as the initial whole blood volume). Using this suspension, 1 ml was poured into a glass slide chamber uncoated with poly2-methoxyethyl acrylate and adhered at 37 ° C. for 1 hour. The unadhered cells were then washed with PBS solution. Then, the number of cancer cells adhered with a fluorescence microscope was counted. The cell capture rate (%) was calculated by calculating the ratio between the number of adhered cells and the number of charged cells.

〔親水性ポリマー層（コーティング層）の膜厚〕
医療用検査器具の親水性ポリマー層の膜厚は、親水性ポリマー層の断面を、ＴＥＭを使用し、加速電圧１５ｋＶ、１００００倍で測定（撮影）した。 [Film thickness of hydrophilic polymer layer (coating layer)]
The film thickness of the hydrophilic polymer layer of the medical inspection instrument was measured (photographed) by measuring the cross section of the hydrophilic polymer layer using a TEM at an acceleration voltage of 15 kV and 10000 times.

〔水の接触角〕
医療用検査器具の親水性ポリマー層の表面に蒸留水２μｌを滴下し、３０秒後の接触角をθ／２法（室温）で測定した。
なお、実施例４で使用した遠心分離管を切り出して、内表面の接触角を測定した結果、接触角は１８．３度であった。 [Water contact angle]
2 μl of distilled water was dropped on the surface of the hydrophilic polymer layer of the medical examination instrument, and the contact angle after 30 seconds was measured by the θ / 2 method (room temperature).
As a result of cutting out the centrifuge tube used in Example 4 and measuring the contact angle of the inner surface, the contact angle was 18.3 degrees.

血液又は体液に内表面に低タンパク質吸着層を形成した容器を用いた遠心分離処理を施し、試料を分画・分離することで、細胞回収率が高くなった。 The cell recovery rate was increased by performing centrifugation treatment using a container in which a low protein adsorption layer was formed on the inner surface of blood or body fluid, and fractionating and separating the sample.

また、分画した回収液を用いて、親水性ポリマー層（コーティング層）に接触させることで、がん細胞等の特定細胞が選択的に捕捉され、特定細胞の細胞捕捉率が増加した。 In addition, by contacting the hydrophilic polymer layer (coating layer) with the fractionated recovery solution, specific cells such as cancer cells were selectively captured, and the cell capture rate of the specific cells increased.

１１ 遠心容器
１２ 分離液
１３ 試料
１４ 分画層又は分画線
１５ 分画層又は分画線の上層（上澄み）
１６ 分画層又は分画線の下層（沈み）
１７ 赤血球を含む層
１８ 低タンパク質吸着層
２ マルチウェルプレート
２１ ウェル
２２ 親水性ポリマー層 11 Centrifugal container 12 Separation liquid 13 Sample 14 Fractional layer or fractionation line 15 Fractional layer or upper layer of fractionation line (supernatant)
16 Fractional layer or lower layer of fractionation line (sinking)
17 Layer containing red blood cells 18 Low protein adsorption layer 2 Multi-well plate 21 Well 22 Hydrophilic polymer layer

Claims (25)

血液又は体液中に含まれる特定細胞の分画方法であって、
前記血液又は前記体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、
前記遠心分離は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて行われ、
前記低タンパク質吸着層は、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸ブチルとの共重合体により形成され、
前記特定細胞は、がん細胞である特定細胞の分画方法。 A method for fractionating specific cells contained in blood or body fluid.
The blood or the body fluid is fractionated by centrifugation to collect specific cells contained in the blood or the body fluid.
The centrifugation is performed using a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface.
The low protein adsorption layer is formed by a copolymer of 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine and butyl methacrylate.
The specific cell is a method for fractionating a specific cell which is a cancer cell. 前記遠心分離により分画し、形成された分画層と、前記分画層の直上の上層及び前記分画層の直下の下層とを回収し、
回収する前記上層及び前記下層のそれぞれの厚みが、前記分画層の厚みの２．０倍以下である請求項１記載の特定細胞の分画方法。 The fractionated layer formed by fractionation by the centrifugation, the upper layer directly above the fractionated layer, and the lower layer immediately below the fractionated layer were collected.
The method for fractionating specific cells according to claim 1, wherein the thickness of each of the upper layer and the lower layer to be collected is 2.0 times or less the thickness of the fractionation layer. 前記遠心分離により分画し、形成された分画線又は分画層と、前記分画線又は前記分画層の直上の上層及び前記分画線又は前記分画層の直下の下層とを回収し、
回収する前記上層及び前記下層のそれぞれの厚みが、５．０ｍｍ以下である請求項１記載の特定細胞の分画方法。 The fractionation line or fractionation layer formed by fractionation by the centrifugation, the upper layer directly above the fractionation line or the fractionation layer, and the lower layer immediately below the fractionation line or the fractionation layer are collected. And
The method for fractionating specific cells according to claim 1, wherein the thickness of each of the upper layer and the lower layer to be collected is 5.0 mm or less. 前記遠心分離時に分離液を用いて分画する請求項１〜３のいずれかに記載の特定細胞の分画方法。 The method for fractionating specific cells according to any one of claims 1 to 3, wherein the separation solution is used for fractionation at the time of centrifugation. 前記分離液の密度が１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬである請求項４記載の特定細胞の分画方法。 The method for fractionating specific cells according to claim 4, wherein the density of the separated solution is 1.060 to 1.115 g / mL. 前記分離液の密度が１．０６０〜１．０８５ｇ／ｍＬである請求項４記載の特定細胞の分画方法。 The method for fractionating specific cells according to claim 4, wherein the density of the separated solution is 1.060 to 1.085 g / mL. 前記容器は、内表面の少なくとも一部の水の接触角が３０度以下である請求項１〜６のいずれかに記載の特定細胞の分画方法。 The method for fractionating specific cells according to any one of claims 1 to 6, wherein the container has a contact angle of at least a part of water on the inner surface of 30 degrees or less. 前記血液又は前記体液に溶血剤を混合させた後、前記遠心分離を施す請求項１〜７のいずれかに記載の特定細胞の分画方法。 The method for fractionating specific cells according to any one of claims 1 to 7, wherein the hemolytic agent is mixed with the blood or the body fluid, and then the centrifugation is performed. 前記血液又は前記体液中の血球細胞同士を凝集させた後、前記遠心分離を施す請求項１〜８のいずれかに記載の特定細胞の分画方法。 The method for fractionating specific cells according to any one of claims 1 to 8, wherein the blood cells in the blood or body fluid are aggregated and then centrifuged. 血液又は体液中に含まれる特定細胞の捕捉方法であって、
前記血液又は前記体液を遠心分離により分画して前記血液又は前記体液中に含まれる特定細胞を回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、
前記遠心分離は、内表面の少なくとも一部に低タンパク質吸着層が形成された容器を用いて行われ、
前記低タンパク質吸着層は、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸ブチルとの共重合体により形成され、
前記特定細胞は、がん細胞である特定細胞の捕捉方法。 A method for capturing specific cells contained in blood or body fluid.
The blood or body fluid is fractionated by centrifugation to collect specific cells contained in the blood or body fluid, and then the specific cells contained in the obtained collected liquid are captured in a hydrophilic polymer layer.
The centrifugation is performed using a container in which a low protein adsorption layer is formed on at least a part of the inner surface.
The low protein adsorption layer is formed by a copolymer of 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine and butyl methacrylate.
The specific cell is a method for capturing a specific cell which is a cancer cell. 前記遠心分離により分画し、形成された分画層と、前記分画層の直上の上層及び前記分画層の直下の下層とを回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、
回収する前記上層及び前記下層のそれぞれの厚みが、前記分画層の厚みの２．０倍以下である請求項１０記載の特定細胞の捕捉方法。 The fractionated layer formed by fractionation by centrifugation, the upper layer directly above the fractionated layer, and the lower layer immediately below the fractionated layer are recovered, and then specified contained in the obtained recovered liquid. Capturing cells in a hydrophilic polymer layer,
The method for capturing specific cells according to claim 10, wherein the thickness of each of the upper layer and the lower layer to be collected is 2.0 times or less the thickness of the fractionation layer. 前記遠心分離により分画し、形成された分画線又は分画層と、前記分画線又は前記分画層の直上の上層及び前記分画線又は前記分画層の直下の下層とを回収し、次いで、得られた回収液中に含まれる特定細胞を親水性ポリマー層に捕捉し、
回収する前記上層及び前記下層のそれぞれの厚みが、５．０ｍｍ以下である請求項１０記載の特定細胞の捕捉方法。 The fractionation line or the fractionation layer formed by fractionation by the centrifugation, the upper layer directly above the fractionation line or the fractionation layer, and the lower layer immediately below the fractionation line or the fractionation layer are collected. Then, the specific cells contained in the obtained recovery liquid were captured in the hydrophilic polymer layer, and the cells were captured.
The method for capturing specific cells according to claim 10, wherein the thickness of each of the upper layer and the lower layer to be collected is 5.0 mm or less. 前記遠心分離時に分離液を用いて分画する請求項１０〜１２のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 10 to 12, wherein the separation solution is used for fractionation at the time of centrifugation. 前記分離液の密度が１．０６０〜１．１１５ｇ／ｍＬである請求項１３記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to claim 13, wherein the separation solution has a density of 1.060 to 1.115 g / mL. 前記分離液の密度が１．０６０〜１．０８５ｇ／ｍＬである請求項１３記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to claim 13, wherein the separation solution has a density of 1.060 to 1.085 g / mL. 前記容器は、内表面の少なくとも一部の水の接触角が３０度以下である請求項１０〜１５のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 10 to 15, wherein the container has a contact angle of at least a part of water on the inner surface of 30 degrees or less. 前記血液又は前記体液中に溶血剤を混合させた後、前記遠心分離を施す請求項１０〜１６のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 10 to 16, wherein the hemolytic agent is mixed in the blood or the body fluid, and then the centrifugation is performed. 前記血液又は前記体液中の血球細胞同士を凝集させた後、前記遠心分離を施す請求項１０〜１７のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 10 to 17, wherein blood cell cells in the blood or body fluid are aggregated and then centrifuged. 前記血液又は前記体液を希釈した後、前記血液又は前記体液中の血球細胞同士を凝集させ、次いで、前記遠心分離を施す請求項１０〜１８のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 10 to 18, wherein after diluting the blood or the body fluid, blood cell cells in the blood or the body fluid are aggregated and then centrifuged. 前記血液又は前記体液中の血球細胞同士を凝集させた後、希釈し、次いで、遠心分離を施す請求項１０〜１８のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 10 to 18, wherein blood cell cells in the blood or body fluid are aggregated, diluted, and then centrifuged. 前記血球細胞同士を凝集させる方法が抗原抗体反応を用いる方法である請求項１８〜２０のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 18 to 20, wherein the method for agglutinating blood cell cells is a method using an antigen-antibody reaction. 前記親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性ポリマーで形成されている請求項１０〜２１のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。

（式中、Ｒ^１は水素原子又はメチル基、Ｒ^２はアルキル基を表す。ｐは１〜８、ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。） Any of claims 10 to 21, wherein the hydrophilic polymer layer is formed of at least one hydrophilic polymer selected from the group consisting of a polymer represented by the following formula (I) and poly (meth) acryloyl morpholine. The method for capturing specific cells described in C.

(In the formula, R ¹ represents a hydrogen atom or a methyl group, R ² represents an alkyl group. P represents 1 to 8, m represents 1 to 5, and n represents the number of repetitions.) 前記親水性ポリマー層は、下記式（ＩＩ）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体で形成されている請求項１０〜２１のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。

（式中、Ｒ^１ は水素原子又はメチル基、Ｒ^２ はアルキル基を表す。ｐは１〜８、ｍは１〜５を表す。） The hydrophilic polymer layer is formed of a copolymer of at least one hydrophilic monomer selected from the group consisting of a compound represented by the following formula (II) and (meth) acryloyl morpholine and another monomer. The method for capturing a specific cell according to any one of claims 10 to 21.

(In the formula, R ¹ represents a hydrogen atom or a methyl group , R ² represents an alkyl group. P represents 1 to 8 and m represents 1 to 5. ) 前記親水性ポリマー層の厚みが１０〜８００ｎｍである請求項１０〜２３のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 10 to 23, wherein the hydrophilic polymer layer has a thickness of 10 to 800 nm. 前記親水性ポリマー層表面にフィブロネクチンが吸着されている請求項１０〜２４のいずれかに記載の特定細胞の捕捉方法。 The method for capturing specific cells according to any one of claims 10 to 24, wherein fibronectin is adsorbed on the surface of the hydrophilic polymer layer.

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