JP6894993B2 - 血漿タンパク質にコンジュゲートしたヘパリンを含む治療用apac分子 - Google Patents
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Description
本発明は、抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方の活性を有する抗血栓性分子;医薬としてのその使用;抗凝固剤および血小板阻害剤としてのその選択的構造および使用、または主に、抗凝固剤もしくは血小板阻害剤のいずれかとしてのその選択的構造および使用、ならびにその製造方法に関する。本発明は、医療産業および動物医療産業の両方で使用される。
循環血液が液体からゲル様マトリックスへと変わる凝固の生理的プロセスは、複雑であり、順次進行する多様な生化学反応を伴う。
凝血の生理的プロセスは、血小板の、血管損傷による特異的活性化、付着、および凝集により一次血栓またはシールを生じること、続いて、フィブリンの沈着および成熟により安定した血餅を生じることを伴う。前者の血小板活性は血小板阻害剤により阻害され、後者のフィブリンの沈着は抗凝固剤により阻害されうる。
凝血プロセスは、血管への傷害により血管の内皮および/または深層が損傷してほぼ直ちに開始する。血液が内皮の内側の空間へ曝されることにより2つのプロセスが始まる:血小板の変化、および他の凝固因子の中でもトロンビン生成およびフィブリン形成に際立って寄与する血漿凝固因子VIIへの内皮下組織因子の曝露。
内皮が損傷を受けると、下に存在するコラーゲンが循環血小板に曝され、循環血小板は、コラーゲン特異的糖タンパク質表面受容体を介してコラーゲンに直接結合する。間接的に、ヴォンヴィレブランド因子は、血小板をコラーゲンと密接に繋ぎ、また血小板をコラーゲンと架橋させる。血小板が細胞外マトリックスに局在化することにより、血小板インテグリンの活性化をもたらし、傷害部位への血小板のさらなる付着を引き起こすシグナル伝達カスケードを誘発する血小板糖タンパク質VIとコラーゲンの相互作用が促進される。この結果、傷害部位に即座に血小板によって血栓が形成される。これは、一次止血と称される。
二次止血も同時に起こり、いわゆる「凝固カスケード」を伴う。因子VIIの他に、さらなる凝固因子または凝血因子が複雑なカスケードで反応し、フィブリノーゲンの酵素切断をもたらし、フィブリン鎖を形成して血小板血栓を補強する。凝固カスケードは、プロテアーゼが切断し、続いて、次のプロテアーゼとして作用する酵素前駆体を順に活性化する一連のステップからなる。これらの反応の結果として、可溶性タンパク質であるフィブリノーゲンが、活性化された血小板表面において不溶性のフィブリンの糸に変換される。血小板を結びつけるのと一緒に、フィブリンの糸は安定な血餅を形成する。重要なヴォンヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンは、血小板と、さらに血漿によってもたらされる。
凝固カスケードは、古典的に(いくぶん人為的に)3つの経路に分けられ;第1に組織因子、第2に接触活性化経路、これらは両方、フィブリン形成に導く因子Xおよびトロンビンの第3の「最終共通経路」を活性化する。組織因子経路の主要な役割は、そのフィードバック活性化の役割という点で凝固カスケードの最も重要な構成要素であるトロンビンが瞬時に形成されるプロセスである、「トロンビンバースト」を生じさせることである。興味深いことに、トロンビンは、凝固カスケードによって産生される一方で、最も有効な血小板活性剤であるため、血小板活性化と凝固の間を結ぶものであり、したがって、この分子を標的とすることができる治療薬は、非常に有効ま抗血栓薬である可能性が高い。
凝固カスケードは、血管傷害後の著しい失血または出血を予防することを目的とする通常の生理的プロセスである。最終的に、血餅は、線維素溶解と称されるプロセスによって再構成され、再吸収される。このプロセスを担う主要な酵素(プラスミン)は、種々の活性剤および阻害剤によって調節される。さらに、凝固システムは、免疫系および補体系と重複し、その結果、血餅に侵入する微生物を物理的に捕捉し、血管透過性を増大させ、貪食細胞に対する走化性物質をもたらす。さらに、凝固システムの生成物のいくつかは、そのまま抗菌剤となる。
しかしながら、血餅(血栓としても知られる)が必要ない場合にも形成される場合がある。例えば、急性の医学的疾患、長引く運動抑制、手術、またはがんなどのいくつかの高リスク条件により、血餅の発生リスクが増大しうる。さらに、凝固プロセスに関する生理学的問題により、個体は出血、血栓症、および場合によってはその両方を引き起こす場合があり、アテローム動脈硬化性心血管疾患および/または不整脈を伴う重大な予後をもたらしうる。
抗血小板剤および抗凝固剤は、凝血障害を処置するために使用される。抗血小板剤は、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、チカグレロールおよびプラスグレルを含み、糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤の非経口投与は冠動脈インターベンション(血管形成術およびステント留置)の間に使用される。抗凝固剤については、ワルファリン(および関連するクマリン)およびヘパリンが最も一般的に使用されるが、直接経口抗凝固剤はまた、トロンビン阻害剤であるダビガトランならびにリバーロキサバン、アピキサバンおよびエドキサバンなどの活性化因子Xの阻害剤を含む。
アンチトロンビン(AT)は、セリンプロテアーゼ阻害剤であり、凝固プロテアーゼの主要な血漿阻害剤の1つである。ATは、例えばトロンビン(因子IIa)および活性化因子X(因子Xa)を阻害することにより凝固カスケードをブロック/調節する。ATとこれらの因子との相互作用は、ヘパリン(未分画ヘパリン;UFH)および低分子量ヘパリン(LMWH;画分ヘパリン)の存在によって増大され、特異的なペンタサッカライド配列を介してATに結合することにより凝固プロセスを阻害する。この結合によって、凝血に関する因子IIa、Xa、および他のプロテアーゼの阻害を加速するATの立体構造の変化がもたらされる。一旦解離すると、ヘパリンおよびLMWHは遊離して、他のAT分子に結合し、続いてさらにトロンビンおよび因子Xaを阻害する。
ATに加えて、他の天然に存在する抗凝固剤が存在し、そのうち、プロテインCおよびS、組織因子経路阻害剤およびヘパリン補因子IIは重要な役割を果たす。これらの分子の活性もヘパリンによって増強される。
主に、標準的ヘパリン調製物が血栓症の全身的処置に使用される。これらは、凝固活性が優勢である静脈血栓などの乏血小板血栓において最も有効である。臨床的に使用される標準的ヘパリンは、血栓症のさらなる成長をブロックすることによる血栓症の全身的処置に有効であるが、アテローム性プラークの内因性の破壊あるいは外部からの血管形成術または血管もしくは微小管手術に伴う動脈における血小板により推進される血栓性合併症を単独で予防する程には効果的ではない。
ステント留置を伴うまたは伴わない血管形成術[PT(C)A=経皮的血管(冠動脈)形成術]および血管または微小管手術などの動脈インターベンションは、(方向性)動脈切除術および末梢または肺の血栓内膜摘出術とともに、循環器疾患に対する処置の成長モダリティを表す。したがって、内因性血管もしくは微小管傷害および/または動静脈フィステラもしくは動静脈グラフトの挿入および維持などの外部からのインターベンションと関連して生じる、血小板により推進される動脈血栓症は、頻繁に遭遇する問題であり、これらの状況では、血栓症の従来の全身的抗凝固処置は、限られた有効性しかない場合が多い。
動脈インターベンションと関連する現代の全身的抗血栓症処置には、UFH(平均15kDaの)またはLMWH(平均7.5kDaの)などの抗凝固剤と、アセチルサリチル酸(シクロオキシゲナーゼ阻害剤)、クロピドグレルまたは他のADP拮抗薬などの抗血小板薬との組合せが含まれる。他の開発は、有効な血小板糖タンパク質IIb/IIIa、ヴォンヴィレブランド因子ならびにアブシキシマブ、チロフィバンおよびエプチフィバタイドなどのフィブリノーゲン受容体拮抗薬によっても代表される。これらの比較的新しい静脈内投与される組合せ処置は、静脈内処置された血栓を生じやすい血管の急性血栓閉塞の30〜35%の予防に成功した。血液製剤の注入を必要とする最も初期入院患者の出血リスク(大出血)はおよそ6〜7%であり、有効な血小板ADP受容体ブロック薬を用いると、大出血は、最初の1カ月間の外来で12〜15%まで増加する。死亡率に関連するリスクは、最初の1カ月の経過観察で、突発性出血の場合、15〜30倍である。
残念ながら、未分画ヘパリンを用いる全身的治療は、予測できないバイオアベイラビリティー、短い半減期、易感染抗トロンビン/AT機能をもたらすタンパク質への非特異的結合、血小板因子4(PF4)を用いて血小板減少症および血栓症をもたらす免疫原性効果などの不利益を有する。これらの望ましくない影響は、残念ながら、フィブリン結合トロンビン、および血小板結合因子Xaへの限定された効果、ならびに血小板分泌PF4によるヘパリン活性の部分的中和による動脈血栓症に対する限定された有効性も有する低分子量分画ヘパリンの使用によって軽減される。したがって、血管または微小管傷害およびインターベンションに伴う血栓症を予防および/または処置するための有効で、信頼性が高く、安全な治療法の開発には大きな需要がある。
本発明者らは、タンパク質コアに結合した際に、哺乳動物のマスト細胞から得ることができる長鎖(75±25KDa)の未変性ヘパリンプロテオグリカン(HEP−PG)を含む合成分子が、血小板がコラーゲンに付着することによって誘発される血小板活性化の強力な阻害によって血小板とコラーゲンの相互作用を阻害するその能力に基づく、強力な抗血栓性を発現することを以前に見出した(WO9926983)。したがって、この分子は、抗血小板処置として有効であり、局所適用に最も適しており、全身的抗血小板薬と組み合わせて理想的に使用される。この分子は、少なくとも局所投与される場合に、正常な止血反応を確実にする全身的血小板機能を保つ点で有利である。
他の研究者らは、未分画ヘパリン鎖(約20〜100鎖)のポリリシンなどの直鎖ポリアミドへの結合を含む合成抗血栓性分子を作製した(US5,529,986)。この分子は、抗トロンビンに結合し、この活性を増強するため、上記WO9926983に記載されたものと比較して異なる作用機序を有する。したがって、この分子は抗凝固剤として有効である。
本発明者らのさらなる研究により、本発明者らは、ヘパリンの使用に基づく別の分類の合成抗血栓性分子を開発した。しかしながら、本発明者らは、本発明者らの新たな分類の分子が、抗血小板活性と抗凝固活性の両方を有する点で有利であることを、驚くべきことに見出した。本発明者らの知る限り、このような二重性分子が同定されたのは初めてである。さらに、本発明者らは、本発明者らの新たな分類の分子の、抗血小板剤または抗凝固剤として優位にまたはより大きい程度で作用する傾向は、各分子に結合するまたは含まれるヘパリンの量に関して操作され/設計されうることを発見した。最後に、本発明者らはまた、本発明者らの新たな分類の分子が、局所作用を有し、故に全身的影響への懸念なく標的化された方式で使用することができる点で有利であることを発見した。
発明についての記述
本発明の第1の態様によれば、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む、抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子が提供される。
本発明の第1の態様によれば、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む、抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子が提供される。
本明細書中で言及される前記血漿タンパク質に結合しているヘパリン鎖の数は、比色定量による硫酸化グリコサミノグリカンアッセイ、Blyscan Assay Kit(例えば、Biocolor Ltd.、英国)を考慮して、被験試料を読み取り/決定できる検量線を作成するために特定濃度のヘパリン標準物質を使用して決定されるものである。したがって、発明の主要な記述において言及されるヘパリン鎖の数は、表Iの列1と相関する。使用される特定のアッセイは、本明細書に記載されている。
抗血小板(AP)活性および抗凝固(AC)活性は、狭窄症の部位でAPが必要とされ、ならびに乱れがあり、血小板の成長がトロンビンによって媒介される場合に、遠位および近位でAC作用が必要とされる湾曲血管または狭窄血管においてなど、抗血小板活性が必要とされおよび/または抗凝固活性が必要とされる事例に、分子が対処できるため、独特であり、極めて有利である。
好ましい二重機能性に加えて、本発明者らはまた、本発明の分子が、コラーゲンおよびヴォンヴィレブランド因子を含む細胞外マトリックスへの強力な結合能を有し、したがって、これらの分子は標的化された局所抗血栓作用を有することを発見した。出血または大量出血を引き起こす可能性のある有害な全身的抗血栓効果を有するかもしれないという懸念なく、分子を特定の部位で使用して、特定の状態を処置できることを意味するため、このことは非常に望ましい特徴である。この有利な標的化は、投与方式、すなわち局所的または全身的にかかわらず存在する。
本明細書において言及される標的化抗血栓作用は、適用部位において、かなりの期間、例えば24時間超、さらに理想的には48時間または50時間超、さらには120時間まで、本発明の分子を保持することを指す。とりわけ、この適用部位における保持は、血管の外側および内側に投与される場合の両方で起こる。
本発明の好ましい実施形態において、前記血漿タンパク質は、アルブミン、グロブリンまたはフィブリノーゲンであり、理想的には血清アルブミンまたはアルファ2−マクログロブリンであり、より理想的にはヒト血清アルブミン(HSA)またはヒトアルファ2−マクログロブリンである。一般的に知られているように、血清アルブミンは肝臓によって産生され、血漿に溶解され、哺乳動物において最も豊富に存在する血液タンパク質である。血清アルブミンは、分子量がおよそ66,000ダルトンの球状の水溶性タンパク質である。さらに知られているように、アルファ2−マクログロブリン(α2MおよびA2M)は、大きな血漿タンパク質であり、実際に血漿中で最も大きな、主要非免疫グロブリンタンパク質であり、主に肝臓によって産生される。アルファ2−マクログロブリンは、アンチプロテアーゼとして作用し、多種のプロテイナーゼを不活性化することができる。
本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記血漿タンパク質は組換え体である。
本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ヘパリンは未分画ヘパリンである。より理想的には、やはり前記ヘパリンは哺乳動物由来、理想的にはヒトまたはブタ由来のものである。血漿タンパク質がヒト由来であり、ヘパリンがブタまたはウシヘパリンである場合において、前記APAC分子はキメラ分子に相当する。
好ましくは、ヘパリンは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21kDa、理想的には15または16または17kDaを含む群から選択される分子量を有する。
本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ヘパリンは組換え体である。
本発明のまたより好ましい実施形態において、前記リンカー分子は、少なくとも前記ヘパリンの前記血漿タンパク質への連結が完了した場合に、ヘパリンの1分子に結合する単一リンカー分子であり、したがって、1つのリンカー分子の前記血漿タンパク質への結合により、ヘパリン1分子の前記血漿タンパク質への結合が生じる。したがって、前記リンカーの前記ヘパリンに対する化学量論は、1:1である。好ましくは、前記リンカーはアミンリンカーであり、故に前記ヘパリンおよび血漿タンパク質のアミノ基と連結し、理想的にであって排他的にではないが、前記リンカーはヘパリン鎖のセリンとコンジュゲートし、理想的には同鎖の末端または末端付近に位置し、かつ理想的にであって排他的にではないが、前記リンカーは血漿タンパク質のリシンとコンジュゲートする。より理想的にはまた、前記リンカーは、ジスルフィド架橋の使用により、前記ヘパリンと血漿タンパク質をコンジュゲートする。またより好ましくは、前記リンカーは、SPDPリンカーなどのヘテロ二機能性架橋剤またはDTSPリンカーなどのホモ二機能性架橋剤である。
SPDP(例えばSigma−AldrichまたはThermo Scientific Pierceから市販されている)は、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルおよびピリジルジチオール反応基を介したアミン対スルフヒドリルのコンジュゲーションのために使用される短鎖架橋剤であり、システインのスルフヒドリルと切断可能な(還元可能な)ジスルフィド結合を形成する。これは、短鎖型および長鎖型で利用できる。長鎖型はスルホン化形態で利用でき、水溶性である。本発明者らは3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用することを好む。すべてのSPDPは、リシン残基と反応して安定なアミド結合を形成するアミン反応性N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを含有するが、リンカーの他方の末端において、スルフヒドリルと反応して可逆的なジスルフィド結合を形成するピリジルジスルフィド基が存在する。
DTSP(3,3’−ジチオジプロピオン酸ジ(N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル)、例えばSigma−AldrichまたはThermo Scientific Pierceから市販されている)は、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基を介したアミン対アミンのコンジュゲーションのために使用される短鎖架橋剤である。これは、短鎖型および長鎖型で利用できる。長鎖型は、スルホン化形態(N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)エステル)で利用でき、水溶性である。DTSPは、スペーサーアームにおいて、2つのアミン反応性N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基およびジスルフィド架橋を含有する。N−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第一級アミン含有残基と反応して、リンカー分子に切断可能なジスルフィド結合を有する安定なアミド結合を形成する。
したがって、本発明者らの好ましい合成分子に対する一般式は以下のように記述されうる:
(Hep−リンカー)n−PlPr
[式中、
n=4〜16であり、
PlPrは、ヒト血清アルブミンまたはヒトアルファ2−マクログロブリンなどの血漿タンパク質であり、
ヘパリン鎖は10〜21KDaである]。
(Hep−リンカー)n−PlPr
[式中、
n=4〜16であり、
PlPrは、ヒト血清アルブミンまたはヒトアルファ2−マクログロブリンなどの血漿タンパク質であり、
ヘパリン鎖は10〜21KDaである]。
より詳細には、本発明者らが、本発明者らの好ましいリンカーである3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP)または(3,3’−ジチオジプロピオン酸ジ(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)(DTSP)を使用する場合、本発明者らの好ましい合成分子は以下のように記述されうる:
(Hep−NH−CO−CH2−CH2−S−S−CH2−CH2−CO−NH)n−PlPr
ここで、n=4〜16;
PlPrは、ヒト血清アルブミンまたはヒトアルファ2−マクログロブリンなどの血漿タンパク質であり、ヘパリン鎖は10〜21KDaである。
(Hep−NH−CO−CH2−CH2−S−S−CH2−CH2−CO−NH)n−PlPr
ここで、n=4〜16;
PlPrは、ヒト血清アルブミンまたはヒトアルファ2−マクログロブリンなどの血漿タンパク質であり、ヘパリン鎖は10〜21KDaである。
アルブミン、特にHSAなどの各血漿タンパク質に36鎖までのヘパリンを結合することが可能であるが、本発明者らは、4〜16個の間のヘパリン鎖が各血漿タンパク質に結合することによって、抗血小板活性および抗凝固活性の両方の望ましい二重機能性がもたらされることを発見した。さらに、本明細書でデータが示すように、本発明者らはまた、6個未満のヘパリン鎖、理想的には4〜6個の間のヘパリン鎖が各血漿タンパク質に結合することによって、優位にまたはより大きい程度で、望ましい抗凝固活性がもたらされる一方で、8個超のヘパリン鎖、理想的には8〜16個の間のヘパリン鎖が各血漿タンパク質に結合することによって、優位にまたはより大きい程度で、望ましい抗血小板活性がもたらされることを発見した。
したがって、本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記APAC分子が、優位にまたはより大きい程度で、抗凝固剤として使用される場合、前記分子は、前記血漿タンパク質に結合した6個以下、例えば4〜6個の間のヘパリン鎖を有する。
したがって、本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記APAC分子が、優位にまたはより大きい程度で、抗血小板剤/血小板阻害剤として使用される場合、前記分子は、前記血漿タンパク質に結合した8個以下、例えば8〜16個の間のヘパリン鎖を有する。
したがって、本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記APAC分子が、優位にまたはより大きい程度で、抗血小板剤/血小板阻害剤として使用される場合、前記分子は、前記血漿タンパク質に結合した8個のヘパリン鎖を有する。
したがって、本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記APAC分子が、優位にまたはより大きい程度で、抗血小板剤/血小板阻害剤として使用される場合、前記分子は、前記血漿タンパク質に結合した11個のヘパリン鎖を有する。
したがって、ある特定数のヘパリン鎖が各血漿タンパク質のコアに優先的に連結することによって、合成分子の優位な機能に影響を与えることができる。本発明者らの分子を使用する場合に達成されるべき結果が抗血栓性である一方、抗血小板活性に重きを置く必要がある場合もあり、抗凝固活性にさらに重きを置く必要がある場合もあるため、このような顕著な特徴は技術アプリケーションを有する。例えば、ずり速度の比較的低い、すなわち管腔が大きく血流速度が低い静脈などの管を処置する場合、抗凝固性に優位または重きを置く抗血栓薬が非常に望ましい。一方、例えば、ずり速度が比較的高い、すなわち血流速度が高いまたは管の管腔が小さい、かつそれ故に血流速度が高い動脈または動静脈瘻などの管を処置する場合、抗血小板活性に優位または重きを置く抗血栓薬が非常に望ましい。同様に、カテーテル、ステントまたはバルーン血管形成術を行うために使用される装置などのインプラントが使用される場合、これらを本発明のAPAC分子で被覆することができ、使用されるAPAC分子のタイプは、理想的には、インプラントが挿入される管の性質に関して決定される。
本発明の第2の態様によれば、医薬として使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子が提供される。
本発明の第3の態様によれば、抗血栓薬として使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子が提供される。
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記抗血栓薬は局所的に作用する。このことにより、本発明者らは、抗血栓薬が細胞外マトリックスに結合し、したがって、抗血栓薬は、適用部位、または意図された作用部位で、持続性の局所活性を保持することを意味する。実際に、この局所作用活性は、本発明の分子が、最も必要とされる、すなわち抗血栓症が起こりやすい部位、言い換えれば、コラーゲンとヴォンヴィレブランド因子の両方が存在する/不可欠な構成要素である細胞外マトリックスに効率的に標的化されることを意味するため、有利である。
本発明の第4の態様によれば、血栓症または血栓症が疑われるものを処置するための医薬の製造において使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子の使用が提供される。
本明細書において言及される血栓症が疑われるものとは、外科的インターベンション、例えば外科的血栓除去術の実施など(限定されない)、血栓症を起こす可能性のある任意の例、状況または条件を指し、この例において、本発明の分子は、手術部位に投与されるか、手術された管に注入されるか、血液供給が前記手術部位の付近/前記手術部位に流れる隣接する下流の管に注入される。
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記医薬は抗血栓薬であり、理想的には局所作用する。局所作用によって、本発明者らは、抗血栓薬が細胞外マトリックスに結合し、したがって、適用部位で、持続性の局所活性と共に保持されることを意味する。実際に、この局所作用活性は、本発明の分子が、最も必要とされる、すなわち抗血栓症が起こりやすい部位、言い換えれば、コラーゲンとヴォンヴィレブランド因子の両方が存在する/不可欠な構成要素である細胞外マトリックスに効率的に標的化されることを意味するため、有利である。
本発明の前述の態様において、前記APAC分子が、抗凝固剤として優位にまたはより大きい程度で使用される場合、好ましくは、前記分子は、前記リンカーを介して、前記血漿タンパク質に結合する6以下、例えば4〜6のヘパリン鎖を有する。
同様に、本発明の前述の態様において、前記APAC分子が、抗血小板剤/血小板阻害剤として優位にまたはより大きい程度で使用される場合、好ましくは、前記分子は、前記リンカーを介して、前記血漿タンパク質に結合する8以上、例えば8〜16のヘパリン鎖を有する。
本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記APAC分子は、血栓性合併症、例えば、アテローム性プラークの内因性の破裂;または再閉塞を予防するための血栓溶解療法;または外部からの血管形成術;または血管もしくは微小血管の手術、血管形成術、特にステント留置を伴うもしくは伴わない経皮的経腔的(冠動脈)血管形成術などの動脈インターベンション;(方向性)動脈切除術;末梢もしくは肺の血管内膜摘除術;血小板由来の動脈血栓症;血管もしくは微小血管傷害;血栓性血小板減少性紫斑病または外部からのインターベンション、例えば、または動静脈瘻もしくは動静脈グラフトの挿入および維持ならびにアンチトロンビン(AT)欠乏症に関連するものの処置又は予防において使用されうる。
本発明の第5の態様によれば、虚血再灌流傷害または急性腎傷害または心筋梗塞または卒中または末梢動脈閉塞性疾患または腸間膜虚血の処置に使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子の使用が提供される。
あるいは、本発明の第6の態様によれば、虚血再灌流傷害または急性腎傷害または心筋梗塞または卒中または末梢動脈閉塞性疾患または腸間膜虚血を処置するための医薬の製造において使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子の使用が提供される。
本発明の第7の態様によれば、抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、
i)未分画ヘパリン(Hep)鎖を改変してスルフヒドリル(−SH)基を有する反応体生成物を生成するステップと、
ii)血清アルブミンなどの血漿タンパク質を改変してピリジルジチオール(−PDP)基を有する反応体生成物を生成するステップと
iii)ヘテロ二機能性架橋剤を使用して、i)の反応体生成物をii)の反応体生成物と連結させるステップと
を含む方法が提供される。
i)未分画ヘパリン(Hep)鎖を改変してスルフヒドリル(−SH)基を有する反応体生成物を生成するステップと、
ii)血清アルブミンなどの血漿タンパク質を改変してピリジルジチオール(−PDP)基を有する反応体生成物を生成するステップと
iii)ヘテロ二機能性架橋剤を使用して、i)の反応体生成物をii)の反応体生成物と連結させるステップと
を含む方法が提供される。
本発明の好ましい方法において、前記リンカーは、3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルSPDPリンカー(例えばSigma−AldrichまたはThermo Scientific Pierceから市販されている(場合によってはGMP品質))である。
本発明の第8の態様によれば、抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、
i)未分画ヘパリン(Hep)鎖を改変してN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(−NHS)基を有する反応体生成物を生成するステップと、
ii)ホモ二機能性架橋剤を使用して、i)の反応体生成物を、第一級アミンを含有する血清アルブミンなどの血漿タンパク質と連結させるステップと
を含む方法が提供される。
i)未分画ヘパリン(Hep)鎖を改変してN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(−NHS)基を有する反応体生成物を生成するステップと、
ii)ホモ二機能性架橋剤を使用して、i)の反応体生成物を、第一級アミンを含有する血清アルブミンなどの血漿タンパク質と連結させるステップと
を含む方法が提供される。
本発明の好ましい方法において、前記リンカーは、3,3’−ジチオジプロピオン酸ジ(N−ヒドロキシスクシンイミドエステルDTSPリンカー(例えばSigma−AldrichまたはThermo Scientific Pierceから市販されている(場合によってはGMP品質))である。
本発明の第9の態様によれば、血栓性合併症、例えば、アテローム性プラークの内因性の破裂に関連するもの;再閉塞を予防するための血栓溶解療法;血小板由来の動脈血栓症;血管または微小血管傷害;血栓性血小板減少性紫斑病;虚血性再灌流傷害;急性腎傷害;心筋梗塞;卒中;末梢動脈閉塞性疾患、腸間膜虚血およびアンチトロンビン(AT)欠乏症を含む群から選択される疾患または状態の処置のための方法であって、
複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であり、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子の有効量を、処置される個体に投与するる、方法が提供される。
複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であり、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子の有効量を、処置される個体に投与するる、方法が提供される。
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記抗血栓性分子は、再閉塞を予防するための血栓溶解療法後に投与される。
より好ましくはさらに、前記ヘパリン鎖数が、8、9、10、11および12を含む群から選択される。
本発明の第10の態様によれば、外部からの血管形成術、血管または微小血管の手術、動脈インターベンション、血管形成術、特にステント留置を伴うまたは伴わない経皮的経腔的(冠動脈)血管形成術、(方向性)動脈切除術、末梢または肺の血管内膜摘除術、および外部からのインターベンション、例えば、動静脈瘻または動静脈グラフトの挿入および維持などを含む群から選択される処置方法であって、
複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であり、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子の有効量を、前記処置の前、間または後に、処置される個体に投与する方法が提供される。
複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子であり、各ヘパリン鎖が10〜21KDaの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、および16を含む群から選択される抗血栓性分子の有効量を、前記処置の前、間または後に、処置される個体に投与する方法が提供される。
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記抗血栓性分子は、任意の1または複数の上記処置が実施される前に投与される。
より好ましくはさらに、前記ヘパリン鎖の数が、8、9、10、11および12を含む群から選択される。
より好ましくはさらに、抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子は、Butyl Sepharose媒体(GE Healthcare、米国)を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)および/または限外濾過/血液透析濾過などのクロマトグラフィーによって精製された。しかしながら、APAC分子は、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの他の手段、または当業者に公知の他の方法によって精製されてもよい。
以下の特許請求の範囲および本発明の前述の明細書において、文脈が技術用語または必要な意味を表現するために他に要求する場合を除き、語「含む(comprises)」または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変形は、包括的な意味で使用され、すなわち、本発明の種々の実施形態において、述べられた特徴の存在を特定するが、さらなる特徴の存在または付加を排除するものではない。
この明細書において引用されている、任意の特許または特許出願を含むすべての参照文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。いかなる参照文献も先行技術を構成することは認められない。さらに、先行技術のいずれも、当技術分野における共通の一般知識の一部を構成することは認められない。
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載されていてもよい。
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになる。一般的に言えば、本発明は、この明細書(添付の特許請求の範囲および図面を含む)において開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組合せに拡張される。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または実施例と併せて記載されている特徴、整数、特性、化合物または化学的部分は、矛盾しなければ、本明細書に記載された任意の他の態様、実施形態または実施例に適用できるものと理解される。
さらに、他に記述がなければ、本明細書に開示された任意の特徴は、同じまたは同様の目的を果たす代わりの特徴によって置き換えることができる。
本発明は、例としてのみであるが、特に以下の図面を参照して、ここで記載される。
方法
コンジュゲーション
未分画ヘパリン(Hep)鎖を、2種の代替的架橋剤によって作製されたジスルフィド架橋を介して、ヒト血清アルブミン(HSA)にコンジュゲートし、反応経路は以下を使用する:
i)ヘテロ二機能性架橋剤である3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP)。コンジュゲーションのために、Hepリンカー領域におけるSerおよびHSAにおけるLysの遊離アミンを利用した。HepとHSAは、それぞれ、別の反応で、スルフヒドリル(−SH)およびピリジルジチオール(−PDP)誘導体に改変した。最終のコンジュゲーション反応において、HSAのピリジルジチオール基は、Hepのスルフヒドリル基と反応して、ジスルフィド結合複合体の形成とピリジン2−チオンの放出をもたらした。
ii)ホモ二機能性架橋剤である3,3’−ジチオジプロピオン酸ジ(N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル(DTSP)。コンジュゲーションのために、Hepリンカー領域におけるSerおよびHSAにおけるLysの遊離アミンを利用した。Hepを、最初に、第1のNHS基の放出を伴って、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル誘導体に改変した。最終のコンジュゲーション反応において、HSAのLysは、誘導体化HepのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基と反応して、リンカー領域における切断可能なジスルフィド結合を有する複合体の形成と第2のN−ヒドロキシスクシンイミド基の放出をもたらした。
コンジュゲーション
未分画ヘパリン(Hep)鎖を、2種の代替的架橋剤によって作製されたジスルフィド架橋を介して、ヒト血清アルブミン(HSA)にコンジュゲートし、反応経路は以下を使用する:
i)ヘテロ二機能性架橋剤である3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP)。コンジュゲーションのために、Hepリンカー領域におけるSerおよびHSAにおけるLysの遊離アミンを利用した。HepとHSAは、それぞれ、別の反応で、スルフヒドリル(−SH)およびピリジルジチオール(−PDP)誘導体に改変した。最終のコンジュゲーション反応において、HSAのピリジルジチオール基は、Hepのスルフヒドリル基と反応して、ジスルフィド結合複合体の形成とピリジン2−チオンの放出をもたらした。
ii)ホモ二機能性架橋剤である3,3’−ジチオジプロピオン酸ジ(N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル(DTSP)。コンジュゲーションのために、Hepリンカー領域におけるSerおよびHSAにおけるLysの遊離アミンを利用した。Hepを、最初に、第1のNHS基の放出を伴って、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル誘導体に改変した。最終のコンジュゲーション反応において、HSAのLysは、誘導体化HepのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル基と反応して、リンカー領域における切断可能なジスルフィド結合を有する複合体の形成と第2のN−ヒドロキシスクシンイミド基の放出をもたらした。
Hep−HSA複合体を、Butyl Sepharose媒体(GE Healthcare、米国)を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)または限外濾過/血液透析濾過によって精製した。最後に、Hep−HSA複合体を、pH7.4のリン酸緩衝液(PBS)に溶出した。複合体を、HSAに対するHep鎖のコンジュゲーションレベルを示すサフィックスエクステンション付きのAPACと称した。
本発明を例示するAPAC複合体の一般式は、
(Hep−NH−CO−CH2−CH2−S−S−CH2−CH2−CO−NH)n−HSA
(式中、HSAに結合する未分画ヘパリン鎖の平均数をnと定義する)
である。
(Hep−NH−CO−CH2−CH2−S−S−CH2−CH2−CO−NH)n−HSA
(式中、HSAに結合する未分画ヘパリン鎖の平均数をnと定義する)
である。
HSAに対するHepの平均コンジュゲーションレベル(CL)は、以下の等式に関するHepおよびHSAの濃度ならびにこれらの平均分子量を使用して決定する:
Hepのモル=Hep[C]/平均Hep分子量
HSAのモル=HSA[C]/HSA分子量
CL=Hepのモル/HSAのモル
Hep分子量=15800
HSA分子量=66472
Hepのモル=Hep[C]/平均Hep分子量
HSAのモル=HSA[C]/HSA分子量
CL=Hepのモル/HSAのモル
Hep分子量=15800
HSA分子量=66472
Hepポリマーに対する平均分子量は、ヘパリン製造者から得られた情報に基づく。HSA分子量は、ALBU_HUMAN、UniProtKB/Swiss−ProtからのP02768、シグナルおよびプロペプチドを有さないアイソフォーム1に基づく。
APAC複合体。表Iを参照のこと。
APAC1は1モルのHSA当たり4〜6モルのHepの平均CLを有する。
APAC2は1モルのHSA当たり8〜16モルのHepの平均CLを有する。
APAC複合体。表Iを参照のこと。
APAC1は1モルのHSA当たり4〜6モルのHepの平均CLを有する。
APAC2は1モルのHSA当たり8〜16モルのHepの平均CLを有する。
2010年に、第一世代のAPAC、すなわちAPAC1が、1モルのHSA当たり6モルのHepの平均CLを有する比較的大きな(1g)スケールで製造された(CL6:1、バッチ1.1)。APAC1は、インビトロで抗凝固有効性および抗血小板有効性の両方を示した。急性血栓症の2種の異なるヒヒモデルにおいて、未分画ヘパリン(UFH)、すなわちHSAに結合していないヘパリンである対照に対して、これは、血管開存性ならびに血栓およびフィブリンの蓄積の両方の減少を維持した。また、放射活性で(Cu−64)標識されたAPAC1は、対照、すなわちUFHと比較して、新たなラットの吻合における局所投与部位での局在性を延長した(IPS治療法における研究、カナダ)。
2011年に、APAC2(バッチ2.1)と称される第二世代のAPACが製造され、APAC1と比較した場合、HSAに対するHepの平均CL(11:1)がほぼ2倍であった。APAC1と比較した場合、APAC2は、同じヘパリン濃度で多血小板血漿(PRP)におけるコラーゲン誘発血小板凝集の阻害においてより効率的であった。ラットの吻合モデルにおいて、Cu−64標識したAPAC2は、血管の内側に投与され、UFH対照の2倍の時間検出可能であった(IPST、カナダ)。
2012年に、第三世代のAPAC(今回は複数のバッチ3.1から3.6)が製造された。6種の異なるAPAC複合体(CL6:1から16:1を有する)が、コンジュゲーション反応(CR)自体の再現性を研究するために、小規模で製造された(バッチサイズ約50mg)。これらのAPAC複合体は、製造順に従って称され(CR1から6)、したがって、これらの名称は生成物の特定のCLを反映していない。製造プロトコルが小規模用に調整されたので、それと一致した変化によって生成物の最終特性がわずかに改変される場合もあった。興味深くかつ一様に、CLの高い化合物は、PRPにおけるコラーゲン誘発血小板凝集の阻害において、低いCLよりも効率的であった。一方、抗凝固有効性は、低いCLでより明白であると思われた。
2013年には、第四世代のAPAC、APAC1(CL4:1、バッチ4.1)およびAPAC2(CL8:1、バッチ4.2)の両方が製造された。
2014年には、第五世代のAPAC、APAC1(CL4:1、バッチ5.1)およびAPAC2(CL8:1、バッチ5.2)が作製された。2014年のバッチの分析が進行中である。
定量
コンジュゲート分子、すなわちHSAタンパク質と高度に硫酸化されたヘパリン部分の両方を有する性質のため、APAC生成物のCLを決定することが要求されてきた。HSA濃度は、製造者の使用説明書(Pierce Biotechnology、米国)に従って、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイで決定した。2013年には、BCAアッセイはタンパク質を過大評価すると思われたため、280nmでの直接UV測定も行い、BCAアッセイを検証した。Hep(Heparin Leo、Leo Phama、デンマーク)は、製造者の使用説明書(Biocolor Ltd.、英国)に従って、Blyscan Sulfated Glycosaminoglycanアッセイ、すなわちBlyscanアッセイで決定した。
コンジュゲート分子、すなわちHSAタンパク質と高度に硫酸化されたヘパリン部分の両方を有する性質のため、APAC生成物のCLを決定することが要求されてきた。HSA濃度は、製造者の使用説明書(Pierce Biotechnology、米国)に従って、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイで決定した。2013年には、BCAアッセイはタンパク質を過大評価すると思われたため、280nmでの直接UV測定も行い、BCAアッセイを検証した。Hep(Heparin Leo、Leo Phama、デンマーク)は、製造者の使用説明書(Biocolor Ltd.、英国)に従って、Blyscan Sulfated Glycosaminoglycanアッセイ、すなわちBlyscanアッセイで決定した。
2010年および2012年には、Hepはグリコサミノグリカン(GAG)標準物質(ウシ気管のコンドロイチン4−硫酸)に対してアッセイされた。このGAG標準物質を用いて、Hep濃度は、典型的には過大評価された。したがって、2013年には、ヘパリン出発物質が、Blyscanアッセイに対する新しい標準物質として含まれた。完全性と比較の理由のため、GAGおよびヘパリンの両方を次の分析に使用した。CLの決定は、ヘパリンアッセイにおいて使用した特定の標準物質に影響を受け(表I)、またHSAの分析によっても影響を受けた。それにもかかわらず、様々なAPACと対照UFHが比較された全ての研究において、Hep濃度は、同じアッセイ、すなわちGAGまたは最近ではHep標準物質のいずれか(硫酸化グリコサミノグリカンアッセイ、Blyscanアッセイキット、Biocolor Ltd.、英国)を用いて決定した。
簡潔には、定量化される被験試料を微量遠心管に添加し、水を使用して体積を100μlに調整した。各アッセイについて、Blyscan Assay Kitの硫酸化GAG標準物質または公知のヘパリン標準物質も、試薬ブランク(0μg;水またはPBS)に加えて、特定濃度範囲で行った。アッセイを開始するために、1.0mlのBlyscan Dye試薬を添加し(無機緩衝液中の1,9−ジメチル−メチレンブルー)、少なくとも30分間混合した。硫酸化ヘパリンを含有する管は、紫/ピンク色に変化した。得られたGAG色素複合体を、遠心分離(>10,000×gで10分間)によって未結合の色素から分離した。上清を捨て、1.0mlのBlyscan Dissociation Reagentを添加してボルテックスした。次いで、得られた溶液を、656nmの分光光度法による読取値でアッセイした。試薬ブランクと一緒に標準物質を使用して検量線を作成し、これを利用してヘパリン濃度を決定した。吸光度値は、0.05から1.5単位の間であり、そうでなければ、試料をそれぞれ再構成または希釈した。
分子量
APACの分子量(分子量)はまだ最終のものではなく、溶液のモル濃度が概算されただけにすぎない。通常のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)および組合せの高圧SECに関する研究ならびにトリプル検出器アレイ(TDA;屈折計、粘度計および左右角度光散乱検出器を有する)技術により、APAC1(バッチ1.1)とAPAC2(バッチ2.1)の間の分子量において、おおよそ2倍の増加が示された。
APACの分子量(分子量)はまだ最終のものではなく、溶液のモル濃度が概算されただけにすぎない。通常のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)および組合せの高圧SECに関する研究ならびにトリプル検出器アレイ(TDA;屈折計、粘度計および左右角度光散乱検出器を有する)技術により、APAC1(バッチ1.1)とAPAC2(バッチ2.1)の間の分子量において、おおよそ2倍の増加が示された。
インビトロにおけるAPAC機能の評価
材料および方法
採血
試料採取前少なくとも6〜7日間にいかなる医薬も得ていない健常ドナーからの血液を使用した。試料は、一晩の絶食後に、静脈穿刺を介して前肘静脈から標準の真空採血管(0.109Mのクエン酸ナトリウムVacuette455322、Greiner Bio−one)に採取した。試料は採血後4時間有効であるとみなした。
材料および方法
採血
試料採取前少なくとも6〜7日間にいかなる医薬も得ていない健常ドナーからの血液を使用した。試料は、一晩の絶食後に、静脈穿刺を介して前肘静脈から標準の真空採血管(0.109Mのクエン酸ナトリウムVacuette455322、Greiner Bio−one)に採取した。試料は採血後4時間有効であるとみなした。
多血小板血漿および乏血小板血漿
血液を、摂氏22度にて、180×gで12分間遠心分離し、多血小板血漿(PRP)を分離した。乏血小板血漿(PPP)採取のために、残りの血液を、摂氏22度にて、1500×gで10分間再度遠心分離した。PRPの血小板(PLT)数を細胞カウンタSysmex KX−21(Sysmex Corporation、日本)で測定し、自動校正トロンボグラム(CAT)分析用にPPPで150×106 10%PLT/mLに、アゴニスト誘発PRP凝集用に300×106±10%PLT/mLに調整した。院内血漿プールとして、11人のドナーから採血し、2000×gで10分間遠心分離した。PPPを10.000×gで10分間再度遠心分離し、全ての残っている血小板を除去した。血漿を合わせて、アリコートで保存し、使用まで凍結させた。CAT血漿は2回遠心分離した。
血液を、摂氏22度にて、180×gで12分間遠心分離し、多血小板血漿(PRP)を分離した。乏血小板血漿(PPP)採取のために、残りの血液を、摂氏22度にて、1500×gで10分間再度遠心分離した。PRPの血小板(PLT)数を細胞カウンタSysmex KX−21(Sysmex Corporation、日本)で測定し、自動校正トロンボグラム(CAT)分析用にPPPで150×106 10%PLT/mLに、アゴニスト誘発PRP凝集用に300×106±10%PLT/mLに調整した。院内血漿プールとして、11人のドナーから採血し、2000×gで10分間遠心分離した。PPPを10.000×gで10分間再度遠心分離し、全ての残っている血小板を除去した。血漿を合わせて、アリコートで保存し、使用まで凍結させた。CAT血漿は2回遠心分離した。
血漿
APAC複合体およびUFH対照の抗凝固有効性を、同等のヘパリン濃度(Blyscan GAG st.)で試験した。3種の異なる血漿が使用された:実験室対照血漿、すなわち標準ヒト血漿(SHP、Siemens、ドイツ)、溶媒/界面活性剤(S/D)処理血漿(Octaplas、Octapharma、スイス)、および院内プール血漿(PP、11人の健常ドナー)。この概要において、院内プール血漿での結果を実施例として示している。
APAC複合体およびUFH対照の抗凝固有効性を、同等のヘパリン濃度(Blyscan GAG st.)で試験した。3種の異なる血漿が使用された:実験室対照血漿、すなわち標準ヒト血漿(SHP、Siemens、ドイツ)、溶媒/界面活性剤(S/D)処理血漿(Octaplas、Octapharma、スイス)、および院内プール血漿(PP、11人の健常ドナー)。この概要において、院内プール血漿での結果を実施例として示している。
アンチトロンビン(AT)欠乏血漿(American Diagnostica、米国)を使用して、APACおよび、APTTアッセイでUFHの、ATに依存しない抗凝固有効性を研究した。
凝固
ヘパリンは、アンチトロンビンとトロンビンの複合体(IIa)に結合し、アンチトロンビンの能力を増強させて、トロンビンおよび凝固因子Xaならびに凝固の内因性および外因性経路の上流のいくつかの他の凝固因子を不活性化させる。対照的に、低分子量ヘパリン(LMWH)はアンチトロンビンにのみ結合し、ほぼ排他的に因子Xaを阻害する。トロンビンの標的化は長い鎖長を要し、ヘパリンにおいて少なくとも18単位の五糖の配列を必要とする。ヘパリン含有血漿試料の抗凝固有効性は、血小板と他の血液細胞を欠くPPPにおけるフィブリン血餅形成までに通常試験される。ヘパリンは高度に硫酸化され、強い負電荷を有する。したがって、循環血漿タンパク質または血管内皮への非特異的結合は、ここでは調査されない他の相互作用を誘発するかもしれない。
ヘパリンは、アンチトロンビンとトロンビンの複合体(IIa)に結合し、アンチトロンビンの能力を増強させて、トロンビンおよび凝固因子Xaならびに凝固の内因性および外因性経路の上流のいくつかの他の凝固因子を不活性化させる。対照的に、低分子量ヘパリン(LMWH)はアンチトロンビンにのみ結合し、ほぼ排他的に因子Xaを阻害する。トロンビンの標的化は長い鎖長を要し、ヘパリンにおいて少なくとも18単位の五糖の配列を必要とする。ヘパリン含有血漿試料の抗凝固有効性は、血小板と他の血液細胞を欠くPPPにおけるフィブリン血餅形成までに通常試験される。ヘパリンは高度に硫酸化され、強い負電荷を有する。したがって、循環血漿タンパク質または血管内皮への非特異的結合は、ここでは調査されない他の相互作用を誘発するかもしれない。
トロンビン時間
トロンビン時間(TT)(Thrombin BC試薬、Siemens、ドイツ)アッセイでは、希釈した(40μLの血漿および100μLのトロンビンBC)クエン酸血漿を、標準化された高用量のトロンビン(0.8IU/ml)で補充し、フィブリノーゲンのフィブリン血餅への変換時間を凝固計(KC−4、Sigma−Amelung、米国)で測定する。
トロンビン時間(TT)(Thrombin BC試薬、Siemens、ドイツ)アッセイでは、希釈した(40μLの血漿および100μLのトロンビンBC)クエン酸血漿を、標準化された高用量のトロンビン(0.8IU/ml)で補充し、フィブリノーゲンのフィブリン血餅への変換時間を凝固計(KC−4、Sigma−Amelung、米国)で測定する。
活性化部分トロンボプラスチン時間
活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT、試薬Dade Actin FSL、Siemens、米国)アッセイでは、血餅形成は、接触活性化を表す内因性経路(I、II、V、VIII、IX、X、XI、XII)の凝固因子によって、および血漿の再石灰化によって誘発される。実験では、50μLの血漿を50μLのActin FSL(100μMのエラグ酸中のダイズおよびウサギの脳のリン脂質)で希釈し、50μLの25mM CaCl2で再石灰化した。充分量のヘパリンの存在下で、TTおよびAPTTは用量に依存して延長され始める。臨床的には、静脈内投与されたヘパリン抗凝固の程度が主にAPTTでモニターされる。治療レベルの抗凝固に到達するためには、対照試料に対して1.5から3倍の延長が目標とされる。APTTアッセイは、使用される試薬と凝固計に依存するが、ベースラインの範囲は、典型的には20〜40秒である。
活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT、試薬Dade Actin FSL、Siemens、米国)アッセイでは、血餅形成は、接触活性化を表す内因性経路(I、II、V、VIII、IX、X、XI、XII)の凝固因子によって、および血漿の再石灰化によって誘発される。実験では、50μLの血漿を50μLのActin FSL(100μMのエラグ酸中のダイズおよびウサギの脳のリン脂質)で希釈し、50μLの25mM CaCl2で再石灰化した。充分量のヘパリンの存在下で、TTおよびAPTTは用量に依存して延長され始める。臨床的には、静脈内投与されたヘパリン抗凝固の程度が主にAPTTでモニターされる。治療レベルの抗凝固に到達するためには、対照試料に対して1.5から3倍の延長が目標とされる。APTTアッセイは、使用される試薬と凝固計に依存するが、ベースラインの範囲は、典型的には20〜40秒である。
校正自動トロンボグラム
出血または血栓症のリスクに関連する状態を評価するために、トロンビン生成が実験的に使用される(Hemkerら Pathophysiol Haemost Thromb 2002;32:249〜53)。トロンビンは、凝固プロセス全体にわたって形成されるが、全トロンビンの2から5%のみが、フィブリンがインビトロで凝血するために必要である。したがって、従来の凝固時間(すなわち、TTおよびAPTT)によって、Hemkerの方法である校正自動トロンボグラム(CAT)によって捕捉されうる、凝固の間のトロンビン活性の大半が見過ごされる。CATは、組織因子に誘発されるトロンビン生成を評価し、これは、蛍光発生的トロンビン基質の***を検出し、試料を公知のトロンビン活性を有する対照と並列比較することによってモニターされる。トロンビン生成の過程で、抗凝固因子およびプロコアグラント因子の両方が、トロンボグラムの測定特性に影響を与える。ラグタイムは、PT(組織因子(TF)で誘発される)/APTT(エラグ酸で誘発される)を反映するフィブリン血餅形成の時間を反映する。曲線のピークは、正味のトロンビン生成の最大速度とそれに到達する時間(ttピーク)を示す。曲線下面積、すなわち内因性トロンビン産生能(ETP)は、形成される全トロンビンを測定する。CATでは、トロンビン生成は、クエン酸PPPまたはPRPのいずれかにおいて評価されうる。トロンビンは、再石灰化血漿において、試料を、PPPおよびPRPに対して、それぞれTF(5pM)およびリン脂質(PPL)(4μM)(PPP試薬、Stago、フランス)で、またはTF(1pM、PRP試薬、Stago、フランス)で誘発および補充することによって活性化される。CATによって、凝血因子の欠乏または過活性、および抗凝固剤(ヘパリンまたは直接トロンビン阻害剤のような)または出血障害の場合の補充療法の使用を検出することができる。
出血または血栓症のリスクに関連する状態を評価するために、トロンビン生成が実験的に使用される(Hemkerら Pathophysiol Haemost Thromb 2002;32:249〜53)。トロンビンは、凝固プロセス全体にわたって形成されるが、全トロンビンの2から5%のみが、フィブリンがインビトロで凝血するために必要である。したがって、従来の凝固時間(すなわち、TTおよびAPTT)によって、Hemkerの方法である校正自動トロンボグラム(CAT)によって捕捉されうる、凝固の間のトロンビン活性の大半が見過ごされる。CATは、組織因子に誘発されるトロンビン生成を評価し、これは、蛍光発生的トロンビン基質の***を検出し、試料を公知のトロンビン活性を有する対照と並列比較することによってモニターされる。トロンビン生成の過程で、抗凝固因子およびプロコアグラント因子の両方が、トロンボグラムの測定特性に影響を与える。ラグタイムは、PT(組織因子(TF)で誘発される)/APTT(エラグ酸で誘発される)を反映するフィブリン血餅形成の時間を反映する。曲線のピークは、正味のトロンビン生成の最大速度とそれに到達する時間(ttピーク)を示す。曲線下面積、すなわち内因性トロンビン産生能(ETP)は、形成される全トロンビンを測定する。CATでは、トロンビン生成は、クエン酸PPPまたはPRPのいずれかにおいて評価されうる。トロンビンは、再石灰化血漿において、試料を、PPPおよびPRPに対して、それぞれTF(5pM)およびリン脂質(PPL)(4μM)(PPP試薬、Stago、フランス)で、またはTF(1pM、PRP試薬、Stago、フランス)で誘発および補充することによって活性化される。CATによって、凝血因子の欠乏または過活性、および抗凝固剤(ヘパリンまたは直接トロンビン阻害剤のような)または出血障害の場合の補充療法の使用を検出することができる。
PRPにおける血小板凝集
血小板凝集は、37℃で1000r.p.mの撹拌子速度にてAggram血小板凝集計(Helena Laboratories Inc.、米国)を使用して、Born(J Physiol 1962;162:67〜68)の比濁法を用いて研究した。コラーゲン(I型フィブリル、Kollagenreagens−Horm、Nycomed Pharma、AustriaまたはChronologコラーゲン、Chronolog Ltd.、米国)を、最終濃度0.5μg/mLの主要アゴニストとして使用した。血小板凝集を誘発する前に、試験物質を、PRPを用いて、摂氏22°で2分間、摂氏37°で1分間インキュベートした。該当する場合、5分での最大凝集(光透過の%変化)、傾きおよび曲線下面積を測定した。
血小板凝集は、37℃で1000r.p.mの撹拌子速度にてAggram血小板凝集計(Helena Laboratories Inc.、米国)を使用して、Born(J Physiol 1962;162:67〜68)の比濁法を用いて研究した。コラーゲン(I型フィブリル、Kollagenreagens−Horm、Nycomed Pharma、AustriaまたはChronologコラーゲン、Chronolog Ltd.、米国)を、最終濃度0.5μg/mLの主要アゴニストとして使用した。血小板凝集を誘発する前に、試験物質を、PRPを用いて、摂氏22°で2分間、摂氏37°で1分間インキュベートした。該当する場合、5分での最大凝集(光透過の%変化)、傾きおよび曲線下面積を測定した。
全てのアッセイにおいて、ベースラインは、試験物質と等しい体積の媒体(PBS、pH7.4)を用いて測定した。本発明者らは、他のアゴニスト;アデノシン二リン酸(ADP)、リストセチンおよびコラーゲン関連ペプチド(CRP)についても研究した。APACは、ADP誘発血小板凝集を阻害しないが、高濃度のリストセチン誘発凝集は阻害される(データは図示せず)。コラーゲンに対するAPACの抗血小板活性は、血小板凝集試験において最も顕著な特徴である。
ヒヒにおける急性血栓症のモデル
媒体と比較したAPAC1(バッチ1.1)およびUFHの抗血栓症に対する有効性を、麻酔ヒヒの急性血栓症の2種の充分に確立されたモデルで研究した。改変Folt’sモデルにおいて、大腿動脈と静脈の間に体外AVシャントを作成した。血流を、動脈に配置された外部圧迫器によって制御し、流量をプローブでモニターした。動脈を、Martin把針器(Hegar−Baumgartner TC Gold 14cm)を備えた交差クランプによって10秒間、2回、外側から傷つけた。傷に近接した全ての側枝を結紮した。APAC1またはUFHまたはリン酸緩衝液(PBS)のいずれかのボーラス(4mg/mL)を注射するために、血管アクセスの近位1cmに針(26G)を用いてシャントを穿刺した。血流に曝す前に、傷を試験物質で3分間処置した。ベースラインの血流を回復した直後に、外部圧迫器を傷に配置し、流量を30〜100mL/分に減少させた(90から30%の狭窄)。減少した血流によって、狭窄動脈において血小板の蓄積が検出され、周期的血流減少(CFR)として記録された。5mL/分で、動脈は閉塞したと考えられ、圧迫器を開放し、リン酸緩衝液(PBS)で洗い流すことによって血栓を除去した。ベースラインの血流が回復した後に、狭窄を最適用し、実験を繰り返した。
媒体と比較したAPAC1(バッチ1.1)およびUFHの抗血栓症に対する有効性を、麻酔ヒヒの急性血栓症の2種の充分に確立されたモデルで研究した。改変Folt’sモデルにおいて、大腿動脈と静脈の間に体外AVシャントを作成した。血流を、動脈に配置された外部圧迫器によって制御し、流量をプローブでモニターした。動脈を、Martin把針器(Hegar−Baumgartner TC Gold 14cm)を備えた交差クランプによって10秒間、2回、外側から傷つけた。傷に近接した全ての側枝を結紮した。APAC1またはUFHまたはリン酸緩衝液(PBS)のいずれかのボーラス(4mg/mL)を注射するために、血管アクセスの近位1cmに針(26G)を用いてシャントを穿刺した。血流に曝す前に、傷を試験物質で3分間処置した。ベースラインの血流を回復した直後に、外部圧迫器を傷に配置し、流量を30〜100mL/分に減少させた(90から30%の狭窄)。減少した血流によって、狭窄動脈において血小板の蓄積が検出され、周期的血流減少(CFR)として記録された。5mL/分で、動脈は閉塞したと考えられ、圧迫器を開放し、リン酸緩衝液(PBS)で洗い流すことによって血栓を除去した。ベースラインの血流が回復した後に、狭窄を最適用し、実験を繰り返した。
第2のヒヒモデルでは、コラーゲン被覆PTFEグラフト(2cm、4mm内腔)を外在化動静脈シャントに配置することによって血栓症を誘発した。血栓形成コラーゲン表面をAPACまたはUFH(いずれも4mg/mL)で10分間処置した。血流が開始し(100mL/分;265−1)、111−インジウム標識血小板およびフィブリンの沈着(125−イオジン−フィブリノーゲンの蓄積)を60分間定量化した。
傷害部位の保持
局所投与した64−Cu標識APACまたはUFH(3mg/Kg)のオンサイト有効性、分布、及び保持を、ラットにおいて部分的に結紮した(1cm離して2個の緩い縫合糸)大腿動脈の吻合を50時間PET画像化することによって評価した。
局所投与した64−Cu標識APACまたはUFH(3mg/Kg)のオンサイト有効性、分布、及び保持を、ラットにおいて部分的に結紮した(1cm離して2個の緩い縫合糸)大腿動脈の吻合を50時間PET画像化することによって評価した。
虚血性再灌流傷害および急性腎傷害モデル。
動物。体重235〜250gの特定病原体除去、近交系雄Sprague Dawley(SD)ラット(Harlan Laboratories;Horst、オランダ)を使用した。ラットは、通常のラットフードと水道水を自由に摂取させ、12時間の明/暗サイクルで維持した。アメリカ国立衛生研究所およびOffice of Animal Care and Use(National Research Council、Washington DC、National Academy Press、1996)によって出版されたGuide for the Care and Use of Laboratory Animal Resourcesに従って、動物をヒトが世話した。
動物。体重235〜250gの特定病原体除去、近交系雄Sprague Dawley(SD)ラット(Harlan Laboratories;Horst、オランダ)を使用した。ラットは、通常のラットフードと水道水を自由に摂取させ、12時間の明/暗サイクルで維持した。アメリカ国立衛生研究所およびOffice of Animal Care and Use(National Research Council、Washington DC、National Academy Press、1996)によって出版されたGuide for the Care and Use of Laboratory Animal Resourcesに従って、動物をヒトが世話した。
血液細胞の計数および凝固プロファイル。SDラットに、PBS(pH7.4で10mMのリン酸ナトリウム、137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム)で適当な濃度に希釈したAPAC2(バッチ2.1、16μg、32μgもしくは80μg)またはUFH32μg(注入溶液5000IU/mL;200IU/mg;Leo Pharma、デンマーク)を静脈内投与した(n=8/群)。対照ラットは生理食塩水媒体を静脈内に受けた。10分で、ラットは血液細胞計数および凝固プロファイル分析のために屠殺された。最初の血液試料を、3.8%のクエン酸ナトリウム抗凝固剤を予め充填した2mLシリンジで抜き取り、3mLのポリプロピレン試料管に入れた。第2の試料を、直後に、ラット血清の採取のために別の2mLの空のシリンジに抜き取った。試料、すなわちPPPおよび血漿ならびに血清を血液細胞の計数のために別々に処理した。血液細胞の計数を、クエン酸血液試料中で、細胞カウンタSysmex KX−21を用いて決定した。PPPに対して、血液を、1200×gで15分間遠心分離して(22℃)、白血球と赤血球細胞を分離した。PPPを新しい管にピペットで移しながら、バフィーコートを破壊しないよう注意した。PPPを再度、16100×gで5分間遠心分離し、その後PPPを新しい管に採取した。すぐに使用しない場合、PPPは−40℃で保存した。
腎動脈のクランピングモデル。SDラットは、温虚血の発症10分前または後に、試験モデルによって、PBSで適切な濃度に希釈したAPAC2(バッチ2.1)16μg、32μgもしくは80μgまたはUFH32μg(注入溶液 5000IU/mL、200mg/IU)のいずれかを静脈内に受けた(n=8/群)。対照ラットは生理食塩水媒体を静脈内に受けた。ラットを吸入イソフルランで麻酔して、正中腹部切開を行った。両腎動脈を、試験モデルによって、30または60分間クランピングした。クランプを除去した後、血流を回復させるために腎臓を検査して、腹部を閉じた。ラットには、体液平衡と疼痛緩和の術後維持のために、それぞれ1mLのPBSと0.1mLのブプレノルフィン(Temgesic 0.3mg/ml、Schering−Plough、Kenilworth、ニュージャージー)を投与した。
腎機能および急性腎傷害の評価。腎機能および腎傷害の評価のために、腎傷害の1、2、および3日後に、ラット尾静脈血液試料を麻酔下で採取した。フィンランド、ヘルシンキのヘルシンキ大学病院、HUSLAB臨床化学部でクレアチニンおよび尿素窒素活性をさらに分析するまで、血清を−20℃で凍結させた。急性腎傷害に対するバイオマーカーとして、本発明者らは、ラットの好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)を使用した。NGAL血清レベルを、両腎動脈クランピングの3日後、マウスモノクローナル抗NGAL(BioPorto Diagnostics A/SからのABS 039−08、Gentofte、デンマーク)を使用するELISAによって評価した。
免疫組織化学。免疫組織化学のつぃて、4mm厚さのパラフィン包埋またはクリオスタット断片を、ガラススライド上で連続して切断し、ペルオキシダーゼABC法を使用して染色した(Vectastain Elite ABCキット、Vector Laboratories)。反応は、3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC、Vector Laboratories)によって可視化された。免疫染色として、標本を、pH7.40の1.5%の正常ヤギ血清/PBSで20分インキュベーションし、続いて、室温で30分間(モノクローナル抗体)または+4℃で15時間(ポリクローナル抗体)、最適希釈で一次抗体とインキュベーションして、ブロックした。一次抗体を0.1%ウシ血清アルブミン/PBS溶液で希釈した。PBSで洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼの活性を、0.1%のペルオキシダーゼ(hydrogen peroxidase)(30%)/PBS溶液との10分のインキュベーションでブロックした。PBSでの介在洗い流しと共に、標本を、PBS緩衝液中で、室温で30分間、ビオチン化抗体とさらにインキュベートし、PBS緩衝液中で、室温で30分間、アビジン−ビオチン化ホースラディッシュ複合体で検出し、反応をAEC(Vector Laboratories)で明らかにした。スライドを、Mayer’sのヘマラムで対比染色した。陽性細胞の密度を決定するために、4つのランダムフィールドの各四分円の断面を、40×の倍率で計数し、1mm2に対する合計としてスコアを得た。使用した抗体と希釈液は、BD Pharmingen、サンディエゴ、カリフォルニアからのCD8+T細胞(5mg/mL、22071D)およびR&D systems、アビングドン、英国からのKIM−1(8mg/mL、AF3689)であった。
ヒアルロナン(HA)を、記載されたように、0.05%の3,3−ジアミノベンジジン(DAB)(Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ)を用いるアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ検出(Vector Laboratories;1:200希釈)によって、ウシ関節軟骨から調製したアグリカンのビオチン化G1ドメインとリンクタンパク質を含有する特定のビオチン化bHABCヒアルロナン結合複合体を使用して、パラフィン断片から染色した。染色前に、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、ストレプトマイセス属のヒアルロン酸分解酵素でいくつかの断片を消化すること、またはヒアルロン酸オリゴ糖でbHABPプローブをプレインキュベートすることによって、染色の特異性を制御した。各試料から、40×倍率で10枚の写真を撮影し、ヒアルロナンに陽性の面積を、コンピュータ映像化を用いて測定した(Zeiss Axionvision 4.4、Carl Zeiss International)。これら10個の測定値の平均面積を統計分析に使用した。全ての分析を、2人の独立した観察者による盲検下で行った。
腎臓の組織学的検査。組織損傷の半定量的評価を以下のように行った:2mmの厚さのパラフィン包埋腎臓試料をヘマトキシリンエオジンで染色した。尿細管傷害(扁平化、拡張、円柱および壊死)について以下のパラメータの重症度を以下のように0から3のスケールで等級付けし:等級0=損傷なし、等級1=軽度の損傷、等級2=中程度の損傷、等級3=重度の損傷、全体の尿細管傷害スコア(0〜12)として表した。
統計。全てのデータは、平均+/−SEMであり、Windows バージョン15.0用SPSSによって分析した(SPSS Inc、シカゴ、イリノイ)。2群の比較のために、ノンパラメトリックMann−WhitneyのU検定およびパラメトリックStudent’sのt検定を適用した。多群の比較のために、Dunnの事後検定を用いたノンパラメトリックKruskal−Wallis検定およびDunnett’s correctionを用いたパラメトリックANOVAを適用した。生存のために、ログランク(Mantel−Cox)を用いたKaplan−Meier分析を適用した。P<0.05を統計的に有意とみなした。
結果
トロンビン時間
2010年から2012年までのAPAC複合体(CL6:1から16:1)の存在下でのプール血漿におけるTT測定の例が図1に示されており、APAC1(バッチ4.1)およびAPAC2(バッチ4.2)については図2に示されている。
トロンビン時間
2010年から2012年までのAPAC複合体(CL6:1から16:1)の存在下でのプール血漿におけるTT測定の例が図1に示されており、APAC1(バッチ4.1)およびAPAC2(バッチ4.2)については図2に示されている。
図1
1μg/mLでは、全てのAPACはTTを少なくとも1.5倍延長させ、一方UFHはTTをベースライン(30秒)の1.3倍延長させた。APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)は測定された最大TT(300秒)に到達し、一方APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)はTTをベースラインの2.5倍延長させた(図1)。APAC−CL6(6Hep鎖)はTTを5.5倍、APAC−CL8、バッチ3.2(8Hep鎖)は5.8倍、バッチ3.1(8Hep鎖)は4.3倍、APAC−CL10(10Hep鎖)は2.4倍、APAC−CL13(13Hep鎖)は2.5倍およびAPAC−CL16(16Hep鎖)は3.7倍、ベースライン値を延長させた(図1)。1.5μg/mLでは、全てのAPACおよびUFHが測定値の最大時間に到達した。
1μg/mLでは、全てのAPACはTTを少なくとも1.5倍延長させ、一方UFHはTTをベースライン(30秒)の1.3倍延長させた。APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)は測定された最大TT(300秒)に到達し、一方APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)はTTをベースラインの2.5倍延長させた(図1)。APAC−CL6(6Hep鎖)はTTを5.5倍、APAC−CL8、バッチ3.2(8Hep鎖)は5.8倍、バッチ3.1(8Hep鎖)は4.3倍、APAC−CL10(10Hep鎖)は2.4倍、APAC−CL13(13Hep鎖)は2.5倍およびAPAC−CL16(16Hep鎖)は3.7倍、ベースライン値を延長させた(図1)。1.5μg/mLでは、全てのAPACおよびUFHが測定値の最大時間に到達した。
図2
APAC1(バッチ4.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ4.2、8Hep鎖)は、それぞれTTを2.1から2.4倍延長させた(図2)。1.25μg/mLでは、APAC1(バッチ4.1、4Hep鎖)は測定された最大時間(300秒)に到達し、一方APAC2(バッチ4.2、8Hep鎖)はTTを3.2倍延長させた(図2)。
APAC1(バッチ4.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ4.2、8Hep鎖)は、それぞれTTを2.1から2.4倍延長させた(図2)。1.25μg/mLでは、APAC1(バッチ4.1、4Hep鎖)は測定された最大時間(300秒)に到達し、一方APAC2(バッチ4.2、8Hep鎖)はTTを3.2倍延長させた(図2)。
活性化部分トロンボプラスチン時間
図3
APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)、APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)およびCL6:1から16:1で、バッチ3.1から3.5(8、8、10、13、16Hep鎖)のAPACの存在下で、プール血漿におけるAPTT測定の例が、図3に示されている。
図3
APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)、APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)およびCL6:1から16:1で、バッチ3.1から3.5(8、8、10、13、16Hep鎖)のAPACの存在下で、プール血漿におけるAPTT測定の例が、図3に示されている。
APTTベースライン(30秒)と比較して、1μg/mLでは、APAC1(バッチ1.1)はAPTTを1.4倍延長させ、一方他のAPACおよびUFHはAPTTを1.1から1.2倍延長させた。2μg/mLでは、APAC1(バッチ1.1)はAPTTを2.0倍延長させ、一方他のAPACおよびUFHはより少ない、1.4から1.6倍の延長を示した。3μg/mLでは、ベースラインと比較して、APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)はAPTTを2.6倍、APAC−CL8(バッチ3.1および3.2、8Hep鎖)は2.1倍、APAC−CL10(バッチ3.3、10Hep鎖)は2.0倍、APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)は1.9倍、APAC−CL13(バッチ3.4、13Hep鎖)、APAC−CL16(バッチ3.5、16Hep鎖)およびUFHはいずれも1.8倍延長させた。6μg/mLでは、APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)はAPTTを6.7倍、APAC−CL8(バッチ3.1および3.2、8Hep鎖)は5.4から4.7倍、APAC−CL10(バッチ3.3、10Hep鎖)は4.5倍、APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)は4倍、APAC−CL13(バッチ3.4、13Hep鎖)は3.8倍、APAC−CL16(バッチ3.5、16hep鎖)は3.6倍およびUFHは3.1倍延長させた。8μg/mLでは、APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)はAPTTを9.8倍、APAC−CL8(バッチ3.1および3.2、8Hep鎖)は9.3から8.7倍、APAC−CL10(バッチ3.3、10Hep鎖)は7.4倍、APAC−CL13(バッチ3.4、13Hep鎖)は6.0倍、APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)は5.4倍、APAC−CL16(バッチ3.5、16Hep鎖)は5.8倍およびUFHは4.2倍、少なくとも延長させた。使用した最も高い濃度では、APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)とAPAC−CL10(バッチ3.3、10Hep鎖)との間のAPTTの差は25%、APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)との間の差は45%であった。全てにおいて、典型的には、APTTは、第一世代および第二世代のAPAC(バッチ1.1および2.1、4および11Hep鎖)の最も低いCLの存在下で、ベースラインと比較して最も延長された。
第四世代のAPAC(APAC1対APAC2)は、高用量(6μg/mL超)のHepが使用されるまで、APTT延長が非常に類似するという点で、以前のバッチと異なった。次いで再び、抗凝固は、ヘパリンのより低い結合CLから利益を得た。1μg/mLでは、APAC1(バッチ4.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ4.2、8Hep鎖)はいずれも、ベースライン値(29秒)と比較してAPTTを1.2倍延長させた。2μg/mLでは、APAC1(バッチ4.1)およびAPAC2(バッチ4.2)は、APTTを同様に、それぞれ1.4および1.3倍延長させた。3μg/mLでは、再度、APAC1(バッチ4.1)およびAPAC2(バッチ4.2)は、APTTを同様に、それぞれ1.8および1.7倍延長させた。6μg/mLでは、APAC1(バッチ4.1)およびAPAC2(バッチ4.2)は、APTTを、それぞれ3.9および3.4倍延長させた。8μg/mLでは、APAC1(バッチ4.1)およびAPAC2(バッチ4.2)は、APTTを、それぞれ7.5および6.0倍延長させた。使用した最も高い濃度では、APAC1(バッチ4.1)とAPAC2(バッチ4.2)の間のAPTTの差は21%であった。
図4
異なるヘパリン結合、CLを有するAPACのAPTT評価した抗凝固作用を図4に示す。
異なるヘパリン結合、CLを有するAPACのAPTT評価した抗凝固作用を図4に示す。
図5
第四世代のAPAC1(バッチ4.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ4.2、8Hep鎖)の存在下でのAPTTを図5に示す。
第四世代のAPAC1(バッチ4.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ4.2、8Hep鎖)の存在下でのAPTTを図5に示す。
PPPにおける自動校正トロンボグラム(CAT)
図6〜9
組織因子(5pM)、外因性経路活性剤によって誘発されるCATは、APTTを延長させるために必要とされるより低い濃度のAPACで抗凝固作用を示した。0.25〜1.5μg/mLの低いヘパリン濃度において、APACはピークとETPを低減させ、試験した3つの異なる血漿全て(PP、SHPおよびOctaplas)に用量依存してttピークを延長させた。プール血漿における第一世代のAPAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)、第二世代のAPAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)、UFHおよび第三世代のAPAC−CL6から16の影響を示すトロンボグラムを、実施例として、図7〜12に示した。APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)に対するラグタイム(秒)、ETP(nM)、ピーク(nM)およびttピーク(秒)は表IIにまとめ、APAC−CL6からAPAC−CL16に対しては表IIIにまとめた。媒体対照と比較した値の相対変化(%)を示す。トロンビン生成が完全に阻害された場合、ラグタイム(秒)、ETP(nM)、ピーク(nM)、ttピーク(秒)を0として表した。
図6〜9
組織因子(5pM)、外因性経路活性剤によって誘発されるCATは、APTTを延長させるために必要とされるより低い濃度のAPACで抗凝固作用を示した。0.25〜1.5μg/mLの低いヘパリン濃度において、APACはピークとETPを低減させ、試験した3つの異なる血漿全て(PP、SHPおよびOctaplas)に用量依存してttピークを延長させた。プール血漿における第一世代のAPAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)、第二世代のAPAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)、UFHおよび第三世代のAPAC−CL6から16の影響を示すトロンボグラムを、実施例として、図7〜12に示した。APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)に対するラグタイム(秒)、ETP(nM)、ピーク(nM)およびttピーク(秒)は表IIにまとめ、APAC−CL6からAPAC−CL16に対しては表IIIにまとめた。媒体対照と比較した値の相対変化(%)を示す。トロンビン生成が完全に阻害された場合、ラグタイム(秒)、ETP(nM)、ピーク(nM)、ttピーク(秒)を0として表した。
UFHと比較して、ラグタイムとttピークは、試験した全ての濃度で全てのAPACによって明らかに延長された。ETPは、ETPがUFHと類似する1.0μg/mLのAPAC−CL6(バッチ3.6、6Hep鎖)を除いて、全ての濃度で、UFHと比較してAPACによって減少した。ピークは、ピーク値がUFHに類似する1.0μg/mLのAPAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)を除いて、全ての濃度で、UFHと比較してAPACによって減少した。トロンビン生成は、ベースラインピーク値15%を示したAPAC−CL6(バッチ3.6、6Hep鎖)を除いて、1.5μg/mLのAPACで完全に消失した。全体的に、APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)は、比較的類似したトロンビン生成阻害を有した。第三世代では、CL13:1および16:1を有するAPACは、CL<10を有するAPACより有効な阻害剤である。
PRPにおける自動校正トロンボグラム
図10〜12
これらの図は、血小板依存性トロンビン生成、すなわちプロコアグラント活性を調査し(出血または血栓症のリスクを評価するため)、APACがトロンビン生成を阻害することを示す。血小板の存在下で、低い(1pM)TFトリガーを使用し、それによってトロンビン生成もPPLを添加した血漿CATにおけるより少なかった。低Hep濃度0.25〜1.5μg/mLでは、APACはピークおよびETPを低減させ、試験した各健常ドナーのPRPに用量依存するttピークを延長させた。
図10〜12
これらの図は、血小板依存性トロンビン生成、すなわちプロコアグラント活性を調査し(出血または血栓症のリスクを評価するため)、APACがトロンビン生成を阻害することを示す。血小板の存在下で、低い(1pM)TFトリガーを使用し、それによってトロンビン生成もPPLを添加した血漿CATにおけるより少なかった。低Hep濃度0.25〜1.5μg/mLでは、APACはピークおよびETPを低減させ、試験した各健常ドナーのPRPに用量依存するttピークを延長させた。
図10ではUFH濃度、図11では第一世代のAPAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)、第二世代のAPAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)、ならびに図12では第四世代のAPAC1(バッチ4.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ4.2、8Hep鎖)の影響を示すトロンボグラムを、研究の結果を反映する選択濃度を使用する実施例として示した。0.5μg/mLでは、APACは、UFHの少なくとも2倍のトロンビン生成の有効阻害剤であった。CL8:1および11:1を有するAPACは、血漿−プロコアグラント活性のより強力な阻害剤であり、CL6:1を有するAPACよりピークおよびttピークを低減させた。1.0μg/mLでは、UFHに対する有効性の差が、全てのAPACによってより一層宣言された。
まとめると、UFHと比較してAPACでは明らかに、トロンビン生成が遅延し、血小板活性が阻害された。コンジュゲートしたヘパリン鎖数が多いほど、阻害も強かった。
コラーゲン誘発血小板凝集
図13〜14。APACに対して高感受性(ドナーの50%)、中程度感受性(ドナーの30%)および低感受性を有するドナーにおける代表的な凝集曲線(図13)ならびに高レスポンダーおよび中程度レスポンダーにおけるAPAC1のプール用量反応分析(図14)。
図13〜14。APACに対して高感受性(ドナーの50%)、中程度感受性(ドナーの30%)および低感受性を有するドナーにおける代表的な凝集曲線(図13)ならびに高レスポンダーおよび中程度レスポンダーにおけるAPAC1のプール用量反応分析(図14)。
図13。APAC APAC−CL6からCL16(Hep[C]1、3、10、30および90μg/mLで)について、3人の独立したドナーからのクエン酸抗凝固PRPにおいて試験し、ドナーはそれぞれ異なる感受性を有する(30μg/mLのヘパリン濃度での阻害%として定義(全体でED50)):コラーゲン(coll;0.5μg/mL)誘発血小板凝集において、APACに対する高レスポンダー>60%、低レスポンダー<40%および中程度レスポンダー40〜60%。6分での最大凝集%および曲線の傾き(凝集の速度)についての結果を検出した。
APAC−CL6からAPAC−CL16(8、8、10、13、16、および6Hep鎖)およびAPAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)は、速度と最大血小板凝集を低下させたが、UFHは低下させなかった。高い結合CL11から16:1を有するAPACは、より低いCL6から10:1を有する分子より、より強力な阻害剤であった。APAC−CL6からAPAC−CL16に対する、低レスポンダーに関する1、10および30μg/mLでの結果を図13に表した。最大凝集はそれほど影響を受けなかったが、凝集曲線(凝集の速度に関する)は、全てのAPACバリアントについて用量依存的に下降した。APAC−CL16(バッチ3.5、16Hep鎖)は、この低レスポンダー(ドナー2)において最高の阻害剤であり、最大凝集%を92から38%まで低下させた。
図14。高レスポンダーのPRPでは、APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)は、10μg/mLで、最大血小板凝集の90%を阻害したが、中程度レスポンダーのPRPでは、凝集の75%を阻害するためには90μg/mLが必要だった。高レスポンダーおよび中程度レスポンダーに関してAPAC1の3、10、30、60および90μg/mLでの結果が表されている。
ヒヒにおける血栓症の急性モデル
図15〜16
ヒヒにおける急性血栓症モデルにおいて、APACおよびUFHを、4mg/mLで、傷に局所投与した(図15)。UFHの存在下で、100mL/分の流量で、動脈は繰り返し(5CFR/27分)閉塞した(30%に狭窄)。対照的に、APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)は、120分の経過観察時間の後、実験が中断されるまで、血栓形成を有効に阻害した。実験の終わりに、180分の時点で、APACが選択試験期間(それぞれ10および15分)閉塞を阻害し続ける一方で、動脈を、まず50mL/分まで(60%の狭窄)、最終30mL/分まで(90%の狭窄)再狭窄した。UFHおよびリン酸緩衝液(PBS)を用いる対照実験では、繰り返しCFRが起こった(結果は図示せず)。体外コラーゲングラフトに関するヒヒ血栓症モデルでは(図16)、APAC1は、UFHと比較して、コラーゲンへの血小板沈着を34±13%(平均および標準偏差、n=4、p=0.01)まで低減させた。遠位への血栓の広がりも、63±11%(n=4、p=0.19)まで減少した。UFHに関する結果は、未処置対照(n=21)の値と類似した。フィブリンの蓄積は、APAC1によって低減したが(45±14%)、UFHによっては低減しなかった(1.1±0.1%、n=4、p=0.01)。
図15〜16
ヒヒにおける急性血栓症モデルにおいて、APACおよびUFHを、4mg/mLで、傷に局所投与した(図15)。UFHの存在下で、100mL/分の流量で、動脈は繰り返し(5CFR/27分)閉塞した(30%に狭窄)。対照的に、APAC1(バッチ1.1、4Hep鎖)は、120分の経過観察時間の後、実験が中断されるまで、血栓形成を有効に阻害した。実験の終わりに、180分の時点で、APACが選択試験期間(それぞれ10および15分)閉塞を阻害し続ける一方で、動脈を、まず50mL/分まで(60%の狭窄)、最終30mL/分まで(90%の狭窄)再狭窄した。UFHおよびリン酸緩衝液(PBS)を用いる対照実験では、繰り返しCFRが起こった(結果は図示せず)。体外コラーゲングラフトに関するヒヒ血栓症モデルでは(図16)、APAC1は、UFHと比較して、コラーゲンへの血小板沈着を34±13%(平均および標準偏差、n=4、p=0.01)まで低減させた。遠位への血栓の広がりも、63±11%(n=4、p=0.19)まで減少した。UFHに関する結果は、未処置対照(n=21)の値と類似した。フィブリンの蓄積は、APAC1によって低減したが(45±14%)、UFHによっては低減しなかった(1.1±0.1%、n=4、p=0.01)。
強力な保持能力と緩慢な分解に対応して、PETは、50時間を超えて(〜120時間)、ラットの吻合部位で未分解APACを検出したが、UFHは24時間後にすでに検出できなかった(n=2)。約10%のAPACが、血管の適用部位に直接結合した。APACとUFHは両方、尿路経路を介して排除された。
虚血性再灌流傷害および急性腎傷害モデル
図17〜20
とりわけ、虚血性再灌流傷害は、急性腎傷害モデルにおいて実証されたが、本発明の治療法は、任意の他の再灌流傷害に関連して使用され、したがって、心筋梗塞または卒中または末梢動脈閉塞性疾患または腸間膜虚血によって例示されるような他の傷害を予防し、回復させまたは処置するために使用されうる。
図17〜20
とりわけ、虚血性再灌流傷害は、急性腎傷害モデルにおいて実証されたが、本発明の治療法は、任意の他の再灌流傷害に関連して使用され、したがって、心筋梗塞または卒中または末梢動脈閉塞性疾患または腸間膜虚血によって例示されるような他の傷害を予防し、回復させまたは処置するために使用されうる。
IRIからの腎機能の回復を分析した。APAC2(バッチ2.1、11Hep鎖)の16または32μgの用量は、ラットの血液学的分析に基づいた。APAC2の臨床上妥当な用量範囲およびUFHの比較臨床用量は、以前の動物モデルに基づいた。APAC2およびUFHの抗凝固有効性に関する用量は、APTTで10分の静脈内注射後に示され(図17)、UFHは、最も高い用量(80μg)でAPAC2よりAPTTを3倍延長させた。SDラットは、両腎動脈が30分間クランピングされる10分前に、生理食塩水媒体(静脈内)またはAPAC2 16もしくは32μg(静脈内)のいずれかで処置した。虚血後の腎機能を評価するために、再灌流後3日間、ラット血清および血漿を採取した。APAC2 32μg処置ラットでは、媒体処置ラットと比較した場合、血清クレアチニン(**P<0.01、図18A)および尿素窒素(**P<0.01、図18B)レベルが減少した。腎傷害のバイオマーカーである好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)血清レベルのELISA分析により、APAC2 32μgの前処置も尿細管間質性傷害を低減させることが明らかとなった(**P<0.01、図18C)。
APAC2前処置により、30分の両腎動脈クランピングモデルにおいて、損傷関連自然免疫リガンドヒアルロナン発現および炎症性細胞浸潤が減少した。右の腎臓は、再灌流後3日で除去した。尿細管間質性傷害マーカーKim−1の密度により、媒体処置のラット腎臓と比較してAPAC2 32μg前処置のラット腎臓において、傷害免疫反応性尿細管の数が有意に減少したことが示された(*P<0.05、図19B)。IRIは、自然免疫リガンドヒアルロナン(HA)の腎皮質への蓄積を誘発するので、本発明者らは、IRI後のHAタンパク質発現に対するAPAC2前処置の効果を分析した。30分の温虚血および3日間の再灌流を受けた腎臓では、APAC2 32μg前処置は、媒体処置腎臓と比較した場合、HA免疫反応性領域を有意に減少させた(*P<0.05、図19A)。
尿細管の拡張、上皮壊死、扁平化および円柱の分析を含む尿細管損傷の半定量評価によって、3日目に、媒体処置腎臓において重度の尿細管傷害が明らかになった(図19)。APAC2 16および32μg前処置は両方、全体の尿細管傷害スコアを低減させ、単離された尿細管の断面において、軽度の尿細管拡張および上皮の扁平化のみが観察された(*P<0.05、図19)。
APAC前処置によって、1時間両腎動脈クランピングモデルにおいて、急性腎傷害が予防される。
最後に、本発明者らは、重度のほぼ不可逆的なIRIモデルにおいて、APAC(バッチ2.1、11ヘパリン鎖)前処置の効果を研究した。両腎動脈を1時間クランピングした。SDラットは、温虚血の誘導の10分前に生理食塩水媒体(静脈内)または32μg(静脈内)のいずれかを受けた。ラットの生存は、媒体処置で75%(8匹中6匹)およびAPAC2 32μg群で100%(8匹中8匹)であった(*P<0.05、図20A)
次に、本発明者らは、血清クレアチニンおよび尿素窒素測定を用いて腎機能を分析した。APAC2前処置によって、媒体処置腎臓と比較した場合、血清クレアチニンおよび尿素窒素レベルが低減した(赤色破線、**P<0.01および***P<0.001、図20B&C)。
アンチトロンビン欠乏血漿におけるトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間
APAC1(バッチ5.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ5.2、8Hep鎖)の存在下で、AT欠乏血漿におけるTTおよびAPTT測定の例が、図21および22にそれぞれ示されている。ヘパリン濃度は、標準物質としてヘパリン出発物質を用いて決定する。
APAC1(バッチ5.1、4Hep鎖)およびAPAC2(バッチ5.2、8Hep鎖)の存在下で、AT欠乏血漿におけるTTおよびAPTT測定の例が、図21および22にそれぞれ示されている。ヘパリン濃度は、標準物質としてヘパリン出発物質を用いて決定する。
図21
1μg/mLでは、APAC1(バッチ5.1、4Hep鎖)は、TTを少なくともベースラインの2倍延長させ、2μg/mLでは、TTは、測定した最大時間に到達した(250秒)。2μg/mLでは、APAC2(バッチ5.2、8Hep鎖)は、TTをベースラインの4.6倍延長させた(図21)。
1μg/mLでは、APAC1(バッチ5.1、4Hep鎖)は、TTを少なくともベースラインの2倍延長させ、2μg/mLでは、TTは、測定した最大時間に到達した(250秒)。2μg/mLでは、APAC2(バッチ5.2、8Hep鎖)は、TTをベースラインの4.6倍延長させた(図21)。
図22
4μg/mLでは、全てのAPAC1(バッチ5.1、4Hep鎖)は、APTTをベースラインの1.4倍、5μg/mLでは、1.7倍延長させた。4μg/mLでは、APAC2(バッチ5.2、8Hep鎖)は、APTTをベースラインの1.9倍延長させた(図22)。4μg/mLでは、UFHは、APTTをベースラインの1.5倍延長させた。
4μg/mLでは、全てのAPAC1(バッチ5.1、4Hep鎖)は、APTTをベースラインの1.4倍、5μg/mLでは、1.7倍延長させた。4μg/mLでは、APAC2(バッチ5.2、8Hep鎖)は、APTTをベースラインの1.9倍延長させた(図22)。4μg/mLでは、UFHは、APTTをベースラインの1.5倍延長させた。
Hepのコンジュゲーションレベル(CL)と抗凝固効果および抗血小板効果との関連についての結論
全てのバリアントは、抗凝固および抗血小板(コラーゲン誘発凝集および血小板プロコアグラント活性)の二重作用を発現する。
全てのバリアントは、抗凝固および抗血小板(コラーゲン誘発凝集および血小板プロコアグラント活性)の二重作用を発現する。
CL6〜16:1を有するAPACは以下の抗凝固特性を共有する:
(Blyscan GAG標準物質で評価されたヘパリン濃度)
・ 臨床用量(約3μg/mL)でUFHと類似したAPTTの延長
・ 高臨床用量(約6〜8μg/mL)でUFHより有効なAPTTの延長
・ Hep CL6:1を有するAPACは、特により高濃度で、CL≧8:1を有するAPACより強力な抗凝固剤と思われる。
・ トロンビン生成は、CATにおいて遅延し、PPPおよびPRPの両方において、少なくともUFHと同等の有効性のAPTT延長(1.0μg/mL)に必要とされるより低い濃度で減少した。
・ CL≧8:1を有するAPACは、PRPにおいて、より低いCLを有する種よりもトロンビン生成の阻害においてより強力であると思われる
(Blyscan GAG標準物質で評価されたヘパリン濃度)
・ 臨床用量(約3μg/mL)でUFHと類似したAPTTの延長
・ 高臨床用量(約6〜8μg/mL)でUFHより有効なAPTTの延長
・ Hep CL6:1を有するAPACは、特により高濃度で、CL≧8:1を有するAPACより強力な抗凝固剤と思われる。
・ トロンビン生成は、CATにおいて遅延し、PPPおよびPRPの両方において、少なくともUFHと同等の有効性のAPTT延長(1.0μg/mL)に必要とされるより低い濃度で減少した。
・ CL≧8:1を有するAPACは、PRPにおいて、より低いCLを有する種よりもトロンビン生成の阻害においてより強力であると思われる
APACは、抗血小板特性を有する:
・ クエン酸PRPにおいて、速度およびコラーゲンによって誘発される最大血小板凝集を低減させるが、UFHは低減させない
・ CL(8〜16:1)を有するAPACは、一様に、CL4〜6:1を有する分子よりコラーゲン誘発血小板凝集のより強力な阻害剤である
・ クエン酸PRPにおいて、速度およびコラーゲンによって誘発される最大血小板凝集を低減させるが、UFHは低減させない
・ CL(8〜16:1)を有するAPACは、一様に、CL4〜6:1を有する分子よりコラーゲン誘発血小板凝集のより強力な阻害剤である
以下を有するAPAC、すなわち
CL≦6:1を有するAPACは、CL≧8を有するAPACよりTTを延長させる
CL≦6:1を有するAPACは、CL≧8を有するAPACよりAPTTを延長させる
CL≧8:1を有するAPACは、CATにおいて、特にPRPにおいて、CL4〜6:1を有するAPACよりトロンビン生成を阻害する
CL≧8:1を有するAPACは、CL4〜6:1を有するAPACよりコラーゲン誘発PRP凝集を阻害する
CL≦6:1を有するAPACは、CL≧8を有するAPACよりTTを延長させる
CL≦6:1を有するAPACは、CL≧8を有するAPACよりAPTTを延長させる
CL≧8:1を有するAPACは、CATにおいて、特にPRPにおいて、CL4〜6:1を有するAPACよりトロンビン生成を阻害する
CL≧8:1を有するAPACは、CL4〜6:1を有するAPACよりコラーゲン誘発PRP凝集を阻害する
全体として、血小板凝集および血小板プロコアグラント活性の両方の阻害は、HSAにコンジュゲートする多数のヘパリン鎖からの利益を受けている。
Claims (7)
- 抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、
i)未分画ヘパリン(Hep)鎖を改変してスルフヒドリル(−SH)基を有する反応体生成物を生成するステップと、
ii)ヒト血漿タンパク質を改変してピリジルジチオール(−PDP)基を有する反応体生成物を生成するステップと
iii)ヘテロ二機能性架橋剤を使用して、i)の反応体生成物をii)の反応体生成物と連結させるステップと
を含む方法。 - リンカーが、3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP)リンカーである、請求項1に記載の方法。
- 抗血小板および抗凝固(APAC)活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、
i)未分画ヘパリン(Hep)鎖を改変してN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(−NHS)基を有する反応体生成物を生成するステップと、
ii)ホモ二機能性架橋剤を使用して、i)の反応体生成物を、第一級アミンを含有する血清アルブミンなどのヒト血漿タンパク質と連結させるステップと
を含む方法。 - リンカーが、3,3’−ジチオジプロピオン酸ジ(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(DTSP)リンカーである、請求項3に記載の方法。
- 前記抗血栓性分子が、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)または限外濾過/血液透析濾過によって精製される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血漿タンパク質が、アルブミン、グロブリン、フィブリノーゲン、血清アルブミンおよびアルファ2−マクログロブリンを含むまたはこれらからなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血漿タンパク質が、血清アルブミンまたはアルファ2−マクログロブリンである、請求項6に記載の方法。
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