JP6890111B2 - Method for discriminating species and strains of Lactobacillus microorganisms - Google Patents
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Description
本発明は、ラクトバチルス属微生物の特定の種及び特定の菌株の判別方法に関する。 The present invention relates to a method for discriminating a specific species and a specific strain of a Lactobacillus microorganism.
従来細菌や真菌の菌種同定に関してはＤＮＡまたはＲＮＡの配列解析を利用して行うのが一般的な手法である。このような一般的な菌株を同定する手法としては、純粋培養された菌株の生菌のＤＮＡを用いて、ＲｉｂｏＰｒｉｎｔｅｒやＰｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ）法、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）法、Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法、Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ＰＣＲ（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）法、Ｍｕｌｔｉｌｏｃａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）法、Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｉｓｙｓ（ＭＬＳＡ）法などの解析が一般的である（非特許文献１参照）。
また、このような菌種同定の応用として、特許文献１には、乳製品中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡプローブ、および、このようなプローブの調製についての試みが開示されている。また、特許文献２には、環境汚染物質の分解、除去を促進することのできるＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ属に属する新規微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子または１６ＳｒＲＮＡから調製したプローブを用いて、環境汚染物質分解促進能を有する細菌の検出・定量を簡便迅速に行うとともに、汚染環境のモニタリング、評価を行うことが開示されている。
このように、細菌や真菌の菌種や菌株の同定技術は、様々な場面で必要とされ、開発されている。
Conventionally, it is a general method to identify bacterial species of bacteria or fungi by using DNA or RNA sequence analysis. As a method for identifying such a general strain, the DNA of the viable strain of the purely cultured strain is used, and the RiboPrinter, Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) method, Restion Fragment Lens Polymerase (RFLP) method, and RFLP method are used. Polymorphic DNA (RAPD) method, Repetitive Element Palindromic PCR (Rep-PCR) method, Multilocas sex typing (MLST) method, Multilocus sexual analysis (MLSA), etc.
Further, as an application of such bacterial species identification,
As described above, techniques for identifying bacterial species and strains of bacteria and fungi are required and developed in various situations.
しかしながら、現在数多く販売されている死菌の乳酸菌などを混入する清涼飲料などの飲料や食品などにおいては、その製造工程中のｐＨや加熱条件、保存期間中のｐＨや温度条件において、菌体のＤＮＡが分解されてしまうため、菌種や菌株を同定するのに必要なＤＮＡを十分に得にくいという問題がある。そうすると、品質保証の観点から必要とされる製造した商品（すなわち食品や飲料）に混入している菌種や菌株を同定することが極めて困難である。
したがって、本発明の目的は、飲料や食品中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる方法を提供することである。
However, in the case of beverages and foods such as soft drinks containing dead lactic acid bacteria, which are currently sold in large numbers, the bacterial cells are subject to pH and heating conditions during the manufacturing process and pH and temperature conditions during the storage period. Since the DNA is degraded, there is a problem that it is difficult to obtain sufficient DNA necessary for identifying the bacterial species and strain. Then, it is extremely difficult to identify the bacterial species and strains mixed in the manufactured products (that is, foods and beverages) required from the viewpoint of quality assurance.
Therefore, an object of the present invention is to provide a method capable of detecting a specific species of a Lactobacillus microorganism (including a dead bacterium) contained in a beverage or a food, or a specific strain of the specific species.
本発明者らは、鋭意研究の結果、食品や飲料清涼水などの飲料中に含まれる菌体（死菌を含む）の特定の種や菌株を検出するために、これまで全く着目されてこなかった製品中の菌体の約５０−約４５０ｂｐ程度のＲＮＡ断片を使用することで、予想外にも菌種や菌株を同定するのに必要なＤＮＡ断片配列が得られることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下〔１〕〜〔９〕に関する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕試料中のラクトバチルス属微生物（乳酸菌）の特定の種またはラクトバチルス属微生物の特定の種の特定の株を検出標的微生物として検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
ｉｖ）前記プライマーセット中の各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的乳酸菌が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
〔２〕試料が飲料である、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕試料が加熱殺菌され、２５℃で１２ヶ月以内の期間保存された、あるいはそれに相当する条件下で保存された飲料である、前記〔１〕記載の方法。
As a result of diligent research, the present inventors have not paid much attention to detect specific species or strains of bacterial cells (including dead bacteria) contained in beverages such as foods and beverages. We have found that the DNA fragment sequence necessary for identifying a bacterial species or strain can be unexpectedly obtained by using an RNA fragment of about 50 to about 450 bp of the bacterial cells in the product, and the present invention has been developed. Completed.
That is, the present invention relates to the following [1] to [9].
Another aspect of the present invention may be as follows.
[1] A method for detecting a specific species of a Lactobacillus microorganism (lactic acid bacterium) or a specific strain of a specific species of a Lactobacillus microorganism in a sample as a detection target microorganism, and the following steps:
i) Step of extracting RNA from a sample,
ii) A step of synthesizing cDNA using the RNA extracted in i) as a template.
A step of performing PCR using the cDNA synthesized in iii) ii) as a template and a primer set consisting of two or more sets of primers capable of amplifying a gene region of about 50 bp to about 450 bp characteristic of the detection target microorganism. And iv) Detected in the sample when any of the sequences in the region amplified by each primer pair in the primer set is identical to each of the sequences of the detection target microorganism amplified by the same primer pair. The process of determining that the target lactic acid bacterium was present,
The method described above.
[2] The method according to [1] above, wherein the sample is a beverage.
[3] The method according to [1] above, wherein the sample is heat sterilized and stored at 25 ° C. for a period of 12 months or less, or is stored under conditions corresponding thereto.
〔４〕試料中の乳酸菌ラクトバチルス・ガセリ種（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）における菌株を判定する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（１）、（３）、（４）及び（６）からなるプライマーセット（Ａ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（１）、（３）、（４）及び（７）からなるプライマーセット（Ｂ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
・プライマー対（１）、（３）、（５）及び（６）からなるプライマーセット（Ｃ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（１）、（３）、（５）及び（７）からなるプライマーセット（Ｄ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
[4] A method for determining a strain of lactic acid bacterium Lactobacillus gasseri in a sample.
i) Step of extracting RNA from a sample,
ii) A step of synthesizing cDNA using the RNA extracted in step i) as a template.
iii) Using the cDNA synthesized in step ii) as a template
-Primer set (A) consisting of primer pairs (1), (3), (4) and (6)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
-Primer set (B) consisting of primer pairs (1), (3), (4) and (7)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
-Primer set (C) consisting of primer pairs (1), (3), (5) and (6)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
-Primer set (D) consisting of primer pairs (1), (3), (5) and (7)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
・プライマー対（２）、（３）、（４）及び（６）からなるプライマーセット（Ｅ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（２）、（３）、（４）及び（７）からなるプライマーセット（Ｆ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
・プライマー対（２）、（３）、（５）及び（６）からなるプライマーセット（Ｇ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（２）、（３）、（５）及び（７）からなるプライマーセット（Ｈ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）：前記プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１３の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２３の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３３の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４３の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号５３の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号６３の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号７３の配列とが同一である場合、ラクトバチルス・ガセリ種（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）における菌株を判定する工程含む、前記方法。
-Primer set (E) consisting of primer pairs (2), (3), (4) and (6)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
-Primer set (F) consisting of primer pairs (2), (3), (4) and (7)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
-Primer set (G) consisting of primer pairs (2), (3), (5) and (6)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
-Primer set (H) consisting of primer pairs (2), (3), (5) and (7)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
A step of performing PCR using at least one primer set selected from the group consisting of, and
iv): The sequence of the region amplified by the primer pair (1) (excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 13 are the same, or the sequence of the region amplified by the primer pair (2) (excluding the primer sequence). The sequence of SEQ ID NO: 23 is the same as the sequence of SEQ ID NO: 23 (excluding the primer sequence), and the sequence of the region amplified by the primer pair (3) (excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 33 are the same. Moreover, the sequence of the region amplified by the primer pair (4) (excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 43 are the same, or the sequence of the region amplified by the primer pair (5) (primer). (Excluding the sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 53 are the same, and the sequence of the region amplified by the primer pair (6) (excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 63 are the same, or , When the sequence of the region amplified by the primer pair (7) (excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 73 are the same, a step of determining a strain in Lactobacillus gasseri (L. gasseri) is included. , Said method.
〔５〕試料中の乳酸菌ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）ＣＰ２３０５株を検出する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）
を用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号８３の配列と同一であり、かつ、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号９３の配列と同一である場合に、前記試料中にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
〔６〕工程ｉｉｉ）において、プライマー対（８）を用いるＰＣＲとプライマー対（９）を用いるＰＣＲが別個の容器内で行われる、前記〔５〕記載の方法。
〔７〕工程ｉｖ）において、プライマー対（８）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（９）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列と配列番号１０３の配列との同一性が決定される、前記〔５〕記載の方法。
[5] A method for detecting the lactic acid bacterium Lactobacillus gasseri CP2305 strain in a sample.
i) Step of extracting RNA from a sample,
ii) A step of synthesizing cDNA using the RNA extracted in step i) as a template.
iii) Using the cDNA synthesized in step ii) as a template
A primer set (Z) consisting of a primer pair (8) and (9):
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (8):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CACCATCAAGCATCATTTGAACAC (SEQ ID NO: 12);
In addition, a primer pair (9) for amplifying a part of the lepA gene sequence:
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5)
And the process of performing PCR using
iv) The sequence of the region amplified by the primer pair (8) (excluding the primer sequence) is the same as the sequence of SEQ ID NO: 83, and the sequence of the region amplified by the primer pair (9) (primer sequence). When is the same as the sequence of SEQ ID NO: 93, L. The process of determining that the gasseri CP2305 strain was present,
The method described above.
[6] The method according to [5] above, wherein in step iii), PCR using the primer pair (8) and PCR using the primer pair (9) are performed in separate containers.
[7] In step iv), the sequence of the region amplified by the primer pair (9) (excluding the primer sequence) was bound downstream of the sequence of the region amplified by the primer pair (8) (excluding the primer sequence). The method according to [5] above, wherein the identity between the fusion sequence and the sequence of SEQ ID NO: 103 is determined.
〔８〕下記プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）を含む、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株検出用キット：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）。
〔９〕下記プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）。
[8] L.I. gasseri CP2305 strain detection kit:
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (8):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CACCATCAAGCATCATTTGAACAC (SEQ ID NO: 12);
In addition, a primer pair (9) for amplifying a part of the lepA gene sequence:
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5).
[9] Primer set (Z) consisting of the following primer pairs (8) and (9):
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (8):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CACCATCAAGCATCATTTGAACAC (SEQ ID NO: 12);
In addition, a primer pair (9) for amplifying a part of the lepA gene sequence:
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5).
本発明のプライマー対（１）〜（９）をまとめると、以下の表１のとおりである。
本発明の方法によると、飲料中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる。 According to the method of the present invention, a specific species of a Lactobacillus microorganism (including a dead bacterium) contained in a beverage or a specific strain of the specific species can be detected.
本発明者らは、殺菌処理、長期保存等の過程を経た試料であっても、試料中に残存するＲＮＡを鋳型として比較的短い領域を増幅対象としてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株を特異的に検出することができることを見いだした。
特に、本発明者らは、殺菌処理および／または数ヶ月以上の長期保存等の過程を経た試料であっても、試料中に残存するＲＮＡに対して比較的短い領域を増幅対象としてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができることを見いだした。長期保存とは例えば１ヶ月以上、または３ヶ月以上、好ましくは３ヶ月〜６ヶ月、さらに好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月またはこれと同等の条件下での保存をいい、特に試料が飲料や食品の場合、製造から消費期限までの期間、製造から賞味期限までの期間、またはこれらを超える期間の保存も「長期保存」に含まれる。そして、試料を２５℃の保存環境下またはそれに相当する環境下においた場合であれば、例えば９ヶ月以内、少なくとも６ヶ月以内であれば問題なく、試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる。なお、保存温度は通常、４〜３５℃の条件で行われる。ただし、当該試料が例えば５５℃という過酷な温度条件下で保存された場合であっても３〜５日間程度であれば、プライマーセットの種類によっては試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出しうることがある。
したがって、本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の菌種または菌株を特異的に検出することができる。特に本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬ．ｇａｓｓｅｒｉあるいはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる。
The present inventors carry out RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) using RNA remaining in the sample as a template and a relatively short region as an amplification target even if the sample has undergone a process such as sterilization treatment or long-term storage. By doing so, it has been found that a specific species of the genus Lactobacillus or a specific strain of a specific species of the genus Lactobacillus can be specifically detected.
In particular, the present inventors have RT-PCR targeting a region relatively short with respect to RNA remaining in the sample, even if the sample has undergone a process such as sterilization and / or long-term storage for several months or longer. By performing L. Gasseri species or L. It was found that the gasseri CP2305 strain can be specifically detected. Long-term storage refers to storage under, for example, 1 month or longer, or 3 months or longer, preferably 3 to 6 months, more preferably 3 to 12 months or equivalent conditions, and in particular, the sample is a beverage or food. In the case, "long-term storage" also includes storage for a period from manufacture to expiration date, a period from manufacture to expiration date, or a period exceeding these. Then, when the sample is placed in a storage environment of 25 ° C. or an environment equivalent thereto, there is no problem if it is within 9 months, at least 6 months, for example, and L. Gasseri species or L. The gasseri CP2305 strain can be specifically detected. The storage temperature is usually 4 to 35 ° C. However, even when the sample is stored under a harsh temperature condition of, for example, 55 ° C., if it is about 3 to 5 days, depending on the type of primer set, L. Gasseri species or L. The gasseri CP2305 strain may be specifically detected.
Therefore, according to the present invention, a specific strain or strain of the genus Lactobacillus can be specifically detected using RT-PCR. In particular, according to the present invention, L. cerevisiae using RT-PCR. gasseri or L. The gasseri CP2305 strain can be specifically detected.
本発明によってＬ．ｇａｓｓｅｒｉ、特にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる試料には、乳酸菌（乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物））入りの食品、飲料、飼料等、特に乳酸菌の死菌入りの食品、飲料、飼料等が含まれる。本発明における飲料には、発酵乳、発酵乳(殺菌)、乳製品乳酸菌飲料、乳製品乳酸菌飲料(殺菌)、乳酸菌飲料及び清涼飲料水が含まれる。
本明細書において「特異的に検出」するとは、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉの他の菌株とＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株とを区別して、弁別的にＬ．ｇａｓｓｅｒｉまたはＬ．ｇａｓｓｅｒｉの特定の株を検出することを言う。たとえば、「Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出」するとは、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの他の菌株とＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株とを区別して弁別的に試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を検出することを言う。また、「Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉを特異的に検出」するとは、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種とＬ．ｇａｓｓｅｒｉとを区別して弁別的に試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉを検出することを言う。
According to the present invention, L. gasseri, especially L. Samples capable of specifically detecting the gasseri CP2305 strain include foods, beverages, feeds and the like containing lactic acid bacteria (lactic acid bacteria (microorganisms of the genus Lactobacillus)), particularly foods, beverages and feeds containing dead lactic acid bacteria. Is done. The beverage in the present invention includes fermented milk, fermented milk (sterilized), dairy product lactic acid bacteria beverage, dairy product lactic acid bacteria beverage (sterilized), lactic acid bacteria beverage and soft drink.
As used herein, "specifically detected" refers to other Lactobacillus species or L. cerevisiae. Other strains of gasseri and L. Gasseri species or L. Distinguishing from the gasseri CP2305 strain, distinctively L. gasseri or L. It refers to detecting a specific strain of gasseri. For example, "specifically detecting the L. gasseri CP2305 strain" means that L. gasseri CP2305 strain is specifically detected. Other strains of gasseri and L. The L. et al. In the sample distinguishing it from the gasseri CP2305 strain. It refers to detecting the gasseri CP2305 strain. In addition, "specifically detecting L. gasseri" means that other Lactobacillus species and L. gasseri are detected. The L.I. It refers to detecting gasseri.
本発明の方法において、１組以上のプライマー対を用いて、試料中に含まれ得る生物体由来のＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅された配列の配列を決定する。１組のプライマー対では十分な特異性が得られない場合は、同じ遺伝子の他の領域または別の遺伝子を増幅するプライマー対を更に組み合わせて２組以上のプライマー対（各組の各プライマー対は、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる）を含むプライマーセットとすることができる。本発明においては十分な特異性を得るために２組以上のプライマー対を組み合わせてプライマーセットとしてＰＣＲを行うのが好ましく、さらに好ましくは３組以上、特に好ましくは４組以上のプライマー対を組み合わせてプライマーセットとしてＰＣＲを行なう。プライマーセットを構成する各プライマー対は、このプライマー対によって増幅される配列が検出標的の菌種（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種）または特定の菌株（たとえば、特定のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株）と他の菌種または菌株の少なくとも１つと異なるように選ばれる。各プライマー対は公知のデータベースから対象となる菌種または菌株の遺伝子配列を入手し、他の菌種または菌株の同じ遺伝子の配列を入手し、これらをアラインメントすることによって目的の菌種または菌株に特徴的な配列、好ましくは可能な限り特異性の高い配列を同定することによって設計することができる。プライマー設計のために、与えられた配列に対してプライマー配列の候補を出力するコンピュータープログラムも利用することができる。各プライマー対が増幅する領域の長さは、一般に約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐが好ましく、約８０ｂｐ〜約４５０ｂｐがより好ましく、約１００ｂｐ〜約４５０ｂｐが好ましく、約１００ｂｐ〜約３５０ｂｐがより好ましく、特に約１００〜約２５０ｂｐ程度が好ましい。増幅する領域の長さを４５０ｂｐよりも長く設定した場合には、飲料中にその長さのＲＮＡが残存していない恐れがあり、所望の量に増幅できない可能性がある。 In the method of the present invention, RT-PCR is performed using one or more sets of primer pairs using RNA derived from an organism that can be contained in a sample as a template to determine the sequence of the amplified sequence. If one set of primer pairs does not provide sufficient specificity, then two or more sets of primer pairs (each primer pair in each set may be a combination of primer pairs that amplify other regions of the same gene or another gene. , Each consisting of a forward primer and a reverse primer). In the present invention, in order to obtain sufficient specificity, it is preferable to combine two or more sets of primer pairs to perform PCR as a primer set, and more preferably three or more sets, particularly preferably four or more sets of primer pairs are combined. PCR is performed as a primer set. Each primer pair that constitutes a primer set identifies a specific strain (for example, a specific species of the genus Lactobacillus) or a specific strain (for example, a specific species of the genus Lactobacillus) whose sequence is amplified by this primer pair. Strain) and other strains or strains are selected to be different from at least one. For each primer pair, obtain the gene sequence of the target strain or strain from a known database, obtain the same gene sequence of another strain or strain, and align these to obtain the desired strain or strain. It can be designed by identifying characteristic sequences, preferably sequences that are as specific as possible. A computer program that outputs primer sequence candidates for a given sequence can also be used for primer design. The length of the region amplified by each primer pair is generally preferably from about 50 bp to about 450 bp, more preferably from about 80 bp to about 450 bp, more preferably from about 100 bp to about 450 bp, more preferably from about 100 bp to about 350 bp, and particularly about 100 bp. ~ About 250 bp is preferable. When the length of the region to be amplified is set to be longer than 450 bp, RNA of that length may not remain in the beverage, and it may not be possible to amplify to a desired amount.
各プライマーセットに含まれるプライマー対の配列および数を上述のように選択することによって、特定の種（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種）、または特定の種の特定の株（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株）を試料中で同定することができる。
ＰＣＲによって増幅された配列を、同じプライマーセットによって増幅される検出標的の菌種または菌株（たとえばＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株）のそれぞれの遺伝子領域の配列と比較する。２以上のプライマー対によって試料から増幅された２以上の遺伝子領域の配列が同じプライマー対によって増幅される検出標的菌種または菌株の遺伝子領域の配列とそれぞれと一致することは、目的の標的菌種または菌株を同定することの指標となる。２以上のプライマー対を含むセットを用いて増幅された２以上の遺伝子領域の（２以上の）配列の少なくとも１つが同じプライマー対によって増幅される検出標的菌種または菌株の遺伝子領域の配列と一致しない場合は、その検出標的菌種または菌株が試料中に存在したとは認められない。
By selecting the sequence and number of primer pairs contained in each primer set as described above, a particular species (eg, a particular species of the genus Lactobacillus), or a particular strain of a particular species (eg, a particular strain of the genus Lactobacillus) can be identified. A specific strain of the species) can be identified in the sample.
The PCR-amplified sequence is compared to the sequence of each gene region of the detection target strain or strain (eg, L. gasseri CP2305 strain) amplified by the same primer set. It is the target strain of interest that the sequence of two or more gene regions amplified from the sample by two or more primer pairs matches the sequence of the gene region of the detected target strain or strain amplified by the same primer pair. Or it can be an index for identifying a strain. At least one of the (two or more) sequences of two or more gene regions amplified using a set containing two or more primer pairs matches the sequence of the gene region of the detection target strain or strain amplified by the same primer pair. If not, it is not recognized that the detection target strain or strain was present in the sample.
具体的には、下記のプライマーセットのいずれかをＰＣＲに使用してＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種であるか、及びその中の菌株を特異的に検出することができる。 Specifically, one of the following primer sets was used for PCR to L. It is a gasseri species, and the strains therein can be specifically detected.
＜プライマーセット（Ａ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
<Primer set (A)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
＜プライマーセット（Ｂ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
<Primer set (B)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
＜プライマーセット（Ｃ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
<Primer set (C)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
＜プライマーセット（Ｄ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
<Primer set (D)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
＜プライマーセット（Ｅ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
<Primer set (E)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
＜プライマーセット（Ｆ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
<Primer set (F)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
＜プライマーセット（Ｇ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
<Primer set (G)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
＜プライマーセット（Ｈ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
<Primer set (H)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
＜プライマーセット（Ｚ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）
<Primer set (Z)>
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (8):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CACCATCAAGCATCATTTGAACAC (SEQ ID NO: 12);
In addition, a primer pair (9) for amplifying a part of the lepA gene sequence:
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5)
＜（ｉ）プライマーセット（Ａ）〜（Ｈ）＞
プライマー対（１）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｆｕｓＡ遺伝子領域の配列は配列番号１３に示され、プライマー対（２）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｆｕｓＡ遺伝子領域の配列は配列番号２３に示され、プライマー対（３）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号３３に示され、プライマー対（４）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号４３に示され、プライマー対（５）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号５３に示され、プライマー対（６）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号６３に示され、プライマー対（７）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号７３に示される（いずれもプライマー配列を含まない）。
また、後述する方法でプライマー対（１）又は（２）によって増幅されるｆｕｓＡ遺伝子配列、及び、プライマー対（３）と、プライマー対（４）及び（５）のいずれか１つと、プライマー対（６）及び（７）のいずれか１つとによって増幅されるｌｅｐＡ遺伝子配列上の３か所の遺伝子配列部分の組み合わせでＢＬＡＳＴ解析することが好ましい。ｆｕｓＡ遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位８個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その配列同一性は９８−１００％である。またそれ以外にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉなどが上位に確認できるが、その配列同一性は９０−９５％程度である。ｌｅｐＡ遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位１０個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その配列同一性は９３−１００％である。またそれ以外にＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓなどが上位に確認できたが、その配列同一性は高くても９０％程度である。
以上から、プライマー対（１）又は（２）によって増幅されるｆｕｓＡ遺伝子配列、及び、プライマー対（３）と、プライマー対（４）及び（５）のいずれか１つと、プライマー対（６）及び（７）のいずれか１つとによって増幅されるｌｅｐＡ遺伝子配列の組み合わせでＢＬＡＳＴ解析した場合において、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されたＬ．ｇａｓｓｅｒｉの９種類のいずれの菌株の配列とも上記いずれかのプライマーセットで得られたＰＣＲ産物の配列は、９５〜１００％の配列同一性を有するが、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ種以外のラクトバチルス属微生物の配列とは９０％程度の配列同一性しか有さない。
<(I) Primer sets (A) to (H)>
L. amplified by primer pair (1). The sequence of the fusA gene region of the gasseri CP2305 strain is shown in SEQ ID NO: 13 and is amplified by primer pair (2). The sequence of the fusA gene region of the gasseri CP2305 strain is shown in SEQ ID NO: 23 and is amplified by primer pair (3). The sequence of the lepA gene region of the gasseri CP2305 strain is shown in SEQ ID NO: 33 and is amplified by primer pair (4). The sequence of the lepA gene region of the gasseri CP2305 strain is shown in SEQ ID NO: 43 and is amplified by primer pair (5). The sequence of the lepA gene region of the gasseri CP2305 strain is shown in SEQ ID NO: 53 and is amplified by primer pair (6). The sequence of the lepA gene region of the gasseri CP2305 strain is shown in SEQ ID NO: 63 and amplified by primer pair (7). The sequence of the lepA gene region of the gasseri CP2305 strain is shown in SEQ ID NO: 73 (none of which contains the primer sequence).
In addition, the fusA gene sequence amplified by the primer pair (1) or (2) by the method described later, the primer pair (3), any one of the primer pairs (4) and (5), and the primer pair ( It is preferable to perform BLAST analysis with a combination of three gene sequence portions on the lepA gene sequence amplified by any one of 6) and (7). Regarding the fusA gene sequence, the top 8 bacterial species with high sequence identity were L. It is gasseri and its sequence identity is 98-100%. In addition to that, L. acidofilus, L .; Although jonsoni and the like can be confirmed at the top, their sequence identity is about 90-95%. Regarding the lepA gene sequence, the top 10 bacterial species with high sequence identity were L. It is gasseri and its sequence identity is 93-100%. In addition to that, L. jonsoni, L. et al. Although amylovorus and the like could be confirmed at the top, the sequence identity is about 90% at the highest.
From the above, the fusA gene sequence amplified by the primer pair (1) or (2), the primer pair (3), any one of the primer pairs (4) and (5), the primer pair (6) and In the case of BLAST analysis with a combination of lepA gene sequences amplified by any one of (7), L. The sequences of the PCR products obtained by any of the above primer sets with the sequences of any of the nine strains of gasseri have 95 to 100% sequence identity, but L. It has only about 90% sequence identity with the sequences of Lactobacillus microorganisms other than gasseri species.
各プライマー対によって増幅される領域を図１に模式化した。なお、図１は、簡単な模式化であり、実際のプライマーの長さと厳密に対応するものではない。Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出するためには、プライマー対（１）と（３）と（４）と（６）とからなるプライマーセットを使用することが特に好ましい。 The region amplified by each primer pair is schematically shown in FIG. Note that FIG. 1 is a simple schematic and does not exactly correspond to the actual primer length. L. In order to specifically detect the gasseri CP2305 strain, it is particularly preferable to use a primer set consisting of primer pairs (1), (3), (4) and (6).
たとえば、試料に対してプライマーセット（Ａ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１３の配列と同一であり、かつ、プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号３３の配列と同一であり、プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４３と同一であり、プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号６３と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（１）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（３）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合し、さらにその下流にプライマー対（４）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）とプライマー対（６）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）とを結合させた融合配列を用いて同一性を決定してもよい。 For example, RT-PCR was performed on the sample using the primer set (A), and the sequence of the region amplified by the primer pair (1) (excluding the primer sequence) was the same as the sequence of SEQ ID NO: 13 and , The sequence of the region amplified by the primer pair (3) (excluding the primer sequence) is the same as the sequence of SEQ ID NO: 33, and the sequence of the region amplified by the primer pair (4) (excluding the primer sequence) is the sequence. When the sequence of the region amplified by the primer pair (6) (excluding the primer sequence) is the same as that of SEQ ID NO: 63, the lactic acid bacteria in the sample are L.I. It can be determined to be the gasseri CP2305 strain. Further, for example, the sequence of the region amplified by the primer pair (3) (excluding the primer sequence) is bound downstream of the sequence of the region amplified by the primer pair (1) (excluding the primer sequence), and further downstream thereof. Identity is achieved using a fusion sequence in which the sequence of the region amplified by the primer pair (4) (excluding the primer sequence) and the sequence of the region amplified by the primer pair (6) (excluding the primer sequence) are bound. You may decide.
プライマーセット（Ｂ）〜（Ｈ）を用いた場合にも、上記プライマーセット（Ａ）を用いる場合と同様に操作することで、前記試料中の乳酸菌がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であると決定することができる。 Even when the primer sets (B) to (H) are used, the lactic acid bacteria in the sample can be depleted by the same operation as when the primer set (A) is used. It can be determined to be the gasseri CP2305 strain.
ここで、非特許文献１に記載の既存のプライマー配列によって解析された既存のデータベース登録配列は、当該プライマー配列分から２０〜１００塩基程度が削除されてデータベースに登録されているため、必要に応じて、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５菌株におけるＰＣＲ産物の配列データの長さを調整し、比較することが必要となる。例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、図７に示すように、本発明に使用されるプライマー対（１）〜（５）で増幅される領域の遺伝子配列の長さを調整し得る。
Here, the existing database registration sequence analyzed by the existing primer sequence described in
また、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株において上記プライマーセット（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、長さを合わせたそれぞれの菌株ごとのｆｕｓＡ遺伝子配列の後ろにｌｅｐＡ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成することが可能である（図２参照）。Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各種菌株については、ｆｕｓＡ遺伝子配列およびｌｅｐＡ遺伝子配列は、以下のアクセッション番号から取得できる。本系統樹解析により、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各種菌株のいずれかであるか同定することが可能であるが示される。 In addition, for example, the Accession No. of Table 2 below, which is registered in GeneBank. Download the sequence and L. In each gasseri strain, the length of the gene sequence of the region that can be amplified by any of the above primer sets (A) to (H) is matched, and lepA is added after the fusA gene sequence for each strain with the length matched. It is possible to create a phylogenetic tree by connecting gene sequences, processing each strain into one gene sequence to create comparative sequence data, and performing phylogenetic tree analysis using sequence analysis software such as MEGA. (See FIG. 2). L. For various gasseri strains, the fusA gene sequence and the lepA gene sequence can be obtained from the following accession numbers. By this phylogenetic tree analysis, L. It is shown that it is possible to identify any of the various strains of gasseri.
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列は、以下の表３のように対応する。なお、これらの配列は、上述のように、既存のプライマー配列によって解析されたＣＰ２３０５株以外のＬ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株の既存のデータベース登録配列は、当該プライマー配列分から２０〜１００塩基程度が削除されている。 L. The gene sequences of the regions that can be amplified by the above primer set in each strain of gasseri correspond as shown in Table 3 below. In addition, as described above, these sequences are L. cerevisiae other than the CP2305 strain analyzed by the existing primer sequence. In the existing database registration sequence of each strain of gasseri, about 20 to 100 bases are deleted from the primer sequence.
＜（ｉｉ）プライマーセット（Ｚ）＞
試料に対して、プライマーセット（Ｚ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行ない、含まれる菌体がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種であるか、及びその中の菌株がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５であるかを特異的に検出することができる。
<(Ii) Primer set (Z)>
RT-PCR was performed on the sample using the primer set (Z), and the cells contained were L. Is it a gasseri species, and the strain in it is L. It is possible to specifically detect whether it is gasseri CP2305.
より具体的に説明すると、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセット（Ｚ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号８３の配列と同一であり、かつ、プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号９３の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であると決定することができる。
プライマー対（８）を用いるＰＣＲとプライマー対（９）を用いるＰＣＲが別個の容器内で行われることが好ましい。
More specifically, RT-PCR was performed on the sample, RT-PCR was performed using the primer set (Z), and the sequence of the region amplified by the primer pair (8) (excluding the primer sequence) was obtained. When the sequence of the region amplified by the primer pair (9) (excluding the primer sequence) is the same as the sequence of SEQ ID NO: 93, the lactic acid bacterium in the sample is L. .. It can be determined to be the gasseri CP2305 strain.
It is preferred that PCR with primer pair (8) and PCR with primer pair (9) be performed in separate containers.
増幅された領域の配列についてのＢＬＡＳＴ解析の結果、プライマー対（８）によって得られたｆｕｓＡ遺伝子配列と相同性が高かった上位９個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その相同性は９８−９９％である。またそれ以外にＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが確認できるが、その相同性は９２−９４％程度である。以上のことから解析配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉのｆｕｓＡ遺伝子であるとの判別が可能である。
また、増幅された領域の配列についてのＢＬＡＳＴ解析の結果、プライマー対（９）によって得られたｌｅｐＡ遺伝子配列と相同性が高かった上位１０個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その相同性は９５−９９％であった。また、１１位以降の菌種はＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓなどのその他の菌種であり、最も相同性が高くても９１％程度である。以上のことから解析配列によりＬ．ｇａｓｓｅｒｉのｌｅｐＡ遺伝子での判別が可能である。
As a result of BLAST analysis on the sequence of the amplified region, the top 9 bacterial species having high homology with the fusA gene sequence obtained by the primer pair (8) were L. It is gasseri, and its homology is 98-99%. In addition to that, L. jonsoni, L. et al. Helveticus, L. et al. Although acidofilus and the like can be confirmed, the homology is about 92-94%. From the above, the analysis sequence is L. It is possible to discriminate that it is the fusA gene of gasseri.
In addition, as a result of BLAST analysis on the sequence of the amplified region, the top 10 bacterial species having high homology with the lepA gene sequence obtained by the primer pair (9) were L. It was gasseri, and its homology was 95-99%. In addition, the bacterial species after the 11th place are L. jonsoni, L. et al. Helveticus, L. et al. It is another bacterial species such as amylovorus, and has the highest homology of about 91%. From the above, the analysis sequence was used to determine L. It is possible to discriminate by the lepA gene of gasseri.
本発明の別の態様において、各プライマーセット中の１組のプライマー対によって増幅された領域の配列の下流に同じプライマーセット中の他の組のプライマー対によって増幅された領域の配列を結合して融合遺伝子配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作成し、この配列を検出標的菌種または菌株について同じプライマー対を用いて同様に作成した融合遺伝子配列と比較することができる。融合遺伝子配列を作成する場合、プライマー配列は共通しているので、プライマー配列を除くことが好ましい。
たとえば、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を検出標的菌株として上記プライマー対（８）を使用して増幅された配列において他の配列と比較するために長さを調整した配列番号１１３（GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAAATCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGG）で示されるｆｕｓＡ配列の下流に上記プライマー対（９）を使用して増幅された配列において他の配列と比較するために長さを調整した配列番号１１４（AGAAACCACTTCCTGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAACACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT）で示されるｌｅｐＡ配列（いずれもプライマー配列を含まない）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで結合して作成した融合遺伝子配列は以下の通りである。
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ＣＰ２３０５（配列番号１０３）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAAATCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCTGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAACACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
In another aspect of the invention, a sequence of regions amplified by another set of primer pairs in the same primer set is attached downstream of the sequence of regions amplified by one set of primer pairs in each primer set. A fusion gene sequence can be prepared in silico and this sequence can be compared to a fusion gene sequence similarly prepared using the same primer pair for the detection target strain or strain. When preparing the fusion gene sequence, it is preferable to remove the primer sequence because the primer sequences are common.
For example, L. Gasseri CP2305 strain was used as the detection target strain, and the length was adjusted to compare with other sequences in the sequence amplified using the above primer pair (8). SEQ ID NO: 113 (GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTTG The sequence shown by SEQ ID NO: 114 (AGAAACCACTTCCTGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAACACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT) whose length was adjusted for comparison with other sequences in the sequence amplified using the above primer pair (9) The fusion gene sequence prepared by binding with silico is as follows.
L. gasseri_CP2305 (SEQ ID NO: 103)
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAAATCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCTGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTATG
また、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録のＬ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株９種類を検出標的菌株として上記プライマーセット（Ｚ）を使用して増幅された、上記配列番号１１３に対応するｆｕｓＡ配列の下流に、上記配列番号１１４に対応するｌｅｐＡ配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで結合して作成した融合遺伝子配列は以下のとおりである。
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＬＭＧ＿１１４１３（配列番号１０４）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCTGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿１９９９２（配列番号１０５）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿４９６３（配列番号１０６）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿９８５７（配列番号１０７）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
In addition, L. Nine kinds of gasseri strains are detected. The lepA sequence corresponding to SEQ ID NO: 114 is in silico downstream of the fusA sequence corresponding to SEQ ID NO: 113, which is amplified using the primer set (Z) as the target strain. The fusion gene sequence prepared by binding in is as follows.
L. gasseri_strine_LMG_11413 (SEQ ID NO: 104)
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTGAACTTG
L. gasseri_strain_ATCC_19992 (SEQ ID NO: 105)
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTACTG
L. gasseri_strain_ATCC_4943 (SEQ ID NO: 106)
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTACTG
L. gasseri_strain_ATCC_9857 (SEQ ID NO: 107)
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTACTG
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿４９６２（配列番号１０８）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGTATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿２９６０１（配列番号１０９）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATCTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＬＭＧ＿１８１７６（配列番号１１０）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAAACCACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTATTCCGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTACAGTTAAATGATGCG
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＬＭＧ＿１０７７１（配列番号１１１）
GATGACGGTATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATTCGTAAAGCTACTTTGAATTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAAACCACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTATTCCGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTACAGTTAAATGATGCG
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ＡＴＣＣ＿３３３２３（配列番号１１２）
GATGACGGTATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATTCGTAAAGCTACTTTGAATTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAAACCACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTATTCCGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTACAGTTAAATGATGCG
L. gasseri_strain_ATCC_4942 (SEQ ID NO: 108)
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGTATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTACTG
L. gasseri_strine_ATCC_29601 (SEQ ID NO: 109)
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATCTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTACTG
L. gasseri_strine_LMG_18176 (SEQ ID NO: 110)
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAACACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTCGTATGAAATTCCACCAATG
L. gasseri_strine_LMG_10771 (SEQ ID NO: 111)
GATGACGGTATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATTCGTAAAGCTACTTTGAATTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAACACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTCGTATGAAATTCCACCAATG
L. gasseri_ATCC_33323 (SEQ ID NO: 112)
GATGACGGTATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATTCGTAAAGCTACTTTGAATTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAACACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTCGTATGAAATTCCACCAATG
得られた配列番号１０３〜１１２の遺伝子配列に関して、例えばＮｅｉｇｈｂｏｒ Ｊｏｉｎｉｎｇ ＭｅｔｈｏｄでＭＥＧＡ６等配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、作成した系統樹を図３に示す。図３に示す系統樹からも分かるように、ＣＰ２３０５株は上記ＧｅｎｅＢａｎｋ登録のすべての菌株とは配列が異なり、ＣＰ２３０５株であることを明確に確認できる。当該菌株であることが確認できる。 Regarding the obtained gene sequences of SEQ ID NOs: 103 to 112, a phylogenetic tree was analyzed using, for example, Neighbor Joining Method using sequence analysis software such as MEGA6, and the created phylogenetic tree is shown in FIG. As can be seen from the phylogenetic tree shown in FIG. 3, the CP2305 strain has a different sequence from all the strains registered in GeneBank, and it can be clearly confirmed that the CP2305 strain is the CP2305 strain. It can be confirmed that the strain is concerned.
上記プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）によると、試料に含まれる菌体がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であるか否か明確に検出することができるため、当該プライマーセットからなるキットも本発明に含まれる。プライマー対（８）及び（９）で増幅される領域は１００〜２００ｂｐと大変小さく、試料中に多く残存している可能性が高いＲＮＡ部分をターゲットとしているため、高い確率でＲＴ−ＰＣＲを成功させることができる。また、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの菌株間の比較において、ＣＰ２３０５株に特異的な領域をターゲットとしているため、明確にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株が試料に含まれているか否かを判別することができる。 According to the primer set (Z) composed of the primer pairs (8) and (9), the cells contained in the sample are L.I. A kit consisting of the primer set is also included in the present invention because it can be clearly detected whether or not it is a gasseri CP2305 strain. The region amplified by primer pairs (8) and (9) is very small, 100 to 200 bp, and targets the RNA portion that is likely to remain in the sample in large quantities, so RT-PCR is successful with high probability. Can be made to. In addition, L. In the comparison between the gasseri strains, since the region specific to the CP2305 strain was targeted, clearly L. It is possible to determine whether or not the gasseri CP2305 strain is contained in the sample.
本発明によって特異的に検出することができるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株は２００７年９月１１日に特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（旧住所：〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）（ＩＰＯＤはＮＩＴＥ−ＩＰＯＤとして２０１３年４月１日に下記に移転：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３１が付与されている。 L. can be specifically detected by the present invention. Gasseri CP2305 strain was released on September 11, 2007 at the Patent Organism Depositary Center (IPOD) (former address: 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 305-8566, Tsukuba Center Central No. 6) (IPOD is 2013 as NITE-IPOD) Moved to the following on April 1: 〒292-0818 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba (Room 120) has been deposited internationally and has been given the accession number FERM BP-11331.
本発明の方法において、ＲＴ−ＰＣＲは当業者によく知られた方法に従って行うことができる。すなわち、試料から常法にしたがってＲＮＡを抽出し、常法に従ってオリゴｄＴプライマーなどを用いてＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、上記プライマーセットのいずれかを用いて常法にしたがってＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことができる。ＰＣＲの条件はプライマーのＴｍ値、増幅される領域の長さ、配列等から導かれる標準的な条件を利用することができる。プライマーセットに含まれる２組のプライマー対（各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる）によるＰＣＲは同一の容器中で行うこともできるが、増幅産物を個別にシーケンシングする必要があるのでプライマー対ごとにそれぞれ別個の容器でＰＣＲを行うのが好ましい。得られた増幅産物を電気泳動にかけ、予想される長さの断片が増幅されていることを確認し、そのＤＮＡ断片をゲルから常法に従って抽出し、当分野でよく知られた方法によってシーケンシングする。
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、ゲルからのＤＮＡ断片の抽出、シーケンシング等を行うための種々の方法、試薬、キットおよびこれらの操作に必要な装置等も当業者にはよく知られており、商業的に容易に入手することもできる。
In the method of the present invention, RT-PCR can be performed according to methods well known to those skilled in the art. That is, RNA is extracted from a sample according to a conventional method, cDNA is synthesized using RNA as a template using an oligo dT primer or the like according to a conventional method, and PCR (polymerase chain reaction) is performed according to a conventional method using any of the above primer sets. )It can be performed. As the PCR conditions, standard conditions derived from the Tm value of the primer, the length of the region to be amplified, the sequence, and the like can be used. PCR with two sets of primer pairs included in the primer set (each primer pair consists of a forward primer and a reverse primer) can be performed in the same container, but the primers need to be sequenced individually for the amplification products. It is preferable to carry out PCR in separate containers for each pair. The resulting amplification product is electrophoresed to confirm that fragments of the expected length are amplified, the DNA fragments are extracted from the gel according to conventional methods and sequenced by methods well known in the art. To do.
Various methods, reagents, kits and devices required for these operations are also well known to those skilled in the art for RNA extraction, cDNA synthesis, PCR, extraction of DNA fragments from gels, sequencing and the like. , Also readily available commercially.
得られた増幅産物の配列とＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株由来の配列（たとえばｆｕｓＡおよびｌｅｐＡ配列）との比較は目視で行うこともできるが配列比較のための各種アルゴリズムやプログラムは商業的に入手可能であり、ＢＬＡＳＴＮなどのツールもＮＣＢＩ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪセンターから提供されており広く公衆に利用可能である。このようなアルゴリズムやプログラムを利用する場合、上述の融合遺伝子配列を比較すれば１回の解析で配列同一性を決定することができるので有利であろう。
またＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株が他の乳酸菌種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種の他の株と異なることをより理解しやすくするため、作成した融合遺伝子配列を用いて系統樹を作成することができる。系統樹作成のためのアルゴリズムや具体的なプログラムは当業者にはよく知られており、商業的あるいは公共的に利用可能である。たとえば、ＭＥＧＡなどのフリーソフトウエアや、ＮＣＢＩ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪセンターから提供されているアラインメントおよび系統樹作成用のＣｌｕｓｔａｌＷなどが利用可能である。
The sequence of the obtained amplification product and L. Gasseri species or L. Although comparisons with sequences derived from the gasseri CP2305 strain (eg, fusA and lepA sequences) can be made visually, various algorithms and programs for sequence comparison are commercially available, and tools such as BLASTN are also available at NCBI, EMBL. And it is provided by the DDBJ Center and is widely available to the public. When using such an algorithm or program, it would be advantageous to compare the above-mentioned fusion gene sequences because the sequence identity can be determined in one analysis.
In addition, L. Gasseri species or L. The gasseri CP2305 strain is another lactic acid bacterium species or L. In order to make it easier to understand that it is different from other strains of gasseri species, a phylogenetic tree can be prepared using the prepared fusion gene sequence. Algorithms and specific programs for creating a phylogenetic tree are well known to those skilled in the art and are commercially available or publicly available. For example, free software such as MEGA and Clustal W for alignment and phylogenetic tree creation provided by NCBI, EMBL and DDBJ Centers are available.
試料中の乳酸菌が殺菌処理等により本質的に死滅していると考えられる場合、特に殺菌処理および／または長期保存（例えば、４℃〜３５℃にて、１ヶ月以上または３ヶ月以上、好ましくは３ヶ月〜６ヶ月、特に好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月、またはこれらと同等な条件下における保存）により試料中の乳酸菌が死滅し、かつ乳酸菌由来の核酸が相当程度損傷（分解等）していると考えられる場合においても、本発明によればＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる。本発明は試料が飲料や食品の場合、一般に製造から消費期限までの期間、製造から賞味期限までの期間、またはこれらを超える期間保存されていた場合でもＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる。 When it is considered that the lactic acid bacteria in the sample are essentially killed by sterilization or the like, particularly sterilization and / or long-term storage (for example, at 4 ° C to 35 ° C for 1 month or more or 3 months or more, preferably 3 months or more). Lactic acid bacteria in the sample are killed by 3 to 6 months, particularly preferably 3 to 12 months, or storage under the same conditions), and the nucleic acid derived from the lactic acid bacteria is considerably damaged (degraded, etc.). Even in the case where it is considered, according to the present invention, L. Gasseri species or L. The gasseri CP2305 strain can be specifically detected. In the present invention, when the sample is a beverage or food, generally, the period from production to the expiration date, the period from production to the expiration date, or even when stored for a period exceeding these, L. Gasseri species or L. The gasseri CP2305 strain can be specifically detected.
本発明によってＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株と区別され得る他の乳酸菌およびＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種の他の株には、たとえば以下の乳酸菌が含まれるが、これらに限定されない：
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＡＴＣＣ３１４、ＡＴＣＣ４３５６、ＡＴＣＣ９２２４、ＡＴＣＣ５３５４４、ＡＴＣＣ４３５７）；
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（ＡＴＣＣ３３６２０、ＡＴＣＣ３３６２１、ＬＭＧ１８１８８、ＡＴＣＣ３３６２２、ＡＴＣＣ５３６７１、ＬＭＧ１８１９２、ＬＭＧ１８１７９、ＬＭＧ１８１９０、ＡＴＣＣ３３１９８、ＬＭＧ１８１８０、ＬＭＧ１８１８６）；
Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ（ＡＴＣＣ５３５４５、ＡＴＣＣ５５２２１、ＪＣＭ５８１０、ＬＭＧ１１４１５、ＬＭＧ１７７５３、ＡＴＣＣ３３８２０、ＬＭＧ１１４４０、ＬＭＧ１８１８７、ＬＭＧ１２００３、ＬＭＧ１２００５、ＬＭＧ１８１８９）；
Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＬＭＧ１４７５１、ＬＭＧ１８１８１、ＡＴＣＣ５３６７３、ＬＭＧ１４７５２、ＬＭＧ１４７５３、ＬＭＧ１４７５４、ＬＭＧ１４７５５、ＡＴＣＣ３３１９９）；
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ（ＡＴＣＣ４９６３、ＡＴＣＣ１９９９２、ＬＭＧ１１４１３、ＡＴＣＣ２９６０１、ＡＴＣＣ９８５７、ＡＴＣＣ４９６２、ＡＴＣＣ３３３２３、ＬＭＧ１０７７１、ＬＭＧ１８１７６）；
Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＬＭＧ１８１７５、ＬＭＧ１８１８４、ＬＭＧ１８１９３、ＮＣＣ５３３、ＡＴＣＣ３３２、ＡＴＣＣ３３２００、ＬＭＧ１８２０４、ＬＭＧ１８１９５）。
According to the present invention, L. Other lactic acid bacteria that can be distinguished from the gasseri CP2305 strain and L. Other strains of Lactobacillus gasseri include, but are not limited to, for example, the following lactic acid bacteria:
L. acidofilus (ATCC314, ATCC4356, ATCC9224, ATCC53544, ATCC4357);
L. amylovorus (ATCC 33620, ATCC 33621, LMG18188, ATCC33622, ATCC53671, LMG18192, LMG18179, LMG18190, ATCC33198, LMG18180, LMG18186);
L. crispatus (ATCC53545, ATCC55221, JCM5810, LMG11415, LMG17753, ATCC33820, LMG11440, LMG18187, LMG1203, LMG1205, LMG18189);
L. Gallinarum (LMG14751, LMG18181, ATCC53373, LMG14752, LMG14753, LMG14754, LMG14755, ATCC33199);
L. gasseri (ATCC 4963, ATCC 19992, LMG 11413, ATCC 29601, ATCC 9857, ATCC 4962, ATCC 33323, LMG 10771, LMG 18176);
L. jonsoni (LMG18175, LMG18184, LMG18193, NCC533, ATCC332, ATCC33200, LMG18204, LMG18195).
以下に公知のプライマー対を用いて種々の試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株の検出を試みたが失敗に終わった結果を参考性１及び２として、簡単に示す。
（参考例１）
（i）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株の生菌体、（ii）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を加熱殺菌し、乾燥させた菌体（死菌）、及び、（iii）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を飲料製品中に混合し加熱殺菌したのちに集菌した菌体（死菌）の３種類のサンプルから、それぞれ公知の方法でＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡをテンプレートとして、上記非特許文献１（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖｏｌｕｍｅ ７９ Ｎｕｍｂｅｒ ２３）に記載の試験方法に従い、６つのハウスキーピング遺伝子（ｆｕｓＡ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｌｅｐＡ、ｐｙｒＧ、ｒｅｃＡ）の一部（約５００ｂｐ〜１０００ｂｐ）を非特許文献１に記載のプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。結果としては、上記（i）及び（ii）のサンプルからは目的の増幅産物が確認されたが、（iii）のサンプルからは配列解析可能な増幅産物が確認されず、菌株の解析を行うことができなかった。
Using the primer pairs known below, L. The results of attempts to detect the gasseri CP2305 strain but failed are shown briefly as
(Reference example 1)
(I) L. Viable cells of gasseri CP2305 strain, (ii) L. et al. Gasseri CP2305 strain was heat sterilized and dried, and (iii) L. et al. DNA was extracted from three types of samples of bacterial cells (killed bacteria) obtained by mixing the gasseri CP2305 strain in a beverage product, sterilizing by heating, and then collecting the cells (killed bacteria) by a known method. Using the obtained DNA as a template, six housekeeping genes (fusA, gyrA, gyrA, and six housekeeping genes (fusA, gyrA), according to the test method described in Non-Patent Document 1 (Applied and Environmental Microbiology, p. 7220-7228, December 2013 Volume 79 Number 23). A part (about 500 bp to 1000 bp) of lepA, pyrG, recA) was amplified by PCR using the primer pair described in
（参考例２）
（ii）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を加熱殺菌し、乾燥させた菌体（死菌）、及び、（iii）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を飲料製品中に混合し加熱殺菌したのちに集菌した菌体（死菌）の２種類のサンプルから公知の方法で抽出した、ＲＮＡをテンプレートにして、参考例１で使用したのと同じプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより６つのハウスキーピング遺伝子（ｆｕｓＡ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｌｅｐＡ、ｐｙｒＧ、ｒｅｃＡ）の一部（約５００ｂｐ〜１０００ｂｐ）の増幅を行った。結果としては、上記（ii）のサンプルからは目的の増幅産物を得ることができたが、（iii）のサンプルからは、目的の増幅産物を得ることができないか、又は非特異的な増幅産物が多く生成され、塩基配列解析に十分な純度の増幅産物を得ることができなかった。
(Reference example 2)
(Ii) L. Gasseri CP2305 strain was heat sterilized and dried, and (iii) L. et al. The gasseri CP2305 strain was mixed in a beverage product, sterilized by heating, and then collected from two types of bacterial cells (killed bacteria). RNA was used as a template and used in Reference Example 1. Using the same primer pair as above, a part (about 500 bp to 1000 bp) of 6 housekeeping genes (fusA, gyrA, gyrB, lepA, pyrG, recA) was amplified by RT-PCR. As a result, the desired amplification product could be obtained from the sample (ii) above, but the desired amplification product could not be obtained from the sample (iii), or a non-specific amplification product could be obtained. Was produced, and an amplification product with sufficient purity for base sequence analysis could not be obtained.
参考例１及び２で使用したプライマーは以下のとおりであった。
したがって、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株に対する特異的検出能力を試験するまでもなく、非特許文献１（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖｏｌｕｍｅ ７９ Ｎｕｍｂｅｒ ２３）に記載された方法およびプライマーは加熱殺菌された乳酸菌（死菌）入り飲料ではそもそもＰＣＲによる増幅産物を得ることすらできず、本発明の目的には利用できないことが明らかになった。
本発明をより理解しやすくすることを目的として本発明の具体的態様を記載する。
Therefore, L. The methods and primers described in Non-Patent Document 1 (Applied and Inventional Microbiology, p. 7220-7228 December 2013 Volume 79 Number 23) without testing the specific detection ability for the gasseri CP2305 strain were sterilized by heating. It was clarified that the (killed bacteria) -containing beverage could not even obtain an amplified product by PCR in the first place, and could not be used for the purpose of the present invention.
Specific embodiments of the present invention will be described for the purpose of making the present invention easier to understand.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらより何ら限定されるものではなく、また、本発明の範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えてもよい。
以下の実施例及び比較例では、以下の実験手順によってシークエンスサンプルを得た。
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto, and various changes and modifications are made without departing from the scope of the present invention. May be good.
In the following examples and comparative examples, sequence samples were obtained by the following experimental procedure.
＜実験手順＞
１．集菌とサンプルの洗浄
試料としてのサンプル飲料が入ったペットボトルを開栓前に上下に数回反転させてよく混合し、沈殿物がペットボトルの下部に残っていないことを確認した。次に、ペットボトルを開栓し、サンプル飲料液１０ｍＬを１５ｍＬ容滅菌ディスポプラスティックチューブに採取し、６０００ｒｐｍ（４８３０×ｇ）にて１０分間遠心分離した。遠心分離したサンプル飲料の上澄みを廃棄したのち、１０ｍＬの滅菌水をチューブに入れて再懸濁させた。再懸濁液を６０００ｒｐｍ（４８３０×ｇ）にて１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。沈殿物における下側には必要な菌体、上側には乳タンパク等の夾雑物があるため、滅菌水５ｍＬを添加して菌のペレットを崩さないように上部の乳タンパク等の夾雑物のみを軽く懸濁して上澄みを廃棄し、この洗浄作業を２回繰り返した。菌の沈殿を滅菌水１ｍＬに再懸濁し、滅菌済の１．５ｍＬチューブに採取した。そして、菌の沈殿物の再懸濁液を１４，０００ｒｐｍ（１９，０００×ｇ）にて２分間遠心分離し、滅菌水１ｍＬを添加してペレット上部を洗浄してＲＮＡ抽出用のサンプルとした。
<Experimental procedure>
1. 1. Collecting bacteria and cleaning the sample The PET bottle containing the sample beverage as a sample was turned upside down several times before opening and mixed well, and it was confirmed that no precipitate remained at the bottom of the PET bottle. Next, the PET bottle was opened, 10 mL of the sample beverage solution was collected in a 15 mL sterile disposable plastic tube, and centrifuged at 6000 rpm (4830 × g) for 10 minutes. After discarding the supernatant of the centrifuged sample beverage, 10 mL of sterile water was placed in a tube and resuspended. The resuspension was centrifuged at 6000 rpm (4830 xg) for 10 minutes and the supernatant was discarded. Since there are necessary bacterial cells on the lower side of the precipitate and impurities such as milk protein on the upper side, add 5 mL of sterilized water and add only the impurities such as milk protein on the upper side so as not to break the pellets of the bacteria. The supernatant was lightly suspended and the supernatant was discarded, and this washing operation was repeated twice. The bacterial precipitate was resuspended in 1 mL of sterile water and collected in a sterilized 1.5 mL tube. Then, the resuspension of the bacterial precipitate was centrifuged at 14,000 rpm (19,000 × g) for 2 minutes, 1 mL of sterilized water was added, and the upper part of the pellet was washed to prepare a sample for RNA extraction. ..
２．ＲＮＡ抽出
上記１で得られたＲＮＡ抽出用のサンプルを３５０μｌのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＢＰ）に懸濁しよく溶解した。そして、キットのＤＮＡ除去用カラムを用いてＤＮＡを除去した。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ｐｌｕｓキットのマニュアルに従い、ＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ溶液を得た。
2. RNA extraction The sample for RNA extraction obtained in 1 above was suspended in 350 μl of Lysis Buffer (LBP) and dissolved well. Then, the DNA was removed using the DNA removal column of the kit. RNA extraction was performed according to the manual of the Nucleospin RNA plus kit to obtain an RNA solution.
３．ＲＴ−ＰＣＲによる目的遺伝子領域の増幅
上記２で調製したＲＮＡ溶液から、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を使用して目的遺伝子領域を増幅した。
各実施例で使用する各プライマーセットに含まれるそれぞれのプライマーの１０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を調整した。各プライマーは必要な配列をユーロフィンジェノミクス社のＰＣＲｅａｄｙプライマーにて合成依頼（５０ｐｍｏｌ／ｌ）したものを使用し、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの滅菌水にて、５倍に希釈した。
3. 3. Amplification of target gene region by RT-PCR From the RNA solution prepared in 2 above, PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit Ver. 2 was used to amplify the gene region of interest.
A 10 pmol / μl solution of each primer contained in each primer set used in each example was prepared. For each primer, the required sequence was synthesized by requesting synthesis (50 pmol / l) with a PCReady primer manufactured by Eurofin Genomics, and diluted 5-fold with DNase and RNase-free sterile water.
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて、下記反応組成通りに溶液を調製し、ＰＣＲ用の２００μｌ容チューブに下記組成を入れてよく混合した。当該キットのプロトコルではＰＣＲ反応液組成は総量５０μｌとするように指定されていたが、反応液中のＴｅｍｐｌａｔｅ濃度を上げるために総量２５μｌとし、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡの量を４μｌとした。プライマー及びＴｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡ（上記２にて調製したＲＮＡ溶液）以外はキットに付属したものを使用した。 PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit Ver. Using No. 2, a solution was prepared according to the following reaction composition, and the following composition was placed in a 200 μl volume tube for PCR and mixed well. In the protocol of the kit, the total amount of the PCR reaction solution composition was specified to be 50 μl, but in order to increase the Template concentration in the reaction solution, the total amount was set to 25 μl, and the total amount of Template RNA was set to 4 μl. Except for the primer and Template RNA (RNA solution prepared in 2 above), the ones included in the kit were used.
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ １μｌ
２× １ ｓｔｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ １２．５μｌ
Ｆｏｒｗａｏｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０ μＭ） １μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０ μＭ） １μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡ （２にて調整のＲＮＡ溶液） ４μｌ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ 2 Ｏ Ｂａｌａｎｃｅ
総量２５μｌ
上記組成で増幅産物が確認されない場合は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡの量を８μｌに増量し、再度ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
2 x 1 step Buffer 12.5 μl
Forward Primer (10 μM) 1 μl
Reverse Primer (10 μM) 1 μl
Template RNA (RNA solution adjusted in 2) 4 μl
RNase Free dH 2 O Balance
Total amount 25 μl
When no amplification product was confirmed in the above composition, the amount of Template RNA was increased to 8 μl, and RT-PCR was performed again.
サーマルサイクラーＣ１０００Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにセットして、以下のように動かした。
ＳＴＥＰ１：５０℃、３０分、
ＳＴＥＰ２：９５℃、２分、
ＳＴＥＰ３：９５℃、３０秒、
ＳＴＥＰ４：５５℃、３０秒、
ＳＴＥＰ５：７２℃、３０秒
の条件でＳＴＥＰ３−５を計４０サイクルとして、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。得られたサンプルについて、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施し、目的のバンドを確認した。
It was set in the thermal cycler C1000 Touch Thermal Cycler and operated as follows.
STEP1: 50 ° C, 30 minutes,
STEP2: 95 ° C, 2 minutes,
STEP3: 95 ° C, 30 seconds,
STEP4: 55 ° C, 30 seconds,
STEP5: The RT-PCR reaction was carried out under the conditions of 72 ° C. and 30 seconds with STEP3-5 as a total of 40 cycles. The obtained sample was electrophoresed on an agarose gel according to a conventional method to confirm the target band.
４−１．目的バンドのみがきれいに増幅されている場合
（１）反応液５μｌを新品の２００μｌ容ＰＣＲチューブ採取し、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴTM ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｒｅａｇｅｎｔを２μｌ添加してマイクロピペッターでよく混合した。
（２）サーマルサイクラーで５０℃１５分→８５℃１５分のインキュベーションを行い、ＰＣＲ産物を精製した。
4-1. When only the target band is clearly amplified (1) 5 μl of the reaction solution was collected in a new 200 μl PCR tube , 2 μl of ExoSAP-IT TM PCR Product Cleanap Reagent was added, and the mixture was mixed well with a micropipettor.
(2) Incubation was carried out in a thermal cycler at 50 ° C. for 15 minutes → 85 ° C. for 15 minutes to purify the PCR product.
４−２．目的バンド以外に１００ｂｐ前後のＰｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒやその他の増幅産物が確認される場合
電気泳動後にＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐを用いて精製した。
（１）定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施し、目的のバンドを確認後、アガロースゲルから目的バンドの部分を切り出し、滅菌済み１．５ｍｌチューブに採取した。
（２）ＮＴＩ溶液２００μｌを添加し、５０℃で５−１０分程度インキュベートする。インキュベート中２−３分おきにＶｏｒｔｅｘにてよく混合しゲルを完全に溶解させた。
（３）Ｎｅｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｃｏｌｕｍｎを付属の２ｍｌのコレクションチューブにセットし（２）で溶解したサンプル液全量をカラムの上に供し、１１，０００×ｇで３０秒間遠心を行った。ろ液を廃棄し、再度コレクションチューブにセットした。
（４）７００ｍｌのＮＴ３溶液をカラムに供し１１，０００×ｇで３０秒間遠心を行った。ろ液を廃棄し、再度コレクションチューブにセットする。この工程をもう１回繰り返した。
（５）１１，０００×ｇで１分間遠心を行い、カラムに残ったＮＴ＃溶液を除去した。
（６）新しい滅菌済みの１．５ｍｌチューブにカラムをセットし、ＮＥ溶液を１５μｌ添加し、室温で１分間静置した。
（７）１１，０００×ｇで１分間遠心を行い、カラムを廃棄し、シーケンス用の精製ＰＣＲ産物とした。
4-2. When Primer dimer and other amplification products of around 100 bp are confirmed in addition to the target band, purification was performed using Nucleospin Gel and PCR Clean up after electrophoresis.
(1) Electrophoresis was carried out on an agarose gel according to a conventional method, and after confirming the target band, a portion of the target band was cut out from the agarose gel and collected in a sterilized 1.5 ml tube.
(2) Add 200 μl of NTI solution and incubate at 50 ° C. for about 5-10 minutes. The gel was completely dissolved by mixing well with Vortex every 2-3 minutes during the incubation.
(3) Necleospin Gel and PCR Clean-up Volume was set in the attached 2 ml collection tube, and the entire amount of the sample solution dissolved in (2) was placed on a column and centrifuged at 11,000 × g for 30 seconds. The filtrate was discarded and set in the collection tube again.
(4) 700 ml of NT3 solution was applied to a column and centrifuged at 11,000 × g for 30 seconds. Discard the filtrate and set it in the collection tube again. This process was repeated once more.
(5) Centrifugation was carried out at 11,000 × g for 1 minute to remove the NT # solution remaining on the column.
(6) The column was set in a new sterilized 1.5 ml tube, 15 μl of NE solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 minute.
(7) Centrifugation was carried out at 11,000 × g for 1 minute, and the column was discarded to obtain a purified PCR product for sequencing.
５．シーケンスサンプルの調製
Ｂｉｇｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ Ｋｉｔ、精製したＰＣＲ産物、並びに、各菌株用のプライマーセットのプライマー対のフォワード及びリバースプライマー両方を用いてシーケンス反応を実施した。
（１）上記３にてＰＣＲに使用したプライマー対のフォワード及びリバースプライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ溶液を、８μｌを滅菌済み１．５ｍｌチューブに採取し、９２μｌの滅菌水を用いて希釈し、０．８ｐｍｏｌ／μｌの溶液とした。
（２）Ｂｉｇｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ Ｋｉｔ付属の溶液と４−１又は４−２で得られたＰＣＲ産物、プライマー溶液、滅菌水を用いて、下記の通りの組成のシーケンス反応用の液を２００μｌ容ＰＣＲチューブに調製した。一つのＰＣＲ産物あたりフォワード解析用とリバース解析用の２サンプルを用意した。
5. Sequence sample preparation A sequence reaction was performed using both the Bigdye Terminator v1.1 Cycle Sequenceing Kit, the purified PCR product, and the primer pair forward and reverse primers of the primer set for each strain.
(1) 8 μl of the forward and reverse primer 10 pmol / μl solution of the primer pair used for PCR in 3 above was collected in a sterilized 1.5 ml tube, diluted with 92 μl of sterilized water, and 0.8 pmol / μl. It was made into a μl solution.
(2) Using the solution attached to the Bigdy Terminator v1.1 Cycle Sequenceting Kit and the PCR product, primer solution, and sterilized water obtained in 4-1 or 4-2, prepare a solution for sequence reaction having the following composition. Prepared in a 200 μl volume PCR tube. Two samples, one for forward analysis and one for reverse analysis, were prepared for each PCR product.
フォワード解析サンプル
精製ＰＣＲ産物 ２μｌ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｗａｔｅｒ（滅菌水） ８μｌ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＲＲ−１００ ４μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（０．８ｐｍｏｌ／μｌ） ４μｌ
２０μｌ
Forward analysis sample purified
5
Sequencing RR-100 4 μl
Forward primer (0.8 pmol / μl) 4 μl
20 μl
リバース解析サンプル
精製ＰＣＲ産物 ２μｌ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｗａｔｅｒ（滅菌水） ８μｌ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＲＲ−１００ ４μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（０．８ｐｍｏｌ／μｌ） ４μｌ
２０μｌ
（３）サーマルサイクラーにセットして、
９６℃、１０秒、
５０℃、５秒、
６０℃、４分の条件で計２５サイクル反応を実施した。
Reverse analysis Sample purified
5
Sequencing RR-100 4 μl
Reverse primer (0.8 pmol / μl) 4 μl
20 μl
(3) Set it in the thermal cycler and
96 ° C, 10 seconds,
50 ° C, 5 seconds,
A total of 25 cycles of reaction were carried out under the conditions of 60 ° C. and 4 minutes.
６．シーケンスサンプルの精製
（１）サンプル数の分の新しい滅菌済みの１．５ｍＬチューブ、及びＢｉｇｄｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用意した。
（２）ＳＡＭ溶液９０μｌとＸｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液２０μｌをチューブに採取し、上記シーケンス反応産物２０μｌを添加した。
（３）チューブシェーカーにセットし、攪拌スピードを最大値にセットし３０分間攪拌した。
（４）７５０×ｇにて２分間遠心を行い、上澄み２０μｌをサンプルとして、ＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄを２０μｌと混合しＤＮＡシーケンサに供し、配列の解析を行った。
6. Purification of sequence samples (1) A new sterilized 1.5 mL tube for the number of samples and a Bigdye Xterminator Purification Kit were prepared.
(2) 90 μl of the SAM solution and 20 μl of the Xterminator solution were collected in a tube, and 20 μl of the above sequence reaction product was added.
(3) The mixture was set in a tube shaker, the stirring speed was set to the maximum value, and the mixture was stirred for 30 minutes.
(4) Centrifugation was carried out at 750 × g for 2 minutes, and 20 μl of the supernatant was used as a sample, HiDi Formamide was mixed with 20 μl, and the mixture was subjected to a DNA sequencer to analyze the sequence.
７．配列の解析と配列同一性及び菌種判別
（１）得られたそれぞれの配列フォワード、リバースの配列をＭＥＧＡ（フリーソフトウエア）の配列解析ソフトを用いて、コンセンサスシーケンスを得た。
（２）得られた配列をＮＣＢＩホームページのＢＬＡＳＴＮ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）にて既存のＤＮＡデータと配列同一性の確認を行った。
（３）データベースにＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｎｒ／ｎｔ）を選択し、検索対象の制限を設定せずに配列同一性を確認した。
7. Sequence analysis and sequence identity and bacterial species discrimination (1) Consensus sequences were obtained for the obtained sequence forward and reverse sequences using MEGA (free software) sequence analysis software.
(2) The obtained sequence is sequence-identical with the existing DNA data on the NCBI homepage BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome). Confirmed.
(3) Nucleotide Collection (nr / nt) was selected for the database, and sequence identity was confirmed without setting restrictions on the search target.
８．配列の解析と配列同一性及び系統樹解析による菌株判別
（１）ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の上記表２に示されるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列をダウンロードし、解析した遺伝子とそれぞれの遺伝子の配列比較し、今回解析した遺伝子の配列と長さを合わせるために前後の余分な部分を削除した。
（２）長さをそろえた遺伝子の配列を用いて、それぞれの菌株のｆｕｓＡ遺伝子配列の後ろにｌｅｐＡ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工した。
（３）加工して作成した遺伝子配列に関して、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。系統樹解析の結果ＣＰ２３０５株は上記ＧｅｎｅＢａｎｋ登録のすべての菌株とは配列が異なることが判明した。図２及び図３の系統樹は上述したとおりである。
8. Strain discrimination by sequence analysis, sequence identity and phylogenetic tree analysis (1) Accession No. 2 shown in Table 2 above registered in GeneBank. The sequence was downloaded, the sequence of the analyzed gene was compared with the sequence of each gene, and the extra parts before and after were deleted in order to match the sequence and length of the gene analyzed this time.
(2) Using the gene sequences of the same length, the lepA gene sequence was linked after the fusA gene sequence of each strain, and each strain was processed into one gene sequence.
(3) Regarding the gene sequence created by processing, a phylogenetic tree was analyzed using sequence analysis software such as MEGA to create a phylogenetic tree. As a result of phylogenetic tree analysis, it was found that the CP2305 strain had a different sequence from all the strains registered in GeneBank. The phylogenetic trees of FIGS. 2 and 3 are as described above.
［実施例１］
試料であるサンプル飲料として、２５℃で６カ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した。この試料に対し、プライマー対（１）〜（７）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行い、得られた７種類のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。その結果を図４及び図５に示す。図４中レーン１〜３が、それぞれプライマー対（１）〜（３）によるＰＣＲ産物を示す。また、図５中レーン８、６、４及び２が、それぞれサンプル飲料のＲＮＡを利用してプライマー対（４）〜（７）を用いて得られたＰＣＲ産物を示す。なお、図５中レーン７、５、３及び１は、培養したＣＰ２３０５菌体のＲＮＡを利用してプライマー対（４）〜（７）を用いて得られたＰＣＲ産物を示す（ポジティブコントロール）。
[Example 1]
As a sample beverage as a sample, a PET bottled body Calpis (registered trademark) stored at 25 ° C. for 6 months was used. This sample was PCRed for each of the primer pairs (1) to (7) in separate containers, and the obtained 7 types of PCR products were electrophoresed on an agarose gel according to a conventional method. The results are shown in FIGS. 4 and 5.
［実施例２］
実施例１で得られた各ＰＣＲ産物を用いてシークエンスサンプルを作製し、塩基配列のシークエンス解析及びＢＬＡＳＴ解析を行った。
＜ｆｕｓＡ遺伝子配列について＞
実施例１のサンプルのプライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１３の配列とが同一であり、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２３の配列とが同一であることを確認した。
＜ｌｅｐＡ遺伝子配列について＞
実施例１のサンプルの前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３３の配列とが同一であり、前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３４の配列とが同一であることを確認した。また、実施例１のサンプルの前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号５３の配列とが同一であり、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号６４の配列とが同一であり、実施例１のサンプルの前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号７３の配列とが同一であることを確認した。
実施例１のサンプルの含まれる当該の配列を持つ菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉである可能性が極めて高いことが明らかになった。
[Example 2]
Sequence samples were prepared using each PCR product obtained in Example 1, and sequence analysis and BLAST analysis of the base sequence were performed.
<About the fusA gene sequence>
The sequence of the region amplified by the primer pair (1) of the sample of Example 1 (excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 13 are the same, and the sequence of the region amplified by the primer pair (2) (excluding the primer sequence). It was confirmed that the sequence of SEQ ID NO: 23 (excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 23 are the same.
<About lepA gene sequence>
The sequence of the region amplified by the primer pair (3) (excluding the primer sequence) of the sample of Example 1 and the sequence of SEQ ID NO: 33 are the same, and the sequence of the region amplified by the primer pair (4) It was confirmed that (excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 34 are the same. Further, the sequence of the region amplified by the primer pair (5) (excluding the primer sequence) of the sample of Example 1 and the sequence of SEQ ID NO: 53 are the same, and the region amplified by the primer pair (6). (Excluding the primer sequence) and the sequence of SEQ ID NO: 64 are the same, and the sequence of the region amplified by the primer pair (7) of the sample of Example 1 (excluding the primer sequence) and SEQ ID NO: 73. It was confirmed that the sequence was the same.
The bacterial species having the relevant sequence included in the sample of Example 1 is L. It became clear that the possibility of gasseri was extremely high.
［実施例３］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株についてプライマー対（１）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（３）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（４）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（６）によるＰＣＲ産物の塩基配列をつなぎ合わせて、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。また同様に、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、それぞれの菌株ごとのｆｕｓＡ遺伝子配列の後ろにｌｅｐＡ遺伝子配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。結果を図２に示す。図２からも分かるように本試験で解析した実施例１のサンプルから得られたＤＮＡ配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のＤＮＡ由来の配列と１００％一致し、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ種の他の株を含む１０株とは配列が異なることが分かり、サンプルに含まれる菌株はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であることが明らかになった。
[Example 3]
<Creation of phylogenetic tree>
L. Nucleotide sequence of PCR product by primer pair (1), base sequence of PCR product by primer pair (3), base sequence of PCR product by primer pair (4), base sequence of PCR product by primer pair (6) for gasseri CP2305 strain The sequences were spliced together and connected in silico to prepare a fusion gene sequence. Similarly, the Accession No. of Table 2 registered in GeneBank. Download the sequence and L. In each strain of gasseri, the length of the gene sequence of the region that can be amplified by the above primer set was matched, and the lepA gene sequence was connected in silico after the fusA gene sequence for each strain to prepare a fusion gene sequence. .. A phylogenetic tree was created by processing each strain into a single gene sequence to create comparative sequence data, and performing phylogenetic tree analysis using MEGA6 sequence analysis software. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 2, the DNA sequence obtained from the sample of Example 1 analyzed in this test is L.I. It was 100% consistent with the DNA-derived sequence of gasseri CP2305 strain, and L. It was found that the sequence was different from that of 10 strains including other strains of gasseri species, and the strains contained in the sample were L. It was revealed that it was a gasseri CP2305 strain.
［実施例４］
試料であるサンプル飲料として、以下の４種類を準備し、それぞれのサンプルについてｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）及びｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行った。
サンプル（ア）：ペットボトル入りのＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株含有飲料／製造直後
サンプル（イ）：ペットボトル入りのＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株含有飲料／２５℃で９ヶ月間（賞味期限）保存後
サンプル（ウ）：ペットボトル入りのＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株含有飲料／２５℃で９ヶ月間（賞味期限）保存後
サンプル（エ）：培養したＣＰ２３０５菌末から得られたＲＮＡ（ポジティブコントロール）
[Example 4]
The following four types of sample beverages are prepared as samples, and for each sample, a primer pair (8) for amplifying a part of the fusA gene sequence and a primer pair (8) for amplifying a part of the lepA gene sequence ( PCR was performed in separate containers for each of 9).
Sample (A): L. in a PET bottle. Beverage containing gasseri CP2305 strain / Immediately after production Sample (a): L. Beverage containing gasseri CP2305 strain / After storage at 25 ° C for 9 months (expiration date) Sample (c): L. in a PET bottle. Beverage containing gasseri CP2305 strain / After storage at 25 ° C for 9 months (expiration date) Sample (d): RNA (positive control) obtained from cultured CP2305 bacterial powder
上記４種類のサンプル（ア）〜（エ）から得られた各２種のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。その結果を図６に示す。図６中レーン１がサンプル（ア）のプライマー対（８）によるＰＣＲ産物を示し、レーン２がサンプル（イ）のプライマー対（８）によるＰＣＲ産物を示し、レーン３がサンプル（ウ）のプライマー対（８）によるＰＣＲ産物を示し、レーン４がサンプル（エ）のプライマー対（８）によるＰＣＲ産物を示し、レーン５がサンプル（ア）のプライマー対（９）によるＰＣＲ産物を示し、レーン６がサンプル（イ）のプライマー対（９）によるＰＣＲ産物を示し、レーン７がサンプル（ウ）のプライマー対（９）によるＰＣＲ産物を示し、レーン８がサンプル（エ）のプライマー対（９）によるＰＣＲ産物を示す。増幅される鎖長はｆｕｓＡ遺伝子配列増幅用のプライマー対（８）で１５７ｂｐであり、ｌｅｐＡ遺伝子配列増幅用のプライマー対（９）で１６５ｂｐであった。
この結果から、プライマー対（８）及び（９）によって得られるＤＮＡ配列は、比較的短いため、２５℃で長期間保存した後のサンプルであっても、ＰＣＲ産物が得られることが分かった。
Each of the two PCR products obtained from the above four samples (a) to (d) was electrophoresed on an agarose gel according to a conventional method. The result is shown in FIG. In FIG. 6,
From this result, it was found that since the DNA sequences obtained by the primer pairs (8) and (9) are relatively short, a PCR product can be obtained even in a sample after long-term storage at 25 ° C.
［実施例５］
実施例４で得られた各ＰＣＲ産物を用いてシークエンスサンプルを作製し、塩基配列のシークエンス解析及びＢＬＡＳＴ解析を行った。
＜ｆｕｓＡ遺伝子配列について（図６のレーン１〜４）について＞
サンプル（ア）〜（エ）のそれぞれのプライマー対（８）を用いて得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析結果は全て同じであった。そして、得られたシークエンス解析に基づくＢＬＡＳＴ解析の結果、配列同一性が高かった上位９個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その相同性は９８−９９％であった。またそれ以外にＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが確認できたが、その相同性は９２−９４％程度であった。以上のことから解析配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉのｆｕｓＡ遺伝子であると予測された。
＜ｌｅｐＡ遺伝子配列について（図６のレーン５〜８）について＞
サンプル（ア）〜（エ）のそれぞれのプライマー対（９）を用いて得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析結果は全て同じであった。そして、得られたシークエンス解析に基づくＢＬＡＳＴ解析の結果、配列同一性が高かった上位１０個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その相同性は９５−９９％であった。また１１位以降の菌種はＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓなどのその他の菌種であり、最も相同性が高くても９１％程度であった。以上のことから解析配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉのｌｅｐＡ遺伝子であると考えられた。
以上の結果から、サンプル（ア）〜（エ）に含まれる当該の配列を持つ菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉである可能性が極めて高いことが明らかになった。
[Example 5]
Sequence samples were prepared using each PCR product obtained in Example 4, and sequence analysis and BLAST analysis of the base sequence were performed.
<About the fusA gene sequence (
The results of sequence analysis of the PCR products obtained using the respective primer pairs (8) of the samples (a) to (d) were the same. Then, as a result of BLAST analysis based on the obtained sequence analysis, the top 9 bacterial species having high sequence identity were L. It was gasseri, and its homology was 98-99%. In addition to that, L. jonsoni, L. et al. Helveticus, L. et al. Although acidofilus and the like could be confirmed, the homology was about 92-94%. From the above, the analysis sequence is L. It was predicted to be the fusA gene of gasseri.
<About the lepA gene sequence (
The results of sequence analysis of the PCR products obtained using the respective primer pairs (9) of the samples (a) to (d) were the same. Then, as a result of BLAST analysis based on the obtained sequence analysis, the top 10 bacterial species having high sequence identity were L. It was gasseri, and its homology was 95-99%. In addition, the bacterial species after the 11th place are L. jonsoni, L. et al. Helveticus, L. et al. It is another bacterial species such as amylovorus, and the highest homology was about 91%. From the above, the analysis sequence is L. It was considered to be the lepA gene of gasseri.
From the above results, the bacterial species having the relevant sequence contained in the samples (a) to (d) are L. It became clear that the possibility of gasseri was extremely high.
［実施例６］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株について実施例４で使用したプライマー対（８）を用いて増幅したｆｕｓＡ遺伝子配列の下流にプライマー対（９）を用いて増幅したｌｅｐＡ遺伝子配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列（配列番号１０３）を作成した。また、同様に、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＬ．ｇａｓｓｅｒｉ株を含む１０株のそれぞれについても同様に、プライマー対（８）を用いて増幅したｆｕｓＡ遺伝子配列の下流にプライマー対（９）を用いて増幅したｌｅｐＡ遺伝子配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列（配列番号１０４〜１１２）を作成した。作成した融合遺伝子配列群を用いて、ＭＥＧＡ６によりＮｅｉｂｅｒｈｏｏｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ法にて系統樹を作成した。結果を図３に示す。図３からも分かるように本試験で解析したすべてのサンプル（ア）〜（エ）から得られたＤＮＡ配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のＤＮＡ由来の配列と１００％一致し、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ種の他の株を含む１０株とは配列が異なることが分かり、サンプル（ア）〜（エ）に含まれる菌株はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であることが明らかになった。
[Example 6]
<Creation of phylogenetic tree>
L. For the gasseri CP2305 strain, the lepA gene sequence amplified using the primer pair (9) is connected in silico downstream of the fusA gene sequence amplified using the primer pair (8) used in Example 4, and the fusion gene sequence ( SEQ ID NO: 103) was created. Similarly, L.A. registered in GenBank. Similarly, for each of the 10 strains including the gasseri strain, the lepA gene sequence amplified using the primer pair (9) is connected and fused in silico downstream of the fusA gene sequence amplified using the primer pair (8). Gene sequences (SEQ ID NOs: 104-112) were prepared. Using the prepared fusion gene sequence group, a phylogenetic tree was prepared by the Neiberhood-joining method using MEGA6. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 3, the DNA sequences obtained from all the samples (a) to (d) analyzed in this test are L.I. It was 100% consistent with the DNA-derived sequence of gasseri CP2305 strain, and L. It was found that the sequence was different from the 10 strains including other strains of gasseri species, and the strains contained in the samples (a) to (d) were L. It was revealed that it was a gasseri CP2305 strain.
Claims (7)
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な５０ｂｐ〜４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
ｉｖ）前記プライマーセット中の各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的微生物が存在していたと決定する工程、
を含み、
前記プライマーセットが、
・プライマー対（１）、（３）、（４）及び（６）からなるプライマーセット（Ａ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（１）、（３）、（４）及び（７）からなるプライマーセット（Ｂ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
・プライマー対（１）、（３）、（５）及び（６）からなるプライマーセット（Ｃ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（１）、（３）、（５）及び（７）からなるプライマーセット（Ｄ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
・プライマー対（２）、（３）、（４）及び（６）からなるプライマーセット（Ｅ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（２）、（３）、（４）及び（７）からなるプライマーセット（Ｆ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
・プライマー対（２）、（３）、（５）及び（６）からなるプライマーセット（Ｇ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（２）、（３）、（５）及び（７）からなるプライマーセット（Ｈ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットである、
前記方法。 A method for detecting Lactobacillus gasseri (L. gasseri) in a sample as a detection target microorganism, and the following steps:
i) Step of extracting RNA from a sample,
ii) A step of synthesizing cDNA using the RNA extracted in i) as a template.
cDNA as a template synthesized in iii) ii), a step of performing PCR using a primer set consisting of the detection target microorganisms characteristic 5 bp to 4 50 bp of gene region capable of amplifying two or more sets of primer pairs, And iv) Detected in the sample when any of the sequences in the region amplified by each primer pair in the primer set is identical to each of the sequences of the detection target microorganism amplified by the same primer pair. The process of determining that the target microorganism was present,
Only including,
The primer set
-Primer set (A) consisting of primer pairs (1), (3), (4) and (6)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and
Reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and
Reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and
Reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and
Reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
-Primer set (B) consisting of primer pairs (1), (3), (4) and (7)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and
Reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and
Reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and
Reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and
Reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
-Primer set (C) consisting of primer pairs (1), (3), (5) and (6)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and
Reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and
Reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and
Reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and
Reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
-Primer set (D) consisting of primer pairs (1), (3), (5) and (7)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (1):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and
Reverse primer CTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC (SEQ ID NO: 2);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and
Reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and
Reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and
Reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
-Primer set (E) consisting of primer pairs (2), (3), (4) and (6)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and
Reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and
Reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and
Reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and
Reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
-Primer set (F) consisting of primer pairs (2), (3), (4) and (7)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and
Reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and
Reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (4):
Forward primer TGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG (SEQ ID NO: 6) and
Reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and
Reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
-Primer set (G) consisting of primer pairs (2), (3), (5) and (6)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and
Reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and
Reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and
Reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (6):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and
Reverse primer GTACCACATCCATATGAAGCAATC (SEQ ID NO: 10)
-Primer set (H) consisting of primer pairs (2), (3), (5) and (7)
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (2):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and
Reverse primer TGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC (SEQ ID NO: 3);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (3):
Forward primer CGGGGTYGTTTTATCGGTTCG (SEQ ID NO: 4) and
Reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (5):
Forward primer CCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG (SEQ ID NO: 8) and
Reverse primer TTCTCCGCGTTTTCGTTGACA (SEQ ID NO: 7);
Primer pair for amplifying a part of the lepA gene sequence (7):
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and
Reverse primer CAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA (SEQ ID NO: 11)
At least one primer set selected from the group consisting of
The method.
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）
を用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号８３の配列と同一であり、かつ、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号９３の配列と同一である場合に、前記試料中にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。 It is a method for detecting the lactic acid bacterium Lactobacillus gasseri CP2305 strain in a sample.
i) Step of extracting RNA from a sample,
ii) A step of synthesizing cDNA using the RNA extracted in step i) as a template.
iii) Using the cDNA synthesized in step ii) as a template
A primer set (Z) consisting of a primer pair (8) and (9):
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (8):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CACCATCAAGCATCATTTGAACAC (SEQ ID NO: 12);
In addition, a primer pair (9) for amplifying a part of the lepA gene sequence:
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5)
And the process of performing PCR using
iv) The sequence of the region amplified by the primer pair (8) (excluding the primer sequence) is the same as the sequence of SEQ ID NO: 83, and the sequence of the region amplified by the primer pair (9) (primer sequence). When is the same as the sequence of SEQ ID NO: 93, L. The process of determining that the gasseri CP2305 strain was present,
The method described above.
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）。 L.A. contains a primer set (Z) consisting of the following primer pairs (8) and (9). gasseri CP2305 strain detection kit:
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (8):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CACCATCAAGCATCATTTGAACAC (SEQ ID NO: 12);
In addition, a primer pair (9) for amplifying a part of the lepA gene sequence:
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5).
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）。 Primer set (Z) consisting of the following primer pairs (8) and (9):
Primer pair for amplifying a part of the fusA gene sequence (8):
Forward primer GGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT (SEQ ID NO: 1) and reverse primer CACCATCAAGCATCATTTGAACAC (SEQ ID NO: 12);
In addition, a primer pair (9) for amplifying a part of the lepA gene sequence:
Forward primer GCGCTGAAAATCCAACTG (SEQ ID NO: 9) and reverse primer AAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC (SEQ ID NO: 5).
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