JP6888974B2

JP6888974B2 - Ｃｙｐ２ａ１３阻害活性を有する化合物及びｃｙｐ２ａ１３阻害剤

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Publication number: JP6888974B2
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Inventors: 宮澤　三雄; 三雄宮澤
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Publication date: 2021-06-18
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Description

本発明は、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有する化合物及びＣＹＰ２Ａ１３阻害剤に関する。

シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は主に肝臓に含まれる酵素であり、ヒトの薬物代謝反応の約８割に関与するといわれている。ＣＹＰは脂溶性基質を酸化することで水溶性を高め、体外へ排出しやすくする役割を果たしている。

ＣＹＰ２Ａ１３は、３種存在するＣＹＰ２Ａファミリーの１つであり、鼻の粘膜、気道、及び肺等の呼吸器官に発現するアイソザイムである。ＣＹＰ２Ａ１３は、タバコの主成分であるニコチンを代謝する酵素であり、ニコチンを中間体であるイミニウムイオンへと代謝する。このイミニウムイオンはさらにアルデヒドオキシダーゼにより、最終生成物であるコチニンへ代謝される。また、ＣＹＰ２Ａ１３は、たばこに含有されている前駆体変異原物質である４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）を代謝し、活性化することが知られている。

喫煙者においてニコチンの代謝による消失は、集中力の欠如や不安、不眠などの離脱症状をもたらし、これらの症状を解消するため喫煙を繰り返し、ニコチン濃度を維持しようする。このように喫煙を繰り返すことにより、ＮＮＫが代謝され、結果的に発癌リスクが高まることとなる。

これまでに、本出願人は単環性モノテルペン化合物である（＋）−ネオメントール、双環性モノテルペン化合物である（−）−ミルテナール等がＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有し、ＣＹＰ２Ａ１３阻害剤として使用できることを報告している（下記特許文献１参照）。

一方、モノテルペン以外にもＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有する化合物及びＣＹＰ２Ａ１３阻害剤の開発が要望されている。

特許第５７３０３５５号公報

本発明は、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有する化合物及びＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねてきた。その研究過程において、林檎、バラ、コーヒー、ワイン等の主要な香気成分であるβ−ダマセノンに着目し、β−ダマセノンの生物変換（biotransformation）により生成する化合物が、ＣＹＰ２Ａ１３
阻害活性を有していることを見出した。
本発明者らは、さらに研究を進め、ある種の特定ヨノン系化合物及びセスキテルペン化合物についても優れたＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有していることを見出した。本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。

即ち、本発明は、以下のＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有する化合物及びＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を包含する。

項１．下記式（１）又は（２）で表される化合物。

項２．項１に記載の化合物、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン、γ−イロン、（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド、バレンセン、酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル、酢酸ミルテニル、シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールからなる群より選ばれた少なくとも１種を含有するＣＹＰ２Ａ１３阻害剤。

項３．項１に記載の化合物、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（−）−カリオフィレンオキサイド、酢酸ボルニル、β−シクロシトラール及びサフラナールからなる群より選ばれた少なくとも１種を含有する上記項２に記載のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤。

項４．項２又は３に記載のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を含有する喫煙回数低減剤。

項５．項２又は３に記載のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤とニコチンとを含む製剤。

項６．項１に記載の化合物の製造方法であって、β−ダマセノンを黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌により生物変換する製造方法。

本発明の式（１）及び式（２）で表される化合物は新規化合物であり、高いＣＹＰ２Ａ
１３阻害活性を有している。そのため、式（１）、式（２）で表される化合物等を含むＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を用いることによって、ニコチン代謝を遅らせ、体内のニコチン濃度を長期間維持することができるため、結果的に喫煙量を減らすことができる。

実施例で培養したアスペルギルス・ニガーによるβ−ダマセノンの生物変換の経時的変化を示す図である。実施例で得られた化合物１の^１ＨＮＭＲ及び^１３ＣＮＭＲのスペクトルデータを示す図である。実施例で得られた化合物２の^１ＨＮＭＲ及び^１３ＣＮＭＲのスペクトルデータを示す図である。２−ヒドロキシ−β−ダマセノン、３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコン、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン及びβ−ダマセノンのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。 γ−イオノン、α−ダマセノン及びγ−ダマセノンのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。 α−イロン、β−イロン及びγ−イロンのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン及び（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オールのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド及びバレンセンのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル及び酢酸ミルテニルのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールのＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を示すグラフである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、下記式（１）又は（２）で表される化合物である。

上記式（１）で表される化合物は、２−ヒドロキシ−β−ダマセノン（以下、「化合物１」ともいう）であり、上記式（２）で表される化合物は、３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコンである（以下、「化合物２」ともいう）。

化合物１及び化合物２は、次に示すようにβ−ダマセノンを生物変換（biotransformation）することにより代謝産物として製造される。

β−ダマセノンの生物変換には、黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌（ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、具体的にはアスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ４４１４が用いられる。アスペルギルス・ニガーＮＢＲＣ４４１４は（独）製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＩＴＥＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ）から購入可能である。

生物変換の具体的な方法としては、アスペルギルス・ニガーの培養培地に、基質であるβ−ダマセノンを添加して、培養することにより行うことができる。培養に用いられる培地としては、アスペルギルス・ニガーが利用し得る栄養源を含むものであれば液状でも固状でもよい。この培地には、アスペルギルス・ニガーを培養するために必要な物質、例えば、アスペルギルス・ニガーが同化し得る炭素源、消化し得る窒素源及び無機物等が適宜配合される。培地のｐＨ及び温度条件は、アスペルギルス・ニガーの育成に好適な範囲であればどのような条件でも使用することができる。例えば、温度２８℃程度で２〜７日間培養することが好ましい。

生物変換の後、代謝産物を分離又は抽出し、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィー又はシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することにより、化合物１及び化合物２を得ることができる。

化合物１及び化合物２は、以下の実施例で示すように、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有している。化合物１及び化合物２はそのままＣＹＰ２Ａ１３阻害剤として用いることが可能
である。

また、以下の実施例で示すように、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン、γ−イロン、（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド、バレンセン、酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル、酢酸ミルテニル、シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールはＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有している。

α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン及びγ−イロンは、ヨノン系化合物である。

上記したヨノン系化合物の中でも、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性の観点から、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノンが好ましい。

（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド及びバレンセンはセスキテルペン化合物である。

上記したセスキテルペン化合物の中でも、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性の観点から、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（−）−カリオフィレンオキサイドが好ましい。

酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル及び酢酸ミルテニルは、環状モノテルペンアセテート化合物である。

上記した環状モノテルペンアセテート化合物の中でも、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性の観点から、酢酸ボルニルが好ましい。

シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールは、モノテルペンアルデヒド化合物である。

上記したモノテルペンアルデヒド化合物の中でも、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性の観点から、β−シクロシトラール及びサフラナールが好ましい。

上記したヨノン系化合物、セスキテルペン化合物、環状モノテルペンアセテート化合物又はモノテルペンアルデヒド化合物は、種々の植物の精油成分として知られていることから、安全かつ入手が容易である。本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、上記したヨノン系化合物、セスキテルペン化合物、環状モノテルペンアセテート化合物又はモノテルペンアルデヒド化合物を含む精油をも包含する。例えば、γ−イオノン、（＋）−アロマデンドレン、バレンセン、ヌートカトン、酢酸ボルニル、等は、それぞれタマリンド、ユーカリ、オレンジ、グレープフルーツ、ヒノキ、レモングラス等の植物から単離することができる。

上記のヨノン系化合物、セスキテルペン化合物、環状モノテルペンアセテート化合物又はモノテルペンアルデヒド化合物を含む植物からの精油は、公知の方法を用いて抽出することができる。その抽出方法は、該当する植物を、そのまま抽出に供することができるが、より細かく粉砕した後、抽出に供するのが好ましい。

抽出溶媒としては、特に限定的ではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等のグリコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；水等を用いることができる。これらの抽出溶媒は、一種単独又は二種以上を混合して用いることができる。特に、メタノール、エタノール等のアルコール類、及び酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いることが、取り扱いが容易であり、しかも優れた活性を有する抽出物を得ることができる点で好ましい。

上記した方法によって抽出物を得た後、必要に応じ、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離することによって、抽出液を得ることができる。本発明では、得られた抽出液をそのままＣＹＰ２Ａ１３阻害剤として用いることが可能であるが、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性をさらに高めるため、適宜濃縮又は溶媒を留去して、エキス状や粉末状として用いることもできる。

本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、ＣＹＰ２Ａ１３の発現あるいは酵素活性を抑制することで、ニコチンを代謝させず、あるいは代謝速度を低下させることで体内に長く留まらせることができ、結果的に喫煙者の喫煙回数を減らす働きを有する。そのため、喫煙回数低減剤として有用である。

また、本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を用いて喫煙者の喫煙回数を低減させることにより、結果的に４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）の吸入量を低減させることができる。さらに、ＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、ＣＹＰ２Ａ１３の発現あるいは酵素活性を抑制することで、体内でＮＮＫの代謝及び活性化を抑制する働きを有する。そのため、発癌リスクを低減できる禁煙補助剤としても有効である。

本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、従来慣用されている方法により、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の剤に製剤化することができる。製剤化には通常用いられている賦形剤、結合剤、潤沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分及び配合量を適宜選択して常法により製剤化される。

本発明の製剤を投与する場合、その投与形態は特に限定されず、通常用いられる方法であればよく、例えば、経口、経皮、経肺、吸入、局所、直腸等のいずれでもよい。好適には、チューインガム、点鼻スプレー、口内スプレー、うがい薬、経皮パッチ等の形態が例示される。特に、経皮スキンパッチの形態、ネブライザー等によるエアロゾール投与、ディフューザーによる空間への噴霧等で用いることが好適である。

本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤は、ニコチンとともに用いて、ニコチンを代謝させず、あるいは代謝速度を低減させることによりニコチンを体内に長く留まらせ、喫煙者の喫煙衝動をより低減することができる。例えば、公知のニコチン製剤（例えば、チューインガム、点鼻スプレー、口内スプレー、うがい薬、経皮パッチ等）とともに上記したＣＹＰ２Ａ１３阻害剤の製剤を併用することができる。また、製剤中にＣＹＰ２Ａ１３阻害剤とニ
コチンを含有していてもよい。

喫煙者の喫煙回数を低減させるため、フィルター付タバコのフィルターに本発明のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を含有させることもできる。また、喫煙ルームなどにおいて、ディフューザーを用いて空間に噴霧することも可能である。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。

実施例１
黒色｛こくしょく｝アスペルギルス菌（アスペルギルス・ニガー）の培養
１Ｌ三角フラスコに蒸留水５００ｍｌ中に、ショ糖（７．５ｇ）、グルコース（７．５ｇ）、ポリペプトン（２．５ｇ）、塩化カリウム（２５０ｍｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（２５０ｍｇ）、リン酸二水素カリウム（０．５ｇ）及び硫酸鉄(ＩＩ)七水和物（５ｍｇ）を含むオートクレーブした培養液を調製した。さらに、４℃で寒天培地上で保持した黒色｛こくしょく｝アスペルギルスＮＢＲＣ４４１４(（独）製品評価技術基盤機構
バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）から購
入)の胞子を添加し、３日間培養した。

β−ダマセノンの代謝化合物の製造
前記培養した培地に、基質であるβ−ダマセノン（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ社から入手）を添加（基質濃度は０．５〜５０ｍｇ／ｍＬ）した。β−ダマセノンを添加した培地を２８℃で７日間振盪培養し、培地及び菌糸体を濾過することにより分離した。分離した菌糸体は、ｐＨ４まで酸性にし、酢酸エチルで抽出した。得られた抽出物を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４によって乾燥し、減圧することによって酢酸エチルを除去した。

ここで、β−ダマセノンの代謝産物の存在を確認するために、１日１回薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及びガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を行った。

ＴＬＣ分析は、シリカゲル６０ＧＦ２５４を塗布したＴＬＣプレート(メルク社製、層
厚０．２５ｍｍ)を用いて行った。

ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）は、スプリット注入器、キャピラリーカラム（ＨＰ−５ＭＳ、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ）を備えたガスクロマトグラフ（ＨＰ−５８９０Ａ、ヒューレット−パッカード社製）を、質量分析計（５９７２Ａ、ヒューレット−パッカード社製）に直結した装置で行った。昇温プログラムはＧＣと同一にした。キャリヤーガスとしてヘリウムを１．０ｍＬ／分の流量で用いた。イオン源部の温度は２８０℃であり、電子エネルギーは７０ｅＶであった。イオン化法は電子衝撃法（ＥＩ）を使用した。

また、β−ダマセノンの代謝産物の存在を確認するために、酢酸エチルで抽出した抽出物をＧＣ−ＭＳで分析した結果、２つの代謝物（化合物１及び化合物２）のピークを確認することができた。

図１に、培養したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒによるβ−ダマセノンの生物変換の経時的変化を示す。図１におけるプロット（●）はβ−ダマセノンを表し、プロット（▲）は化合物１を表し、プロット（■）は化合物２を表す。β−ダマセノンを７日間生物変換することにより、化合物１を約４０％の収率で得ることができ、化合物２を約６０％の収率で得ることができた。

化合物１及び化合物２の構造決定
化合物１及び化合物２の構造を決定する目的で、ＨＲＥＩＭＳ、ＩＲ、^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。

ＨＲＥＩＭＳの測定には、日本電子株式会社製ＪＥＯＬｔｈｅＴａｎｄｅｍＭＳ
ｓｔａｔｉｏｎＪＭＳ−７００を使用した。

ＩＲ（赤外線吸収）スペルトルの測定には、日本分光株式会社製のＪＡＳＣＯＦＴ／ＩＲ−４７０ｐｌｕｓフーリエ変換赤外分光光度計を使用した。

核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ）は、日本電子株式会社製ＪＥＯＬＥＣＡ−８００（８００ＭＨｚ）分光計を用い、ＣＤＣｌ_３中で測定し、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準物質として使用して測定した。

化合物１の物性は下記の通りである。
ＨＲＥＩＭＳ：ｍ／ｚ（ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，％）２０６．１３０７（Ｍ^＋，８），１９１（４），１７３（１５），１３７（１８），９１（１９），７７（１４），６９（１００），４１（６３），４３（３６）；
ＩＲ（ν_ｍａｘ，ｆｉｌｍ，ｃｍ^−１）：３３７７，２９５４，２９２１，２８５７，１６３８，１４３９，１０６７，１０２０，９６０
化合物１の^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルデータを図２に示す。

ＨＲＥＩＭＳでは、ｍ／ｚ２０６．１３０７に分子イオンピークが確認され、化合物１の分子量が２０６．１３０７であり、組成式がＣ_１３Ｈ_１８Ｏ_２であることが示唆された。ＩＲスペクトルデータより、水酸基（３３７７ｃｍ^−１，１０６７ｃｍ^−１）、カルボニル基（１６３８ｃｍ^−１）及び二重結合（１０２０ｃｍ^−１，９６０ｃｍ^−１）の存在が示唆された。

さらに、部分構造を決定するため、２次元ＮＭＲとして、ＨＭＢＣ（hetero-nuclear multiple-bond connectivity）を測定した。水酸基の位置について、ＨＭＢＣより、１１
位のメチル基由来のプロトンからＣ−２位への相関が観測され、同様に、４位のメチンプロトンからＣ−２位への相関が観測された。このことから、水酸基の位置を２位と特定した。

以上より、化合物１の構造は、下記式（１）で表されることが判明し、２−ヒドロキシ−β−ダマセノンであると決定した。

化合物１は、新規化合物である。

化合物２の物性は下記の通りである。
ＨＲＥＩＭＳ：ｍ／ｚ（ｒｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，％）２２４．１４１３（Ｍ^＋，４），２０９（９），１５５（２１），１３７（３７），１２３（１２），１０９（２６），８１（１６），６９（１００），４３（３４），４１（４２）；
ＩＲ（ν_ｍａｘ，ｆｉｌｍ，ｃｍ^−１）：３４３５，３０５０，２９６６，１６４１，１４４１，１２９０，１０５０，９７５
化合物２の^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルデータを図３に示す。

ＨＲＥＩＭＳでは、ｍ／ｚ２２４．１４１３に分子イオンピークが確認され、化合物２の分子量が２２４．１４１３であり、組成式がＣ_１３Ｈ_２０Ｏ_３であることが示唆された。ＩＲスペクトルデータより、水酸基（３４３５ｃｍ^−１，１０５０ｃｍ^−１）、カルボニル基（１６４１ｃｍ^−１）及び二重結合（３０５０ｃｍ^−１，９７５ｃｍ^−１）の存在が示唆された。

また、^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルデータより、β−ダマセノンのＮＭＲデータと比較すると、３位及び４位由来のメチンプロトン及びカーボンが消失し、オキシメチン由来のプロトン、カーボンシグナルが観測された。さらに、２次元ＮＭＲとして、ＨＭＢＣを測定することにより、水酸基の位置を３位及び４位に特定した。

以上より、化合物２の構造は、下記式（２）で表されることが判明し、３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコンであると決定した。

化合物２は、新規化合物である。

試験例１（ＨＰＬＣを用いたニコチン代謝分析法）
新規化合物である２−ヒドロキシ−β−ダマセノン及び３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコン；ヨノン系化合物である、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン及びγ−イロン；セスキテルペン化合物である、（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド及びバレンセン；環状モノテルペンアセテート化合物である、酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル及び酢酸ミルテニル；モノテルペンアルデヒド化合物である、シトラール、β−シクロシトラール、ペリラ
アルデヒド及びサフラナールを用いて、以下のニコチン代謝分析を行った。また、ニコチン代謝分析のポジティブコントロールとして、クマリンを使用した。

５μＬのバキュロウイルス組換えＣＹＰ２Ａ１３（２０ｎｍｏｌ／ｍＬ、ＢＤ社製）、１５μＬのプールドヒト肝サイトゾール（０．３ｍｇ／ｍＬ、ＢＤ社製）、５２．５μＬのＮＡＤＰＨ生成系（０．５ｍＭＮＡＤＰ^＋、５ｍＭＧ−６−Ｐ、０．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬＧ−６−ＰＤＨ）、１０μＬのニコチン（５０μＭ）、および５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を混合し、全量を２５０μＬとした。この混合液を３７℃で３０分間反応させた。

阻害剤である２−ヒドロキシ−β−ダマセノン、３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコン、α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン及びβ−ダマセノンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。

阻害剤であるγ−イオノン、α−ダマセノン及びγ−ダマセノンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、５０、２５、１２．５μＭになるように調製した。

阻害剤であるα−イロン、β−イロン及びγ−イロンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１００、５０、２５μＭになるように調製した。

阻害剤である（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド及びバレンセンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。

阻害剤である酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル及び酢酸ミルテニルについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。

阻害剤であるシトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。

ポジティブコントロールであるクマリンについては、ＤＭＳＯに溶解させ、全量２５０μＬの反応系で、１０、５、２．５μＭになるように調製した。

反応後、内部標準物質として２５μＬのトランス−４’−カルボキシコチニンメチルエステル（２５μＭ）および反応停止剤としてアセトニトリル／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）混合溶液を２５０μＬ加えた。反応停止後、４℃、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清をとり、上清を活性化させたＳｅｐ−ＰａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）にてクリーンナップし、ＨＰＬＣによりコチニンの生成量を定量した。ＨＰＬＣ分析条件及び内部標準物質の調整法は以下の通りである。コチニン生成量の結果を図４〜１０に、本実施例で用いた上記化合物のＩＣ_５０値を表１及び表２に示す。

ＨＰＬＣ分析条件
ＳｃｈｅｒｚｏＳＭ−Ｃ１８（３．０×１５０ｍｍ、ｉｍｔａｋｔ社製）を用い、移
動相を１５％アセトニトリル／５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、フローレート（Ｆｌｏｗｒａｔｅ）を０．４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を３７℃とした。検出には、２６０ｎｍのＵＶ波長を用いた。コチニンの生成量はコチニンの絶対検量線を作成し、それより算出した。阻害の評価はそれぞれの５０％阻害濃度であるＩＣ_５０値を求めることにより行った。

内部標準物質の調製法
トランス−４’−カルボキシコチニン（ｔｒａｎｓ−４’−ｃａｒｂｏｘｙｃｏｔｉｎｉｎｅ）(東京化成工業株式会社)３０ｍｇをセトン２０ｍＬに溶解し、ジアゾメタンを２ｍＬ加え室温で２０分間、反応させた。反応後、溶媒を留去し、メチルエステル体であるトランス−４’−カルボキシコチニンメチルエステル（ｔｒａｎｓ−４’−ｃａｒｂｏｘｙｃｏｔｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）３９ｍｇを得た。

図４〜１０及び表１〜２より、本実施例で用いた全ての化合物について、ＣＹＰ２Ａ１３阻害活性を有することが確認できた。ポジティブコントロールとして使用したクマリンについては、ＩＣ_５０値は３．８μＭであった。

ＣＹＰ２Ａ１３の阻害効果では、新規化合物である２−ヒドロキシ−β−ダマセノン及び３，４−ジヒドロキシ−β−ダマスコンが、ポジティブコントロールとして使用したクマリンと同程度の阻害活性を示すことがわかった。

製造例（製剤例）
試験例１で分析を行った２−ヒドロキシ−β−ダマセノンを用いて、下記製造例１〜５の製剤を調製できる。

製造例１（パッチ製剤付着性ゲル）

製造例２（パッチ製剤付着性ゲル）

製造例３（スプレー製剤）

製造例４（スプレー製剤）

製造例５（チューインガム製剤）
下記の組成物Ａを調製する。

上記の組成物Ａを、下記のガムベース及び香料と混合してチューインガムを製造する。

Claims

α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン、γ−イロン、（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド、バレンセン、酢酸ボルニル、酢酸イソボルニル、酢酸ミルテニル、シトラール、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールからなる群より選ばれた少なくとも１種を含有するＣＹＰ２Ａ１３阻害剤。
α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、β−ダマセノン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（−）−カリオフィレンオキサイド、酢酸ボルニル、β−シクロシトラール及びサフラナールからなる群より選ばれた少なくとも１種を含有する請求項１に記載のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤。
請求項１又は２に記載のＣＹＰ２Ａ１３阻害剤を含有する喫煙回数低減剤。
α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、γ−イオノン、α−ダマセノン、γ−ダマセノン、α−イロン、β−イロン、γ−イロン、（＋）−アロマデンドレン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォラン−７α−オール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（＋）−シクロイソロンギフォル−５−オール、（−）−エピセドロール、（＋）−セドリルアセテート、ヌートカトン、（−）−グロブロール、（−）−カリオフィレンオキサイド、バレンセン、酢酸ミルテニル、β−シクロシトラール、ペリラアルデヒド及びサフラナールからなる群より選ばれた少なくとも１種を含有するＣＹＰ２Ａ１３阻害剤とニコチンとを含む製剤。
α−イオノール、β−イオノール、β−ダマスコン、（−）−アロアロマデンドレン、（−）−イソロンギフォロール、（−）−イソロンギフォレン−９−オン、（−）−カリオフィレンオキサイド、β−シクロシトラール及びサフラナールからなる群より選ばれた少なくとも１種を含有するＣＹＰ２Ａ１３阻害剤とニコチンとを含む製剤。