JP6885537B2

JP6885537B2 - トランスケトラーゼ、それを用いた糖の製造方法および酵素活性の測定法

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Publication number: JP6885537B2
Application number: JP2016226804A
Authority: JP
Inventors: 明秀吉原; 和也秋光; 何森　健; 健何森; 耕平大谷
Original assignee: Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Kagawa University NUC; Izumoring Co Ltd
Current assignee: Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Kagawa University NUC; Izumoring Co Ltd
Priority date: 2016-11-22
Filing date: 2016-11-22
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2036-11-22
Also published as: JP2018082645A

Description

本発明は、アルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物に由来する新規トランスケトラーゼ、およびこのトランスケトラーゼの基質特異性を利用する糖の製造方法および製造した糖を測定することによる酵素活性の測定法に関する。

酵素の化合物の製造への利用については、その特異的な反応を利用した各種の酵素反応が提案されてきている。例えば、糖類の製造にも酵素が適用される例が数多く知られている。
一例を挙げると、ケトースの製造には、はアルドースにイソメラーゼを作用させる反応による方法とポリオールを酸化する方法によるのが一般的である。
このアルドースにイソメラーゼを作用させて作る方法としては、例えば、炭素数６のヘキソースであるＤ−フラクトースは、Ｄ−グルコースにＤ−キシロースイソメラーゼを作用させてケトースが大量に製造されている。また、炭素数５のＤ−キシルロースはＤ−キシロースにＤ−キシルロースイソメラーズを作用させることで製造される。これらのイソメラーゼ反応を用いたケトースの製造では、糖を構成する炭素数は不変である。

ポリオールを酸化してケトースを作る方法としては、例えば、炭素数６のヘキソースのＤ−ソルビトールを酸化してＬ−ソルボースを作る。また炭素数５のペントースの場合ではリビトールを酸化してＬ−リブロ―スを作ることができる方法がある。
これらのイソメラーゼを用いる方法、ポリオールを酸化する方法では、炭素数を増加したケトースを作ることはできず、アルドヘキソースからケトヘキソース、アルドペントースからケトペントースを製造するために利用されている。

イソメラーゼを使用する糖の合成方法は、例えば、希少糖の製造に利用されている。希少糖は、自然界には存在しない、あるいはごく微量にしか存在しない単糖で、これまでほとんど研究がされていなかったが、Ｄ−プシコース、Ｄ−アロースの大量製造がイソメラーゼを使用する方法により可能になった。
これは、有用な酵素反応が見出された結果であり、Ｄ−タガトース−３−エピメラーゼ（ＤＴＥ）を利用することにより、希少糖の1種であるＤ−プシコースやＤ−アロースの大量製造技術が確立された。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ（ＩＰＯＤＦＥＲＭＢＰ−０８５９３）由来のＬ−ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を作用させてＤ−アロースへと異性化するＤ−アロースの製造方法（特許文献１）や、Ｄ−プシコースおよび／またはＬ−プシコースを含有する溶液にＤ−キシロースイソメラーゼを作用させて、Ｄ−プシコースからはＤ−アロースとＤ−アルトロースを、Ｌ−プシコースからはＬ−アルトロースを生成せしめ、これらＤ−アロース、Ｄ−アルトロース及びＬ−アルトロースから選ばれる1種または2種以上のアルドヘキソースを採取するアルドヘキソースの製造方法（特許文献２）が提案されている。

これらの技術により希少糖の入手が容易となり希少糖の製造技術の研究や、生理作用、化学的性質に関する研究が促進されて希少糖の特異的な生理作用が次々と解明されてきた。これまでに、希少糖には、例えば、次の生理活性を有することが知られている。
プシコース：希少糖の中で最も開発が進んでおり、果糖を加熱処理することなどにより生じるため、果糖を含む一般的な食品にも少量含まれている。砂糖の7割程度の甘味があり、キレと清涼感のある良質な味質を特徴とするゼロカロリーの糖である。さらに、非虫歯、抗虫歯効果、食後血糖値上昇抑制作用、抗糖尿病作用、内臓脂肪蓄積抑制効果を示すことが報告されている。このように、プシコースはこれまで知られている糖質とは異なり、多くの生理活性を有することから、メタボリックシンドロームの予防、改善が期待される甘味料として注目されている。

アロース：臍帯(さいたい)血中やインドの薬用の海藻に含まれており、プシコース同様に天然の糖である。カロリーゼロで、味質が砂糖に近く甘味度も砂糖の8割程度である。酸化ストレス軽減機能を持つが、カテキンやビタミンCなど還元力を機序とする抗酸化剤とは異なった作用を示す。種々のストレス時に血管内皮など多種多様な細胞から発生する活性酸素を抑制し、活性酸素による細胞障害を防御する。この防御機構によって、血圧上昇抑制、心筋梗塞・脳梗塞などの予防、寿命延長効果などが確認されている。さらに、癌細胞や破骨細胞の分化増殖抑制効果も認められている。そのため、甘味料だけでなく、生活習慣病の予防・改善作用のある医薬品や医療用食品への応用展開も期待されている。
ソルボース：甘味度は砂糖の7割程度である。小腸でのスクラーゼ阻害によって砂糖の分解を抑える効果が強いため、食後血糖値上昇抑制作用を有しており、糖尿病の予防・改善に向けて期待されている甘味料である。

特開２００８−１０９９３３号公報特開２００２−１７３９２号公報国際公開第２０１３／５８００号再表２００４／０６３３６９号公報

炭素数４のテトロースはＤ−グルコースを原料とした酵母による発酵法によりエリトリトールを生産できるので、これを原料として用いることができる。炭素数５のペントースは主にヘミセルロースから得られるＤ−キシロースを原料として用いる。炭素数６のヘキソースはデンプン等から容易に得られるＤ−グルコースがその原料となる。炭素数が７つの単糖（ヘプトース）に関する研究は合成方法が確立していないためほとんど進んでいない。
炭素数７のヘプトースとしては自然界における存在が最初に発見されたのはセドヘプツロースであった。ベンケイソウから１９１７年にその存在が発見された。またアボガド中にＤ−マンノヘプツロース、ボレミトール（Ｄ−グリセロ−Ｄ−タロ−ヘプチロール）の存在が報告されているが、ヘプトースの全部の種類の合成を完成する原料となる量ではない。また、生物界におけるヘプトースの重要な役割としては、カルビン回路における糖代謝において、セドヘプツロース７リン酸が代謝中間体として機能しているのみである。このように炭素数７の構造的に多種類存在するヘプトースの研究はほとんど研究が進んでいない。その理由はテトロース、ペントース、ヘキソースのように多量に入手することができる原料もなく、自然界における役割についてもほとんど存在しないと思わるからである。

本発明は、酵素反応による糖類の製造に関する技術分野において、リン酸化されていないアルドースと、リン酸化されていないケトースを構成する糖類の炭素数には限定されることなく適用可能な新規酵素トランスケトラーゼを提供すること、およびこのトランスケトラーゼの基質特異性を利用する糖の製造方法、ならびに、製造した糖を測定する酵素活性の測定法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、新規酵素トランスケトラーゼおよびそれを用いたケトースの新たな製造方法を提供すること、また、ケトースからなる希少糖の新たな製造方法、炭素数が７、８などの通常の方法では人が手にすることのできないケトースの製造方法の提供を目的とする。さらにまた、トランスケトラーゼの活性測定法は煩雑であるが、容易に正確に短時間で測定することができるトランスケトラーゼの活性測定法を提供することを目的とする。

これまで、トランスケトラーゼが遊離のアルドース、ケトースの反応に関与することは知られていなかったにも関わらず、本発明者らはアルスロバクター
(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物に由来する新規トランスケトラーゼがリン酸化していないアルドースとリン酸化していないケトースに反応して炭素数の多いケトースを製造することを初めて見出し、そのことを基としてさらに研究、開発を続け本発明に到達したものである。
すなわち、本発明は、安全性の高い微生物アルスロバクター
(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物由来の新規トランスケトラーゼに関するものであり、その単離精製されたトランスケトラーゼを用いたケトースの製造方法、基質をリン酸化されていないアルドースとリン酸化していないケトースを用い、トランスケトラーゼを作用させて反応させ、炭素数が増大したケトースを製造する方法を提供するものである。またこの新たな反応を利用することで、トランスケトラーゼの酵素活性の測定として利用できることを提供できる。

本発明は以下の（１）または（２）に記載のトランスケトラーゼを要旨とする。
（１）下記（ａ）から（ｅ）に記載の性質を有するアルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物由来のトランスケトラーゼ。
（ａ）リン酸化されていないアルドースと、リン酸化されていないケトースに作用させると炭素数が増加したリン酸化されていないケトースを生成する活性を有する。
（ｂ）ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定した分子量が９１ｋＤａである。
（ｃ）Ｌ−トレオースとＬ−エリトルロースに作用させＬ−ソルボースを生成する活性を有する。
（ｄ）反応至適ｐＨは７．０から９．０である。
（ｅ）反応至適温度は５０℃である。
（２）アルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物が、アルスロバクターグロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０(寄託番号ＮＩＴＥＢＰ−１１１１)である上記（１）に記載のトランスケトラーゼ。

また、本発明は以下の（３）に記載のＬ−ソルボースの製造方法を要旨とする。
（３リン酸化されていないアルドースとしてＬ−トレオース、リン酸化されていないケトースとしてＬ−エリトルロースに、請求項１または２に記載のトランスケトラーゼを作用させることを特徴とする、炭素数が増加したリン酸化されていないケトースであるＬ−ソルボースの製造方法。

また、本発明は以下の（４）または（５）に記載のトランスケトラーゼの活性測定方法を要旨とする。
（４）リン酸化していないＬ−トレオースとリン酸化していないＬ−エリトルロースを基質とし、Ｌ−ソルボースを生産させることによる、上記（１）または（２）に記載のトランスケトラーゼの活性測定法。
（５）リン酸化していないＬ−トレオース基質を受容体とし、かつリン酸化していないＬ−エリトルロース基質を供与体として、上記（１）または（２）に記載のトランスケトラーゼを作用させ反応を行ないＬ−ソルボースを生産させた後、Ｌ−ソルボースをシステインカルバゾール法によりを検出することを特徴とする上記（４）に記載のトランスケトラーゼの活性測定法。

本発明は以下の効果を奏するものである。
（１）リン酸化されていないアルドースと、リン酸化されていないケトースに作用させると炭素数が増加したリン酸化されていないケトースを生成する活性を有する新規なトランスケトラーゼを提供することができる。本発明の新規なトランスケトラーゼを作用させる反応は、ケトースとアルドースを構成する糖類の炭素数には限定されることなく適用される。
（２）トランスケトラーゼを用いた新たなケトースの製造方法を提供することができる。
（３）これまで製造することが困難であった炭素数の大きなケトースを作ることが可能となり、全く新しいケトースの製造法としても有用であり、炭素数が７、８などの通常の方法では人が手にすることのできないケトースの製造が可能となる。新規トランスケトラーゼを見出したことにより、それを用いた新たなケトースの製造方法を提供することができ、これまで製造することが困難であった炭素数の大きなケトースを容易に製造することが可能となり、全く新しいケトースの製造法として、炭素数が７、８などの通常の方法では人が手にすることのできないケトースの製造が可能となる。
（４）ケトース型の希少糖を製造する方法として有用である。
（５）リン酸化した糖の変換反応を触媒できる酵素として知られているトランスケトラーゼを用いて、リン酸化していない糖の反応の可能性が示されたことにより今後の大きな広がりを示す結果が得られた。
（６）この反応を利用することでトランスケトラーゼの活性測定法に利用できる。トランスケトラーゼ活性測定用反応生成物を簡便に製造する方法および該生成物を用いることによる優れたトランスケトラーゼ活性の測定方法を提供することができる。

従来のトランスケトラーゼによる反応の一例を示す。本発明のトランスケトラーゼによるソルボースの製造例を示す。グルコースよりエリトルロースとトレオースを製造する反応例を示す。トランスケトラーゼの精製を示す。トランスケトラーゼの至適ｐＨおよび温度を示す。エリトルロースの異性化反応による生成物の割合を示す。トランスケトラーゼの反応前後における含有されている糖の種別を示す。実施例３の生産物のＮＭＲスペクトルを示す。標準のＬ−ｓｏｒｂｏｓｅのＮＭＲスペクトルを示す。

本発明は、次の（ａ）から（ｅ）の性質によって特定されるにアルスロバクター属に属する微生物由来のトランスケトラーゼに関するものである。
（ａ）リン酸化されていないアルドースと、リン酸化されていないケトースに作用させると炭素数が増加したリン酸化されていないケトースを生成する活性を有する。
（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約９１ｋＤａである。
（ｃ）Ｌ−トレオースとＬ−エリトルロースに作用させＬ−ソルボースを生成する活性を有する。
（ｄ）反応至適ｐＨは７．０から９．０である。
（ｅ）反応至適温度は５０℃である。

本発明者等は数多く単離した菌株の中に新規なケトース３−エピメラーゼを産生する微生物Ｍ３０株を見出し、Ｍ３０株は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性に基づく系統解析により、アルスロバクターグロビホルミスに属することが判明した（特許文献３）。
菌株の同定は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性により行い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を解析し塩基数７３４を特定した。
この菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。上記特定した塩基数７３４の塩基配列に対し相同性９７％以上であった菌株名と相同性（％）の値からＭ３０株の微生物は、アルスロバクターグロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）であることが決定された。
本発明のトランスケトラーゼを有する菌株であるアルスロバクターグロビホルミス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０は、２０１１年６月２２日付で千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、寄託番ＮＩＴＥＰ−１１１１として寄託し、２０１２年５月２日にブタペスト条約に基づく国際寄託として、寄託番号ＮＩＴＥＢＰ−１１１１として国際寄託した。

トランスケトラーゼは、全ての生物が持つペントースリン酸経路と、光合成のカルビン回路に関与する重要な酵素であり、これら２つの経路で反対方向に進む２つの重要な反応を触媒する。非酸化的なペントースリン酸経路の最初の反応では、補因子のチアミンピロリン酸が５炭素のケトース（Ｄ−キシルロース−５−リン酸）から２つの炭素を受け取り、これを５炭素のアルドース（Ｄ−リボース−５−リン酸）に転移させ、７炭素のケトース（セドヘプツロース−７−リン酸）を形成する。２つの炭素を取られたＤ−キシルロース−５−リン酸は、３炭素のアルドースであるグリセルアルデヒド−３−リン酸になる。カルビン回路では、トランスケトラーゼは逆の反応を触媒し、セドヘプツロース−７−リン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸をアルドースのＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸及びケトースのＤ−キシルロース−５−リン酸に変換する。トランスケトラーゼは遊離のアルドースやケトースを基質として用いるのではなく、リン酸化したアルドース、リン酸化したケトースを基質として反応が進むことが知られている。このようにトランスケトラーゼは遊離のアルドースやケトースを基質とするのではなく、リン酸化したアルドース、リン酸化したケトースを基質として反応が進むことで知られている酵素である。
他の反応例を挙げると、トランスケトラーゼは一般には図１に示すようにＤ−キシルロース−5リン酸とＤ−エリトロース−４リン酸を基質にして反応し、炭素数の多いＤ−フラクトース−６−リン酸とグリセルアルデヒド−３リン酸が製造される。
この反応で注目すべきことはトランスケトラーゼによる反応で炭素数が増えたケトースが製造されることである。

これまで、トランスケトラーゼが遊離のアルドース、ケトースの反応に関与することは知られていなかったにも関わらず、本発明のアルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物に由来する新規トランスケトラーゼは、リン酸化していないアルドースとケトースに反応して炭素数の多いケトースを製造する。
反応例を挙げると、本発明の新規トランスケトラーゼは、図２に示すように、リン酸化していないケトースであるＬ−エリトルロースとリン酸化していないアルドースであるＬ−トレオースをトランスケトラーゼの存在下に反応させてＬ−ソルボースとグリコールアルデヒドを製造する。
この反応では、基質であるケトースを供与体（ｄｏｎｏｒ）といい、アルドースを受容体
（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と言われるが、受容体に供与体から炭素数２のケト基を移動させて結合させることで炭素数の多いケトースを作る反応である。供与体のＬ−エリトルロースは炭素数を２減らしてグリコールアルデヒドとなり、受容体のＬ−トレオースは炭素数を２増加してＬ−ソルボースに変換される。

本発明では、アルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物に由来する新規トランスケトラーゼを、リン酸化されていないアルドースと、リン酸化されていないケトースに作用させ、炭素数が増加したリン酸化されていないケトースを製造することができる。例えば、ケトースからなる希少糖を製造するのに有用な方法を提供することができる。
従来のトランスケトラーゼは、リン酸化されたアルドースとリン酸化されたケトースの反応に利用されていたが、本発明の新規トランスケトラーゼは、リン酸化されていないアルドースとリン酸化されていないケトースの反応に応用するものであり、ケトースを供与体、アルドースを受容体として、炭素数の増加したケトースを製造することできる新規な反応を見出したことによるものである。本発明は、ケトースとアルドースを構成する糖類の炭素数には限定されることなく適用される。

本発明のトランスケトラーゼを用いた反応により希少糖を製造することができる。希少糖とは、国際希少糖学会の定義によれば、「自然界に希にしか存在しない糖」であり、すなわち、自然界における存在量が少ない単糖である。発明者の何森健は、４炭糖、５炭糖、６炭糖についてのイズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）連携図を特許文献４で公表しその有用性を示している。炭素数が４つの単糖（テトロース）は、アルドース４種類、ケトース２種類および糖アルコール３種類ある。炭素数が５つの単糖（ペントース）は、アルドース８種類、ケトース４種類および糖アルコール４種類ある。炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある。
例えば、六炭糖（ヘキソース）には、ケトースの場合はＬ−プシコース、Ｌ−ソルボース、Ｌ−フルクトース、Ｌ−タガトース、Ｄ−タガトース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−プシコースがあり、アルドースの場合は、Ｌ−アロース、Ｌ−グロース、Ｌ−グルコース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−アルトロース、Ｌ−イドース、Ｌ−マンノース、Ｌ−タロース、Ｄ−タロース、Ｄ−イドース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グロース、Ｄ−アロースが挙げられる。
炭素数４のテトロースはＤ−グルコースを原料とした酵母による発酵法によりエリトリトールの生産できるので、これを原料として用いることができる。炭素数５のペントースは主にヘミセルロースから得られるＤ−キシロースを原料として用いる。炭素数６のヘキソースはデンプン等から容易に得られるＤ−グルコースがその原料となる。
炭素数が７つの単糖（ヘプトース）の種類は、炭素数７のアルドヘプトース、ケトヘプトース、ヘプチトールはそれぞれ３２，２６，１６種類存在する。これらのヘプトースに関する研究は合成方法が確立していないためほとんど進んでいない。
炭素数７のヘプトースとしては自然界における存在が最初に発見されたのはセドヘプツロースであった。ベンケイソウから１９１７年にその存在が発見された。またアボガド中にＤ−マンノヘプツロース、ボレミトール（Ｄ−グリセロ−Ｄ−タロ−ヘプチロール）の存在が報告されているがヘプトース全種類の合成を完成する原料となる量ではない。また、生物界におけるヘプトースの重要な役割としては、カルビン回路における糖代謝において、セドヘプツロース７リン酸が代謝中間体として機能しているのみである。このように炭素数７の構造的に多種類存在するヘプトースの研究はほとんど研究が進んでいない。その理由はテトロース、ペントース、ヘキソースのように多量に入手することができる原料もなく、自然界における役割についてもほとんど存在しないと思わるからである。これらのヘプトースの製造は、本発明のトランスケトラーゼを用いた酵素反応を利用して、なされる。本発明は、新規トランスケトラーゼを見出したことにより、これまで製造することが困難であった炭素数の大きなケトースを容易に製造ることが可能となり、全く新しいケトースの製造として、炭素数が７、８などの通常の方法では人が手にすることのできないケトースの製造が可能としたものである。

図２に示した反応例は希少糖の製造例である。リン酸化していないケトースであるＬ−エリトルロースとリン酸化していないアルドースであるＬ−トレオースをトランスケトラーゼの存在下に反応させてＬ−ソルボースとグリコールアルデヒドを製造する。供与体のＬ−エリトルロースは炭素数を２減らしてグリコールアルデヒドとなり、受容体のＬ−トレオースは炭素数を２増加してＬ−ソルボースに変換される。
本発明において、図２に示したトランスケトラーゼによる反応には、ケトースとアルドースが共存する系が必要である。そのためには、まず、両者を含有する系を製造する必要があり、例えば、図３に記載の一連の反応が用いられる。当初の原料としてのＤ−グルコースを微生物モニリエラエスピー（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａｓｐ．）により発酵させてエリトリトールを製造する（Ａ）。
次いで、生成した化合物をアセトバクターアセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ａｃｅｔｉ）ＮＢＲＣ３２８１により酸化することによりＬ−エリトルロースに変換する（Ｂ）。
このＬ−エリトルロースを、エンテロバクターアエロゲネス
（Ｅｍｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＩＫ７（ＩＫ７Ｌ−ＡＩ）由来のＬ−アラビノースイソメラーゼによりＬ−エリトルロースとＬ−トレオースの平衡混合物に変換する（Ｃ）。
こうして製造された両化合物の混合物をトランスケトラーゼにより希少糖であるＬ−ソルボースとグリコールアルデヒドへと反応させる。
上述の合成工程で使用されるＩＫ７Ｌ−ＡＩは、図３に示すように、Ｌ−リブロ―スとＬ−アラビノース間の異性化反応に関与する酵素として知られている。

本発明で用いられるトランスケトラーゼは、アルスロバクターグロビホルミス（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１１１１）のトランスケトラーゼを、遺伝子工学的手法で発現して用いたものである。

[酵素のクローニング]
アルスロバクターグロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０のドラフトゲノム解析結果より推定トランスケトラーゼ遺伝子配列を検索し、4遺伝子を抽出した。それら配列よりPCRプライマーを設計した（TK1F: ATGACCGTCGCCCAC, TK1R: TCATCGGGCGGCCTT, TK2F: ATGCCAACAGATACCGTCCA, TK2R: TCATCGGGCGGCCTTT, TK3F: TGAATCCGACTGCAACCG, TK3R:TTAGTTGGCCGCGGC, TK4F: TGGCACATGTGAAAGAGCA, TK4R: TCAGGACTGGAGTCCGG）。設計したプライマーとＫＯＤＦＸＮｅｏ（東洋紡社）を用いたＰＣＲ法（９４℃、２分、１サイクル、９８℃、１０秒、５５℃、３０秒、６８℃、１分３０秒、３０サイクル）により、アルスロバクターグロビホルミスＭ３０ゲノムからトランスケトラーゼ遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子をｐＱＥ６０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）に挿入し、宿主である大腸菌Ｍ１５菌株を形質転換した。塩基配列は導入プラスミドを単離、精製しシークエンス解析により確認した。これを下に示す方法により大腸菌で発現させ酵素を得た。

また、本発明のトランスケトラーゼは、固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができる。本酵素は、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固定化酵素として、ケトースの製造に用いることができる。

以下に本発明のトランスケトラーゼの精製方法と精製後の酵素の理化学的性質について説明する。
なお、本明細書で使用する場合、「約」は、プラスマイナス１０％を意味する。

1．測定方法
（１）タンパク質定量
タンパク質の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に基づきナカライテクス株式会社製プロテインアツセイＣＢＢ溶液を用いて行った。検量線の作成には標準タンパク質として牛血清アルブミンを用いた。吸光度の測定には日立製分光光度計Ｕ−３２００を用いた。
（２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、分離ゲル１５％、濃縮ゲル４％になるように調整し、
Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って行った。分子量マーカーは、ＳＩＧＭＡ社製の
ＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｔＬｏｗＲａｎｇｅを用いた。

（３）新しいトランスケトラーゼ活性の測定方法
通常トランスケトラーゼの酵素活性の測定は、図１で示されるように、
Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５ｐとＤ−ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ−４ｐを反応させ、生産物であるＤ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６ｐをＨＰＣＬによって測定する。この方法は高価で不安定な基質を用いる必要がある。
一方、本発明では、上述の通り、アルスロバクターグロビホルミス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１１１１）のトランスケトラーゼ遺伝子を、遺伝子工学的手法を用いてクローニングして酵素たんぱく質を得た。その酵素反応は、本発明の酵素反応で作ることが明らかとなったＬ−ソルボースをシステインカルバゾール法により測定した。
この方法は新しいトランスケトラーゼ（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ）の活性測定法として利用できる。

[Ｌ−ｅｒｙｔｈｒｕｌｏｓｅとＬ−ｔｈｒｅｏｓｅを用いる方法の利点]
図２に示されるように、本発明のＬ−エリトルロース（Ｌ−ｅｒｙｔｈｒｕｌｏｓｅ）とＬ−トレオース（Ｌ−ｔｈｒｅｏｓｅ）を用いる反応を用いることで、生産するＬ−ソルボース
（Ｌ−ｓｏｒｂｏｓｅ）を測定する方法は、基質が安価であること、生産物のＬ−ソルボースが感度よく迅速にシステインカルバゾール法によって測定できる。
すなわち、上記のＤ−キシルロース−５リン酸（Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５ｐ）とＤ−エリトロース−４リン酸（Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ−４ｐ）の場合を含め、活性測定は非常に複雑である。ところが本発明で得られた炭素数４のＬ−ｅｒｙｔｈｒｕｌｏｓｅとＬ−ｔｈｒｅｏｓｅとの反応で生成するＬ−ｓｏｒｂｏｓｅは上記式のように反応が進み、Ｌ−ｓｏｒｂｏｓｅをシステインカルバゾール法により容易に活性を感度よく測定できる。この方法によってトランスケトラーゼ（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ）を測定した。

活性測定の条件
１）反応液組成
終濃度
Ｌ−エリトルロース 0.1%
Ｌ−トレオース 0.1%
MgCl ₂ 1 mM
チアミンピロリン酸
（Thiamine pyrophosphate） 1 mM
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
（Sodium phosphate buffer(pH7.0)）50 mM
酵素
（Enzyme）
-------------------------------------
全量（total） 0.5 mL

２）反応条件
上記の組成で３０℃で１０分間酵素反応する。
反応後１０％ＴＣＡ溶液を５０μｌ添加して反応停止、システインカルバゾール法にて５０℃で３０分呈色反応をおこない、５８０ｎｍの吸光度を測定して酵素活性測定とする。
３）１分間に１μｍｏｌのＬ−ソルボース(Ｌ−ｓｏｒｂｏｓｅ)を生産する酵素量を１単位とする。

２．組換え大腸菌の培養
１００μｇ/ｍｌのアンピシリンを含むＳＢ培地に組換え大腸菌を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍ、１２時間振盪培養した後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して４時間酵素の発現を誘導した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、５分）して集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を懸濁し、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、５分）して菌体を回収することで菌の洗浄を行った。
３．粗酵素溶液の調製
得られた菌体の重量の５倍量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再度懸濁し、超音波破砕（３０％、３０秒、４回）して菌体を破砕した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、５分）を行い、得られた上清を粗酵素液とした。

４．酵素の精製
[ＨｉＴｒａｐＱＨＰカラムクロマトグラフィー]
超音波破砕によって得られた酵素は５０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐＱＨＰに供した。酵素は緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0〜1 Mへ直線的濃度勾配をかけることにより溶出し、活性のある画分を回収した。

[ＨｉＴｒａｐＰｈｅｎｙｌＨＰカラムクロマトグラフィー]
得られた粗酵素液は５０ｍｌの２Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４含有２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐＰｈｅｎｙｌＨＰに供した。酵素は緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を２Ｍ〜０Ｍへ直線的濃度勾配をかけることにより溶出し、活性のある画分を回収した。次に得られた活性画分に含まれる硫酸アンモニウムを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて４℃、一晩透析によって除した。

[ＲｅｓｏｕｃｅＱカラムクロマトグラフィー]
次に得られた活性画分を５０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＲｅｓｏｕｃｅＱに供した。酵素は緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０〜１Ｍへ直線的濃度勾配をかけることにより溶出し、活性のある画分を回収した。回収した酵素液はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を検討し、精製酵素とした。

各精製段階での精製度と収率
精製段階を通じて、各精製工程後に２８０nmの吸光度によるタンパク質の定量と酵素活性の測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度の確認を行った。その結果を図４と表１に示す。図4に示したとおり精製純度は電気泳動的に単一であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約91ｋＤａである。

５．本酵素の理化学的性質の解析
トランスケトラーゼの諸性質の解析を上述の調製方法で得られた精製酵素を用いて行った。
［酵素の性質]
酵素の至適pH、および至適温度と温度安定性を図５に示した。反応至適ｐＨは７．０から９．０である。好ましい至適ｐＨは７．０から８．０であった。至適温度は３０〜５０℃で温度安定性は３０℃以下であることが判明した。好ましい反応至適温度は５０℃である。

以下に具体的な実施例により本発明を説明する。以下の実施例では、本発明により希少糖の一種であるソルボースの製造を例に記載したが、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースを原料として炭素数７の糖を製造することも可能である。
［ソルボースの製造］
［反応原料であるアルドースとケトースの製造］
本発明でソルボースを製造するにあたり原料となるアルドースとケトースの合成を行った。その工程は図3に示す。
（１）ケトースの製造
Ｄ−グルコースから微生物モニリエラエスピー（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａｓｐ．）による発酵作用により炭素数４のエリトリトールを合成し（図3の発酵A）、これを酢酸菌で酸化して炭素数４のＬ−エリトルロースを製造した（図3の酸化反応B）。
（２）アルドースの製造
炭素数４のＬ−エリトルロースをＬ−アラビノースイソメラーゼを用いて炭素数４のＬ−トレオース製造した（図３の異性化反応C）。

［Ｌ−エリトルロースおよびＬ−トレオースを含有するＬ−ソルボースの合成原料の製造］
２０ｗｔ％のＬ−エリトルロースを含有する溶液を表２に記載の反応条件によりアラビノースイソメラーゼによる異性化反応を実施して、Ｌ−エリトルロース：Ｌ−トレオースが７：３で含有する反応生成物を得た。反応時間と両化合物の生成割合を図６示した。この反応生成物をトランスケトラーゼ反応の原料として用いた。

［トランスケトラーゼの反応］
実施例1の方法で製造したＬ−エリトルロースとＬ−トレオースを基質として、アルスロバクターグロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１１１１）由来のトランスケトラーゼを用いて３０℃の温度下で反応を行った。
主な反応条件としては表３に示す。

反応後の生成物を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により製造物を分析した。
反応前のＨＰＬＣと１１６時間反応させた後のＨＰＬＣの一例を図７に対比させて示した。
反応前には大きく現れていたＬ−トレオースとＬ−エリトルロースのピークが減少して、リテンションタイムが１１．２分にピークが現れた。このピークはソルボースに対応することから、ソルボースの生成が明らかとなった。

［製造物の確認］
クロマトにより分離した各ピークに対応する生成物をＮＭＲおよび旋光度分析した結果、製造物はＬ−ソルボースであると確認した。
図８に生産物のＮＭＲスペクトルを示す。図９に標準のＬ−ｓｏｒｂｏｓｅのＮＭＲスペクトルを示す。生産物のＮＭＲスペクトルは、標準のＬ−ｓｏｒｂｏｓｅとよく一致した。

[本発明の反応による具体例のまとめ]
本発明の希少糖であるＬ−リボースの反応経路の一例をまとめると、エリトリトールから製造したＬ−エリトルロースと、このＬ−エリトルロースをＬ−アラビノースイソメラーゼで製造したＬ−トレオースを基質とし、トランスケトラーゼにより反応させると以下のような反応が進行した。
すなわち炭素４のテトロースであるＬ−エリトルロースを供与体とし、Ｌ−トレオースを受容体とする反応が進行し、炭素６のＬ−ソルボースを製造することが可能となった。
トランスケトラーゼはリン酸化した糖に作用するのみと思われていたが、リン酸化していないアルドースとケトースを基質としても反応することを示すことができた。
この反応は煩雑なトランスケトラーゼの活性測定に利用できることも明らかになった。

本発明は、新規トランスケトラーゼを見出したことにより、それを用いた新たなケトースの製造方法を提供することができ、これまで製造することが困難であった炭素数の大きなケトースを容易に製造ることが可能となり、全く新しいケトースの製造として、炭素数が７、８などの通常の方法では人が手にすることのできないケトースの製造が可能としたものである。また、本発明は、ケトース型の希少糖を製造する方法として有用である。
本発明により、リン酸化した糖の変換反応を触媒できる酵素を用いて、リン酸化していない糖の反応の可能性が示されたことにより今後の大きな広がりを示す結果が得られた。また、新たに製造された糖類の研究開発により、食品、医薬などの技術分野における応用が期待される。
さらにトランスケトラーゼの迅速な酵素活性測定に利用可能である。
上述のように、希少糖には実用性の高い生理活性があることがわかってきており、この他にも甘味料、農薬、医薬、工業材料など、広い分野での実用化の可能性を秘めている。現在、すべての希少糖で大量製造が確立されているわけではなく、多段階の反応を経て少量しか製造できないものも多く新規な希少糖の製造経路を作り出すことがでればさらなる希少糖研究の進展につながることが期待される。

Claims

下記（ａ）から（ｅ）に記載の性質を有するアルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物由来のトランスケトラーゼ。
（ａ）リン酸化されていないアルドースと、リン酸化されていないケトースに作用させると炭素数が増加したリン酸化されていないケトースを生成する活性を有する。
（ｂ）ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定した分子量が９１ｋＤａである。
（ｃ）Ｌ−トレオースとＬ−エリトルロースに作用させＬ−ソルボースを生成する活性を有する。
（ｄ）反応至適ｐＨは７．０から９．０である。
（ｅ）反応至適温度は５０℃である。
アルスロバクター(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)属に属する微生物が、アルスロバクターグロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０(寄託番号ＮＩＴＥＢＰ−１１１１)である請求項１に記載のトランスケトラーゼ。
リン酸化されていないアルドースとしてＬ−トレオース、リン酸化されていないケトースとしてＬ−エリトルロースに、請求項１または２に記載のトランスケトラーゼを作用させることを特徴とする、炭素数が増加したリン酸化されていないケトースであるＬ−ソルボースの製造方法。
リン酸化していないＬ−トレオースとリン酸化していないＬ−エリトルロースを基質とし、Ｌ−ソルボースを生産させることによる、請求項１または２に記載のトランスケトラーゼの活性測定法。
リン酸化していないＬ−トレオース基質を受容体とし、かつリン酸化していないＬ−エリトルロース基質を供与体として、請求項１または２に記載のトランスケトラーゼを作用させ反応を行ないＬ−ソルボースを生産させた後、Ｌ−ソルボースをシステインカルバゾール法によりを検出することを特徴とする請求項４に記載のトランスケトラーゼの活性測定法。