JP6874147B2 - 腫瘍特異的殺傷アデノウイルスおよび免疫チェックポイント阻害剤を含む抗癌用組成物 - Google Patents
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Description
実験材料および実験方法
1.動物実験
Charles River Laboratories International、Inc.(Wilmington、MA)から6週〜8週齢の雄性C57BL/6マウスを購入して、無菌状態のラミナエアフローキャビネットで飼育した。すべての動物実験は、AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)の承認下に行われ、漢陽大学校動物管理および利用委員会(University of Hanyang Institutional Animal Care and Use Committee)のガイドラインに基づいて行われた。
E1領域にIL−12、E3領域にGM−CSF−RelaxinまたはshVEGFが導入されたアデノウイルス(Ad)を図1および図2に示されたように製作した。
B16−F10細胞(5×105)を6〜7週齢の雄性C57BL/6正常免疫(immune−competent)マウスの右側の脇腹の皮下に注入した。腫瘍体積が約100mm3に到達すれば、類似した腫瘍サイズを有するグループに分類し、1日、3日、および5日目に、腫瘍殺傷アデノウイルス(RdB/IL12/shVEGF Ad;RdB/IL12/GMCSF−RLX Ad)を5×109 VP濃度で腫瘍内投与した。また、免疫チェックポイント阻害剤との併用による抗癌効果を確認するために、3日、6日、および9日目に、前記腫瘍殺傷アデノウイルスが投与されたマウスに免疫チェックポイント阻害剤である抗PD−L1抗体、抗PD−1抗体および抗CTLA−4抗体を200μg濃度で腹腔内投与し、さらに免疫チェックポイント阻害剤との併用による相乗効果を評価するために、5×109 VPを利用した以前の実験より5倍さらに低い用量の腫瘍殺傷アデノウイルス(1×109 VP)を利用して上記と同じ実験を再度実施した。一方、本実験で、対照群としては、PBS処理群(PBS)、免疫チェックポイント阻害剤単独処理群(抗PD−L1抗体、抗PD−1抗体、抗CTLA−4抗体)を利用した。
黒色腫が誘導された前記3の動物モデルのうち、1次腫瘍を注入した後、50日目、成功裏に治療されたマウス(1次腫瘍を促進できない時点から25日目)を対象として、2次腫瘍を再注入(rechallenge)した。以後、前記と同様に、腫瘍の垂直直径を測定して腫瘍の成長を隔日でモニタリングし、腫瘍の平均体積を算出することによって、抗腫瘍免疫記憶効果を評価した。本実験で、対照群としては、正常マウスに黒色腫を誘導した群(Normal)を利用した。
すべてのデータは、平均標準誤差で示した。Stat View software(Abacus Concepts、Inc.、Berkeley、CA)およびthe Mann−Whitney test(non−parametric rank sumtest)を利用して比較した。0.05以下のP valueは、統計的に有意性あることを示す(*、P<0.05;**、P<0.01)。
1.黒色腫マウスにおける抗癌効果の確認
本発明者らは、黒色腫マウス内注入された腫瘍の体積および完全寛解の有無とマウスの生存率を比較して、組換えアデノウイルスおよび/または免疫チェックポイント阻害剤の抗癌効果を確認しようとした。
本発明者らは、免疫チェックポイント阻害剤との併用による相乗効果をさらに詳細に評価するために、5×109 VPを利用した以前の実験より5倍さらに低い用量の腫瘍殺傷アデノウイルス(1×109 VP)を利用して組換えアデノウイルス単独投与と組換えアデノウイルスおよび免疫チェックポイント阻害剤併用投与との間に抗癌効果を比較した。また、前記結果に基づいて、免疫チェックポイント阻害剤として抗PD−L1抗体、抗PD−1抗体または抗CTLA−4抗体を利用した場合、これらの抗癌効果を比較し、本実験で組換えアデノウイルスは、RdB/IL12/GMCSF−RLX Adを使用した。
本発明者らは、黒色腫マウス内注入された2次腫瘍の体積などを比較して、本発明の組換えアデノウイルス、または前記組換えアデノウイルスと免疫チェックポイント阻害剤の併用による免疫記憶効果と再発癌に対する抗癌効果を確認しようとした。
その結果、RdB/IL12/shVEGF Ad群で2次腫瘍の成長が明確に阻害され(図10a)、特に、免疫チェックポイント阻害剤である抗PD−1抗体との併用によって2次腫瘍の成長は、さらに顕著に阻害されることを確認することができた(図10b)。このような結果は、本発明の組換えアデノウイルスは、免疫記憶による抗腫瘍免疫反応の増進効果を通じて腫瘍の再発を未然に防止することができることを意味し、前述した抗癌効果と同様に、このような効果は、免疫チェックポイント阻害剤との併用を通じて上昇することができることを示唆するものである。
(1)IL−12、GM−CSF、およびRelaxinの発現様相の確認
IL−12、GM−CSF、およびRelaxin(RLX)遺伝子の同時発現による抗癌効果を再度検証するために、前述したように、IL−12遺伝子がアデノウイルスのE1領域に、GM−CSFおよびrelaxin遺伝子がE3領域に挿入されたアデノウイルスであるRdB/IL12/GMCSF−RLX Adを製作した。前記RdB/IL12/GMCSF−RLX Adは、アデノウイルスの初期遺伝子であるE1B遺伝子が消失され、E1A遺伝子が変異された癌細胞特異的殺傷アデノウイルスであって、製作されたアデノウイルスによるIL−12、GM−CSF、またはRLXの発現量を確認した。具体的に、シリアンハムスターのすい臓癌細胞株(Hap−T1)に0.2、0.5、1、2、および5 MOI(multiplicityof infection)のRdB/IL12/GMCSF−RLXを感染させ、これから48時間後にこれらの培地を回収した。以後、Enzyme−linked immunosorbent assay(ELISA)を通じてIL−12、およびGM−CSFの発現量を確認し、Reverse transcription polymerase chain reaction(RT−PCR)を通じてRelaxinの発現量を確認した。
RdB/IL12/GMCSF−RLX AdとαPD−1の併用による抗癌効果の相乗を検証するために、HaP−T1すい臓癌細胞株を皮下注射して誘導されたシリアンハムスターの腫瘍動物モデルに7×107 viral particles(VP)/30μlのRdB/IL12/GMCSF−RLX Adを腫瘍内投与し、これと共に、10mg/kgのαPD−1を腹腔内投与した後、これによる腫瘍の体積変化を観察した。一方、比較群としては、RdB/IL12/GMCSF−RLX Ad単独投与群を利用した。
RdB/IL12/GMCSF−RLX AdとαPD−1の併用による腫瘍組織内変化を具体的に確認するために、7×107 VPのRdB/IL12/GMCSF−RLX Adと10mg/kgのαPD−1を前述したように併用投与した後、採取した腫瘍組織を免疫組織学的に評価した。一方、比較群としてαPD−1またはRdB/IL12/GMCSF−RLX Ad単独投与群、対照群としては、PBS投与群を利用した。
RdB/IL12/GMCSF−RLX AdによってαPD−1の腫瘍組織内浸透が増加するにつれて、腫瘍組織内T細胞の浸潤および活性化が誘導できるかを評価するために、draining lymph node(DLN)と腫瘍組織内浸潤されたリンパ球でinterferon(IFN)−γ−発現CD4+またはCD8+ T細胞の群集変化を評価した。その結果、図15および図16に示したように、RdB/IL12/GMCSF−RLX AdまたはαPD−1単独投与群、およびRdB/IL12/GMCSF−RLX AdとαPD−1併用投与群は、PBSまたはαPD−1単独投与群に比べてIFN−γ−発現CD4+およびCD8+ T細胞の群集が高い水準で観察された(P<0.001またはP<0.01)。特に、RdB/IL12/GMCSF−RLX AdとαPD−1併用投与群は、RdB/IL12/GMCSF−RLX AdまたはαPD−1単独投与した群に比べてもIFN−γ−発現CD4+およびCD8+ T細胞の群集が有意的に増加することを確認することができたところ(P<0.001)、このような結果は、RdB/IL12/GMCSF−RLX AdとαPD−1の併用投与は、interferon(IFN)−γ−発現CD4+およびCD8+ T細胞の腫瘍内浸潤および活性化を誘導することを示すものである。
免疫チェックポイント阻害剤に対する抵抗性を有する条件下で、RdB/IL12/GMCSF−RLX AdとαPD−1の併用が有効な治療効能を示すことができるかを評価するために、αPD−1で前処理された腫瘍を対象として併用投与による腫瘍の成長抑制効果を評価した。具体的に、αPD−1単独投与によって腫瘍の成長がこれ以上効果的に抑制されないとき(一番目の抗体治療後9日目)、RdB/IL12/GMCSF−RLX Adを2日間隔で総4回投与した。一方、比較群としてαPD−1単独投与群を利用した。
腫瘍組織内RLXの発現は、αPD−1の腫瘍内浸透を促進させることによって、相乗的(synergistic)抗癌治療効能を示すものと予想した。したがって、RdB/IL12/GMCSF−RLX Adが繊維組織型(desmoplastic)すい臓腫瘍組織にαPD−1の腫瘍内浸透を増加させるか否かを評価しようとした。RdB/IL12/GMCSF−RLX Adは、0日または2日目に、腫瘍組織内に直接投与され、αPD−1は、2日目に腹腔内投与され(c:RdB/IL12/GMCSF−RLX+Alexa 488−anti PD−1)、比較群としては、Alexa 488−接合されたαPD−1単独投与群(b;Alexa 488−anti PD−1)、対照群としては、PBS単独投与群(a;PBS)が用いられた。上記のように処理された腫瘍組織を7日目に採取し、腫瘍組織内Alexa 488−αPD−1の蓄積を免疫蛍光分析を通じて定量化した。組織面積当たりAlexa 488−αPD−1の蓄積を定量化した結果、図20に示したように、PBS単独投与群またはαPD−1単独投与群は、それぞれ14±2A.U./μm2または21±1A.U./μm2を示した反面、併用投与群は、32±6A.U./μm2を示した。このような結果から、RdB/IL12/GMCSF−RLX Adは、腫瘍組織にαPD−1の浸透を顕著に向上させ、腫瘍組織内αPD−1の局所化(localization)を向上させることに寄与することが分かった。また、前記Alexa 488−αPD−1がCD4+またはCD8+ T細胞の発現部位に位置するか否かを確認するために、PBS(a:PBS)、Alexa 488−接合されたαPD−1単独(b:Alexa 488−anti PD−1)またはRdB/IL12/GMCSF−RLX AdおよびAlexa 488−接合されたαPD−1併用投与(c:RdB/IL12/GMCSF−RLX+Alexa 488−anti PD−1)されたそれぞれ腫瘍組織に対して、CD4+またはCD8+に対する免疫染色を行った。その結果、図21に示したように併用投与群は、Alexa 488−αPD−1単独投与群に比べてαPD−1とCD4またはCD8の共同−局所化が高く観察された。
Claims (10)
- IL−12(Interleukin 12)を暗号化する遺伝子;GM−CSF(Granulocyte−macrophage colony−stimulating factor)を暗号化する遺伝子;およびRelaxinを暗号化する遺伝子を含む、癌を治療するための組換え腫瘍溶解性(oncolytic)アデノウイルスであって、
活性なE1A遺伝子を含む、組換え腫瘍溶解性アデノウイルス。 - 前記組換えアデノウイルスは、E1BおよびE3領域よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上の領域が欠失されていることを特徴とする請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- 前記組換えアデノウイルスは、前記E1B領域にIL−12を暗号化する遺伝子が挿入されており、
前記E3領域にGM−CSFを暗号化する遺伝子およびRelaxinを暗号化する遺伝子が挿入されているものである、請求項2に記載の組換えアデノウイルス。 - (a)請求項1〜3のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性アデノウイルス;および(b)薬学的に許容される担体(carrier)を含む癌の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と同時に、別途に、または順次に併用投与されるものである、請求項4に記載の薬学的組成物。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤は、PD−1(programmed cell death−1)拮抗剤、PD−L1(programmed cell death−ligand 1)拮抗剤、PD−L2(programmed cell death−ligand 2)拮抗剤、CD27(cluster of differentiation 27)拮抗剤、CD28(cluster of differentiation 28)拮抗剤、CD70(cluster of differentiation 70)拮抗剤、CD80(cluster of differentiation 80、also known as B7−1)拮抗剤、CD86(cluster of differentiation 86、also known as B7−2)拮抗剤、CD137(cluster of differentiation 137)拮抗剤、CD276(cluster of differentiation 276)拮抗剤、KIRs(killer−cell immunoglobulin−like receptors)拮抗剤、LAG3(lymphocyte−activation gene 3)拮抗剤、TNFRSF4(tumor necrosis factor receptor superfamily、member 4、also known as CD134)拮抗剤、GITR(glucocorticoid−induced TNFR−related protein)拮抗剤、GITRL(glucocorticoid−induced TNFR−related protein ligand)拮抗剤、4−1BBL(4−1BB ligand)拮抗剤、CTLA−4(cytolytic T lymphocyte associated antign−4)拮抗剤、A2AR(Adenosine A2A receptor)拮抗剤、VTCN1(V−set domain−containing T−cell activation inhibitor 1)拮抗剤、BTLA(B− and T−lymphocyte attenuator)拮抗剤、IDO(Indoleamine 2、3−dioxygenase)拮抗剤、TIM−3(T−cell Immunoglobulin domain and Mucin domain3)拮抗剤、VISTA(V−domain Ig suppressor of T cell activation)拮抗剤、およびKLRA(killer cell lectin−like receptor subfamily A)拮抗剤、およびこれらの組合せよりなる群から選ばれるいずれか一つである、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 前記癌は、胃癌、肺癌、非小細胞性肺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、すい臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮頸癌、骨癌、非小細胞性骨癌、血液癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、子宮癌、直腸癌、肛門付近癌、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病(Hodgkin’s disease)、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、唾液腺腫瘍、肉腫癌、仮性粘液腫、肝芽腫、睾丸癌、膠芽腫、口脣癌、卵巣生殖細胞腫瘍、基底細胞癌、多発性骨髄腫、胆のう癌、脈絡膜黒色腫、ファーテル膨大部癌、腹膜癌、舌癌、小細胞癌、小児リンパ腫、神経芽細胞腫、十二指腸癌、尿管癌、星状細胞腫、髄膜腫、腎盂癌、外陰部癌、胸腺癌、中枢神経系(central nervous system、CNS)腫瘍、1次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫および脳下垂体腺腫よりなる群から選ばれるいずれか一つである、請求項4に記載の薬学的組成物。
- 前記癌は、再発癌(Recurrent cancer)であることを特徴とする請求項4に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物は、抗腫瘍免疫性(Antitumor immunity)を増進させることを特徴とする請求項4に記載の薬学的組成物。
- 免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項4に記載の治療用薬学的組成物。
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