JP6872563B2 - 分子コンピューティング構成要素及び分子コンピューティングの方法 - Google Patents
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Description
CompuSpheresが、
プログラム可能;例えば、各独立した粒子は、ユーザ定義の閾値を超えた特定のDNA又はRNAターゲットの存在/不在を演算するように設計される。
自律性;CompuSpheresは、タスクを独力で行い、燃料dNTPs及び触媒活性が提供される限り、陽性検出に対応する増幅状態を維持する。
再使用可能;燃料が除去され、触媒活性が除去されるか、又は、それらが洗浄されると、CompuSpheresは初期状態に戻る。
環境感度;CompuSpheresは、周囲の溶液中の分子を感知することができる(CompuSpheresは、他の多くの高スループット戦略のようでなく、物理的に仕切られていない。)。
モジュール化;各モジュールは、微小球のプログラミングを多様性のあるものとするように、設計され、独立して又は共同で微小球上に付着することができる。
多重化可能(多重操作可能):異なる分子のプログラムを保持する粒子は、同じ溶液中で異なる感知動作を行うことができる。
であることを実証する。
(a)DNAモジュールを備えた微小球のプログラミングは、よく混合された分子のプログラミングプロトコル(ここで、規則コード化テンプレートは、固相に付着しておらず、溶液中で自由である)に関して、いくつかの調節を必要とする。特に、PEN−DNAツールボックスと比較して、コード化テンプレートの配列のデザインルールは変わらないが、適切なスペーサ及びリンカーを加える必要がある。これらの調節が行われると、質的な動的挙動、及び、その結果の分子プログラミングルールは、粒子上でも、溶液中と基本的に同じである。
(b)CompuSpheresは、例えば、核酸ターゲットの検出に適用可能な、自律的な演算能力を示す。
(c)CompuSpheresは多重アッセイに適している。同じ溶液中の異なるCompuSpheresは異なるタスクを行うことができ、結果は蛍光性リポーター及びバーコードを使用して抽出することができる。
(d)多様性のあるアッセイは、簡易な設計ルールを使用し、(すべてのターゲットについて同じ)双安定な増幅モチーフと、(興味の対象である個々のターゲット用に具体的に設計された)ターゲット変換モジュールとを結合することによって設計され得る。
(e)SybrGreen又はEvaGreenのような非特異性リポーターは、CompuSphereに基づいたプロトコルの結果をモニターする簡単な方法を提供する。あるいは、特異性リポーター戦略は、より高い信号のより高い検知特異性を提供するか又はアッセイを多重化するために設計され得る。
(f)あるCompuSphereは、統合機能を提供するように協力する種々の装飾テンプレートを統合することができる。例えば、あるCompuSphereは増幅モジュール、漏出吸収モジュール、ターゲット変換モジュール、特異性リポーター鎖及びスペクトル的に直交する蛍光性バーコードを保持することができる。
ポリメラーゼ効率におけるそれらの5’端部を介してのテンプレートの固定化の影響が調査された。その目的のために、二重繰り返し配列T1を使用する間接アッセイが考案された(図6A)。この配列は、相補配列(α、CATTCTGACGAG)のポリメラーゼ/ニッカーゼ媒介指数関数的増幅のために、テンプレートとして使用される。自触媒的種αの増幅は、少量のdNTPsが存在する状態でモニターされる。αに対応する蛍光信号は、最初の指数関数的な増幅位相とそれに続く安定水準(トリガーの生産がエキソヌクレアーゼttRecJによる分解に等しい定常状態に相当する)とを備える増幅プロフィールを示す。最後に、dNTPsが消耗すると、反応の終わりとなり、初期水準(これ以上生産はなく、分解のみ)に復帰する。テンプレートT1は、その出力側(5’端部)に位置付けられたビオチン部分(bioteg又はビオチン)の前方の0〜3デオキシアデノシンとともに拡張される(図6)。図7は実験条件用の表を示す。他のテンプレート上での更なる重合を準備することができない3’ミスマッチされたトリガーの生産によって、ポリメラーゼが(ポリ)dAリンカーを横切って読む場合、増幅は生じない。
αtoαと呼ばれる単一のテンプレートによって符号化された単純システムが選択された(Bioteg* C* T* C* G* TCAGAATGCTCGTCAGAATp、* 及び、pは、それぞれ、ホスホロチオエート結合、及び、3’末端リン酸エステルを表す。)。このテンプレートがリピート構造を有し、ニッキング酵素認識を包含しているので、ポリメラーゼ、ニッキング酵素及びdNTPsが存在する状態で、正確なバッファ、塩及び温度条件で培養されたとき、その相補的配列α(CAT TCT GAC GAG)の指数関数的な増幅が起こることは周知である(図10A)(国際公開第2004−067726A3及び非特許文献40参照。)。さらに、反応がエキソヌクレアーゼが追加的に存在する状態(そして、テンプレートがエキソヌクレアーゼによって分解から保護されると仮定する)で行われる場合、dNTPsが溶液からすべて排出されるまでに、その反応は安定水準に達し、安定したままであることが報告されている。それから、テンプレートが単鎖の状態に戻っているが、DNA生成反応はこれ以上保持されず、αの濃度は0まで戻る。蛍光性リポーターは、反応の進行を追跡するために使用することができ、したがって、蛍光信号について、特徴的増幅/安定水準/ベースライン形状への回帰を見ることができる(例えば、非特許文献2参照。)。
図10Bは、CSαM がα鎖を効率的に増幅し、急激な蛍光増加に帰着することを示す。指数関数的相の後、信号は定常状態(ここで、ポリメラーゼ/ニッカーゼ/テンプレートによるαの生成は、エキソヌクレアーゼによる分解と等しい)に対応する安定した安定水準に達する。dNTPs枯渇後、生成は停止し、α鎖の緩やかな分解はテンプレートを初期の単鎖状態に戻し、それにより蛍光が減少する。溶液の残りの部分内で信号が観察されない(生成された単鎖のDNA鎖のうちのいくつかが微小球から拡散すると予想されても、それらは検出可能な蛍光信号を生成しない)一方で、球上では酵素反応が厳密に発生していることに留意することは重要である。この結果は、3つのPEN−DNAツールボックス酵素活性(ポリメラーゼ活性、ニッカーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性)が存在する状態で、多孔質微小球の大部分の内部での局所化された単純な増幅機能が適切に進行していることを示している。また、化学燃料(dNTP)が枯渇すると初期状態に戻る、というシステムの再使用可能性を示している。
ビーズ機能化:2つのビオチン化されたDNAテンプレート(300pmol αtoα、Bioteg* C* T* C* G* TCAGAATGCTCGTCAGAATp)及び漏出吸収テンプレート(100pmol pTα、Biotin* A* A* AAAACTCGTC AGAATGp)は、拘束力のあるバッファ(Tris−HCl pH7.9 20mM、EDTA 10mM、NaCl 1M、Tween20 0.2%)内で、混合される(3:1の比率)。Sepharoseビーズは、即座の攪拌を用いて、導入される(在庫懸濁液、300μgから5μL)。機能化された粒子(CSαB )は、貯蔵バッファ内で、洗浄されて6か月まで4℃で貯留される。
反応アセンブリ:異なる3つの反応が、0、8又は32nMのターゲット(α、CATTCTGACGAG)が追加されたマスター・ミックス(図15の表において示される反応バッファ+酵素)内にCSαB を導入することによって、組み立てられる。
反応モニタリング:3つの試料の各々は、45℃で加熱され、二本鎖の特異的染料Evagreenを使用する低速度撮影の落射蛍光顕微鏡によって画像化される(実施例2参照。)。各ビーズの蛍光信号は、増幅反応の進行を示す。自触媒的反応が閾値未満で信号を増幅しない場合、低い蛍光信号は「オフ」状態に対応する。これに反して、急激な蛍光増加は、CompuSphereをその「オン」状態にする増幅反応に対応し、「オン」状態は非常に長い時間維持される(もし、十分なdNTPがバッファに含まれていれば、実施例2を参照。)。
図14は実験結果を示す。具体的には、図14は、増幅テンプレート及び漏出吸収テンプレート(CSαB )の混合物で機能化された微小球を使用し、DNA鎖の存在/不在の検出を示す。部分A(最上位部分)は、検出スキームの原理を示す。部分B(左下部分)は、3つの試料について得られた時間トレースを示す:CSαB は、それぞれ、0、8又は32nMのターゲット鎖αが追加された反応ミックスを使用して培養される。部分C(右下部分)は蛍光像b及び(α)を示す。ターゲットがない状態で、CompuSpheresは、「オフ」レスポンスを報告して、不活性状態に留まる。ターゲットが反応ミックスに加えられると、CompuSpheresは、ターゲットの存在を感知して配列を増幅し、強い蛍光状態(「オン」状態)への変更に移行する。図14に示されるように、ターゲット(0nM α)がない状態で、CSαB は1000分までの間「オフ」状態に留まる。ターゲットが試料(32nM)に導入されると、閾値を超え、微小球は「オン」に切り替わり、強い蛍光信号を発する。ターゲットが中間濃度(8nM α)では、CSは、遅れて(約400分)、「オン」状態に切り替わる。結論として、双安定性プログラムが埋め込まれる微粒子は、特定のターゲットの存在を検出し、ターゲットがない状態でのバックグラウンド増幅に敏感にならずに、対応する蛍光反応を表示することができる。
多重化の例として、2つの異なるプログラムが、図17の表において示される2つの別個のCompuSpheres集団を使用して実施された:一方はα(CATTCTGACGAG)と呼ばれる鎖を感知するが、他方はβ(CATTCAGGATCG)と呼ばれる鎖を感知するように設計されている。診断には、2つのターゲットが配列においてかなり類似している場合が多い。ここで、βは、αに類似しているが、少しミスマッチした配列で示されている。各粒子集団は、蛍光特性を使用して区別され得るように、(蛍光性のオリゴヌクレオチドラベル付けされたビオチンを共同移植することによって)合成の間に蛍光染料でバーコードが付与される。合成の後、両タイプの微小球は、一緒に貯留されて、入力なし;αのみ;βのみ;α及びβのうちのいずれかを包含する試料に曝される。
図16は、プログラムされた各粒子が、その蛍光性のバーコードを使用して識別されることができ、そのターゲット鎖の存在/不在を独立して明確に検出し、予期された(同種のターゲットの存在における)「オン」/(トリガーの不在中における)「オフ」状態を採用することを示している。図16に示されるように、2つのCompuSpheresバッチが合成される;一方はαを感知する双安定性モジュールで機能化されたものであり、他方は入力がβである双安定性モジュールが埋め込まれたものである。2つのCompuSpheres集団は、別々にバーコードが付与され、一緒に貯留され、反応ミックスが追加され、ターゲットに曝された。各ビーズの演算は蛍光顕微鏡によってモニターされる。各実験条件について、システムは、対応するターゲットの不在(CS「オフ」状態)又は存在(CS「オン」状態)を効率的に報告するように見える。この結果は、同じ溶液内の異なってプログラムされた微小球を使用して、種々のターゲットの同時測定を行うことができることを実証する。同じ溶液に浸される間に異なる微小球が異なるタスクを遂行可能であることを示すので、これは、CompuSpheresの大きな多重化能力の可能性を強調する。
この原理を実証するために、双安定モジュール(増幅テンプレートβtoβ Biotin* C* G* A* TCCTGAATGCGATCCTGAAT−p及び漏出吸収テンプレートpTβ、Biotin* A* A* AAAACGATCCTGAATG−p)を有するCompuSpheres CSβB が合成された。粒子には、続いて、ターゲット変換モジュール(テンプレートαtoβ)が追加される。これらの粒子はCSα→βB と命名される。CSβB 及びCSα→βB は、0又は10nMのターゲットαを包含している(図19の表において示される)反応ミックス内で別々に培養され、反応は45℃で蛍光顕微鏡法によってモニターされる。
このケースでは、ターゲット特異的分子プログラムと並んで、リポーター鎖がCompuSphere合成の間に加えられる(図20A)。このリポーター鎖は、ビオチン部分の前方の5’polyTテールを用いて拡張されたステムループ構造からできている。ステムの両方の末端はフルオロフォア及び消光剤を用いて修正される。ループは双安定性モジュールのトリガーに相補的である。一旦トリガーがループに結合すると、ステムは不安定になり、トリガーはポリメラーゼによって延長される。この不可逆ステップがフルオロフォアを消光剤から離間させ、その結果、蛍光放射が強化される。微粒子(CSα→βBR)は、4本鎖プログラム(図21の表に示される増幅テンプレート、漏出吸収テンプレート、ターゲット変換テンプレート及びリポーター)を用いて機能化される。洗浄後、CSα→βBRは、酵素機構及び0から10nMまでの範囲の濃度のターゲットαを用いて、45℃で培養される。その反応は、赤色チャンネル(Cy5放射蛍光)を通して蛍光顕微鏡によってモニターされる。
図20は、4つの試料(ターゲットの濃度=0、0.1、1及び10nM)についての顕微鏡実験の結果を示す。具体的には、図20Aは4本鎖プログラム(CSα→βBR)が埋め込まれたCompuSphereの模式図である。図20Bは染料/消光剤プローブRβを使用するメカニズムを示す。図20Cは4つの試料について、時間トレース及びエラーバーを示す:CSα→βBRは、反応ミックス及びターゲット(αの0、0.1、1又は10nM)と一緒に培養される。そして、図20Dは各試料の1つのCompuSphereについての蛍光像を示す。ターゲットがない状態で、CSα→βBRはオフ状態に留まり、1000分以上の間低い蛍光水準を示し、リポーターは、粒子に付着していても、性能に影響を与えないことを実証する。我々は、0.1nMのターゲットについて同様の結果(ビーズは「オフ」に留まる)を観察したが、これは、実験中に閾値を超えないことを示唆している。これに反して、CompuSpheresは、1及び10nMのα鎖によってトリガーされる、というポジティブ信号を報告する。この実験において遂行された報告戦略は、いかなる増幅された配列に対しても適用可能な包括的な設計戦略を用いることによって、特異的蛍光信号の生成が可能であることを示す。他の多くの蛍光報告戦略が、アプリオリに、本実施の形態において示された微小球アプローチと互換性があることは、明らかである。
(a)分子のプログラムの容易な取り扱い及び蓄積
(b)迅速で簡単なバッファ交換
(c)プログラム再使用性
(d)小型化及び並列化
(e)多重化された動作及びリーディング(例えば、蛍光性バーコードを使用して)
Circulating free DNA(cfDNA)は、プラズマ中において非常に低い濃度で存在するので、重要ではあるが困難なバイオマーカー候補である。血液サンプル中に存在するマイクロRNA(miRNA)も種々の疾病に関連している。高感度で、特異性があり、ロバストで、安価な検出スキームはそれらを臨床診断にとって価値のあるものとするであろう。
Claims (14)
- 分子ターゲットの検出用の構成要素であって、
細孔を含む微小球であって、少なくとも細孔のうちのいくつかは微小球の表面に開口している微小球と、
該微小球に付着する複数のモジュールであって、各々は核酸塩基の連続配列であり、各々の複数の複製が微小球に付着しているモジュールとを備え、
該モジュールは第1及び第2のモジュールを含み、前記第1のモジュールは、増幅テンプレートであって、部分的な繰り返し構造及びニッキング酵素認識部位を含み、前記第2のモジュールは、漏出吸収テンプレート(100pmol pTα、Biotin * A * A * AAAACTCGTC AGAATGp)であって、前記第1のモジュールから非特異的反応の生成物を吸収して閾値効果を誘発し、
前記モジュールの少なくとも1つは、リンカー、スペーサ、エキソヌクレアーゼ保護修飾、蛍光修飾、及び、物理化学又は生化学の特性を変化させるための修飾から選択される他の修飾を有する、構成要素。 - 前記微小球上に移植されたモジュールは、局所的に協力してそれらの環境中の化学信号を感知し、レスポンスを演算して報告信号を生成する、請求項1に記載の構成要素。
- 前記構成要素は複数の微小球を備え、該微小球は同時に同一の試料内に存在する、請求項2に記載の構成要素。
- 前記微小球は異なるタイプであって、その上に移植された蛍光性のバーコードによって識別することができ、各微小球はモジュールの別個の組み合わせを有し、それにより、各微小球は異なる感知機能を発揮する、請求項3に記載の構成要素。
- 感知機能は、微小球に付着するモジュールの組み合わせによって協力して遂行され、前記モジュールは、短いDNA鎖の交換を通じて微小球上で本質的に局所的に協力し、微小球が独立して機能することは物理的なコンパートメントを必要とせずに得られる、請求項1に記載の構成要素。
- 前記構成要素は複数の微小球を備え、各微小球は、1つの溶液内で独立して感知機能を遂行する、請求項1に記載の構成要素。
- 前記モジュールは、第3のモジュールとして、ターゲット変換モジュール、リポーターモジュール、及び、蛍光性バーコードモジュールから選択される1つのモジュールを含む、請求項1に記載の構成要素。
- 前記モジュールの少なくとも1つは、DNAオリゴヌクレオチドの配列を包含している、請求項1に記載の構成要素。
- 前記モジュールの少なくとも1つは、1つの末端で1つ以上のビオチン修飾を有し、前記微小球はストレプトアビジンで被覆され、前記モジュールは、ビオチン−ストレプトアビジン接合によって前記微小球上で不動化されている、請求項1に記載の構成要素。
- 細孔を含む複数の微小球であって、少なくとも細孔のうちのいくつかは微小球の表面に開口している微小球と、該微小球に移植された複数のモジュールであって、各モジュールはDNA鎖であり、前記モジュールは第1、第2及び第3のテンプレートを含み、前記第1のテンプレートは増幅テンプレートであり、第2のテンプレートは、漏出吸収テンプレート(100pmol pTα、Biotin * A * A * AAAACTCGTC AGAATGp)であって、漏出反応を吸収して、微小球が酵素の混合物と接触するときの非特異的自発的な増幅を回避し、前記第3のテンプレートはターゲット変換テンプレートであり、これにより、第1のテンプレートが所定閾値を超えた刺激を受けるときに限り、DNAが指数関数的に増幅され、前記第3のテンプレートはターゲット核酸配列を補足することができ、その結果、前記第1のテンプレートを刺激し、前記所定閾値を超え、増幅が起きてターゲット配列の存在が感知されるモジュールとを備える構成要素を使用する分子コンピューティングの方法であって、
1つ以上の分子プログラムを作成するモジュール及びその組み合わせを設計するステップと、
各分子プログラムを1組の微小球に付着するステップと、
各々が自分の分子プログラムを搬送するいくつかの微小球を、1つ以上のターゲット化合物及び酵素の混合物を含む溶液と接触させるステップと、
DNAの生成及び交換が各微小球上で移植されたモジュール間で局所的に発生してターゲット配列を検出するように移植された微小球を酵素の混合物とともに一定温度で培養するステップと、を含む方法。 - 前記酵素の混合物は、ポリメラーゼ、ニッカーゼ及びエキソヌクレアーゼのような活性の1つ以上を包含している、請求項10に記載の方法。
- 前記モジュールはリポーターモジュールを含み、該リポーターモジュールは、ターゲット配列の存在が報告されるように増幅テンプレートの生成物を使用して蛍光信号を生成する、請求項10に記載の方法。
- 前記微小球の蛍光性の特性が微小球の1セットのモジュールの性質、及び、微小球の機能を明らかにするように、前記モジュールはバーコード付モジュールを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記構成要素は、異なる微小球がユニークな酵素の混合物と接触するときに、異なる感知動作が異なるタイプの微小球によって同時に行われるように、前記モジュールの異なる組み合わせを備えた異なるタイプの微小球を備える、請求項10に記載の方法。
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