JP6872479B2 - 筋萎縮性側索硬化症の処置 - Google Patents
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Description
本発明は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の処置法に関する。具体的には、本発明は、ヒトSOD1プレmRNA内で選択的スプライシングを起こして、その結果、細胞機構によりスキッピングされたmRNAの破壊をもたらすように適合されているアンチセンス配列の使用を実行する。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は疫学上、孤発性病型(90%〜95%)と家族性病型(5%〜10%)に分類される(Rosen et al., 1993)。家族性病型(fALS)の20%が、スーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)遺伝子の突然変異によって引き起こされる。SOD1金属酵素の機能は、ミトコンドリア酸化的リン酸化の毒性副産物であるスーパーオキシドを、分子状酸素又は過酸化水素へと変換することである。突然変異体SOD1は、疾患の発症機構に関与している神経毒性特性を有する(毒性機能獲得)。実際に、突然変異型のヒトSOD1遺伝子を過剰発現しているトランスジェニックマウス(例えばSOD1G93Aマウス)はALSの大半の病理学的特徴を再現し、これはALS前臨床試験に広く使用されている(Gurney et al., 1994)。したがって、SOD1蓄積の低減は、SOD1に関連したfALSの病型を処置する論理的な戦略として出現した。アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)(Crooke, 2004)又はsiRNA(Dorn et al., 2004)若しくは合成マイクロRNA(Boudreau et al., 2011)のいずれかを用いてのRNA干渉の使用に主に基づいて、中枢神経系(CNS)内のほぼ全ての遺伝子をダウンレギュレートする魅力的な分子アプローチが開発された。
本発明は、ヒトSOD1プレmRNA内でエキソンスキッピングを誘発するように適合されているアンチセンスオリゴヌクレオチドをマウスに投与した場合に、ALSマウスモデルの生存期間が、先行技術のALS治療戦略と比較して、大きく改善され得るという予想外の発見から始まる。
本発明は、ALSを患っているヒト被験者を処置するのに有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)に関する。被験者は、SOD1遺伝子又は他のALS関連遺伝子、例えばSOD1mRNAレベルの上昇をもたらすALS関連遺伝子の突然変異によって引き起こされた孤発性又は家族性の病型のALSを患う(ALSオンラインデータベースALSoD、http://alsod.iop.kcl.ac.uk, April 2014)。被験者は、疾患の症候発生前であっても、症候性段階であってもよい。
−本発明のAON、又は上記のような該AONをコードしているベクター;及び
−野生型SOD1タンパク質をコードしているベクター(例えば野生型ヒトSOD1タンパク質、そのコード配列は、そのコードされるmRNAが、AONにより誘発されるエキソンスキッピングに抵抗性となるように設計されている)
を含む、部品キットに関する。
実施例1:ALSマウスにおけるhSOD1のサイレンシング及び生存期間の改善
材料及び方法
マウス株(動物)、インビボでの電気穿孔、及びアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)
動物の管理は、欧州の実験動物の管理と使用に関する指針に従った。高コピーSOD1G93AマウスのB6SJL−Tg(SOD1*G93A)1Gur/J(JACKSON番号SN2726)はJackson Laboratories(バーハーバー、メイン州)から購入した。
HEK−293T細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含有しているダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、37℃で、5%CO2中で培養した。2’−O−メチルホスホロチオエート(2’OMePS)AONはEurogentecから購入し、最終濃度1μg/μlでH2ORNaseフリー水に再懸濁した。各々のAON 5μgを、製造業者の説明書に従ってオリゴフェクトアミン(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞をRNA抽出のために収集した。
全RNAを細胞から又は新しく凍結させた脊髄からRNA抽出キットNucleoSpin RNAII(Macherey-Nagel)を用いて製造業者のプロトコールにより抽出した。iScript cDNA合成キットプロトコール(Biorad)に従って、オリゴ(dT)プライマー及びランダムヘキサマープライマーを使用して、全RNA 1μgからcDNAを合成した。ヒトSOD1mRNA内のエキソン2の存在を調べるために、RT−PCR分析を、以下のプライマーを使用して、cDNA 200ngから行なった:
正方向プライマー1、ヒトSOD1エキソン1に一致:5’-CTAGCGAGTTATGGCGAC-3’(配列番号5);逆方向プライマー4/5、ヒトSOD1(エキソン4とエキソン5の境界)に一致:5’-GCCAATGATGCAATGGTCTC-3’(配列番号6)。
最も出来栄えの良い2つのAONに相当するDNA配列を、すでに記載されているように(Goyenvalle et al., 2004)、PCR媒介突然変異誘発を使用して、pAAVsc_U7DTex23(親切にもGENETHON、イブリー、フランスによって提供された)にクローニングした。ウイルス粒子のscAAV血清型10を、Dominguez et al.(Dominguez et al., 2011)に以前に記載されているように、トリトランスフェクション法を使用して生成した。ベクター力価をITRのQ−RT−PCRによって決定し;力価はウイルスゲノム(vg)/mlとして表現した。
成体マウスの脊髄への注射のために、50日令のマウスを使用した。マウスを、ケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射(100mg/kgのケタミン、16mg/kgのキシラジン;体重10gあたり0.1ml)を用いて麻酔した。注射はRaoul et al. 2005(Raoul et al., 2005)に報告されているように行なわれた。各ベクターを9.5×1010vg(4.7×1012vg/Kg)含有している総容量10μl(一部位あたり5μl)を各マウスに注射した。
新しく凍結させた脊髄をホモジナイズし、プロテアーゼ阻害剤混液(Complete Mini, Roche Diagnostics)を供給された溶解緩衝液(150mM NaCl、50mMトリス−HCl、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1%NP40、1%SDS)を使用して、タンパク質溶解液を調製した。タンパク質抽出物をDCタンパク質アッセイ(BioRad)によって定量した。30μgを、12%ポリアクリルアミドゲル(Criterion XT 10%ビス−トリス、Biorad)上で分離し、以下の抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した:抗α−チューブリン抗体(T5168、Sigma Aldrich);抗ヒトSOD1抗体(sc−8636、Santa Cruz Biotechnology)。マウス及びウサギIgに対するペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗血清はAmersham Pharmacia Biotechから購入した。ウェスタンブロットを、SuperSignal West Duraキット(Thermoscientific)を使用して展開した。濃度測定分析を、ImageJソフトウェアを使用して行なった。
1)AON設計
ヒトSOD1遺伝子内でのエキソンスキッピングを誘発するために、本発明者らは、ヒトSOD1プレmRNAのスプライスアクセプター部位(SA)と又はエキソンスプライシングエンハンサー(ESE)配列とに干渉するRNA−AONを設計した。ヒトSOD1遺伝子は5つのエキソンから構成され、本発明者らは、エキソン2のスキッピングの誘発を計画した。実際に、SOD1プレmRNAからエキソン2をスキッピングすると、フレームシフトが誘発され、これにより切断短縮されたcDNAが生成され、これによりエキソン4内に中途終止コドン(TGA)が生じる。エキソン2のスキッピングを最適化するために、本発明者らは、イントロン1内のSA配列に標的化するAON配列を設計し、そしてESE配列の標的化は、SAを上回る利点を示す可能性があることが報告されていたので(Goyenvalle et al., 2004)、本発明者らはまた、エキソン2のESE配列を標的化するAONも設計した。ESEは、Ser−Arg−リッチ(SR)タンパク質に結合することによってスプライシングを促進するエキソン内部配列である(Cartegni et al., 2002)。これらの配列を決定するために、本発明者らは、4つの最も豊富なSRタンパク質(SF2/ASF、SC35、SRp40、及びSRp55)に対する結合部位を予測するESEfinderソフトウェアを使用した。図1に、エキソン2内の有望なESE配列が示されている。
本発明者らは、HEK−293T細胞へのトランスフェクション後、hSOD1mRNAレベルを低減させるその効力に基づいて最適なAONを選択した。細胞トランスフェクションを最適化するために、本発明者らは、化学的に改変された2’−O−メチルホスホロチオエート(2’OMePS)AON(Eurogentec)を使用した。なぜなら、この改変は、ヌクレアーゼ及びRNaseHによる分解に対するかなりの抵抗性を付与するからである(Aartsma-Rus et al., 2009)。対照として本発明者らは、各実験でトランスフェクション効率の対照としても使用されていた、混合した蛍光(FAM)標識されたAONを使用した。RT−PCR分析後、本発明者らは、全試料においてヒトSOD1mRNA完全長(355bp)に相当する、PCR産物を観察した。SOD1−AONでトランスフェクトされた細胞において、本発明者らは、スキッピングされたエキソン2の形態に相当する、追加の258bpの産物を観察した(図2)。PCR産物をシークエンスした後、本発明者らは、小さな258bpのバンドに相当する、ヒトSOD1−mRNA内でのエキソン2のスキッピングと(図3)、エキソン4の中途終止コドンの発生を確認した。本発明者らは、選択されたAONが、ヒトSOD1エキソン2のスキッピングを誘発することができたと結論付けた。
U7snRNAは、通常、ヒストンプレmRNA3’末端プロセシングに関与しているが、これをSm/Lsmタンパク質の結合部位(U7 smOpt)における小さな変化によるスプラシング調節のための万能ツールへと変換することができる(Schumperli and Pillai, 2004)。それ故、snRNP粒子に包埋されたアンチセンス配列は分解から保護され、核内に蓄積し、そこでスプライシングが起こる。SOD1G93AマウスにAONを送達するために、本発明者らは、D.Schumperli(Schumperli and Pillai, 2004)によって記載されたU7カセットを使用した。それは、天然U7プロモーター(−267位から+1位)、U7 smOpt snRNA、及び116位に至るまでの下流配列からなる。このカセットをscAAV骨格の逆位末端配列(ITR)間に配置し、U7smOpt内のヒストンプレmRNAに対して相補的な18塩基の天然配列を、2つの選択された20塩基のAON配列(及び対照配列、CTR;Pietri-Rouxel, 2009 et al.によって記載)によって置き換え、本発明者らは対応するウイルス粒子(すなわち、AAV10−U7−CTR及びAAV10−U7−hSOD1)を作製した。
hSOD1 RNAレベルを低減させるその効力を分析するために、AAV10−U7−CTL及びAAV10−U7−hSOD1を、50日令のSODG93Aマウスの脊髄に直接注射した(AAV10−U7−hSOD1ではn=3、AAV10−U7−CTRではn=2)。注射から4週間後、脊髄を取り出し、SODmRNAを、RT−PCRを使用してエキソン2のスキッピングについて分析した(図5)。ヒトSOD1発現もまた、以前のインビトロでの実験に記載されているようにリアルタイムPCR分析によって評価した(図6)。予想された通り、エキソン2のスキッピングされた形態が、AAV10−U7−hSOD1を注射された動物の脊髄においてのみ観察され(図5)、完全長のhSOD1mRNAは80%超低減した(図6)。
本研究は、家族性筋萎縮性側索硬化症のための非常に効果的な遺伝子療法処置を同定することを目指した橋渡しプロジェクトである。血流及びCNSへのscAAV10の共送達(Co−IV/ICV)は、広範な脊髄及び全身への遺伝子送達のための強力なアプローチである。Co−IV/ICV AAV10遺伝子導入と効果的なエキソンスキッピング戦略の組合せは、hSOD1の強力なサイレンシングを可能とし、そしてALSげっ歯類において現在までに報告されている中で最も高い生存期間の延長を媒介する。比較すると、ASOの脳灌流を使用したクリーブランド/アイシス臨床試験は、ラット生存期間の9.1%の延長に基づき(Smith et al., 2006)、38%の生存期間の延長が近年、AAV9−shRNAを使用してKasparのチームによって公表された(Foust et al., 2013)。
AAV10−U7−hSOD1送達の治療利点を、野生型hSOD1タンパク質のさらなる発現によって改善することができる。実際に、突然変異型のヒトSOD1mRNAに特異的に標的化しないAAV10−U7−hSOD1の送達は、内因性野生型SOD1タンパク質のサイレンシングも誘発する可能性があり、これにより、副作用がトリガーされる可能性がある。AAV10−U7−hSOD1による内因性野生型SOD1のサイレンシングは、このベクターに、エキソンのスキッピングを回避するための「サイレント」突然変異を含む野生型SOD1配列を導入することによって補うことができる。
ベクター
N末端又はC末端にflagタグを有するhSOD1optをコードしているDNA配列をGene Art(Life technologies)によって合成し、そしてまず、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、キメラβグロビンイントロン、独特な制限酵素部位NheI、及びサルウイルス40(SV40)転写終結シグナルを有する、本発明者らの研究室で入手できる、空のpAAVベクターに酵素的消化によってクローニングした。PGKプロモーター制御下にあるhSOD1optを含有しているカセットを、PCRによって、pAAV−U7−SOD1ベクター又はpAAV−U7−CTRに、U7プロモーターの前にそして2つの方向でクローニングした。同じ方法を用いて、研究室で入手可能なプラスミドから増幅させたPGK−GFPを、対照として、各々のpAAV−U7に挿入した。
各プラスミド 2μgを、FBSを含まないOPTIMEM(Life technologies)培地中でリポフェクトアミン及びPlus試薬(Life technologies)を用いてトランスフェクトした(製造業者の説明書に従って)。37℃で5%CO2中で3時間後、トランスフェクションを、10%FBSを含むDMEMの添加により停止した。
細胞をトランスフェクションから48時間後に収集した;タンパク質溶解液を実施例1に記載のように調製した。ウェスタンブロットを、以下の抗体を用いて行なった:抗Flag M2抗体(Sigma)及び抗アクチン抗体(Sigma)。マウス及びウサギIgに対するペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗血清はAmersham Pharmacia Biotechから購入した。ウェスタンブロットを、SuperSignal West Duraキット(Thermoscientific)を使用して展開した。
毒性を有する突然変異型のhSOD1の抑制及び機能的hSOD1タンパク質の発現の両方を得るために、本発明者らは、「消去−置換」戦略を考え、ここではサイレンシング用のpAAV−U7−hSOD1ベクターを、野生型SOD1発現のための外因性hSOD1cDNAと共に提供した。野生型hSOD1コード配列(hSOD1opt)は、U7アンチセンス作用に対して不応性とするためにアンチセンス配列に対して最大数のミスマッチを有するように設計された(GeneArt, Life technologies)。外因性hSOD1タンパク質の同定を可能とするために、Flag−タグペプチドをcDNAに融合させた。FlagのC末端又はN末端の位置は、hSOD1opt発現及び/又は機能に対して影響を及ぼす可能性があるので、これをタンパク質のN末端(Flag−hSOD1opt)又はC末端(hSOD1opt−Flag)のいずれかに付加した。配列をホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターの制御下に、U7プロモーターと同じ方向に又は逆の方向に配置した。最後の治療用AAVベクターのAAV−U7−hSOD1−Flag−hSOD1opt及びAAV−U7−hSOD1−Flagを図9に示す。PGKプロモーターの制御下に置かれた緑蛍光タンパク質(GFP)をコードしている配列も、対照としてのpAAV−U7ベクターに挿入した(pAAV−U7−hSOD1−GFP)。
Claims (18)
- ヒトSOD1プレmRNAに標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは該プレmRNA内でエキソンスキッピングを誘発するように適合されており、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1又は配列番号4を含む、該アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1及び配列番号4を含む、請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、U7核内低分子RNAなどの核内低分子RNAにより改変されている、請求項1〜2のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むベクター。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしているウイルスベクターである、請求項4記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターがAAVベクターである、請求項5記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、AAV9又はAAV10ベクターである、請求項6記載のベクター。
- 前記ベクターはさらに、ヒトSOD1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有している発現カセットを含み、該ヌクレオチド配列は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが該ヌクレオチド配列によってコードされるプレmRNA内でエキソンスキッピングを誘発することができないように設計されている、請求項4〜7のいずれか一項記載のベクター。
- 筋萎縮性側索硬化症の処置法に使用するための、請求項1〜3のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項4〜7のいずれか一項記載のベクター。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記ベクターが、静脈内及び/又は脳室内経路を介しての投与用である、請求項9記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はベクター。
- 配列番号11又は12に示される配列を含む核酸分子。
- 請求項11の核酸分子を含む発現カセット。
- 請求項11の核酸分子又は請求項12の発現カセットを含むベクター。
- 前記ベクターがプラスミド又はウイルスベクターである、請求項13記載のベクター。
- 請求項14記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞又は原核細胞である、請求項15記載の宿主細胞。
- 哺乳動物細胞、ヒト細胞、又は非ヒト細胞である、請求項15記載の宿主細胞。
- 前記細胞がヒト細胞である場合、該細胞はヒト胚性幹細胞ではない、請求項17記載の宿主細胞。
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