JP6870007B2 - Test substance detection method and fluorescence detection method - Google Patents
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本発明は、被検物質検出方法、及び、蛍光検出方法に関し、特に、検出感度を向上させる技術に関する。 The present invention relates to a method for detecting a test substance and a method for detecting fluorescence, and more particularly to a technique for improving detection sensitivity.
従来、生体試料中に含まれる遺伝子やタンパク質等の被検物質を検出する方法として、光を照射すると活性化する標識物質を利用して、被検物質を検出する被検物質検出方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。 Conventionally, as a method for detecting a test substance such as a gene or protein contained in a biological sample, a test substance detection method for detecting a test substance using a labeling substance that is activated when irradiated with light has been proposed. (See, for example, Patent Document 1).
この種の被検物質検出方法として、被検物質に結合した標識物質である蛍光物質を光励起した際に、蛍光物質から放射される光を検出することにより、被検物質を検出する方法もある。この被検物質の検出方法において、被検物質が微量である場合、被検物質に結合した蛍光物質から放射される光も微弱となる。したがって、蛍光物質から放射された光を感度よく検出するには、検出器から出力される検出信号のＳ／Ｎ比向上を図ることが重要となる。 As a method for detecting a test substance of this type, there is also a method for detecting a test substance by detecting the light emitted from the fluorescent substance when the fluorescent substance, which is a labeling substance bound to the test substance, is photoexcited. .. In this method for detecting a test substance, when the amount of the test substance is very small, the light emitted from the fluorescent substance bound to the test substance is also weak. Therefore, in order to detect the light emitted from the fluorescent substance with high sensitivity, it is important to improve the S / N ratio of the detection signal output from the detector.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比向上を図ることができる被検物質検出方法、及び、蛍光検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a test substance detection method and a fluorescence detection method capable of improving the S / N ratio of a fluorescence detection signal.
ある観点に係る被検物質検出方法は、生体試料に含まれる被検物質を検出する被検物質の検出方法であって、２４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の第１ピーク波長の光が照射されると４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第２ピーク波長の光を発する蛍光物質と被検物質とを含む複合体に、第１ピーク波長の光を照射する工程と、光検出器により、第１ピーク波長の光が照射された蛍光物質から発せられる第２ピーク波長の光を検出し、蛍光像の画像を得る工程と、第１ピーク波長とは異なる第３ピーク波長の光を複合体に照射する工程と、光検出器により、第３ピーク波長の光が照射された被検物質の明視野像の画像を得る工程と、を備え、光検出器は、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下のピーク波長の全域における量子効率が、第１ピーク波長における量子効率の２倍以上であり、光検出器が、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する複数色の光を検出する。 The test substance detection method according to a certain viewpoint is a test substance detection method for detecting a test substance contained in a biological sample, and is 450 nm or more when irradiated with light having a first peak wavelength of 240 nm or more and 300 nm or less. A step of irradiating a complex containing a fluorescent substance and a test substance that emits light having a second peak wavelength of 900 nm or less with light having a first peak wavelength, and a light detector irradiating light with a first peak wavelength. A step of detecting the light of the second peak wavelength emitted from the fluorescent substance and obtaining an image of a fluorescence image, a step of irradiating the composite with light of a third peak wavelength different from the first peak wavelength, and a light detector. The light detector is provided with a step of obtaining a bright-field image of the test substance irradiated with light having a third peak wavelength, and the optical detector has a quantum efficiency of the first in the entire peak wavelength range of 450 nm or more and 900 nm or less. Ri der least twice the quantum efficiency at the peak wavelength, the light detector detects a plurality of colors of light having a peak wavelength in 900nm the range above 450nm.
他の観点に係る被検物質検出方法は、生体試料に含まれる被検物質を検出する被検物質検出方法であって、被検物質と酵素とを含む複合体中の酵素と基質との反応により生じ且つ２４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の第１ピーク波長の光が照射されると４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第２ピーク波長の光を発する蛍光物質に、第１ピーク波長の光を照射する工程と、光検出器により、第１ピーク波長の光が照射された蛍光物質から発せられる第２ピーク波長の光を検出し、蛍光像の画像を得る工程と、第１ピーク波長とは異なる第３ピーク波長の光を複合体に照射する工程と、光検出器により、第３ピーク波長の光が照射された被検物質の明視野像の画像を得る工程と、を備え、光検出器は、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下のピーク波長の全域における量子効率が、第１ピーク波長における量子効率の２倍以上であり、光検出器が、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する複数色の光を検出する。 The test substance detection method according to another viewpoint is a test substance detection method for detecting a test substance contained in a biological sample, and is a reaction between an enzyme and a substrate in a complex containing the test substance and the enzyme. The step of irradiating the fluorescent substance that emits the light of the second peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less when the light of the first peak wavelength of 240 nm or more and 300 nm or less is irradiated with the light of the first peak wavelength and the light detection. A process of detecting the light of the second peak wavelength emitted from the fluorescent substance irradiated with the light of the first peak wavelength and obtaining an image of a fluorescence image, and the light of the third peak wavelength different from the first peak wavelength. The light detector is 450 nm or more and 900 nm or less. quantum efficiency at entire region of the peak wavelength of, der least twice the quantum efficiency at the first peak wavelength is, the light detector detects a plurality of colors of light having a peak wavelength in 900nm the range above 450nm.
ある観点に係る蛍光検出方法は、２４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の第１ピーク波長の光が照射されると４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第２ピーク波長の光を発する蛍光物質に、第１ピーク波長の光を照射する工程と、光検出器により、第１ピーク波長の光が照射された蛍光物質から発せられる第２ピーク波長の光を検出し、蛍光像の画像を得る工程と、第１ピーク波長とは異なる第３ピーク波長の光を蛍光物質に照射する工程と、光検出器により、第３ピーク波長の光が照射された蛍光物質の明視野像を得る工程と、を備え、光検出器は、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下のピーク波長の全域における量子効率が、第１ピーク波長における量子効率の２倍以上であり、蛍光像の画像を得る工程は、光検出器により、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する複数色の光を検出する。 In the fluorescence detection method according to a certain viewpoint, a fluorescent substance that emits light having a second peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less when irradiated with light having a first peak wavelength of 240 nm or more and 300 nm or less is irradiated with light having a first peak wavelength. The step of detecting the light of the second peak wavelength emitted from the fluorescent substance irradiated with the light of the first peak wavelength by the light detector and obtaining the image of the fluorescence image are different from the step of obtaining the image of the fluorescence image. irradiating light of a third peak wavelength in a fluorescent substance, a photodetector, a step of light to obtain a bright field image of the fluorescent material irradiated in the third peak wavelength, comprising a photodetector, 450 nm 900nm or more following quantum efficiency at entire region of the peak wavelength, der least twice the quantum efficiency at the first peak wavelength is, to obtain an image of the fluorescence image by the light detector, a peak in 900nm the range above 450nm Detects light of multiple colors with wavelength .
本発明によれば、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比向上を図ることができる被検物質検出方法、及び、蛍光検出方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a test substance detection method capable of improving the S / N ratio of a fluorescence detection signal and a fluorescence detection method.
＜第１実施形態＞
＜１＞構成
第１実施形態に係る被検物質検出システムの構成について説明する。被検物質検出システムは、被検物質検出装置１と、信号変換装置２と、画像処理装置３と、を備える。
<First Embodiment>
<1> Configuration The configuration of the test substance detection system according to the first embodiment will be described. The test substance detection system includes a test
被検物質検出装置１は、光源１１と、光拡散部材１２と、被検物質保持部１３と、光検出器６と、を備える。光源１１と、光拡散部材１２と、被検物質保持部１３と、光検出器６は、それぞれこの順で積層された状態で配置されている。被検物質保持部１３における光源１１側には、光拡散部材１２が配置されている。被検物質検出装置１は、光源１１および光拡散部材１２を含む第１ユニット１ａと、被検物質保持部１３および光検出器６を含む第２ユニット１ｂとから構成されている。この光検出器６は、後述の受光部１６を含む。
The test
光源１１は、第１ピーク波長の光を出射する。第１実施形態の第１ピーク波長は、２７０ｎｍである。光源１１としては、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）等の半導体発光素子が用いられる。光源１１が、電球等に比べて消費電力が比較的低いＬＥＤ等の半導体発光素子から構成されているので、光源１１として電球等を用いた構成に比べて省電力化を図ることができる。この光源１１から光が照射される際、領域Ｓ２２には被検物質保持部１３における被検物質と蛍光物質を含む複合体が存在している。光源１１から光が領域Ｓ２２に照射されると、当該複合体に含まれる蛍光物質が光励起される。蛍光物質は、第１ピーク波長の光により励起されると、ピーク波長が第１ピーク波長とは異なる第２ピーク波長の光を発する蛍光物質である。第１実施形態では、第２ピーク波長は７０５ｎｍである。蛍光物質としては、量子ドットが用いられる。なお、量子ドットについては、後出する＜３＞において詳細に説明する。
The
光拡散部材１２は、光源１１から入力される光を拡散する機能を有する。この光拡散部材１２としては、例えば透明な基材中に基材とは屈折率が異なる透明粒子が分散されたもの、又は透明な基材の表面がブラスト加工されたものを使用すればよい。図２中の矢印Ｌ１で示すように、光源１１から光拡散部材１２の光源１１に対向する一面側に入射する光は、光拡散部材１２の厚さ方向に直交する方向に拡散し、図２中の矢印Ｌ２で示すように、光拡散部材１２の光源１１側とは反対側の他面側から出射する。
The
図２に示すように、被検物質保持部１３は、基材１３ａと、基材１３ａにおける光拡散部材１２に対向する面側に固定化された捕捉物質２１とから構成される。この被検物質保持部１３は、捕捉物質２１が被検物質を捕捉した状態で被検物質を保持する。
As shown in FIG. 2, the test
基材１３ａは、透明材料から板状に形成されており、後述の光検出器６の光電変換素子１６１を覆うように配置されている。
The
捕捉物質２１は、基材１３ａにおける光拡散部材１２に対向する面側に固定化されている。この捕捉物質２１の基材１３ａへの固定化は、基材１３ａに結合する結合基等を介して行なうことができる。この結合基としては、例えば、チオール基、ヒドロキシル基、リン酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基、アミノ基等が挙げられる。基材１３ａ上への捕捉物質２１の固定化は、物理吸着法やイオン結合法等により行なわれていてもよい。基材１３ａ上における捕捉物質２１の固定量は、特に限定されるものではなく、用途及び目的に応じて設定することができる。
The trapping
捕捉物質２１は、被検物質の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸である場合、捕捉物質２１として、核酸にハイブリダイズする核酸プローブや核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。被検物質がタンパク質またはペプチドである場合、捕捉物質２１として、タンパク質やペプチドに対する抗体等を用いることができる。このように、被検物質保持部１３は、捕捉物質２１に対応する特定の有機物質を選択的に保持することができる。したがって、被検物質とともに他の夾雑物質が混合した試料の中から、被検物質だけを取り出すことが可能となる。
The trapping
捕捉物質２１による被検物質の捕捉は、例えば、捕捉物質２１と被検物質とが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質２１と被検物質とが結合する条件は、被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸であり、捕捉物質２１が核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下において行なうことができる。また。被検物質が核酸、タンパク質またはペプチドであり、捕捉物質２１が核酸に対する抗体やタンパク質に対する抗体またはペプチドに対する抗体である場合、被検物質の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうのに適した溶液中で行なうことができる。更に、被検物質が、リガンドであり、捕捉物質２１がリガンドに対するレセプタである場合や、被検物質がレセプタであり、捕捉物質２１がレセプタに対するリガンドである場合、被検物質の捕捉は、リガンドとレセプタとの結合に適した溶液中で行なうことができる。
The
光検出器６は、主として、受光部１６と、支持基板１６２と、受光部１６と支持基板１６２とを電気的に接続するためのワイヤ１６４と、支持基板１６２と受光部１６との間に設けられた樹脂部１６２ａと、を備える。
The
受光部１６は、第１保護層１４と第２保護層１５と光電変換素子１６１と、を備える。第１保護層１４は、第２保護層１５の上に積層され、第２保護層１５は、光電変換素子１６１の上に積層されている。ここで、第１保護層１４と第２保護層１５と光電変換素子１６１とは、一体的に形成されている。
The
このような光検出器６は、図３に示す感度特性を有する。第１実施形態では、光検出器６は、受光部１６にシリコン基板を用いた光電変換素子が用いられたセンサであり、より具体的には、シリコン基板を用いたフォトダイオードが用いられたＣＭＯＳイメージセンサである。このＣＭＯＳイメージセンサは、シリコン基板にフォトダイオードやＭＯＳＦＥＴ、配線等が周知のイオン注入技術や成膜技術等を利用して作り込まれたものである。
Such an
ＣＭＯＳイメージセンサは、フォトダイオードと当該フォトダイオードに接続されたＭＯＳＦＥＴとからなる複数のセル（図示せず）が、格子状に配列された構成を有する。このように、ＣＭＯＳイメージセンサのような固体撮像素子を用いることで、光検出器６を構成する複数のセルの集積化を図ることができるので、その分、光検出器で得られる撮像画像の解像度の向上を図ることができ、ひいては、被検物質の検出感度の向上を図ることができる。ＣＭＯＳイメージセンサは、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ）等に比べて消費電力が比較的低いので、光検出器としてＰＭＴ等を用いた構成に比べて省電力化を図ることができる。
The CMOS image sensor has a configuration in which a plurality of cells (not shown) including a photodiode and a MOSFET connected to the photodiode are arranged in a grid pattern. In this way, by using a solid-state image sensor such as a CMOS image sensor, it is possible to integrate a plurality of cells constituting the
第１実施形態に係る光検出器６の感度特性は図３に示すとおりである。図３中、ηは光検出器６の量子効率、ηｍａｘは量子効率の最大値、ηｔｈは量子効率５％を示す。最大量子効率ηｍａｘは４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の波長帯域に含まれている。光検出器６は、第１ピーク波長における量子効率が約０％である一方、第２ピーク波長における量子効率が約４０％であり、第２ピーク波長における量子効率は第１ピーク波長における量子効率の２倍をはるかに上回っている。
The sensitivity characteristics of the
第１保護層１４および第２保護層１５は、光電変換素子１６１を保護する層である。第１保護層１４は、例えば窒化シリコン（ＳｉＮ）膜から構成され、第２保護層１５は、例えば酸化シリコン（ＳｉＯ２）膜から構成される。この第２保護層１５は、第１保護層１４を補強する役割を果たす。第１保護層１４における被検物質保持部１３側には、複数のマイクロレンズから構成されるマイクロレンズアレイが設けられている。
The first
光電変換素子１６１は、例えばシリコン基板を用いたフォトダイオードである。光電変換素子１６１の各セルで受光された光は、フォトダイオードにより検出信号に変換されて支持基板１６２側へ送られる。第１保護層１４には、この光電変換素子１６１を構成する複数のセルそれぞれに対応する位置にマイクロレンズが１つずつ設けられている。光電変換素子１６１の周部には、各セルからの信号を外部に取り出すための端子が設けられている。
The
支持基板１６２は、受光部１６を支持する。支持基板１６２は、シリコン基板から形成され、中央部に凹部が形成されるとともに、凹部の外周部に信号取り出し用の端子（図示せず）が複数設けられている。支持基板１６２の凹部の内側には、受光部１６が配設されている。
The
ワイヤ１６４は、光電変換素子１６１の周部に設けられた端子と、支持基板１６２に設けられた端子とを接続している。このワイヤ１６４は、樹脂部１６２ａ内に埋設されている。
The
ところで、第１ユニット１ａは、他に、例えば光源１１を移動可能に支持する支持部材（図示せず）と、光源１１から照射される光の強度や向き、位置等を制御する光源制御部（図示せず）とを備えている。ここで、支持部材は、光源１１の向きや位置を変更するための光源移動機構を有している。
By the way, the
図４は、第１実施形態に係る被検物質検出装置１の第２ユニット１ｂの概略断面図である。図４に示すように、第２ユニット１ｂは、被検物質保持部１３と光検出器６とを収納するハウジング１７を備える。ハウジング１７には、光検出器６の受光部１６に光を取り込むための窓部１７ａと、受光部１６に接続された信号線をハウジング１７の外部に導出させるための信号線導出孔１７ｂとが設けられている。ハウジング１７の窓部１７ａは、被検物質保持部１３により覆われている。ハウジング１７の信号線導出孔１７ｂの内面と信号線の外面との間には、水密性を保つようにブッシング１８が設けられている。
FIG. 4 is a schematic cross-sectional view of the
信号変換装置２は、光電変換素子１６１から取得した信号を画像情報に変換して画像処理装置３へ出力する。この信号変換装置２は、例えば光電変換素子１６１から取得したアナログ信号をデジタル信号に変換するアナログデジタル変換器を含んで構成されている。
The
画像処理装置３は、信号変換装置２から入力される画像情報に基づいて、被検物質保持部１３上の画像を生成し、生成した画像を表示部３ａに表示する。ここで、表示部３ａは、例えばディスプレイ等から構成されている。
The
画像処理装置３は、信号変換装置２から入力される画像情報に基づいて、光検出器６で検出される光の光量を算出することができる。画像処理装置３は、光検出器６で検出可能な光の光量と蛍光物質の量との関係を示す検量データを保持している。画像処理装置３は、この検量データに基づき、蛍光物質の量を算出するとともに、算出した蛍光物質の量から検物質の量を算出する機能を有する。
The
この画像処理装置３は、ＣＰＵと、ＲＯＭ、ＲＡＭ等のメモリと、を備えるコンピュータを含んで構成されている。ＣＰＵが、メモリに記憶されたコンピュータプログラムを実行することにより、画像処理装置３の各種機能が実現されている。
The
＜２＞被検物質の検出方法
次に、第１実施形態に係る被検物質検出装置１を用いた被検物質検出方法について説明する。
図５および図６（ａ−１）〜（ａ−３）は、第１実施形態に係る被検物質検出方法の処理手順を説明するための模式図である。
<2> Test substance detection method Next, a test substance detection method using the test
5 and 6 (a-1) to 6 (a-3) are schematic views for explaining the processing procedure of the test substance detection method according to the first embodiment.
まず、図５（ａ）に示すように、例えばディスペンサＤ１を使用して、被検物質が分散された試料Ｓ１１を、被検物質保持部１３上に滴下する。試料Ｓ１１は、例えば、ハイブリダイゼーション用緩衝液を含む液体中に被検物質が分散したものである。この工程により、被検物質保持部１３には、捕捉物質により被検物質が捕捉されている領域Ｓ２１が形成される。
First, as shown in FIG. 5A, for example, using the dispenser D1, the sample S11 in which the test substance is dispersed is dropped onto the test
このとき、図６（ａ−１）や（ａ−２）に示すように、試料Ｓ１１中に分散している被検物質３１が、被検物質保持部１３上に設けられた捕捉物質２１によって捕捉される。例えば、被検物質３１がタンパク質から構成され、捕捉物質２１として被検物質３１に対する抗体を用いた場合、捕捉物質２１は、タンパク質から構成される被検物質３１を捕捉する。このとき、捕捉物質２１は、液体試料中の被検物質３１を選択的に捕捉し、被検物質３１以外の他の物質（夾雑物質）を捕捉しない。
At this time, as shown in FIGS. 6 (a-1) and 6 (a-2), the
次に、図５（ｂ）に示すように、Tris Buffer Saline with Tween 20、又はPhosphate buffered saline with Tween 20等の洗浄液Ｗ１を用いて、被検物質保持部１３から試料Ｓ１１を除去する。このとき、ユーザは、例えば被検物質検出装置１の第２ユニット１ｂだけを被検物質検出装置１から取り外して洗浄すればよい。
Next, as shown in FIG. 5B, sample S11 is removed from the test
これにより、被検物質保持部１３における領域Ｓ２１に存在する被検物質３１のみが残る。なお、以下の説明においては、「Tris Buffer Saline with Tween 20」のことを「TBS-T」又は「TBS」ということがある。
As a result, only the
続いて、図５（ｃ）に示すように、例えばディスペンサＤ２を使用して、蛍光物質である量子ドットを保持しており、捕捉物質２１に捕捉された被検物質３１に結合する結合物質が分散された試薬Ｓ１２を、被検物質保持部１３における領域Ｓ２１に滴下する。この工程により、被検物質保持部１３には、捕捉物質２１と被検物質３１と量子ドットとを含む複合体が存在する領域Ｓ２２が形成される。図６（ａ−３）に示すように、領域Ｓ２２には、捕捉物質２１と被検物質３１と量子ドットを保持した結合物質４１とを含む複合体が形成されている。試薬Ｓ１２は、例えば、ハイブリダイゼーション用緩衝液を含む液体中に量子ドットを保持した抗体が分散したものである。このハイブリタイゼーション用緩衝液は、例えば試料Ｓ１１に含まれるものと同じものを採用すればよい。
Subsequently, as shown in FIG. 5 (c), for example, a dispenser D2 is used to hold a quantum dot which is a fluorescent substance, and a binding substance which binds to the
その後、図５（ｄ）に示すように、Tris Buffer Saline with Tween 20、又はPhosphate buffered saline with Tween 20等の洗浄液Ｗ２を用いて、被検物質保持部１３から試薬Ｓ１２を除去する。このとき、ユーザは、例えば被検物質検出装置１の第２ユニット１ｂだけを被検物質検出装置１から取り外して洗浄すればよい。
Then, as shown in FIG. 5D, the reagent S12 is removed from the test
この工程により、被検物質保持部１３から夾雑物質が除去され、被検物質保持部１３における領域Ｓ２２に存在する、捕捉物質２１と被検物質３１と量子ドットを保持した結合物質４１とを含む複合体のみが残る。
By this step, the contaminants are removed from the test
その後、図５（ｅ）に示すように、光源１１から光Ｌ２を、被検物質保持部１３における領域Ｓ２２に照射することにより、領域Ｓ２２に存在する複合体に含まれる量子ドットは蛍光を発する。この量子ドットから発せられる光Ｋ１は、光検出器６の光電変換素子１６１で受光される。
After that, as shown in FIG. 5E, by irradiating the region S22 in the test
光検出器６は、光電変換素子１６１が量子ドットから発せられる光Ｋ１を受光すると、当該光Ｋ１に対応する検出信号を信号変換装置２に入力する。この工程により、信号変換装置２は、光検出器６から取得した検出信号を画像情報に変換して画像処理装置３へ出力する。画像処理装置３は、画像情報に基づいて画像を生成し表示部３ａに表示する。
When the
＜３＞量子ドットについて
次に、第１実施形態に係る量子ドットについて詳細に説明する。
<3> Quantum Dots Next, the quantum dots according to the first embodiment will be described in detail.
図６（ｂ−１）は、第１実施形態に係る被検物質検出方法で用いられる量子ドットの概略構成図であり、図６（ｂ−２）は、図６（ｂ−１）におけるコア４１１およびシェル４１２部分のエネルギバンド図である。
FIG. 6 (b-1) is a schematic configuration diagram of quantum dots used in the test substance detection method according to the first embodiment, and FIG. 6 (b-2) is a core in FIG. 6 (b-1). It is an energy band diagram of a
図６（ｂ−１）に示すように、量子ドット４１０は、コア４１１と、コア４１１を被覆するシェル４１２と、シェル４１２を被覆する有機層４１３と、有機層４１３に結合している修飾物質４１４と、から構成されている。
As shown in FIG. 6 (b-1), the
コア４１１は、第１半導体から構成されている。図６（ｂ−２）に示すように、シェル４１２は、第１半導体に比べてバンドギャップが広い第２半導体から構成されている。この第１半導体と第２半導体との組み合わせとしては、例えばＩｎＰ／ＺｎＳ、ＣｕＩｎＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ等が挙げられる。
The
量子ドット４１０としては、コア４１１とシェル４１２とが同じ材料から構成されているものであってもよい。この場合、コア４１１およびシェル４１２を構成する第１、第２半導体としては、例えばＣｄＴｅ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ等が挙げられる。
As the
有機層４１３は、ＴＯＰＯ（トリオクチルフォスフィンオキシド）やＨＤＡ（ヘキサデシルアミン）等から構成されている。
The
修飾物質４１４は、例えばグルタチオン等のトリペプチドから構成されている。なお、修飾物質４１４としては、トリペプチドに限定されるものではなく、例えば、合成化合物であるチオールやポリエチレンイミン、天然物由来のペプチド、糖鎖、リン脂質等から構成されていてもよい。
The
図７は、量子ドット４１０の、吸収スペクトルと蛍光スペクトルとを示す図である。ここでは、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルは、平均粒径が互いに異なる７種類の量子ドットについて測定した結果を示している。測定された量子ドット４１０は、コア４１１を構成する第１半導体がＣｄＳｅであり、シェル４１２を構成する第２半導体がＺｎＳである。なお、図７における、吸収スペクトル（ｊ−２）（ｊ＝１〜７）および蛍光スペクトル（ｋ−１）（ｋ＝１〜７）は、番号ｊ，ｋが大きいものほど平均粒径が小さいものに対応する。
FIG. 7 is a diagram showing an absorption spectrum and a fluorescence spectrum of the
図７に示すように、量子ドット４１０の吸収スペクトル（ｊ−２）（ｊ＝１〜７）に対して、蛍光スペクトル（ｋ−１）（ｋ＝１〜７）は長波長側にシフト（ストークスシフト）している。量子ドット４１０の蛍光スペクトル（ｋ−１）（ｋ＝１〜７）は、量子ドット４１０のコア４１１の平均粒径が小さくなるほど短波長側にシフトしている。
As shown in FIG. 7, the fluorescence spectra (k-1) (k = 1 to 7) are shifted to the long wavelength side with respect to the absorption spectra (j-2) (j = 1 to 7) of the quantum dots 410 ( Stokes shift). The fluorescence spectrum (k-1) (k = 1 to 7) of the
このように、蛍光物質として量子ドット４１０を採用すれば、量子ドット４１０の平均粒径を変化させることにより、量子ドット４１０から放射される光の波長帯域を変更することができる。したがって、例えば光検出器６の感度特性に応じて量子ドット４１０の平均粒径を適宜設定することにより、被検物質の検出感度の向上を図ることができる。この観点から、量子ドットの平均粒径は、１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
In this way, if the
量子ドット４１０は、例えば、液相で行う化学合成法を利用して作製することができる。具体的には、コア４１１およびシェル４１２の表面がＴＯＰＯやＨＤＡ等の有機層で被覆された粒子（以下、「表面修飾前量子ドット」と称する）を、配位性有機溶媒中で化学合成することにより作製する。なお、量子ドットは、表面修飾前量子ドットの表面の有機層を、両親媒性のチオール化合物等で置換する方法（配位子置換法）により作製することもできる。量子ドットは、他に、表面修飾前量子ドットの表面の有機層を両親媒性ポリマで被覆する（カプセル化法）ことにより、作製することもできる。
The
以上説明したように、第１実施形態に係る被検物質検出方法において、１９０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下の第１ピーク波長の光を蛍光物質に照射すると、蛍光物質は４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第２ピーク波長の光を発する。蛍光物質から発せられる第２ピーク波長の光は、第２ピーク波長における量子効率が、第１ピーク波長における量子効率の２倍以上である光検出器６により検出される。これにより、光検出器は第２ピーク波長の光より第１ピーク波長の光を検出しにくくなり、第１ピーク波長の光を検出することによるバックグラウンドレベルが低くなるので、その分、微弱な第２ピーク波長の光を検出することが可能となる。つまり、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比が向上する。そのため、高い検出感度で、被検物質を検出することができる。
As described above, in the test substance detection method according to the first embodiment, when the fluorescent substance is irradiated with light having a first peak wavelength of 190 nm or more and 350 nm or less, the fluorescent substance has a second peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less. It emits light. The light of the second peak wavelength emitted from the fluorescent substance is detected by the
＜第２実施形態＞
第２実施形態に係る被検物質検出方法は、第１実施形態に係る被検物質検出装置と同様の被検物質検出装置を使用する。第１実施形態では、捕捉物質２１に捕捉された被検物質３１に結合する結合物質として、量子ドットを保持した結合物質を用い、量子ドットから発せられる第２ピーク波長の光を検出することにより、被検物質３１を検出したが、第２実施形態に係る被検物質検出方法は、第１実施形態と異なり、捕捉物質２１に捕捉された被検物質３１に結合する結合物質として、酵素標識された結合物質を用い、酵素と基質との反応により生じる蛍光物質から発せられる第２ピーク波長の光を検出することにより、被検物質３１を検出する。ここでは、被検物質検出装置の構成についての説明は省略する。被検物質検出方法のみについて説明する。
<Second Embodiment>
The test substance detection method according to the second embodiment uses the same test substance detection device as the test substance detection device according to the first embodiment. In the first embodiment, a binding substance holding a quantum dot is used as a binding substance that binds to the
図８および図９は、第２実施形態に係る被検物質検出方法の処理手順を説明するための模式図である。
まず、第１実施形態で説明した方法と同様の方法により、被検物質保持部１３に、捕捉物質により被検物質が捕捉されている領域Ｓ２１（図５（ｂ）参照）を形成する。ここにおいて、図６（ａ−２）に示すように、試料Ｓ１１中に分散している被検物質３１が、被検物質保持部１３上に設けられた捕捉物質２１によって捕捉される。
8 and 9 are schematic views for explaining the processing procedure of the test substance detection method according to the second embodiment.
First, a region S21 (see FIG. 5B) in which the test substance is captured by the trapping substance is formed in the test
次に、図８（ａ）に示すように、例えばディスペンサＤ２１を使用して、酵素標識された結合物質２４１が分散された試薬Ｓ２１２を、被検物質保持部１３における領域Ｓ２１に滴下する。すると、被検物質保持部１３には、捕捉物質２１と被検物質３１と酵素標識された結合物質２４１とを含む複合体が存在する領域Ｓ２３が形成される。ここで、試薬Ｓ２１２は、例えば、ハイブリダイゼーション用緩衝液を含む液体中に酵素標識された抗体が分散したものである。酵素（図９の２４１１）としては、例えばペルオキシターゼやアルカリフォスターゼを採用すればよい。ハイブリタイゼーション用緩衝液は、例えば第１実施形態で説明した試料Ｓ１１に含まれるものと同じものを採用すればよい。
Next, as shown in FIG. 8A, the reagent S212 in which the enzyme-labeled
図９（ａ）および（ｂ）に示すように、試薬Ｓ２１２中に分散している酵素標識された結合物質２４１は、領域Ｓ２３に存在する捕捉物質２１に捕捉された被検物質３１に結合する。これにより、捕捉物質２１と被検物質３１と酵素標識された結合物質２４１とを含む複合体が形成される。
As shown in FIGS. 9A and 9B, the enzyme-labeled
次に、図８（ｂ）に示すように、Tris Buffer Saline with Tween 20、又はPhosphate buffered saline with Tween 20等の洗浄液Ｗ２２を用いて、被検物質保持部１３から試薬Ｓ２１２を除去する。これにより、被検物質保持部１３における領域Ｓ２３に存在する複合体のみが残る。このとき、被検物質検出装置１から第２ユニット１ｂを取り外して、第２ユニット１ｂを洗浄することができる。
Next, as shown in FIG. 8B, the reagent S212 is removed from the test
続いて、図８（ｃ）に示すように、例えばディスペンサＤ２２を使用して、蛍光基質が分散された試薬Ｓ２１３を、被検物質保持部１３における領域Ｓ２３に滴下する。この試薬Ｓ２１３は、例えば、ハイブリダイゼーション用緩衝液を含む液体中に蛍光基質が分散したものである。
Subsequently, as shown in FIG. 8C, the reagent S213 in which the fluorescent substrate is dispersed is dropped onto the region S23 in the test
蛍光基質としては、例えばペルオキシターゼと反応して蛍光物質であるレゾルフィンを生成するペルオキシターゼ用蛍光基質や、アルカリフォスターゼと反応して蛍光物質であるＢＢＴ−アニオンを生成するアルカリフォスターゼ用蛍光基質を採用すればよい。なお、ペルオキシターゼ用蛍光基質から生成されるレゾルフィンは、例えば有機系色素に比べて強い蛍光を発する蛍光物質である。アルカリフォスターゼ用蛍光基質から生成されるＢＢＴ−アニオンは、例えば有機系色素に比べて大きなストークスシフトと広い蛍光スペクトルを持つ蛍光物質である。このハイブリタイゼーション用緩衝液は、例えば試薬Ｓ２１２に含まれるものと同じものを採用すればよい。 As the fluorescent substrate, for example, a fluorescent substrate for peroxidase that reacts with peroxidase to produce resorphin, which is a fluorescent substance, and a fluorescent substrate for alkaline fostase, which reacts with alkaline fosterase to generate BBT-anion, which is a fluorescent substance, are adopted. do it. The resorphin produced from the fluorescent substrate for peroxidase is, for example, a fluorescent substance that emits stronger fluorescence than an organic dye. The BBT-anion produced from the fluorescent substrate for alkaline fosterase is, for example, a fluorescent substance having a large Stokes shift and a wide fluorescence spectrum as compared with organic dyes. As the buffer solution for hybridization, for example, the same buffer solution contained in the reagent S212 may be adopted.
上記工程により、蛍光基質２４２と、領域Ｓ２３上に存在する複合体の酵素とが反応して生成された蛍光物質２４３が、試薬Ｓ２１３中に分散される。このとき、被検物質保持部１３には、蛍光基質２４２と酵素との反応により生成された蛍光物質２４３が存在する領域Ｓ２４が形成される。
By the above step, the
図９（ｃ）に示すように、蛍光基質２４２は、領域Ｓ２３上に存在する複合体の酵素と反応して、蛍光物質２４３を生成する。例えば、酵素がペルオキシターゼの場合、酵素とペルオキシターゼ用蛍光基質とが反応して、蛍光物質２４３であるレゾルフィンが生成される。
As shown in FIG. 9C, the
その後、図８（ｄ）に示すように、光源１１から光Ｌ２を、蛍光基質２４２と酵素との反応により生成された蛍光物質２４３が存在する領域Ｓ２４に照射することにより、試薬Ｓ２１３中に分散した蛍光物質２４３を蛍光させる。この蛍光物質２４３から発せられる光Ｋ２は、受光部１６の光電変換素子１６１で受光される。
Then, as shown in FIG. 8D, the light L2 is dispersed in the reagent S213 by irradiating the region S24 in which the
以上説明したように、第２実施形態に係る被検物質検出方法において、１９０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下の第１ピーク波長の光を蛍光物質に照射すると、蛍光物質は４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第２ピーク波長の光を発する。蛍光物質から発せられる第２ピーク波長の光は、第２ピーク波長における量子効率が、第１ピーク波長における量子効率の２倍以上である光検出器６により検出される。これにより、光検出器６は第２ピーク波長の光より第１ピーク波長の光を検出しにくくなり、第１ピーク波長の光を検出することによるバックグラウンドレベルが低くなるので、その分、微弱な第２ピーク波長の光を検出することが可能となる。つまり、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比が向上する。そのため、高い検出感度で、被検物質を検出することができる。
As described above, in the test substance detection method according to the second embodiment, when the fluorescent substance is irradiated with light having a first peak wavelength of 190 nm or more and 350 nm or less, the fluorescent substance has a second peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less. It emits light. The light of the second peak wavelength emitted from the fluorescent substance is detected by the
第１及び第２実施形態に係る被検物質検出方法では、光検出器６は、第１ピーク波長の光が照射される際、第１ピーク波長の光が照射される方向に、蛍光物質、光検出器６の順となるよう配置されている。このように、光源１１から出射される第１ピーク波長の光と、被検物質保持部１３に存在する複合体の蛍光物質から発せられる第２ピーク波長の光との両方が光検出器６に入射しやすい構成であっても、光検出器６は第２ピーク波長における量子効率が、第１ピーク波長における量子効率の２倍以上であるので、第２ピーク波長の光より第１ピーク波長の光を検出しにくい。そのため、第１ピーク波長の光を検出することによるバックグラウンドレベルが低くなるので、その分、微弱な第２ピーク波長の光を検出することができる。
In the test substance detection method according to the first and second embodiments, the
なお、第１及び第２実施形態の光検出器１０６であるモノクロＣＭＯＳイメージセンサは、カラーフィルタによって入射光の一部が吸収されないため、同じ光電変換素子を用いるカラーＣＭＯＳイメージセンサに比べて量子効率は高くなる。
Since the monochrome CMOS image sensor, which is the
＜第３実施形態＞
第３実施形態は、図１０に示すように、光検出器１０６の構成が第１実施形態とは異なっている。光検出器１０６以外の被検物質検出装置の構成、及び被検物質検出方法は、第１及び第２実施形態と同様とすることができる。
<Third Embodiment>
In the third embodiment, as shown in FIG. 10, the configuration of the
第３実施形態の光検出器１０６は、受光部１１６と、カラーフィルタ１１９と、マイクロレンズ１２０と、カバー部材１２１とを備えたカラーＣＭＯＳイメージセンサである。受光部１１６は、光電変換素子１６１ａと、光電変換素子１６１ａ上に設けられた第１保護層１１４、及び第２保護層１１５とを備えている。光電変換素子１６１ａと第１保護層１１４と第２保護層１１５とは、この順で下から積層されている。光電変換素子１６１ａは、第１実施形態と同様にフォトダイオードを用いることができる。第１保護層１１４も、第１実施形態と同様に窒化シリコン膜によって構成することができる。第２保護層１１５も、第１実施形態と同様に酸化シリコン膜によって構成することができる。
The
カラーフィルタ１１９は、受光部１１６上に複数設けられている。複数のカラーフィルタ１１９は、それぞれ特定の波長域の光を選択的に透過し、その他の波長域の光を吸収する吸収フィルタにより構成されている。具体的に、複数のカラーフィルタ１１９は、それぞれ赤色、緑色、及び青色の波長域の光を透過する。したがって、光検出器１０６は、カラーフィルタ１１９によって複数色にわたる波長域の光、すなわち複数色の可視光を識別して検出することができる。
A plurality of
光検出器１０６は、カラーフィルタ１１９によって６２０ｎｍ以上７５０ｎｍ未満の範囲にピーク波長のある赤色の分光感度を有する第１の検出部と、４９５ｎｍ以上５７０ｎｍ未満の範囲にピーク波長のある緑色の分光感度を有する第２の検出部と、４５０ｎｍ以上４９５ｎｍ未満の範囲にピーク波長のある青色の分光感度を有する第３の検出部として機能する。
The
第１の検出部のカラーフィルタ１１９である赤色フィルタＲは、赤の波長域以外の光を吸収する第１吸収部を構成する。第２の検出部のカラーフィルタ１１９である緑色フィルタＧは、緑の波長域以外の光を吸収する第２吸収部を構成する。第３の検出部のカラーフィルタ１１９である青色フィルタＢは、青の波長域以外の光を吸収する第３吸収部を構成する。
The red filter R, which is the
マイクロレンズ１２０は、各カラーフィルタ１１９に対応するように複数設けられている。各マイクロレンズ１２０は、上方から入射した光をカラーフィルタ１１９を介して受光部１１６の光電変換素子１６１ａに集光する。
A plurality of
カバー部材１２１は、石英ガラス板等の透明な板材からなり、マイクロレンズ１２０を上方から覆っている。被検物質を含む複合体は、カバー部材１２１上に設けられ、光源１１が発する励起光が上方から照射される。カバー部材１２１は、第１及び第２実施形態で説明した被検物質を含む複合体を用いる場合は、第１及び第２実施形態の基材１３ａとして機能する。
The
複数のカラーフィルタ１１９は、図１１に示す配列パターンで並べられている。具体的には、光検出器１０６であるＣＭＯＳイメージセンサの１画素αが２×２の４区画α１〜α４に分割され、そのうちの１区画α１に、赤色フィルタＲが設けられ、他の１区画α４に、青色フィルタＢが設けられ、残りの２区画α２とα３に、緑色フィルタＧが設けられている。そして、図１１に示す配列パターンが、受光部１１６の全体にわたって規則的に並べられている。
The plurality of
図１２は、カラーＣＭＯＳイメージセンサの１画素における区画あたりの量子効率をカラーフィルタの色別に示している。ηｒｅｄ、ηｇｒｅｅｎ、ηｂｌｕｅは、それぞれ赤色フィルタＲ、緑色フィルタＧ、青色フィルタＢが設けられた各区画α１〜α４の量子効率である。 FIG. 12 shows the quantum efficiency per pixel of a color CMOS image sensor for each color of the color filter. η red , η green , and η blue are the quantum efficiencies of the compartments α1 to α4 provided with the red filter R, the green filter G, and the blue filter B, respectively.
一方、図１１に示すカラーＣＭＯＳイメージセンサの１画素αあたりの量子効率ηｐｉｘｅｌは、この１画素α中の全区画α１〜α４の量子効率の平均として表される。すなわち、量子効率ηｐｉｘｅｌは、次の式（１）によって求めることができる。
ηｐｉｘｅｌ＝（ηｂｌｕｅ＋ηｇｒｅｅｎ＋ηｇｒｅｅｎ＋ηｒｅｄ）／４
＝１／４ηｂｌｕｅ＋１／２ηｇｒｅｅｎ＋１／４ηｒｅｄ ・・・（１）
On the other hand, the quantum efficiency η pixel per pixel α of the color CMOS image sensor shown in FIG. 11 is expressed as the average of the quantum efficiencies of all the compartments α1 to α4 in the one pixel α. That is, the quantum efficiency η pixel can be obtained by the following equation (1).
η pixel = (η blue + η green + η green + η red ) / 4
= 1/4η blue + 1 / 2η green + 1/4η red・ ・ ・ (1)
図１３には、１画素αあたりの量子効率ηｐｉｘｅｌ、その成分１／４ηｂｌｕｅ、１／２ηｇｒｅｅｎ、及び１／４ηｒｅｄとをそれぞれ示している。カラーＣＭＯＳイメージセンサは、複数の画素αが集積されることによって構成されるため、１画素αあたりの量子効率ηｐｉｘｅｌと、カラーＣＭＯＳイメージセンサ全体の量子効率ηａｌｌとは同一となる。すなわち、次の式（２）が成り立つ。
ηａｌｌ＝ηｐｉｘｅｌ ・・・（２）
FIG. 13 shows the quantum efficiency η pixel , its
η all = η pixel ... (2)
図１３において、ηｍａｘは、１画素αのあたりの量子効率ηｐｉｘｅｌ、すなわちカラーＣＭＯＳイメージセンサの量子効率ηａｌｌの最大値を示し、ηｔｈは、量子効率５％を示す。量子効率ηｍａｘとなるときの波長は、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の範囲の波長域に含まれている。カラーＣＭＯＳイメージセンサからなる本実施形態の光検出器１０６は、光源１１が発する１９０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下の第１ピーク波長の光に対しては量子効率が約０％となる。一方、蛍光物質が発する第２ピーク波長の光は、図１３に示すように約２２％となっている。したがって、第３実施形態の光検出器１０６を用いた場合においても、第２ピーク波長における量子効率が、第１ピーク波長における量子効率の２倍以上となる。
In FIG. 13, ηmax indicates the maximum value of the quantum efficiency η pixel per pixel α, that is, the quantum efficiency η all of the color CMOS image sensor, and ηth indicates the quantum efficiency of 5%. The wavelength at which the quantum efficiency ηmax is obtained is included in the wavelength range of 450 nm or more and 900 nm or less. The
これにより、光検出器１０６は、第２ピーク波長の光より第１ピーク波長の光を検出しにくくなり、第１ピーク波長の光を検出することによるバックグラウンドレベルが低くなるので、その分、微弱な第２ピーク波長の光を検出することが可能となる。つまり、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比が向上する。そのため、高い検出感度で、被検物質を検出することができる。さらに、検出器１０６は、第２ピーク波長の光の色を識別して検出することができる。
As a result, the
＜変形例＞
なお、本発明は、前述した各実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された範囲内の全ての態様を含む。例えば、以下に示す変形例を含む。
<Modification example>
The present invention is not limited to the above-described embodiments, but includes all aspects within the scope of the claims. For example, the following modification is included.
（１）第１〜第３実施形態に係る被検物質検出方法は、本発明を被検物質の検出に用いる例について説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、被検物質に限らず、蛍光物質からの蛍光を検出する蛍光検出方法に用いてもよい。この場合、第１〜第３実施形態で用いた捕捉物質は必須では無い。そのため、この蛍光検出方法に用いる装置としては、例えば、第１実施形態における被検物質検出装置１の被検物質保持部１３を基材１３ａに代えた装置を用いることができる。
(1) The test substance detection method according to the first to third embodiments has described an example in which the present invention is used for detecting a test substance, but the present invention is not limited thereto. For example, it may be used not only in the test substance but also in a fluorescence detection method for detecting fluorescence from a fluorescent substance. In this case, the trapping substance used in the first to third embodiments is not essential. Therefore, as the device used in this fluorescence detection method, for example, a device in which the test
（２）第１〜第３実施形態では、第１ピーク波長が２７０ｎｍである例について説明したが、本発明はこれに限定されない。本発明において、第１ピーク波長は、１９０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下であればよい。 (2) In the first to third embodiments, an example in which the first peak wavelength is 270 nm has been described, but the present invention is not limited thereto. In the present invention, the first peak wavelength may be 190 nm or more and 350 nm or less.
本発明において、第１ピーク波長は、例えば、図１４に示すように、２４２ｎｍ〜２４３ｎｍの間にあってもよい。図１４は、変形例に係るＬＥＤから出射される深紫外光の光学スペクトルの一例を示す図である。なお、図１４は、ＬＥＤへの順方向バイアスの大きさを７種類の大きさに設定した場合それぞれにおける光学スペクトルを示している。図１４において、（１）〜（７）のうち番号が大きいほど順方向バイアスが大きい。 In the present invention, the first peak wavelength may be between 242 nm and 243 nm, for example, as shown in FIG. FIG. 14 is a diagram showing an example of an optical spectrum of deep ultraviolet light emitted from the LED according to the modified example. Note that FIG. 14 shows the optical spectra when the magnitude of the forward bias to the LED is set to seven different magnitudes. In FIG. 14, the larger the number among (1) to (7), the larger the forward bias.
なお、光源は波長が短くなるほど光の出力が低下するため、蛍光の検出信号の強度向上の観点から、本発明において、第１ピーク波長は、２４０ｎｍ以上が好ましい。光検出器に入射する光に起因した検出信号のバックグラウンドレベルを抑制する観点から、本発明において、第１ピーク波長は、３００ｎｍ以下が好ましい。このように、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比向上の観点から、本発明において、第１ピーク波長は、２４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下が好ましい。なお、汎用の光源としては、波長１９０ｎｍよりも長いものが取得しやすい。一方、光源から出射される光の波長が、３５０ｎｍより長い場合、汎用の光検出器では光源からの光を検出してしまい、バックグラウンドノイズの原因となる可能性がある。 Since the light output of the light source decreases as the wavelength becomes shorter, the first peak wavelength is preferably 240 nm or more in the present invention from the viewpoint of improving the intensity of the fluorescence detection signal. In the present invention, the first peak wavelength is preferably 300 nm or less from the viewpoint of suppressing the background level of the detection signal caused by the light incident on the photodetector. As described above, from the viewpoint of improving the S / N ratio of the fluorescence detection signal, the first peak wavelength is preferably 240 nm or more and 300 nm or less in the present invention. As a general-purpose light source, it is easy to obtain a light source having a wavelength longer than 190 nm. On the other hand, if the wavelength of the light emitted from the light source is longer than 350 nm, a general-purpose photodetector may detect the light from the light source and cause background noise.
（３）第１〜第３実施形態では、第２ピーク波長が、７０５ｎｍである例について説明したが、本発明はこれに限定されない。本発明において、第２ピーク波長は、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下であればよい。日本照明学会では明るさを定義するのに３６０ｎｍから８３０ｎｍの分光感度を用いているため、本発明において、第２ピーク波長が８３０ｎｍ以下であれば、汎用の光検出器および蛍光物質を使用しやすく、より好適である。そのため、第２ピーク波長は、４５０ｎｍ以上８３０ｎｍ以下が好ましい。 (3) In the first to third embodiments, an example in which the second peak wavelength is 705 nm has been described, but the present invention is not limited thereto. In the present invention, the second peak wavelength may be 450 nm or more and 900 nm or less. Since the Illuminating Engineering Institute of Japan uses a spectral sensitivity of 360 nm to 830 nm to define brightness, in the present invention, if the second peak wavelength is 830 nm or less, it is easy to use a general-purpose photodetector and a fluorescent substance. , More suitable. Therefore, the second peak wavelength is preferably 450 nm or more and 830 nm or less.
（４）第１〜第３実施形態に係る被検物質検出方法では、光検出器６，１０６が、第１ピーク波長の光に対する量子効率が約０％であり、第２ピーク波長における量子効率が約４０％又は約２２％である例について説明したが、本発明はこれに限定されない。本発明において、光検出器は、第２ピーク波長における量子効率が、第１ピーク波長における量子効率の２倍以上であればよい。
(4) In the test substance detection method according to the first to third embodiments, the
なお、本発明において、光検出器に入射する光に起因した検出信号のバックグラウンドレベルを抑制する観点から、光検出器は、第１ピーク波長の光に対する量子効率が１０％未満であることが好ましい。言い換えれば、第１ピーク波長は、光検出器が１０％以上の量子効率で検出しない波長であることが好ましい。このような構成とすることにより、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比のさらなる向上を図ることができる。 In the present invention, from the viewpoint of suppressing the background level of the detection signal caused by the light incident on the photodetector, the photodetector has a quantum efficiency of less than 10% with respect to the light having the first peak wavelength. preferable. In other words, the first peak wavelength is preferably a wavelength that the photodetector does not detect with a quantum efficiency of 10% or more. With such a configuration, the S / N ratio of the fluorescence detection signal can be further improved.
本発明において、光検出器に入射する光に起因した検出信号のバックグラウンドレベルをさらに抑制する観点から、光検出器は、第１ピーク波長の光に対する量子効率が５％未満であることがより好ましい。言い換えれば、第１ピーク波長は、光検出器が５％以上の量子効率で検出しない波長であることがより好ましい。このような構成とすることにより、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比のさらなる向上を図ることができる。 In the present invention, from the viewpoint of further suppressing the background level of the detection signal caused by the light incident on the photodetector, the photodetector has a quantum efficiency of less than 5% with respect to the light having the first peak wavelength. preferable. In other words, the first peak wavelength is more preferably a wavelength that the photodetector does not detect with a quantum efficiency of 5% or more. With such a configuration, the S / N ratio of the fluorescence detection signal can be further improved.
（５）第１〜第３実施形態に係る被検物質検出方法では、光検出器６，１０６として、シリコン基板を用いた光電変換素子を含むＣＭＯＳイメージセンサが用いられる例について説明したが、本発明はこれに限定されない。
(5) In the test substance detection method according to the first to third embodiments, an example in which a CMOS image sensor including a photoelectric conversion element using a silicon substrate is used as the
なお、光検出器がシリコン基板を用いた光電変換素子を含むと、シリコンが１９０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下の第１ピーク波長の光をさえぎるため、光検出器における第１ピーク波長の光に対する量子効率が低くなる。そのため、光検出器に入射する光に起因した検出信号のバックグラウンドレベルを抑制する観点から、光検出器はシリコン基板を用いた光電変換素子を含むことが好ましい。具体的に、シリコン基板を用いた光電変換素子を含む光検出器としては、ＣＭＯＳイメージセンサ、ｍｉｃｒｏＰＭＴ(Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ)、ＰｉＮ(Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ)フォトダイオード、ＡＰＤ(Ａｖａｋａｎｃｈｅ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ)、ＭＰＣＣ(Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｘｅｌ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ)、ＥＭＣＣＤ(Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ)、ＣＣＤ(Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ)イメージセンサ、或いは、ＮＭＯＳ(Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ)イメージセンサが挙げられる。その中でも、ＣＭＯＳイメージセンサおよびｍｉｃｒｏＰＭＴは、第１ピーク波長における量子効率が特に低いので、蛍光の検出信号におけるＳ／Ｎ比を向上させることができるので、本発明において、光検出器は、ＣＭＯＳイメージセンサまたはｍｉｃｒｏＰＭＴが好ましい。 If the photodetector includes a photoelectric conversion element using a silicon substrate, the silicon blocks the light having the first peak wavelength of 190 nm or more and 350 nm or less, so that the quantum efficiency of the photodetector with respect to the light of the first peak wavelength is low. Become. Therefore, from the viewpoint of suppressing the background level of the detection signal caused by the light incident on the photodetector, the photodetector preferably includes a photoelectric conversion element using a silicon substrate. Specifically, as a photodetector including a photoelectric conversion element using a silicon substrate, a CMOS image sensor, a microPMT (Photomultiplier Tube), a PiN (Positive-Intrinsic-Negative) photodiode, an APD (Avacanche PhotoMix), and an MP -Pixel Photodiode), EMCCD (Electron Multiplier Tube Coupled Device), CCD (Charge Coupled Device) image sensor, or NMOS (Negative Digital) Image Sensor, etc. Among them, the CMOS image sensor and the microPMT have particularly low quantum efficiency at the first peak wavelength, so that the S / N ratio in the fluorescence detection signal can be improved. Therefore, in the present invention, the photodetector is a CMOS image. Sensors or microPMTs are preferred.
（６）第１〜第３実施形態に係る被検物質検出方法では、蛍光物質として量子ドットを用いる例について説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、蛍光物質として有機系色素を用いてもよい。有機系色素としては、例えば、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）、ローダミン（Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ）、キサンテン（Ｘａｎｔｈｅｎｅ）またはシアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）から合成される有機系色素を採用することができる。 (6) In the test substance detection method according to the first to third embodiments, an example in which quantum dots are used as the fluorescent substance has been described, but the present invention is not limited thereto. For example, an organic dye may be used as the fluorescent substance. As the organic dye, for example, an organic dye synthesized from coumarin, rhodamine, xanthene or cyanine can be adopted.
図１５は、変形例に係る被検物質検出方法で用いられる有機色素の蛍光スペクトルの一例を示す。ここで、一例に示す有機系色素は、いずれもモレキュラープローブ社製の有機色素である。図１５において、（１−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０、（２−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、（３−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、（４−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、（５−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、（６−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、（７−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、（８−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、（９−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、（１０−３）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５に対応する。
FIG. 15 shows an example of the fluorescence spectrum of the organic dye used in the test substance detection method according to the modified example. Here, the organic dyes shown as an example are all organic dyes manufactured by Molecular Probe Co., Ltd. In FIG. 15, (1-3) is Alexa Fluor 790, (2-3) is
なお、有機系色素は、他に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（いずれもモレキュラープローブ社製）を用いてもよい。 In addition, as the organic dye, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680 and Alexa Fluor 700 (all manufactured by Molecular Probes) may be used.
更に、有機系色素としては、他に、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ２Ｏ３：Ｒｅ、Ｌｎ２Ｏ２Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ４、ＭＯ・ｘＡｌ２Ｏ３：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ―８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等を採用してもよい。なお、上記ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。 Furthermore, as organic dyes, 9-phenylxanthene dyes, cyanine dyes, methalocyanine dyes, xanthene dyes, triphenylmethane dyes, acrydin dyes, oxazine dyes, coumarin dyes, and merocyanine dyes. Dyes, rodacyanine dyes, polymethine dyes, porphyrin dyes, phthalocyanine dyes, rhodamine dyes, xanthene dyes, chlorophyll dyes, eosin dyes, Mercurochrome dyes, Indigo dyes, BODIPY dyes, CALFluor dyes Oregon green dye, Rhodol green, Texas red, Cascade blue, Nucleic acid (DNA, RNA, etc.), Cyaninated cadmium, Tellurized cadmium, Ln2O3: Re, Ln2O2S: Re, ZnO, CaWO4, MO ・ xAl2O3: Eu , Zn2SiO4: Mn, LaPO4: Ce, Tb, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5 and Cy9 (all manufactured by Amasham Bioscience); DY-610, DY-615, DY -630, DY-631, DY-633, DY-635, DY-636, EVOblue10, EVOblue30, DY-647, DY-650, DY-651, DY-800, DYQ-660 and DYQ-661 (all of which). (Manufactured by Dyomics); Atto425, Atto465, Atto488, Atto495, Atto520, Atto532, Atto550, Atto565, Atto590, Atto594, Atto610, Atto611X, Atto610, Atto611X, Atto620, Atto611X, Atto620, Atto635 (Manufactured by Atto-TEC GmbH); VivoTagS680, VivoTag680, VivoTagS750 (all manufactured by VisEnMedical) and the like may be adopted. In addition, the said Ln represents La, Gd, Lu or Y, Re represents a lanthanide group element, M represents an alkaline earth metal element, and x represents a number of 0.5 to 1.5.
なお、量子ドットは、例えば有機系色素や蛍光蛋白質等に比べて輝度が高くかつ光源から照射される光による退色が起こりにくい。したがって、有機系色素や蛍光蛋白質等の蛍光物質は長波長の光よりも短波長の光により退色が起こりやすいが、そのように短波長の光を蛍光物質に照射する場合であっても、蛍光物質として量子ドットを使用することで、短波長の光による退色が起こりにくく、微量の被検物質の検出や長時間に亘る被検物質の観察に有利である。そのため、本発明において、蛍光物質は、量子ドットが好ましい。 It should be noted that the quantum dots have higher brightness than, for example, organic dyes and fluorescent proteins, and are less likely to be discolored by the light emitted from the light source. Therefore, fluorescent substances such as organic dyes and fluorescent proteins are more likely to fade due to short wavelength light than long wavelength light, but even when the fluorescent substance is irradiated with such short wavelength light, it is fluorescent. By using quantum dots as a substance, fading due to light of a short wavelength is unlikely to occur, which is advantageous for detecting a trace amount of the test substance and observing the test substance for a long time. Therefore, in the present invention, the fluorescent substance is preferably quantum dots.
（７）第１〜第３実施形態では、光源１１が、ＬＥＤ等の半導体発光素子から構成される例について説明したが、光源１１の種類はこれに限定されるものではない。例えば、光源１１として放電ランプ（例えばＨＩＤランプ等）等から構成されるものであってもよい。
(7) In the first to third embodiments, an example in which the
（８）更に、第１〜第３実施形態では、量子ドット４１０の修飾物質４１４として、グルタチオン等のペプチド１種類から構成される例について説明したが、修飾物質４１４は、１種類の有機物質のみからなるものに限定されるものではない。例えば、修飾物質４１４が、ペプチドと、当該ペプチドに結合した抗体或いはレセプタに対するリガンドとから構成されるものであってもよい。
(8) Further, in the first to third embodiments, an example in which the modifying
（９）第３実施形態の光検出器１０６は、蛍光物質から発せられる光の一部を透過するフィルタとして吸収フィルタを備えていたが、吸収フィルタではなく、干渉フィルタであってもよい。第３実施形態の光検出器１０６は、カラーフィルタ１１９として、赤色、緑色、青色の３色のフィルタを備えていたが、シアン、マゼンダ、黄色の３色のフィルタを備えていてもよい。光検出器１０６は、カラーフィルタ１１９を備えないものであってもよい。例えば、光検出器１０６として、色による吸収の深さの違いを利用して複数色を識別して検出する積層型のイメージセンサ、光電変換膜を積層した有機膜イメージセンサ、又はディフレクタ等の分光部を備えた分光型イメージセンサ等を用いることができる。
(9) Although the
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and the like, but the present invention is not limited thereto.
＜実施例１＞
（ＣＭＯＳイメージセンサ上への蛍光物質の固定）
第１実施形態の検出器６を構成するモノクロＣＭＯＳイメージセンサに予め備えられているカバーガラスを取り外し、２次元アレイ状に配置されたマイクロレンズアレイ上に、蛍光物質として１μＭの量子ドットを含む試料と、リファレンス試料としてTBS-Tを滴下した。その後、そのＣＭＯＳイメージセンサを５０℃の環境に１０分放置することにより、試料を乾燥させた。なお、ＣＭＯＳイメージセンサの感度特性は図３に示されたとおりである。なお、モノクロＣＭＯＳイメージセンサには、アプティナイメージング社製のMT9M001を用いた。量子ドットには、ライフテクノロジー社製のQdot 705 ストレプトアビジンコンジュゲートQ10163MPを用いた。
<Example 1>
(Fixing of fluorescent material on CMOS image sensor)
A sample containing 1 μM quantum dots as a fluorescent substance on a microlens array arranged in a two-dimensional array by removing the cover glass provided in advance in the monochrome CMOS image sensor constituting the
（励起光の照射）
その後、ＣＭＯＳイメージセンサの上部から光拡散部材（Diffuser）を介して励起光を照射した。それぞれの励起光強度は、ＣＭＯＳイメージセンサの画素値が飽和しない範囲での最大強度とした。
比較例１では、青色ＬＥＤを有する光源を用いて、ピーク波長が４７０ｎｍの光を照射した。
比較例２では、紫外ＬＥＤを有する光源を用いて、ピーク波長が３６５ｎｍの光を照射した。
本実施例では、深紫外ＬＥＤを有する光源を用いて、ピーク波長が２７０ｎｍの光を照射した。
(Irradiation of excitation light)
Then, the excitation light was irradiated from the upper part of the CMOS image sensor via the light diffusing member (Diffuser). Each excitation light intensity was set to the maximum intensity within a range in which the pixel value of the CMOS image sensor was not saturated.
In Comparative Example 1, a light source having a blue LED was used to irradiate light having a peak wavelength of 470 nm.
In Comparative Example 2, a light source having an ultraviolet LED was used to irradiate light having a peak wavelength of 365 nm.
In this embodiment, a light source having a deep ultraviolet LED was used to irradiate light having a peak wavelength of 270 nm.
（実験結果）
図１６（ａ−１）は、比較例１で得られる画像、図１６（ｂ−１）は、比較例２で得られる画像、図１６（ｃ−１）は、実施例で得られる画像である。図１６（ａ−２）は、図１６（ａ−１）のＡ−Ａ線における強度プロファイルを示し、図１６（ｂ−２）は、図１６（ｂ−１）のＡ−Ａ線における強度プロファイルを示し、図１６（ｃ−２）は、図１６（ｃ−１）のＡ−Ａ線における強度プロファイルを示す。図１６（ａ−２）（ｂ−２）（ｃ−２）のグラフにおいてはＡ−Ａ線上の位置をＸ座標と示している。
(Experimental result)
16 (a-1) is an image obtained in Comparative Example 1, FIG. 16 (b-1) is an image obtained in Comparative Example 2, and FIG. 16 (c-1) is an image obtained in Example. is there. 16 (a-2) shows the intensity profile in line AA of FIG. 16 (a-1), and FIG. 16 (b-2) shows the intensity in line AA of FIG. 16 (b-1). The profile is shown, and FIG. 16 (c-2) shows the intensity profile at line AA of FIG. 16 (c-1). In the graphs of FIGS. 16 (a-2), (b-2), and (c-2), the position on the line AA is shown as the X coordinate.
図１６（ａ−１）および図１６（ａ−２）に示すように、比較例１の場合、画像中において、リファレンスとしてTBS-Tを添加した領域（以下、領域Ｒｅｆという）の検出強度および量子ドットを添加した領域（以下、領域Ｓ２５）の検出強度が、画像中の他の領域の検出強度に比べて低い。これは、青色ＬＥＤを用いた光源から出射される光のピーク波長（４７０ｎｍ）が、ＣＭＯＳイメージセンサの感度が比較的高い波長帯域内に存在するため、ＣＭＯＳイメージセンサから出力される検出信号のバックグラウンドレベルが高くなっているためと考えられる。 As shown in FIGS. 16 (a-1) and 16 (a-2), in the case of Comparative Example 1, the detection intensity and the detection intensity of the region to which TBS-T was added as a reference (hereinafter referred to as region Ref) in the image. The detection intensity of the region to which the quantum dots are added (hereinafter, region S25) is lower than the detection intensity of other regions in the image. This is because the peak wavelength (470 nm) of the light emitted from the light source using the blue LED exists in the wavelength band where the sensitivity of the CMOS image sensor is relatively high, so that the detection signal output from the CMOS image sensor is backed up. This is probably because the ground level is high.
図１６（ｂ−１）および（ｂ−２）に示すように、比較例２の場合、領域Ｓ２５における検出感度は、領域Ｓ２５および領域Ｒｅｆを除く画像内の領域における検出感度に比べて高い。領域Ｒｅｆにおける検出感度は、領域Ｓ２５および領域Ｒｅｆを除く画像内の領域における検出感度に比べてやや低い。これは、ＣＭＯＳイメージセンサは、ピーク波長が４７０ｎｍである比較例１の光に比べて、ピーク波長が３６５ｎｍの比較例２の光に対する感度が低いため、比較例１に比べてＣＭＯＳイメージセンサから出力される検出信号のバックグラウンドレベルが低下しているからと考えられる。比較例２の場合も、検出信号のバックグラウンドレベルは、領域Ｓ２５における検出強度の８０％程度であり、検出信号におけるＳ／Ｎ比が十分に高いとはいえない。 As shown in FIGS. 16 (b-1) and 16 (b-2), in the case of Comparative Example 2, the detection sensitivity in the region S25 is higher than the detection sensitivity in the region in the image excluding the region S25 and the region Ref. The detection sensitivity in the region Ref is slightly lower than the detection sensitivity in the regions in the image excluding the region S25 and the region Ref. This is because the CMOS image sensor is less sensitive to the light of Comparative Example 2 having a peak wavelength of 365 nm than the light of Comparative Example 1 having a peak wavelength of 470 nm, and therefore is output from the CMOS image sensor as compared with Comparative Example 1. It is considered that the background level of the detected signal is lowered. Also in the case of Comparative Example 2, the background level of the detection signal is about 80% of the detection intensity in the region S25, and it cannot be said that the S / N ratio in the detection signal is sufficiently high.
一方、図１６（ｃ−１）および（ｃ−２）に示すように、実施例１の場合、領域Ｓ２５における検出感度が、領域Ｓ２５および領域Ｒｅｆを除く画像内の領域における検出感度に比べて極めて高くなっている。領域Ｒｅｆにおける検出感度は、バックグラウンドレベルと同程度になっており、領域Ｓ２５における検出感度に比べて極めて低くなっている。これは、ＣＭＯＳイメージセンサは、２７０ｎｍの波長に対する感度が略ゼロであるため、バックグラウンドレベルの上昇が抑制されているからと考えられる。実施例１の場合、検出信号のバックグラウンドレベルは、領域Ｓ２５における検出強度の４％程度であり、十分に高いＳ／Ｎ比を得ることができている。 On the other hand, as shown in FIGS. 16 (c-1) and 16 (c-2), in the case of Example 1, the detection sensitivity in the region S25 is higher than the detection sensitivity in the region in the image excluding the region S25 and the region Ref. It is extremely high. The detection sensitivity in the region Ref is about the same as the background level, which is extremely lower than the detection sensitivity in the region S25. It is considered that this is because the CMOS image sensor has substantially zero sensitivity to the wavelength of 270 nm, so that the increase in the background level is suppressed. In the case of the first embodiment, the background level of the detection signal is about 4% of the detection intensity in the region S25, and a sufficiently high S / N ratio can be obtained.
これらの結果から、蛍光物質に照射する光のピーク波長を、ＣＭＯＳイメージセンサの感度が実質的にない２７０ｎｍの波長とし、蛍光物質から発せられる蛍光の波長を、ＣＭＯＳイメージセンサの感度が十分ある７０５ｎｍの波長とすることで、ＣＭＯＳイメージセンサから出力される検出信号のバックグラウンドレベルの上昇を抑制し、蛍光の検出信号におけるＳ／Ｎ比を向上させることができることが分かる。 From these results, the peak wavelength of the light irradiating the fluorescent substance is set to 270 nm, which is substantially insensitive to the CMOS image sensor, and the wavelength of fluorescence emitted from the fluorescent substance is set to 705 nm, which is sufficiently sensitive to the CMOS image sensor. It can be seen that by setting the wavelength to, it is possible to suppress an increase in the background level of the detection signal output from the CMOS image sensor and improve the S / N ratio in the fluorescence detection signal.
＜実施例２＞
図１０に示す光検出器１０６であるカラーＣＭＯＳイメージセンサのカバー部材１２１上に、蛍光物質として以下に示す１μＭの量子ドットとリファレンスとを各０．５μＬ滴下し、５０℃で１０分加熱して乾燥させた。実施例２として、ＬＥＤ光源からピーク波長２７０ｎｍの深紫外光を照射することで蛍光像を得た。比較例として、光源からピーク波長４０５ｎｍの紫外光を照射することで明視野像を得た。
<Example 2>
0.5 μL of each of the 1 μM quantum dots and the reference shown below as fluorescent substances was dropped onto the
カラーＣＭＯＳイメージセンサには、アプティナイメージング社製のMT9M001C12STCを用いた。 MT9M001C12STC manufactured by Aptina Imaging Co., Ltd. was used as the color CMOS image sensor.
リファレンスには以下の（１）を用い、量子ドットには以下の（２）〜（６）を用いた。
（１）TBS
（２）Qdot 525 ストレプトアビジンコンジュゲート Ex. 425nm / Em. 525nm （Q10141MP, ライフテクノロジー社製）
（３）Qdot 585 ストレプトアビジンコンジュゲートEx. 425nm / Em. 585nm （Q10111MP, ライフテクノロジー社製）
（４）Qdot 625 ストレプトアビジンコンジュゲートEx. 425nm / Em. 625nm （A10196, ライフテクノロジー社製）
（５）Qdot 705 ストレプトアビジンコンジュゲートEx. 425nm / Em. 705nm （Q10161MP, ライフテクノロジー社製）
（６）Qdot 800 ストレプトアビジンコンジュゲートEx. 425nm / Em. 800nm （Q10173MP, ライフテクノロジー社製）
The following (1) was used as a reference, and the following (2) to (6) were used as quantum dots.
(1) TBS
(2) Qdot 525 Streptavidin Conjugate Ex. 425nm / Em. 525nm (Q10141MP, manufactured by Life Technologies)
(3) Qdot 585 Streptavidin Conjugate Ex. 425nm / Em. 585nm (Q10111MP, manufactured by Life Technologies)
(4) Qdot 625 Streptavidin Conjugate Ex. 425nm / Em. 625nm (A10196, manufactured by Life Technologies)
(5)
(6)
図１７に実施例２の結果を示し、図１８に比較例の結果を示す。図１７（ａ）及び図１８（ａ）は、それぞれ蛍光像及び明視野像の画像を示している。それぞれ画像上の１〜６の丸付き数字と波長の値とは、上記（１）のリファレンス及び（２）〜（６）の量子ドットに対応している。図１７（ｂ）及び図１８（ｂ）は、それぞれ図１７（ａ）及び図１８（ａ）の画像上に点線で示されるＸ（１）軸上の強度プロファイルを示す。図１７（ｃ）及び図１８（ｃ）は、図１７（ａ）及び図１８（ａ）の画像上に点線で示されるＸ（２）軸上の強度プロファイルを示す。
FIG. 17 shows the result of Example 2, and FIG. 18 shows the result of Comparative Example. 17 (a) and 18 (a) show images of a fluorescence image and a bright-field image, respectively. The circled
図１８に示す比較例では、上記（１）のリファレンス及び上記（２）〜（６）の量子ドットのいずれにおいても青色の検出強度が高くなり、さらのその周囲においても青色の検出感度が高くなった。これは、図１２に示すように、紫外光のピーク波長４０５ｎｍが、光検出器１０６の青色の分光感度に重複するため、光検出器１０６から出力される検出信号のバックグラウンドレベルが高くなったためと考えられる。一方、リファレンス及び量子ドットの領域では赤色、緑色、及び青色の検出強度が、その周囲の検出強度よりも低くなった。これにより、リファレンス及び量子ドットの明視野像を確認することができた。
In the comparative example shown in FIG. 18, the blue detection intensity is high in both the reference (1) and the quantum dots (2) to (6) above, and the blue detection sensitivity is also high in the surrounding area. became. This is because, as shown in FIG. 12, the peak wavelength of ultraviolet light of 405 nm overlaps with the blue spectral sensitivity of the
図１７に示す実施例２では、量子ドット（２）〜（６）から発せられた蛍光が、波長に応じた色で検出され、量子ドットの周囲の検出強度は極めて低くなった。また、蛍光を発しないリファレンス（１）はほとんど検出されなかった。したがって、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比が向上し、高い検出感度で蛍光物質を検出することができた。また、第３実施形態の光検出器１０６を用いれば、光源の波長を変えることによって明視野像と複数色の蛍光像との双方を取得することができた。
In Example 2 shown in FIG. 17, the fluorescence emitted from the quantum dots (2) to (6) was detected in a color corresponding to the wavelength, and the detection intensity around the quantum dots became extremely low. In addition, the reference (1) that does not emit fluorescence was hardly detected. Therefore, the S / N ratio of the fluorescence detection signal was improved, and the fluorescent substance could be detected with high detection sensitivity. Further, by using the
＜実施例３＞
以下の（２）〜（５）に示す蛍光物質としての蛍光ビーズと、以下の（１）に示す非蛍光ビーズとを、それぞれ１０μＬずつ混釈して５０μＬの溶液とし、これを図１０に示す光検出器１０６であるカラーＣＭＯＳイメージセンサのカバー部材１２１上に、滴下して５０℃で３０分加熱して乾燥固定した。実施例３として、光源からピーク波長２７０ｎｍの深紫外光を照射することで蛍光像を得た。比較例として、光源からピーク波長４０５ｎｍの紫外光を照射することで明視野像を得た。
<Example 3>
The fluorescent beads as the fluorescent substance shown in (2) to (5) below and the non-fluorescent beads shown in (1) below are each mixed by 10 μL to prepare a 50 μL solution, which is shown in FIG. It was dropped onto the
非蛍光ビーズには以下の（１）を用い、蛍光ビーズには以下の（２）〜（５）を用いた。
（１）15μm ポリスチレン非蛍光ビーズ（18328, ポリサイエンス社製）
（２）15μm ポリスチレン蛍光ビーズ Ex. 365nm / Em. 415nm（F-8837、ライフテクノロジー社製）
（３）15μm ポリスチレン蛍光ビーズ Ex. 505nm / Em. 515nm（F-8844、ライフテクノロジー社製）
（４）15μm ポリスチレン蛍光ビーズ Ex. 540nm / Em. 560nm（F-8841、ライフテクノロジー社製）
（５）15μm ポリスチレン蛍光ビーズ Ex. 580nm / Em. 605nm（F-8842、ライフテクノロジー社製）
The following (1) was used for the non-fluorescent beads, and the following (2) to (5) were used for the fluorescent beads.
(1) 15 μm polystyrene non-fluorescent beads (18328, manufactured by Polyscience)
(2) 15 μm polystyrene fluorescent beads Ex. 365 nm / Em. 415 nm (F-8837, manufactured by Life Technologies, Inc.)
(3) 15 μm polystyrene fluorescent beads Ex. 505 nm / Em. 515 nm (F-8844, manufactured by Life Technologies, Inc.)
(4) 15 μm polystyrene fluorescent beads Ex. 540 nm / Em. 560 nm (F-8841, manufactured by Life Technologies, Inc.)
(5) 15 μm polystyrene fluorescent beads Ex. 580 nm / Em. 605 nm (F-8842, manufactured by Life Technologies, Inc.)
図１９（ａ）に比較例の結果を示し、図１９（ｂ）に実施例３の結果を示す。図１９（ａ−１）及び（ｂ−１）は、それぞれ明視野像及び蛍光像の全体画像を示し、図１９（ａ−２）及び（ｂ−２）は、図１９（ａ−１）及び（ｂ−１）の一部を拡大した像を示す。図１９（ｂ−２）の画像上の１〜５の数字は、上記（１）の非蛍光ビーズ及び上記（２）〜（５）の蛍光ビーズに対応している。また、図１９（ｂ−２）の画像上の非蛍光ビーズ（１）及び蛍光ビーズ（２）〜（５）を横断する点線上の強度プロファイルを、図２０に示す。なお、図２０において、図１９（ｂ−２）の点線上の位置をＸ座標としている。
FIG. 19 (a) shows the results of the comparative example, and FIG. 19 (b) shows the results of the third embodiment. 19 (a-1) and (b-1) show the whole image of the bright field image and the fluorescent image, respectively, and FIGS. 19 (a-2) and 19 (b-2) are shown in FIG. 19 (a-1). And (b-1) shows a partially enlarged image. The
図１９（ａ）に示すように、ピーク波長λｐｅａｋが４０５ｎｍの紫外光を照射することによって、光検出器１０６により非蛍光ビーズ（１）及び蛍光ビーズ（２）〜（５）の明視野像を得ることができた。図１９（ｂ）に示すように、ピーク波長λｐｅａｋが２７０ｎｍの深紫外光を照射することによって光検出器１０６により蛍光ビーズ（２）〜（５）の蛍光像を得ることができた。図２０に示すように、光検出器１０６は、蛍光ビーズ（２）〜（５）から発せられた蛍光が、波長に応じた色で検出され、蛍光ビーズの周囲の検出強度は極めて低くなった。したがって、蛍光の検出信号のＳ／Ｎ比が向上し、高い検出感度で蛍光物質を検出することができた。また、第３実施形態の光検出器１０６を用いれば、光源の波長を変えることによって、明視野像と複数色の蛍光像との双方を取得することができた。
As shown in FIG. 19A, by irradiating ultraviolet light having a peak wavelength of λpeak of 405 nm, the
＜実施例４＞
図２１に示すように、ストレプトアビジン結合蛍光磁性粒子３２０に捕捉されたビオチン結合一次抗体３２１と抗原３３１とを結合させ、さらに酵素３４１１で標識された二次抗体３４１を抗原３３１に結合させた複合体を生成し、この複合体を蛍光基質溶液中に懸濁した溶液を作製した。蛍光基質と酵素３４１１との反応により蛍光物質が生成される。具体的には、自動前処理装置を用いて、抗原捕捉用抗体溶液（HISCL（登録商標）-2000i用R1試薬、シスメックス株式会社製）５０μＬと、０ＩＵ／ｍＬ又は２５００ＩＵ／ｍＬのリコンビナントＨＢｓ抗原（HISCL HBsAg、シスメックス株式会社製）２０μＬを４２℃で３分間反応させた。磁性ビーズ懸濁液（HISCL-2000i用R2試薬、シスメックス株式会社製）３０μＬを添加し、４２℃で３分間反応させたのち、磁気分離を行った。この反応により、図２０の（Ｉ）に示すように、抗原捕捉用抗体が磁性ビーズに捕捉された。
<Example 4>
As shown in FIG. 21, a composite in which the biotin-binding
その後、洗浄液３００μＬの分注と磁気分離の組合せ洗浄を計２回実施した。ALP標識抗体溶液（HISCL-2000i用R3試薬、シスメックス株式会社製）１００μＬを添加し、４２℃で３分間反応させた後、磁気分離を行った。これにより、図２０の（II）に示すように、抗原に酵素標識二次抗体が結合した。その後、洗浄液３００μＬの分注と磁気分離との組合せ洗浄を計３回実施した。さらに、洗浄液１５０μＬの分注と磁気分離の組合せ洗浄を行った。その後、分散液（HISCL-2000i用R4試薬、シスメックス株式会社製）５０μＬを添加し、混合撹拌した。さらにＡＬＰ用蛍光基質であるＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）溶液（S1000、プロメガ株式会社製）２０μＬを添加し、混合撹拌した。 Then, a combination cleaning of 300 μL of the cleaning liquid and magnetic separation was performed twice in total. 100 μL of an ALP-labeled antibody solution (R3 reagent for HISCL-2000i, manufactured by Sysmex Corporation) was added, reacted at 42 ° C. for 3 minutes, and then magnetically separated. As a result, as shown in (II) of FIG. 20, the enzyme-labeled secondary antibody bound to the antigen. Then, a combination cleaning of 300 μL of the cleaning liquid and magnetic separation was performed a total of three times. Further, a combination cleaning of 150 μL of the cleaning liquid and magnetic separation was performed. Then, 50 μL of a dispersion liquid (R4 reagent for HISCL-2000i, manufactured by Sysmex Corporation) was added, and the mixture was mixed and stirred. Further, 20 μL of AttoPhos (registered trademark) solution (S1000, manufactured by Promega Co., Ltd.), which is a fluorescent substrate for ALP, was added, and the mixture was mixed and stirred.
ネガティブコントロールとして０ＩＵ／ｍＬのリコンビナントＨＢｓ抗原を反応させた混合溶液と、ポジティブコントロールとして２５００ＩＵ／ｍＬのリコンビナントＨＢｓ抗原を反応させた混合溶液とを、図１０に示す光検出器１０６であるカラーＣＭＯＳイメージセンサ上にそれぞれ２μＬずつ滴下した。そして、ＬＥＤ光源によりピーク波長２７０ｎｍの深紫外光を照射することにより蛍光像を取得した。その蛍光像を図２２に示す。また、図２２の蛍光像におけるＸ軸上の強度プロファイル（画素値）を図２３に示す。
A color CMOS image of the
図２２及び図２３に示すように、ネガティブコントロールの蛍光像では、蛍光物質の量が少ないため、全体的に検出強度の低い画像となった。これに対してポジティブコントロールは、酵素標識と蛍光基質との反応で生成された蛍光物質を多く含むため、検出強度が高く、しかも波長に応じた色を識別したカラー画像が得られた。 As shown in FIGS. 22 and 23, in the fluorescent image of the negative control, since the amount of the fluorescent substance is small, the image has a low detection intensity as a whole. On the other hand, since the positive control contains a large amount of fluorescent substance produced by the reaction between the enzyme label and the fluorescent substrate, a color image having high detection intensity and different colors according to the wavelength was obtained.
１ 被検物質検出装置
１ａ 第１ユニット
１ｂ 第２ユニット
２ 信号変換装置
３ 画像処理装置
３ａ 表示部
６ 光検出器
１１ 光源
１２ 光拡散部材
１３ 被検物質保持部
１３ａ 基材
１４ 第１保護層
１５ 第２保護層
１６ 受光部
１７ ハウジング
１７ａ 窓部
１７ｂ 信号線導出孔
１８ ブッシング
２１ 捕捉物質
３１ 被検物質
４１，２４１ 結合物質
１０６ 光検出器
１１６ 受光部
１１９ カラーフィルタ
１６１ 光電変換素子
１６２ 支持基板
１６２ａ 樹脂部
１６４ ワイヤ
２４２ 蛍光基質
２４３ 蛍光物質
３３１ 抗原
４１０ 量子ドット
４１１ コア
４１２ シェル
４１３ 有機層
４１４ 修飾物質
２４１１ 酵素
３４１１ 酵素
1 Test
Claims (19)
２４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の第１ピーク波長の光が照射されると４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第２ピーク波長の光を発する第１蛍光物質と被検物質とを含む第１複合体と、前記第１ピーク波長の光が照射されると前記第２ピーク波長とは異なる波長であり、且つ、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第４ピーク波長の光を発する第２蛍光物質と被検物質とを含む第２複合体と、を含む試料に、前記第１ピーク波長の光を照射する工程と、
光検出器により、前記第１ピーク波長の光が照射された前記第１蛍光物質から発せられる前記第２ピーク波長の光と、前記第１ピーク波長の光が照射された前記第２蛍光物質から発せられる前記第４ピーク波長の光と、を検出し、蛍光像の画像を得る工程と、
前記第１ピーク波長とは異なる第３ピーク波長の光を前記複合体に照射する工程と、
前記光検出器により、前記第３ピーク波長の光が照射された前記被検物質の明視野像の画像を得る工程と、を備え、
前記光検出器は、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下のピーク波長の全域における量子効率が、前記第１ピーク波長における量子効率の２倍以上であり、
前記光検出器が、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する複数色の光として、前記第２ピーク波長の光と、前記第４ピーク波長の光と、を検出する、
被検物質検出方法。 This is a test substance detection method for detecting a test substance contained in a biological sample.
A first complex containing a first fluorescent substance and a test substance that emits light having a second peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less when irradiated with light having a first peak wavelength of 240 nm or more and 300 nm or less, and the first peak. A second complex containing a second fluorescent substance and a test substance that emit light having a fourth peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less, which is a wavelength different from the second peak wavelength when irradiated with light of a wavelength. And the step of irradiating the sample containing the above with light of the first peak wavelength.
From the second peak wavelength light emitted from the first fluorescent substance irradiated with the light of the first peak wavelength and the second fluorescent substance irradiated with the light of the first peak wavelength by the light detector. A step of detecting the emitted light having the fourth peak wavelength and obtaining an image of a fluorescence image, and
A step of irradiating the complex with light having a third peak wavelength different from the first peak wavelength,
A step of obtaining a bright-field image of the test substance irradiated with light having the third peak wavelength by the photodetector is provided.
The photodetector has a quantum efficiency in the entire peak wavelength range of 450 nm or more and 900 nm or less, which is more than twice the quantum efficiency in the first peak wavelength.
The photodetector detects the light having the second peak wavelength and the light having the fourth peak wavelength as light having a peak wavelength in the range of 450 nm or more and 900 nm or less.
Test substance detection method.
請求項１に記載の被検物質検出方法。 The third peak wavelength has a longer wavelength than the first peak wavelength.
The method for detecting a test substance according to claim 1.
請求項１または請求項２に記載の被検物質検出方法。 The photodetector identifies and detects light of a plurality of colors having a peak wavelength in the range of 450 nm or more and 900 nm or less.
The test substance detection method according to claim 1 or 2.
請求項３に記載の被検物質検出方法。 The photodetector is arranged between a light receiving portion that receives light, the light receiving portion, the first fluorescent substance, and the second fluorescent substance, and the light emitted from the first fluorescent substance and the second fluorescent substance. Equipped with a filter that transmits a part of
The method for detecting a test substance according to claim 3.
請求項４に記載の被検物質検出方法。 The filter includes a first filter that transmits light having a wavelength in the first range, a second filter that transmits light having a wavelength in a second range different from the first range, and the first and second filters. Includes a third filter that transmits light in a third range of wavelengths that is different from the range of
The method for detecting a test substance according to claim 4.
請求項５に記載の被検物質検出方法。 The first filter transmits light having a blue wavelength, the second filter transmits light having a green wavelength, and the third filter transmits light having a red wavelength.
The method for detecting a test substance according to claim 5.
請求項４〜請求項６のいずれか１項に記載の被検物質検出方法。 The filter is an absorption filter.
The test substance detection method according to any one of claims 4 to 6.
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の被検物質検出方法。 The photodetector has a quantum efficiency of less than 10% at the first peak wavelength.
The test substance detection method according to any one of claims 1 to 7.
請求項８に記載の被検物質検出方法。 The photodetector has a quantum efficiency of less than 5% at the first peak wavelength.
The method for detecting a test substance according to claim 8.
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の被検物質検出方法。 The photodetector includes a photoelectric conversion element using a silicon substrate.
The test substance detection method according to any one of claims 1 to 9.
請求項１０に記載の被検物質検出方法。 The photodetector is a microPMT, a PiN photodiode, an APD, an MPCC, an EMCCD, a CCD image sensor, a CMOS image sensor, or an NMOS image sensor.
The method for detecting a test substance according to claim 10.
請求項１１に記載の被検物質検出方法。 The photodetector is a microPMT or CMOS image sensor.
The method for detecting a test substance according to claim 11.
請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の被検物質検出方法。 The fluorescent substance is a quantum dot or an organic dye.
The test substance detection method according to any one of claims 1 to 12.
請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の被検物質検出方法。 When the light of the first peak wavelength is irradiated, the photodetector of the first fluorescent substance, the second fluorescent substance , and the photodetector in the direction of being irradiated with the light of the first peak wavelength. Arranged in order,
The test substance detection method according to any one of claims 1 to 13.
請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の被検物質検出方法。 The test substance is a nucleic acid, protein, or peptide.
The test substance detection method according to any one of claims 1 to 14.
請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の被検物質検出方法。 The step of forming the complex by binding the fluorescent substance and the test substance is further included.
The test substance detection method according to any one of claims 1 to 15.
前記被検物質と酵素とを含む第１複合体中の酵素と基質との反応により生じ且つ２４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の第１ピーク波長の光が照射されると４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第２ピーク波長の光を発する第１蛍光物質と、前記被検物質と酵素とを含む第２複合体中の酵素と基質との反応により生じ、且つ、２４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の第１ピーク波長の光が照射されると、前記第２ピーク波長とは異なる波長であり、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の第４ピーク波長の光を発する第２蛍光物質と、を含む試料に、前記第１ピーク波長の光を照射する工程と、
光検出器により、前記第１ピーク波長の光が照射された前記第１蛍光物質から発せられる前記第２ピーク波長の光と、前記第１ピーク波長の光が照射された前記第２蛍光物質から発せられる前記第４ピーク波長の光と、を検出し、蛍光像の画像を得る工程と、
前記第１ピーク波長とは異なる第３ピーク波長の光を前記複合体に照射する工程と、
前記光検出器により、前記第３ピーク波長の光が照射された前記被検物質の明視野像の画像を得る工程と、を備え、
前記光検出器は、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下のピーク波長の全域における量子効率が、前記第１ピーク波長における量子効率の２倍以上であり、
前記光検出器が、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する複数色の光として、前記第２ピーク波長の光と、前記第４ピーク波長の光と、を検出する、
被検物質検出方法。 This is a test substance detection method for detecting a test substance contained in a biological sample.
When the light of the first peak wavelength of 240 nm or more and 300 nm or less is irradiated, which is generated by the reaction of the enzyme and the substrate in the first complex containing the test substance and the enzyme, the second peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less It is generated by the reaction between the first fluorescent substance that emits light and the enzyme in the second complex containing the test substance and the enzyme, and is irradiated with light having a first peak wavelength of 240 nm or more and 300 nm or less. A step of irradiating a sample containing a second fluorescent substance having a wavelength different from the second peak wavelength and emitting light having a fourth peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less with light having the first peak wavelength. ,
From the second peak wavelength light emitted from the first fluorescent substance irradiated with the light of the first peak wavelength and the second fluorescent substance irradiated with the light of the first peak wavelength by the light detector. A step of detecting the emitted light having the fourth peak wavelength and obtaining an image of a fluorescence image, and
A step of irradiating the complex with light having a third peak wavelength different from the first peak wavelength,
A step of obtaining a bright-field image of the test substance irradiated with light having the third peak wavelength by the photodetector is provided.
The photodetector has a quantum efficiency in the entire peak wavelength range of 450 nm or more and 900 nm or less, which is more than twice the quantum efficiency in the first peak wavelength.
The photodetector detects the light having the second peak wavelength and the light having the fourth peak wavelength as light having a peak wavelength in the range of 450 nm or more and 900 nm or less.
Test substance detection method.
請求項１７に記載の被検物質検出方法。 The enzyme is peroxidase or alkaline phosphatase,
The method for detecting a test substance according to claim 17.
光検出器により、前記第１ピーク波長の光が照射された前記第１蛍光物質から発せられる前記第２ピーク波長の光と、前記第１ピーク波長の光が照射された前記第２蛍光物質から発せられる前記第４ピーク波長の光と、を検出し、蛍光像の画像を得る工程と、
前記第１ピーク波長とは異なる第３ピーク波長の光を前記蛍光物質に照射する工程と、
前記光検出器により、前記第３ピーク波長の光が照射された前記蛍光物質の明視野像を得る工程と、を備え、
前記光検出器は、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下のピーク波長の全域における量子効率が、前記第１ピーク波長における量子効率の２倍以上であり、
前記蛍光像の画像を得る工程は、前記光検出器により、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ以下の範囲にピーク波長を有する複数色の光として、前記第２ピーク波長の光と、前記第４ピーク波長の光と、を検出する、
蛍光検出方法。 When the light of the first peak wavelength of 240 nm or more and 300 nm or less is irradiated, the first fluorescent substance which emits the light of the second peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less, and the second when the light of the first peak wavelength is irradiated. A step of irradiating a sample containing a second fluorescent substance having a wavelength different from the peak wavelength and emitting light having a fourth peak wavelength of 450 nm or more and 900 nm or less with light having the first peak wavelength.
From the second peak wavelength light emitted from the first fluorescent substance irradiated with the light of the first peak wavelength and the second fluorescent substance irradiated with the light of the first peak wavelength by the light detector. A step of detecting the emitted light having the fourth peak wavelength and obtaining an image of a fluorescence image, and
A step of irradiating the fluorescent substance with light having a third peak wavelength different from the first peak wavelength,
A step of obtaining a bright-field image of the fluorescent substance irradiated with light having the third peak wavelength by the photodetector is provided.
The photodetector has a quantum efficiency in the entire peak wavelength range of 450 nm or more and 900 nm or less, which is more than twice the quantum efficiency in the first peak wavelength.
In the step of obtaining the image of the fluorescence image, the light of the second peak wavelength and the light of the fourth peak wavelength are used as light of a plurality of colors having a peak wavelength in the range of 450 nm or more and 900 nm or less by the photodetector. , Detect,
Fluorescence detection method.
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