JP6862442B2 - 植物材料から低分子ｒｎａ濃縮水性抽出物を得る方法および方法に由来する抽出物 - Google Patents

Description

本発明は、植物材料から、最大長１５０ヌクレオチド（ｎｔ）の低分子ＲＮＡ（リボ核酸）濃縮水性抽出物を得る方法、そのような方法に由来する抽出物、ならびにそのような抽出物を含む組成物およびその化粧品における使用に関する。

従来のリボ核酸（ＲＮＡ、低分子量ＲＮＡ）抽出プロトコールは、研究室で実施され、このため小規模であり、これらのプロセスが、毒性であり化粧品の溶媒ではないと考えられるフェノールおよびクロロホルムなどの溶媒の使用を伴うことから、ドラフト内で実施しなければならない（Ｚｕｍｂｏ，Ｐ．２０１４“Ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，”２０１４）。これらの溶媒は、溶解した細胞、もしくは非常に細かく破砕した植物もしくは動物組織の水相に添加されるか、または液体窒素の存在下で産生される破砕調製物に直接添加される。このようにして得た溶液を、１０，０００ｇ程度の高速で、４℃で遠心分離すると、十分に分離された２つの相、すなわちタンパク質を含む有機相と、総ＲＮＡ（total RNA）を含む水相とが生成され、中間相はＤＮＡを含む。次に、中間相および有機相を誤って収集しないように、水相を注意深く回収しなければならない。ＲＮＡの沈殿ステップはイソプロパノールによって行われる。次に、総ＲＮＡ沈降物をエタノールで洗浄する。次に、総ＲＮＡを水に再溶解させ、超低温（−２０℃、および−８０℃はなおよい）で保存しなければならない。

低分子量ＲＮＡのみを得る場合には、Ｓｉｇｍａ社のキット、ｍｉｒＰｒｅｍｉｅｒ（商標）マイクロＲＮＡ単離キットなどの、精製カラムを含むキットを使用することが可能である。これらのキットは、当該体積がｍＬ程度であることから、研究室での試験規模に限って使用することができ、したがって大規模な製品開発に適応させることができない。

さらに、これらの全ての抽出および精製プロトコールでは、精製された核酸分画を得ることができない。このＲＮＡもしくはＤＮＡまたは低分子ＲＮＡ核酸分画は、目的の他の任意の分子、例えば皮膚に対して有益な効果を有し、そのため美容上興味深い可能性がある二次代謝物、ビタミン、糖、ペプチド等を含まない。

その上、例えば、純粋なＤＮＡに関して濃縮された植物胚の水性抽出物を得る方法を記述する文書、国際公開第８４０３８３５号が知られている。そのような方法は、特に、スクロース、ＥＤＴＡ（０．０５Ｍ）、および塩化ナトリウムを含むｐＨ９．５の緩衝抽出溶液中で破砕したコムギ胚および／またはダイズ胚を使用する。濾過後、残渣を、陰イオン性洗浄剤を補充したｐＨ７．４の緩衝食塩水トリス溶液に、周囲温度で攪拌しながら再懸濁させた後、過塩素酸ナトリウムを０℃で攪拌しながら添加し、クロロホルムおよびオクタノールを添加した後、低温（４℃）および超高速（２５，０００ｇ）で遠心分離する。本質的にＤＮＡを含むが、少量のＲＮＡおよび少量のアミノ酸を有する水相を回収し、これに対してＲＮアーゼを作用させることができることは有利である。

このように、この文書は、産物に毒性の影響を残し得、このため化粧品において使用することができない、陰イオン性洗浄剤ならびにクロロホルムおよびオクタノールを含む様々な溶媒による処置を含む非常に多数の処置を使用して、ＤＮＡに関して特異的に濃縮された植物胚の水性抽出物を得ることを開示する。

文書、フランス国特許第２８３１１６８号も同様に知られており、この特許は、植物材料、特にＤＮＡまたはＲＮＡ含有量が高い植物胚または種子から核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）に富む抽出物を得る方法を記述する。方法は、９〜１３の初回ｐＨでセルロース分解酵素の存在下、水性培地中で植物材料を抽出すること、ｐＨを中性（これらの酵素の作用にとって最適なｐＨ）に向けて数分間で低下させること、次に、水性抽出物を回収するために植物材料を分離すること、ならびに最後にプロテアーゼによって抽出物を処置すること、および精製水性抽出物を回収するために不溶性物質を分離することに存する。このようにして得た凍結乾燥産物は、特にＤＮＡを０．１〜１重量％、ＲＮＡを０．２〜１．５重量％、ならびに炭水化物、タンパク質、ミネラル、ビタミンＢおよび脂質を含み得る。

特に、この文書に記載のデータに基づくと、このようにして得た凍結乾燥産物は、１〜１０ｍｇ／ＬのＤＮＡを、および１０〜７５ｍｇ／ＬのＲＮＡを含むようである。

上記を考慮すると、本発明が解決することを提唱する問題は、植物材料から、低分子ＲＮＡに関して特異的に濃縮され、ＤＮＡを含まない水性抽出物を得るための、工業規模で実施するために容易かつ安価で、セルロース分解酵素（セルラーゼ、ヘミセルラーゼ）またはＤＮアーゼを必ずしも使用する必要がなく、低分子ＲＮＡの良好な収量を提供し、例えば洗浄剤および潜在的に毒性の溶媒の使用などの、上記の先行技術の方法の短所を有しない方法を開発することである。

このようにして得た抽出物は、化粧品に直接使用することができる。

このため、本発明の第一の主題は、植物材料か、最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得る方法であって、
ａ）植物材料を水に接触させるステップと、
ｂ）エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（ＥＤＴＡ）を、ａ）で得た混合物に添加し、混合物のｐＨを１０．５〜１１の間にするステップと、
ｃ）次に、ｂ）で得た混合物のｐＨを６〜８の間の値に調節するステップと、
ｄ）ｃ）で得た混合物を、植物材料を除去するようにおよび水性粗抽出物（aqueous raw extract）を回収するように精製するステップと、ならびに
ｅ）最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得るために、水性粗抽出物の少なくとも１回の濾過を行い、そのｐＨをチェックして、必要であれば、６〜８の間の値に、好ましくは６〜６．５の間に調節するステップ、
を含む方法である。

さらに、本発明の第二の主題は、本発明に従う方法によって得た、最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡに関して濃縮された植物材料の水性抽出物であって、抽出物の総重量と比較して重量で５〜６０ｇ／ｋｇの乾燥抽出物、および１０〜１０００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡを含み、ＤＮＡを含まない水性抽出物である。

本発明の第三の主題は、アンチエイジング活性剤としての本発明に従う抽出物の有効量と、生理的に許容される媒体とを含む組成物である。

本発明の第四の主題は、皮膚の加齢の徴候に対処するための本発明に従う組成物の化粧品における使用である。

最後に、本発明の第五の主題は、皮膚の水和状態を改善するための本発明に従う組成物の化粧品における使用である。

本発明および本発明から得られる利点は、添付の図面を参照して書かれた以下の説明および非制限的な実施形態を読むことによってよりよく理解されるであろう。

本発明の実施例２に従う抽出物（コメ胚芽）における低分子量ＲＮＡの抽出に及ぼすｐＨの効果を証明する、２％アガロースゲルでの電気泳動を表す図である。 本発明の実施例２に従う抽出物（コメ胚芽）における低分子量ＲＮＡの抽出に及ぼす酵素的加水分解の効果を証明する、２％アガロースゲルでの電気泳動を表す図である。 本発明の実施例３に従う抽出物（レンズマメ）の低分子量ＲＮＡのＢｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ（登録商標）による定量を表す図である。 ＤＮアーゼによる処置の前および後での、本発明の実施例４に従う抽出物（レンズマメ）の低分子量ＲＮＡのＢｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ（登録商標）による定量を表す図である。 継代８回（Ｐ８）のヒト線維芽細胞におけるヒアルロナンシンターゼ２（ＨＡＳ２）の発現に及ぼす実施例７、８、および９に従うバオバブ（アダンソニアディギタータ（Ａｄａｎｓｉｏｎａ ｄｉｇｉｔａｔａ））の異なる抽出物の効果を表す図である。 継代３２回（Ｐ３２）のヒト線維芽細胞におけるヒアルロナンシンターゼ２（ＨＡＳ２）の発現に及ぼす実施例７、８、および９に従うバオバブ（アダンソニアディギタータ）の異なる抽出物の効果を表す図である。

本明細書において特に示していない限り、間隔が示されている場合、上記間隔の上限および下限を含むと理解される。

本発明は、植物材料から、最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得るために実施する方法に関する。本発明の方法の前に、当業者に公知の任意のタイプの予備的な抽出ステップ（化学的加水分解、酵素的加水分解等）を行うことができ、それによって、例えば本発明の方法の適切な実施にとって有害となり得る特定の植物分画を予め除去することが可能であることに注目すべきである。

「低分子ＲＮＡ」または「低分子量ＲＮＡ」は、全ての一本鎖および／または二本鎖の非メッセンジャー低分子ＲＮＡ型、例えばマイクロＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、イントロン、低分子核ＲＮＡ、または任意のＲＮＡ断片などの、低分子量を有し、最大長１５０ヌクレオチドの非コードＲＮＡ（リボ核酸）を意味すると理解される。

一般的に、植物材料は、そのライフサイクルが一般的に水性環境で起こる植物、例えば藻類を含む、無機物で生育して二酸化炭素を吸収する、非常に低い運動度を特徴とする、植物、植物界の一部である生きている生物である。

本発明を実施するために、本発明に従う植物材料は、植物全部または好ましくは植物の一部（果実、葉、根、球根、胚芽、種子等）であることが有利であり、これらは、新鮮な、乾燥、発芽した、全部の、粉末の、凍結された形態で使用することができるが、油かすまたはビールかすなどの、変換後に得られた植物残渣の形態でも使用することができる。本発明を実施するために、上記の植物種の全ての部分を使用して抽出物、最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得ることができる。このように、植物の特定の部分に関する実施例を、説明のために非制限的に示す。

低分子量ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得るために、開始植物材料として任意の果実または果実の一部の使用を検討することができることは有利である。例えば、果実全部、小片の形態、粉末の形態、新鮮または凍結形態、ビールかすの形態での果実を挙げることができる。トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）の果実のみならず、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）の果実、例えば、ハイビスカスエスクレンツス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）などの他の科の果実を挙げることができる。同様に、ザクロ科（Ｐｕｎｉｃａｃｅａｅ）の果実、例えばプニカグラナツム（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）（ザクロ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）の果実、例えばアクチニジアキネンシス（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（キウイフルーツ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）の果実、例えばプシデュームグアバ（Ｐｓｉｄｕｍ ｇｕａｊａｖａ）（グアバ）、フクギ科（Ｃｌｕｓｉａｃｅａｅ）の果実、例えばガルシニアカンボジア（Ｇａｒｃｉｎｉａ ｃａｍｂｏｄｇｉａ）（マラバータマリンド（Ｍａｌａｂａｒ ｔａｍａｒｉｎｄ））、パパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）の果実、例えばカリカパパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）（パパイア）も挙げることができる。同様に、キントラノオ科（Ｍａｌｐｈｉｇｉａｃｅａｅ）に属する果実、例えばマルフィジアグラブラ（Ｍａｌｐｈｉｇｉａ ｇｌａｂｒａ）（アセロラ）、ベリーの形態の果実、例えばツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）の果実、例えばバクシニウムミルティルス（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）（ワートルベリー）、およびスグリ科（Ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａｃｅａｅ）の果実、例えばリベスニグルム（Ｒｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ）（クロスグリ）の使用も検討することができる。またはナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）の任意の果実、例えばリシウムバルバルム（Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ）（クコ）を考慮することができる。

低分子量ＲＮＡ濃縮水性抽出物はまた、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、例えばバラ、およびミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、例えばダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ）（サワーオレンジフラワー）の全部の形態、粉末の形態、新鮮または凍結形態の任意の花から得ることができる。同様に、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）の花、例えばソケイ（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（ジャスミン）またはキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）の花、例えばケンタウレアシアヌス（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ ｃｙａｎｕｓ）（ヤグルマギク）などの他の科の花の使用も挙げることができる。

種子もまた、低分子量ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得るための開始植物材料として使用することができる。全部、または粉末、発芽、もしくは非発芽の形態の任意の種子を使用することができる。参考までにおよび非制限的に、これらの種子は、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）の植物、例えばキヌアケノポディウム（Ｑｕｉｎｏａ ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、マメ科植物またはマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、例えばレンズエスクレンタ（Ｌｅｎｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（レンズマメ）、またはイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に属する植物、例えばイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（コメ）に由来し得る。それらはまた、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）の植物、例えばペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ）（カボチャ）、またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）の植物にも由来し得る。同様に、ミカン科もしくはバラ科の、または種もしくは核を含む果実を生じる他の任意の種の小さい種子または種も本発明に使用することができる。

植物の地下部分、例えば根または根茎、球根もまた、低分子量ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得るための開始植物材料として考慮することができる。これらの地下部分は、全部の形態、粉末の形態、新鮮、乾燥、または凍結形態であり得る。参考までにおよび非制限的に、根または球根または根茎は、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、例えばリリウムカンディダム（Ｌｉｌｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）またはリリウムティグリヌム（Ｌｉｌｉｕｍ ｔｉｇｒｉｎｕｍ）に由来するが、本発明に関してアヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）の任意の植物種の使用も考慮することができる。

同様に、低分子量ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得るための開始植物材料として、任意のタイプの葉の全部の形態、粉末の形態、新鮮または凍結形態を考慮することも可能である。ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）もしくはヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）の植物、または発達した葉系を有する他の任意のタイプの植物科の植物を挙げることができる。

実施例で使用される植物は、好ましくはイネ科（以前はｇｒａｍｉｎａｃｅａｅ）、マメ科植物と一般的に呼ばれるマメ科、アオイ科、パンヤ科（Ｂｏｍｂａｃａｃｅａｅ）、ウリ科、アカザ科または擬穀類科、バラ科、ミカン科、ユリ科、トケイソウ科から選択される。

非制限的な説明的な例として、植物材料は、ハイビスカスエスクレンツス（オクラ）、アダンソニアディギタータ（バオバブ）、ケノポディウムキヌア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）（キヌア）、レンズエスクレンタ（レンズマメ）、イネ（コメ）、ペポカボチャ（カボチャ）、ロサケンチフォリア（Ｒｏｓａ ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）（バラ）、ダイダイ（ビターオレンジツリー）、リリウムカンディダム（ユリ）、リリウムティグリヌム（オニユリ）、パッシフローラアラタ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ａｌａｔａ）（パッションフラワー）種から選択される。

本発明に従う方法の第一のステップａ）において、植物材料を、好ましくは植物材料／水の比率が４〜２０重量％、より好ましくは５〜１５重量％、例えば５、１０、または１５重量％の比率で水に接触させる。

使用する水は、蒸留水、脱塩水、または無機塩および／または希土類元素に富む水であり、好ましくは蒸留水である。

好ましくは、植物材料を、ステップａ）で水に接触させる前に破砕する。破砕は、より良好な抽出を可能にする機械的作用である。機械的破砕の後に、ＥＤＴＡの存在下でのアルカリ溶解により、細胞膜、特に核膜の完全な破壊が促進される。

次に、ステップｂ）において、ＥＤＴＡ四ナトリウムをａ）で得た混合物に添加する。このステップのｐＨはアルカリ性であり、必要に応じて水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加することによって１０．５〜１１の間の値に調節しなければならない。ステップｂ）では、１０．５〜１１の間のアルカリｐＨを維持することは必須である。実際に、ＥＤＴＡの作用に関連するこのｐＨレベルは、核膜を含む細胞膜の破壊、細胞の溶解、およびＤＮＡの変性（二重らせんの２つの鎖が分離する）を引き起こす。ステップｂ）でのｐＨチェックは、ｐＨがアルカリ性に留まり、９〜１１の間で安定化することを示している。

ＥＤＴＡ四ナトリウムの濃度は、好ましくは２〜１５ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭである。

この濃度は、最終抽出物における低分子量ＲＮＡの抽出収量を最適にするために選択される。ＥＤＴＡ四ナトリウムは、セルロースミクロフィブリルを取り囲むペクチン分子間のイオン結合を形成するカルシウムイオンなどの二価イオンを錯体形成によって封鎖することによって、植物細胞のペクト−セルロース膜を弱くして破壊する。この結果、抽出の際に細胞内容物の放出が促進される。ＥＤＴＡ処置ステップは、抽出物を低分子量ＲＮＡに関して濃縮するために必須である。

ＥＤＴＡ処置ステップは、２０〜８０℃の間の温度で好ましくは少なくとも１時間持続する。このステップにおいて、ａ）で得た混合物を攪拌することは有利である。

次にステップｃ）において、ｂ）で得た混合物のｐＨを６〜８の間の値に調節する。

例えば、ｐＨを、塩酸（ＨＣｌ）溶液、または化粧品における使用に適合する、クエン酸もしくは乳酸などの、ｐＨを調節することができる任意の酸を添加することによって調節する。

この酸性化ステップは、ＤＮＡの突然の再生（二重鎖の鎖の新たな対形成）を引き起こす。しかし、非常に長い染色体ＤＮＡの新たな対形成は、完全には起こらず、それによって不溶性のもつれが形成される。これに対し、非常に短い低分子ＲＮＡは溶液中に留まっている。このように、ＤＮＡおよび低分子ＲＮＡは、２つの個別の相、すなわち他の成分もあるが染色体ＤＮＡを含む固相、および他の成分もあるが低分子ＲＮＡを含む液相へと分離される。

ステップｄ）において、ｃ）で得た混合物を、植物材料を除去するようにおよび水性粗抽出物を回収するように精製する。当業者に公知の任意の方法を使用することができる。好ましくは、残留植物材料が沈降物に沈降し、水性粗抽出物が上清中に回収されるように、ｃ）で得た混合物を低速で、例えば４０００ｇで少なくとも１０分間遠心分離する。

遠心分離の際に非常に密集した沈降物を得るために、ステップｄ）の前に珪藻土またはシリカを１０〜２０ｇ／ｋｇの濃度で混合物に添加することが有利であり、これにより望ましくない固形物を含まない上清を得ることが可能となる。

ステップｅ）において、ｐＨをチェックして、６〜８の間の値に再調節する。好ましくは、ｐＨを６〜６．５の間の値、さらにより好ましくは６．５に再調節する。ｐＨを、塩酸（ＨＣｌ）または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の溶液を添加することによって再調節する。

実際に、６より低いｐＨでは、一般的に核酸の沈殿、このため最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡの沈殿が起こり得る。本発明に従う方法のステップｅ）におけるｐＨ調節ステップは、低分子量ＲＮＡの最適な抽出にとって不可欠なステップである。

ステップｅ）のｐＨの再調節の前に、ｄ）で得た水性粗抽出物の少なくとも１回の濾過を行うことが有利である。好ましくは、濾過のカットオフを２０〜５０μｍから０．１〜０．３μｍに低下させることによって連続的な濾過を実施する。

有利である実施形態に従って、本発明に従う方法は、ステップｃ）の前に、ｂ）で得た混合物に対して直接、またはｂ）で得た混合物の遠心分離後の上清に対して実施される追加の加水分解ステップ、ならびに４５〜６５℃の間の温度、および使用される酵素に応じて調節されたｐＨ、一般的には６〜８．５の間のｐＨにおける、少なくとも１時間の、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、および／またはプロテアーゼから選択される少なくとも１つの酵素、好ましくはプロテアーゼの作用による植物材料の除去を含む。

追加の加水分解ステップを実施する場合には、先のステップの際に抽出された低分子量ＲＮＡを保存するためおよび過度の酸性ｐＨによるその沈殿を防止するために、ｐＨを必要に応じて、６〜８の間、好ましくは６〜６．５の間に再調節する。

この有利である実施形態において、方法はさらに、６５〜８０℃の間の温度で少なくとも１時間の酵素の不活化ステップを必ず含み、この不活化ステップは、加水分解ステップの直後またはｅ）での連続的な濾過ステップのうちの２つのステップの間に実施する。

本発明の第二の主題は、上記の方法によって得ることができる本発明の最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡに関して濃縮された、植物材料の水性抽出物である。

特定の実施形態において、本発明の最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物は、上記の方法によって得られる。

この抽出物はＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を含まない。

そのような最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物は、希釈前、抽出物の総重量に対する重量で、５〜６０ｇ／ｋｇの乾燥抽出物、および１０〜１０００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡを含む。本発明に従う方法によって得ることができる抽出物はさらに、０．５〜３０ｇ／ｋｇのタンパク質断片および０．５〜５０ｇ／ｋｇの糖を含む。そのような抽出物はさらに、０．０１〜５ｇ／ｋｇのアミノ酸および０．０１〜４ｇ／ｋｇのフェノール化合物を含み得る。

そのようにして得た抽出物は、濃縮されていると考えられる。次に、これを化粧品における使用のために生理的に許容される溶媒で、抽出物の濃度が目的の特定の乾燥抽出物重量に調節されるように、希釈することができる。

生理的に許容される溶媒の説明的なおよび非制限的な例として、水、グリセロール、エタノール、プロパンジオールならびにＺｅｍｅａ（登録商標）と呼ばれるトウモロコシ由来のその天然型、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化ジグリコール、環状ポリオール、またはこれらの溶媒の任意の混合物を挙げることができる。

好ましくは、本発明に従う方法によって得ることができる抽出物は、３０％グリセロールおよび水などの溶媒で希釈され、抽出物の総重量に対する重量で、５〜３５ｇ／ｋｇの乾燥抽出物、および１０〜５００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡを含む。この希釈抽出物はさらに、０．５〜２０ｇ／ｋｇのタンパク質断片、および０．５〜３０ｇ／ｋｇの糖を含む。そのような希釈抽出物はさらに、０．０１〜３ｇ／ｋｇのアミノ酸、０．０１〜２ｇ／ｋｇのフェノール化合物を含み得る。

例証するために、本発明に従う方法の好ましい実施形態の例を、以下に記述する。

［実施例１］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたイネ科のコメ胚芽（イネ）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、イネ科（以前のｇｒａｍｉｎａｃｅａｅ）のコメ（イネ）から得る。

第一のステップにおいて、粉末形態の５％のコメ胚芽を蒸留水に入れて１０ｍＭ ＥＤＴＡ四ナトリウムを添加する、またはコメ胚芽粉末５０ｇを蒸留水１ｋｇに入れてＥＤＴＡ四ナトリウム３．８ｇを添加する。このステップのｐＨは、抽出物を低分子量ＲＮＡに関して最適に濃縮するために、アルカリ性で１０．５〜１１の間でなければならない。

混合物を周囲温度で２時間攪拌する。

次に、プロテアーゼ（セリンエンドペプチダーゼであるＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）と、ブロメラインとからなる）を、使用する植物材料に関してそれぞれ２％で添加する、または各酵素１ｇを混合物に添加して、酵素的加水分解を実施する。ｐＨを７．５〜８の間に調節する。

次に、混合物を５５℃で２時間加熱後、これらの同じ酵素を不活化するために８０℃で２時間加熱する。

次に、混合物を珪藻土（混合物１ｋｇあたり１０ｇ）と共に４０００ｇで１０分間遠心分離して、固形物を除去する。

このステップの後、任意選択の希釈の前に、必要に応じてｐＨを６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、ｐＨをチェックする。

次に、植物抽出物を透明化するために、０．２μｍでの濾過滅菌まで漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

一般的に、２０〜５０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、３〜１５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５〜３０ｇ／ｋｇの糖、１．５〜３ｇ／ｋｇのアミノ酸、３００〜７５０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および５０〜４００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、淡黄色のコメ胚芽の水性抽出物。

それにもかかわらず、イネ種からのコメ胚芽に関して、得られた抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

より詳しくは、本実施例において、２３ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物であると決定される水性抽出物が得られる。物理化学分析では、この抽出物が４．８ｇ／ｋｇのタンパク質断片、８．２ｇ／ｋｇの糖、２．３ｇ／ｋｇのアミノ酸、３２８ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１３２ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡの濃度を有することを示している。その後、この抽出物を水で希釈して、グリセロールなどの化粧品溶媒、および１．５％フェノキシエタノールなどの保存剤を添加することによって保存することができる。

［実施例２］
方法の実施におけるｐＨおよび酵素的加水分解の影響に関する試験
本発明に従う方法の実施におけるｐＨの影響を試験するために、異なるｐＨ値および異なるタイプの植物に関して抽出試験を行った。

これらの抽出を、特にコメ胚芽（実施例１に記載のように）について実施した。本発明に従って検討したおよびより詳しく記述した全てのタイプの植物に関して、一般的に比較可能な結果を得ることができる。

５％コメ胚芽粉末を水に入れる、またはコメ胚芽粉末５０ｇを蒸留水１ｋｇに入れ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ四ナトリウム（または３．８ｇ）を添加する。濃水酸化ナトリウム１〜３ｍＬを添加することによってｐＨを７または１１に調節した後、混合物を周囲温度で２時間攪拌する。

次に、この重要なステップの後に各抽出物に関して低分子量ＲＮＡの濃縮を観察するために、抽出方法の際に試料の収集を実施する。

このように、低分子量ＲＮＡの存在を可視化するために２％アガロースゲルでの電気泳動を実施する（図１Ａ）。

図１Ａに例証するように、抽出物を低分子量ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨは、ｐＨ １１のアルカリｐＨであることが観察され得る。実際にｐＨ７では抽出物は低分子量ＲＮＡを含まない（特徴的なバンドは存在しない）。

このため、ＥＤＴＡ処置ステップの際のアルカリｐＨの使用は、本発明に従う方法の実施にとって必須の条件である。

第二のステップにおいて、使用する植物材料に関して混合物中で各２％のプロテアーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）と、ブロメラインとからなる）または各酵素１ｇによって酵素的加水分解を行う。６より低いｐＨは低分子量ＲＮＡの沈殿を引き起こすことから、酵素の活性に関して最適なｐＨであり、混合物中で低分子量ＲＮＡを可溶性に維持するために最適である７．５〜８の間にｐＨを調節する。

混合物を、酵素の活性にとって最適な温度である５５℃で２時間加熱した後、これらの同じ酵素を不活化するために８０℃で２時間加熱する。

次に、固形物を除去するために、混合物を珪藻土（混合物１ｋｇあたり１０ｇ）と共に４０００ｇで１０分間遠心分離する。

このステップの後、ｐＨを６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、任意選択の希釈前にｐＨをチェックする。

次に、植物抽出物を透明化するために、多孔性０．２μｍでの濾過滅菌まで漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

最終抽出物を、２％アガロースゲルでの電気泳動によって可視化する（図１Ｂ）。

図１Ｂに例証されるように、酵素の使用は、最終抽出物中の低分子量ＲＮＡの抽出収量を有利に改善することが認められる。

この結果を異なるタイプの植物抽出物について観察した。酵素が低分子量ＲＮＡの抽出を増強するという事実は、タンパク質がしばしば核酸に結合しているという事実によるものであり得る。タンパク質のペプチド結合を分解する酵素によってタンパク質を分解すると、このように、小さいサイズ（１０ｋＤａ未満）のタンパク質断片を作製し、それによってタンパク質に結合したＲＮＡを解離させて放出させることが可能となり、このため抽出物中のその最終的な収量が増加する。

［実施例３］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたマメ科のレンズマメ（レンズエスクレンタ）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物をレンズマメ（レンズエスクレンタ）から得る。

第一のステップにおいて、抽出方法の前日にレンズマメ４０ｇを蒸留水で覆って、レンズマメを発芽させる。

翌日、抽出方法で使用したレンズマメの４％に等しい量を得るために、蒸留水を添加する。

レンズマメ（蒸留水１ｋｇに関して十分な量の４０ｇ）を破砕して、１０ｍＭ ＥＤＴＡ四ナトリウム（または３．８ｇ）を添加する。ＮａＯＨ溶液を添加することによってｐＨを１１に調節し、混合物を周囲温度で２時間攪拌する。

固形の破片を除去するために、大きい多孔性の濾過を実施することは有利である。

酵素的加水分解を実施するために、ＨＣｌ溶液の添加によってｐＨを７．５〜８の間に調節する前に酵素が可溶化することができるように注意して、プロテアーゼ（使用する植物材料に関して２％ブロメラインおよび２％Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標））を濾液に添加する。

濾液を５５℃で２時間攪拌しながら維持し、その間に加水分解が起こる。

植物水性粗抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズを有する漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

次に、酵素を不活化するために、抽出物を８０℃で１時間加熱する。

濾過を、０．３〜０．４μｍの多孔性まで継続する。

抽出方法のこのステップにおいて、ｐＨを有利に６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、任意選択の希釈の前にｐＨを適切にチェックすることは重要である。

一般的に、１５〜２５ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、３〜８ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２〜８ｇ／ｋｇの糖、１〜３ｇ／ｋｇのアミノ酸、３００〜７５０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および５０〜１５０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、暗赤色のレンズマメの水性抽出物が得られる。

しかし、同じ種のレンズマメ（レンズエスクレンタ）に関して、得られた抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

より詳しくは、本実施例において、１５．４ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、６．９ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２．１ｇ／ｋｇの糖、１．４ｇ／ｋｇのアミノ酸、４００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および９６ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に抽出物を、水、または例えば水および３０％グリセロールを含む生理的に許容される溶媒で、最終抽出物が１０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物に調節されるように希釈する。

物理化学分析では、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）による低分子量ＲＮＡの定量によって、図２により詳しく例証されているように、希釈後、この抽出物が５．１ｇ／ｋｇのタンパク質断片、１．５ｇ／ｋｇの糖、０．８ｇ／ｋｇのアミノ酸、２８０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および７０ｍｇ／ｋｇの低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）の濃度を有することを示している。

Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ（登録商標）は、低分子量ＲＮＡの分析などの核酸の分析のために特異的な電子チップにより小型化された電気泳動を実施することが可能な装置である。これは、数マイクロリットルを使用して抽出物に含まれるサイズおよび濃度を決定することが可能である。結果は、縦軸に任意の蛍光単位（ＦＵ）および横軸にヌクレオチド（ｎｔ）数を示すグラフの形である。内部マーカーを各分析に加えて（図２における４ヌクレオチドでのピーク）、分析の適切な実施をバリデートするための内部対照とする。

［実施例４］
実施例３に従う抽出物（レンズマメ）中のＤＮＡの非存在に関する試験
本発明に従う抽出物中で得られた核酸が実際にＲＮＡであり、より詳しくは低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）であり、ＤＮＡではないことを確認するために、ＤＮＡを特異的に分解するＤＮアーゼ（ＯＰＴＩＺＹＭＥ（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ）を使用する試験を、供給元によって推奨されるプロトコールに従って実施した。

５００μｇ／ｍＬのサケＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ、３１１４９−１０ｇ−Ｆ）を含む対照溶液および５００μｇ／ｍＬのトルラ酵母由来低分子量ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｒ６６２５−２５Ｇ）を含む別の対照溶液を調製した。反応容積は、ＤＮＡまたはＲＮＡ１μｇあたり、ＲＮアーゼ１μＬ、１０倍緩衝液１μＬを含み、０．１容積％ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）水で全量を１０μＬとした。反応混合物を、ＤＮアーゼの反応の最適な条件である３７℃で３０分間インキュベートする。次に、５０ｍＭ ＥＤＴＡ四ナトリウムを添加して、６５℃で１０分間加熱することによって酵素を不活化する。

ＤＮアーゼの作用後、実施例３に従う対照溶液および抽出物のプロファイルを可視化するために、低分子ＲＮＡをＤＮアーゼによる処置の前および後にＢｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ（登録商標）によって定量する。植物抽出物のＤＮアーゼによる処置の存在下または非存在下で得たプロファイルは同一であり、図３に例証するように、同じまたはおよそ３０ｍｇ／ｋｇの量が残っている。内部マーカー（図３における４ヌクレオチドでのピーク）を各分析に加えて、分析の適切な実施をバリデートするための内部対照とする。

ＤＮＡを特異的に分解するがＲＮＡは分解しない酵素であるＤＮＡアーゼによる試験により、実施例３に従う抽出物の核酸が、ＤＮアーゼによる処置後になおも存在することが証明されている。このため、これは実際にＲＮＡ、特に最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであり、ＤＮＡではない。

［実施例５］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたアオイ科のオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、ハイビスカスエスクレンツス種のオクラの実から得る。

第一のステップにおいて、解凍後、１０％のハイビスカスエスクレンツスの実を蒸留水中で混合する、または例えば実１００ｇを蒸留水１ｋｇ中で混合した後、ＥＤＴＡ四ナトリウムを最終濃度１０ｍＭまたは１ｋｇあたり３．８ｇで添加して１０分間破砕する。このステップにおけるｐＨは、抽出物を低分子ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨである１０．５〜１１の間である。

次に、この混合物を４５℃で２時間攪拌する。この段階の温度は２０℃から８０℃まで変更しうるが、この種に関して、４５℃の温度は最終水性抽出物の低分子量ＲＮＡに関する濃縮に関して最善の結果を得ることを可能にする温度であることが判明している。

２時間後、珪藻土（またはシリカ）を１０ｇ／ｋｇの濃度で添加し、混合物をさらに１０分間攪拌した後、４０００ｇで１０分間遠心分離する。

次に、上清を収集する。この生抽出物は、特にタンパク質断片、糖、および低分子量ＲＮＡを含む。

酵素的加水分解を実施するために、ｐＨを７．５〜８の間に調節する前に酵素が可溶化することができるように注意して、プロテアーゼ（使用する植物材料の量に関して２％ブロメラインおよび２％Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標））を添加する。

粗溶液を攪拌しながら５５℃で２時間維持し、その間に加水分解が起こる。酵素的加水分解により、低分子量タンパク質の断片（１０ｋＤａ未満、高分子量タンパク質はおそらくアレルゲン性である）を得ることが可能となる。このようにして得られたそのようなタンパク質断片はさらに、皮膚に関して興味深い生物活性を有し得る。

生抽出物の透明化を開始するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズを有する漸減する多孔性の濾紙を使用して連続的な濾過を実施した後、８０℃の高温で抽出物を一晩加熱するステップを行う。このステップは、プロテアーゼを不活化することが可能であり、プロテアーゼは強い熱の作用により、変性を受けて不活化される。

次に、濾過を０．１〜０．３μｍでの濾過滅菌まで継続する。

次に、低分子量ＲＮＡが沈殿するのを防止するために、植物抽出物は、６〜８の間の最終ｐＨを有しなければならない。抽出方法のこのステップにおいて、さらにより好ましくはｐＨを６〜６．５の間にするために、任意選択の希釈前に、ｐＨを実際に確認しなければならない。

一般的に、１０〜２０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、２〜５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２．５〜５ｇ／ｋｇの糖、０．１〜２ｇ／ｋｇのアミノ酸、０．２〜３ｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１０〜１００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、淡黄色の水性抽出物が得られる。

それにもかかわらず、同じ種（ハイビスカスエスクレンツス）のオクラの実に関して、得られた抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

本実施例において、より詳しくは、１３．３ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、３．２ｇ／ｋｇのタンパク質断片、３．９ｇ／ｋｇの糖、７９０ｍｇ／ｋｇのアミノ酸、４９０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および６０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に、例えば水および３０％グリセロールを含む生理的に許容される溶媒で、最終抽出物が１０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物に調節されるように、抽出物を希釈する。

物理化学分析では、希釈後、抽出物が、２．５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２．７ｇ／ｋｇの糖、５２０ｍｇ／ｋｇのアミノ酸、３２０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および３５ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡの濃度を有することを示している。

［実施例６］
オクラ（ハイビスカスエスクレンツス）から低分子ＲＮＡを抽出する方法の実施におけるＥＤＴＡ処置ステップの役割の証明
低分子量ＲＮＡの抽出におけるＥＤＴＡ処置ステップの役割を証明する目的で、本発明に従う方法の特定の必須のステップを、抽出物を低分子量ＲＮＡに関して濃縮することが不可能となるように改変することによって、ハイビスカスエスクレンツスの実の抽出物を得た。

１５％の解凍したハイビスカスエスクレンツスの実を蒸留水と混合した後、破砕する、または実１５０ｇを蒸留水１ｋｇ中で混合する。

次に、プロテアーゼを連続的に添加する。使用する植物材料に関して２％のＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（または３ｇ）をｐＨ８、５５℃（この酵素にとって最適な条件）で添加して２時間放置した後、２％ブロメライン（または３ｇ）を４〜４．５の値に調節したｐＨで、５５℃で添加して２時間放置する。

次に、この混合物を遠心分離して固形の破片を除去する。

生抽出物の透明化を開始するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズを有する漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を行い、次いで８０℃の高温で抽出物を一晩加熱するステップを行う。

濾過を、０．１〜０．３μｍでの濾過滅菌まで継続する。

得られた水性抽出物を、例えば水および３０％グリセロールを含む生理的に許容される溶媒で、９．６ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物となるように希釈する。最終抽出物のｐＨは４〜４．５の間である。

物理化学分析では、希釈後、最終植物抽出物が、２．２ｇ／ｋｇのタンパク質断片、３．８ｇ／ｋｇの糖、５５０ｍｇ／ｋｇのアミノ酸、および２４３ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物の濃度を有することを示している。

Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ（登録商標）による分析では、低分子量ＲＮＡの濃度がこの抽出物に関してゼロであることを示している。この結果は、ＥＤＴＡ処置ステップを行わない抽出方法に基づいて得た抽出物が、低分子量ＲＮＡを含まないことを証明している。その結果、ＥＤＴＡ処置ステップは、本発明に従う低分子量ＲＮＡに富む抽出物を得るために必須である。

［実施例７］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたパンヤ科のバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、アダンソニアディギタータ種のバオバブから得る。

第一のステップにおいて、５％のバオバブ種子の油かす（アダンソニアディギタータ）を、乾燥状態で、もしくはＥＤＴＡ四ナトリウムを最終濃度１０ｍＭで含む水中で直接破砕する、または蒸留水１ｋｇ中のバオバブの油かす５０ｇにＥＤＴＡ四ナトリウム３．８ｇを添加する。このステップのｐＨは、アルカリ性であり、より詳しくは抽出物を低分子量ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨである１０．５〜１１の間である。

混合物を５８℃で２時間攪拌する。

この種に関して、タンパク質分解酵素による加水分解ステップを実施することは有利であり、使用する植物材料の量に関して２％パパイン（または１ｇ）を添加する。必要であれば、混合物のｐＨを７〜８の間に調節し、混合物を、この酵素の最適な条件である５８℃で２時間攪拌する。

次に、ｐＨを８に調節した後、固形物を除去するために、抽出物を４０００ｇで１０分間遠心分離する。

植物抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズを有する漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

次に、酵素を熱により不活化するために、抽出物を８０℃で８〜１２時間加熱する。

濾過を、０．３〜０．４μｍの多孔性まで継続する。抽出方法のこのステップにおいて、ｐＨを６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、任意選択の希釈の前に、ｐＨを適切に確認しなければならない。一般的に、酸性ｐＨによって核酸の沈殿が起こり、このため低分子量ＲＮＡの沈殿も起こり得る。

一般的に、１５〜２５ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、３〜８ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２〜８ｇ／ｋｇの糖、０．０５〜１ｇ／ｋｇのアミノ酸、０．０５〜１ｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１０〜８０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、暗赤色のバオバブの水性抽出物が得られる。

しかし、アダンソニアディギタータ種から得た抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

本実施例において、より詳しくは、１７ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、５．３ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５．４ｇ／ｋｇの糖、６５０ｍｇ／ｋｇのアミノ酸、４４１ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および５７ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に、抽出物を水および３０％グリセロールの混合物中で希釈し、１．５％フェノキシエタノールを添加し、これによって、１２ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物の最終抽出物を得ることが可能となる。

物理化学分析では、希釈後、この抽出物が、２．９ｇ／ｋｇのタンパク質断片、４ｇ／ｋｇの糖、４００ｍｇ／ｋｇのアミノ酸、３１０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および４１ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡの濃度を有することを示している。

［実施例８］
バオバブ（アダンソニアディギタータ）からの低分子ＲＮＡの抽出方法の実施に関するＥＤＴＡ処置ステップの役割の証明
低分子量ＲＮＡの抽出におけるＥＤＴＡ処置ステップの役割を証明する目的で、本発明に従う方法の特定の必須のステップを、抽出物を低分子量ＲＮＡに関して濃縮することが不可能となるように改変することによって、バオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物を同様に得た。

第一のステップにおいて、１０％のバオバブ種子の油かす（アダンソニアディギタータ）を破砕した後、水を添加する、またはバオバブの油かす１００ｇを蒸留水１ｋｇ中に入れる。

この種に関して、タンパク質分解酵素による加水分解を実施し、使用する植物材料に関して２％パパインまたは２ｇを添加する。ｐＨを、７〜８の間の値に調節し、混合物を、酵素の活性に関して最適な条件である５８℃で２時間攪拌する。この期間の後、ｐＨを、化粧品成分に関して日常的に使用されるｐＨである４．５に低下させる。

その後、抽出物を４０００ｇで１０分間遠心分離して固形物を除去する。次に、抽出物を、高温によって酵素を不活化するために、８０℃で８〜１２時間加熱する。

次に、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで０．３〜０．４μｍまでの多孔性を有する漸減する多孔性の濾紙を使用して連続的な濾過を実施する。

次に、１２．５ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、５．８ｇ／ｋｇのタンパク質断片、７．６ｇ／ｋｇの糖、５４０ｍｇ／ｋｇのアミノ酸、および４４０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物であると決定される、透明な黄色の抽出物が得られる。

次に、抽出物を、３０％グリセロールを含む最終抽出物が得られるように、水およびグリセロールで希釈し、１０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物に調節する。

物理化学分析では、希釈後、植物抽出物が、３．２５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５．１ｇ／ｋｇの糖、３１０ｍｇ／ｋｇのアミノ酸、および２５０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物の濃度を有することを示している。これらの抽出条件下（ＥＤＴＡ処置の非存在下）、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ（登録商標）による分析では、低分子量ＲＮＡの濃度がこの抽出物に関してゼロであることを示している。この結果は、ＥＤＴＡ処置（アルカリｐＨで）を行わない抽出方法を使用して得られた抽出物が、低分子量ＲＮＡを含まないことを確認する。ＥＤＴＡ処置ステップは、本発明に従う低分子量ＲＮＡに富む抽出物を得るために必須である。

［実施例９］
オクラ（ハイビスカスエスクレンツス）およびバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物の調製における最終ｐＨの影響に関する試験
抽出物を低分子量ＲＮＡに関して濃縮するために、抽出方法を、最終のｐＨ調節ステップを除き、実施例５および７と同じ操作条件下で実施する。

この抽出方法は、ＥＤＴＡ四ナトリウムによる処置ステップの後に酵素的加水分解ステップを伴って実施するが、抽出物を、ｐＨ６〜８の間ではなくて、４〜４．５の間の酸性ｐＨに最終的に調節する。

これによって、低分子量ＲＮＡの沈殿が起こり、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｕｒ（登録商標）による分析によって確認された結果は、このようにして得られたオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）およびバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物のいぜれに関して低分子量ＲＮＡのゼロ濃度を与える。

［実施例１０］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたウリ科のカボチャ（ペポカボチャ）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、ウリ科のカボチャ（ペポカボチャ）から得る。

第一のステップにおいて、１０％のカボチャ種子の油かすを、水と混合し、最終濃度が１０ｍＭとなるようにＥＤＴＡ四ナトリウムを添加する、またはカボチャの油かす１００ｇを蒸留水１ｋｇ中に入れてＥＤＴＡ四ナトリウム３．８ｇを添加する。

このステップでのｐＨは、抽出物を低分子量ＲＮＡに関して最適に濃縮するためにアルカリ性、より詳しくは１０．５〜１１の間でなければならない。

混合物を４５℃で２時間攪拌する。

次に、酵素的加水分解をプロテアーゼによって実施し、使用する植物材料の量に関して２％Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）および４％パパイン、またはＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２ｇおよびパパイン４ｇを混合物に添加する。ｐＨを、これら２つの酵素の活性の最適なｐＨである７．５〜８の間に調節し、このｐＨはまた、６より低いｐＨがＲＮＡを沈殿させ得ることから、混合物中で低分子量ＲＮＡを可溶性で維持するために最適なｐＨでもある。

次に、混合物を、酵素の活性にとって最適な温度である５０℃で２時間加熱した後、これらの同じ酵素を不活化するために８０℃で２時間加熱する。

次に、固形物を除去するために、混合物を珪藻土（混合物１ｋｇあたり１０ｇ）と共に４０００ｇで１０分間遠心分離する。

このステップの後、必要に応じてｐＨを６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、任意選択の希釈前にｐＨをチェックする

植物抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズを有する漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。次に、濾過を、０．２μｍでの濾過滅菌まで継続する。

一般的に、２０〜５０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、３〜２５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、１〜１０ｇ／ｋｇの糖、および５０〜２５０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、淡黄色の水性抽出物が得られる。

しかし、同じ種（ペポカボチャ）のカボチャに関して、得られた抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

本実施例において、より詳しくは、３７．３ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、１８．４ｇ／ｋｇのタンパク質断片、３．８ｇ／ｋｇの糖、および１６８ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に、抽出物を、例えば水および３０％グリセロールを含む生理的に許容される溶媒で希釈することができる。

［実施例１１］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたアカザ科または擬穀類科のキヌア（ケノポディウムキヌア）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、アカザ科または擬穀類科のキヌアケノポディウムキヌアから得る。

第一のステップにおいて、発芽したキヌア種子（最終重量の１０％、または１００ｇ）を抽出プロセスに使用して、蒸留水１ｋｇと混合した後、破砕し、ＥＤＴＡ四ナトリウムを、最終濃度１０ｍＭまたは３．８ｇが得られるように添加する。このステップでのｐＨは、アルカリ性で１０．５〜１１の間でなければならず、このため本発明に従う抽出物を、最大長１５０ヌクレオチドを有する低分子ＲＮＡに関して最適に濃縮するために、ｐＨをＮａＯＨによって調節する。混合物を５５℃で２時間攪拌する。

酵素的加水分解をプロテアーゼによって実施し、２％Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）および２％ブロメラインを混合物に添加する（使用する材料に関して）。ｐＨを、これらの２つの酵素の活性の最適なｐＨである７．５〜８の間に調節するが、このｐＨはまた、６より低いｐＨがＲＮＡを沈殿させ得ることから、混合物中で低分子量ＲＮＡを可溶性で維持するためにも最適である。

混合物を、酵素の活性の最適な温度である４５℃で２時間加熱する。

次に、混合物を珪藻土（混合物１ｋｇあたり１０ｇ）と共に４０００ｇで１０分間遠心分離して固形物を除去する。

次に、これらの酵素を不活化するために、濾液を８０℃で２時間加熱する。

次に、植物抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズを有する漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

この濾過ステップの後、３０％グリセロールを含む最終抽出物が得られるように、好ましくは水およびグリセロールで抽出物の希釈を実施することができる。

次に、濾過を、０．２μｍでの濾過滅菌まで継続する。

一般的に、２０〜５０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、３〜１５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、１０〜３０ｇ／ｋｇの糖、０．５〜５ｇ／ｋｇのアミノ酸、１００〜７００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および５０〜２５０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、淡黄色の抽出物が得られる。

非発芽キヌア種子からまたはキヌア粉からも、類似の結果を得ることができる。

それにもかかわらず、同じ種のキヌア（ケノポディウムキヌア）に関して、得られた抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

より詳しくは、本実施例において、３３ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、９．５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２１．６ｇ／ｋｇの糖、１．８ｇ／ｋｇのアミノ酸、３６４ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１７３ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に、抽出物を、例えば水および３０％グリセロールを含む生理的に許容される溶媒で希釈することができる。

［実施例１２］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたバラ科のバラ（ロサケンチフォリア）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、バラ科のバラ（ロサケンチフォリア）から得る。本実施例において、新鮮な花全部を使用する。

第一のステップにおいて、１０％のバラを蒸留水に混合する、または例えば花１００ｇを蒸留水１ｋｇに添加した後、ＥＤＴＡ四ナトリウムを最終濃度１０ｍＭまたは１ｋｇあたり３．８ｇで添加して１０分間破砕する。このステップでのｐＨは、抽出物を低分子ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨである１０．５〜１１の間である。

次に、この混合物を８０℃で１時間攪拌する。この段階の温度は５０℃〜８０℃まで変更し得るが、この種に関して、温度８０℃は、最終水性抽出物の低分子量ＲＮＡに関する濃縮に関して最善の結果を得ることを可能にする温度であることが見出されている。

このステップの後、固形物を除去して植物抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズの漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

このステップにおいて、必要に応じてｐＨを６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、ｐＨをチェックする。

次に、濾過を、０．２μｍでの濾過滅菌まで継続する。

一般的に、５〜２０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、１〜１０ｇ／ｋｇのタンパク質断片、１〜１０ｇ／ｋｇの糖、０．５〜２ｇ／ｋｇのフェノール化合物、および２０〜２００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、暗赤色の水性抽出物が得られる。

それにもかかわらず、同じ種のバラ（ロサケンチフォリア）に関して、得られた抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

本実施例において、より詳しくは、１１．３ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、５．１ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２．６ｇ／ｋｇの糖、１ｇ／ｋｇのフェノール化合物、および９６ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に、抽出物を例えば、８ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物の最終抽出物を得ることができるように３０％グリセロールで希釈することができる。

物理化学分析では、希釈後、この抽出物が、４．６ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２ｇ／ｋｇの糖、２８０ｍｇ／ｋｇのアミノ酸、８００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および８３ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡの濃度を有することを示している。

［実施例１３］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたミカン科のビターオレンジの花（ダイダイ）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、ミカン科のビターオレンジの花（ダイダイ）から得る。本実施例において、新鮮な花全部を使用する。

第一のステップにおいて、５％のビターオレンジの花を蒸留水中で混合する、または例えば花５０ｇに、１ｋｇになるように蒸留水を添加した後、ＥＤＴＡ四ナトリウムを最終濃度１０ｍＭまたは１ｋｇあたり３．８ｇで添加して５分間破砕する。このステップでのｐＨは、抽出物を低分子ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨである１０．５〜１１の間である。

次に、この混合物を４５℃で１時間攪拌する。この段階の温度は２５℃〜５０℃まで変更し得るが、この種に関して、温度４５℃は、最終水性抽出物の低分子量ＲＮＡに関する濃縮に関して最善の結果を得ることを可能にする温度であることが見出されている。

このステップの後、固形物を除去して植物抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズの漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

このステップにおいて、必要に応じてｐＨを６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、ｐＨをチェックする。

次に、濾過を、０．３〜０．５μｍの多孔性まで継続する。

一般的に、５〜２０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、１〜１０ｇ／ｋｇのタンパク質断片、１〜１０ｇ／ｋｇの糖、２００〜１０００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１０〜１００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、コハク色の水性抽出物が得られる。

それにもかかわらず、同じ種（ダイダイ）の花に関して、得られた抽出物は、採取した時間、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

本実施例において、より詳しくは、１１．８ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、４．５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、３．８ｇ／ｋｇの糖、５６０ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および２０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に、抽出物を、水またはグリセロールなどの生理的に許容される溶媒で希釈することができる。

［実施例１４］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたユリ（リリウムカンディダム）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、ユリ科のシロユリの球根（リリウムカンディダム）から得る。

第一のステップにおいて、１５％のユリの球根を蒸留水に入れる、または例えば球根１５０ｇを、ＥＤＴＡ四ナトリウムの最終濃度１０ｍＭまたは１ｋｇあたり３．８ｇを含む蒸留水１ｋｇに入れた後、溶液の破砕を５分間実施する。このステップでのｐＨは、抽出物を低分子ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨである１０．５〜１１の間である。

次に、この混合物を６５℃で３０分間攪拌する。この段階の温度は５０℃〜８０℃まで変更し得て、攪拌時間は３０分間〜１時間まで変更し得るが、この種に関して、温度６５℃で３０分間は、最終水性抽出物の低分子量ＲＮＡに関する濃縮に関して最善の結果を得ることを可能にする条件を構成することが見出されている。

このステップの後、固形物を除去して植物抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズの漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

このステップにおいて、必要に応じてｐＨを６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、ｐＨをチェックする。

濾過を、２〜４μｍの多孔性まで継続する。次に、３０％グリセロールおよび１．５％フェノキシエタノールを添加することにより、抽出物を保存することができる。濾過を、０．２〜０．３μｍの多孔性まで継続する。

一般的に、１０〜２５ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、０．５〜５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２〜１５ｇ／ｋｇの糖、１００〜５００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１０〜１００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、黄色の水性抽出物が得られる。

それにもかかわらず、同じ種のユリ（リリウムカンディダム）に関して、得られた抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

より詳しくは、本実施例において、１６．３ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、１．５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５．３ｇ／ｋｇの糖、２００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および２０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に、抽出物を、水またはグリセロールなどの生理的に許容される溶媒で希釈することができる。

［実施例１５］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたユリ科のユリ（リリウムティグリヌム）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、ユリ科のオニユリの球根（リリウムティグリヌム）から得る。

第一のステップにおいて、洗浄および解凍後、１０％のユリの球根を蒸留水に混合する、または例えば球根１００ｇを、ＥＤＴＡ四ナトリウムの最終濃度１０ｍＭまたは１ｋｇあたり３．８ｇを含む蒸留水１ｋｇに入れた後、混合物を５分間破砕する。このステップでのｐＨは、抽出物を低分子ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨである１０．５〜１１の間である。

次に、この混合物を８０℃で１時間攪拌する。この段階の温度は５０℃〜８０℃まで変更し得て、攪拌時間は３０分間〜１時間まで変更し得るが、この種に関して、温度８０℃で１時間は、最終水性抽出物の低分子量ＲＮＡに関する濃縮に関して最善の結果を得ることを可能にする条件を構成することが見出されている。

このステップの後、固形物を除去して植物抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズの漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

このステップにおいて、必要に応じてｐＨを６〜６．５の間にするためおよび抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、ｐＨをチェックする。濾過を、０．２〜０．３μｍの多孔性まで継続する。

一般的に、１０〜２５ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、０．５〜５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５〜２０ｇ／ｋｇの糖、１００〜５００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１０〜１００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、黄色の水性抽出物が得られる。

それにもかかわらず、同じ種のユリ（リリウムティグリヌム）に関して、得られた抽出物は、採取場所、採取年、季節、気候条件等などの要因に応じてかなりの変動を示し得る。

より詳しくは、本実施例において、１７．９ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、２．１ｇ／ｋｇのタンパク質断片、１１．４ｇ／ｋｇの糖、２００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および５４ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

次に、抽出物を、１０ｇ／ｋｇの固形物の最終抽出物を得ることができるように、水、３０％グリセロール、および１．５％フェノキシエタノールの混合物で希釈する。

物理化学分析では、希釈後、この抽出物が、１．０ｇ／ｋｇのタンパク質断片、５．８ｇ／ｋｇの糖、１００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および３０ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡの濃度を有することを示している。

［実施例１６］
低分子ＲＮＡに関して濃縮されたトケイソウ科のパッションフルーツ（パッシフローラアラタ）の抽出物の調製
低分子量ＲＮＡ（最大長１５０ヌクレオチドを有する）濃縮水性抽出物を、トケイソウ科のパッションフルーツ（パッシフローラアラタ）から得る。

第一のステップにおいて、５％の果実粉末を蒸留水に混合する、または例えば果実粉末５０ｇを蒸留水１ｋｇと混合した後、溶液を５分間攪拌後、ＥＤＴＡ四ナトリウムを最終濃度１０ｍＭまたは１ｋｇあたり３．８ｇで添加する。このステップでのｐＨは、抽出物を低分子ＲＮＡに関して濃縮するために最適なｐＨである１０．５〜１１の間である。

次に、この混合物を５０℃で１時間攪拌する。この段階の温度は２５℃〜８０℃まで変更し得て、攪拌時間は３０分間〜１時間まで変更し得るが、この種に関して、温度５０℃で６０分間は、最終水性抽出物の低分子量ＲＮＡに関する濃縮に関して最善の結果を得ることを可能にする条件を構成することが見出されている。

このステップの後、固形物を除去するために、混合物を４０００ｇで１０分間遠心分離する。

次に、植物抽出物を透明化するために、２０〜５０μｍの間のサイズ、次いで７〜２０μｍの間のサイズ、２〜４μｍまでの漸減する多孔性の濾紙を通して連続的な濾過を実施する。

このステップにおいて、必要に応じてｐＨを６〜６．５の間にするためおよび酸性ｐＨに対して感受性である抽出物の低分子ＲＮＡを保存するために、ｐＨをチェックする。

濾過を、０．３〜０．５μｍの多孔性まで継続する。

一般的に、１０〜３０ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、０．５〜５ｇ／ｋｇのタンパク質断片、２〜１５ｇ／ｋｇの糖、１００〜１５００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および１０〜１００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、コハク色の水性抽出物が得られる。

次に、３０％グリセロールなどの生理的に許容される溶媒を添加することにより、抽出物を希釈または保存することができる。

本実施例において、３０％溶媒の添加後、１５ｇ／ｋｇの乾燥重量抽出物、２．３ｇ／ｋｇのタンパク質断片、３．０ｇ／ｋｇの糖、２００ｍｇ／ｋｇのフェノール化合物、および３５ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡであると決定される、水性抽出物が得られる。

本発明の第三の態様に従って、本発明に従って得た低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物を、活性なアンチエイジング剤として本発明に従う低分子ＲＮＡのそのような抽出物の有効量と、生理的に許容される媒体とを含む化粧品組成物の調製において使用することは有利である。

有効量という表現は、抽出物の活性、特に化粧品活性、より詳しくは、皮膚の加齢の徴候に抵抗する活性または皮膚の水和を改善する活性を得るために必要であり、毒性ではない、本発明に従う抽出物の最少量を指す。

本発明に従う低分子ＲＮＡの抽出物は、乾燥重量が５〜３５ｇ／ｋｇの間である、その希釈型で使用することが有利である。

本発明に従う低分子ＲＮＡの抽出物は、組成物の総重量に対する重量で、０．１〜５％の濃度、好ましくは１〜５％の濃度で組成物中に存在することが有利である。

生理的に許容される媒体は、毒性、刺激、類似の不当なアレルギー反応等、または不耐性反応を引き起こすことなく、皮膚または粘膜の外層に接触させるために適し、妥当な利益／リスク比に釣り合う媒体を指す。

本発明に従って使用することができる組成物は、任意の適切な経路によって、特に経口経路によって、または外用の局所経路によって適用することができ、組成物の処方は、当業者によって適応される。

好ましくは、本発明に従う組成物は、局所経路による適用にとって適した形態である。したがって、これらの組成物は、生理的に許容される媒体、すなわちその適用時に不快感のリスクがなく、皮膚および付属器と適合性であり、全ての適した化粧品形態をカバーする媒体を含まなければならない。

局所適用という表現は、本発明に従う低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物、より詳しくは、抽出物を含む組成物が、皮膚または粘膜の表面に適用されるかまたは広げられるという事実を指す。

皮膚は、より詳しくは顔の皮膚、特に目および口の周囲、鼻、額、首、手の皮膚、ならびに体の残りの皮膚を指す。

本発明を実践するための組成物は、特に水性、水−アルコール、または油性溶液、水中油型乳剤、または油中水型乳剤、または多層乳剤の形態であり得る。それらはまた、皮膚、粘膜、唇、および／または毛髪に適用するために適した、懸濁剤または散剤の形態でもあり得る。

これらの組成物は、いくぶん流動性であり得て、それらはまたクリーム、ローション、乳液、セラム、軟膏、ゲル、ペースト、またはフォームの形態であり得る。それらはまた、スティックなどの固体の形態でもあり得るか、またはそれらはエアロゾルの形態で皮膚に適用することができる。

当該の適応分野において一般的に使用される生理的に許容される媒体として、例えば処方に必要な補助剤、例えば、溶媒、増粘剤、希釈剤、抗酸化剤、染料、日焼け止め、セルフタンニング剤、顔料、増量剤、保存剤、香料、消臭剤、精油、ビタミン、必須脂肪酸、界面活性剤、被膜生成ポリマー等を挙げることができる。

全ての例において、当業者は、これらの補助剤ならびにその割合を、それらが本発明に従う組成物の所望の有利な特性にとって有害とならないように選択する。これらの補助剤は、例えば組成物の総重量の０．０１〜２０％に対応し得る。本発明に従う組成物が乳剤である場合、油相は、組成物の総重量に関して重量で、５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％を表し得る。組成物に使用される乳化剤および乳化補助剤は、当該分野において通常使用されるものから選択される。例えば、それらは、組成物の総重量に関して重量で０．３〜３０重量％の範囲の割合で使用することができる。

本発明の別の有利な実施形態に従って、本発明に従う低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物は、化粧品の分野において使用されるリポソームもしくは他の任意のナノカプセルもしくはマイクロカプセルなどの化粧品媒介体に封入するかもしくは含めることができ、または粉末有機ポリマー、タルクおよびベントナイトなどの無機支持体に吸着させることができる。

本発明に従う組成物は、本発明に従う活性剤に加えて、本発明の活性剤に対して類似および／または補助的な美容効果を有する少なくとも１つの他の活性剤を含み得ることは有利である。本発明に従って、この活性剤は、「追加の活性剤」として定義される。

例えば、追加の活性剤は、アンチエイジング剤、皮膚引き締め剤、美白剤、水和剤、排膿剤、微小循環促進剤、スクラブ剤、角質溶解剤、細胞外マトリクスの刺激剤、エネルギー代謝の活性化剤、抗菌剤、抗真菌剤、カーミング剤、抗フリーラジカル剤、抗ＵＶ剤、抗アクネ剤、抗炎症剤、麻酔薬、熱感を得る薬剤、フレッシュ感を得る薬剤、減量薬から選択することができる。

そのような追加の活性剤は、
− ビタミンＡおよび特にレチノイン酸、レチノール、プロピオン酸レチノール、パルミチン酸レチノール；
− ビタミンＢ３およびより詳しくはニコチンアミド、ニコチン酸トコフェロール；
− ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パンテノール；
− ビタミンＣ、特にアスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、テトラパルミチン酸アスコルビル、アスコルビルリン酸マグネシウムおよびナトリウム；
− ビタミンＥ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、ＰＰ、コエンザイムＱ１０；
− メタロプロテナーゼ阻害剤、またはＴＩＭＰの活性化剤；
− ＤＨＥＡ、その前駆体および誘導体；
− アルギニン、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ジパルミチン酸ヒドロキシプロリン、パルミトイルグリシン、ヒドロキシリジン、メチオニンおよびその誘導体、Ｎ−アシル化アミノ酸化合物などのアミノ酸；
− ジ、トリ、テトラ、ペンタ、およびヘキサペプチドならびにその親油性誘導体を含む天然または合成ペプチド、その異性体誘導体、ならびに金属イオン（例えば、銅、亜鉛、マンガン、マグネシウム、およびその他）などの他の種と錯体を形成するその誘導体、からなる群から選択することができる。例として、ＭＡＴＲＩＸＹＬ（登録商標）、ＡＲＧＩＲＥＬＩＮＥ（登録商標）、ＣＨＲＯＮＯＧＥＮ（商標）、ＬＡＭＩＮＩＸＹＬ ＩＳ（商標）、ＰＥＰＴＩＤＥ Ｑ１０（商標）、ＣＯＬＬＡＸＹＬ（商標）（フランス国特許第２８２７１７０号、ＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標））、ＰＥＰＴＩＤＥ ＶＩＮＣＩ ０１（商標）（フランス国特許第２８３７０９８号、ＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標））、ＰＥＰＴＩＤＥ ＶＩＮＣＩ ０２（商標）（フランス国特許第２８４１７８１号、ＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標））、ＡＴＰｅｐｔｉｄｅ（商標）（フランス国特許第２８４６８８３号、ＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標））の名称で商業的に知られているペプチド、またはＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標）からＡＴＰｅｐｔｉｄｅ（商標）の名称で販売されている、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＮＨ_２を有する合成ペプチド；
− ＧＰ４Ｇ（商標）（フランス国特許第２８１７７４８号、ＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標））の名称で販売されているアルテミアサリーナ（Ａｒｔｅｍｉａ ｓａｌｉｎａ）の抽出物；
− 亜麻種子抽出物（Ｌｉｐｉｇｅｎｉｎｅ（商標）、フランス国特許第２９５６８１８号、ＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標））、ダイズ、スペルト、ブドウのつる、ナタネ、亜麻種子、コメ、トウモロコシ、エンドウの抽出物などの植物ペプチド抽出物；
− 酵母抽出物、例えばＤｙｎａｇｅｎ（商標）（フランス国特許第２９５１９４６号、ＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標））、またはＡｃｔｏｐｏｎｔｉｎｅ（登録商標）（フランス国特許第２９４４５２６号、ＡＳＨＬＡＮＤ（登録商標））；
− デヒドロ酢酸（ＤＨＡ）；
− 合成または天然起源のフィトステロール；
− サリチル酸およびその誘導体、αおよびβヒドロキシ酸、シラノール；
− アミノ糖、グルコサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン；
− ポリフェノール、イソフラボン、フラボノイドの抽出物、例えばブドウ抽出物、マツ抽出物、オリーブ抽出物；
− セラミドまたはリン脂質、動物起源の油、例えばスクアレンまたはスクアラン；スイートアーモンド、コプラ、トウゴマ、ホホバ、オリーブ、ナタネ、落花生、ヒマワリ種子、コムギ胚芽、トウモロコシ胚芽、ダイズ、ワタ、アルファルファ、ポピー、カボチャ、マツヨイグサ、キビ、オオムギ、ライムギ、ベニバナ、パッションフラワー、ヘーゼルナッツ、ヤシ、杏仁、アボカド、およびカレンデュラオイル；エトキシル化植物油、シアバターなどの脂質；
− 全てのＵＶスクリーンおよび日焼け止め、
− 環状ＡＭＰおよびその誘導体、アデニレートシクラーゼ酵素の活性化剤、およびホスホジエステラーゼ酵素阻害剤、センテラアジアチカ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）抽出物、アシアチコシドおよびアシアチン酸、メチルキサンチン、テイン、カフェインおよびその誘導体、テオフィリン、テオブロミン、フォースコリン、エスクリンおよびエスクロシド、ＡＣＥ阻害剤、Ｖａｌ−Ｔｒｐペプチド、ニューロペプチドＹ阻害剤、エンケファリン、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）抽出物、ヤマノイモ抽出物（ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、ルチン、イェルバマテ抽出物、ガラナ抽出物、オリゴ糖、多糖、カルニチン、ツタ抽出物、ヒバマタ抽出物、ウツボグサ（Ｐｒｕｎｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）加水分解抽出物、ケイカンカ（Ｃｅｌｏｓｉａ ｃｒｉｓｔａｔａ）加水分解抽出物、アノゲイススレイオカルプス（Ａｎｏｇｅｉｓｓｕｓ ｌｅｉｏｃａｒｐｕｓ）抽出物、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｕｔｉｌｉｓｓｉｍａ）葉の抽出物、パルミトイルカルニチン、カルノシン、タウリン、ニワトコ抽出物、ダルス（Ｐａｌｍａｒｉａ ｐａｌｍａｔａ）抽出物などの藻類抽出物、を挙げることができる。

例として、本発明に従って得た最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物を含む化粧品組成物の処方の例を以下に挙げる。

［実施例１７］
目の周囲用の香膏

調製方法：
１．相Ａを透明になるまで主容器中でホモジナイズする；
２．２５℃で、相Ｂに散布し、均一になるまで１０分間ホモジナイズする；
３．２５℃で、相Ｃを異なるビーカーに調製し、均一になるまで混合する。相Ｄに散布し、均一になるまで十分に混合する；
４．２５℃で、相Ｃ＋Ｄを主容器に添加して、均一になるまで混合する；
５．２５℃で、相Ｅを主容器に添加し、均一になるまで混合する；
６．２５℃で、相Ｆを予め混合し、これを主容器に添加して、均一になるまで混合する；
７．２５℃で停止する。

組成物は、ｐＨ ５．７０〜６．２０の間および粘度（Ｄ０）８０，０００〜１３０，０００ｃｐｓ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＲＶＴ／Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｃ／５ ＲＰＭ／１分／２５°Ｃ）を有する紫色の真珠様のクリームゲルの形態である。

［実施例１８］
リッチクリーム

調製方法：
１．相Ａを主容器中でホモジナイズして、７５〜８０℃での加熱を開始する；
２．３０℃で、相Ｂに散布し、加熱しながらホモジナイズする；
３．異なるビーカーにおいて、相Ｃを調製し、７５〜８０℃で均一になるまで加熱する；
４．７５℃で、相Ｃを主容器に添加して、１０分間ホモジナイズする；
５．温度を冷却させ、相Ｄを６５℃で添加する。十分に混合して１０分間ホモジナイズする；
６．相Ｅを主容器に添加する前に予め混合する；
７．相Ｅを６０℃で添加する。十分に混合して１０分間ホモジナイズする；
８．３５℃で、相Ｆを予め混合してから添加し、十分に混合する；
９．相Ｇを主容器に添加する前に予め混合する；
１０．相Ｇを３５℃で添加する。十分に混合してホモジナイズする；
１１．異なるビーカーにおいて、相Ｈを調製し、Ｎａｔｒｏｓｏｌ（商標）を周囲温度で水中に散布し、調製物全体を６０℃で加熱しながらホモジナイズする；
１２．相Ｈを３０℃で添加する。十分に混合してホモジナイズする；
１３．２５℃で停止する。

組成物はこのように、ｐＨ ４．９０〜５．４０の間および粘度（Ｄ０）１６０，０００〜２１０，０００ｃｐｓ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＲＶＴ／Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｄ／５ ＲＰＭ／１分／２５°Ｃ）を有するピンク色のバター様クリームの形態である。

［実施例１９］
フェイスセラム

調製方法：
１．周囲温度のビーカーに相Ａの成分を秤取り、混合する。相Ｂを散布してホモジナイズする；
２．周囲温度で、相Ｃに散布し、調製物全体をホモジナイズし続ける；
３．周囲温度で、相Ｄを相ＡＢＣに添加し、ホモジナイズし続ける；
４．周囲温度で、相Ｅを添加し、ホモジナイズする；
５．周囲温度で、相Ｆを添加し、調製物全体をホモジナイズする；
６．周囲温度で、相Ｇを添加し、均一になるまで混合する；
７．２５℃で停止する。

組成物は、このように、ｐＨ ６．３０〜７．１０の間および粘度（Ｄ０）１０，０００〜１５，０００ｃｐｓ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＲＶＴ／Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｂ／５ ＲＰＭ／１分／２５°Ｃ）を有する、なめらかで半透明のクリームイエローのゲルの形態である。

［実施例２０］
アンチエイジングマスク

調製方法
１．２５℃で、相Ａを主容器中でホモジナイズする；
２．２５℃で、相Ｂに散布し、均一になるまで十分に混合する；
３．２５℃で、相Ｃを添加して、均一になるまで十分に混合する；
４．異なるビーカーにおいて相Ｄを予め混合し、２５℃で主容器に添加する；
５．２５℃で、相Ｅを主容器に添加し、十分に混合する；
６．相Ｆを予め混合し、徐々に添加する。均一になるまで十分混合する；
７．異なるビーカーにおいて相Ｇを予め混合し、主容器に均一になるまで添加する；
８．２５℃で停止する。

組成物は、このように、ｐＨ ５．３０〜５．８０および粘度（Ｄ０） ７０，０００〜１００，０００ｃｐｓ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＲＶＴ／Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｃ／５ ＲＰＭ／１分／２５°Ｃ）を有する、光っている緑色効果を有するゲルクリームの形態である。

［実施例２１］
セラム

調製方法
１．主容器に水を添加して、ハイローヘリックスブレードによって混合を開始する；
２．成分の残りを順に添加し、それぞれの添加の間に混合する。

組成物は、このように、ｐＨ ５．７５〜６．２５の間および粘度（Ｄ０） １１００〜１４００ｃｐｓ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＲＶＴ／Ｓｐｉｎｄｌｅ ３／２０ ｒｐｍ／２５°Ｃ／１分）を有する、なめらかで半透明のセラムの形態である。

第四の態様において、本発明は、皮膚の加齢の徴候に対処するための本発明に従う組成物の化粧品における使用に関する。

「皮膚の加齢の徴候」という表現は、加齢による皮膚の外観の任意の変化、例えばしわおよび小じわ、きず、目の下のたるみ、目の周囲の黒ずみ、しなびる、皮膚の弾力性、ハリ、および／もしくは色合いの喪失のみならず、例えば皮膚の薄化などの変化した外観に系統的に反映されない皮膚の内部の任意の変化、または汚染およびＵＶ照射などの環境ストレスの結果としての皮膚の任意の内部分解も意味すると理解される。

皮膚のコラーゲンの発現に関する試験は、本発明のアンチエイジング効果を評価する１つの手段である。実際に、皮膚の線維芽細胞によって合成されるコラーゲンは、重要な生物学的役割を有する。コラーゲンは、皮膚などの組織の結合の原因であり、皮膚に対して抵抗性および柔軟性の特性を付与する。

本発明はまた、皮膚の水和を改善するために本発明に従う組成物の化粧品における使用にも関する。

皮膚の水和の改善は、例えば乾燥、堅さ、および不快感などの脱水による皮膚の外観の変化の任意の改善を意味すると理解される。

ヒアルロン酸の発現およびヒアルロン酸の合成に関係する酵素の発現に関する試験は、本発明の水和効果を評価する１つの手段である。実際に、ヒアルロン酸は、真皮の細胞外マトリクスの主成分であり、同様に表皮にも存在し、皮膚の水和に関係している。

この点において、本発明を、実施した試験の異なる結果によって以下に例証する。

この効果に関して、以下の実施例２２〜２５に表すものと類似（表していない）である結果が、植物材料、より詳しくはケノポディウムキヌア（キヌア）、レンズエスクレンタ（レンズマメ）、イネ（コメ胚芽）、またはペポカボチャ（カボチャ）から得た、本発明に従う最大長１５０ヌクレオチドの他の低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物についても得られた。

［実施例２２］
Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの試験による真皮の細胞外マトリクスに及ぼす実施例５、６および９に従うオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の抽出物の効果の評価
本試験の目的は、真皮の細胞外マトリクスに及ぼすオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の３つの抽出物の効果を比較することである。実施例５に従って得た低分子量ＲＮＡに関して濃縮された第一の抽出物、実施例６に従って得た第二の抽出物（ＥＤＴＡ処置の非存在下）、および実施例９に従って沈殿後に得られた最後の抽出物。

本試験の目的は、細胞外マトリクスの構造に関係するＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンタンパク質の発現に及ぼすハイビスカスエスクレンツスのこれら３つの抽出物の効果を評価することである。コラーゲンは、皮膚の弾力性およびハリを維持するために非常に重要である。

プロトコール
直径６ｍｍのヒト皮膚の生検を、特定の培地（ＤＭＥＭ １ｇ／Ｌ、ＨＡＭＦ１２、ＳＶＦ、および抗生物質）の存在下、６ウェルプレートに入れたインサート上で抽出物ビボでの培養で維持する。生検を４８時間培養して、実施例５、６および９に従うオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の抽出物を、ＰＢＳで１／１００もしくは３／１００に希釈して、または１容積％および３容積％の最終濃度でそれぞれ、１日２回適用する。対照条件を、１×ＰＢＳを使用して作製する。生検表面に載せたおよそ２０μＬの液滴の形態で適用を行う。次に、生検をホルムアルデヒドで固定した後、パラフィンに包埋する。厚さ４μｍの皮膚切片を調製する。マイクロ波インキュベーションによって特定の部位を露出後にＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの標識を実施した後、トリプシンによる処置を行う。Ｉ型コラーゲン特異的ウサギポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｒｅｆ．６００−４０１−１０３−０．５）、ＩＩＩ型コラーゲン特異的ウサギポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｒｅｆ．６００−４０１−１０５−０，５）、次に蛍光体に結合させた抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｅｆ．Ａ２１２０６）を使用して免疫標識を実施する。次に、生検を落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡）下で調べる。得られた写真に基づいて、ソフトウェアＶｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）により蛍光の定量を実施した。

結果
実施例５に従って得た低分子ＲＮＡに関して濃縮されたオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の１％および３％抽出物による処置により、抽出物ビボ試験に関して、１×ＰＢＳによって処置した対照条件と比較して、ならびに実施例６（ＥＤＴＡ処置を行わない）および９（沈殿後に得られた）に従って得たオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の抽出物による処置と比較して、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの発現の有意な増加を観察することが可能である。

結論
低分子ＲＮＡ（実施例５）に関して濃縮されたオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の１％および３％抽出物は、低分子ＲＮＡ（実施例６および９）に関して濃縮されていないハイビスカスエスクレンツスの２つの抽出物と比較して、ヒトの抽出物ビボ皮膚においてより多くのＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの発現を刺激する。

［実施例２３］
Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの試験による真皮の細胞外マトリクスに及ぼす実施例７、８および９に従うバオバブ（アダンソニアディギタータ）抽出物の効果の評価
本試験の目的は、真皮の細胞外マトリクスに及ぼすバオバブ（アダンソニアディギタータ）の３つの抽出物の効果を比較することである。実施例７に従って得た低分子量ＲＮＡに関して濃縮された第一の抽出物、実施例８に従って得た第二の抽出物（ＥＤＴＡ処置を行わない）、および実施例９に従って沈殿後に得た最後の抽出物。

本試験の目的は、細胞外マトリクスの構造に関係するＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンタンパク質の発現に及ぼすバオバブ（アダンソニアディギタータ）のこれらの３つの抽出物の効果を評価することである。コラーゲンは、皮膚の弾力性およびハリの維持にとって非常に重要である。

プロトコール
直径６ｍｍのヒト皮膚生検を、特定の培地（ＤＭＥＭ １ｇ／Ｌ、ＨＡＭＦ１２、ＳＶＦ、および抗生物質）の存在下、６ウェルプレートに入れたインサート上で抽出物ビボでの培養で維持する。生検を４８時間培養して、実施例７、８および９に従うバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物を、ＰＢＳで１／１００および３／１００に希釈して、または１容積％および３容積％の最終濃度でそれぞれ、１日２回適用する。対照条件を１×ＰＢＳを使用して作製する。生検表面に載せたおよそ２０μＬの液滴の形態で適用を行う。次に、生検をホルムアルデヒドで固定した後、パラフィンに包埋する。厚さ４μｍの皮膚切片を調製する。マイクロ波インキュベーションによって特定の部位を露出後にＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの標識を実施した後、トリプシンによる処置を行う。Ｉ型コラーゲン特異的ウサギポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｒｅｆ．６００−４０１−１０３−０．５）、ＩＩＩ型コラーゲン特異的ウサギポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｒｅｆ．６００−４０１−１０５−０．５）、次に蛍光体に結合させた抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｅｆ．Ａ２１２０６）を使用して免疫標識を実施する。次に、生検を落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡）下で調べる。得られた写真に基づいて、ソフトウェアＶｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）により蛍光の定量を実施した。

結果
実施例７に従って得た低分子ＲＮＡに関して濃縮されたバオバブ（アダンソニアディギタータ）の１％抽出物による処置により、抽出物ビボ試験に関して、１×ＰＢＳによって処置した対照条件と比較して、ならびに実施例８（ＥＤＴＡ処置を行わない）および９（沈殿後に得られた）に従って得たアダンソニアディギタータの１％抽出物による処置と比較して、Ｉ型コラーゲンの発現の有意な増加を観察することが可能である。

実施例７に従って得た低分子ＲＮＡに関して濃縮されたバオバブ（アダンソニアディギタータ）の３％抽出物による処置により、抽出物ビボ試験に関して、１×ＰＢＳによって処置した対照条件と比較して、ならびに実施例８（ＥＤＴＡ処置を行わない）および９（沈殿後に得られた）に従って得たバオバブ（アダンソニアディギタータ）の３％抽出物による処置と比較して、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの発現の有意な増加を観察することが可能である。

結論
低分子ＲＮＡ（実施例７）に関して濃縮されたバオバブ（アダンソニアディギタータ）の１％抽出物は、低分子ＲＮＡに関して濃縮されていないアダンソニアディギタータの１％抽出物（実施例８および９）と比較して、抽出物ビボでヒト皮膚においてより多くのＩ型コラーゲンの発現を刺激する。

低分子ＲＮＡ（実施例７）に関して濃縮されたバオバブ（アダンソニアディギタータ）の３％抽出物は、低分子ＲＮＡに関して濃縮されていないアダンソニアディギタータの３％抽出物（実施例８および９）と比較して、抽出物ビボでヒト皮膚においてより多くのＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの発現を刺激する。

［実施例２４］
ヒアルロンナンシンターゼ２（ＨＡＳ２）の試験による真皮のヒアルロン酸の合成に及ぼす実施例７、８および９に従うバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物の効果の評価
本試験の目的は、ヒアルロン酸の合成に関係する酵素であるＨＡＳ２の発現に及ぼすバオバブ（アダンソニアディギタータ）の３つの抽出物の効果を比較することである。低分子量ＲＮＡに関して濃縮された第一の抽出物を実施例７に従って得て、第二の抽出物を実施例８（ＥＤＴＡ処置を行わない）に従って得て、および最後の抽出物を実施例９に従って沈殿後に得る。

ヒアルロン酸は、皮膚の水和に関係する真皮の細胞外マトリクスの主成分である。加齢と共に、その再生は、そのＨＡＳ２合成酵素の発現と同様に妨害される（Ｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

プロトコール
ヒト線維芽細胞を特定の培地において培養し、長期間の処置（３２回を超える継代）のために培養において維持する。各継代時に、細胞の一部を凍結する。次に、２つの正反対の継代、すなわち継代８回（若い継代）および継代３２回（老齢の継代）を選択する。融解後、老齢または非老齢の線維芽細胞を、培養培地で１／１００に希釈したまたは最終濃度１容積％の実施例７、８、および９に従うバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物によって４８時間（１日２回適用）処置する。実施例７、８、および９に従うアダンソニアディギタータの３つの１％抽出物によって処置したまたは処置していない老齢または非老齢線維芽細胞におけるＨＡＳ２発現の評価を、免疫標識によって観察する。

免疫標識を行うために、細胞をすすいで冷メタノールによって５分間固定する。非特異的部位を１％ウシ血清アルブミンによって１５分間飽和させた後、細胞をＨＡＳ２特異的マウスモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｅｆ．ＭＡＳ−１７０８７）の溶液と共にインキュベートした後、蛍光体と結合した抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｅｆ．Ａ２１２０２）の溶液と共にインキュベートする。次に、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡）下で調べる。得られた写真に基づいて、ソフトウェアＶｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して、蛍光の定量を実施した。

結果
図４Ａに例証するように、継代８回（若いと考えられる継代回数）の線維芽細胞では、実施例７に従って得た最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡに関して濃縮されたバオバブ（アダンソニアディギタータ）の１％抽出物による処置により、無処置条件と比較して、ならびに実施例８（ＥＤＴＡ処置を行わない）および９（沈殿後に得られた）に従って得たアダンソニアディギタータの１％抽出物による処置と比較して、ＨＡＳ２発現の有意な増加を観察することが可能である。

加えて、図４Ｂに例証するように、文献と一致して、継代８回の線維芽細胞（Ｐ８）と継代３２回の線維芽細胞（Ｐ３２）（老齢）の間ではＨＡＳ２発現の有意な減少が観察される。

老齢の線維芽細胞において、実施例７に従って得た本発明に従う低分子ＲＮＡに関して濃縮されたバオバブ（アダンソニアディギタータ）の１容積％抽出物による処置により、ＨＡＳ２発現の維持を観察することが可能である。この維持は、実施例８（ＥＤＴＡ処置を行わない）および９（沈殿後に得られた）に従ってそれぞれ得たアダンソニアディギタータの抽出物によって処置した細胞では観察されない。

結論
最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡに関して濃縮されたバオバブ（アダンソニアディギタータ）の１％抽出物（実施例７）は、無処置条件と比較して、ならびに実施例８（ＥＤＴＡ処置を行わない）および９（沈殿後に得られた）に従って得たアダンソニアディギタータの抽出物と比較して、線維芽細胞においてより多くのＨＡＳ２発現を刺激する。

さらに、老齢の線維芽細胞において、本発明に従う低分子ＲＮＡに関して濃縮されたバオバブ（アダンソニアディギタータ）の１％抽出物（実施例７）は、非老齢線維芽細胞において観察されたＨＡＳ２発現レベルの維持を可能にする。低分子ＲＮＡに関して濃縮されていないアダンソニアディギタータの他の１％抽出物（実施例８および９）は、この維持を可能にしない。

［実施例２５］
ヒアルロン酸の発現レベルに及ぼす実施例５に従うオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の抽出物および実施例７に従うバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物の効果の評価
本試験の目的は、ヒアルロン酸の発現に及ぼす、実施例５および７に従ってそれぞれ得られたオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）およびバオバブ（アダンソニアディギタータ）の最大長１５０ヌクレオチドの低分子量ＲＮＡ濃縮抽出物の効果を標識によって可視化することである。

ヒアルロン酸は、真皮の細胞外マトリクスの主成分であり、皮膚の水和に関係している。

プロトコール
直径６ｍｍのヒト皮膚生検を、特定の培地（ＤＭＥＭ １ｇ／Ｌ、ＨＡＭＦ１２、ＳＶＦ、および抗生物質）の存在下、６ウェルプレートに入れたインサート上で抽出物ビボでの培養で維持する。生検を４８時間培養して、ＰＢＳで１容積％に希釈した、実施例５および７（それぞれ）に従うオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の抽出物もしくはバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物、または対照条件の１×ＰＢＳを１日２回適用する。生検表面に載せたおよそ２０μＬの液滴の形態で適用を行う。次に、生検をホルムアルデヒドで固定した後、パラフィンに包埋する。厚さ４μｍの皮膚切片を調製する。切片を、ヒアルロン酸特異的ビオチン化タンパク質（Ｃｏｇｅｒ，ｒｅｆ：４００−７６３−１Ａ）の存在下、次に蛍光体に結合させたストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｅｆ：Ｓ３２３５４）の存在下でインキュベートする。次に、生検を落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡）下で調べる。得られた写真に基づいて、ソフトウェアＶｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して、蛍光の定量を実施した。

結果
実施例５および７に従ってそれぞれ得られた低分子ＲＮＡに関して濃縮されたオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の抽出物またはバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物による処置により、１×ＰＢＳで処置した対照条件と比較して、表皮または真皮におけるヒアルロン酸発現の有意な増加を観察することが可能である。

結論
最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡに関して濃縮されたオクラ（ハイビスカスエスクレンツス）の抽出物およびバオバブ（アダンソニアディギタータ）の抽出物（実施例５および７に従う）は、１×ＰＢＳによって処置した対照条件と比較して、抽出物ビボでヒト皮膚におけるヒアルロン酸発現を刺激する。

当然、本発明は、上記で述べた実施形態および実施例に限定されず、当業者は、通常の作業を通して、明白に記述されていない他の実施形態を実施してもよく、それらも本発明の広い範囲によってカバーされる。
出願時の特許請求の範囲は以下の通りです。
［請求項１］
植物材料から最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得る方法であって、
ａ）前記植物材料を水に接触させるステップと、
ｂ）エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（ＥＤＴＡ）を、１０．５〜１１の間のｐＨで、ａ）で得た混合物に添加するステップと、
ｃ）次に、ｂ）で得た前記混合物のｐＨをｐＨ６〜８の間の値に調節するステップと、
ｄ）残留固形植物材料を除去するようにおよび精製された水性粗抽出物を得るように、ｃ）で得た前記混合物を精製するステップと、
ｅ）ｐＨをチェックして、必要に応じて６〜８の間の値、好ましくは６〜６．５の間の値に再調節するステップ
を含む方法。
［請求項２］
ステップａ）において、植物材料を４重量％〜２０重量％の植物材料／水の比率で水に接触させる、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
ステップｂ）のエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（ＥＤＴＡ）処置が、温度２０〜８０℃で少なくとも１時間の攪拌時間で実施される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
［請求項４］
ステップｄ）において、ｃ）で得た前記混合物を遠心分離する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項５］
ステップｅ）の前に、ｄ）で得た水性粗抽出物の少なくとも１回の濾過、好ましくは濾過のカットオフを２０〜５０μｍから０．１〜０．３０μｍへと低下させることによって水性粗抽出物の連続的な濾過を実施する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項６］
ステップｃ）の前に、ｂ）で得た前記混合物に対して直接、またはｂ）で得た前記混合物の遠心分離後の上清に対して実施される追加の加水分解ステップ、ならびに４５〜６５℃の間の温度および６〜８．５の間のｐＨにおける、少なくとも１時間の、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、および／またはプロテアーゼから選択される少なくとも１つの酵素の作用による前記残留植物材料の除去を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項７］
前記加水分解ステップの直後に、またはステップｅ）の前の前記連続的な濾過ステップのうちの２つのステップの間に実施される、酵素を６５〜８０℃の間の温度で少なくとも１時間不活化するステップを含む、請求項６に記載の方法。
［請求項８］
１０〜２０ｇ／ｋｇの濃度の珪藻土またはシリカを、ステップｄ）の前に前記混合物に添加する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項９］
ＥＤＴＡ四ナトリウムの濃度が２〜１５ｍＭの間、好ましくは１０ｍＭである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］
前記植物材料を、ステップａ）で水に接触させる前に破砕する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１１］
前記植物材料が、種子、果実、球根、花、葉、根、胚から、または油かすおよびビールかすから選択される植物の一部である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１２］
前記植物材料が、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、ザクロ科（Ｐｕｎｉｃａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、フクギ科（Ｃｌｕｓｉａｃｅａｅ）、パパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）、キントラノオ科（Ｍａｌｐｈｉｇｉａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、スグリ科（Ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、パンヤ科（Ｂｏｍｂａｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、アヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１３］
前記植物材料が、種ハイビスカスエスクレンツス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、アダンソニアディギタータ（Ａｄａｎｓｏｎｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）（バオバブ）、ケノポディウムキノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）（キヌア）、レンズエスクレンタ（Ｌｅｎｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（レンズマメ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（コメ胚芽）、ペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ）（カボチャ）、ロサケンチフォリア（Ｒｏｓａ ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）（バラ）、ダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ）（ビターオレンジツリー）、リリウムカンディダム（Ｌｉｌｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）（ユリ）またはリリウムティグリヌム（Ｌｉｌｉｕｍ ｔｉｇｒｉｎｕｍ）（オニユリ）、パッシフローラアラタ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ａｌａｔａ）（パッションフラワー）から選択される、請求項１２に記載の方法。
［請求項１４］
前記抽出物の総重量と比較して重量で、５〜６０ｇ／ｋｇの乾燥抽出物、１０〜１０００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ、０．５〜３０ｇ／ｋｇのタンパク質断片、および０．５〜５０ｇ／ｋｇの糖を含み、ＤＮＡを含まない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡに関して濃縮された植物材料の水性抽出物。
［請求項１５］
溶媒で希釈され、前記抽出物の総重量と比較して重量で、５〜３５ｇ／ｋｇの乾燥抽出物、０．５〜２０ｇ／ｋｇのタンパク質断片、０．５〜３０ｇ／ｋｇの糖、および１０〜５００ｍｇ／ｋｇの最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡを含む、請求項１４に記載の抽出物。
［請求項１６］
アンチエイジング活性剤としての請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の前記抽出物の有効量と、生理的に許容される媒体とを含む組成物。
［請求項１７］
前記抽出物が、前記組成物の総重量の１重量％〜５重量％の間の濃度で存在する、請求項１６に記載の組成物。
［請求項１８］
皮膚に局所適用されるために処方される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項１９］
皮膚の加齢の徴候に対処するための、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の前記組成物の化粧品における使用。
［請求項２０］
皮膚の水和を改善するための、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の前記組成物の化粧品における使用。

Claims (16)

1. 植物材料から最大長１５０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ濃縮水性抽出物を得る方法であって、
   ａ）前記植物材料を水に接触させるステップと、
   ｂ）エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（ＥＤＴＡ）を、１０．５〜１１の間のｐＨで、ａ）で得た混合物に添加するステップと、
   ｃ）次に、ｂ）で得た前記混合物のｐＨをｐＨ６〜８の間の値に調節するステップと、
   ｄ）残留固形植物材料を除去するようにおよび精製された水性粗抽出物を得るように、ｃ）で得た前記混合物を精製するステップと、
   ｅ）ｐＨをチェックして、必要に応じて６〜８の間の値に再調節するステップ
   を含む方法。
2. ステップａ）において、植物材料を４重量％〜２０重量％の植物材料／水の比率で水に接触させる、請求項１に記載の方法。
3. ステップｂ）のエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（ＥＤＴＡ）処置が、温度２０〜８０℃で少なくとも１時間の攪拌時間で実施される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
4. ステップｄ）において、ｃ）で得た前記混合物を遠心分離する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. ステップｅ）の前に、ｄ）で得た水性粗抽出物の少なくとも１回の濾過を実施する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ステップｃ）の前に、ｂ）で得た前記混合物に対して直接、またはｂ）で得た前記混合物の遠心分離後の上清に対して実施される追加の加水分解ステップ、ならびに４５〜６５℃の間の温度および６〜８．５の間のｐＨにおける、少なくとも１時間の、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、および／またはプロテアーゼから選択される少なくとも１つの酵素の作用による前記残留植物材料の除去を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記加水分解ステップの直後に、またはステップｅ）の前の前記連続的な濾過ステップのうちの２つのステップの間に実施される、酵素を６５〜８０℃の間の温度で少なくとも１時間不活化するステップを含む、請求項６に記載の方法。
8. １０〜２０ｇ／ｋｇの濃度の珪藻土またはシリカを、ステップｄ）の前に前記混合物に添加する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ＥＤＴＡ四ナトリウムの濃度が２〜１５ｍＭの間である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記植物材料を、ステップａ）で水に接触させる前に破砕する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記植物材料が、種子、果実、球根、花、葉、根、胚から、または油かすおよびビールかすから選択される植物の一部である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記植物材料が、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、ザクロ科（Ｐｕｎｉｃａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、フクギ科（Ｃｌｕｓｉａｃｅａｅ）、パパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）、キントラノオ科（Ｍａｌｐｈｉｇｉａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、スグリ科（Ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、パンヤ科（Ｂｏｍｂａｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、アヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記植物材料が、種ハイビスカスエスクレンツス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、アダンソニアディギタータ（Ａｄａｎｓｏｎｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）（バオバブ）、ケノポディウムキノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）（キヌア）、レンズエスクレンタ（Ｌｅｎｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（レンズマメ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（コメ胚芽）、ペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ）（カボチャ）、ロサケンチフォリア（Ｒｏｓａ ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）（バラ）、ダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ）（ビターオレンジツリー）、リリウムカンディダム（Ｌｉｌｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）（ユリ）またはリリウムティグリヌム（Ｌｉｌｉｕｍ ｔｉｇｒｉｎｕｍ）（オニユリ）、パッシフローラアラタ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ａｌａｔａ）（パッションフラワー）から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. ステップｅ）において、ｐＨをチェックして、必要に応じて６〜６．５の間の値に再調節するステップを含む、請求項１に記載の方法。
15. ステップｅ）の前に、濾過のカットオフを２０〜５０μｍから０．１〜０．３０μｍへと低下させることによって水性粗抽出物の連続的な濾過を実施する、請求項５に記載の方法。
16. 前記ＥＤＴＡ四ナトリウムの濃度が１０ｍＭである、請求項９に記載の方法。

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