JP6857686B2 - インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システム - Google Patents
インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システム Download PDFInfo
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Description
本発明は、インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムに関する。
肝臓は、肝臓がんが発達するまでに、脂肪肝、肝線維症、および肝硬変などのステップを経る(非特許文献1、Liver Cancer. 2013 Aug; 2(3-4): 365-366)。したがって、新薬開発の初期段階において肝線維症を引き起こす薬物をスクリーニングすることは非常に重要である。
上記インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを配置し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンスおよび第二インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること、および
上記結果を正常の対照群のそれらと比較することで、試験薬物誘発性脂肪肝を評価すること、
を含む、前記方法を提供する。
上記インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを配置し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを押し、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを押し、インピーダンスアナライザを用いることで第三インピーダンスを測定すること、
第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し、インピーダンスアナライザを用いることで第四インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンス、第二インピーダンス、第三インピーダンス、および第四インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること、および
圧力変化からスフェロイドの剛性を得ること、
を含む、前記方法を提供する。
円柱状の第一チューブ;第一チューブ内に挿入され、第一チューブの内表面と接触する外表面を有し、第一チューブよりも小さい長さを有する、円柱状の第二チューブ;第一チューブの一端に接続されており、第一チューブの一端に接続されたiチューブと、第一チューブに圧力を加えることで第一チューブ内の肝細胞スフェロイドの位置を調整するためのシリンジに接続されたiiチューブと、内部に設置されたコイル状の金(Au)ワイヤを有し、金ワイヤの一端が外側へ突出されたiiiチューブとを含む、Y状の第三チューブ;第一チューブのもう一端に接続されており、第一チューブのもう一端に接続されたIチューブと、バロメータおよびシリンジポンプにチューブを介して接続されたIIチューブと、内部に設置されたコイル状の白金(Pt)ワイヤを有し、白金ワイヤの一端が外側へ突出されたIIIチューブとを含む、Y状の第四チューブ;および、外に向かって突出した金ワイヤに接続された作用電極、および外に向かって突出した白金ワイヤに接続された対電極を含むインピーダンスアナライザ、
を含む、前記システムを提供する。
上記インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
iiチューブに接続されたシリンジを用いて、第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを置くこと
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて、第二チューブの内部に肝細胞スフェロイドを配置し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること;
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて、第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し(引き離し)、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること;
上記測定された第一インピーダンスおよび第二インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること;および
上記結果を正常の対照群のそれらと比較することで、試験薬物誘発性脂肪肝を評価すること、
を含む、前記方法を提供する。
上記インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
iiチューブに接続されたシリンジを用いて、第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを置くこと、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて第二チューブの一端に肝細胞スフェロイドを固定し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて圧力を上昇させることにより第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを移動し、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて圧力を上昇させることにより第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドをさらに移動し、インピーダンスアナライザを用いることで第三インピーダンスを測定すること、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し、インピーダンスアナライザを用いることで第四インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンス、第二インピーダンス、第三インピーダンスおよび第四インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること、および
圧力変化からスフェロイドの剛性を得ること
を含む、前記方法を提供する。
本発明の一側面において提供されるインピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムは、三次元の肝ミクロ組織を用い、これにより、試験薬物誘発性脂肪肝および肝線維症が、非侵襲的で再現性の高い様式で分析され得る。
これ以降、本発明を詳細に記載する。
円柱状の第一チューブ;第一チューブ内に挿入され、第一チューブの内表面と接触する外表面を有し、第一チューブよりも小さい長さを有する、円柱状の第二チューブ;第一チューブの一端に接続されており、第一チューブの一端に接続されたiチューブと、第一チューブに圧力を加えることで第一チューブ内の肝細胞スフェロイドの位置を調整するためのシリンジに接続されたiiチューブと、内部に設置されたコイル状の金(Au)ワイヤを有し、金ワイヤの一端が外側へ突出したiiiチューブとを含む、Y状の第三チューブ;第一チューブのもう一端に接続されており、第一チューブのもう一端に接続されたIチューブと、バロメータおよびシリンジポンプにチューブを介して接続されたIIチューブと、内部に設置されたコイル状の白金(Pt)ワイヤを有し、白金ワイヤの一端が外側へ突出したIIIチューブとを含む、Y状の第四チューブ;および、外に向かって突出した金ワイヤに接続された作用電極、および外に向かって突出した白金ワイヤに接続された対電極を含むインピーダンスアナライザ、
を含む、前記システムを提供する。
上記インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを配置し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンスおよび第二インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること、および
上記結果を正常の対照群のそれと比較することで、試験薬物誘発性脂肪肝を評価すること、
を含む、前記方法を提供する。
上記インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
iiチューブに接続されたシリンジを用いて、第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを置くこと、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて第二チューブの一端に肝細胞スフェロイドを固定し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し(引き離し)、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンスおよび第二インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること;および
上記結果を正常の対照群のそれと比較することで、試験薬物誘発性脂肪肝を評価すること、
を含む、前記方法を提供する。
試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドから計算された内部抵抗が正常の対照群のそれよりも大きい場合、試験薬物が脂肪肝を引き起こす毒性を有することを判断すること、
試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドから計算された外部抵抗が正常の対照群のそれよりも大きい場合、試験薬物が脂肪肝を引き起こす毒性を有することを判断すること、および/または
試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドから計算されたキャパシタンスが正常の対照群のそれよりも小さい場合、試験薬物が脂肪肝を引き起こす毒性を有することを判断すること
もまた含み得る。
上記インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを配置し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを移動し、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを移動し、インピーダンスアナライザを用いることで第三インピーダンスを測定すること、
第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し、インピーダンスアナライザを用いることで第四インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンス、第二インピーダンス、第三インピーダンスおよび第四インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること、および
圧力変化からスフェロイドの剛性を得ること、
を含む、前記方法を提供する。
上記インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
iiチューブに接続されたシリンジを用いて、第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを置くこと、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて第二チューブの一端に肝細胞スフェロイドを固定し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを移動し、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを移動し、インピーダンスアナライザを用いることで第三インピーダンスを測定すること、
IIチューブに接続されたシリンジポンプを用いて第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し(引き離し)、インピーダンスアナライザを用いることで第四インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンス、第二インピーダンス、第三インピーダンスおよび第四インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること、および
圧力変化からスフェロイドの剛性を得ること、
を含む、前記方法を提供する。
シリンジポンプを用いて圧力を-10 mPaに設定することにより、1-1インピーダンスを測定すること、
シリンジポンプを用いて圧力を-15 mPaに設定することにより、1-2インピーダンスを測定すること、および
シリンジポンプを用いて圧力を-20 mPaに設定することにより、1-3インピーダンスを測定すること
を追加的に含み得る。
1. 完全に分化したHepaRG肝臓細胞株が、4,000,000 細胞/100 uLの密度で得られた。
2. Microfit Co.から提供されたC253000のマニュアルに従い、試料が調製された。400,000のHepaRG細胞が各ウェルに置かれることを可能にするように、10 μLの細胞懸濁液#1が各ウェルへ分配された。このステップは、マイクロパターンプレート法または懸滴法などの3D細胞調製方法を用いて実施され得る。
3. 細胞は3日間培養され、細胞培養培地は毎日交換された。
4. 4日目に、ミクロ組織(MT)は、100 uLの青いチップを用いて、96ウェルプレート(超低接着表面マルチプルウェルプレート、Corning)へ分配された。
1. 1.8 mmの外径、0.4 mmの内径および5 mmの長さを有するプラスチックチップ(第二チューブ)が、2 mmの外径、1.8 mmの内径および8 cmの長さを有するガラスチューブ(第一チューブ)の中心に置かれた。
2. 2つのY状のチューブ(それぞれ、第三チューブおよび第四チューブ)が調製された。0.5 mmの直径および5 cmの長さを伴う少なくとも99%の金(Au)ワイヤが、1つのYチューブ(第三チューブ)の一方(iiiチューブ)にコイルの形状で置かれ、0.5 mmの直径および5 cmの長さを伴う少なくとも99%の白金(Pt)ワイヤが、もう1つのYチューブ(第四チューブ)の一方(IIIチューブ)にコイルの形状で置かれた。このとき、金(Au)および白金(Pt)ワイヤの末端はYチューブの外側に露出され、チューブ(iiiチューブおよびIIIチューブ)の末端は、空気および水の流れを遮断するために塞がれた。
3. 白金(Pt)ワイヤを含有するYチューブのもう一端(IIチューブ)は、チューブを介して圧力センサおよびシリンジポンプに接続され、金(Au)ワイヤを含有するYチューブのもう一端(iiチューブ)は、肝ミクロ組織(MT)の位置を手動で調整するために1 mLシリンジに接続された。
4. 各Yチューブは、PBSバッファーで満たされた。
(例1の1から4に従う)
5a. 超低接着表面マルチプルウェルプレートに分配された肝ミクロ組織(MT)は、脂肪肝毒性誘発薬物である0.5 Mのオレイン酸で処置された。
6a. 200 μLのピペットが例1の第一ガラスチューブの末端に挿入され、肝ミクロ組織(MT)および培養培地が、気泡形成を防ぎながらガラスチューブを満たすためにもう一つの末端を通じて吸い上げられた。
7a. ガラスチューブが、例1および例4の2つのYチューブ(第三チューブおよび第四チューブ)の間に、気泡形成を防ぎながら挿入された。
8a. 液体中の気泡は除去され、各Yチューブのワイヤに同じ液体を共有させた。
9a. ポテンシオスタットまたはインピーダンスアナライザの作用電極/検出電極はYチューブ(iiiチューブ)の外に突出する金(Au)ワイヤに接続され、基準/対電極はもう一つのYチューブ(IIIチューブ)の外に突出する白金(Pt)ワイヤに接続された。
10a. 1 mLのシリンジを用いることにより、肝ミクロ組織(MT)はプラスチックチップの末端に置かれた。
11a. シリンジポンプを用いることにより圧力は-5 mPaに設定され、肝ミクロ組織(MT)は圧力差によりプラスチックチップに固定された。
12a. 交流電流インピーダンスは、肝ミクロ組織(MT)およびPBSバッファーのインピーダンスを測定するために、106 Hzから10-2 Hzまで、50 mVの固定電圧で測定された。
13a. シリンジポンプの圧力は、プラスチックチップから肝ミクロ組織(MT)の除去をさせることを可能にするために、10 mPaで設定された。
14a. インピーダンスは、PBSバッファー(バックグラウンド)のインピーダンスを測定するために、106 Hzから10-2 Hzまで、50 mVの固定電圧で測定された。
16a. 肝ミクロ組織(MT)の内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスは、正常の対照群のそれらと比較された。このとき、正常の対照群は、脂肪肝毒性誘発薬物として認識されているオレイン酸で処置されていない肝ミクロ組織(MT)を意味する。
17a. オレイン酸により肝臓組織内で脂肪が形成された場合、電流が干渉され、よって、内部抵抗が上昇した。細胞サイズが上昇した場合、細胞間隙を反映する外部抵抗値が上昇した。キャパシタンスは、細胞膜の安定性を反映する。したがって、試験薬物が毒性を有すると、キャパシタンスは減少する。
図2は、圧力変化による肝ミクロ組織(MT)の変形、インピーダンス、および位相角における変化を示す写真およびグラフの一式であり、ここで、図2aは、対照群を説明し、図2bは、オレイン酸で処置された肝ミクロ組織を説明する。
図3は、圧力変化による肝ミクロ組織(MT)の抵抗パターンを説明するグラフである。
(例1の1から4に従う)
5b. 超低接着表面マルチプルウェルプレートに分配された肝ミクロ組織(MT)は、肝線維症誘発薬物であるTGF-βで処置された。
6b〜12b. これらのステップは、実験例1の6a〜12aと同じ様式によって実施された。
13b. シリンジポンプの圧力は-10 mPaに設定され、これにより、肝ミクロ組織(MT)はより密接にプラスチックチップに固定された。
14b. 交流電流インピーダンスは、肝ミクロ組織(MT)およびPBSバッファー(バックグラウンド)のインピーダンスを測定するために、106 Hzから10-2 Hzまで、50 mVの固定電圧で測定された。
15b. シリンジポンプの圧力は-15 mPaに設定され、これにより、肝ミクロ組織(MT)は、より頑丈にプラスチックチップに固定された。
17b. シリンジポンプの圧力は-20 mPaに設定され、これにより、肝ミクロ組織(MT)は、より頑丈にプラスチックチップに固定された。
18b. 交流電流インピーダンスは、肝ミクロ組織(MT)およびPBSバッファー(バックグラウンド)のインピーダンスを測定するために、106 Hzから10-2 Hzまで、50 mVの固定電圧で測定された。
19b. シリンジポンプの圧力は、プラスチックチップから肝ミクロ組織(MT)の除去をさせることを可能にするために、10 mPaで設定された。
21b. 12b、14b、16bおよび18bの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンス、ならびに20bの抵抗およびキャパシタンスは、フィッティングプログラム(例、Zview)を用いることで測定された。
22b. 上記測定された内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスは、PBSインピーダンスを除き、対照群のそれらと比較された。このとき、正常の対照群は、肝線維症毒性誘発薬物として認識されているTGF-βで処置されていない肝ミクロ組織(MT)を意味する。
23b. インピーダンスは、肝ミクロ組織(MT)のひずみに比例して上昇した。したがって、ストレスに従うひずみの変化は、圧力およびインピーダンスの傾斜として表現され得る。肝ミクロ組織(MT)の剛性が肝線維症誘発薬物のようなものにより上昇した場合、ひずみのストレスに対する比が低減した。
Claims (14)
- インピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムであって、
第一チューブ、および第一チューブ内に挿入され第一チューブよりも小さい長さを有する第二チューブを含む肝細胞スフェロイドひずみ発生部と、
肝細胞スフェロイドひずみ発生部と接続されている、肝細胞スフェロイドのインピーダンスを測定するためのインピーダンスアナライザを含むインピーダンス測定部とを含み、
インピーダンス測定部で測定されたインピーダンスから脂肪肝および肝線維症を評価し、
肝細胞スフェロイドひずみ発生部が、
第一チューブの一端に接続されており、第一チューブに圧力を加えることで第一チューブ内の肝細胞スフェロイドの位置を調節する第三チューブ、および
第一チューブのもう一端に接続されており、第一チューブ内の圧力を調節することで第一チューブ内の肝細胞スフェロイドの位置を調節する第四チューブ
を含む、前記システム。 - 第一チューブの内径が第二チューブの外径と同じであり、第二チューブの内径が肝細胞スフェロイドの直径よりも小さい、請求項1に記載のインピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システム。
- 第三チューブが、
Yの形状であり、
第一チューブの一端に接続されたiチューブ、第一チューブに圧力を加えることで第一チューブ内の肝細胞スフェロイドの位置を調整するためのシリンジに接続されたiiチューブ、および電極材料を含有するiiiチューブを含む、
請求項1に記載のインピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システム。 - 第四チューブが、
Yの形状であり、
第一チューブのもう一端に接続されたIチューブ、バロメータおよびシリンジポンプに接続されたIIチューブ、および電極材料を含有するIIIチューブを含む、
請求項1に記載のインピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システム。 - iiiチューブに含有された電極材料が、コイル状のワイヤの形でありiチューブの内部へ伸展している、
請求項3に記載のインピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システム。 - IIIチューブに含有された電極材料が、コイル状のワイヤの形でありIチューブの内部へ伸展している、
請求項4に記載のインピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システム。 - 試験薬物誘発性脂肪肝を評価するための方法であって、以下のステップ:
請求項1に記載のインピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを配置し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンスおよび第二インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること、および
上記結果を正常の対照群のそれらと比較することで、試験薬物誘発性脂肪肝を評価すること、
を含む、前記方法。 - 肝細胞スフェロイドひずみ発生部がバッファーで満たされながら行われる、請求項7に記載の試験薬物誘発性脂肪肝を評価するための方法。
- 試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドから計算された内部抵抗が正常の対照群のそれよりも大きい場合、試験薬物が脂肪肝を引き起こす毒性を有することを判断するステップを追加的に含む、
請求項7に記載の試験薬物誘発性脂肪肝を評価するための方法。 - 試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドから計算された外部抵抗が正常の対照群のそれよりも大きい場合、試験薬物が脂肪肝を引き起こす毒性を有することを判断するステップを追加的に含む、
請求項7に記載の試験薬物誘発性脂肪肝を評価するための方法。 - 試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドから計算されたキャパシタンスが正常の対照群のそれよりも小さい場合、試験薬物が脂肪肝を引き起こす毒性を有することを判断するステップを追加的に含む、
請求項7に記載の試験薬物誘発性脂肪肝を評価するための方法。 - 試験薬物誘発性肝線維症を評価するための方法であって、以下のステップ:
請求項1に記載のインピーダンスに基づく脂肪肝および肝線維症評価システムの第一チューブの内部に、試験薬物で処置された肝細胞スフェロイドを置くこと、
第二チューブの一端に接触させるよう肝細胞スフェロイドを配置し、インピーダンスアナライザを用いることで第一インピーダンスを測定すること、
第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを押し、インピーダンスアナライザを用いることで第二インピーダンスを測定すること、
第二チューブの内部へ肝細胞スフェロイドを押し、インピーダンスアナライザを用いることで第三インピーダンスを測定すること、
第二チューブから肝細胞スフェロイドを除去し、インピーダンスアナライザを用いることで第四インピーダンスを測定すること、
上記測定された第一インピーダンス、第二インピーダンス、第三インピーダンス、および第四インピーダンスに基づき、肝細胞スフェロイドの内部抵抗、外部抵抗およびキャパシタンスを得ること、および
圧力変化からスフェロイドの剛性を得ること、
を含む、前記方法。 - 第二チューブの内径が肝細胞スフェロイドの直径よりも小さい、請求項12に記載の試験薬物誘発性肝線維症を評価するための方法。
- 肝細胞スフェロイドひずみ発生部がバッファーで満たされながら行われる、請求項12に記載の試験薬物誘発性肝線維症を評価するための方法。
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