JP6847044B2

JP6847044B2 - 肥満及び２型糖尿病（ｔ２ｄ）の治療のための膵内分泌前駆細胞療法

Info

Publication number: JP6847044B2
Application number: JP2017547514A
Authority: JP
Inventors: ティモシー・ジェイ・キーファー; ジェニファー・イー・ブルーイン
Original assignee: シーシーエス・ベンチャーズ・リミテッド
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2021-03-24
Anticipated expiration: 2036-03-11
Also published as: JP2018507889A; EP3268016A1; EP3268016B1; CN107530379A; EP3268016A4; CA2979293C; US20180055890A1; US20210015872A1; CA2979293A1; AU2016228894A1; WO2016141460A1; AU2016228894B2; US10772917B2

Description

本発明は、対象における代謝障害、医学的状態、及び関連付けられる病理学的状態を治療するための方法に関する。特に、本発明は、対象における体重減少、グルコース耐性の改善、及び/又はインスリン感受性の上昇を達成するための、多能性幹細胞の分化から生じる細胞の、単独又は抗糖尿病薬物療法との組合せの、使用に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、2015年3月11日出願の米国仮特許出願第62/131,540号、表題「THERAPY FOR THE TREATMENT OF OBESITY」の利益を主張する。

肥満は、急速に世界的に蔓延してきており、この蔓延は全ての年齢及び社会経済群にわたっている。世界の過体重及び肥満の人の数は、1980年の8億5700万人から2013年には21億人に上昇した(Ngら、Global, Regional & National Prevalence of Overweight and Obesity in Children and Adults During 1980-2013: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study、Lancet、(2014))。加えて、肥満は、2型糖尿病又は2型真性糖尿病(T2D)を含むいくつかの疾患の発症の主要なリスク因子であることが知られている。

国際糖尿病連合は、世界で約3億8000万人の人が糖尿病を有し、そのうちの最大95%がT2Dを患っていると推定している。T2Dでは、身体がインスリンを適切に使用することができないか、又はインスリン抵抗性である。また、T2Dは一般的に、高血糖、インスリン抵抗性、及び低インスリンレベルにより特徴付けられる。T2Dは、主に、遺伝的素因を有する人における肥満及び運動不足のためであると考えられている。

食事、運動、及び体重管理は、T2Dを管理する基本である。しかしながら、1つ又は複数の薬物が血糖レベルを制御するために使用される薬物療法が、必要とされる場合がある。現在のT2D治療のための薬物療法は、メグリチニド、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ4(「DPP-4」)阻害剤、ビグアナイド、チアゾリジンジオン、アルファ-グルコシダーゼ阻害剤、及びナトリウム-グルコース共輸送体2(「SGLT2」)阻害剤を含む、経口薬物療法である。加えて、注射可能な薬物療法、例えばアミリン模倣体及びインクレチン模倣体は、T2Dを治療するために使用される。

真性糖尿病の第2の型である1型(T1D)は、膵臓によりインスリンがほとんど又は全く産生されない慢性状態である。歴史的に、T1Dは、食事、運動、及び体重の制御に加えて、インスリン投与で治療された。しかしながら、より最近の治療は、ランゲルハンス島の移植を含み、この治療は移植可能なランゲルハンス島の不足に悩まされている。したがって、更により最近では、治療開発は、移植に適切なインスリン産生細胞の供給源を開発することに集中していた。1つのそのようなアプローチは、胚性幹細胞等の多能性幹細胞からのインスリン産生細胞の作成である。

ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の富化培養物の生成及びそのような細胞の膵内分泌前駆細胞への更なる分化が知られている(例えば、US2009/0170198;Rezania, A.ら、Diabetes、2012;Rezania, A.ら、Stem Cells、2013;Bruin, J.E.ら、2013;Bruin, J.E.ら、Stem Cell Research 2014)。また、公開特許出願、US2012/0039955は、ストレプトゾトシン(STZ)誘発T1D様状態を有するSCIDマウスにおける、カプセル化(encapsulated)膵内分泌前駆細胞集団の移植後の血糖減少を説明している。また、身体への膵内分泌前駆細胞の続く移植は、機能的膵内分泌細胞へのまた更なる分化を可能にすることが知られている。

US2009/0170198 US2012/0039955 US20150353895 WO2015002724 WO/2014/160413 米国特許第5,843,780号米国特許出願公開第2011/0104805号米国特許第7,510,873号米国特許出願公開第2005/0058631号米国特許出願公開第2007/0122903号

Ngら、Global, Regional & National Prevalence of Overweight and Obesity in Children and Adults During 1980-2013: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study、Lancet(2014) Rezania, A.ら、Diabetes、2012 Rezania, A.ら、Stem Cells、2013 Bruin, J.E.ら、Stem Cell Research 2014 NIH Human Embryonic Stem Cell Registry Bruin, JE.ら「Hypothyroidism impairs human stem cell-derived pancreatic progenitor cell maturation in mice」 Diabetes(2016) pii:db151439.[出版物に先行するEpub] Diabetes、61、2016頁、2012

本発明は、部分的には、高脂肪食(HFD)給餌マウスにおいて、膵内分泌前駆細胞(ステージ4細胞)と小分子抗糖尿病薬との併用療法は、小分子抗糖尿病薬又は前駆細胞移植単独のいずれかより有効であったという驚くべき発見に基づく。更に、驚くべきことに、HFDも抗糖尿病薬も、ヒト胚性幹細胞(hESC)由来細胞の、インビボで成熟し、グルコースに応答して適切にインスリンを分泌する能力には影響を及ぼさなかった。幹細胞が成熟する環境は、成熟プロセスから生じる分化細胞に重要である。本発明の実施形態は更に、膵内分泌前駆細胞は、対象における2型糖尿病(T2D)治療のための療法として特定の利用性を見出し得るという発見に基づき、ここで、対象は、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬での治療の候補者である。本発明の実施形態は更に、膵内分泌前駆細胞と小分子抗糖尿病薬との組合せを用いる治療は、T2D、肥満、グルコース不耐性、及び/又はインスリン抵抗性の治療で有用であるという偶然の発見に基づく。或いは、本明細書で説明する方法は、血糖コントロールを改善するために使用することができる。本発明の追加の実施形態は更に、膵内分泌前駆細胞の移植は単独で対象における体重減少をもたらすという偶然の発見に基づく。更に、また、体重減少は、より分化した細胞(すなわち、ステージ5、ステージ6、又はステージ7細胞)により達成された。

第1の実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための方法であって、膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程を含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程であり、対象が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬での治療の候補者である工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための方法であって、膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程であり、対象が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬での治療の候補者である工程を含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程であり、対象が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬で治療されている工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための方法であって、膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程であり、対象が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬で治療されている工程を含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における肥満を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における肥満を治療するための方法であって、膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程を含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における制御体重増加を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における制御体重増加を治療するための方法であって、膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程を含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における肥満を治療するための方法であって、(a)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を対象に投与する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(c)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における肥満を治療するための方法であって、(a)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を対象に投与する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における制御体重増加を治療するための方法であって、(a)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を対象に投与する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(c)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における制御体重増加を治療するための方法であって、(a)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を対象に投与する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における肥満、グルコース不耐性、又はインスリン抵抗性を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における肥満、グルコース不耐性、又はインスリン抵抗性を治療するための方法であって、膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程を含む方法が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における肥満、グルコース不耐性、又はインスリン抵抗性を治療するための方法であって、(a)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を対象に投与する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(c)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における肥満、グルコース不耐性、又はインスリン抵抗性を治療するための方法であって、(a)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を対象に投与する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における血糖コントロールを改善する方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程であり、対象が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬での治療の候補者である工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における血糖コントロールを改善する方法であって、膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程であり、対象が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬での治療の候補者である工程を含む方法が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における血糖コントロールを改善する方法であって、(a)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を対象に投与する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程であり、対象が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬での治療の候補者である工程と、(c)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における血糖コントロールを改善する方法であって、(a)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を対象に投与する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程であり、対象が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬での治療の候補者である工程とを含む方法が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための膵内分泌前駆細胞集団及び1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における2型糖尿病(T2D)を治療するための膵内分泌前駆細胞集団及び1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における肥満を治療するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における肥満を治療するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における制御体重増加を治療するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における制御体重増加を治療するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における肥満を治療するための膵内分泌前駆細胞集団及び治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における肥満を治療するための膵内分泌前駆細胞集団及び治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における制御体重増加を治療するための膵内分泌前駆細胞集団及び治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、対象における制御体重増加を治療するための膵内分泌前駆細胞集団及び治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における肥満、グルコース不耐性、又はインスリン抵抗性を治療するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における肥満、グルコース不耐性、又はインスリン抵抗性を治療するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における肥満、グルコース不耐性、又はインスリン抵抗性を治療するための膵内分泌前駆細胞集団及び治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における肥満、グルコース不耐性、又はインスリン抵抗性を治療するための膵内分泌前駆細胞集団及び治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における血糖コントロールを改善するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における血糖コントロールを改善するための膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における血糖コントロールを改善するための膵内分泌前駆細胞集団及び治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植、及び膵内分泌細胞を含む集団を生成するためのインビボでの成熟に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、T2Dを有する対象における血糖コントロールを改善するための膵内分泌前駆細胞集団及び治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬の使用であって、細胞が、対象への移植に好適である使用が提供される。

更なる実施形態では、(a)膵内分泌前駆細胞集団と、(b)治療的有効量の1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬とを含む、市販包装が提供される。

本方法は更に、対象を1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬で治療する工程を含むことができる。1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬は、以下の、ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP-4)阻害剤、チアゾリジンジオン、及びビグアナイドから選択することができる。抗糖尿病薬は、シタグリプチン、メトホルミン、及びロシグリタゾンを含む群から選択することができる。1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬は、以下の、メグリチニド、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP-4)阻害剤、ビグアナイド、チアゾリジンジオン、アルファ-グルコシダーゼ阻害剤、ナトリウム-グルコース共輸送体2(SGLT-2)阻害剤、及び胆汁酸封鎖剤から選択することができる。小分子抗糖尿病薬は、レパグリニド、ナテグリニド、グリピジド、グリメピリド、グリブリド、サキサグリプチン、シタグリプチン、リナグリプチン、メトホルミン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、アカルボース、ミグリトール、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、及びコレセベラム(colsevelam)を含む群から選択することができる。抗糖尿病薬は、シタグリプチンであり得る。抗糖尿病薬は、メトホルミンであり得る。抗糖尿病薬は、ロシグリタゾンであり得る。

膵内分泌前駆細胞は、インビボで成熟して、少なくとも2%の膵内分泌細胞を含む集団を生成することができる。膵内分泌前駆細胞は、カプセル化されていてもよい。膵内分泌前駆細胞は、カプセル化されていなくてもよい。膵内分泌前駆細胞は、マクロカプセル化されていてもよい。膵内分泌前駆細胞は、マイクロカプセル化されていてもよい。膵内分泌細胞を含む集団は、混合集団であり得る。膵内分泌細胞を含む集団は、成熟膵島細胞を含むことができる。膵内分泌細胞を含む集団は、成熟膵内分泌細胞を含むことができる。膵内分泌細胞を含む集団は、ベータ細胞を含むことができる。膵内分泌細胞を含む集団は、アルファ細胞を含むことができる。

市販包装は更に、T2Dの治療についての使用説明書を含むことができる。市販包装は更に、肥満の治療についての使用説明書を含むことができる。市販包装は更に、血糖コントロールについての使用説明書を含むことができる。

実施例1のマウスの、低脂肪食(10%脂肪)、高脂肪食(45%脂肪;60%脂肪)、又は高脂肪高炭水化物食(西欧)の投与後の特定の日の絶食体重を示すグラフを示す。実施例1のマウスの、低脂肪食(10%脂肪)、高脂肪食(45%脂肪;60%脂肪)、又は高脂肪高炭水化物食(西欧)の投与後の特定の日の絶食血中グルコースレベルを示すグラフを示す。実施例1のマウスの経口グルコース負荷中の47日目の血中グルコース値の元の値及び曲線下面積のグラフを示す。実施例1のマウスの経口グルコース負荷中の47日目に回収された試料中のインスリンレベルのグラフを示す。実施例1のマウスについて42日目に行ったインスリン耐性試験の結果のグラフを示す。実施例1のマウスの部分集合の43日目の最近の脂肪の二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)評価の結果を示す。実施例1のマウスの47〜49日目に4〜6時間の午前絶食後に測定したレプチンレベルを示す。実施例2のマウスで移植8、12、16、及び20週間後で、一晩絶食後及び経口混合食負荷40分後に測定したヒトCペプチドレベルのグラフを示す。実施例2のマウスについての移植18週間後での腹腔内グルコース耐性試験(ipGTT)後のヒトCペプチド測定の結果を示すグラフであり、正規化基線レベルである。実施例2のマウスについての移植18週間後での腹腔内グルコース耐性試験(ipGTT)後のヒトCペプチド測定の結果を示すグラフであり、元のレベル(ng/mL)である。実施例3のマウスにおける移植24週間後でのアルギニン耐性試験後のヒトインスリンの結果を示すグラフである。実施例3のマウスにおける移植24週間後でのアルギニン耐性試験後のグルカゴンの結果を示すグラフであり、移植受容動物における0及び15分でのグルカゴンレベルを示す。実施例3のマウスにおける移植24週間後でのアルギニン耐性試験後のグルカゴンの結果を示すグラフであり、模擬処置マウス(模擬、縞模様のバー)及び移植受容動物(Tx、黒べたのバー)における15分のみでのグルカゴンレベルを示す。インスリン、グルカゴン、又は両方のホルモン(Ins+/Gcg+)について免疫反応性であった、デバイスを伴う細胞の割合に関するグラフを示す。実施例4のマウスにおける移植12週間後で測定したHbA1Cレベルを示すグラフを示す。実施例4のマウスにおける移植24週間後で測定したHbA1Cレベルを示すグラフを示す。実施例4のマウスにおける移植20週間後に一晩絶食後及び経口食餌負荷40分後に測定した血中グルコースレベルを示すグラフを示す。実施例4のマウスにおける移植18週間後に行った腹腔内グルコース耐性試験の結果を示すグラフを示す。実施例4のマウスにおける移植24週間後に行った腹腔内グルコース耐性試験の結果を示すグラフを示す。実施例4のマウスにおける移植22週間後に行ったインスリン耐性試験の結果を示すグラフを示す。図５Ａから図５Ｆは、食餌誘発肥満が、抗糖尿病薬と組合せた前駆細胞移植後に後退したことを示すグラフであり、薬物を伴わない10%脂肪食(黒色/灰色;全てのパネル;n=8匹のマウス)、薬物を伴わない60%脂肪食(A及びB;1群当たりn=7〜8匹のマウス)、60%脂肪食+メトホルミン(A及びC;1群当たりn=7〜8匹のマウス)、60%脂肪食+シタグリプチン(A及びD;1群当たりn=8匹のマウス)、又は60%脂肪食+ロシグリタゾン(A及びE;1群当たりn=8匹のマウス)を給餌したマウスで、絶食体重を評価した。全ての処置群からの模擬マウスの体重追跡を(A)で示す。各処置群からの模擬マウス(実線、黒記号)及び移植受容動物(Tx;点線、白記号)を、参照としてのLFD対照と共に示す(B〜E)。2日目から12日目までの体重変化を各線グラフの右の箱ひげ図で示し、各データ点は個々のマウスを表す。線グラフのデータは平均値±SEMとして表される。(F)移植前(2日目)及び移植後(75日目)の体重。図５Ｇは、実施例6のマウスの移植20週間後の、相対的精巣上体脂肪パッド質量対体重を示すグラフを示す。図５Ｈは、実施例6のマウスにおいて移植20週間後に評価した血漿マウスレプチンレベルのグラフを示す。図５Ａから図５Ｆは、食餌誘発肥満が、抗糖尿病薬と組合せた前駆細胞移植後に後退したことを示すグラフであり、薬物を伴わない10%脂肪食(黒色/灰色;全てのパネル;n=8匹のマウス)、薬物を伴わない60%脂肪食(A及びB;1群当たりn=7〜8匹のマウス)、60%脂肪食+メトホルミン(A及びC;1群当たりn=7〜8匹のマウス)、60%脂肪食+シタグリプチン(A及びD;1群当たりn=8匹のマウス)、又は60%脂肪食+ロシグリタゾン(A及びE;1群当たりn=8匹のマウス)を給餌したマウスで、絶食体重を評価した。全ての処置群からの模擬マウスの体重追跡を(A)で示す。各処置群からの模擬マウス(実線、黒記号)及び移植受容動物(Tx;点線、白記号)を、参照としてのLFD対照と共に示す(B〜E)。2日目から12日目までの体重変化を各線グラフの右の箱ひげ図で示し、各データ点は個々のマウスを表す。線グラフのデータは平均値±SEMとして表される。(F)移植前(2日目)及び移植後(75日目)の体重。図５Ｇは、実施例6のマウスの移植20週間後の、相対的精巣上体脂肪パッド質量対体重を示すグラフを示す。図５Ｈは、実施例6のマウスにおいて移植20週間後に評価した血漿マウスレプチンレベルのグラフを示す。図５Ａから図５Ｆは、食餌誘発肥満が、抗糖尿病薬と組合せた前駆細胞移植後に後退したことを示すグラフであり、薬物を伴わない10%脂肪食(黒色/灰色;全てのパネル;n=8匹のマウス)、薬物を伴わない60%脂肪食(A及びB;1群当たりn=7〜8匹のマウス)、60%脂肪食+メトホルミン(A及びC;1群当たりn=7〜8匹のマウス)、60%脂肪食+シタグリプチン(A及びD;1群当たりn=8匹のマウス)、又は60%脂肪食+ロシグリタゾン(A及びE;1群当たりn=8匹のマウス)を給餌したマウスで、絶食体重を評価した。全ての処置群からの模擬マウスの体重追跡を(A)で示す。各処置群からの模擬マウス(実線、黒記号)及び移植受容動物(Tx;点線、白記号)を、参照としてのLFD対照と共に示す(B〜E)。2日目から12日目までの体重変化を各線グラフの右の箱ひげ図で示し、各データ点は個々のマウスを表す。線グラフのデータは平均値±SEMとして表される。(F)移植前(2日目)及び移植後(75日目)の体重。図５Ｇは、実施例6のマウスの移植20週間後の、相対的精巣上体脂肪パッド質量対体重を示すグラフを示す。図５Ｈは、実施例6のマウスにおいて移植20週間後に評価した血漿マウスレプチンレベルのグラフを示す。実施例6のマウスについて移植12週間後に行った経口グルコース耐性試験の結果を示すグラフを示す。実施例6のマウスについて移植12週間後に行った経口グルコース耐性試験の結果を示すグラフを示す。実施例6のマウスについて移植12週間後に行った経口グルコース耐性試験の結果を示すグラフを示す。実施例6のマウスについて移植12週間後に行った経口グルコース耐性試験の結果を示すグラフを示す。実施例6のマウスについて移植12週間後に行った経口グルコース耐性試験の結果を示すグラフを示す。実施例6のマウスについての移植4週間後の(6F)、腹腔内グルコース注射前(0)又は60分後(60)のいずれかのマウスCペプチドレベルを示すグラフを示す。実施例6のマウスにおいて一晩絶食後及び腹腔内グルコース負荷60分後に測定したヒトCペプチド分泌の結果を示すグラフである。マウスへの実施例1の食餌投与後5日目(これは図1に伴う追加の時点である)の経口グルコース耐性試験の結果のグラフを示す。実施例1のマウスの5日目の体重のグラフを示す。マウスへの実施例1の食餌投与後32日目(これは図1に伴う追加の時点である)の経口グルコース耐性試験の結果のグラフを示す。実施例1のマウスの32日目の体重のグラフを示す。実施例1のマウスにおける47日目〜49日目の間の4〜6時間の午前絶食後の血漿レベルを示すグラフである。7Eは、遊離脂肪酸のグラフである。実施例1のマウスにおける47日目〜49日目の間の4〜6時間の午前絶食後の血漿レベルを示すグラフである。7Fは、トリグリセリドのグラフである。実施例1のマウスにおける47日目〜49日目の間の4〜6時間の午前絶食後の血漿レベルを示すグラフである。7Gは、コレステロールのグラフである。図８は、実施例2のステージ4、4日目細胞のキーマーカーのフローサイトメトリーの結果の4つのグラフを示し、シナプトフィジン及びNKX6.1、クロモグラニン及びNKX2.2、PDX1及びKi67、並びにPAX4及びOCT3/4の共発現を示す。図８は、実施例2のステージ4、4日目細胞のキーマーカーのフローサイトメトリーの結果の4つのグラフを示し、シナプトフィジン及びNKX6.1、クロモグラニン及びNKX2.2、PDX1及びKi67、並びにPAX4及びOCT3/4の共発現を示す。実施例4のマウスについて移植18週間後に行った腹腔内グルコース耐性試験の結果のグラフを示す。実施例4のマウスについて移植24週間後に行った腹腔内グルコース耐性試験の結果のグラフを示す。実施例4のマウスについて移植22週間後に行ったインスリン耐性試験の結果のグラフを示す。実施例4のマウスについて移植22週間後に行ったインスリン耐性試験の結果のグラフを示す。実施例4のマウスからの膵臓切片における、移植又は模擬手術29週間後及び食餌投与36週間後のベータ細胞量免疫染色のグラフを示す。実施例4のマウスからの膵臓切片における、移植又は模擬手術29週間後及び食餌投与36週間後のアルファ細胞量免疫染色のグラフを示す。実施例4のマウスからの膵臓切片における、移植又は模擬手術29週間後及び食餌投与36週間後のインスリン対グルカゴン免疫染色比のグラフを示す。実施例4のマウスの体重のグラフを示す。実施例4のマウスの精巣上体脂肪質量のグラフを示す。実施例4のマウスの血漿レプチンレベルのグラフを示す。実施例4のマウスの肝臓質量のグラフを示す。実施例6のマウスの部分集合の絶食血中グルコース(左)及び体重レベル(右)の2つのグラフを示す。実施例6のマウスへの低脂肪食又は高脂肪食いずれかの投与後の絶食血中グルコース(左)及び体重レベル(右)の2つのグラフを示す。実施例6のマウスへの低脂肪食又は高脂肪食いずれかの投与2週間後の経口グルコース耐性試験の結果のグラフを示す。実施例6のマウスへの低脂肪食又は高脂肪食いずれかの投与3週間後のインスリン耐性試験の結果のグラフを示す。雌マウスについての、移植後の時間(日)に対してプロットした体重(g)のグラフを示し、1M=100万、5M=500万、S4=ステージ4細胞、及びS7=ステージ7細胞である。マウスを、移植約4日前及び移植後約2〜4週間毎に、4時間の絶食(通常午前7時〜午前11時)後に計量し、零(0)は移植の日である。雄マウスについての、移植後の時間(日)に対してプロットした体重(g)のグラフを示し、1M=100万、5M=500万、S4=ステージ4細胞、及びS7=ステージ7細胞である。マウスを、移植約4日前及び移植後約2〜4週間毎に、4時間の絶食(通常午前7時〜午前11時)後に計量し、零(0)は移植の日である。雌マウスについての、移植後の時間(週)に対してプロットした体重(g)のグラフを示し、1M=100万、5M=500万、S4=ステージ4細胞、及びS7=ステージ7細胞である。マウスを移植2、4、8、12、16、20、及び24週間後に一晩絶食(通常午後5時から午前8時、約15時間)後に計量し、零(0)は移植の日である。雄マウスについての、移植後の時間(週)に対してプロットした体重(g)のグラフを示し、1M=100万、5M=500万、S4=ステージ4細胞、及びS7=ステージ7細胞である。マウスを移植2、4、8、12、16、20、及び24週間後に一晩絶食(通常午後5時から午前8時、約15時間)後に計量し、零(0)は移植の日である。マウス及び非糖尿病マウスにおける移植したステージ7細胞とヒト膵島移植片とを比較する、体重(g)(BW)のグラフを示し、ヒト膵島移植片マウスの部分集合は糖尿病ではなく(すなわち、STZ処置なし)、残りは「糖尿病」であった(すなわち、STZ処置あり)。マウス及び非糖尿病マウスにおける移植したステージ7細胞とヒト膵島移植片とを比較する、血中グルコース(mM)(BG-4時間絶食)のグラフを示し、ヒト膵島移植片マウスの部分集合は糖尿病ではなく(すなわち、STZ処置なし)、残りは「糖尿病」であった(すなわち、STZ処置あり)。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14と同じマウス)とを比較するグラフを示し、ランダム給餌マウスでマウスレプチン(ng/ml)を測定した。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14と同じマウス)とを比較するグラフを示し、二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)からの体脂肪量(g)を示す。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14と同じマウス)とを比較するグラフを示し、ランダム給餌マウスの脂肪(g)で割ったマウスレプチン(ng/ml)を示す。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14及び図15と同じマウス)とを比較するグラフを示し、二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)で測定した除脂肪量を示す。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14及び図15と同じマウス)とを比較するグラフを示し、二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)で測定した体脂肪量を示す。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14及び図15と同じマウス)とを比較するグラフを示し、二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)で測定した体脂肪%を示す。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14及び図15と同じマウス)とを比較するグラフを示し、左腎若しくは右腎(移植片を有する腎臓)のいずれか又は両方の腎周囲脂肪質量である。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14及び図15と同じマウス)とを比較するグラフを示し、精巣上体脂肪の質量である。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14及び図15と同じマウス)とを比較するグラフを示し、腸間膜脂肪の質量である。対照マウスと、ステージ7細胞を移植したマウス(S7)及びヒト膵島細胞を移植したマウス(図14及び図15と同じマウス)とを比較するグラフを示し、全ての脂肪パッド質量の合計である。皮下デバイスなし移植マウス及び腎被膜(KC)移植マウスにおいて、対照マウス(細胞移植なし-模擬手術)に対してステージ4及びステージ6細胞移植片を比較するグラフを示し、Cペプチド(ng/ml)を示す。皮下デバイスなし移植マウス及び腎被膜(KC)移植マウスにおいて、対照マウス(細胞移植なし-模擬手術)に対してステージ4及びステージ6細胞移植片を比較するグラフを示し、体重を示す。皮下デバイスなし移植マウス及び腎被膜(KC)移植マウスにおいて、対照マウス(細胞移植なし-模擬手術)に対してステージ4及びステージ6細胞移植片を比較するグラフを示し、週単位の絶食血中グルコースを示す。個々のマウス(X軸に動物番号)におけるTheraCyte社製デバイス内で皮下移植した(S7+TcTx)、又はカプセル化せず腎被膜(KC)下に移植した、ステージ7細胞の移植後の示される時点でのヒトCペプチドの追跡グラフを示し、動物番号10及び40では移植が失敗であった。マウスにおけるTheraCyte社製デバイス(TC)内で皮下移植した、又はカプセル化せず腎被膜(KC)下に移植した、ステージ7細胞の移植後の示される時点でのヒトCペプチドの追跡グラフを示す。

本発明の以下の詳細な説明は、添付した図面と共に読めば、より良く理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、図面は、本発明の実施形態を示す。しかしながら、本発明は、示される正確な配置、実施例、及び道具に限定されない。

本発明は、機能的膵内分泌細胞への更なる分化のための対象への膵内分泌前駆細胞の移植は、単独で又は治療的有効量の抗糖尿病薬の投与との組合せで、対象において体重減少をもたらすという発見を対象とする。加えて、機能的膵内分泌細胞への更なる分化のための膵内分泌前駆細胞の移植を、単独で又は治療的有効量の選択された抗糖尿病薬の投与との組合せで含む、共療法は、2型糖尿病(T2D)モデル哺乳類でグルコース耐性及びインスリン抵抗性の改善をもたらす。

したがって、本発明の実施形態は、対象における肥満を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させる工程とを含む方法を提供する。任意選択で、本方法は、治療的有効量の1つ又は複数の抗糖尿病薬を対象に投与する工程を含むことができる。或いは、本発明の実施形態は、対象における肥満を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、約2%以上の膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法を提供する。任意選択で、本方法は、治療的有効量の1つ又は複数の抗糖尿病薬を対象に投与する工程を含むことができる。加えて、本発明の実施形態は、対象における肥満、グルコース不耐性、及びインスリン抵抗性を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させる工程と、(c)治療的有効量の1つ又は複数の抗糖尿病薬を対象に投与する工程であり、抗糖尿病薬がジペプチジルペプチダーゼ4阻害剤、チアゾリジンジオン、及びビグアナイドからなる群から選択される工程とを含む方法を提供することができる。或いは、本発明の他の実施形態は、対象における肥満を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、約2%以上の膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程とを含む方法を提供する。任意選択で、本方法は、治療的有効量の1つ又は複数の抗糖尿病薬を対象に投与する工程を含む。加えて、本発明は、対象における肥満、グルコース不耐性、及びインスリン抵抗性を治療するための方法であって、(a)膵内分泌前駆細胞集団を対象に移植する工程と、(b)膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、約2%以上の膵内分泌細胞を含む集団を生成する工程と、(c)治療的有効量の1つ又は複数の抗糖尿病薬を対象に投与する工程であり、抗糖尿病薬がジペプチジルペプチダーゼ4阻害剤、チアゾリジンジオン、及びビグアナイドからなる群から選択される工程とを含む方法を提供する。更にいくつかの実施形態では、本明細書で説明するインビトロ成熟プロセスに由来するステージ4、5、6、及び7の細胞
又は膵内分泌細胞を含む、様々な示される膵臓内胚葉系列細胞又は本明細書で膵臓前駆細胞として定義される細胞は、単独で又は組合せで、しかし任意の抗糖尿病薬とは独立して使用することができ、肥満、グルコース不耐性、血糖コントロール、及びインスリン抵抗性を治療するために使用することができる。

本発明で有用な膵内分泌前駆細胞を提供するために使用される幹細胞又は多能性幹細胞は、単一細胞レベルで、自己更新及び分化するそれらの能力により定義される未分化細胞であり、ヒト胚性幹細胞、誘発多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト羊水由来細胞、ヒト胎盤由来細胞、及びヒト単為生殖由来幹細胞を含むが、これらに限定されない。また、幹細胞は、インビトロで多数の胚葉(内胚葉、中胚葉、及び外胚葉)から様々な細胞系列の機能的細胞に分化するそれらの能力により特徴付けられる。また、幹細胞は、移植後に多数の胚葉組織を生じ、胚盤胞への注入後に、全てでなければほとんどの組織に実質的に寄与する。

幹細胞は分化し、分化は、非特殊化(「非委任(uncommitted)」)細胞又はあまり特殊化していない細胞が特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞は、細胞系列内でより特殊化(「委任した」)位置を取った細胞である。「委任した」という用語は、分化のプロセスに適用される場合、正常な状況下では、それが特定の細胞種又は細胞種のサブセットに分化し続け、正常な状況下では、異なる細胞種に分化するか、又はより分化していない細胞種に戻ることができない点まで分化経路を進行した細胞を指す。

マーカーは、幹細胞及び様々な分化した細胞を特徴付けるために使用することができる。「マーカー」は、本明細書で使用される場合、問題の細胞で差次的に発現する核酸又はポリペプチド分子である。これに関連して、差次的発現は、未分化細胞、同じ系列内の別の分化ステージにある細胞、又は異なる系列の細胞と比較して、陽性マーカーに対してレベルの増大及び陰性マーカーに対してレベルの減少を意味する。マーカーである核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して問題の細胞で十分により高いか、又はより低く、そのため、問題の細胞を特定し、本技術分野で既知の様々な方法のいずれかを用いて他の細胞から区別することができる。

分化プロセスは多くの場合、いくつかの連続ステージを通した進行としてみなされる。本発明の一実施形態の目的のために、段階状の分化で、「ステージ1」は、多能性幹細胞が胚体内胚葉の特徴的マーカーを発現する細胞(「ステージ1細胞」)に分化する分化プロセスの第1段階を指す。「ステージ2」は、胚体内胚葉細胞の特徴的マーカーを発現する細胞の、腸管細胞の特徴的マーカーを発現する細胞(「ステージ2細胞」)への分化である、第2段階を指す。「ステージ3」は、腸管細胞の特徴的マーカーを発現する細胞の、前腸内胚葉細胞の特徴的マーカーを発現する細胞(「ステージ3細胞」)への分化である、第3段階を指す。「ステージ4」は、前腸内胚葉細胞の特徴的マーカーを発現する細胞の、膵内分泌前駆細胞の特徴的マーカーを発現する細胞(「ステージ4細胞」)への分化である、第4段階を指す。他の実施形態では、段階状の分化プロセスは、膵臓前腸前駆細胞の、膵内分泌前駆細胞(「ステージ5細胞」)又は未熟な内分泌細胞(「ステージ6細胞」)への分化、及び続いてより成熟した内分泌細胞(「ステージ7細胞」)への更なる分化を含み、各ステージは、所与のステージの細胞に特徴的な特異的マーカーにより特定される。しかしながら、特定の細胞集団は集団中の細胞種のいずれかにより定義され、この細胞種は同じ集団中の他の細胞種と比較してそれらが発現するマーカーにより特定されるので、実際の番号付けたステージは、限定的ではない。

特定の集団中の全ての細胞が同じ速度でステージを進行するわけではないことに留意すべきである。その結果、インビトロ細胞培養物中で、集団中に存在する大多数の細胞より、分化経路をあまり進行していないか、又はより進行した細胞の存在を検出することは、特に後期の分化ステージでは、珍しいことではない。本発明を例示する目的のために、上記に特定したステージと関連付けられる様々な細胞種の特徴を、本明細書で説明する。

「胚体内胚葉」若しくは「内胚葉系列細胞」又はそれらの同義語は、本明細書で使用される場合、以下のマーカー、FOXA2(肝細胞核因子3-ベータ(「HNF3-ベータ」)としても知られる)、GATA4、SOX17、CXCR4、Brachyury、Cerberus、OTX2、グースコイド、C-Kit、CD99、及びMIXL1のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉細胞の特徴的マーカーは、CXCR4、FOXA2、及びSOX17である。

「腸管細胞」又はその同義語は、本明細書で使用される場合、胚体内胚葉細胞により発現されるHNF4-アルファを超える、実質的に増大したHNF4-アルファ発現により特徴付けることができる、胚体内胚葉に由来する細胞を指す。

「前腸内胚葉細胞」若しくは「PDX1膵臓内胚葉細胞」又はそれらの同義語は、本明細書で使用される場合、以下のマーカー、PDX1、FOXA2、CDX2、SOX2、及びHNF4-アルファのうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。前腸内胚葉細胞は、胃管細胞と比較して、PDX1の発現の増大により特徴付けることができる。

「膵臓前腸前駆細胞」若しくは「膵臓前駆細胞」若しくは「ステージ4細胞」(S4細胞)又はそれらの同義語は、本明細書で使用される場合、以下のマーカー、PDX1、NKX6.1、HNF6、SOX9、FOXA2、PTF1a、PROX1、及びHNF4アルファのうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。より具体的には、膵臓前腸前駆細胞は、PDX1、NKX6.1、及びSOX9のうちの少なくとも1つの発現について陽性であること、並びにNGN3及びNeuroDの低い発現により特定することができる。

「膵内分泌前駆細胞」若しくは「ステージ5細胞」(ステージ5細胞)若しくは「膵臓内胚葉細胞」又はそれらの同義語は、本明細書で使用される場合、膵臓ホルモン発現細胞になることができ、以下のマーカー、NGN3、NKX2.2、NeuroD1、ISL1、PDX1、PAX4、PAX6、NKX6.1、又はARXのうちの少なくとも1つを発現する、膵臓内胚葉細胞を指す。膵内分泌前駆細胞は、NKX2.2、NKX6.1、PDX1、及びNeuroD1のそれらの発現により特徴付けることができる。

「膵内分泌細胞」若しくは「膵臓ホルモン発現細胞」若しくは「膵内分泌系列の特徴的マーカーを発現する細胞」若しくは「ステージ6若しくは7細胞」(S6若しくはS7細胞)又はそれらの同義語は、本明細書で使用される場合、以下のホルモン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することができる細胞を指す。これらのホルモンに加えて、膵内分泌細胞の特徴的マーカーは、NGN3、NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、ARX、NKX2.2、MNX1(Hb9)、及びPAX6のうちの1つ又は複数を含む。ベータ細胞の特徴的マーカーを発現する膵内分泌細胞は、インスリン及び以下の転写因子、PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NeuroD1、ISL1、HNF3-ベータ、MAFA、MNX1、及びPAX6のうちの少なくとも1つのそれらの発現により特徴付けることができる。「より成熟した内分泌細胞」は、膵内分泌細胞の特徴的マーカーを発現するが、未熟な内分泌細胞と比較してより成熟した表現型を有し、このことは、より成熟した内分泌細胞は、インスリン+、MAFA+、NKX6.1+、及びPDX1+であるのみでなく、グルコース応答性インスリン分泌を示すことを意味する。

「機能的膵臓ベータ細胞」又は「ベータ細胞」、それらの同義語は、本明細書で使用される場合、US20150353895で言及されるグルコース応答性かつPDX-1及びNKX6.1について陽性であることができるインスリン陽性細胞;又はWO2015002724で言及される「SC-ベータ細胞」を指す。更にいくつかの実施形態では、機能的膵臓ベータ細胞は、インスリン、Cペプチド、PDX1、MAFA、NKX6-1、PAX6、NEUROD1(又はNEUROD)、グルコキナーゼ(GCK)、SLC2A1、PCS1、KCNJ11、ABCC8、SLC30A8、SNAP25、RAB3A、GAD2、PTPRN、NKX2-2、PAX4、IRX1、及びIRX2からなる群から選択される内因性成熟膵臓ベータ細胞の少なくとも1つの特徴的マーカーを発現する。

「適切な増殖因子」若しくは「適切な因子」又はそれらの同義語は、細胞集団をあるステージから別のステージ又は更に分化したステージへ分化させるために使用される特定の増殖因子及び剤を指す。分化段階又はステージの各々のために適切な因子又は剤は、D'Amour, KA.ら、2005;D'Amour, KA.ら、2006;Kroon E.ら、2008;Schulz T.ら、2012;Rezania A.ら、2014;Bruin J.ら、2014;Pagliuca FW.ら、2014;Agulnick A.D.ら、2015 (WO/2014/160413も参照のこと)等で詳細に説明されている。

本発明の方法で有用な細胞は、ステージ4若しくはステージ5膵内分泌前駆細胞、又はステージ6若しくはステージ7膵内分泌細胞、及び成熟ベータ細胞は含まないが、それまでの全ての細胞の任意の集団であってもよく、「膵内分泌前駆細胞」と総称される。或いは、本方法で有用な細胞は、内分泌細胞及びインビトロで成熟した膵内分泌細胞を更に含むことができる。或いは、本発明で有用な細胞は、未成熟膵内分泌細胞、又はインスリン+、MAFA+、NKX6.1+、及びPDX1+であるのみでなく、グルコース応答性インスリン分泌を示す、より成熟した内分泌細胞の集団のいずれかであってもよい。好ましくは、本発明で使用される細胞は、膵内分泌前駆細胞である。

「対象」又はその同義語は、本明細書で使用される場合、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒト成人又は小児を指す。「肥満」は、本明細書で使用される場合、望ましくない、又は対象の理想体重の約20%に等しいか、若しくはそれより多い体脂肪の蓄積を意味する。化合物、増殖因子、又は剤の「有効量」又はその同義語は、細胞培養培地の残りの成分の存在中で、細胞を未分化状態(例えば多能性細胞)に維持するか、又は細胞の分化を促進するかのいずれかに十分な化合物、増殖因子、又は剤の濃度を指す。この濃度は、当業者により容易に決定され、本明細書で説明する細胞種の多くについて、有効量は少なくともD'Amour, KA.ら 2005;D'Amour, KA.ら 2006;Kroon E.ら 2008;Schulz T.ら 2012;Rezania A.ら 2014;Bruin J.ら 2014;Pagliuca FW.ら 2014;Agulnick A.D.ら 2015等で詳細に説明されている。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、同じ処理又は治療的有効量の化合物、増殖因子、又は剤を受けていない細胞培養物と比較されるとおりである。「治療的有効量」又はその同義語は、本明細書で使用される場合、対象に所望の利益を提供するために、単独で又は組合せで与えられる、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を指す。

いくつかの実施形態では、本発明の方法及び共療法は、対象において肥満及びグルコース不耐性の1つ又は両方を治療するために、移植した分化した細胞に加えて抗糖尿病薬を利用する。「抗糖尿病薬」又は「抗糖尿病薬物療法」により、T2Dを有する人において血糖レベルを低下させるよう働く、薬物療法、剤等を意味する。

本発明で有用な抗糖尿病薬は、膵臓からのインスリン放出及び産生を刺激すること、肝臓からのグルコース放出を阻害すること、炭水化物を分解する胃の酵素を阻害すること、インスリンに対する細胞の感受性を改善すること、腎臓におけるグルコース再吸収を阻害すること、又は胃内の食物運動を遅延させることを含む、血糖を低下させるいくつかの様式のいずれかにより働くことができる。これらの抗糖尿病薬は、以下の経口薬物療法:メグリチニド、例えばレパグリニド及びナテグリニド;スルホニル尿素、例えばグリピジド、グリメピリド、及びグリブリド;ジペプチジルペプチダーゼ4(「DPP-4」)阻害剤、例えばサキサグリプチン、シタグリプチン、及びリナグリプチン;ビグアナイド、例えばメトホルミン;チアゾリジンジオン、例えばロシグリタゾン及びピオグリタゾン;アルファ-グルコシダーゼ阻害剤、例えばアカルボース及びミグリトール;ナトリウム-グルコース共輸送体2(「SGLT2」)阻害剤、例えばカナグリフロジン、ダパグリフロジン、及びエンパグリフロジン;並びに胆汁酸封鎖剤、例えばコレセベラムを含む。或いは、注射可能な薬物療法、例えばプラムリンチド(pranlintide)を含むアミリン模倣体、及びGLP-1受容体アゴニスト、例えばエキセナチド及びリラグルチドを含むインクレチン模倣体を含む。

抗糖尿病薬は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医により求められる、組織系、動物、又はヒトで生物学的応答又は薬効応答を引き出す抗糖尿病薬の量を意味する「治療的有効量」で使用され、この生物学的応答又は薬効応答は、治療される疾患若しくは障害の症状の1つ若しくは複数の軽減、又は治療される疾患若しくは障害の1つ若しくは複数の症状の重症度の低減を含む。

任意の多能性幹細胞は、膵内分泌前駆体、膵臓前腸前駆体、及び成熟内分泌細胞を提供するために本発明で使用することができる。使用することができる多能性幹細胞の例示的な種類は、妊娠期間中の任意の時間に、典型的に、しかし必ずではなく、約10〜12週間の妊娠期間の前に採取された前胚組織(例えば胚盤胞)、胚組織、又は胎児組織を含む、確立された多能性細胞株を含む。非限定的な例は、確立されたヒト胚性幹細胞(hESC)株又はヒト胚性生殖細胞株、例えばNIH Human Embryonic Stem Cell Registryで列挙される最近の362種のヒト胚性幹細胞株のいずれかであり、H1(NIHコード:WA01)、H7(NIHコード:WA07)、H9(NIHコード:WA09)(WiCell Research Institute(商標)社、Madison、WI、USA)、SA002(Cellartis AB Corporation(商標)社、Goteburg、Sweden)、CyT49(ViaCyte、Inc.社)を含むが、これらに限定されない。多能性幹細胞マーカーは、例えば以下の、ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81のうちの1つ又は複数の発現を含む。これらはRT-PCR若しくはフローサイトメトリー又は現在若しくは後に開発される同様の技術により検出可能であり得る。

また、既に支持細胞の非存在下で培養した多能性幹細胞集団から採取した細胞は好適である。また、いくつかの多能性関連転写因子、例えばOCT4、NANOG、SOX2、KLF4、及びZFP42(Loh, YH.ら 2011、f;また、IPS、Takahashi, K.及びYamanaka, S. 2006も参照のこと)の強制発現を用いた成人体細胞由来の、人工多能性細胞(IPS)、又は再プログラム化多能性細胞を使用することができる。また、本発明の方法で使用されるヒト胚性幹細胞は、Thomsonら(米国特許第5,843,780号;Thomson, JA.ら 1998;Thomson, JA.及びMarshall, VS. 1998;Thomson, JA.ら 1995)により説明されるように調製することができる。また、突然変異ヒト胚性幹細胞株、例えばBG01v(BresaGen(商標)社、Athens、Georgia.)、又はヒト成人体細胞に由来する細胞、例えばTakahashiら 2007で開示される細胞を使用することができる。ある特定の実施形態では、本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、Liら 2009;Maheraliら 2007;Stadtfeldら 2008;Nakagawaら 2008;Takahashiら 2007;及び米国特許出願公開第2011/0104805号で説明される方法に従って得ることができる。ある特定の実施形態では、本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、「ナイーブ型」であると考えられ、Gafniら 2013、及びWareら 2014で説明される方法に従って得ることができる。

ある特定の実施形態では、多能性幹細胞は、非胚性起源の細胞であってもよい。好適な細胞のまた他の供給源は、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト羊水由来細胞、ヒト胎盤由来細胞、及びヒト単為生殖細胞を含む。一実施形態では、臍帯組織由来細胞は、米国特許第7,510,873号の方法により得ることができる。別の実施形態では、胎盤組織由来細胞は、米国特許出願公開第2005/0058631号の方法を用いて得ることができる。別の実施形態では、羊水由来細胞は、米国特許出願公開第2007/0122903号の方法を用いて得ることができる。これらの特許出願の各々は、細胞の単離及び特徴付けに関係するので、本明細書中にそれを全体として組み込む。

多能性幹細胞は典型的に、様々な様式で多能性幹細胞を支持する一層の支持細胞上で培養される。或いは、多能性幹細胞は、本質的に支持細胞を含まないが、それにもかかわらず実質的な分化を受けることなく多能性幹細胞の増殖を支持する培養系で培養することができる。支持細胞を含まない培養物中の多能性幹細胞の、分化を伴わない成長は多くの場合、以前に別の細胞種を培養することにより調節した培地を用いて支持される。或いは、支持細胞を含まない培養物中の多能性幹細胞の、分化を伴わない成長は、既知組成の培地を用いて支持することができる。

多能性細胞は、様々な支持細胞層を用いて又はマトリックスタンパク質コーティング済み容器を用いることにより培養物中で容易に拡張するさせることができる。或いは、既知組成の培地、例えば商標mTeSR(商標)-1及びTeSR(商標)-2(StemCell Technologies, Inc.(商標)社、Vancouver、B.C.、Canada)として販売されている培地との組合せの化学的に既知組成の表面は、ルーチンの未分化細胞拡張に使用することができる。多能性細胞は、酵素消化、機械的分離、又は様々なカルシウムキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸(「EDTA」)を用いて培養プレートから容易に除去することができる。或いは、任意のマトリックスタンパク質又は支持細胞層の非存在下で懸濁液中にて拡張させることができる。

多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播種することができる。例示的で好適な培養基質は、細胞外マトリックス成分、例えば基底膜に由来する成分、又は接着分子受容体-リガンドカップリングの部分を形成することができる成分である。好適な培養基質は、商標MATRIGEL(商標)(Corning Incorporated(商標)社、Corning、New York)として販売されている再構成基底膜である。

本技術分野で既知の他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は、代替として好適である。増殖させる細胞種によって、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸等を、単独で又は様々な組合せで含むことができる。

多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び望ましい特徴の保持を促進する、好適な分布で、かつ培地の存在下で基質上に播種することができる。

多能性細胞がベータ細胞に向かって分化するとき、それらは様々なステージを通って分化し、これらのステージの各々は特定のマーカーの存在又は非存在により特徴付けることができる。これらのステージへの細胞の分化は、培養培地に添加されるある特定の因子の存在又は欠損を含む特異的な培養条件により達成される。一般的に、このプロセスは、多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化を含む。これらの胚体内胚葉細胞は、その後更に腸管細胞に分化することができ、これは、その後今度は前腸内胚葉細胞に分化することができる。一実施形態では、前腸内胚葉細胞は、膵臓前腸前駆細胞に分化することができ、これは、その後更に膵内分泌前駆細胞に分化することができる。これらの細胞はまた更に、膵臓ホルモン産生又は分泌細胞に分化することができる。別の実施形態では、前腸内胚葉細胞は、膵内分泌前駆細胞に分化し、更に膵臓ホルモン産生又は分泌細胞に分化することができる。

本発明のある特定の実施形態では、膵内分泌前駆細胞の特徴的マーカーを発現する細胞に到達するために、多能性幹細胞で開始するプロトコルが使用される。このプロトコルは、以下のステージを含む。

ステージ1:多能性幹細胞、例えば細胞培養株から得た胚性幹細胞を、適切な因子で処理して、胚体内胚葉細胞の形成を誘発する。

ステージ2:ステージ1で得られた細胞を、適切な因子で処理して、細胞形成を腸管細胞の特徴的マーカーを発現するように誘発する。

ステージ3:ステージ2で得られた細胞を、適切な因子で処理して、前腸内胚葉細胞の特徴的マーカーを発現する細胞への更なる分化を誘発する。

ステージ4:ステージ3で得られた細胞を、適切な因子で処理して、以下のマーカー、PDX1、NKX6.1、HNF1ベータ、PTF1アルファ、HNF6、HNF4アルファ、SOX9、HB9、又はPROX1のうちの少なくとも1つを発現する膵臓の膵臓内胚葉系列の特徴的マーカーを発現する細胞への更なる分化を誘発する。膵臓内胚葉系列の特徴的マーカーを発現する細胞は、実質的にCDX2又はSOX2を発現しない。

ステージ5:ステージ4で得られた細胞を、適切な因子で処理して、膵臓ホルモン発現細胞になることができる膵内分泌前駆細胞の特徴的マーカーを発現する細胞への更なる分化を誘発し、特にNGN3の誘発を最大化する。かかる細胞は、以下のマーカー、NGN3、NKX2.2、NeuroD、ISL-1、Pax4、Pax6、又はARXのうちの少なくとも1つを発現することができる。

ステージ6又はステージ7:ステージ5又は6で得られた細胞を、適切な因子で処理して、インスリンを発現し、グルコース応答性、かつPDX-1及びNKX6.1並びにしばしばMAFAについて陽性であることができる膵内分泌細胞の特徴的マーカーを発現する細胞への更なる分化を誘発する。

本発明は、治療方法、並びに特に肥満、グルコース不耐性、及びインスリン抵抗性のうちの1つ又は複数を患う対象を治療するための方法を提供する。一実施形態では、治療方法は、本発明の方法により得た又は得ることができる細胞を対象に移植する工程を含む。一実施形態では、治療方法は、インビトロで多能性細胞を、例えば本明細書で説明するように、膵臓前駆細胞、膵内分泌細胞、又は成熟内分泌細胞に分化させる工程と、分化した細胞を対象に移植する工程とを含む。別の実施形態では、本方法は更に、多能性幹細胞を分化させる工程の前に、例えば本明細書で説明する多能性幹細胞を培養する工程を含む。また更なる実施形態では、本方法は更に、移植工程後にインビボで細胞を分化させる工程を含む。一実施形態では、本方法のいずれかにより治療される対象は、哺乳類であり、好ましくはヒトである。

一実施形態では、細胞は、分散細胞として移植するか、又は血管系、例えば肝門脈に注入することができるクラスターに形成することができる。或いは、細胞は、宿主の免疫系から細胞を保護するために、生体適合性、多孔性、ポリマー支持体、分解可能デバイス若しくは分解不可能デバイス、又はカプセル化(マクロ又はマイクロカプセル化を使用することができる)で提供することができる。細胞は、例えば肝臓、筋肉脂肪、膵臓、腎臓肩甲下腔、大網、腹膜、漿膜下腔、腸、胃、又は皮下ポケットを含む、受容者の適切な部位に移植することができる。移植部位は、細胞の受け場所があっても、なくても、細胞移植前に血管新生化することができる。例えば、事前血管新生化皮下部位を、膵島細胞移植のために準備することができる(Pepper AR.ら 2015を参照のこと)。実際に、発明者らは、Pepper AR.ら 2015の方法を用いたデバイスなしでの皮下移植後にステージ4及びステージ6細胞の両方が生存し、成熟し、かつ機能する(すなわち、グルコース誘発及びCペプチド放出の両方を示す)ことができることを示している(図示せず)。

保護カプセルを使用して免疫による破壊からベータ細胞を守る試みは、多くの問題を有する(Tang, Q.及びDesai, TA. 2016を参照のこと)。例えば、ベータ細胞をカプセル化するために使用される材料は、免疫細胞及びそれらが生成する毒性分子がベータ細胞に達することを防ぐ一方で、グルコース及びインスリンについて浸透性でなければならない。かかるカプセル中にベータ細胞を密封すると、その構造は膵島の血管新生を妨げ得るため、カプセル化により悪化される状態である虚血の結果として膵島の高割合が移植直後に死滅するので、問題となり得る。更に、カプセル化は、カプセル表面とベータ細胞との間の空間を横切ってグルコース及びインスリンが拡散するのに必要な時間のために、ベータ細胞が血中グルコースレベル変化に応答するスピードを低減し得る。膵島クラスターで、血中グルコース変化とインスリン放出との効率的なカップリングのために各ベータ細胞に隣接する1つの毛管がある。ベータ細胞の生存及び機能の両方の問題は、多くの場合細胞をカプセル化するために使用される材料により誘発される炎症性異物応答(FBR)により悪化し得る。移植受容者のマクロファージは、この材料を外来性と認識し、それらを含有する繊維状の壁を形成し、これはデバイス表面の汚損及びその中の細胞の窒息を引き起こし得る。

インビボで移植細胞の更なる分化、生存、又は活性を向上させるために、追加の因子、例えば増殖因子、抗酸化剤、又は抗炎症剤を、細胞投与前、同時、又は後に投与することができる。これらの因子は、内因性細胞により分泌され、原位置で投与細胞に曝露され得る。移植細胞は、本技術分野で既知の内因性増殖因子及び外因的に投与した増殖因子の任意の組合せにより、分化を誘発することができる。加えて、移植細胞の拒絶を防ぐために、細胞移植前又は後に1つ又は複数の免疫抑制薬を対象に投与することが有益であり得る。

移植で使用される細胞の量は、移植対象の条件、及び移植療法への応答を含むいくつかの因子に依存し、当業者が決定することができる。細胞は、患者への移植前に支持体上でインビトロにて維持することができる。或いは、細胞を含有する支持体は、追加のインビトロ培養をすることなく患者に直接移植することができる。支持体は、任意選択で、移植細胞の生存及び機能を促進する少なくとも1つの医薬剤を組み込むことができる。

インビボ成熟のための膵臓前駆細胞の宿主への移植は、細胞を多くの環境的影響に曝露し、これは、許容的、禁制的、有害、有益、又はこれらのいくつかの組合せであり得る。更に、これらの影響の多くの順列及び組合せは、予想するのが困難であり、影響は多くの因子(例えば、細胞のステージ、細胞種、宿主環境(疾患状態、薬物療法等を含む))に依存することになっている。例えば、T1Dモデル(すなわち、T1D患者における自己免疫応答を模倣するために大量のSTZ用量での膵島破壊による絶対的インスリン欠乏状態であって、これはインスリン投与を必要とするが、インスリン治療の種類によっては、運動及び食物摂取はそれでも高血糖又は低血糖をもたらし得る)における細胞成熟は、T2Dモデル(すなわち、膵島細胞の部分的損傷があり、それらはそれでもインスリンを産生し、いくらかある場合の不十分な量及びインスリン抵抗性が、肝臓による不適切なグルコース放出及びCNSによる不適切な代謝調節のために、血中グルコース増大を引き起こす)とはかなり異なる。更に、インビボでの膵臓前駆細胞成熟に対するT2D糖尿病薬物療法(例えばレパグリニド、ナテグリニド、グリピジド、グリメピリド、グリブリド、サキサグリプチン、シタグリプチン、リナグリプチン、メトホルミン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、アカルボース、ミグリトール、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、及びコレセベラム)の役割は、以前は理解されていなかった。実際に、カルシニューリン阻害剤(例えばシクロスポリン及びタクロリムス)は、膵管ライゲーションモデルで膵臓再生をブロックすることが報告されている(例えばHeit, JJ.ら、2006年;及びNir, T D.ら、2007年を参照のこと)。更に、高脂肪食への曝露は、インビボでの成熟プロセスに影響しないように見える(実施例3を参照のこと)。

移植ベータ細胞からのインスリン置換がT2Dで治療をもたらし得ると予想することは、それを支持する証拠の不足にもかかわらず、可能であった。しかしながら、インスリン分泌前に前もって必要な前駆細胞成熟期間がT2D環境内で増殖する場合にどのように影響を受けるかを予想することはできなかった。血糖症及びインスリン抵抗性(T2Dの重要な特徴)の両方が高まると、ベータ細胞発生を損い得るという証拠がある(例えばJonas, JC.ら 1999;及びKahraman, S.ら 2014を参照のこと)。同様に、食事は、ベータ細胞発生に影響することが示されている(例えば、O'Dowd, JF.及びStocker, CJ. 2013を参照のこと)。したがって、膵臓前駆細胞がベータ細胞に成熟し、続いてこの環境(高血糖、インスリン抵抗性、T2Dと同様)で適切に機能し、これによりグルコースホメオスタシスを改善するかどうかは、実験を必要とした。

本明細書で報告されるように、前駆細胞の分化は雄マウスと雌マウスで異なり(グルコース応答性ベータ細胞への成熟は、雄より雌で速い)、これは私たちが予想しなかったことであり(図示せず;また図12及び図13を参照のこと)、また、甲状腺機能低下環境は膵臓前駆細胞の分化を損うことが発見されている(Bruin, JE.ら「Hypothyroidism impairs human stem cell-derived pancreatic progenitor cell maturation in mice」 Diabetes(2016) pii:db151439.[出版物に先行するEpub]を参照のこと)。したがって、環境の影響は、実際に移植細胞の成熟及び機能の両方を破壊する可能性があり、これは予想不可能である場合があり、そのため、前駆細胞の機能的ベータ細胞への成熟がT2D様パラメーター環境で起こると仮定するべきではなかった。

他の抗糖尿病薬の影響の点で、本発明者らは、インスリン及びエキセンジン-4の短期効果を以前に調べ、両方とも、試験した条件下では顕著な効果を有さなかった(例えばBruin, JE.ら 2013を参照のこと)。しかしながら、免疫抑制薬等の薬物はベータ細胞再生を損い得ることを他の研究者らが報告している(例えばNir T.ら 2007を参照のこと)。

材料及び方法
hESCのインビトロ分化及び膵臓前駆細胞の評価
H1 hESC株をWiCell Research Institute(商標)社から得た。The University of British Columbia(UBC)でのH1細胞を用いた全ての実験は、Canadian Stem Cell Oversight Committee及びUBC Clinical Research Ethics Boardにより承認された。多能性H1細胞を、以前に説明した(Bruinら、2013年)本発明者らの14日間4ステージプロトコルに従って膵臓前駆細胞に分化させた。膵臓前駆細胞又は内分泌前駆体及び膵内分泌細胞を生成するための他の分化プロトコルは、使用可能であり、少なくとも生理学的グルコースレベルに応答してインスリンを分泌する細胞になるように発生及び成熟することが示されている(Kroon E.ら、2008年;Schulz T.ら、2012年;Rezaniaら、2014年;Pagliuca, FW.ら、2014年;Agulnick, AD.ら、2015年;及びRuss, HA,ら、2015年)。重要な膵臓前駆細胞マーカー又は内分泌細胞マーカーの発現は、特注Taqman(商標)qPCR Arrays(Applied Biosystems(商標)社)を含む周知の方法を用いて移植前に評価される。

フローサイトメトリー
以前に説明されるように(Rezaniaら 2012)、分化した細胞を単一細胞懸濁液に放出し、固定し、透過処理し、様々な細胞内マーカーについて染色した。死細胞をFACS分析中に除外し、ゲーティングはアイソタイプ抗体を用いて決定した。抗体の詳細についてはTABLE1(表1)を参照のこと。

動物
雄SCIDベージュマウス(C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-LystbgN7、8〜10週齢、Taconic(商標)社)を、研究全体を通して12時間の明暗周期で維持した。全ての実験はUBC Animal Care Committeeにより承認され、Canadian Council on Animal Careガイドラインに従って行った。

食餌及び薬物投与
全てのマウスは、UBCに到着後順応させるために2週間、標準の放射線照射食餌(Harlan Laboratories(商標)社、Teklad(商標)食餌2918番)を自由に利用させた。第1のコホートでは、マウスを4つの異なる食餌レジメン(Research Diets(商標)社)のうちの1つに設定し、36週間研究した(1種類の食餌当たりn=11):(1)「10%脂肪」対照食(D12450K、10kcal%脂肪、70kcal%炭水化物(ショ糖なし))、(2)「45%脂肪」食(D12451、45kcal%脂肪(主にラード)、35kcal%炭水化物)、(3)「60%脂肪」食(D12492、60kcal%脂肪(主にラード)、20kcal%炭水化物)、又は(4)「西欧」食(D12079B、41kcal%脂肪(主に乳脂肪)、43kcal%炭水化物(主にショ糖))。

第2のコホートでは、マウスを10%脂肪対照食(D12450K;n=8)に研究期間中、又は60%脂肪食(D12492;n=64)に6週間のいずれかに設定し、研究の残りの期間中以下の処置レジメンのうちの1つを行った(1群当たりn=16):(1)60%脂肪食、薬物なし(D12492)、(2)60%脂肪食、ロシグリタゾンを含有する(食餌1kg当たり18mg又は1日当たり体重1kg当たり約3mg;Cayman Chemical(商標)社;Research Diets(商標)社特注食餌処方D08121002)、(3)60%脂肪食、シタグリプチンを含有する(食餌1kg当たり4g又は1日当たり体重1kg当たり約750mg;シタグリプチンリン酸塩一水和物、BioVision(商標)社;Research Diets(商標)社特注食餌処方D08062502R)、又は(4)60%脂肪食(D12492)及び飲料水中のメトホルミン(1,1-ジメチルビグアナイド塩酸塩)(1.25mg/ml又は1日当たり体重1kg当たり約250mg)。

1型糖尿病(T1D)を誘発するためには、ストレプトゾトシン(STZ)の単回高用量注射、例えば190mg/kg(Rezaniaら 2012を参照のこと)、しかし50mg/kgを超えるいくらかであってもよく、しかし典型的には150mg/kg超である。しかし、単回高用量は、ベータ細胞の迅速かつほぼ完全な破壊を模倣するが、T1Dの自己免疫成分を欠く。或いは、T1Dは、げっ歯類でSTZの数回の低用量注射で誘発することができ、免疫及び炎症性反応を引き起こし、これは多くの場合、ベータ細胞の破壊を引き起こす。対照的に、高脂肪食(HFD)と組合せたSTZの単回低用量(15〜50mg/kgのいくらか)は、炎症と関連付けられるT2Dにおけるベータ細胞破壊の遅い進行をより良く模倣すると考えられる。或いは、HFD(低用量STZなし)は、T2Dモデルを発生させるために使用することができる(Bruinら 2015を参照のこと)。それにもかかわらず、マウスが血中グルコース上昇及び体重増加を伴うHFDに応答しない場合、低用量のSTZを投与することができる。

移植のための膵臓前駆細胞、特に後期ステージ細胞の生成のための多くの方法は、本技術分野で周知である(例えばRezania, A.ら 2014;Pagliuca, FW.ら 2014;Agulnick, AD.ら 2015;及びRuss, HA,ら 2015を参照のこと)。

hESC由来膵臓前駆細胞の移植
マクロカプセル化膵臓前駆細胞の移植のために使用される手順は以下のとおりである。同様のマクロカプセル化膵内分泌前駆細胞又はインスリン産生細胞の移植は、Rezaniaら 2014;Pagliuccaら 2014;及びAgulnick A.D.ら 2015で説明された。全てのマウスを吸入イソフルランで麻酔し、以前に説明するように(Bruinら2013)、移植受容動物は約5×10⁶個のhESC由来膵臓前駆細胞を右脇腹の皮下に(s.c.)、20μlのTheracyte(商標)社マクロカプセル化デバイス(TheraCyte Inc.(商標)社、Laguna Hills、CA)内で受容した。模擬マウスは、同じ手術手順を受けたが、マクロカプセル化デバイスを移植しなかった。第1のコホートでは、マウスを、7週間のLFD又はHFD給餌後、細胞移植(Tx、食餌当たりn=7)又は模擬手術(模擬、食餌当たりn=4)のいずれかを受けるようにランダムに割り当てた。第2のコホートでは、HFD給餌マウス(+/-薬物処置)は、抗糖尿病薬の投与1週間後に、移植(群当たりn=8)又は模擬手術(群当たりn=8)のいずれかを受けた。LFD対照は全て、模擬手術を受けた。処置群を、TABLE2(表2)に要約する。

代謝評価
全ての代謝分析を知覚反応があるおとなしいマウスで行い、血液試料を、伏在静脈を介して回収した。BW及び血中グルコースレベルを、各研究全体を通して定期的に4時間の午前絶食後に評価した。全ての他の代謝試験のために、血液を絶食後(時間0)及び様々な分泌促進物質の投与後の示される時点で回収した。

6時間の午前絶食、及び経口胃管栄養又は腹腔内(i.p.)注射(BW1kg当たり2グルコース、30%溶液;Vetoquinol(商標)社、Lavaltrie、QC)によるグルコース投与後に、グルコース耐性試験(GTT)を行った。移植した細胞からのグルコースで刺激されたヒトCペプチド分泌を、一晩絶食及びグルコース(2g/kg)のi.p.注射後に評価した。4時間の午前絶食及びヒト合成インスリンの投与(体重1kg当たり0.7IU;Novolin ge(商標)Toronto、Novo Nordisk(商標)社、Mississaugua、Canada)後に、インスリン耐性試験(ITT)を行った。毎月の混合食負荷のために、マウスは、一晩絶食(約16時間)後に、Ensure(商標)(体重1g当たり8μL;Abbott Laboratories(商標)社、Abbott Park、Illinois、USA)の経口胃管栄養を受容した。アルギニン耐性試験(ArgTT)のために、マウスは、4時間の午前絶食後に、アルギニンのi.p.注射(2g/kg、40%溶液;Sigma-Aldrich(商標)社)を受容した。血糖レベルを携帯用血糖値測定器(Lifescan(商標)社、Burnaby、Canada)を用いて測定した。マウスのホルモン及び脂質プロファイルを以下のキット、レプチン(マウスレプチンELISA、Crystal ChemInc.(商標)社、Downers Grove、IL)、インスリン(超高感度マウスインスリンELISA、Alpco Diagnostics(商標)社、Salem、NH)、Cペプチド(マウスCペプチドELISA、Alpco Diagnostics(商標)社)、トリグリセリド(血漿トリグリセリドキット、Sigma-Aldrich(商標)社)、遊離脂肪酸(NEFA-HR(2)キット、Wako Chemical(商標)社、Richmond、VA)、及びコレステロール(コレステロールE(商標)キット、Wako Chemical(商標)社)を用いて血漿中で評価した。移植したhESC由来細胞からのホルモン分泌を、血漿ヒトCペプチド(CペプチドELISA、80-CPTHU-E01.1;Alpco Diagnostics(商標)社)並びにヒトインスリン及びグルカゴンレベル(K15160C-2;Meso Scale Discovery(商標)社、Gaithersburg、MD)を測定することにより評価した。ヘモグロビンA1c(HbA1c)レベルを、抗凝血剤としてEDTAを含む伏在静脈から回収した全血からSiemens DCA 200 Vantage Analyzer(商標)(Siemens Healthcare Diagnostics(商標)社、Tarrytown、NY)で測定した。

二重エネルギーX線吸収測定法
体組成を、PIXImus Mouse Densitometer(商標)(Inside Outside Sales(商標)社)で二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)を用いて決定した。データを%脂肪として表す。

qRT-PCR
Theracyte(商標)社製デバイスを、コホート1から移植29週間後に回収し、qPCR分析のために保存した。qPCR分析、ヒト膵島ドナー、及び移植した組織からRNAを単離するために使用した手順を以下に説明する。

Theracyte(商標)社製デバイスを組織回収時に半分に切断し、使用するまでRNA Later Stabilization Solution(商標)(Life Technologies(商標)社、Carlsbad、CA)中で-80℃にて保存した。最初に余分のマウス組織をデバイスの外側から除去し、その後デバイスを2mLのPBSに入れた。デバイスの端部を切り落とし、外側の膜を剥がし戻し、デバイスを単離し、0.1%(v/v)のベータ-メルカプトエタノールを含有する400μlのQiagen Buffer RLT Plus(商標)(Qiagen Inc.(商標)社、Valencia、CA)に入れた。PBSを回収し、2000×gで4分間遠心分離して、デバイスから溢れ出た任意の細胞を回収した。細胞ペレットを、対応するデバイスを溶解するために使用したのと同じRLT Plus緩衝液中に再懸濁した。RNAをQiagen RNeasy Plus Mini(商標)キット(Qiagen Inc.(商標)社)を用いて単離し、16μlのヌクレアーゼ非含有水中に溶離した。RNA濃度をNanoDrop8000(Thermo Scientific(商標)社)を用いて測定した。qPCR分析(ProdoLabs(商標)社、Irvine、CA)のための陽性対照として、ヒト膵島を4人の器官ドナー(23〜48歳;男性2人及び女性2人)から得た。膵島純度は85〜95%、生存度は90〜95%に及んだ。全てのヒト膵島調製物は、以前に示されるように(Rezaniaら 2014)静的グルコース刺激インスリン分泌アッセイを用いて高グルコース濃度でインキュベーション後、ヒトインスリン分泌の2〜4倍増大を示した(図示せず)。

デバイス中のヒト細胞/組織の少ない量、及びRNAのいくらかは周囲のマウス組織に由来するという高い可能性のために、ヒトRNAの量を、標準曲線を用いて測定した。最初に、全てのRNAを、High Capacity cDNA Reverse Transcription(商標)キット(Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社)を用いて以下のプログラム:25℃で10分間、37℃で2時間、4℃で維持にて、cDNAに変換した。事前増幅を遺伝子ラン(TABLE3(表3))に特異的なプライマープール及びTaqMan PreAmp(商標)2x Master Mix(Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社)を用いて以下の周期条件:95℃で10分間、95℃で15秒間及び60℃で4分間を8周期、99℃で10分間、並びに4℃で維持にて行った。ヒトcDNAの量を決定するために、リアルタイムPCRを、ヒトGAPDH及びマウスGapdhに特異的なプライマーを用いて事前に増幅したcDNAについて行い、ヒト細胞株からの既知の量のcDNAから作成した標準曲線に対して測定した。16ngの計算したヒトcDNAを、特注TaqMan Low Density Array(商標)(Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社、TABLE3(表3))でQuant Studio 12K Flex Real Time PCR(商標)器具(Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社)を用いて測定した。データをExpression Suite(商標)ソフトウェア(v1.0.3、Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社)を用いて分析し、デルタデルタCt法を用いて未分化H1細胞に対して正規化した。内因性膵臓ベータ及びアルファ細胞面積を測定するための免疫蛍光染色及び画像定量のために、動物1匹当たり3つの少なくとも200μm分離した膵臓切片をインスリン及びグルカゴンについて免疫染色した。スライド全体の蛍光走査をImage Xpress Micro TM Imaging System(商標)を用いて行い、画像をつなぎ合わせ、MetaXpress Software(商標)(Molecular Devices Corporation(商標)社、Sunnyvale、CA)を用いて分析した。ベータ細胞又はアルファ細胞画分を、インスリン陽性又はグルカゴン陽性面積/全膵臓面積として計算し、それから動物1匹当たり3つの切片の平均に膵臓質量を掛けた。デバイス内の内分泌組成を定量するために、DAPI陽性核の数をMulti Wavelength Cell Scoring(商標)を用いてカウントするか、又は両方のホルモンを処置群盲検法により調査者が手動でカウントした。プライマーをTABLE3(表3)に列挙する。

免疫蛍光染色及び画像定量
移植前に、分化した膵臓前駆細胞の一部を4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で一晩固定し、その後1%アガロース中に包埋し、その後パラフィン包埋した。コホート1では、Theractye(商標)社製デバイス及び様々な組織(腎周囲脂肪組織、回腸、骨格筋、盲腸、空腸、脾臓、結腸、腎臓、胃の腺性部位、十二指腸、肝臓、胃の非腺性部位、心臓、肺、及び精巣)を移植29週間後に回収し、4%PFA中に固定し、70%EtOH中に保存し、その後パラフィン包埋した。全てのパラフィン切片(5mmの厚さ)をWax-it Histology Services(商標)社により調製した。免疫蛍光染色を、以前に説明されるように(Rezaniaら 2011)行い、一次抗体についての詳細をTABLE4(表4)に示す。H&E染色を標準の手順に従って行い、組織分析を独立した病理学者により盲検様式で行った(Nova Pathology PC(商標)社)。

統計分析
全ての統計分析をGraphPad Prism(商標)ソフトウェア(GraphPad Software(商標)社)を用いて行った。HFDマウスをLFD対照と様々な時点で比較するために、二元配置反復測定ANOVAをフィッシャーLSD事後試験で行った。各処置群内で様々な時点の値を基線レベル(時間0)と比較するために、一元配置反復測定ANOVAをダネット事後で行った。10%脂肪対照に対する多重比較のために一元配置ANOVAをダネット事後試験で、又は多数の群間で比較するためにスチューデント=ニューマン=コイルス試験を行った。様々な処置群からのグラフを、薬物処置を伴わないヒト膵島又はHFD給餌マウスのいずれかと比較するために、qPCRデータをフィッシャーLSD事後試験で一元配置ANOVAにより評価した。単一の処置群内で(すなわち、模擬対tx)移植の効果を比較するために、独立t検定を使用し、インスリン又はグルカゴン分泌促進物質(グルコース、経口食餌、アルギニン)の投与前後の試料を比較する場合、対応t検定を使用した。y=0を基線として、曲線下面積を計算した。ITTについては、曲線より上の面積を、各動物についての絶食血中グルコースレベルを基線として用いて計算した。全ての分析について、p<0.05を統計的に有意であると考えた。データは、平均値±SEM(線グラフ)として、又は個々のデータ点を示す箱ひげプロットとして示す。

SH-1533の細胞調製:S4D4 IDPの高度分化9日目への高度分化
S4D4 IDP細胞を解凍して、2つの500ml PBS-MINI垂直スピナーの各々に、1スピナー当たり400mlのステージ5解凍培地を伴って入れた。細胞懸濁液中のDMSOの十分な希釈を確実にするために、細胞がバイアルの底部に沈降している状態で、約3mlの凍結保存培地を各バイアルから吸引し、その後細胞をPBS-MINIスピナーに移した。続いて、解凍培地をスピナーに一滴ずつ添加して、細胞集団を希釈した。解凍培地は、2%KSR、1:200 ITS-X、10μg/mlヘパリン、100nM LDN、1μM T3、5μM ALK5i、250nM SANT-1、50nM RA、10μM Y-27632、及び4ku/ml DNアーゼを補充したDMEM-HG培地からなった。各容器を、25RPMに設定したBSC中のPBS-MINIベース上に置き、2×5ml試料をaccutaseカウント法及びNC100 NucleoCounterを用いた細胞カウントのために引いた。容器をその後、20RPMに設定したPBS-MINIベース上の37℃、5%CO₂インキュベーター内で一晩培養した。

一晩培養後、細胞を含有する各容器をBSCに約5〜10分間入れて、細胞をスピナーの底部に沈降させた。消費された培養培地の大部分を容器から吸引し、新しいステージ5培地は、2% KSR、1:200 ITS-X、10μg/mlヘパリン、100nΜ LDN、lμM T3、5μM ALK5i、250nM SANT-1、及び50nM RAを補充したDMEM-HG培地を含有した。各容器を25RPMに設定したBSC中のPBS-MINIベース上に置き、2×5ml試料をaccutaseカウント法及びNC100 NucleoCounterを用いた細胞カウントのために引いた。培養物をその後、上記に説明するように再び一晩培養したが、ただし、ベーススピードは、クラスターの凝集を減少させるのを補助するために22RPMに増大させた。

培養3日目に、培地を、全てのステージ5成分を含有し、かつ100nMガンマセクレターゼ阻害剤(XX)を添加したステージ6培地に変えた。S6D7完了まで、毎日ステージ6培地の交換を行いながら培養を続け、S6D7完了時に細胞を洗浄及び分取のために灌流スピナーに移した。細胞をスピナーフラスコ上のサンプリングポート及び10ccシリンジを用いて1分取当たり500万個細胞になるように分取し、その後腎被膜移植のために1.5ml遠心分離管に移した。腎被膜一定分量を、2% KSR、1:200 ITS-X、及び10μg/mlヘパリンを補充したDMEM-HG基礎培地中で環境温度にて宅配便により移植現場に即座に移した。FACS、PCR、IHC、及び位相差画像化により、S6D7の細胞集団についてバイオマーカー発現チェックを行った。無菌試料を全ての腎被膜一定分量からの試薬及び残留培地から回収し、その後移植した。

図12、図13。雄及び雌のSCIDベージュマウス(C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdc^scid-Lyst^bgN7;Taconic社、Hudson、NY)は、標準の放射線照射食餌(Teklad食餌2918番、Harlan Laboratories社、Madison、WI、USA)を自由に利用させ、研究全体を通して12時間の明暗周期で維持した。7週齢で、全てのマウスを吸入イソフルランで麻酔し、移植受容動物は、約5×10⁶個のステージ4細胞(5M S4)、約1×10⁶個のステージ4細胞(1M S4)、又は約1×10⁶個のステージ7細胞(1M S7)のいずれかを左脇腹の腎被膜下に受容した:5M S4雌(N=10)、5M S4雄(N=11)、lM S4雄(N=5)、lM S7雌(N=9)、lM S7雄(N=9)。分化したヒトES細胞を、Rezania, A.ら 2014で説明される方法を用いて生成した。体重を、研究全体を通して隔週又は毎月、4時間の午前絶食後に評価した。

図14。6週齢の免疫無防備状態のSCIDベージュマウスを、到着後1週間順応させた。動物にその後、190mg/kgのベータ細胞毒ストレプトゾトシン(STZ)の単回用量を注射して、1型糖尿病モデルを誘発した。Rezania, A.ら 2014で説明される方法を用いて生成した150万個のステージ7細胞、又は約6000個の単離したヒト膵島均等物(IEQ)を腎被膜下に移植した。対照マウスは、STZも細胞移植も受容しなかった。マウスを続いて4時間絶食血中グルコースレベル及び体重について毎週モニターした。ヒト膵島受容マウスは、非STZ処置マウスに加えて、以前にSTZを注射したが、正常血糖に戻ったマウスからなり、ただし、1匹の動物は高血糖であった。

図15A。グルコース測定及び試料採取のための血液は、知覚反応があるおとなしいマウスの伏在静脈から得た。ホルモン検出のために、血液をヘパリン添加細管に回収し、氷上で1.5ml管に移し、7000rpmで9分間のスピン後に血漿を血液細胞から分離した。試料を-30℃で保存し、その後ELISAによりレプチンについてアッセイした。

図15B〜図17。マウスの体組成を、イソフルランで麻酔したマウスについて二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)測定により代謝ケージ分析後の日に測定した。脂肪パッド及び器官の質量を、組織の解剖及び即時計量により決定した。

図18。冷凍保存したステージ4細胞をステージ6細胞に分化させるために、細胞を解凍して、2つの500ml PBS-MINI垂直スピナーの各々に、1スピナー当たり400mlのステージ5解凍培地を伴って入れた。細胞懸濁液中のDMSOの十分な希釈を確実にするために、細胞がバイアルの底部に沈降している状態で、約3mlの凍結保存培地を各バイアルから吸引し、その後細胞をPBS-MINIスピナーに移した。続いて、解凍培地をスピナーに一滴ずつ添加して、集団を希釈した。解凍培地は、2%KSR、1:200 ITS-X、10μg/mlヘパリン、100nM LDN、1μM T3、5μM ALK5i、250nM SANT-1、50nM RA、10μM Y-27632、及び4ku/ml DNアーゼを補充したDMEM-HG培地からなった。各容器を、25RPMに設定したBSC中のPBS-MINIベース上に置き、2×5ml試料をaccutaseカウント法及びNC100 NucleoCounterを用いた細胞カウントのために引いた。容器をその後、20RPMに設定したPBS-MINIベース上の37℃、5%CO₂インキュベーター内で一晩培養した。一晩培養後、細胞を含有する各容器をBSCに約5〜10分間入れて、細胞をスピナーの底部に沈降させた。消費された培養培地の大部分を容器から吸引し、新しいステージ5培地は、2% KSR、1:200 ITS-X、10μg/mlヘパリン、100nΜ LDN、lμM T3、5μM ALK5i、250nM SANT-1、及び50nM RAを補充したDMEM-HG培地を含有した。各容器を25RPMに設定したBSC中のPBS-MINIベース上に置き、2×5ml試料をaccutaseカウント法及びNC100 NucleoCounterを用いた細胞カウントのために引いた。培養物をその後、上記に説明するように再び一晩培養したが、ただし、ベーススピードは、クラスターの凝集を減少させるのを補助するために22RPMに増大させた。培養3日目に、培地を、全てのステージ5成分を含有し、かつ100nMガンマセクレターゼ阻害剤(XX)を添加したステージ6培地に変えた。S6D7完了まで、毎日ステージ6培地の交換を行いながら培養を続け、S6D7完了時に細胞を洗浄及び分取のために灌流スピナーに移した。細胞を移植のために分取した。

細胞移植は、腎被膜下、又はPepper, AR.ら 2015により説明される皮下デバイスなしポケットのいずれかであった。具体的には、細胞移植4週間前に5-French(Fr.)加工ナイロン放射線不透過性血管造影カテーテルの2cm区分を、SCIDベージュマウスの左下腹部に皮下移植した。尾部から胸郭の4mm側面横切開を行い、鈍的剥離を用いて切開線下に小ポケットを創出した。十分な隙間(1cm×3cm)を創出した。カテーテル区分をこの空間に移植し、そのため、カテーテルは正中線と平行して置かれた。切開を縫合閉鎖した。移植すると、カテーテルは血液タンパク質と接着し、密に血管新生化した組織の形成をもたらし、これは最小限に明らかなプロファイルを示した。移植時に、カテーテルを除去すると、細胞移植注入を可能にする血管新生化内腔が現れた。

デバイスなし受容マウスを吸入イソフルランでの麻酔下で維持し、仰臥位に置いた。移植したカテーテル周囲の領域を剃毛及び表面消毒により準備した。頭蓋から移植したカテーテルの上方端部で、小(4mm)切開を行い、カテーテルに到達した。カテーテルの上方縁周囲の組織マトリックスを切り裂いて、カテーテルを引いて除去した。細胞をその後、ピペット先端を用いてこの空間に送達した。切開を縫合閉鎖した。回復前に、受容動物は、ブプレノルフィンの0.1mg/kg皮下ボーラスを受容した。

対照動物は、げっ歯類膵島移植の標準部位である腎被膜下に同じ用量の細胞を受容した。全ての実験について、細胞をプールし、一括し、DL又はKC部位のいずれかにランダムに割り当てて移植した。KC移植を促進するために、左側面腰部隣接肋骨下切開を行い、左腎をその創傷に送達した。腎被膜を切開し、被膜下に空間を作製して、PE-50配管を用いた細胞の移植を可能にした。肋骨下切開を2層で閉鎖した。

動物を体重及び4時間絶食血糖症について規則的間隔でモニターした。移植2、6、及び10週間後にランダム給餌マウスの伏在静脈から血液を回収し、血漿をELISA(Alpco社)によりヒトCペプチドについてアッセイした。

本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮することにより更に明らかになる。

これらの実施例で使用した全ての代謝分析は、伏在静脈を介して回収した血液試料を用いて行った。体重及び血中グルコースレベルを、各研究全体を通して4時間の午前絶食後に規則的に評価した。全ての他の代謝試験のために、血液を、絶食後(時間0)及び様々な分泌促進物質の投与後の示される時点で回収した。体組成を、PIXImus Mouse Densitometer(商標)(Inside Outside Sales(商標)社、Madison、WI)で二重エネルギーX線吸収測定法(「DEXA」)を用いて決定した。データを%脂肪として表す。

(実施例1)
免疫不全マウスにおける肥満及び2型糖尿病(T2D)のモデルの開発
実施例を行う目的のために、8〜10週齢の雄SCIDベージュマウス(C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdc^scid-Lyst^bgN7;Taconic(商標)社、Hudson、NY)を、12時間の明暗周期で維持した。全てのマウスに、順応させるために2週間、標準の放射線照射食餌(Harlan Laboratories(商標)社、Teklad食餌(商標)2918番、Madison、WI)を自由に利用させた。マウスを4つの異なる食餌レジメン(Research Diets(商標)社、New Brunswick、NJ、USA)のうちの1つに設定し、36週間研究した(1種類の食餌当たりn=11):1)「10%脂肪」対照食(D12450K:10kcal%脂肪、70kcal%炭水化物(ショ糖なし))、2)「45%脂肪」食(D12451:45kcal%脂肪(主にラード)、35kcal%炭水化物)、3)「60%脂肪」食(D12492:60kcal%脂肪(主にラード)、20kcal%炭水化物)、又は4)「西欧」食(D12079B:41kcal%脂肪(主に乳脂肪)、43kcal%炭水化物(主にショ糖))。

血中グルコースレベルを携帯用血中グルコース値測定器(Lifescan(商標)社、Milpitas、California)を用いて測定した。マウスホルモン及び脂質プロファイルを以下のキット:レプチン(マウスレプチンELISA、Crystal Chem lnc.(商標)社、Downers Grove、IL)、インスリン(超高感度マウスインスリンELISA、Alpco Diagnostics(商標)社、Salem、NH)、Cペプチド(マウスCペプチドELISA、Alpco Diagnostics(商標)社)、トリグリセリド(Serum Triglyceride(商標)キット、Sigma-Aldrich(商標)社)、遊離脂肪酸(NEFA-HR(2)キット、Wako Chemical(商標)社、Richmond、VA)、及びコレステロール(Cholesterol Eキット(商標)、Wako Chemical(商標)社)を用いて血漿中で評価した。移植したhESC由来細胞からのホルモン分泌を、血漿ヒトCペプチド(CペプチドELISA、80-CPTHU-E01.1;Alpco Diagnostics(商標)社)及びヒトインスリン及びグルカゴンレベル(K15160C-2;Meso Scale Discovery(商標)社、Gaithersburg、MD)を測定することにより評価した。ヘモグロビンA1c(HbA1c)レベルを、抗凝血剤としてEDTAを含む伏在静脈から回収した全血からSiemens DCA 200 Vantage Analyzer(商標)(Siemens Healthcare Diagnostics(商標)社、Tarrytown、NY)で測定した。

図1及び図7は、様々な食餌のマウスにおける体重増加、グルコースホメオスタシス測定、及び脂肪細胞の特徴付けを示す。全ての3種の高脂肪食(HFD;45%脂肪、60%脂肪、及び西欧)は、低脂肪食(LFD)対照(10%脂肪)と比較して絶食体重(図1A)及び血中グルコースレベル(図1B)の急速な増大を誘発した。更に、5日後、全ての3種のHFD群のマウスは、体重における相違(図7B)より前に、LFD対照と比較して重度のグルコース不耐性(図7A)であった。32日目に、HFDマウスは、LFD対照よりグルコース不耐性(図7C)で、かつ顕著に体重が重かった(図7D)。45%及び60%脂肪食給餌マウスは、42日目で明白にインスリン抵抗性であり(LFD対照に対して、インスリン後10及び60〜120分でのより高いグルコースレベル、及び低減した曲線より上の面積)、一方で西欧食マウスは、インスリン投与後10分で顕著なインスリン抵抗性を示したのみであった(図1E)。

全てのHFD群のマウスは、グルコース不耐性を発症し(47日目、図1C)、LFD対照とは異なったインスリン分泌速度論を有した(グルコース誘発インスリン分泌がないか、又はピークインスリンレベルの時間が変わった;図1D)。全てのHFDマウスは、LFD対照と比較して顕著に過体重であり(図1A)、かつ脂肪症を増大しており(図1F)、また、45%及び60%脂肪食給餌マウスは、顕著に上昇した循環レプチンレベルを有した(図1G)。HFDへの曝露は、全てのHFD給餌マウスにおける血漿遊離脂肪酸レベルの顕著な低減(図7E)、45%及び60%脂肪群におけるトリグリセリドレベルの低減(図7F)、及びLFD対照と比較した西欧食群におけるコレステロールレベルの上昇(図7G)を含む、脂質異常症を引き起こした。免疫不全マウスにおけるHFD誘発代謝障害は、脂肪組織におけるマクロファージ浸潤を伴わなかった(F4/80免疫反応性により示され、一方で、T2Dの免疫適格性モデルであるob/obマウスの精巣上体脂肪ではF4/80陽性王冠様構造の顕著な蓄積が観察された(顕微鏡写真示さず))。36週間10%又は60%脂肪食のいずれかを給餌した実施例1のマウス及びob/obマウスの精巣上体脂肪の免疫蛍光染色を行い、ここで、F4/80及びFGF21は、それぞれ、マクロファージ及び脂肪細胞マーカーである。

(実施例2)
ヒト胚性幹細胞からの膵内分泌前駆細胞のインビトロでの作成
ヒト胚性幹細胞株H1細胞(WA01細胞、WiCell Research Institute(商標)社、Madison、WI)を、mTeSR-1(商標)(Stem Cell Technologies(商標)社、Vancouver、BC;カタログ番号05850)中に1:30希釈したMATRIGEL(商標)(Becton Dickinson Biosciences(商標)社、Franklin Lakes、NJ;カタログ番号356231)でコーティングした皿上に1×10⁵/cm²で単一細胞として播種した。約70〜80%コンフルエントで、H1細胞培養物をMg2+及びCa2+を含まない1×Dulbeccoリン酸緩衝食塩水(Invitrogen(商標)社、Carlsbad、CA;カタログ番号14190)ですすぎ、続いて0.02%Versene(商標)(「EDTA」)(Lonza(商標)社、Walkersville、MD;カタログ番号17-711E)で室温にて12分間インキュベートした。放出された単一細胞をmTeSR-1(商標)ですすぎ、1000rpmで5分間スピンした。得られた細胞ペレットを、10μMのROCK阻害剤Y-27632(商標)(Sigma-Aldrich(商標)社、St. Louis Missouri;カタログ番号Y0503)を補充したmTeSR-1(商標)培地中に再懸濁し、単一細胞懸濁液を約1.3×10⁵細胞/cm²で播種した。毎日培地交換し、播種48時間後に分化を開始させ、約90%開始コンフルエントを得た。以下のプロトコルを用いて培養物を分化させた。

ステージ1(3日間):MATRIGEL(商標)コーティングした表面上に播種した未分化H1細胞(90%コンフルエント)を、1.2g/L重炭酸ナトリウム(Sigma-Aldrich(商標)社、カタログ番号S6297)、0.2%ウシ胎仔血清(「FBS」)(Hyclone(商標)社、South Logan、UT;カタログ番号SH30071.02)、100ng/mLアクチビンA(「AA」)(Peprotech(商標)社、Rocky Hill、NJ;カタログ番号338-AC-010)、及び20ng/mLのWnt3A(R&D Systems, Inc.(商標)社、Minneapolis、MN;カタログ番号5036-WN)を補充したRPMI 1640(商標)培地(Invitrogen(商標)社、カタログ番号22400)に1日目の間のみ曝露した。次の2日間、細胞を、0.5%FBS、1.2g/L重炭酸ナトリウム、及び100ng/mL AAを伴うRPMI中で培養した。

ステージ2(3日間):ステージ1細胞を、2g/L重炭酸ナトリウム、2%FBS、及び50ng/mLのFGF7(Peprotech(商標)社、カタログ番号100-19)を補充したDMEM-F12培地(Invitrogen(商標)社(Gibco(商標)社);カタログ番号10565-018)中で3日間培養した。

ステージ3(4日間):ステージ2細胞を、0.25μΜ SANT-1(N-[(3,5-ジメチル-1-フェニル-1H-ピラゾール-4-イル)メチレン]-4-(フェニルメチル)-1-ピペラジンアミン)(Sigma-Aldrich(商標)社、カタログ番号S4572)、2μΜレチノイン酸(「RA」)(Sigma-Aldrich(商標)社、カタログ番号R2625)、100ng/mLのNoggin(商標)(R&D Systems(商標)社、カタログ番号6057-NG)、及び1%(v/v)B27(Invitrogen(商標)社(Gibco(商標)社)、カタログ番号17504-044)を補充したDMEM-HG(高グルコース)培地(Invitrogen(商標)社、カタログ番号10569-044)中で培養した。

ステージ4(5日間):ステージ3細胞を、0.1μm 2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン(「ALK5阻害剤II」、「ALK5i」)(Axxora(商標)社、San Diego、CA;カタログ番号ALK-70-445)、100ng/mL Noggin、500nM (2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-2,4-ペンタジエノイルアミノ)ベンゾラクタム(「TPB」)(Shanghai ChemPartner Co., LTD(商標)社、China)、及び1%B27を補充したDMEM-HG培地中で4日間培養した。培養の最終日の間、細胞を5mg/mL Dispase(商標)で37℃にて5分間処理し、続いて穏やかにピペッティングして、細胞を細胞クラスター(<100μm)に粉砕した。細胞クラスターを、ポリスチレン125〜500ml Spinner Flask(Corning(商標))に移し、0.2μM ALK5i、100nM(6-(4-(2-(ピペリジン-1-イル)エトキシ)フェニル)-3-(ピリジン-4-イル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン、塩酸塩))(「LDN」)BMP受容体阻害剤(Stemgent(商標)社、San Diego、CA;カタログ番号04-0074)、及び1%B27を補充したDMEM-HGでの懸濁液中で、80〜100rpmで一晩スピンした。

(図S2)で示されるように、得られた膵内分泌前駆細胞を、蛍光活性化フローサイトメトリー(「FACS」)及び免疫蛍光染色(顕微鏡写真示さず)により評価した。FACS染色を、Diabetes、61、2016頁、2012で説明されるように、TABLE5(表5)に列挙する抗体を用いて行った。簡単に述べると、細胞をTrypLE(商標)Express(Life Technologies(商標)社、カタログ番号12604)中で37℃にて3〜5分間インキュベートし、解放して単一細胞懸濁液にし、その後それらを0.2%BSA(BD Sciences(商標)社、カタログ番号554657)を含有するPBSの染色緩衝液で2回洗浄した。細胞(1×10⁵〜1×10⁶)を、染色緩衝液中に1:4希釈した0.5%ヒトガンマグロブリンのブロッキング緩衝液100μl中に再懸濁して表面マーキングした。直接結合一次抗体を1:20の最終希釈で細胞に添加し、続いて4℃で30分間インキュベートした。染色した細胞を染色緩衝液中で2回洗浄し、続いて200μlの染色緩衝液中に再懸濁し、その後15μlの7-AAD中でインキュベートして、生存/死亡を区別し、その後BD Canto IIでFACS分析した。細胞内抗体染色を、最初にGreen Fluorescent LIVE/DEAD細胞染料(Life Technologies(商標)社、カタログ番号L23101)で4℃にて20分間インキュベートし、続いて冷PBS中で1回洗浄することにより達成した。細胞の固定は、250μlのCytofix/Cytoperm(商標)緩衝液(BD Sciences(商標)社、カタログ番号554723)中で行い、続いて2%正常ヤギ血清を含有する100μlのPerm(商標)洗浄緩衝液染色/ブロッキング溶液中に細胞を再懸濁した。細胞を、経験的に事前に決定した希釈の一次抗体で4℃にて30分間インキュベートし、続いてPerm/Wash緩衝液中で2回洗浄した。細胞をその後、適切な抗体で4℃にて30分間インキュベートし、その後2回洗浄し、その後BD FACS Canto II(商標)で分析した。使用した抗体濃度を、TABLE5(表5)に示す。膵臓マーカーの抗体を、ヒト膵島又は未分化H1細胞を陽性対照として用いて特異性について試験した。二次抗体については、以下の抗体:1:500の抗マウスAlexa Fluor(商標)647(Life Technologies(商標)社)、1:200(v)のヤギ抗ウサギPE、又は1:800のロバ抗ヤギAlexa 647(商標)(Life Technologies(商標)社)を添加し、4℃で30分間インキュベートし、続いてperm Wash緩衝液で最終洗浄し、BD FACS Canto IIでBD FACS Diva Software(商標)を用いて、少なくとも30,000事象を得て分析した。

インビトロ分化後、細胞の98.8%はPDX1を発現し、71.7%はNKX6.1を発現し(図8A、図8C、図8D、及び図8G)、これらは膵臓内胚葉の2つの重要なマーカーである。PDX1陽性細胞の約20%は、Ki67又はPCNA発現により示されるように(図8A及び図8D)、細胞周期中であり、多能性マーカーOCT3/4は検出されなかった(図8A)。前駆細胞の約16%が内分泌マーカーを発現したが(図8A及び図8B)、シナプトフィジン陽性細胞のうちの2.8%のみしかNKX6.1を共発現せず(図8A)、ほとんどは未成熟内分泌細胞集団を示す多ホルモン性であった(図8F)。インスリン/Cペプチド陽性細胞は、この分化ステージでは、まれにしかPAX6(図8E)又はNKX6.1(図8C)を共発現しなかった。

(実施例3)
HFDへの曝露は、インビボでhESC由来内分泌細胞の機能に影響しなかった
実施例2の膵内分泌前駆細胞を、以下のように20μlのTheracyte(商標)社製マクロカプセル化デバイス(TheraCyte Inc.(商標)社、Laguna Hills、CA)内にカプセル化した。約5×10⁶個の内分泌前駆細胞(クラスター形態)を、容積式ピペットに入れた。わずかな圧力を用いて、細胞を含有する毛管/ピストン先端の先端を、24ゲージのカテーテルのハブ内にぴったりと収め、細胞を容積式ピペットからカテーテルを通してデバイス内に分配した。デバイスを、チタンの返しを用いて密閉した。カプセル化した膵内分泌前駆細胞をその後、4つの食餌レジメンの各々からの7匹のSCIDベージュマウスに皮下移植した。全てのマウスを吸入イソフルランで麻酔し、移植受容動物は、右脇腹の皮下に約5×10⁶個の膵内分泌前駆細胞を受容した。4匹の模擬マウスは、同じ手術手順を受けたが、マクロカプセル化デバイスは移植しなかった。

移植後、膵内分泌前駆細胞は更に、インビボで分化し、全ての食餌群からの得られた細胞は、8〜20週間の間の基礎及び給餌条件下で同様のレベルのヒトCペプチドを分泌し(図2A)、18週間で強固なグルコース刺激ヒトCペプチド分泌を生じた(図2B及び図2C)。同様に、ヒトインスリン分泌は、24週間で全ての食餌群にてアルギニン負荷により誘発された(図2D)。HFD群における基礎グルカゴン分泌増大への傾向が観察されたが、LFD群中の5匹のマウスのうちの4匹は検出不能な絶食グルカゴンレベルを有したので、統計分析を行うことができなかった(図2E)。アルギニン刺激グルカゴンレベルは、食餌群間で同様であり(図2E、図2F)、移植グルカゴンレベルと模擬グルカゴンレベルとの差により示されるように、循環グルカゴンの約半分がhESC由来細胞から起こった可能性があると推定された(図2F)。

Theracyte(商標)社製デバイスを組織回収時に半分に切断し、使用するまでRNAlater Stabilization Solution(商標)(Qiagen,Inc.(商標)社、Valencia、CA;カタログ番号76106)中で-80℃にて保存した。最初に余分のマウス組織をデバイスの外側から除去し、その後デバイスを2mLのPBSに入れた。デバイスの端部を切り落とし、外側の膜を剥がし戻し、デバイスを単離し、0.1%(v/v)のベータ-メルカプトエタノールを含有する400μlのQiagen(商標)Buffer RLT Plus(Qiagen Inc.(商標)社、カタログ番号79216)に入れた。PBSを回収し、2000×gで4分間遠心分離して、デバイスから溢れ出た任意の細胞を回収した。細胞ペレットを、対応するデバイスを溶解するために使用したのと同じRLT Plus緩衝液中に再懸濁した。RNAをQiagen RNeasy Plus Mini(商標)キット(Qiagen Inc.(商標)社、カタログ番号74316)を用いて単離し、16μlのヌクレアーゼ非含有水中に溶離した。RNA濃度をNanoDrop8000(商標)(Thermo Scientific(商標)社)を用いて測定した。

ヒト膵島を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(「qPCR」)分析(Prodo Labs社、Irvine、CA)のための陽性対照として4人の器官ドナー(23〜48歳;男性2人及び女性2人)から得た。膵島純度は85〜95%、生存度は90〜95%に及んだ。全てのヒト膵島調製物は、静的グルコース刺激インスリン分泌アッセイを用いて高グルコース濃度でインキュベーション後、ヒトインスリン分泌の2〜4倍増大を示した(図示せず)。簡単に述べると、ヒト膵島細胞(約20〜50個の膵島細胞)を、Krebs緩衝液(脱イオン水中の129mM NaCl、4.8mM KCL、2.5mM CaCl₂、1.2mM MgSO₂、1mM Na₂HPO₄、1.2mM KH₂PO₄、5mM NaHCO₃、10mM HEPES、及び0.1%BSAを、その後滅菌ろ過した)で2回すすぎ、その後Krebs緩衝液中で40分間事前インキュベートした。細胞をその後、3.3mMグルコースを加えたKrebs緩衝液中で60分間インキュベートした。細胞をその後、16.7mMグルコースを加えたKrebs緩衝液を含有する別のプレートに移し、更なる60分間インキュベートした。各インキュベーション期間後に上清試料を回収し、ヒトCペプチドELISA(Mercodia(商標)社、Winston-Salem、NC;カタログ番号10-1141-01)測定のために-70℃で凍結した。

デバイス中のヒト細胞/組織の少ない量、及びRNAのいくらかは周囲のマウス組織に由来するという高い可能性のために、ヒトRNAの量を、標準曲線を用いて測定した。最初に、全てのRNAを、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(商標)(Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社)を用いて以下のプログラム:25℃で10分間、37℃で2時間、4℃で維持にて、cDNAに変換した。事前増幅を遺伝子ラン(TABLE3(表3))に特異的なプライマープール及びTaqMan PreAmp 2x Master Mix(商標)(Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社)を用いて以下の周期条件:95℃で10分間、95℃で15秒間及び60℃で4分間を8周期、99℃で10分間、及び4℃で維持にて行った。

ヒトcDNAの量を決定するために、リアルタイムPCRを、ヒトGAPDH及びマウスGapdhに特異的なプライマーを用いて事前に増幅したcDNAについて行い、ヒト細胞株からの既知の量のcDNAから作成した標準曲線に対して測定した。16ngの計算したヒトcDNAを、特注TaqMan Low Density Array(商標)(Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社、TABLE3(表3))でQuant Studio 12K Flex Real Time PCR(商標)器具(Thermo Fisher Scientific社/Life Technologies社)を用いて測定した。データをExpression Suite(商標)ソフトウェア(v1.0.3、Thermo Fisher Scientific(商標)社/Life Technologies(商標)社)を用いて分析し、デルタデルタCt法を用いて未分化H1細胞に対して正規化した。

移植前に、膵内分泌前駆細胞の一部を4%パラホルムアルデヒド(「PFA」)中で一晩固定し、その後1%アガロース中に包埋し、その後パラフィン包埋した。Theractye(商標)社製デバイス及び様々な組織(上記TABLE3(表3)で列挙される)を移植29週間後に回収し、4%PFA中に固定し、70%エチルアルコール中に保存し、その後パラフィン包埋した。全てのパラフィン切片(5mmの厚さ)をWax-it Histology Services(商標)社(Vancouver、BC)により調製した。一次抗体を上記TABLE4(表4)に示す。ヘマトキシリン及びエオシン(「H&E」)染色を標準の手順を用いて行い、組織分析を独立した病理学者により盲検様式で行った(Nova Pathology PC(商標)社、Bellingham、WA、USA)。

移植29週間後で、カプセル化hESC由来移植組織は、ヒト膵島と比較して同様の、又は顕著に高レベルの膵島関連遺伝子を有し、異なるLFD又はHFD群間で有意差はなかった(図示せず。CHGB、INS、CGC、SST、NKX6.1、PAX6、ISL1、MAFA、ABCC8、IAPP、PCSK1、PCSK2、GCGR、G6PC2、SLC30A8、及びUCN3)。特に、遺伝子CHGB、INS、CGC、SST、MAFA、及びPCSK1は、ヒト膵島と比較して、カプセル化hESC由来移植組織で(すなわち、10%脂肪、45%脂肪、60%脂肪、及び西欧食について)同様の遺伝子発現を有した。しかしながら、カプセル化hESC由来移植組織中の(すなわち、10%脂肪、45%脂肪、60%脂肪、及び西欧食についての)NKX6.1、PAX6、ISL1、ABCC8、IAPP、PCSK2、GCGR、G6PC2、SLC30A8、及びUCN3遺伝子発現をヒト膵島と比較した場合、hESC由来移植細胞は概してヒト膵島より顕著に高い遺伝子発現レベルを有した。

回収したデバイス内の細胞の大部分は内分泌マーカーシナプトフィジンについて免疫反応性であり、少量の割合は膵管マーカーCK19を発現し、トリプシン陽性外分泌細胞はめったに観察されなかった(顕微鏡写真示さず)。移植組織は、大部分は、インスリン、グルカゴン、又はソマトスタチンのいずれかを発現する細胞からなり、単一ホルモン性インスリン陽性及びグルカゴン陽性細胞の割合は食餌群間で同様であった(図3)。LFD移植組織と比較してHFD移植組織においてインスリン及びグルカゴンの両方について免疫反応性である細胞の、少数であるが、顕著により高い割合が留意された(図3)。これらのまれな多ホルモン性細胞は別として、HFDへの曝露は、概してhESC由来インスリン分泌細胞の成熟状態に影響しないように見え、全ての移植受容動物におけるインスリン陽性細胞の大多数は、移植29週間後でPDX1、NKX2.2、NKX6.1、及びMAFAを共発現した(顕微鏡写真示さず)。

(実施例4)
hESC由来インスリン分泌細胞は、食餌誘発高血糖及びインスリン抵抗性を改善した
グルコース耐性試験(「GTT」)を、移植18及び24週間後で、6時間の午前絶食及び経口胃管栄養又は腹腔内(「i.p.」)注射(体重1kg当たり2gのグルコース、30%溶液、Vetoquinol(商標)社、Lavaltrie、QC)によるグルコース投与後に行った。移植した細胞からのグルコース刺激ヒトCペプチド分泌を、一晩絶食及びグルコースのi.p.注射(2g/kg)後に評価した。インスリン耐性試験(「ITT」)を、移植22週間後に、4時間の午前絶食及びヒト合成インスリン(体重1kg当たり0.7IU、Novolin ge(商標)Toronto、Novo Nordisk(商標)社、Mississauga、Canada)の投与後に行った。毎月の混合食負荷のために、マウスは、一晩絶食(約16時間)後にEnsure(商標)(体重1g当たり8μL、Abbott Laboratories(商標)社、Abbott Park、Illinois、USA)の経口胃管栄養を受容した。アルギニン耐性試験(「ArgTT」)のために、マウスは、4時間の午前絶食後、アルギニンのi.p.注射(2g/kg、40%溶液、Sigma-Aldrich(商標)社)を受容した。

全てのHFD群は、研究期間全体を通してLFD対照と比較して絶食条件下で過体重及び高血糖であり続けた。カプセル化細胞の移植は、模擬手術と比較して体重又は絶食血中グルコースレベルのいずれかに影響しなかった(図示せず)。しかしながら、HbA1Cにより測定されるように、長期血糖コントロールの顕著な改善が、移植後にのみ(図4A及び図4B)観察された。HbA1Cレベルは、LFD模擬対照と比較して全てのHFD模擬マウスにおいて12及び24週間で上昇し、両方の週齢で45〜60%脂肪群において移植により顕著に低減した(図4A及び図4B)。また、45〜60%脂肪食の移植受容動物は、20週間で模擬マウスと比較して混合食刺激後に顕著により低いグルコース逸脱を示し(図4C)、全てのHFD移植受容動物は、移植24週間後で顕著に改善したグルコース耐性を有し(図4E、図9B)、これらの改善は、18週間ではまだ明らかではなかった(図4D、図9A)。45〜60%群のグルコース耐性は、24週間で完全には改善しなかったが、西欧食群の移植受容動物は、対照と区別不能な曲線下面積を有した(図4E、図9B)。また、模擬と比較して、移植を受けたHFD給餌マウスにおける22週間でのインスリン感受性の顕著な改善が(図4F、図9C及び図9D)観察され、これは、HFD移植受容動物のグルコース耐性改善に寄与した可能性がある(図4E)。

内因性膵臓ベータ及びアルファ細胞面積を測定するために、動物1匹当たり3つの少なくとも200μm分離した膵臓切片を、インスリン及びグルカゴンについて免疫染色した。スライド全体の蛍光走査をImageXpress Micro Imaging System(商標)を用いて行い、画像をつなぎ合わせ、MetaXpress Software(商標)(Molecular Devices Corporation(商標)社、Sunnyvale、CA)を用いて分析した。ベータ細胞又はアルファ細胞画分を、インスリン陽性又はグルカゴン陽性面積/全膵臓面積として計算し、それから動物1匹当たり3つの切片の平均に膵臓質量を掛けた。デバイス内の内分泌組成を定量するために、DAPI陽性核の数をMetaXpress(商標)のMulti Wavelength Cell Scoring(商標)モジュールを用いてカウントし、インスリン、グルカゴン、又は両方のホルモンについて免疫反応性の細胞数を処置群盲検法により調査者が手動でカウントした。

ベータ細胞量は、LFD模擬対照と比較して60%脂肪食の全てのマウスで顕著に高く、いずれかの食餌群における模擬マウスと移植マウスとの間の差はなかった(図10A)。アルファ細胞量に対するHFDの効果はなかったが、アルファ細胞量の顕著な低減が、LFD模擬動物と比較してLFD移植受容動物で観察された(図10B)。いずれかの食餌のマウスの膵臓で、インスリン陽性面積対グルカゴン陽性面積の比の有意差はなかった(図10C)。

(実施例5)
細胞療法単独は、肥満表現型に効果を有しなかった
カプセル化hESC由来細胞はHFD給餌マウスでグルコースホメオスタシスを改善したが、肥満表現型に対しては明らかな効果がなかった。研究の終わりに(移植29週間後及び食餌36週間後)、45〜60%脂肪食のマウス(模擬及び処置)は、LFD模擬動物より顕著に高い体重、脂肪症(体重の割合としての精巣上体脂肪パッド質量)、及び循環レプチンレベルを有した(図10D〜図10F)。肥満表現型は、最初の7週間の間、西欧食マウスで、より微細であり(図1A)、研究の終わりまでに西欧食給餌マウス(模擬及びtx)とLFD模擬対照との間に体重、脂肪症、又はレプチンレベルの有意差はなかった(図10D〜図10F)。全てのHFD群は、LFD対照と比較して、肝臓の食餌性脂質代謝異常と一致する(図示せず)、顕著に高い肝臓質量(図10G)及び細胞質空胞化の証拠を有した。45〜60%脂肪食を給餌した移植受容動物は、模擬動物と比較して顕著に低減した肝臓質量を有した(図示せず)が、病理評価は、H&E染色した肝臓切片で細胞質空胞化の差を示さなかった(図示せず)。同様に、腎尿細管上皮の空胞化が、全てのHFD群からの腎臓切片で観察され(食餌性脂質代謝異常と一致する)、この表現型に対する細胞移植の効果はなかった。他の組織病理(脂肪組織、腎周囲、回腸、骨格筋、盲腸、空腸、脾臓、結腸、腎臓、胃の腺性部位、十二指腸、肝臓、胃の非腺性部位、心臓、肺、及び精巣)は、自然に起こる週齢及び性別関連事象と一致し、食餌への曝露又は細胞移植と無関係であると考えられた。

(実施例6)
膵内分泌前駆細胞移植と抗糖尿病薬との併用治療は、食餌誘発肥満及びグルコース耐性を改善した
マウスを、研究期間中10%脂肪対照食(D12450K、n=8)、又は6週間の間60%脂肪食(D12492、n=64)のいずれかに設定し、続いて研究の残りの期間、以下の処置レジメン(1群当たりn=16):1)薬物を含まない60%脂肪食(D12492)、2)ロシグリタゾン含有特注60%脂肪食(食餌1kg当たり18mg又は1日当たり体重1kg当たり約3mg;Cayman Chemical(商標)社、Ann Arbor、MI;Research Diets(商標)社特注食餌製剤D08121002)、3)シタグリプチン含有特注60%脂肪食(食餌1kg当たり4g又は1日当たり体重1kg当たり約750mg;シタグリプチンリン酸一水和物、Bio Vision Inc.(商標)社、Milpitas、CA;Research Diets(商標)社特注食餌製剤D08062502R)、又は4)60%脂肪食(D12492)及び飲料水中のメトホルミン(1.25mg/mL又は1日当たり体重1kg当たり約250mg;1,1-ジメチルビグアナイド塩酸塩、Sigma-Aldrich(商標)社)のうちの1つを行った。処置群を上記TABLE2(表2)に要約する。マウスはHFD投与後急速にT2Dの特性を発達した(図11)。

移植時(薬物投与1週間後)、全てのHFD給餌マウスはLFD対照より顕著に重かった(図5F)。体重減少は、抗糖尿病薬で処置したHFD給餌マウスにおいて移植後最初の2週間以内に観察された(図5C、図5D、及び図5E)。対照的に、薬物処置を伴わないHFD移植受容動物(図5B)、又は任意の薬物で処置した模擬マウス(図5A〜図5E)のいずれかでは、体重変化はこの間に観察されなかった。抗糖尿病薬を受容した全ての移植受容動物は、模擬マウスと比較して75日目の顕著に低い体重(図5F)及び精巣上体脂肪パッド質量の低減(体重に対して、図5G)を有し、そのため、どのパラメーターもLFD給餌模擬対照と異ならなかった。薬物処置を伴わないHFD給餌マウスで体重(図5B及び図5F)又は循環レプチンレベル(図5H)に対する移植の効果はなかったが、本発明者らは、この群で相対的精巣上体脂肪パッド質量における低減を観察した(図5G)。細胞移植とメトホルミン又はシタグリプチンのいずれかとの組合せは、それらの各々の模擬対照と比較して循環レプチンレベルの顕著な低減をもたらした(図5G)。ロシグリタゾン群ではレプチンレベルの回復に対して細胞療法の効果はなかった(図5G)。

どの治療も単独では体重に対して任意の効果を有しなかったので(図5A及び図5Bを参照のこと)、体重については、膵臓前駆細胞移植とT2D小分子治療との併用療法でいくらかの「相乗作用」があるように見える。同様に、移植12週間後で、どの治療も単独ではグルコース耐性に対して任意の効果を有さず(図6A及び図6Bを参照のこと)、一方で試験した組合せは血中グルコース及び体重の顕著な改善をもたらした。それゆえ、組合せの効果は、治療単独の合計より大きい。これについての唯一の例外は、シタグリプチンであり得、シタグリプチンはそれ自体でグルコース耐性の穏やかな低減を示した。

絶食血中グルコースレベルは、研究期間全体を通して併用療法のいずれによっても影響されなかった(図示せず)。移植12週間後で、全てのHFD模擬群のマウスはLFD対照と比較して、薬物処置にかかわらず、グルコース不耐性であった(図6A)。薬物処置を伴わないHFD給餌マウスにおいて移植12週間後で、グルコース耐性に対する細胞療法の効果はなく(図6B)、同様にまた、ロシグリタゾンとの組合せはこの時点で効果的ではなかった(図6E)。細胞療法は、メトホルミン(図6C)又はシタグリプチン(図6D)処置のいずれかと組合せた場合、移植12週間後でグルコース耐性を顕著に改善した。経口グルコース負荷中の血糖コントロールは、LFD対照と、細胞療法と共にシタグリプチンを受容したHFD給餌マウスとの間で区別不能であったが、ただし、唯一、胃管栄養後15分ではほんのわずかに高いピークグルコースレベルであった(図6D)。メトホルミン及びシタグリプチン処置マウスからの細胞移植受容動物のグルコース耐性の改善は、移植16週間後でそれらの各々の模擬対照と比較して顕著に低減した絶食マウスCペプチドレベルと関連付けられ(図6G)、この効果は4週間ではまだ明らかでなかった(図6F)。グルコース耐性の改善は、hESC由来移植組織の機能の差と関連付けられなかった。全ての移植受容動物は、16週間で強固なグルコース応答性ヒトCペプチド分泌を示し、異なる抗糖尿病薬で処置したHFD給餌マウス間でヒトCペプチドレベルの差はなかった(図6G)。

(実施例7)
雄及び雌マウスにおけるステージ4(S4)細胞移植とステージ7(S7)細胞移植との比較
ステージ4細胞膵臓前駆細胞(上記実施例の細胞と同様)を、より分化した膵内分泌細胞であるステージ7細胞と比較し、両方とも正常かつ健康な通常食の雄又は雌マウスに移植した。移植後、マウスの体重を4時間絶食(図12)及び一晩絶食(図13)後に比較した。これらの研究で、4時間絶食後に計量しても(図12)、一晩絶食後に計量しても(図13)、ステージ7細胞を受容したマウスは、ステージ4細胞を受容したマウスより体重が少ない傾向があった。したがって、いくつかのステージ7細胞は、体重増加を低減させるためにわずかに望ましい場合がある。

(実施例8)
マウスにおけるステージ7(S7)細胞移植とヒト膵島細胞移植との比較
ステージ7細胞及びヒト膵島細胞を、移植前に糖尿病(すなわち、STZ投与)又は非糖尿病(すなわち、STZ非投与)のいずれかであるマウスで比較し、移植後に体重(図14A)及び血糖(図14B)を比較した。しかしながら、STZ投与したが、移植なしの対照はなかった。細胞移植を受容した動物は、対照動物より体重をあまり増加しない傾向があった(図14A)。図14Bで示すように、移植を受容した動物は、対照マウスと同様に移植後に血糖をより調節することができるように見えた。しかしながら、予想されるように、ヒト膵島TXマウス(すなわち、Tx後約15日)と比較してS7TXマウスについて、より大きな時間の遅れ(すなわち、Tx後約120日)があった。S7受容動物は、約100日まで正常グルコースを有し、その後すぐに、ヒト膵島受容動物と同様に、実際に対照より低くなる(低血糖)ことに留意することが重要である。達成される血中グルコースレベルは、マウスにとっては低血糖であるが、ヒトは本来、より低い血中グルコースレベルを有し、かつ移植した細胞はヒト細胞であるので、この血中グルコースレベルはヒトにとっては低血糖ではないと考えられる。このより低い血中グルコースは、本発明者らがマウスより低いグルコースレベル設定点を有するヒト細胞を移植しているという事実を反映する可能性がある。或いは、又は加えて、また、それは過剰な数の細胞が移植されたという事実を反映し得る。

図14A及び図14Bで研究したのと同じ動物をマウスレプチンレベルについて比較した場合(図15A)、レプチンは、対照より移植したマウス(ステージ7又はヒト膵島のいずれか)で一貫して低かった。レプチンは典型的に体脂肪量に比例し、体脂肪量をDEXAにより測定すると、ヒト膵島及びステージ7細胞の両方は、より低い体脂肪量を有した(図15B)。同様に、体組成を対照、ヒト膵島Tx、及びステージ7細胞Txマウスの間で比較すると、TXマウスは一貫して、より低い除脂肪体重(図16A)、体脂肪量(図16B)、及び体脂肪%(図16C)を有した。

同様に、図17A〜図17Dは、屠殺した際に回収した腎周囲組織(図17C)、精巣上体組織(図17D)、腸間膜脂肪(図17E)、及び全ての脂肪パッド(図17F)で、ステージ7移植細胞をヒト膵島移植又は対照細胞のいずれかと比較した場合の低減した脂肪質量を示す。(ヒト膵島n=5について、これはSTZを受容した4匹のマウス及びSTZを受容しなかった1匹を含むことに留意されたい)。したがって、糖尿病モデルマウスで、ステージ7ヒト膵臓前駆細胞の移植は、ヒト膵島細胞より、脂肪を低減することにおいて効果的であるように見える。図17Aで、左腎及び右腎の両方のデータが示されており、右腎と比較した左腎周囲の腎周囲脂肪が示され(例外として、対照については「右」腎は「ヒト膵島Tx」又は「ステージ7Tx」のいずれかと標識される)、データが右腎及び左腎について合計されると、グラフ上のバーは「両方」と示される。膵島又はステージ7細胞のいずれかを受容したマウスで、細胞を右腎に移植すると、対照を除いては、左腎より多くの脂肪蓄積をもたらした。これは、インスリンの局所蓄積があり、インスリンは脂肪生成性であると推測されるので、細胞が移植された腎周囲でより多くの脂肪蓄積が観察されるようである。

それゆえ、ヒト膵島及びヒトステージ7細胞の移植は、体重減少を生じ得る。膵島移植を受け、続いて体重が減少したT1D患者のいくつかの報告がある。これは、手術手順、免疫抑制薬、及び/又はライフスタイル変化のためであると思われてきた。しかしながら、おそらくこの体重減少は、膵島細胞それ自体のためである。ヒト膵島及び分化したヒト幹細胞の両方がペプチドグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)を産生することが発見されている。GLP-1は、膵臓ベータ細胞により放出されるインスリンの量を増大させることが知られており、続いて血中グルコースを減少させ得るインクレチン(すなわち、代謝ホルモン)である。更に、動物又はヒトに注射された場合、GLP-1は、体重減少を生じることができ、現在T2D患者で薬物として使用されている。これらの患者では、体重減少が報告されている。

また、細胞を薬物シタグリプチンと組合せて移植した場合、最も大きな体重減少が観察された(図5Dを参照のこと)。シタグリプチンは、GLP-1を分解及び不活性化する酵素ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP-4)の既知の阻害剤である。したがって、細胞が体重増加を低減させる1つの機構はGLP-1を産生することによるものであり、この作用はシタグリプチンでGLP-1を安定化することにより向上される可能性がある。

(実施例9)
マウスにおけるステージ7(S7)マクロカプセル化細胞移植の比較
今のところ、カプセル化は、臨床環境において、免疫応答を避けるための最も良い方法であると提案されている。しかしながら、本発明者らは動物モデルでこのことを実験的に確認することができないので(TheraCyte社により作製された本発明者らが使用したマクロカプセル化デバイスは、異種移植拒絶を防がない)、このことはこれから確定されなければならない。ViaCyteから発表された初期の結果は、それらの同様のデバイスが患者でうまくいく場合があることを示唆する。ステージ4前駆細胞はこれらのデバイスでうまくいったが、より成熟した分化した細胞(すなわち、ステージ>4)が生存し得るかどうかは不明であることに留意するべきである。実際に、胎児膵島対成熟膵島での研究により、胎児膵島(ステージ4細胞と同種)はTheraCyte社製デバイス内で生存し、成熟し、かつ機能するが、成人膵島は生存性が乏しいことが示されている(Lee, SH.ら、2009年)。それゆえ、また、進行した分化プロトコルからのより膵島様の細胞は、うまく働かないと予想される場合があった。しかしながら、最近本発明者らは、ステージ7細胞が実際にこれらのマクロカプセル化デバイス内で生存し、かつ機能し得ることを示すデータ(図19及び図20を参照のこと)を得た。

本発明者らはマクロカプセル化を試験したが、他の研究者らは代替策としてマイクロカプセル化を調査している(例えばVegas, AJ.ら 2016を参照のこと)。また、カプセル化は別として、免疫寛容誘発が、インビボで免疫応答を避けるための策として調査されている(Szot, GL.ら 2015)。これが臨床的に関連するアプローチであるかどうかが決定されなければならない。

毎週の絶食血中グルコース及び体重モニタリングにより、任意の群における動物の平均体重又は血糖症の間で差がないことが示された(図18B及び図18Cを参照のこと)。しかしながら、デバイスなし及び腎被膜(KC)でのステージ4及びステージ6細胞移植を比較すると、移植したマウスのCペプチドレベルは、移植10週間以内ではS6 KC細胞において顕著に高かった(図18Aを参照のこと)。

移植後の移植組織回収、及び続く免疫組織化学分析は、図19及び図20で使用したTheraCyte社製デバイスは、主として内分泌細胞であるように見える細胞(シナプトフィジン陽性)を含有したことを示した。この細胞は、うまく機能し、優れたグルコース応答性Cペプチド産生を有したようであった。

本発明の様々な実施形態が本明細書で開示されるが、多くの適合及び改変が、当業者の通常の一般的知識に従って本発明の範囲内でなされ得る。かかる改変は、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するために、本発明の任意の態様についての既知の均等物の置換を含む。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含める。「含む(comprising)」という語は、無制限の用語として本明細書で使用され、実質的に「非限定的に含む(including, but not limited to)」という句と均等であり、「含む(comprises)」という語は、対応する意味を有する。本明細書で使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈が明らかに別に規定しない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば「1つのもの(a thing)」についての言及は、1つ超のかかるものを含む。本明細書中の参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明の実施形態に対して先行技術であることを認めるものではない。本発明は、実質的に本明細書中で前に説明するように、かつ実施例及び図面を参照して、全ての実施形態及び変形を含む。
(参考文献)

Claims

対象における2型糖尿病(T2D)の治療のための血糖コントロールの改善、T2Dを有する対象におけるグルコース不耐性の治療、又は、T2Dを有する対象におけるインスリン抵抗性の治療のための、膵内分泌前駆細胞集団を含む組成物であって、
前記組成物が、
(a)対象に移植された膵内分泌前駆細胞集団をインビボで成熟させて、膵内分泌細胞を含む集団を生成する
ために使用される、
組成物。
前記組成物が、T2Dを有する対象における血糖コントロールの改善において使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
前記組成物が、T2Dを有する対象におけるグルコース不耐性の治療において使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
前記組成物が、T2Dを有する対象におけるインスリン抵抗性の治療において使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
前記組成物が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬を更に含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬が、以下の:
メグリチニド;スルホニル尿素;ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP-4)阻害剤;ビグアナイド;チアゾリジンジオン;アルファ-グルコシダーゼ阻害剤;ナトリウム-グルコース共輸送体2(SGLT-2)阻害剤;胆汁酸封鎖剤;レパグリニド;ナテグリニド;グリピジド;グリメピリド;グリブリド;サキサグリプチン;シタグリプチン;リナグリプチン;メトホルミン;ロシグリタゾン;ピオグリタゾン;アカルボース;ミグリトール;カナグリフロジン;ダパグリフロジン;エンパグリフロジン;及びコレセベラム
から選択される、請求項５に記載の組成物。
膵内分泌前駆細胞が、インビボで成熟して、少なくとも2%の膵内分泌細胞を含む集団を生成する、請求項３もしくは４、又は、請求項３もしくは４のいずれか一項に従属する場合の請求項５もしくは６に記載の組成物。
血糖コントロールが、H1Abcレベルにより測定される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
2型糖尿病(T2D)を有する対象における肥満を治療するための、膵内分泌前駆細胞集団を含む組成物であって、
前記組成物が、対象に移植され、インビボで成熟して膵内分泌細胞を含む集団を生成する膵内分泌前駆細胞を含み、
前記組成物が、1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬をさらに含む、
組成物。
膵内分泌前駆細胞が、インビボで成熟して、少なくとも2%の膵内分泌細胞を含む集団を生成する、請求項９に記載の組成物。
1つ又は複数の小分子抗糖尿病薬が、以下の:
メグリチニド;スルホニル尿素;ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP-4)阻害剤;ビグアナイド;チアゾリジンジオン;アルファ-グルコシダーゼ阻害剤;ナトリウム-グルコース共輸送体2(SGLT-2)阻害剤;及び胆汁酸封鎖剤
から選択される、請求項９又は１０に記載の組成物。
小分子抗糖尿病薬が、以下の:
レパグリニド;ナテグリニド;グリピジド;グリメピリド;グリブリド;サキサグリプチン;シタグリプチン;リナグリプチン;メトホルミン;ロシグリタゾン;ピオグリタゾン;アカルボース;ミグリトール;カナグリフロジン;ダパグリフロジン;エンパグリフロジン;及びコレセベラム
からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の組成物。
抗糖尿病薬が、シタグリプチン、メトホルミン、及びロシグリタゾンからなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の組成物。