JP6842800B2 - 酵素的方法を使用してレバウディオサイドjを調製するための方法 - Google Patents
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Description
UGT−Bの組み換え大腸菌(又は他の微生物)発現株は、分子クローニング技法及び遺伝子工学技法を利用することによって得られる。次いで、組み換え大腸菌を発酵させて、UGT−Bを含有する組み換え細胞を得るか、又は上記組み換え細胞由来のUGT−Bの凍結乾燥粉末を調製し、取得する。
(1)(配列表に示される配列1及び配列2に従って)必要な遺伝子断片を遺伝的に合成し、pUC57ベクターにライゲーションする一方で、2つの末端にNdeI及びBamHI酵素切断部位をそれぞれ付加する。
(2)各遺伝子断片を、発現ベクターpET30aの対応する酵素切断部位に二重消化及びライゲーションにより挿入し、それにより各遺伝子を、T7プロモーターの制御下で配置する。
(3)組み換えプラスミドを、大腸菌BL21(DE3)に形質転換する。標的タンパク質の発現は、IPTGを利用することによって誘導され、次いでUGT−Bの組み換え大腸菌の発現株が得られる。
UGT−Bを含有する組み換え大腸菌発現株を、1%の割合に従って4mLの液体LB培地に接種する。振盪培養を、37℃で(200rpmで)一晩実行する。一晩培養した物質を採取し、1%の割合に従って50mLのLB液体培地に接種する。OD600値が0.6〜0.8に達するまで、振盪培養を、37℃で(200rpmで)一晩実行する。次いで、0.4mMの最終濃度を有するIPTGを、一晩の振盪培養にわたって20℃で添加する。誘導が完了した後、細胞を遠心分離(8,000rpm、10分)によって回収する。次いで、細胞を5mLの2mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)で再懸濁して、組み換え細胞を得る。次いで、細胞を氷浴中で超音波的に破壊した。ホモジネートを遠心分離する(8,000rpm、10分)。また上清を回収し、凍結乾燥粉末を得るために24時間凍結乾燥させる。
配列3及び配列4に従って、UGT−B遺伝子断片を遺伝的に合成し、一方で2つの末端にNdeI及びBamHI酵素切断部位をそれぞれ付加し、pUC57ベクター(Suzhou Genewiz Biotech.Co.,Ltd.製)にライゲーションした。UGT遺伝子セグメントを、制限エンドヌクレアーゼNdel及びBamHIで酵素消化した後、セグメントを回収し、精製した。BL21(DE3)株を形質転換するために、T4リガーゼを付加して、セグメントをpET30aの対応する酵素切断部位にライゲーションした。
実施例1で調製したUGT−Bを含有する組み換え細胞を、氷浴中で超音波的に破壊した。ホモジネートを遠心分離した(8,000rpm、10分)。また上澄みを回収し、24時間凍結乾燥して、UGT−Bの凍結乾燥粉末を得た。
この実施例では、実施例2の方法に従って調製したUGT−Bの凍結乾燥粉末を、レバウディオサイドJの触媒作用及び合成に使用した。
この実施例では、実施例1の方法に従って調製したUGT−Bを含有する組み換え細胞を、レバウディオサイドJの触媒作用及び合成に使用した。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
1. 酵素的方法を使用してレバウディオサイドJを調製するための方法であって、前記方法において、レバウディオサイドAが、基質として使用され、グリコシル供与体の存在下で、レバウディオサイドJが、UDP−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞及び/又はそこから調製されたUDP−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下での反応によって産生される、方法。
2. 前記グリコシル供与体が、ラムノシル供与体である、項1に記載の方法。
3. 前記ラムノシル供与体が、UDP−ラムノースである、項2に記載の方法。
4. 前記UDP−グリコシルトランスフェラーゼが、Oryza sativa由来のUGT−Bである、項1に記載の方法。
5. Oryza sativa由来のUGT−Bのアミノ酸配列が、配列表に示される配列2と少なくとも60%一致している、項4に記載の方法。
6. Oryza sativa由来のUGT−Bの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列2と少なくとも70%一致している、項5に記載の方法。
7. Oryza sativa由来のUGT−Bの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列2と少なくとも80%一致している、項6に記載の方法。
8. Oryza sativa由来のUGT−Bの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列2と少なくとも90%一致している、項7に記載の方法。
9. 前記反応が、水性系中35〜45℃の温度及び7.5〜8.5のpHで実行される、項1に記載の方法。
10. 前記反応が、リン酸緩衝液中で実行される、項9に記載の方法。
11. 前記反応系が、UDP−グリコシルトランスフェラーゼの組み換え細胞及び細胞透過剤を含有する、項9に記載の方法。
12. 前記細胞透過剤が、トルエンであり、前記反応系中のトルエンの体積比濃度が、1〜3%である、項11に記載の方法。
13. 前記反応に使用される全ての原料を反応ケトルに添加して均一に混合した後、撹拌しながら反応のために設定温度で配置する、項9に記載の方法。
14. 前記組み換え細胞が、微生物細胞である、項1に記載の方法。
15. 前記微生物が、大腸菌(Escherichia coli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)又はピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、項14に記載の方法。
Claims (11)
- 酵素的方法を使用してレバウディオサイドJを調製するための方法であって、反応系においてレバウディオサイドAを、グリコシル供与体と、レバウディオサイドJを産生するための、i)UDP−グリコシルトランスフェラーゼまたはii)UDP−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞存在下で反応させることを含み、ここで、i)またはii)のUDP−グリコシルトランスフェラーゼは配列2のアミノ酸配列を有し、グリコシル供与体がラムノシル供与体である、方法。
- ラムノシル供与体がUDP−ラムノースである、請求項1に記載の方法。
- UDP−グリコシルトランスフェラーゼがOryza sativa由来のUGT−Bである、請求項1に記載の方法。
- 反応系が35〜45℃の温度及び7.5〜8.5のpHを有する水相を含む、請求項1に記載の方法。
- 水相がリン酸緩衝液である、請求項4に記載の方法。
- 反応系が細胞透過剤をさらに含有する、請求項4に記載の方法。
- 細胞透過剤がトルエンであり、トルエンが1〜3%の体積比濃度を有する、請求項6に記載の方法。
- 組み換え細胞が微生物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 微生物が大腸菌(Escherichia coli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)又はピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項8に記載の方法。
- 樹脂単離によりレバウディオサイドJを精製することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 樹脂単離により精製されたレバウディオサイドJが95%を超える純度を有する、請求項10に記載の方法。
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