JP6842655B2 - Composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells - Google Patents
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Description
本発明は、粘膜型マスト細胞への分化を抑制するための組成物に関する。 The present invention relates to a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells.
マスト細胞(Mast Cells;MCs;肥満細胞)は、造血系幹細胞に由来する血球系細胞の一種であり、マクロファージや樹状細胞などのその他の免疫細胞と同様に生体内の様々な組織に分布している。マスト細胞は、各組織において、マスト細胞前駆体(MCP)から誘導されるが、各組織においてみられるマスト細胞の表現型は異なる。これは、マスト細胞が多様性(heterogeneity)を有しているからである(例えば、非特許文献1を参照)。 Mast cells (MCs; mast cells) are a type of hematopoietic cells derived from hematopoietic stem cells and are distributed in various tissues in the body like other immune cells such as macrophages and dendritic cells. ing. Mast cells are derived from mast cell precursors (MCPs) in each tissue, but the mast cell phenotype found in each tissue is different. This is because mast cells have diversity (see, for example, Non-Patent Document 1).
マスト細胞は、多様性を有していることにより、同一の組織又は培養容器内においてさえ、同一の刺激に対して相違する反応を示し得る。換言すれば、同一の表現型を有するマスト細胞を得ることは非常に難しい。かかる状況下において、非特許文献1には、T細胞由来のサイトカインの一種であるインターロイキン(IL)−3の存在下で、骨髄中のMCPを培養することにより、骨髄由来型マスト細胞(Bone marrow−derived MC;BMMC)が得られることが記載されている。BMMCは、異質性があり、かつ、未成熟であり、さらに表現型が様々な培養添加物により変化し得る細胞である。例えば、BMMCを線維芽細胞と共培養することにより、成熟したマスト細胞の一種である結合組織型マスト細胞の表現型を示す。 Due to their diversity, mast cells can respond differently to the same stimulus, even within the same tissue or culture vessel. In other words, it is very difficult to obtain mast cells with the same phenotype. Under such circumstances, Non-Patent Document 1 describes bone marrow-derived mast cells (Bone) by culturing MCP in bone marrow in the presence of interleukin (IL) -3, which is a type of T cell-derived cytokine. It is described that a bone marrow-developed MC (BMMC) can be obtained. BMMCs are cells that are heterogeneous, immature, and whose phenotype can be altered by various culture additives. For example, by co-culturing BMMC with fibroblasts, the phenotype of connective tissue mast cells, which is a type of mature mast cells, is shown.
成熟したマスト細胞の一種として、粘膜型マスト細胞(mucosal MCs)がある。結合組織型マスト細胞が皮膚や血管内に局在化するのに対して、粘膜型マスト細胞は、生体内の粘膜組織に局在しており、IgEに対して高い親和性のあるIgE受容体(FcεRIα)を細胞表面に発現している。マウスにおいては、粘膜型マスト細胞は、MMCP−1などのキマーゼを発現する。このFcεRIαに、アレルゲンとIgEとが免疫複合体を形成して架橋することにより、様々な応答が引き起こされる。そのような応答の結果にもたらされるものとして、例えば、腸内組織における粘膜型マスト細胞が関与する食物アレルギーがある。食物アレルギーは、食物に由来する物質がアレルゲンとなり、IgEと免疫複合体を形成して、FcεRIαと架橋することにより、腸内組織における粘膜型マスト細胞が活性化することにより発症する。 As a kind of mature mast cells, there are mucosal mast cells (mucosal MCs). Connective tissue mast cells are localized in the skin and blood vessels, whereas mucosal mast cells are localized in the mucosal tissue in vivo and have a high affinity for IgE. (FcεRIα) is expressed on the cell surface. In mice, mucosal mast cells express chymase such as MMCP-1. Various responses are evoked by the allergen and IgE forming an immune complex and cross-linking to this FcεRIα. The consequences of such a response include, for example, food allergies involving mucosal mast cells in intestinal tissue. Food allergy develops when food-derived substances become allergens, form immune complexes with IgE, and cross-link with FcεRIα to activate mucosal mast cells in the intestinal tissue.
粘膜型マスト細胞の活性化は、ヒスタミン、エフェクタープロテアーゼ、ヘパリンなどの炎症性メディエータを遊離する脱顆粒、TNF−α、IL−4、IL−13、IL−6、IL−3及びケモカインなどの炎症性サイトカインの産生、血小板活性化因子、プロスタグランジン、ロイコトリエンなどの脂質メディエータの産生などをもたらし、生体におけるアレルギー反応を惹起する(非特許文献2を参照)。 Activation of mucosal mast cells causes degranulation to release inflammatory mediators such as histamine, effector proteases and heparins, and inflammation such as TNF-α, IL-4, IL-13, IL-6, IL-3 and chemokine. It causes the production of sex cytokines, platelet activating factor, prostaglandins, leukotrienes and other lipid mediators, and induces an allergic reaction in the living body (see Non-Patent Document 2).
一方、発酵食品の代表的なものとして、しょうゆがある。大部分のしょうゆは、大豆や小麦などの麦を原料として麹菌などにより発酵及び熟成させて得られる。特許文献1には、しょうゆに含まれる高分子多糖類の中には、マクロファージの活性化作用及びPCA反応抑制作用を示すものがあることが記載されている。 On the other hand, soy sauce is a typical fermented food. Most soy sauce is obtained by fermenting and aging wheat such as soybeans and wheat with aspergillus. Patent Document 1 describes that some of the high molecular weight polysaccharides contained in soy sauce exhibit a macrophage activating effect and a PCA reaction suppressing effect.
上記のとおり、粘膜型マスト細胞は、腸管などの粘膜組織に局在化し、アレルゲンが粘膜組織に到達することによるアレルギーの発症に関与し得る。そこで、粘膜組織を介したアレルギーを抑制するためには、異常に増加した粘膜型マスト細胞の割合を減少させることが肝要である。また、アレルギーを発症していなくとも、粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することもまた肝要である。 As described above, mucosal mast cells can be localized in mucosal tissues such as the intestinal tract and can be involved in the development of allergies when allergens reach the mucosal tissues. Therefore, in order to suppress allergies mediated by mucosal tissues, it is important to reduce the proportion of abnormally increased mucosal mast cells. It is also important to maintain the proportion of mucosal mast cells at normal values even if allergies have not developed.
特に、粘膜組織を介したアレルギーとしては、食物を摂取することにより発症する食物アレルギーがある。そこで、食物アレルギーを誘起する食物性アレルゲンと同時的かつ日常的に摂取することにより、粘膜型マスト細胞の異常増加を抑制し、かつ、粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することにより、アレルギー疾患になりにくい体質作りに貢献できれば、食物アレルギーの罹患者の健康や福祉に資することができ、有益である。しかし、非特許文献1及び2並びに特許文献1を含めて、日常の食事の際に摂取することができ、かつ、粘膜型マスト細胞への分化を抑制して、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させ得るものはこれまでに知られていない。 In particular, as an allergy through mucosal tissue, there is a food allergy that develops by ingesting food. Therefore, by ingesting it simultaneously and daily with a food allergen that induces food allergies, it is possible to suppress an abnormal increase in mucosal mast cells and maintain the proportion of mucosal mast cells at a normal value. If we can contribute to building a constitution that is less likely to cause allergic diseases, it will contribute to the health and welfare of people suffering from food allergies, which is beneficial. However, including Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 1, the mucosal mast cells per cell can be ingested during daily meals and suppress the differentiation into mucosal mast cells. Nothing has been known that could reduce the proportion.
そこで、本発明が解決しようとする課題は、食事の用に供することができ、かつ、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させることができる組成物を提供することにある。 Therefore, an object to be solved by the present invention is to provide a composition that can be used for meals and can reduce the ratio of mucosal mast cells per cell.
大豆の発酵物及び麦の発酵物において、大豆アレルゲン及び麦アレルゲンは発酵を通じて大幅に減少していることがELISA法などにより確認されている。したがって、大豆アレルゲンや麦アレルゲンに敏感に応答する個体において、発酵を通じて大豆アレルゲンや麦アレルゲンが分解した大豆の発酵物及び麦の発酵物を摂取したとしても、アレルギーの症状が見られる可能性が低いと考えられる。 It has been confirmed by the ELISA method and the like that soybean allergens and wheat allergens are significantly reduced through fermentation in fermented soybeans and fermented wheat. Therefore, individuals who are sensitive to soybean allergens and wheat allergens are unlikely to have allergic symptoms even if they ingest soybean fermented products and wheat fermented products obtained by decomposing soybean allergens and wheat allergens through fermentation. it is conceivable that.
本発明者らは鋭意研究を積み重ねた結果、大豆の発酵物や麦の発酵物を含むしょうゆなどの発酵食品は、該発酵食品の後に摂取した小麦アレルゲンに対する免疫寛容がみられ、さらにアレルギーの発症を低めること、すなわち、アレルギーの発症に抑制的に作用し得ることを見出した。そして、さらに鋭意研究を進めていくうちに、粘膜型マスト細胞に着目するに至り、粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法を創作することを試みた。 As a result of diligent research, the present inventors have found that fermented foods such as soy sauce containing fermented soybean products and fermented wheat products are immunotolerant to wheat allergens ingested after the fermented foods, and further develop allergies. It was found that it can suppress the onset of allergies. Then, as we proceeded with further diligent research, we came to pay attention to mucosal mast cells and tried to create a method for inducing differentiation into mucosal mast cells and a method for producing mucosal mast cells.
その結果、BMMCと同様の性質を有する未成熟マスト細胞株とIL−10とを接触させることにより安定的に粘膜型マスト細胞の割合を高め得ることを見出した。この知見を基に製造された粘膜型マスト細胞を用いて検討を重ねた結果、発酵食品に含まれる大豆の発酵物及び麦の発酵物は、未成熟細胞から粘膜型マスト細胞への異常な分化を抑制することや粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することを通じて、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させることにより、大豆アレルゲンや小麦アレルゲンなどの食物性アレルゲンが作用する細胞の数を減じることができ、アレルギーに対して抑制的に作用する可能性があることを見出した。 As a result, it was found that the proportion of mucosal mast cells can be stably increased by contacting IL-10 with an immature mast cell line having the same properties as BMMC. As a result of repeated studies using mucosal mast cells produced based on this finding, the fermented soybean and fermented wheat contained in fermented foods abnormally differentiated from immature cells into mucosal mast cells. Cells on which food allergens such as soybean allergens and wheat allergens act by reducing the proportion of mucosal mast cells per cell by suppressing the proportion of mucosal mast cells and maintaining the proportion of mucosal mast cells at normal values. It was found that the number of mast cells can be reduced and that it may act suppressively against allergens.
そして、これらの知見を基に、本発明者らは、大豆の発酵物及び麦の発酵物を利用した、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物及び抗アレルギー用組成物を創作することに成功した。本発明はこれらの知見及び成功例に基づいて完成するに至った発明である。 Then, based on these findings, the present inventors decided to create a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells and a composition for anti-allergy using fermented soybean and fermented wheat. Successful. The present invention has been completed based on these findings and successful examples.
したがって、本発明の各一態様によれば、以下のものが提供される:
[1]大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
[2]前記組成物は、しゅうゆ又はみそである、[1]に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
[3]前記しょうゆは、こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆからなる群から選ばれるしょうゆである、[2]に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
[4]前記組成物は、インターロイキン−3及びインターロイキン−10の存在下で、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用を有する組成物である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
[5][1]〜[4]のいずれか1項に記載の組成物を有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物。
[6]前記抗アレルギー用組成物は、食物アレルギーを発症している者又は該食物アレルギーを発症する可能性がある者に摂取される抗アレルギー用組成物である、[5]に記載の抗アレルギー用組成物。
[7]前記抗アレルギー用組成物は、食物性アレルゲンを含有する食品と併用される抗アレルギー用組成物である、[5]又は[6]に記載の抗アレルギー用組成物。
[8]前記抗アレルギー用組成物は、粘膜組織を介するアレルギーを対象とする抗アレルギー用組成物である、[5]〜[7]のいずれか1項に記載の抗アレルギー用組成物。
Therefore, according to each aspect of the invention, the following are provided:
[1] A composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells, which contains a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients.
[2] The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells according to [1], wherein the composition is soybean paste or miso.
[3] The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells according to [2], wherein the soy sauce is a soy sauce selected from the group consisting of koikuchi soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, saikomi soy sauce and white soy sauce. Stuff.
[4] The composition is a composition having an action of suppressing the differentiation of an immature mast cell line into a mucosal mast cell in the presence of interleukin-3 and interleukin-10, [1] to The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells according to any one of [3].
[5] An antiallergic composition containing the composition according to any one of [1] to [4] as an active ingredient.
[6] The anti-allergic composition according to [5], wherein the anti-allergic composition is an anti-allergic composition ingested by a person who has developed a food allergy or a person who may develop the food allergy. Composition for allergies.
[7] The anti-allergic composition according to [5] or [6], wherein the anti-allergic composition is an anti-allergic composition used in combination with a food containing a food allergen.
[8] The antiallergic composition according to any one of [5] to [7], wherein the antiallergic composition is an antiallergic composition for allergies via mucosal tissues.
本発明の一態様である組成物は、有効成分による粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用及び抗アレルギー作用を通じて、粘膜性のアレルギーや該アレルギーと関連する炎症、例えば、食物アレルギー、花粉症、胃炎、腸炎、下痢、潰瘍性大腸炎、鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群、口内炎などによる症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療若しくは予防すること、又は免疫療法の用に供することが期待できる。 The composition according to one aspect of the present invention has mucosal allergies and inflammations associated with the allergies, such as food allergies and pollinosis, through the action of suppressing the differentiation of the active ingredient into mucosal mast cells and the antiallergic action. , Gastric inflammation, enteritis, diarrhea, ulcerative colitis, rhinitis, bronchitis, bronchial asthma, Refrel syndrome, stomatitis, etc. to improve, alleviate, suppress, treat or prevent, or for immunotherapy It can be expected to be provided.
特に、食物アレルギーの発症者にとって、アレルゲン除去食品の摂取は該発症者やその周囲の者にとって負担が甚大である。そこで、アレルギーを抑制する作用を示し得る本発明の一態様である組成物によれば、他の飲食品と併用することにより、食物アレルギーに関連する症状を減弱することが期待できる。 In particular, for a person who develops a food allergy, ingestion of an allergen-free food is extremely burdensome for the person who develops the food allergy and those around it. Therefore, according to the composition which is one aspect of the present invention capable of exhibiting an action of suppressing allergies, it can be expected that the symptoms related to food allergies are alleviated when used in combination with other foods and drinks.
以下、本発明の一態様である粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物及び抗アレルギー用組成物(以下、これらをまとめて本発明の一態様の組成物と総称する場合がある。)の詳細並びに本発明の一態様である粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。 Hereinafter, a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells and a composition for anti-allergy, which are one aspect of the present invention (hereinafter, these may be collectively referred to as the composition of one aspect of the present invention). Details and details of a method for inducing differentiation into mucosal mast cells and a method for producing mucosal mast cells, which is one aspect of the present invention, will be described, but the technical scope of the present invention is limited only by the matters of this item. However, the present invention may take various aspects as long as the object is achieved.
本発明の一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物である。 One aspect of the present invention is a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells, which contains a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients.
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。 Unless otherwise specified, each term in the present specification is used in the meaning commonly used by those skilled in the art and should not be construed as having an unreasonably limited meaning.
例えば、分化とは、一般的に、特性をもたない細胞が様々な特性を持つ細胞に変化することをいうところ、本明細書における「分化」は、ある特性を有する細胞が別の特性を有する細胞に転じることを広く意味することに加え、一般に分化細胞として知られている2種の細胞の間での、可逆的又は不可逆的な相互の転換をも含む、より広範な概念として用いられ得る。本明細書における「分化を抑制する」とは、分化することを妨げることに加えて、分化前の状態に維持すること、分化後の状態を分化前の状態に戻すことなどを含み得る。また、本明細書における「分化を誘導する」とは、分化を引き起こすことに加えて、分化することを妨げないことなどを含み得る。 For example, differentiation generally means that a cell having no characteristic changes into a cell having various characteristics, and "differentiation" in the present specification means that a cell having one characteristic has another characteristic. Used as a broader concept, including reversible or irreversible reciprocal conversion between two types of cells commonly known as differentiated cells, in addition to broadly meaning turning into a cell to possess. obtain. As used herein, "suppressing differentiation" may include, in addition to preventing differentiation, maintaining the state before differentiation, returning the state after differentiation to the state before differentiation, and the like. Further, "inducing differentiation" in the present specification may include not only causing differentiation but also not hindering differentiation.
例えば、「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、2種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の2種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の1種以上と固形物又は溶媒の1種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。 For example, the "composition" is not particularly limited as having a commonly used meaning, but is, for example, a combination of two or more substances, specifically, an active ingredient and another substance. Examples include those obtained by combining two or more kinds of active ingredients, and more specifically, one or more kinds of active ingredients combined with one or more kinds of solid substances or solvents. Examples thereof include solid compositions and liquid compositions.
粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物は、含有する有効成分が機能することにより、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を示す。 The composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells exhibits an action of suppressing differentiation into mucosal mast cells by the function of the active ingredient contained therein.
大豆の発酵物は、通常知られているとおりに、大豆に微生物を作用させて大豆中の物質を分解及び/又は変換することなどにより得られる発酵物であれば特に限定されない。同様に、麦の発酵物は、通常知られているとおりに、小麦、大麦、裸麦、はと麦などの麦に微生物を作用させて麦中の物質を分解及び/又は変換することなどにより得られる発酵物であれば特に限定されない。 As is generally known, the fermented soybean is not particularly limited as long as it is a fermented product obtained by allowing microorganisms to act on soybean to decompose and / or convert substances in soybean. Similarly, fermented wheat products are obtained by, as is generally known, decomposing and / or converting substances in wheat by allowing microorganisms to act on wheat such as wheat, barley, bare wheat, and adlay. It is not particularly limited as long as it is a fermented product.
本発明の一態様の組成物は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、しょうゆ、みそ及びこれらを含有する飲食品やこれらを用いて調理や加工された飲食品などが挙げられ、調理の際や他の食材や食品とともに用いられるしょうゆ及びみそであることが好ましい。 The composition of one aspect of the present invention is not particularly limited as long as it contains a fermented soybean product and a fermented wheat product, but for example, soy sauce, miso, foods and drinks containing these, and cooking using these are used. Examples include processed foods and drinks, and soy sauce and miso used during cooking and with other ingredients and foods are preferable.
しょうゆやみそは、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、農林水産省により示されている「しょうゆ品質表示基準」や「みそ品質表示基準」において定義付けされているものを挙げることができる。 Soy sauce and miso are not particularly limited as long as they are generally known, and are defined in, for example, "soy sauce quality labeling standard" and "miso quality labeling standard" indicated by the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries. I can mention things.
しょうゆの具体例としては、例えば、こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ、しろしょうゆ、だししょうゆ、照りしょうゆ、生揚げしょうゆなどが挙げられ、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用の強度の観点からこいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆが好ましいが、これらに限定されない。しょうゆは、上記の例示したしょうゆなどをさらなる加工処理に供したものであってもよい。このような加工処理は特に限定されないが、例えば、脱塩処理や希釈処理などが挙げられる。また、しょうゆは、しょうゆ中の特定の成分を減少若しくは排除又はしょうゆに特定の成分を追加する意図をもって製造したしょうゆであってもよく、例えば、無塩下又は減塩下で製造したしょうゆ、トマトなどの野菜成分を追加するように製造したしょうゆなどが挙げられる。しょうゆは、これらのうちの1種を単独で、又は2種以上を組み合わせて使用できる。 Specific examples of soy sauce include koikuchi soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, saishikomi soy sauce, white soy sauce, dashi soy sauce, shining soy sauce, and fried soy sauce. From the viewpoint of strength, Koikuchi soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, saikomi soy sauce and white soy sauce are preferable, but not limited to these. The soy sauce may be a soy sauce obtained by subjecting the above-exemplified soy sauce or the like to further processing. Such a processing treatment is not particularly limited, and examples thereof include desalting treatment and dilution treatment. In addition, soy sauce may be soy sauce produced with the intention of reducing or eliminating specific components in soy sauce or adding specific components to soy sauce, for example, soy sauce produced under unsalted or reduced salt, tomatoes. Examples include soy sauce manufactured to add vegetable ingredients such as. Soy sauce can be used alone or in combination of two or more.
大豆の発酵物、麦の発酵物及びこれらを含有する組成物は、その入手方法について特に限定されず、例えば、市販されているものや当業者により通常知られている手法により製造したものなどを利用することができる。例えば、しょうゆは、本願出願人であるキッコーマン社から市販されているものを挙げることができ、具体的には「キッコーマン しょうゆ」、「キッコーマン 特選丸大豆しょうゆ」、「キッコーマン 特選丸大豆減塩しょうゆ」、「キッコーマン 減塩しょうゆ」、「キッコーマン 特選有機しょうゆ」、「キッコーマン うすくちしょうゆ」などが挙げられるが、これらに限定されない。 The fermented soybean product, the fermented wheat product, and the composition containing these are not particularly limited in terms of the method of obtaining them, and for example, those commercially available or those produced by a method usually known to those skilled in the art can be used. It can be used. For example, soy sauce may be commercially available from Kikkoman, the applicant of the present application, and specifically, "Kikkoman soy sauce", "Kikkoman specially selected whole soy sauce", and "Kikkoman specially selected whole soy sauce with reduced salt". , "Kikkoman low-salt soy sauce", "Kikkoman special organic soy sauce", "Kikkoman thin soy sauce", etc., but not limited to these.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用であって、結果として粘膜型マスト細胞の割合を低め得る作用であれば、その作用機序、合わせて伴う他の作用、程度などについては特に限定されない。粘膜型マスト細胞への分化抑制作用としては特に限定されないが、例えば、非粘膜型マスト細胞の増殖に適した条件下や非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化に適した条件下における、非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用が挙げられる。 The action of suppressing differentiation into mucosal mast cells is an action of suppressing the differentiation of non-mucosal mast cells into mucosal mast cells, and if the action can reduce the proportion of mucosal mast cells as a result, the action. The mechanism, other actions associated with it, the degree, etc. are not particularly limited. The effect of suppressing differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited, but is, for example, under conditions suitable for proliferation of non-mucosal mast cells or under conditions suitable for differentiation of non-mucosal mast cells into mucosal mast cells. , The action of suppressing the differentiation of non-mucosal mast cells into mucosal mast cells can be mentioned.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、例えば、後述する本発明の粘膜型マスト細胞への分化誘導方法において、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用であることが好ましい。未成熟マスト細胞株の具体的な例としては、FcεRIα及びc−Kitを発現し、かつ、MMCP(Mouse Mast Cell Protease)−1、MMCP−2、MMCP−3、MMCP−4、MMCP−5、MMCP−6及びカルボキシペプチダーゼAを実質的に発現しない未成熟マスト細胞株などが挙げられ、より具体的な例としてはマウスの肝臓に由来するマスト細胞を株化したMC/9細胞などが挙げられる。 The action of suppressing differentiation into mucosal mast cells is, for example, an action of suppressing differentiation of immature mast cell lines into mucosal mast cells in the method for inducing differentiation into mucosal mast cells of the present invention, which will be described later. preferable. Specific examples of immature mast cell lines include FcεRIα and c-Kit, and MMCP (Mast Cell Protease) -1, MMCP-2, MMCP-3, MMCP-4, MMCP-5, Examples thereof include immature mast cell lines that do not substantially express MMCP-6 and carboxypeptidase A, and more specific examples include MC / 9 cells in which mast cells derived from mouse liver are established. ..
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定すること、粘膜型マスト細胞が細胞内外に発現するマーカー分子(タンパク質)を測定すること、粘膜型マスト細胞の数や割合を測定することなどにより評価することができる。例えば、粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質について、標識化抗体を用いて細胞内標識をし、次いで標識した細胞の数及び割合を測定することにより評価することができる。 The effect of suppressing differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited in terms of the evaluation method. For example, the expression level of a gene specifically expressed by mucosal mast cells can be measured, and mucosal mast cells are expressed inside and outside the cells. It can be evaluated by measuring the marker molecule (protein) to be used, measuring the number and ratio of mucosal mast cells, and the like. For example, a protein that is specifically expressed intracellularly in mucosal mast cells can be evaluated by intracellularly labeling with a labeled antibody and then measuring the number and proportion of labeled cells.
粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質は、例えば、マウスの系ではMMCP−1及びMMCP−2などが挙げられる。 Examples of proteins that mucosal mast cells specifically express in cells include MMCP-1 and MMCP-2 in mouse systems.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を評価する具体的な第1の評価系は、IL−3及びIL−10の存在下で、MC/9細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養した細胞の量及び割合(population)並びにMMCP−1について標識化した粘膜型マスト細胞(MMCP−1陽性細胞)のpopulationを測定することを含む方法である。粘膜型マスト細胞のpopulationは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ELISAやラジオイムノアッセイ(RIA)などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができるが、特に限定されない。 A specific first evaluation system for evaluating the differentiation inhibitory effect on mucosal mast cells is a combination of MC / 9 cells and the composition of one aspect of the present invention in the presence of IL-3 and IL-10. A method comprising culturing and then measuring the population and proportion of cultured cells and the populationation of mucosal mast cells labeled for MMCP-1 (MMCP-1 positive cells). Population of mucosal mast cells can be measured by, for example, a method such as flow cytometry, a method utilizing an antigen-antibody reaction such as ELISA or radioimmunoassay (RIA), but is not particularly limited.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を評価する具体的な第2の評価系は、IL−3及びIL−10の存在下で、MC/9細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からRNAを抽出し、次いで抽出したRNAを逆転写してcDNAライブラリーを得て、次いで得られたcDNAライブラリーを基にMMCP−1遺伝子の発現量を測定することを含む方法である。 A specific second evaluation system for evaluating the differentiation inhibitory effect on mucosal mast cells is a combination of MC / 9 cells and the composition of one aspect of the present invention in the presence of IL-3 and IL-10. After culturing, RNA is extracted from the cells collected after culturing, and then the extracted RNA is reverse transcribed to obtain a cDNA library, and then the expression level of the MMCP-1 gene is measured based on the obtained cDNA library. It is a method that includes that.
第1及び第2の評価系におけるMC/9細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養させる条件は特に限定されず、例えば、IL−3及びIL−10が失活せず、かつ、MC/9細胞が死滅しないような条件を挙げることができ、マスト細胞の維持又は増殖に適した培地、温度、CO2濃度、pHなどを採用した培養条件であることが好ましい。この際、IL−3及びIL−10に加えて、他の成分が系内に存在していてもよい。他の成分は、サイトカインが失活せず、かつ、マスト細胞が死滅しないような成分であれば特に限定されないが、例えば、細胞培養に通常用いる成分が挙げられ、より具体的には2−メルカプトエタノールなどの還元剤、血清やL−グルタミンなどの細胞増殖に適した栄養成分、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、IL−2といったサイトカインなどの生理活性物質などが挙げられる。他の成分の使用量は、本発明の目的を達成し得る範囲内において、適宜設定することができる。 The conditions for co-culturing the MC / 9 cells and the composition of one aspect of the present invention in the first and second evaluation systems are not particularly limited, and for example, IL-3 and IL-10 are not inactivated and IL-10 is not inactivated. , MC / 9 cells can be mentioned, and it is preferable that the culture conditions employ a medium, temperature, CO 2 concentration, pH, etc. suitable for maintenance or proliferation of mast cells. At this time, in addition to IL-3 and IL-10, other components may be present in the system. The other components are not particularly limited as long as they do not inactivate cytokines and kill mast cells, but examples thereof include components normally used for cell culture, and more specifically 2-mercapto. Examples thereof include reducing agents such as ethanol, nutritional components suitable for cell growth such as serum and L-glutamine, antibiotics such as penicillin and streptomycin, and physiologically active substances such as cytokines such as IL-2. The amount of other components used can be appropriately set within a range in which the object of the present invention can be achieved.
粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、その程度について特に限定されないが、例えば、上記の第1の評価系により、本発明の一態様の組成物を用いない場合と比べて、MMCP−1が陽性である粘膜型マスト細胞(MMCP−1陽性細胞)の割合を低める作用であり、好ましくはMMCP−1陽性細胞の割合を0.9倍以下に低める作用であり、より好ましくはMMCP−1陽性細胞の割合を0.8倍以下に低める作用であり、さらに好ましくはMMCP−1陽性細胞の割合を0.7倍以下に低める作用である。 The degree of the effect of suppressing differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited, but for example, according to the first evaluation system described above, MMCP-1 can be used as compared with the case where the composition of one aspect of the present invention is not used. It is an action of lowering the proportion of positive mucosal mast cells (MMCP-1 positive cells), preferably an action of reducing the proportion of MMCP-1 positive cells to 0.9 times or less, and more preferably MMCP-1 positive. It is an action of reducing the proportion of cells to 0.8 times or less, and more preferably an action of reducing the proportion of MMCP-1-positive cells to 0.7 times or less.
本発明の別の一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、又は粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物を有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物である。 Another aspect of the present invention is an anti-allergic composition containing a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients, or a composition for suppressing differentiation into mucosal mast cells as an active ingredient. is there.
抗アレルギー用組成物は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、アレルギーの症状、アレルギーと関連した疾患の症状及び自己免疫症状などを改善、緩和、抑制、治療若しくは予防するための、又は免疫療法の用に供するための組成物であり得る。 The antiallergic composition is not particularly limited as long as it is generally known, and for example, allergic symptoms, allergic-related disease symptoms, autoimmune symptoms, etc. are improved, alleviated, suppressed, treated or treated. It can be a composition for prevention or for use in immunotherapy.
抗アレルギー用組成物は、消化器官系、例えば、腸、胃、鼻腔、咽頭、口腔などの器官における粘膜組織を介するアレルギーを対象とするものであることが好ましく、食物アレルギー、花粉症、胃炎、腸炎、下痢、潰瘍性大腸炎、鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群及び口内炎を対象とするものであることがより好ましい。しょうゆやみそなどの発酵食品は食物性アレルゲンを含む食材や食品とともに摂取する頻度が高いことから、食物アレルギーを対象とするものであることが好ましく、食物性アレルゲンが接触する可能性がある腸、胃、咽頭、口腔などの器官における粘膜組織を介するアレルギーを対象とするものであることがより好ましい。 The antiallergic composition preferably targets allergies through mucosal tissues in organs such as the digestive system, such as the intestine, stomach, nasal cavity, pharynx, and oral cavity, and includes food allergies, pollinosis, and gastrointestinal inflammation. More preferably, it targets enteritis, diarrhea, ulcerative colitis, rhinitis, bronchitis, bronchial asthma, Refrel syndrome and stomatitis. Fermented foods such as soy sauce and miso are frequently ingested with foods and foods containing food allergens, so it is preferable that they are intended for food allergies, and the intestines that food allergens may come into contact with. More preferably, it targets allergies mediated by mucosal tissues in organs such as the stomach, pharynx, and oral cavity.
免疫応答のメカニズムは未解明な部分が多く、本発明の技術的範囲はいかなる理論や推測にも拘泥されるものではないが、抗アレルギー用組成物は、例えば、適用した被験体において、粘膜型マスト細胞の割合を低下させることにより、粘膜型マスト細胞が活性化することによる脱顆粒、炎症性サイトカインの産生、脂質メディエータの産生などのいずれかの生理的現象の程度を減弱することができ、これにより抗アレルギー作用を発揮し得る。 Although the mechanism of immune response remains largely unclear and the technical scope of the invention is not bound by any theory or speculation, antiallergic compositions can be described, for example, in mucosal types in applied subjects. By reducing the proportion of mast cells, the degree of any physiological phenomenon such as degranulation by activation of mucosal mast cells, production of inflammatory cytokines, production of lipid mediators, etc. can be attenuated. This can exert an anti-allergic effect.
抗アレルギー作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、当業者にとって公知の方法を特に限定せずに挙げることができ、具体的には適用した被験体におけるアレルギーの症状の程度を測定すること、粘膜型マスト細胞から遊離した、又は産生された生理活性物質を測定すること、粘膜型マスト細胞の割合や数を測定することなどにより評価する方法が挙げられる。 The antiallergic action is not particularly limited in its evaluation method, and for example, a method known to those skilled in the art can be mentioned without particular limitation, and specifically, the degree of allergic symptoms in the applied subject is measured. That is, a method of evaluation by measuring a physiologically active substance released or produced from mucosal mast cells, measuring the proportion or number of mucosal mast cells, and the like can be mentioned.
本発明の一態様の組成物の適用対象は特に限定されず、例えば、動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。適用対象は、健常な対象であってもよいが、アレルギーの治療又は予防が望まれる対象であることが好ましい。 The application target of the composition of one aspect of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include animals, particularly mammals, and mammals include humans, dogs, cats, cows, horses, and the like, and among these, humans. Is preferable. The target of application may be a healthy target, but is preferably a target for which treatment or prevention of allergies is desired.
アレルギーの治療又は予防が望まれる対象としては、例えば、粘膜組織を介したアレルギーに罹患している者又はその可能性がある者が挙げられ、小麦アレルギーや大豆アレルギーなどの食物アレルギーを発症している者及び該食物アレルギーを発症する可能性がある者であることが好ましい。 Targets for which treatment or prevention of allergies are desired include, for example, those who have or may have allergies through mucosal tissues, and develop food allergies such as wheat allergies and soybean allergies. It is preferable to be a person who has a food allergy and a person who may develop the food allergy.
本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用及び抗アレルギー作用を有することから、例えば、食物アレルギーを引き起こす可能性がある食物性アレルゲンを含有する食材や食品と併用することができる。本発明の一態様の組成物と併用される食材や食品としては特に限定されないが、例えば、大豆、小麦などの麦などの食物性アレルゲンを含有する食品が好ましい。本発明の一態様の組成物と併用される食材や食品は、本発明の一態様の組成物と同時的に、又はこれと前後して摂取され得る。 Since the composition of one aspect of the present invention has an action of suppressing differentiation into mucosal mast cells and an antiallergic action, it is used in combination with, for example, a food or food containing a food allergen that may cause food allergies. be able to. The foodstuff or food used in combination with the composition of one aspect of the present invention is not particularly limited, but for example, a food containing a food allergen such as wheat such as soybean and wheat is preferable. Ingredients and foods used in combination with the composition of one aspect of the present invention can be ingested simultaneously with or before and after the composition of one aspect of the present invention.
本発明の一態様の組成物は、その適用方法について特に限定されず、例えば、経口的又は非経口的に適用され得る。非経口的な適用としては、皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射及び注入;経皮;鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などが挙げられるが、これらに限定されない。 The composition of one aspect of the present invention is not particularly limited in terms of its application method, and can be applied, for example, orally or parenterally. Parenteral applications include, but are not limited to, injections and injections by intradermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, etc .; transdermal; inhalation through mucosa such as the nose and pharynx.
本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用及び抗アレルギー作用が用量依存傾向にあることから、それらの適用量は年齢、体格、症状などの適用対象の特性;適用方法;適用部位などに合わせて適宜設定することができる。具体的には、本発明の一態様の組成物がしょうゆ又はしょうゆ含有食品である場合、本発明の一態様の組成物の摂取量は、例えば、0.1〜1,000mg/体重60kg/日であるが、これに限定されない。摂取回数は特に限定されないが、例えば、1日1〜3回であり、摂取量に応じて適宜回数を増減することができる。 Since the composition of one aspect of the present invention tends to have a dose-dependent effect on differentiation inhibitory effect on mucosal mast cells and an antiallergic effect, the application amount thereof is the characteristics of the application target such as age, physique, and symptoms; application. Method: It can be appropriately set according to the application site and the like. Specifically, when the composition of one aspect of the present invention is soy sauce or a food containing soy sauce, the intake of the composition of one aspect of the present invention is, for example, 0.1 to 1,000 mg / body weight 60 kg / day. However, it is not limited to this. The number of intakes is not particularly limited, but is, for example, 1 to 3 times a day, and the number of intakes can be appropriately increased or decreased according to the amount of intake.
本発明の一態様の組成物は、これを経口的に摂取することにより、経口免疫寛容が誘導又は増強される場合がある。その結果として、経口免疫寛容により、例えば、食物アレルギーなどのアレルギー症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが可能となる。 The composition of one aspect of the present invention may induce or enhance oral immune tolerance by ingesting it orally. As a result, oral immune tolerance can improve, alleviate, suppress, treat or prevent, for example, allergic symptoms such as food allergies and autoimmune symptoms.
また、本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞により産生される炎症性サイトカインや炎症性メディエータなどの生理活性物質が関与する、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病などの症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。 In addition, the composition of one aspect of the present invention comprises rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, psoriasis, which involves physiologically active substances such as inflammatory cytokines and inflammatory mediators produced by mucosal mast cells. It can be expected to improve, alleviate, suppress, treat or prevent symptoms such as ulcerative colitis and Crohn's disease.
本発明の一態様の組成物は、それらを単独で、又はそれらを配合する飲食品組成物や医薬品組成物などの形態をとり得る。したがって、本発明の具体的な一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、又は本発明の一態様の組成物を含有する、飲食品組成物、医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物、動物飼料組成物などである。 The composition of one aspect of the present invention may take the form of a food or drink composition or a pharmaceutical composition containing them alone or in combination with them. Therefore, a specific aspect of the present invention is a food or drink composition, a quasi-drug, which contains a fermented soybean product and a fermented wheat product as active ingredients, or contains the composition of one aspect of the present invention. These include quasi-drug compositions, cosmetic compositions, and animal feed compositions.
本発明の一態様の組成物が飲食品組成物である場合は、本発明の目的を達成し得る限り、食経験のある、天然物及び非天然物並びにこれらの含有物を配合してもよい。例えば、飲食品組成物には、抗アレルギー効果や経口免疫寛容増強効果が知られている、フラボノイド、ゲニステイン、ゲニスチンなどを含む豆乳;醤油などに含まれる大豆発酵多糖類;ビタミンCなどのビタミン類などを配合することが好ましい。 When the composition of one aspect of the present invention is a food and drink composition, natural products and non-natural products having eating experience and their inclusions may be blended as long as the object of the present invention can be achieved. .. For example, soymilk containing flavonoids, genistein, genistin, etc., which are known to have anti-allergic effects and oral immune tolerance enhancing effects, in food and drink compositions; soybean fermented polysaccharides contained in soy sauce, etc .; vitamins such as vitamin C. It is preferable to mix such as.
飲食品組成物に含有してもよい他の成分としては、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油などの通常の食品加工に使用される添加物を挙げることができる。添加物の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。 Other ingredients that may be contained in the food and drink composition include, for example, sugar sweeteners, stabilizers, emulsifiers, starches, processed starch products, starch decomposition products, salt, flavoring agents, coloring agents, acidulants, and the like. Examples include animal and vegetable foodstuffs such as flavoring ingredients, nutrients, fruit juices and eggs, excipients, bulking agents, binders, thickeners, additives used in ordinary food processing such as perfume oils. The amount of the additive used is not particularly limited as long as it does not interfere with the solution of the problem of the present invention, and can be set as appropriate.
飲食品組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態を採り得る。 The food and drink composition is not particularly limited as long as it is in a commonly used form, and is, for example, solid, liquid, gel, suspension, cream, sheet, stick, powder, granular, granular, or tablet. It can take various forms such as a rod shape, a plate shape, a block shape, a paste shape, a capsule shape, and a caplet shape.
飲食品組成物の具体的な一態様は、例えば、生体に対して一定の機能性を有する飲食品である機能性飲食品である。機能性飲食品は、例えば、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品に加えて、乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品を包含する。さらに機能性飲食品は、コーデックス(FAO/WHO合同食品規格委員会)の食品規格に基づく健康強調表示(Health claim)が適用される健康飲食品を包含する。 A specific aspect of the food and drink composition is, for example, a functional food and drink which is a food and drink having a certain functionality with respect to a living body. Functional foods and drinks include, for example, foods and drinks for specified health use, foods and drinks with functional claims, foods and drinks with nutritional functions, foods and drinks with health functions, foods and drinks for special purposes, foods and drinks for nutritional supplements, healthy foods and drinks, supplements, beauty foods and drinks. In addition to so-called healthy foods and drinks such as, it includes foods and drinks for specific persons such as foods and drinks for infants, foods and drinks for pregnant women, and foods and drinks for the elderly. Further, functional foods and drinks include healthy foods and drinks to which a health claim based on the food standards of Codex (FAO / WHO Joint Food Standards Committee) is applied.
飲食品組成物の包装形態は特に限定されず、適用される形態などに応じて適宜選択できるが、例えば、PTPなどのブリスターパック;ストリップ包装;ヒートシール;アルミパウチ;プラスチックや合成樹脂などを用いるフィルム包装;バイアルなどのガラス容器;アンプルなどのプラスチック容器などが挙げられる。 The packaging form of the food and drink composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the applicable form and the like. For example, a blister pack such as PTP; strip packaging; heat seal; aluminum pouch; plastic or synthetic resin is used. Film packaging; glass containers such as vials; plastic containers such as ampoules.
本発明の一態様の組成物が医薬品組成物である場合は、適用後に少なくとも粘膜型マスト細胞への分化抑制作用が発揮し、それに伴いアレルギーの症状やアレルギーに関連のある疾患の症状を治療又は予防し得る限り、あらゆる医薬品の形態をとり得る。医薬品組成物には、本発明の目的を達成し得る限り、特許文献1に記載されている有効成分などの他の粘膜型マスト細胞への分化抑制作用又は抗アレルギー作用を有する生理活性物質を配合することができる。このような生理活性物質の他の具体例としては、抗IL−10受容体抗体、IL−10アナログ、IL−10受容体拮抗阻害剤、IL−10との複合体形成物質、抗IL−3受容体抗体、IL−3アナログ、IL−3受容体拮抗阻害剤、IL−3との複合体形成物質などが挙げられるが、これらに限定されない。 When the composition of one aspect of the present invention is a pharmaceutical composition, it exerts at least an inhibitory effect on differentiation into mucosal mast cells after application, and accordingly treats or treats allergic symptoms or symptoms of diseases related to allergies. It can take any form of medicine as long as it can be prevented. The pharmaceutical composition contains a physiologically active substance having an inhibitory effect on differentiation into other mucosal mast cells or an antiallergic effect, such as the active ingredient described in Patent Document 1, as long as the object of the present invention can be achieved. can do. Other specific examples of such physiologically active substances include anti-IL-10 receptor antibody, IL-10 analog, IL-10 receptor antagonism inhibitor, complex-forming substance with IL-10, and anti-IL-3. Examples include, but are not limited to, receptor antibodies, IL-3 analogs, IL-3 receptor antagonistic inhibitors, complex-forming substances with IL-3, and the like.
医薬品組成物には、有効成分以外に様々な目的に対するその他の成分を含めてもよく、このようなその他の成分としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のpHを2〜9、好ましくは4〜8の間で維持することができる量で存在することができる。 In addition to the active ingredient, the pharmaceutical composition may contain other ingredients for various purposes, and such other ingredients include, for example, preservatives, buffers, and the like. Preservatives include sodium bisulfite, sodium bisulfite, sodium thiosulfite benzalkonium chloride, chlorobutanol, thimerosal, phenylmercury acetate, phenylmercury nitrate, methylparaben, polyvinyl alcohol, phenylethyl alcohol, ammonia, dithiothreitol, beta. Examples include mercaptoethanol. Examples of the buffer include sodium carbonate, sodium borate, sodium phosphate, sodium acetate, sodium bicarbonate and the like. These agents can be present in an amount capable of maintaining the pH of the system between 2-9, preferably 4-8.
医薬品組成物の剤型は特に限定されないが、例えば、注射剤(筋肉、皮下、皮内)、経口製剤、点鼻製剤などが例示される。例えば、医薬品組成物は、食物アレルギーなどのアレルギー疾患を治療するためのワクチンとして調製することができる。医薬品組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。 The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and examples thereof include injections (muscle, subcutaneous, intradermal), oral preparations, and nasal drops preparations. For example, the pharmaceutical composition can be prepared as a vaccine for treating allergic diseases such as food allergies. When the pharmaceutical composition is in the form of a vaccine, it may be a mixed cocktail vaccine containing a plurality of active ingredients.
粘膜型マスト細胞を安定的かつ効率的に誘導して、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を増加させる方法についてはこれまでに知られていなかったが、本発明者らは方法を構築することに成功した。本明細書にて、本発明者らが見出した粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法を述べる。 Although a method for stably and efficiently inducing mucosal mast cells to increase the ratio of mucosal mast cells per cell has not been known so far, the present inventors should construct a method. succeeded in. In the present specification, the method for inducing differentiation into mucosal mast cells and the method for producing mucosal mast cells found by the present inventors will be described.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法は、未成熟マスト細胞株とインターロイキン−10とを、又は未成熟マスト細胞株とインターロイキン−10及びインターロイキン−3とを接触させることにより、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を誘導する工程を少なくとも含む方法である。粘膜型マスト細胞の製造方法は、未成熟マスト細胞株とインターロイキン−10とを、又は未成熟マスト細胞株とインターロイキン−10及びインターロイキン−3とを接触させることにより、粘膜型マスト細胞を得る工程を含む製造方法である。 The method for inducing differentiation into mucosal mast cells is to contact the immature mast cell line with interleukin-10 or the immature mast cell line with interleukin-10 and interleukin-3 to induce immature mast cells. It is a method that includes at least a step of inducing differentiation from a cell line into mucosal mast cells. The method for producing mucosal mast cells is to bring mucosal mast cells into contact with an immature mast cell line and interleukin-10, or by contacting an immature mast cell line with interleukin-10 and interleukin-3. It is a manufacturing method including a step of obtaining.
いずれの方法においても、IL−3及びIL−10は、それぞれ通常知られているとおりのサイトカインであれば特に限定されない。IL−3及びIL−10は、その入手方法について特に限定されないが、例えば、市販されているものを利用することやT細胞やB細胞などのIL−3やIL−10を分泌する細胞から得た培養上清などを常法に従って分離精製することなどによって入手することできる。IL−3及びIL−10は、その由来生物種については特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタなどの哺乳類が挙げられるが、高度な分化誘導活性が認められるために、マスト細胞と同一の由来生物種であることが好ましい。 In either method, IL-3 and IL-10 are not particularly limited as long as they are cytokines as are usually known. The method of obtaining IL-3 and IL-10 is not particularly limited, but for example, commercially available ones can be used or obtained from cells secreting IL-3 or IL-10 such as T cells and B cells. It can be obtained by separating and purifying the culture supernatant or the like according to a conventional method. The species of origin of IL-3 and IL-10 are not particularly limited, and examples thereof include mammals such as humans, mice, rats, cows, dogs, horses, cats, sheep, and pigs, but they are highly differentiated. Since the inducing activity is observed, it is preferable that the species is the same as the mast cell.
いずれの方法においても、未成熟マスト細胞株は、通常知られているとおりの骨髄その他の組織に由来するマスト細胞であれば特に限定されないが、例えば、異質性があり、かつ、表現型が粘膜型マスト細胞だけではなく、結合組織型マスト細胞にもなり得るマスト細胞株であることが好ましい。未成熟マスト細胞株は、マスト細胞が特異的に発現するタンパク質を発現するものがより好ましく、FcεRIα及びc−Kitからなる群から選ばれるタンパク質を発現するものがさらに好ましく、FcεRIα及びc−Kitの両方を発現するものがなおさらに好ましい。また、前記未成熟マスト細胞株は、FcεRIα及びc−Kitを発現し、かつ、MMCP−1、MMCP−2、MMCP−3、MMCP−4、MMCP−5、MMCP−6及びカルボキシペプチダーゼAを実質的に発現しない未成熟マスト細胞株であることが好ましい。 In either method, the immature mast cell line is not particularly limited as long as it is a mast cell derived from bone marrow or other tissues as is usually known, but for example, it is heterologous and the phenotype is mucosal. It is preferable that the mast cell line can be not only a type mast cell but also a connective tissue type mast cell. The immature mast cell line is more preferably one that expresses a protein specifically expressed by mast cells, further preferably one that expresses a protein selected from the group consisting of FcεRIα and c-Kit, and of FcεRIα and c-Kit. Those expressing both are even more preferable. In addition, the immature mast cell line expresses FcεRIα and c-Kit, and substantially MMCP-1, MMCP-2, MMCP-3, MMCP-4, MMCP-5, MMCP-6 and carboxypeptidase A. It is preferably an immature mast cell line that is not specifically expressed.
未成熟マスト細胞株は、粘膜型マスト細胞が発現する少なくともいずれか1種のタンパク質の発現が陰性であると評価することによって、粘膜型マスト細胞と区別し得る。例えば、マウスにおいては、未成熟マスト細胞株は、粘膜型マスト細胞が発現するキマーゼの1種であるMMCP(Mouse Mast Cell Protease)−1の発現については陰性と評価される。したがって、粘膜型マスト細胞への分化誘導方法は、例えば、マウスの系においては、MMCP−1陰性であると評価される未成熟マスト細胞株からMMCP−1陽性であると評価される粘膜型マスト細胞への分化を誘導する工程を少なくとも含む方法と表すことができる。 Immature mast cell lines can be distinguished from mucosal mast cells by assessing negative expression of at least one protein expressed by mucosal mast cells. For example, in mice, immature mast cell lines are evaluated as negative for the expression of MMCP (Mouse Mast Cell Protease) -1, which is one of the chymase expressed by mucosal mast cells. Therefore, the method for inducing differentiation into mucosal mast cells is, for example, in a mouse system, a mucosal mast that is evaluated as MMCP-1 positive from an immature mast cell line that is evaluated as MMCP-1 negative. It can be described as a method that includes at least a step of inducing differentiation into cells.
未成熟マスト細胞株は、その入手方法については特に限定されず、例えば、TC Moon, et al(MucosalImmunology, Vol. 3, No. 2, (2010), pp.111-128)に記載されているとおりに、IL−3の存在下又は非存在下で、骨髄中のマスト細胞前駆体やその他の組織に存在するマスト細胞を株化することにより、取得することができる。未成熟マスト細胞株の具体例としては、マウスの肝臓に由来するマスト細胞株であるMC/9細胞などが挙げられるが、これに限定されない。 The method of obtaining the immature mast cell line is not particularly limited, and is described in, for example, TC Moon, et al (Mucosal Immunology, Vol. 3, No. 2, (2010), pp.111-128). As described above, it can be obtained by straining mast cells present in mast cell precursors and other tissues in bone marrow in the presence or absence of IL-3. Specific examples of the immature mast cell line include, but are not limited to, MC / 9 cells, which are mast cell lines derived from mouse liver.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法では、IL−10と、又はIL−10及びIL−3と未成熟マスト細胞株とを接触させることを含む。いずれの方法においても、これらサイトカインと未成熟マスト細胞株とを接触させる条件は特に限定されず、例えば、IL−10及びIL−3が失活せず、かつ、未成熟マスト細胞株が死滅しないような条件を挙げることができ、未成熟マスト細胞株の維持又は増殖に適した培地、温度、CO2濃度、pHなどの培養条件であることが好ましい。 The method for inducing differentiation into mucosal mast cells and the method for producing mucosal mast cells include contacting IL-10 or IL-10 and IL-3 with an immature mast cell line. In either method, the conditions for contacting these cytokines with the immature mast cell line are not particularly limited, and for example, IL-10 and IL-3 are not inactivated and the immature mast cell line is not killed. Such conditions can be mentioned, and it is preferable that the culture conditions are suitable for the maintenance or proliferation of the immature mast cell line , such as medium, temperature, CO 2 concentration, and pH.
未成熟マスト細胞株の細胞数並びにIL−10及びIL−3の添加量は特に限定されない。未成熟マスト細胞株の細胞数は、例えば、通常in vitroで細胞培養する際に用いられる細胞数が挙げられ、培養容器の材質や形状によって適宜設定することができるが、より具体的には103〜108cells/ml程度であり、104〜106cells/mlであることが好ましい。IL−10及びIL−3の添加量は、例えば、通常細胞に対して活性を示し得るとされている範囲の量が挙げられ、未成熟マスト細胞株の細胞数によって適宜設定することができるが、より具体的には0.1ng/ml〜5,000ng/mlであり、1〜1,000ng/mlであることが好ましく、10〜300ng/mlであることがより好ましく、20〜200ng/mlであることがさらに好ましい。 The number of cells in the immature mast cell line and the amount of IL-10 and IL-3 added are not particularly limited. The number of cells in the immature mast cell line includes, for example, the number of cells normally used for cell culture in vitro, and can be appropriately set depending on the material and shape of the culture vessel, but more specifically, 10 It is about 3 to 10 8 cells / ml, and preferably 10 4 to 6 cells / ml. The amount of IL-10 and IL-3 added is, for example, an amount in the range in which activity can be exhibited with respect to normal cells, and can be appropriately set depending on the number of cells in the immature mast cell line. More specifically, it is 0.1 ng / ml to 5,000 ng / ml, preferably 1 to 1,000 ng / ml, more preferably 10 to 300 ng / ml, and 20 to 200 ng / ml. Is more preferable.
IL−3を用いる場合、IL−3の使用方法については特に限定されず、例えば、未成熟マスト細胞株とIL−10とを接触させるときと同時に、又はそのときに前後して、未成熟マスト細胞株と接触させる方法が挙げられるが、IL−3はIL−10と同時に未成熟マスト細胞株に接触させることが好ましい。 When IL-3 is used, the method of using IL-3 is not particularly limited, and for example, the immature mast cell line is brought into contact with the IL-10 at the same time, or before or after that time. Although a method of contacting with a cell line can be mentioned, it is preferable that IL-3 is brought into contact with an immature mast cell line at the same time as IL-10.
未成熟マスト細胞株とIL−10及びIL−3といったサイトカインとの接触時間は特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞の存在が確認できる時間などが挙げられるが、未成熟マスト細胞株の培養時間に相当する2〜4日間程度が好ましい。その他の接触条件は、通常の細胞培養に適した条件であれば特に限定されないが、静置培養であることが好ましい。 The contact time between the immature mast cell line and cytokines such as IL-10 and IL-3 is not particularly limited, and examples thereof include a time during which the presence of mucosal mast cells can be confirmed. It is preferably about 2 to 4 days, which corresponds to the time. Other contact conditions are not particularly limited as long as they are suitable for normal cell culture, but static culture is preferable.
未成熟マスト細胞株とIL−10及びIL−3といったサイトカインとを接触させる際に、他の成分が系内に存在していてもよい。他の成分は、サイトカインが失活せず、かつ、未成熟マスト細胞株が死滅しないような成分であれば特に限定されないが、例えば、通常細胞培養に用いる成分が挙げられ、より具体的には2−メルカプトエタノールなどの還元剤、血清やL−グルタミンなどの細胞増殖に適した栄養成分、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、IL−2といったサイトカインなどの生理活性物質などが挙げられる。他の成分の使用量は、本発明の目的を達成し得る範囲内において、適宜設定することができる。 Other components may be present in the system upon contact of the immature mast cell line with cytokines such as IL-10 and IL-3. The other components are not particularly limited as long as they do not inactivate cytokines and do not kill immature mast cell lines, but examples thereof include components normally used for cell culture, and more specifically. Examples thereof include reducing agents such as 2-mercaptoethanol, nutritional components suitable for cell growth such as serum and L-glutamine, antibiotics such as penicillin and streptomycin, and physiologically active substances such as cytokines such as IL-2. The amount of other components used can be appropriately set within a range in which the object of the present invention can be achieved.
未成熟マスト細胞株とIL−10及びIL−3といったサイトカインとを接触させることにより、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞を分化誘導できる。粘膜型マスト細胞への分化誘導作用は、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を誘導する作用であって、結果として粘膜型マスト細胞の割合を高め得る作用であれば、その作用機序や合わせて伴う他の作用などについては特に限定されない。 By contacting the immature mast cell line with cytokines such as IL-10 and IL-3, mucosal mast cells can be induced to differentiate from the immature mast cell line. The action of inducing differentiation into mucosal mast cells is an action of inducing differentiation of immature mast cell lines into mucosal mast cells, and if the action can increase the proportion of mucosal mast cells as a result, the action. The mechanism and other actions associated with it are not particularly limited.
粘膜型マスト細胞への分化誘導は、その評価方法について特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定すること、粘膜型マスト細胞が細胞内外に発現するマーカー分子(タンパク質)を測定すること、粘膜型マスト細胞の数や割合を測定することなどにより評価することができる。例えば、粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質について、標識化抗体を用いて細胞内標識をし、次いで標識した細胞の数及び割合を測定することにより評価することができる。 The induction of differentiation into mucosal mast cells is not particularly limited in the evaluation method. For example, the expression level of a gene specifically expressed by mucosal mast cells is measured, and mucosal mast cells are expressed inside and outside the cells. It can be evaluated by measuring a marker molecule (protein), measuring the number and ratio of mucosal mast cells, and the like. For example, a protein that is specifically expressed intracellularly in mucosal mast cells can be evaluated by intracellularly labeling with a labeled antibody and then measuring the number and proportion of labeled cells.
粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質は、例えば、マウスの系ではMMCP−1及びMMCP−2などが挙げられる。 Examples of proteins that mucosal mast cells specifically express in cells include MMCP-1 and MMCP-2 in mouse systems.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法の具体的な一態様として、例えば、未成熟マスト細胞株とIL−10とを、又はIL−10及びIL−3とを共培養し、次いで培養した細胞の量及び割合(population)並びに細胞内標識又は細胞外標識した粘膜型マスト細胞のpopulationを測定することを含む方法である。粘膜型マスト細胞のpopulationは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ELISAやラジオイムノアッセイ(RIA)などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができるが、特に限定されない。 As a specific embodiment of the method for inducing differentiation into mucosal mast cells, for example, immature mast cell lines and IL-10, or IL-10 and IL-3 are co-cultured, and then the cultured cells are used. A method comprising measuring the amount and proportion (population) and the populationation of intracellular or extracellularly labeled mucosal mast cells. Population of mucosal mast cells can be measured by, for example, a method such as flow cytometry, a method utilizing an antigen-antibody reaction such as ELISA or radioimmunoassay (RIA), but is not particularly limited.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法の別の具体的な一態様として、例えば、未成熟マスト細胞株とIL−10とを、又はIL−10及びIL−3とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からRNAを抽出し、次いで抽出したRNAを逆転写してcDNAライブラリーを得て、次いで得られたcDNAライブラリーを基に粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定することを含む方法が挙げられる。 As another specific embodiment of the method for inducing differentiation into mucosal mast cells, for example, immature mast cell lines and IL-10, or IL-10 and IL-3 are co-cultured, and then after culturing. RNA is extracted from the collected cells, then the extracted RNA is reverse transcribed to obtain a cDNA library, and then the expression level of genes specifically expressed by mucosal mast cells is measured based on the obtained cDNA library. There are methods that include doing.
粘膜型マスト細胞への分化誘導方法を応用した方法の一つとしては、本発明の別の一態様である、未成熟マスト細胞株とIL−10とを、又はIL−10及びIL−3とを接触させることにより、粘膜型マスト細胞を得る工程を少なくとも含む、粘膜型マスト細胞の製造方法が挙げられる。 As one of the methods to which the method for inducing differentiation into mucosal mast cells is applied, an immature mast cell line and IL-10, or IL-10 and IL-3, which are another aspect of the present invention, are used. A method for producing mucosal mast cells, which comprises at least a step of obtaining mucosal mast cells by contacting the cells.
粘膜型マスト細胞の製造方法により製造される粘膜型マスト細胞は、in vivo又はex vivoでの使用が考えられる。例えば、製造された粘膜型マスト細胞を被験体の粘膜組織に適用することにより、被験体の寄生虫感染防御やその他の粘膜感染症の症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。 The mucosal mast cells produced by the method for producing mucosal mast cells are considered to be used in vivo or ex vivo. For example, by applying the produced mucosal mast cells to the mucosal tissue of the subject, it is expected to improve, alleviate, suppress, treat or prevent the subject's parasite infection protection and other symptoms of mucosal infection. it can.
本発明の一態様である方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。また、工程内及び工程間は、連続的又は断続的に実施することができる。 In the method according to one aspect of the present invention, various steps and operations can be added to the pre-stage or the post-stage or the process of the above-mentioned steps as long as the object of the present invention can be achieved. In addition, it can be carried out continuously or intermittently within and between steps.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples, and the present invention can take various aspects as long as the problems of the present invention can be solved. ..
[実施例1]
マウスマスト細胞株であるMC/9細胞を用いて、粘膜型マスト細胞(MMCP−1陽性細胞)を以下のとおりに誘導した。
[Example 1]
Mucosal mast cells (MMCP-1-positive cells) were induced as follows using MC / 9 cells, which are mouse mast cell lines.
マウスの粘膜型マスト細胞は、マスト細胞の表面マーカー分子であるFcεRIα及びc−Kitを発現すると同時に、細胞内にMMCP−1というプロテアーゼを発現する。マウスマスト細胞株であるMC/9細胞は、FcεRIα及びc−Kitを発現しているが、粘膜型のマーカーであるMMCP−1を発現していない。そこで、MC/9細胞を粘膜型へ分化させることを目的に、下記の実験を実施した。 Mast cell mucosa of mice expresses FcεRIα and c-Kit, which are surface marker molecules of mast cells, and at the same time, expresses a protease called MMCP-1 in the cells. MC / 9 cells, which are mouse mast cell lines, express FcεRIα and c-Kit, but do not express the mucosal marker MMCP-1. Therefore, the following experiment was carried out for the purpose of differentiating MC / 9 cells into the mucosal type.
1.細胞培養のための培地の調製
SIGMA社製Dulbecco’s Modified Eagle’s培地に、下記の終濃度になるように試薬を添加して、培地を調製した。
10%(w/v) FBS
1%(w/v) Penicilline/Streptomycin
2mM L−glutamine
0.05mM 2−mercaptoethanol
10%(w/v) Rat T−STIM(日本ベクトン・ディッキンソン社製)
1. 1. Preparation of medium for cell culture A reagent was added to Dulvecco's Modified Eagle's medium manufactured by SIGMA so as to have the following final concentration to prepare a medium.
10% (w / v) FBS
1% (w / v) Penicillline / Streptomycin
2 mM L-glutamine
0.05 mM 2-mercaptoethanol
10% (w / v) Rat T-STIM (manufactured by Becton Dickinson, Japan)
2.MC/9細胞懸濁液の調製
MC/9(ATCC CRL−8306)凍結ストックを培地に添加し、週に2回程度培地を交換しながら培養した。5継代(P5)の時点で3×106 cells/mLのワーキングストックを作成した。ワーキングストックを培地に添加し、培養後週に2回程度で継代しながら培養することにより、P9以降の細胞を回収した。回収した細胞について、培地で1回洗浄した後、トリパンブルー(Gibco社製)で懸濁し血球計算板を用いて細胞数を計測した。その後、2×106 cells/mLになるように培地に懸濁することにより、MC/9細胞懸濁液を調製した。
2. Preparation of MC / 9 cell suspension MC / 9 (ATCC CRL-8306) frozen stock was added to the medium, and the cells were cultured while changing the medium about twice a week. At the time of 5 passages (P5), a working stock of 3 × 10 6 cells / mL was prepared. The working stock was added to the medium, and the cells after P9 were collected by culturing while subculturing about twice a week after culturing. The collected cells were washed once with a medium, suspended in trypan blue (manufactured by Gibco), and the number of cells was counted using a hemocytometer. The MC / 9 cell suspension was then prepared by suspending in medium to 2 × 10 6 cells / mL.
3.サイトカイン溶液の調製
mouse recombinant protein IL−3(100μM;eBioscience社製)及びmouse recombinant protein IL−10(100μM;eBioscience社製)を、それぞれ120ng/mlとなるように培地で希釈して、IL−3溶液及びIL−10溶液を調製した。
3. 3. Preparation of Cytokine Solution Mouse recombinant protein IL-3 (100 μM; manufactured by eBioscience) and mouse recombinant protein IL-10 (100 μM; manufactured by eBioscience) are diluted with a medium to 120 ng / ml, respectively, to a concentration of 120 ng / ml. A solution and an IL-10 solution were prepared.
4.抗IL−10受容体抗体(αIL−10R抗体)溶液の調製
Purified anti−mouse CD210(IL−10R) Antibody(500μM;Biolegend社製)を、それぞれ12、120及び1200ng/mlとなるように培地で希釈することにより、αIL−10R抗体を調製した。
4. Preparation of anti-IL-10 receptor antibody (αIL-10R antibody) solution Purified anti-mouse CD210 (IL-10R) Antibody (500 μM; manufactured by BioLegend) in a medium at 12, 120 and 1200 ng / ml, respectively. The αIL-10R antibody was prepared by dilution.
5.培養方法
表1の例1〜10が示すとおりに、96ウェル平底プレート(BD FALCON社製)の各ウェルに、内容物が所定の最終濃度になるように上記溶液及び培地を添加して、3日間培養した。ただし、上記培地として、Rat T−STIMを含有しない培地を用いた。
5. Culturing method As shown in Examples 1 to 10 of Table 1, the above solution and medium were added to each well of a 96-well flat bottom plate (manufactured by BD FALCON) so that the contents had a predetermined final concentration, and 3 Incubated for days. However, as the above medium, a medium containing no Rat T-STIM was used.
6.細胞数計測のためのFACSAria解析
培養後に回収した細胞を、1×PBS/2%FBSで2回洗浄した後、Fcブロック(BD Bioscience社製)と反応させた。次いで、反応後の細胞を、PE標識anti−mouse FcεRIα(Biolegend社製)及びPE/cy7標識anti−mouse CD117(c−Kit)(Biolegend社製)と反応させた。次いで、反応後の細胞を、1×PBSで1回洗浄した後、Fixable Viability Dye eFluor 450(eBioscience社製)と反応させた。
6. FACSAria analysis for cell numbering The cells collected after culturing were washed twice with 1 × PBS / 2% FBS and then reacted with Fc block (manufactured by BD Bioscience). The cells after the reaction were then reacted with PE-labeled anti-mouse FcεRIα (manufactured by BioLegend) and PE / cy7-labeled anti-mouse CD117 (c-Kit) (manufactured by BioLegend). Then, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS and then reacted with Fixable Viability Dye eFluor 450 (manufactured by eBioscience).
次いで、反応後の細胞を、1×PBS/2%FBSで1回洗浄した後、ICバッファー(eBioscience社製)を用いて固定化した。次いで、固定化した細胞を、Permeabilizationバッファー(eBioscience社製)を用いて洗浄した後、Alexa647標識抗MMCP−1抗体(purified anti−mouse MCPT−1(mMCP−1)(eBioscience社製)をAlexaFlour647 Antibody Labeling Kit(life technology社製)にて標識したもの)と反応させ細胞内標識を行った。次いで、標識した細胞を、1×PBS/2%FBSで洗浄し、さらに同バッファー200μLに懸濁した後、FACSAriaを用いて解析した。解析の際、特定量のBD FACSTM Accudrop Beads(BD Bioscience社製)を既知体積のサンプルに加え、細胞とともにビーズを計測した。ビーズ量とビーズの取り込み数、生細胞の取り込み数から全細胞数を算出した。さらに全細胞数とMMCP−1陽性細胞の割合とから、MMCP−1陽性細胞数を算出した。 Then, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS / 2% FBS and then immobilized with an IC buffer (manufactured by eBioscience). Then, the immobilized cells were washed with a Permeabilization buffer (manufactured by eBioscience), and then Alexa647-labeled anti-MMCP-1 antibody (purified anti-mouse MCPT-1 (mMCP-1) (manufactured by eBioscience) was added to AlexaFlour647Ant. Intracellular labeling was performed by reacting with a Labeling Kit (labeled by life technology). The labeled cells were then washed with 1 × PBS / 2% FBS, suspended in 200 μL of the same buffer, and then analyzed using FACSAria. During the analysis, a specific amount of BD FACS TM Accudrop Beads (manufactured by BD Bioscience) was added to a sample of known volume and beads were measured along with the cells. The total number of cells was calculated from the amount of beads, the number of beads taken up, and the number of live cells taken up. Furthermore, the number of MMCP-1 positive cells was calculated from the total number of cells and the ratio of MMCP-1 positive cells.
7.細胞数解析結果
FACSAria解析の結果について、例1〜7の結果をまとめたものを図1に示し、例2、例6及び例8〜10の結果をまとめたものを図2に示す。
7. Cell Number Analysis Results Regarding the results of FACSAria analysis, the results of Examples 1 to 7 are summarized in FIG. 1, and the results of Examples 2, 6 and 8 to 10 are summarized in FIG.
(1)例1〜7の結果(図1A〜C)
図1Aが示すとおり、IL−3添加条件と比較して、IL−10添加条件では、MMCP−1陽性細胞の割合の顕著な増加が見られた。また、図1Bが示すとおり、MMCP−1陽性細胞数についても、これらの比較から、IL−10を添加することにより増加傾向を示すことがわかった。
(1) Results of Examples 1 to 7 (FIGS. 1A to 1C)
As shown in FIG. 1A, a significant increase in the proportion of MMCP-1-positive cells was observed under the IL-10 addition condition as compared with the IL-3 addition condition. Further, as shown in FIG. 1B, it was found from these comparisons that the number of MMCP-1 positive cells also showed an increasing tendency by adding IL-10.
総細胞数については、図1Cが示すとおり、サイトカイン非添加条件においては、十分な細胞の増殖が見られなかった。また、IL−3及びIL−10を独立して添加した際には、それぞれ細胞数が増加することが確認されたが、これらの間の増加の程度については、大きな差異はなかった。 As for the total number of cells, as shown in FIG. 1C, sufficient cell proliferation was not observed under the cytokine-free condition. In addition, it was confirmed that the number of cells increased when IL-3 and IL-10 were added independently, but there was no significant difference in the degree of increase between them.
IL−3添加条件とIL−10添加条件との比較から、MMCP−1陽性細胞はIL−10依存的に分化誘導することが確認された。 From the comparison between the IL-3 addition condition and the IL-10 addition condition, it was confirmed that the MMCP-1-positive cells induce differentiation in an IL-10-dependent manner.
一方、IL−3とIL−10とを同時に添加した条件下においては、MMCP−1陽性細胞の割合が増加することが確認された(図1Aを参照)。しかし、その増加の程度は、IL−10を単独で添加した条件と比較して、顕著に大きいというものではなかった。一方、MMCP−1陽性細胞数及び総細胞数については、IL−3添加条件及びIL−10添加条件と比べて、相乗的に顕著に増加することが確認された(図1B及び図1Cを参照)。 On the other hand, it was confirmed that the proportion of MMCP-1-positive cells increased under the condition that IL-3 and IL-10 were added at the same time (see FIG. 1A). However, the degree of the increase was not remarkably large as compared with the condition in which IL-10 was added alone. On the other hand, it was confirmed that the number of MMCP-1 positive cells and the total number of cells were synergistically and significantly increased as compared with the IL-3 addition condition and the IL-10 addition condition (see FIGS. 1B and 1C). ).
図1の結果より、IL−10は濃度依存的にMC/9細胞からMMCP−1陽性細胞を分化誘導する作用があることが確認された。 From the results shown in FIG. 1, it was confirmed that IL-10 has an action of inducing differentiation of MMCP-1-positive cells from MC / 9 cells in a concentration-dependent manner.
(2)例2、例6及び例8〜10の結果(図2A〜C)
抗IL−10受容体抗体を添加することでマスト細胞が発現するIL−10受容体をブロックし、IL−10シグナルを阻害することにより、MMCP−1陽性細胞の誘導がどのような影響を受けるかについて評価した。
(2) Results of Examples 2, 6 and 8 to 10 (FIGS. 2A to 2C)
How is the induction of MMCP-1-positive cells affected by blocking the IL-10 receptor expressed by mast cells by adding an anti-IL-10 receptor antibody and inhibiting the IL-10 signal? Was evaluated.
図2A及び図2Bに示すとおり、IL−3添加条件及びIL−10添加条件と比較して、抗IL−10受容体(aIL−10R)抗体を添加する条件では、濃度依存的なMMCP−1陽性細胞の割合及び数の顕著な減少が確認された。しかし、図2Cが示すとおり、全細胞数は、抗IL−10受容体抗体を添加することにより若干減少したものの、その程度はMMCP−1陽性細胞の割合の減少の程度と比較すると非常に小さかった。すなわち、抗IL−10受容体抗体を添加することにより、総細胞数に与える影響は小さいながらも、MMCP−1陽性細胞の数及び割合を格別顕著に減少した。 As shown in FIGS. 2A and 2B, the concentration-dependent MMCP-1 under the condition of adding the anti-IL-10 receptor (aIL-10R) antibody as compared with the condition of adding IL-3 and the condition of adding IL-10. A significant decrease in the proportion and number of positive cells was confirmed. However, as shown in FIG. 2C, although the total cell number was slightly reduced by the addition of the anti-IL-10 receptor antibody, the degree was very small compared to the degree of reduction in the proportion of MMCP-1-positive cells. It was. That is, the addition of the anti-IL-10 receptor antibody significantly reduced the number and proportion of MMCP-1-positive cells, although the effect on the total number of cells was small.
図2の結果より、IL−10はMC/9細胞からMMCP−1陽性細胞を分化誘導する作用があることが確認されたとともに、IL−10とIL−10受容体との結合を阻害することにより、MMCP−1陽性細胞の割合及び数を減じることができることがわかった。 From the results of FIG. 2, it was confirmed that IL-10 has an effect of inducing differentiation of MMCP-1-positive cells from MC / 9 cells, and also inhibits the binding between IL-10 and the IL-10 receptor. It was found that the proportion and number of MMCP-1-positive cells can be reduced.
[実施例2]
しょうゆが粘膜型マスト細胞の分化を抑制する効果を有することについて、複数の市販しょうゆ及びモデルしょうゆを用いて、以下のとおりに評価した。
[Example 2]
The effect of soy sauce on suppressing the differentiation of mucosal mast cells was evaluated as follows using a plurality of commercially available soy sauces and model soy sauces.
マウスの粘膜型マスト細胞は、マスト細胞の表面マーカー分子であるFcεRIα及びc−Kitを発現すると同時に、細胞内にMMCP−1というプロテアーゼを発現する。マウスマスト細胞株であるMC/9は、FcεRIα及びc−Kitを発現しているが、粘膜型のマーカーであるMMCP−1を発現していない。そこで、MC/9から粘膜型マスト細胞(MMCP−1陽性細胞)への分化を利用して、しょうゆによる分化抑制効果について、下記の実験を実施した。 Mast cell mucosa of mice expresses FcεRIα and c-Kit, which are surface marker molecules of mast cells, and at the same time, expresses a protease called MMCP-1 in the cells. The mouse mast cell line MC / 9 expresses FcεRIα and c-Kit, but does not express the mucosal marker MMCP-1. Therefore, the following experiment was carried out on the differentiation-suppressing effect of soy sauce using the differentiation of MC / 9 into mucosal mast cells (MMCP-1 positive cells).
1.細胞培養のための培地の調製
SIGMA社製Dulbecco’s Modified Eagle’s培地に、下記の終濃度になるように試薬を添加して、培地を調製した。
10%(w/v) FBS
1%(w/v) Penicilline/Streptomycin
2mM L−glutamine
0.05mM 2−mercaptoethanol
10%(w/v) Rat T−STIM(日本ベクトン・ディッキンソン社製)
1. 1. Preparation of medium for cell culture A reagent was added to Dulvecco's Modified Eagle's medium manufactured by SIGMA so as to have the following final concentration to prepare a medium.
10% (w / v) FBS
1% (w / v) Penicillline / Streptomycin
2 mM L-glutamine
0.05 mM 2-mercaptoethanol
10% (w / v) Rat T-STIM (manufactured by Becton Dickinson, Japan)
2.MC/9細胞懸濁液の調製
MC/9(ATCC CRL−8306)凍結ストックを培地に添加し、週に2回程度培地を交換しながら培養した。5継代(P5)の時点で3×106 cells/mLのワーキングストックを作成した。ワーキングストックを培地に添加し、培養後週に2回程度で継代しながら培養することにより、P9以降の細胞を回収した。回収した細胞について、培地で1回洗浄した後、トリパンブルー(Gibco社製)で懸濁し血球計算板を用いて細胞数を計測した。その後、2×106 cells/mLになるように培地に懸濁することにより、MC/9細胞懸濁液を調製した。
2. Preparation of MC / 9 cell suspension MC / 9 (ATCC CRL-8306) frozen stock was added to the medium, and the cells were cultured while changing the medium about twice a week. At the time of 5 passages (P5), a working stock of 3 × 10 6 cells / mL was prepared. The working stock was added to the medium, and the cells after P9 were collected by culturing while subculturing about twice a week after culturing. The collected cells were washed once with a medium, suspended in trypan blue (manufactured by Gibco), and the number of cells was counted using a hemocytometer. The MC / 9 cell suspension was then prepared by suspending in medium to 2 × 10 6 cells / mL.
3.サイトカイン溶液の調製
mouse recombinant protein IL−3(100μM;eBioscience社製)及びmouse recombinant protein IL−10(100μM;eBioscience社製)を、それぞれ120ng/mlとなるように培地で希釈して、IL−3溶液及びIL−10溶液を調製した。
3. 3. Preparation of Cytokine Solution Mouse recombinant protein IL-3 (100 μM; manufactured by eBioscience) and mouse recombinant protein IL-10 (100 μM; manufactured by eBioscience) are diluted with a medium to 120 ng / ml, respectively, to a concentration of 120 ng / ml. A solution and an IL-10 solution were prepared.
4.被験しょうゆ試料の調製
被験しょうゆ試料として、下記の市販しょうゆ及びモデルしょうゆについて、しょうゆ原液の濃度を1として、培地を用いて60倍、120倍、240倍、480倍又は960倍に希釈して試験に供した。
市販しょうゆ:こいくちしょうゆ、特選丸大豆しょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、脱塩しょうゆ(特選丸大豆しょうゆを脱塩処理したもの)(以上、すべてキッコーマン社製)
モデルしょうゆ:たまりしょうゆ(キッコーマン社製)に含まれる成分のうち、酸、食塩、アルコール及びアミノ酸を、たまりしょうゆに含まれる濃度で配合して調製したもの
4. Preparation of test soy sauce sample As a test soy sauce sample, the following commercially available soy sauce and model soy sauce are tested by diluting them 60 times, 120 times, 240 times, 480 times, or 960 times with a medium, with the concentration of the soy sauce stock solution set to 1. Served to.
Commercially available soy sauce: Koikuchi soy sauce, specially selected whole soy sauce, thin soy sauce, tamari soy sauce, desalted soy sauce (desalted specially selected whole soy sauce) (all manufactured by Kikkoman)
Model soy sauce: Of the ingredients contained in Tamari soy sauce (manufactured by Kikkoman), acid, salt, alcohol and amino acids are mixed and prepared at the concentration contained in Tamari soy sauce.
5.培養方法
表1及び表2の例1〜28が示すとおりに、96ウェル平底プレート(BD FALCON社製)の各ウェルに、内容物が所定の最終濃度になるように上記溶液及び培地を添加して、初発細胞数を1.0×105cells/wellとして3日間培養した。ただし、上記培地として、Rat T−STIMを含有しない培地を用いた。
5. Culturing Method As shown in Examples 1 to 28 of Table 1 and Table 2, the above solution and medium were added to each well of a 96-well flat bottom plate (manufactured by BD FALCON) so that the contents had a predetermined final concentration. Te, and cultured for 3 days the number of initial cells as 1.0 × 10 5 cells / well. However, as the above medium, a medium containing no Rat T-STIM was used.
6.細胞数計測のためのFACSAria解析
培養後に回収した細胞を、1×PBS/2%FBSで2回洗浄した後、Fcブロック(BD Bioscience社製)と反応させた。次いで、反応後の細胞を、PE標識anti−mouse FcεRIα(Biolegend社製)及びPE/cy7標識anti−mouse CD117(c−Kit)(Biolegend社製)と反応させた。次いで、反応後の細胞を、1×PBSで1回洗浄した後、Fixable Viability Dye eFluor 450(eBioscience社製)と反応させた。
6. FACSAria analysis for cell numbering The cells collected after culturing were washed twice with 1 × PBS / 2% FBS and then reacted with Fc block (manufactured by BD Bioscience). The cells after the reaction were then reacted with PE-labeled anti-mouse FcεRIα (manufactured by BioLegend) and PE / cy7-labeled anti-mouse CD117 (c-Kit) (manufactured by BioLegend). Then, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS and then reacted with Fixable Viability Dye eFluor 450 (manufactured by eBioscience).
次いで、反応後の細胞を、1×PBS/2%FBSで1回洗浄した後、ICバッファー(eBioscience社製)を用いて固定化した。次いで、固定化した細胞を、Permeabilizationバッファー(eBioscience社製)を用いて洗浄した後、Alexa647標識抗MMCP−1抗体(purified anti−mouse MCPT−1(mMCP−1)(eBioscience社製)をAlexaFlour647 Antibody Labeling Kit(life technology社製)にて標識したもの)と反応させ細胞内標識を行った。次いで、標識した細胞を、1×PBS/2%FBSで洗浄し、さらに同バッファー200μLに懸濁した後、FACSAriaを用いて解析した。解析の際、特定量のBD FACSTM Accudrop Beads(BD Bioscience社製)を既知体積のサンプルに加え、細胞とともにビーズを計測した。ビーズ量とビーズの取り込み数、生細胞の取り込み数から全細胞数を算出した。さらに全細胞数とMMCP−1陽性細胞の割合とから、MMCP−1陽性細胞数を算出した。 Then, the cells after the reaction were washed once with 1 × PBS / 2% FBS and then immobilized with an IC buffer (manufactured by eBioscience). Then, the immobilized cells were washed with a Permeabilization buffer (manufactured by eBioscience), and then Alexa647-labeled anti-MMCP-1 antibody (purified anti-mouse MCPT-1 (mMCP-1) (manufactured by eBioscience) was added to AlexaFlour647Ant. Intracellular labeling was performed by reacting with a Labeling Kit (labeled by life technology). The labeled cells were then washed with 1 × PBS / 2% FBS, suspended in 200 μL of the same buffer, and then analyzed using FACSAria. During the analysis, a specific amount of BD FACS TM Accudrop Beads (manufactured by BD Bioscience) was added to a sample of known volume and beads were measured along with the cells. The total number of cells was calculated from the amount of beads, the number of beads taken up, and the number of live cells taken up. Furthermore, the number of MMCP-1 positive cells was calculated from the total number of cells and the ratio of MMCP-1 positive cells.
7.細胞数解析結果
FACSAria解析の結果について、表1に示す例1〜8の結果をまとめたものを図1に示し、表2に示す例9〜28の結果をまとめたものを図2に示す。
7. Cell Number Analysis Results Regarding the results of FACSAria analysis, FIG. 1 shows a summary of the results of Examples 1 to 8 shown in Table 1, and FIG. 2 shows a summary of the results of Examples 9 to 28 shown in Table 2.
(1)例1〜8の結果(図1A〜C)
図3Aが示すとおり、IL−10のみを添加した場合やIL−3及びIL−10を添加した場合と比較して、脱塩しょうゆを添加した場合では、濃度依存的にMMCP−1陽性細胞の割合が減少した。同様に、図3Bが示すとおり、MMCP−1陽性細胞数についても、濃度依存的にMMCP−1陽性細胞数が減少する傾向にあることを確認した。一方で、図3Cが示すとおり、総細胞数については、このような傾向は見られなかった。
(1) Results of Examples 1 to 8 (FIGS. 1A to 1C)
As shown in FIG. 3A, when desalted soy sauce was added as compared with the case where only IL-10 was added or when IL-3 and IL-10 were added, the MMCP-1-positive cells were concentrated in a concentration-dependent manner. The proportion has decreased. Similarly, as shown in FIG. 3B, it was confirmed that the number of MMCP-1 positive cells also tended to decrease in a concentration-dependent manner. On the other hand, as shown in FIG. 3C, such a tendency was not observed in the total number of cells.
図3の結果より、しょうゆには、細胞の生存率については影響を与えずにして、濃度依存的にMC/9細胞からのMMCP−1陽性細胞への分化を抑制する作用があることが確認された。 From the results shown in FIG. 3, it was confirmed that soy sauce has an effect of suppressing the differentiation of MC / 9 cells into MMCP-1-positive cells in a concentration-dependent manner without affecting the cell viability. Was done.
(2)例9〜28の結果(図2)
図4に示すとおり、サイトカインのみを添加した場合と比較して、サイトカインに加えて、脱塩しょうゆ、こいくちしょうゆ、たまりしょうゆ、特選丸大豆しょうゆ又はうすくちしょうゆを加えた場合は、MMCP−1陽性細胞の割合が減少した。しかし、しょうゆを製造する際の発酵工程によって主として得られるペプチドやタンパク質を含まないモデルしょうゆでは、MMCP−1陽性細胞の割合の減少はみられなかった。
(2) Results of Examples 9 to 28 (Fig. 2)
As shown in FIG. 4, compared with the case where only cytokines are added, when desalted soy sauce, koikuchi soy sauce, tamari soy sauce, specially selected whole soy sauce or light soy sauce is added, MMCP-1 The proportion of positive cells decreased. However, the proportion of MMCP-1-positive cells was not reduced in the model soy sauce containing no peptide or protein, which was mainly obtained by the fermentation process in the production of soy sauce.
図4の結果より、しょうゆのような発酵食品は、MC/9細胞からのMMCP−1陽性細胞への分化を抑制する作用があることが確認された。 From the results shown in FIG. 4, it was confirmed that fermented foods such as soy sauce have an effect of suppressing the differentiation of MC / 9 cells into MMCP-1-positive cells.
本発明の一態様の組成物は、未成熟マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用及び抗アレルギー作用を通じて、健常者に加えて、粘膜型マスト細胞の割合の増加に関連した疾患や症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することを期待する摂取者にとって有用なものであり、このような摂取者の健康及び福祉に資するものとして利用可能なものである。また、本明細書で開示される方法は、未成熟マスト細胞株を安定的に粘膜型マスト細胞へ誘導することができることから、粘膜型マスト細胞の割合を高める目的や、粘膜型マスト細胞の機序を評価する目的において利用可能である。 The composition of one aspect of the present invention is a disease associated with an increase in the proportion of mucosal mast cells in addition to healthy subjects through an action of suppressing the differentiation of immature mast cells into mucosal mast cells and an antiallergic action. It is useful for ingestors who expect to improve, alleviate, suppress, treat or prevent mast cells and symptoms, and can be used as a contribution to the health and welfare of such ingestors. In addition, the method disclosed herein can stably induce an immature mast cell line to mucosal mast cells, and therefore has the purpose of increasing the proportion of mucosal mast cells and the mechanism of mucosal mast cells. It can be used for the purpose of evaluating the introduction.
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