JP6820319B2 - 増強された感度を有するイムノアッセイ - Google Patents
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Description
イムノアッセイ感度を改善することは、イン・ビトロ診断試験の開発における長年の目標であった。患者のトリアージにおける早期の疾病検出及び費用効果のための高感度のバイオマーカー測定の利点は、十分に文書化されている。時間の経過とともに、それぞれのその後の反復が改善された感度を特徴とする、いくつかの世代において多くの臨床アッセイが提供されている。トロポニンIイムノアッセイは、高感度のバージョンが最先端技術を代表する、そのような例の1つである。
定義
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、以下に定義するもののほか、当業者によって理解される、当該用語の通常の意味に従って解釈されるべきである。
本発明は、任意の好適な発光検出システムを使用することができる。一実施形態において、本発明は、プローブ先端上の蛍光シグナルを測定するため、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,492,139号に記載されたものと同様の蛍光検出システムを使用する。該システムは、以下:(a)少なくとも5対1の長さ対幅のアスペクト比を有するプローブであって、第1の端部及び第2の端部を有し、当該第2の端部は蛍光標識に結合された検知表面を有する、プローブ;(b)励起光をプローブの検知表面に直接放射するための光源;(c)検知表面に向けられた集光レンズ;並びに(d)発光蛍光を検出するための光検出器;を備え、ここで、前記集光レンズが発光蛍光を集光し、光検出器に導く。
放出光を検出するのに適した光検出器は、光電子増倍管(PMT)、電荷結合素子(CCD)、又はフォトダイオードである。
第1の態様において、本発明は、発光標識抗体及び酸溶出プロトコルを用いて、液体サンプル中の分析物を検出する方法に関する。
第2の態様では、本発明は、複数の発光標識を有する結合対及び高分子量ポリマーを用いて、液体サンプル中の分析物を検出する方法に関する。
実施例1〜12は、本発明の一実施形態、すなわち、蛍光色素で高度に標識された結合対及び架橋ポリマーを用いる循環増幅による溶出アッセイを説明する。実施例13は、本発明の別の実施形態、すなわち、蛍光色素で直接標識した抗体を用いる溶出アッセイを説明する。
直径1mm、長さ2cmの石英プローブを、製造業者のプロトコルに従って化学気相成長法(Yield Engineering Systems、1224P)を用いて、アミノプロピルシランで被覆した。次にプローブ先端を、ネズミモノクローナル抗フルオレセイン(Biospacific)、10μg/mlのpH7.4のPBS(リン酸緩衝食塩水)中溶液中に浸漬した。抗体をプローブに20分間吸着させた後、プローブ先端をPBS中で洗浄した。これらの抗体被覆プローブを実施例1〜12に使用した。
PBS中に20mg/mlでのFicoll 400 kD(Skold Technology)当たり88個のアミンを含むようにアミノ化された、FICOLL(登録商標)400(Sigma/Aldrich)の2mlに、DMF(N,N−ジメチルホルムアミド)中に50mg/mlでのSPDP(スクシンイミジル6−[3−[2−ピリジルジチオ]−プロピオンアミド(proprionamido)]ヘキサノエート、Invitrogen)の10μLを添加した。SPDP対Ficoll分子カップリング比(molecular coupling ratio)(MCR)は、15であった。混合物を1時間室温で反応させ、続いて透析した。チオールの取り込みは、標準的方法によってFicoll 400 kD当たり5.5と推定された。
DMF中の5mg/mlでのCy5−NHS(GE Healthcare)の32μLを、0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)中の2.4mg/mlでのストレプトアビジン(Scripps Labs)の1mlと、40分間30℃で反応させた。混合物をPD 10カラム(Pharmacia)に適用して、非結合Cy5を除去した。スペクトル解析は、ストレプトアビジン1分子当たり2.8のCy5が連結されることを示した。
DMF中10mg/mlでのSMCC(スクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル(malemidomethyl)]シクロヘキサン−1−カルボキシレート)(Pierce Chemical)の5.8μLを、1mlのPBS(pH7.4)中の2mgのCy5−ストレプトアビジン(実施例2)と、1時間室温で反応させた。混合物をPD 10カラムに適用して、非結合SMCCを除去した。
本実施例は、図7に示した一般的な循環増幅プロトコルに従う。表1は、トロポニン(TnI)、インターロイキン−6(IL−6)及びプロカルシトニン(PCT)について用いられたアッセイを示す。サンプルの20μLを、アッセイ緩衝液(100μLのPBS、5mg/mlのBSA、0.05%のTween 20、pH7.4)と混合し、プローブを浸漬した。洗浄緩衝液は、200μLのPBS、0.05%のTween 20であった。TnI(Hytest)、IL−6(Biospacific)、及びPCT(Hytest)のための抗体を、標準的方法でビオチン化し(B−ab)、120μL中の約5μg/mlでアッセイに使用した。Cy5−ストレプトアビジン−FICOLL(登録商標)を、120μL中の約10μg/mlで使用した。
実施例6は、実施例5のプロトコルに従って、溶出に対する酸性緩衝液の影響を示す。異なる酸性緩衝液は以下の通りであった:10mMのグリシン/HCl、pH2.0;10mMグリシン/HCl、pH3.0;100mMの酢酸ナトリウム/酢酸、pH4.0。
実施例7は、実施例5のプロトコルに従って、pH4〜5.5からの溶出に対する酸性緩衝液の影響を示す。異なる酸緩衝液は以下の通りであった:100mMの酢酸ナトリウム/酢酸、pH4.0;100mMの酢酸ナトリウム/酢酸、pH5.0;100mMの酢酸ナトリウム/酢酸、pH5.5。
ブランクの限界(LOB)は、平均ブランク+1.645x(SDブランク)として定義され、
検出限界(LOD)は、LOB+1.645x(SDブランク)として定義される、
SDは標準偏差である。
(Davidら、Clin. Biochem. Rev. 29:S49~52)
実施例5のpH4でのトロポニンの溶出プロトコルに従って、39体の明らかに正常な個体からの39個のヘパリン血漿サンプルを、直接アッセイ(リード1、酸溶出なし)及び溶出アッセイ(リード2、酸溶出あり)により、トロポニンレベルについて測定した。39個の正常サンプルの100%のトロポニンレベルを、溶出アッセイで検出したが、リード1では46%しか検出されなかった。結果は、本発明の溶出アッセイの利点が正常範囲内のTnIを検出することに適用されることを示している。
実施例8のトロポニンの溶出プロトコルに従って、611個の正常血清サンプルをトロポニンレベルについて検出した。
IL−6は、高感度測定を必要とする別の分析物である。表8は、pH4.0酸溶出を用いて、実施例6のプロトコルに従う、IL−6についてのデータを示している。
表9は、pH4.0酸溶出を用いるPCTアッセイのプロトコルを示す。蛍光シグナルを、代替光学検出構成を用いて測定した。広いレーザービーム及び集光レンズの開口数を有する光学系は、液相中に溶出された標識抗体を直接検出する。
実施例13は、本発明の別の実施形態、すなわち、蛍光色素で直接標識された抗体を用いて、かつ循環増幅しない溶出アッセイを示す。このアッセイは、図5に示された一般的プロトコルに従う。
直径1mm、長さ2cmの石英プローブを、製造業者のプロトコルに従って化学気相成長法(Yield Engineering Systems、1224P)を用いて、アミノプロピルシランで被覆した。次に、プローブ先端を、リン酸緩衝食塩水pH7.4(PBS)中の10μg/mLでのストレプトアビジン(Sigma-Aldrich)の溶液に浸漬した。タンパク質をプローブに5分間吸着させた後、プローブ先端をPBS中で洗浄した。次にプローブ先端を、PBS中の10μg/mLでのビオチン標識抗CRP(Hytest)を含有する溶液に浸漬した。10分後、プローブ先端をPBS中で洗浄した。抗体を標準的方法によってビオチン化した。ビオチン化された抗体を「捕捉抗体」として指定した。
1mlの0.1M炭酸ナトリウム(pH9.5)中の3.2mg/mLでの抗CRP(Hytest)を、DMF中10mg/mlでのCy5−NHS(GE Healthcare)の10.6μLと混合し、1/2時間30℃で反応させた。次に混合物をPD 10カラム(GE Healthcare)上で精製した。Cy5標識抗体を「シグナル抗体」として指定した。
Claims (14)
- 液体サンプル中の分析物を検出する方法であって、以下の工程:
(a)プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第1の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第1の抗体を有し;
(b)前記プローブ先端を、発光標識とコンジュゲートした分析物に対する第2の抗体を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第1の抗体、及び前記第2の抗体との間で免疫複合体を形成させ;
(c)前記プローブ先端を、洗浄溶液を含む洗浄容器中に浸漬し;
(d)前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第1の発光シグナルを測定し;
(e)前記プローブ先端を、pH2.0〜5.0を有する溶出溶液中に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ;
(f)前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第2の発光シグナルを測定し;
(g)前記第1の発光シグナルから前記第2の発光シグナルを減算することによって、溶出された物質の発光シグナルを計算し、そして、分析物量を決定すること、
を含む、方法。 - 液体サンプル中の分析物を検出する方法であって、以下の順で以下の工程:
(a)プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第1の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第1の抗体を有し;
(b)前記プローブ先端を、結合対の第1のメンバーとコンジュゲートした分析物に対する第2の抗体の試薬を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、前記試薬を前記分析物に結合させ;
(c)前記プローブ先端を、第1の洗浄溶液を含む第1の洗浄容器中に浸漬して、前記プローブ先端を洗浄し;
(d)前記プローブ先端を、少なくとも100万ダルトンの分子量を有し、かつ結合対の第2のメンバーの少なくとも5分子及び少なくとも25個の発光標識とコンジュゲートした、架橋多糖を含有する増幅溶液を含む増幅容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第1の抗体、前記第2の抗体、並びに前記結合対の第1及び第2のメンバーの免疫複合体を形成させ;
(e)前記プローブ先端を、第2の洗浄溶液を含む第2の洗浄容器中に浸漬し;
(f)前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第1の発光シグナルを測定し;
(g)前記プローブ先端を、pH2.0〜5.0を有する溶出溶液に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ;
(h)前記プローブ先端を読み取り容器に浸漬し、そして、プローブ先端上に結合した物質の第2の発光シグナルを測定し;
(i)前記第1の発光シグナルから前記第2の発光シグナルを減算することによって、溶出された物質の発光シグナルを計算し、そして、分析物量を決定すること、
を含む、方法。 - 工程(f)の後で、かつ(g)の前に、以下の工程(f’):
(f’)工程(b)〜(e)を1〜10回繰り返すこと、
をさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 液体サンプル中の分析物を検出する方法であって、以下の順で以下の工程:
(a)プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第1の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第1の抗体を有し;
(b)前記プローブ先端を、結合対の第1のメンバーとコンジュゲートした分析物に対する第2の抗体の試薬を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、前記試薬を前記分析物に結合させ;
(c)前記プローブ先端を、第1の洗浄溶液を含む第1の洗浄容器中に浸漬して、前記プローブ先端を洗浄し;
(d)前記プローブ先端を、少なくとも100万ダルトンの分子量を有し、かつ結合対の第2のメンバーの少なくとも5分子及び少なくとも25個の発光標識とコンジュゲートした、架橋多糖を含有する増幅溶液を含む増幅容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第1の抗体、前記第2の抗体、並びに前記結合対の第1及び第2のメンバーの免疫複合体を形成させ;
(e)前記プローブ先端を、第2の洗浄溶液を含む第2の洗浄容器中に浸漬し;
(f)前記プローブ先端を、pH2.0〜5.0を有する溶出溶液を含む溶出容器中に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ;
(g)前記溶出容器から前記プローブ先端を取り出し;
(h)前記溶出容器中の溶出された物質の発光シグナルを測定し、そして、分析物量を決定すること、
を含む、方法。 - 工程(e)の後で、かつ工程(f)の前に、以下の工程(e’):
(e’)工程(b)〜(e)を1〜10回繰り返すこと、
をさらに含む、請求項4に記載の方法。 - 前記先端表面が≦約5mmである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 液体サンプル中の分析物を検出する方法であって、以下の工程:
(a)プローブ先端を、サンプル溶液を含むサンプル容器中に浸漬して、分析物を、存在する場合、プローブ先端上の第1の抗体に結合させ、ここで、前記プローブは、プローブの先端に固定化された分析物に対する第1の抗体を有し;
(b)前記プローブ先端を、発光標識とコンジュゲートした分析物に対する第2の抗体を含有する試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、プローブ先端上で前記分析物、前記第1の抗体、及び前記第2の抗体との間で免疫複合体を形成させ;
(c)前記プローブ先端を、洗浄溶液を含む洗浄容器中に浸漬し;
(d)前記プローブ先端を、pH2.0〜5.0を有する溶出溶液を含む溶出容器中に浸漬して、前記プローブ先端から物質を溶出させ;
(e)前記溶出容器から前記プローブ先端を取り出し;
(f)前記溶出容器中の溶出された物質の発光シグナルを測定し、そして、分析物量を決定すること、
を含み、
ここで、前記先端表面が≦約5mmである、方法。
- 前記発光標識が蛍光標識である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光標識がアリールスルホネートシアニン(arylsulfonate cyanine)である、請求項8に記載の方法。
- 前記発光標識が、ルテニウム(II)トリス−ビピリジンである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合対の第1のメンバーがビオチンであり、かつ前記結合対の第2のメンバーがストレプトアビジンである、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多糖が、スクロース及びエピクロロヒドリンのコポリマーである、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析物がトロポニンである、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出溶液が、3.0〜4.0のpHを有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
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