JP6818718B2 - Modified Amadriase - Google Patents
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Description
本発明は、改変アマドリアーゼ、その遺伝子および組み換え体ＤＮＡ、並びに糖化アミノ酸への作用が改変されたアマドリアーゼの製造法に関する。 The present invention relates to a modified amadriase, a gene and recombinant DNA thereof, and a method for producing amadriase having a modified action on glycated amino acids.
糖化蛋白質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、蛋白質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。蛋白質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、蛋白質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化蛋白質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。 A glycated protein is produced by non-enzymatically forming a covalent bond between an aldehyde group of an aldose (a monosaccharide having an aldehyde group and a derivative thereof) such as glucose and an amino group of the protein, and transferring to Amadori. Is. Examples of the amino group of the protein include an amino-terminal α-amino group and an ε-amino group of the lysine residue side chain in the protein. As glycated proteins generated in the living body, glycated hemoglobin in which hemoglobin in blood is saccharified, glycated albumin in which albumin is saccharified, and the like are known.
これら生体内で生じる糖化蛋白質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ヘモグロビンはαサブユニット（以降α鎖と表記）２分子とβサブユニット（以降β鎖と表記）２分子の計４分子のサブユニットから構成される蛋白質であり、β鎖のアミノ末端が糖化されたヘモグロビンはＨｂＡ１ｃと称されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。 Among these glycated proteins generated in vivo, glycated hemoglobin (HbA1c) is attracting attention as an important blood glucose control marker for diagnosis and symptom management of diabetic patients in the field of clinical diagnosis of diabetes. Hemoglobin is a protein composed of two α subunits (hereinafter referred to as α chain) and two β subunits (hereinafter referred to as β chain), a total of four subunits, and the amino end of the β chain is glycated. Hemoglobin is called HbA1c. The HbA1c concentration in blood reflects the average blood glucose level over a certain period in the past, and the measured value is an important index in the diagnosis and management of diabetic symptoms.
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）、若しくはα−フルクトシルバリン（以降αＦＶと表す）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照）。
実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きく、定量性が低いと考えられている。そのため、現在では特定のプロテアーゼを用いてＨｂＡ１ｃのβ鎖からαＦＶＨを遊離させ、それを定量することによりＨｂＡ１ｃを測定する方法が主流となっている。
As a method for measuring this HbA1c quickly and easily, an enzymatic method using amadriase, that is, α-fructosylvalyl histidine (hereinafter referred to as αFVH) obtained by decomposing HbA1c with a protease or the like and releasing it from the β-chain amino terminus thereof. ), Or a method for quantifying α-fructosylvaline (hereinafter referred to as αFV) has been proposed (see, for example,
Actually, in the method of cutting out αFV from HbA1c, it is considered that the influence of impurities and the like is large and the quantitativeness is low. Therefore, at present, a method of measuring HbA1c by releasing αFVH from the β chain of HbA1c using a specific protease and quantifying it is the mainstream.
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する。
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１６、非特許文献１〜９参照）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
Amadriase catalyzes the reaction of oxidizing imino2acetic acid or its derivatives (also referred to as "Amadori compounds") in the presence of oxygen to produce glyoxylic acid or α-ketoaldehyde, amino acids or peptides, and hydrogen peroxide. To do.
Amadriase has been found in bacteria, yeasts and fungi, but is particularly useful for the measurement of HbA1c, and examples of amadriase having enzymatic activity against αFVH and / or αFV include, for example, the genus Coniochaeta, eupenicilium ( Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Curvularia, Neocosmospora, Cryptococcus, Cryptococcus, Feosperia, Feosperia, Feosperia Emericella, Ulocladium, Penicillium, Fusarium, Achaetomiella, Achaetomiella, Achaetomiula, Achaetomium, Sierrabia, Sierrabia, Sierrabia Genus Gelasinospora, genus Microascus, genus Leptosphaeria, genus Opiobolus, genus Pleospora, genus Pleospora, genus Coniochaetidium, genus Coniochaetidium, genus Pionia , Amadriase derived from the genus Agrobacterium and the genus Arthrobacter have been reported (see, for example,
酵素的方法によるＨｂＡ１ｃの測定においては、アマドリアーゼの性質として厳密な基質特異性が要求される。例えば、先述の様に、特定のプロテアーゼにより遊離されたαＦＶＨを定量することによりＨｂＡ１ｃの測定を実施する場合には、検体中に遊離状態で存在する、および／または、プロテアーゼ等を用いたＨｂＡ１ｃの処理工程において遊離される、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸や糖化ペプチドには作用し難いアマドリアーゼを用いることが望ましい。また、ヘモグロビン分子中に含まれるリジン残基側鎖のε位のアミノ基は糖化を受けることが知られており、この糖化を受けたリジン残基に由来する、ε位のアミノ基が糖化されたε−フルクトシルリジン（以降εＦＫと表す）が、プロテアーゼ処理等によって遊離されることが示唆されている（非特許文献１０参照）。 In the measurement of HbA1c by an enzymatic method, strict substrate specificity is required as a property of amadriase. For example, as described above, when HbA1c is measured by quantifying αFVH released by a specific protease, it is present in the sample in a free state and / or HbA1c using a protease or the like. It is desirable to use amadriase which is difficult to act on glycated amino acids and glycated peptides other than αFVH released in the treatment step. Further, it is known that the amino group at the ε-position of the lysine residue side chain contained in the hemoglobin molecule undergoes saccharification, and the amino group at the ε-position derived from the lysine residue that has undergone this glycation is saccharified. It has been suggested that ε-fructosyllysine (hereinafter referred to as εFK) is released by protease treatment or the like (see Non-Patent Document 10).
実際、現在実用化されているＨｂＡ１ｃ測定法として、測定用のサンプルとして全血を利用するキットが存在しているが、全血中には、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端に由来するαＦＶＨ以外にも、種々の糖化アミノ酸が存在していることが示唆されている（特許文献１７参照）。このような現象は、例えば、特に高カロリーアミノ酸輸液が投与された患者で多く発生し、同様の現象が糖化アルブミンの測定においても正誤差を生じ得ることが報告されている（非特許文献１１〜１３参照）。この現象は、高カロリーアミノ酸輸液によって、高濃度の糖およびアミノ酸が体内に補充された結果、血中もしくは輸液バッグ中で遊離の糖化アミノ酸または糖化ペプチドが生成し、これを測り込んでしまうために、測定値が異常に高値となるものと考えられている。
In fact, as an HbA1c measurement method currently in practical use, there is a kit that uses whole blood as a sample for measurement, but in whole blood, in addition to αFVH derived from the β-chain amino terminus of HbA1c, , It has been suggested that various glycated amino acids are present (see Patent Document 17). It has been reported that such a phenomenon occurs frequently, for example, especially in patients who have been administered a high-calorie amino acid infusion, and that the same phenomenon can cause a positive error in the measurement of glycated albumin (Non-Patent
具体的に、高カロリー輸液にどの程度のアミノ酸および糖が含まれているかというと、例えば、アミノトリパ（登録商標）１号輸液（大塚製薬工場社製）中には、Ｌ−ロイシンが３１．４ｍＭ、Ｌ−アラニンが２６．４ｍＭ、グリシンが２３．１ｍＭ、Ｌ−バリンが２０．１ｍＭ、Ｌ−イソロイシンが１７．９ｍＭ、グルコースが５２１ｍＭ含有されている。また、ユニカリック（登録商標）Ｎ輸液（テルモ社製）中には、Ｌ−ロイシンが３０．９ｍＭ、Ｌ−アラニンが２９．０ｍＭ、グリシンが２２．０ｍＭ、Ｌ−バリンが２３．０ｍＭ、Ｌ−イソロイシンが１９．４ｍＭ、グルコースが９７１ｍＭ含まれている。このような種々のアミノ酸を含有する輸液を体内に補充することにより、血中には、種々の糖化アミノ酸、例えば、α−フルクトシルロイシン（以降αＦＬと表す）、α−フルクトシルアラニン（以降αＦＡと表す）、α−フルクトシルグリシン（以降αＦＧと表す）、αＦＶ、α−フルクトシルイソロイシン（以降αＦＩと表す）等が生成され得る。ＨｂＡ１ｃを測定するにあたっては、αＦＶＨ以外のこれらの物質は、測定誤差の原因物質となることが予測されるため、こうした糖化アミノ酸に対し作用し難い、基質特異性の高いアマドリアーゼが強く望まれている。 Specifically, how much amino acids and sugars are contained in the high-calorie infusion, for example, in the aminotripa (registered trademark) No. 1 infusion (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory, Ltd.), L-leucine is 31.4 mM. , L-alanine is 26.4 mM, glycine is 23.1 mM, L-valine is 20.1 mM, L-isoleucine is 17.9 mM, and glucose is 521 mM. In addition, L-leucine is 30.9 mM, L-alanine is 29.0 mM, glycine is 22.0 mM, L-valine is 23.0 mM, and L-valine is contained in Unicalic (registered trademark) N infusion solution (manufactured by Terumo). It contains 19.4 mM of isoleucine and 971 mM of glucose. By supplementing the body with an infusion solution containing such various amino acids, various saccharified amino acids such as α-fructosyl leucine (hereinafter referred to as αFL) and α-fructosylalanine (hereinafter referred to as αFA) are contained in the blood. ), Α-fructosylglycine (hereinafter referred to as αFG), αFV, α-fructosyl isoleucine (hereinafter referred to as αFI) and the like can be produced. In measuring HbA1c, since these substances other than αFVH are predicted to be causative substances of measurement error, amadriase having high substrate specificity, which is difficult to act on these glycated amino acids, is strongly desired. ..
一般的な技術として、酵素の基質特異性を改変するためには、酵素をコードするＤＮＡに変異を加え、酵素のアミノ酸に置換を導入し、目的とする基質特異性を備えた酵素を選抜する方法が知られている。また、アミノ酸配列の同一性の高い酵素において、アミノ酸置換によって基質特異性を高めたという例が既に知られている場合には、その情報をもとに基質特異性の向上を予想することが可能である。 As a general technique, in order to modify the substrate specificity of an enzyme, a mutation is added to the DNA encoding the enzyme, a substitution is introduced into the amino acid of the enzyme, and an enzyme having the desired substrate specificity is selected. The method is known. In addition, if it is already known that an enzyme having a high amino acid sequence identity has increased substrate specificity by amino acid substitution, it is possible to predict the improvement of substrate specificity based on that information. Is.
実際、カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ）ＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼおよびネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）４７４由来のケトアミンオキシダーゼについては、数個のアミノ酸を置換することによって、αＦＶＨに対する基質特異性が向上した改変型ケトアミンオキシダーゼが示されている（特許文献１参照）。例えば、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼにおいては、５８位のイソロイシンをバリンに、６２位のアルギニンをヒスチジンに、３３０位のフェニルアラニンをロイシンに置換することにより、ε−フルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニルリジン）（以降εＦＺＫと表す）に対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比であるεＦＺＫ／αＦＶＨが０．９５から０．０２５へと低減し、かつ、αＦＶに対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比であるαＦＶ／αＦＶＨが６．３から２．２へと低減することが示されている。 In fact, for ketoamine oxidase from Curvularia clavata YH923 and ketoamine oxidase from Neocosmospora vasinfecta 474, substrate specificity for αFVH can be achieved by substituting a few amino acids. An improved modified ketoamine oxidase has been shown (see Patent Document 1). For example, in ketoamine oxidase derived from curbularia clavata YH923, isoleucine at position 58 is replaced with valine, arginine at position 62 is replaced with histidine, and phenylalanine at position 330 is replaced with leucine, thereby ε-fructosyl- (α-benzyl). ΕFZK / αFVH, which is the activity ratio derived by dividing the enzyme activity for oxycarbonyllysine (hereinafter referred to as εFZK) by the enzyme activity for αFVH, is reduced from 0.95 to 0.025, and the enzyme activity for αFV is reduced. It has been shown that αFV / αFVH, which is the activity ratio derived by dividing by the enzyme activity for αFVH, is reduced from 6.3 to 2.2.
しかし、上記文献において開示される改変型ケトアミンオキシダーゼはαＦＶ／αＦＶＨが低減しているものの、αＦＶの影響を十分に回避できたとはいえない。また、εＦＺＫやαＦＶ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低減を確認している旨の記載もない。 However, although the modified ketoamine oxidase disclosed in the above document has reduced αFV / αFVH, it cannot be said that the influence of αFV can be sufficiently avoided. In addition, there is no description that the reduction of reactivity with saccharified amino acids other than εFZK and αFV has been confirmed.
また、アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ａ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、αＦＶＨに対する反応性を新たに付与した改変型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが報告されている（特許文献１１参照）。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ Ａ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの、５９位のセリンをグリシンに、かつ６５位のリジンをグリシンに置換することにより、または１０９位のリジンをグルタミンに置換することにより、新たにαＦＶＨに対する酵素活性が付与され、αＦＶ／αＦＶＨは２．９となることが示されている。しかしながら、当該アミノ酸置換が糖化アミノ酸に対する反応性の低減に寄与するとの記載はなく、この変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおいても、αＦＶ等の糖化アミノ酸の影響を十分に回避できたとはいえない。
In addition, a modified fructosyl amino acid oxidase that newly imparted reactivity to αFVH by introducing amino acid substitution into fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans A89 and modifying the substrate specificity was reported. (See Patent Document 11). For example, in the fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans A89, by substituting serine at position 59 with glycine and lysine at
実際の測定条件は個々に異なるが、公知の文献中に、各種アマドリアーゼのεＦＫに対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比である「εＦＫ／αＦＶＨ」および／またはεＦＫに対する酵素活性をαＦＶに対する酵素活性で割って導いた活性比である「εＦＫ／αＦＶ」を低減させた改変型アマドリアーゼに関する開示がみられる：Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来アマドリアーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、εＦＫ／αＦＶＨおよび／またはεＦＫ／αＦＶが低い改変型アマドリアーゼが報告されている（特許文献１８参照）。 Although the actual measurement conditions differ from one to another, in known literature, the enzyme activity for εFK and / or the enzyme activity for εFK, which is the activity ratio derived by dividing the enzyme activity for εFK of various amadriase by the enzyme activity for αFVH, is described. There is a disclosure of a modified amadriase with reduced "εFK / αFV", which is the activity ratio derived by dividing by the enzymatic activity for αFV: amadriase from the genus Coniochaeta, fructosyl amino acid oxidase from Aspergillus nidulans, penicillium chrysogenum ΕFK / αFVH and / or Type amadriase has been reported (see Patent Document 18).
例えば、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼの９８位のグルタミン酸をアラニンに、１５４位のセリンをアスパラギンに、２５９位のバリンをシステインに置換することにより、εＦＫ／αＦＶＨが０．３１６から０．０１７まで低減され、αＦＶ／αＦＶＨは３．３７から２．３２に低減されることが示されている。また、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、εＦＫ／αＦＶＨが低い改変型アマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１４参照）。
また、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの５８番目のイソロイシンをスレオニンに、２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに置換することにより、εＦＫ／αＦＶＨが０．１３から０．０２まで低減され、αＦＶ／αＦＶＨは４．９から０．５に低減されることが示されている。さらに５８番目のイソロイシンをスレオニンに、２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに、１１０番目のグルタミンをフェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、またはリジンに置換することにより、αＦＶ／αＦＶＨは４．９から０．４に低減されることが示されている。
しかしながら、これらの置換を導入することによっても、αＦＶＨを測定する上でαＦＶの影響が回避されているとは言い難い。
For example, by substituting glutamic acid at position 98 of Amadriase from the genus Coniochaeta with alanine, serine at position 154 with asparagine, and valine at position 259 with cysteine, εFK / αFVH was reduced from 0.316 to 0.017. , ΑFV / αFVH have been shown to be reduced from 3.37 to 2.32. Further, a modified amadriase having a low εFK / αFVH has been reported by introducing an amino acid substitution into fructosylvalyl histidine oxidase derived from Phaeosphaeria nodolum and modifying the substrate specificity (see, for example, Patent Document 14).
In addition, by substituting isoleucine at position 58 of fructosylvalyl histidine oxidase derived from Phaeosphaeria nodolum with threonine and phenylalanine at position 282 with tyrosine, εFK / αFVH was reduced from 0.13 to 0.02, and αFV / αFVH. Has been shown to be reduced from 4.9 to 0.5. By further substituting isoleucine at position 58 with threonine, phenylalanine at position 282 for tyrosine, and glutamine at position 110 with phenylalanine, tyrosine, histidine, aspartic acid, or lysine, αFV / αFVH was 4.9 to 0.4. It has been shown to be reduced to.
However, it cannot be said that the influence of αFV is avoided in measuring αFVH by introducing these substitutions.
例えば、上述のＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの５８番目のイソロイシンをスレオニンに置換することにより、αＦＶ／αＦＶＨは４．９から０．５に低減されるが、この置換を有する酵素を用いてαＦＶＨ（終濃度２６μＭ）を測定する際に、１３μＭのαＦＶを共存させた場合には、αＦＶＨのみを測定した吸光度変化量に比べて約５０％も測定値が上乗せされることが示されている（特許文献１９参照）。さらに、αＦＶおよびεＦＫ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低減に寄与するとの記載もない。 For example, by substituting threonine for isoleucine at position 58 of fructosylvalyl histidine oxidase derived from Pheasphaeria nodolum described above, αFV / αFVH is reduced from 4.9 to 0.5, but an enzyme having this substitution is used. It has been shown that when 13 μM αFV is coexisted when measuring αFVH (final concentration 26 μM), the measured value is added by about 50% compared to the amount of change in absorbance measured only for αFVH. (See Patent Document 19). Furthermore, there is no description that it contributes to the reduction of reactivity with glycated amino acids other than αFV and εFK.
なお、各種アマドリアーゼを利用して、実際に血液試料中のＨｂＡ１ｃを測定するためには、アマドリアーゼおよび各種の必要とされる成分が処方された測定用試薬組成物を調製し、これを所定の方法で使用して測定を行う。そして、精度の高い測定値を得るという目的のために、酵素自体の性質を向上させる取り組みに加え、例えば、測定誤差の原因物質となり得るεＦＫ等の影響をできる限り受け難い測定用試薬組成物や、αＦＶやεＦＫなどの糖化アミノ酸の影響をできる限り受け難い測定方法の開発も行われている。 In addition, in order to actually measure HbA1c in a blood sample using various amadriase, a reagent composition for measurement in which amadriase and various required components are prescribed is prepared, and this is used as a predetermined method. Use in to make measurements. Then, in addition to efforts to improve the properties of the enzyme itself for the purpose of obtaining highly accurate measured values, for example, reagent compositions for measurement that are as insensitive as possible to the effects of εFK, which can be a causative agent of measurement errors, and , ΑFV, εFK, and other saccharified amino acids are also being developed to make measurement methods as insensitive as possible.
例えば、αＦＶやεＦＫなどの糖化アミノ酸の影響を低減するための試みとして、アマドリアーゼによってαＦＶＨを測定するのに先立ち、εＦＫ等の影響物質を別の酵素を用いて消去する方法が開示されている（例えば、特許文献１６参照）。この方法により影響物質の量を予め減らすことによって、測定値の精度向上が期待できる。しかし、この方法は、消去操作という付随的な前処理が必要となり、測定操作が複雑化するという課題を有する。消去に要する時間、消去反応を停止させる時間など、消去工程に伴う作業に要する時間の分だけ測定時間が長くなる点も課題である。さらに、消去酵素の反応性や安定性まで考慮に入れて、消去にも、測定にも、そして保存にも適した試薬処方を組まねばならないという点は、処方の検討上、大きな制約となり得る。 For example, as an attempt to reduce the influence of glycated amino acids such as αFV and εFK, a method of eliminating an influential substance such as εFK using another enzyme prior to measuring αFVH by amadriase is disclosed ( For example, see Patent Document 16). By reducing the amount of influential substances in advance by this method, improvement in the accuracy of measured values can be expected. However, this method requires an incidental preprocessing called an erasing operation, and has a problem that the measurement operation is complicated. Another problem is that the measurement time is increased by the time required for the work involved in the erasing process, such as the time required for erasing and the time required for stopping the erasing reaction. Furthermore, the fact that a reagent formulation suitable for erasure, measurement, and storage must be formulated in consideration of the reactivity and stability of the scavenging enzyme can be a major constraint in the examination of the formulation.
εＦＫ等の影響を低減するための別の試みとしては、ｐＨ５．５、ｐＨ６．５等の弱酸性ｐＨ条件下でアマドリアーゼを作用させてαＦＶＨの測定を行う方法が報告されている（特許文献２参照）。しかしながら、εＦＫ以外の糖化アミノ酸についての影響を回避しているという言及はない。 As another attempt to reduce the influence of εFK or the like, a method of measuring αFVH by allowing amadriase to act under weakly acidic pH conditions such as pH 5.5 and pH 6.5 has been reported (Patent Document 2). reference). However, there is no mention of avoiding the effects of glycated amino acids other than εFK.
すなわち、天然型若しくは変異型アマドリアーゼを含め、αＦＶＨに対する反応性に対するαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の比率が十分に低いアマドリアーゼや、そのようなアマドリアーゼを用いることにより、糖化アミノ酸の影響をできる限り受け難いαＦＶＨの測定を行うための知見は、これまでにごく僅か報告されているにすぎず、αＦＶＨに対する特異性が高く、精度の高いＨｂＡ１ｃの測定を実現し得るアマドリアーゼが求められている。 That is, it is affected by glycated amino acids as much as possible by using amadriase having a sufficiently low ratio of reactivity to glycated amino acids other than αFVH to reactivity to αFVH, including natural or mutant amadriase, and such amadriase. Only a few findings have been reported so far for the difficult measurement of αFVH, and there is a demand for an amadriase that has high specificity for αFVH and can realize highly accurate measurement of HbA1c.
本発明が解決しようとする課題は、糖化ヘモグロビンのβ鎖アミノ末端に由来するα−フルクトシルバリルヒスチジン以外の糖化アミノ酸の存在下においても、α−フルクトシルバリルヒスチジンを正確に測定できるアマドリアーゼを提供することにある。 The problem to be solved by the present invention is an amadriase capable of accurately measuring α-fructosylvalyl histidine even in the presence of glycated amino acids other than α-fructosylvalyl histidine derived from the β-chain amino terminus of glycated hemoglobin. Is to provide.
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、コニオカエタ属をはじめとする複数の微生物由来のアマドリアーゼにおける特定のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventors have replaced specific amino acid residues in amadriase derived from a plurality of microorganisms including the genus Coniocaeta with specific amino acid residues. The present invention has been completed by finding that the problem can be solved.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する；
（ｉｉ）１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を行うことで、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対するα−フルクトシルバリルヒスチジン以外の糖化アミノ酸への反応性の割合が、欠失、挿入、付加、および／または置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、低減している
の性質を有するアマドリアーゼ。
（２）以下の（ｉｉｉ）および（ｉｖ）：
（ｉｉｉ）配列番号１、３０、３３または３５に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有する；
（ｉｖ）１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を行うことで、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対するα−フルクトシルバリルヒスチジン以外の糖化アミノ酸への反応性の割合が、欠失、挿入、付加、および／または置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、低減している
の性質を有するアマドリアーゼ。
（３）糖化アミノ酸が以下の（ａ）から（ｌ）：
（ａ）α−フルクトシルロイシン
（ｂ）α−フルクトシルアラニン
（ｃ）α−フルクトシルグリシン
（ｄ）α−フルクトシルバリン
（ｅ）α−フルクトシルイソロイシン
（ｆ）α−フルクトシルスレオニン
（ｇ）α−フルクトシルフェニルアラニン
（ｈ）α−フルクトシルセリン
（ｉ）α−フルクトシルメチオニン
（ｊ）α−フルクトシルグルタミン酸
（ｋ）ε−フルクトシルリジン
（ｌ）β−フルクトシルアラニン
よりなる群から選択される１つまたはそれ以上である、上記（１）または（２）記載のアマドリアーゼ。
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の（ｍ）から（ｓ）：
（ｍ）６２位のアルギニン
（ｎ）６３位のロイシン
（ｏ）６４位のアルギニン
（ｐ）２６１位のチロシン
（ｑ）２６３位のグリシン
（ｒ）３５５位のアラニン
（ｓ）４１７位のアルギニン
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する、上記（３）記載のアマドリアーゼ。
（５）配列番号１に示すアミノ酸配列の（ｍ）から（ｓ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置でのアミノ酸残基の置換が以下の（ｔ）から（ｚ）：
（ｔ）６２位のアルギニンがアラニンまたはセリンに置換されている；
（ｕ）６３位のロイシンがアラニンに置換されている；
（ｖ）６４位のアルギニンがセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはヒスチジンに置換されている；
（ｗ）２６１位のチロシンがフェニルアラニン、アスパラギンまたはリプトファンに置換されている；
（ｘ）２６３位のグリシンがセリンに置換されている；
（ｙ）３５５位のアラニンがヒスチジンまたはアスパラギン酸に置換されている；
（ｚ）４１７位のアルギニンがヒスチジンに置換されている；
である上記（４）記載のアマドリアーゼ。
（６）配列番号１に示すアミノ酸配列において、以下の（ａａ）から（ａｆ）：
（ａａ）２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換および２６３位のグリシンのセリンへの置換；
（ａｂ）６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換および２６３位のグリシンのセリンへの置換；
（ａｃ）２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのアミノ酸のセリンへの置換および３５５位のアラニンのヒスチジンへの置換；
（ａｄ）２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのアスパラギン酸への置換；
（ａｅ）６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのヒスチジンへの置換；
（ａｆ）６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのアスパラギン酸への置換
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、上記（４）記載のアマドリアーゼ。
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
（８）上記（７）記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
（９）上記（８）記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
（１０）以下の工程：
（ｉ）上記（９）記載の宿主細胞を培養する工程；
（ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程
を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
（１０）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。
That is, the present invention is as follows.
(1) The following (i) and (ii):
(I) It has an amino acid sequence having at least 75% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(Ii) Deletion, insertion, addition, and / or substitution of one or several amino acids to glycated amino acids other than α-fructosylvalyl histidine for reactivity to α-fructosylvalyl histidine. Amadriase having the property that the rate of reactivity of is reduced compared to the amadriase before deletion, insertion, addition, and / or substitution.
(2) The following (iii) and (iv):
(Iii) It has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, inserted, added, and / or substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 30, 33 or 35;
(Iv) Deletion, insertion, addition, and / or substitution of one or several amino acids to glycated amino acids other than α-fructosylvalyl histidine for reactivity to α-fructosylvalyl histidine Amadriase having the property that the rate of reactivity of is reduced compared to the amadriase before deletion, insertion, addition, and / or substitution.
(3) The saccharified amino acids are as follows (a) to (l):
(A) α-fructosyl leucine (b) α-fructosylalanine (c) α-fructosylglycine (d) α-fructosylvaline (e) α-fructosyl isoleucine (f) α-fructosylsleonine ( g) A group consisting of α-fructosylphenylalanine (h) α-fructosylserine (i) α-fructosylmethionine (j) α-fructosylglutamic acid (k) ε-fructosyllysine (l) β-fructosylalanine. The amadrianse according to (1) or (2) above, which is one or more selected from.
(4) The following (m) to (s): of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(M) Arginine at position 62 (n) Leucine at position 63 (o) Arginine at position 64 (p) Tyrosine at position 261 (q) Glycine at position 263 (r) Alanine at position 355 (s) Arginine at position 417 The amadrianase according to (3) above, which has one or more amino acid residue substitutions at positions corresponding to the amino acids selected from the group.
(5) Substitution of the amino acid residue at the position corresponding to one or more amino acids selected from the group consisting of (m) to (s) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is from the following (t). (Z):
(T) Arginine at position 62 has been replaced with alanine or serine;
(U) Leucine at position 63 has been replaced with alanine;
(V) Arginine at position 64 has been replaced with serine, aspartic acid, glutamic acid or histidine;
(W) Tyrosine at position 261 has been replaced with phenylalanine, asparagine or lyptophan;
(X) Glycine at position 263 is replaced with serine;
(Y) Alanine at position 355 has been replaced with histidine or aspartic acid;
(Z) Arginine at position 417 has been replaced with histidine;
The amadriase according to (4) above.
(6) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the following (aa) to (af):
(Aa) Substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan and substitution of glycine at position 263 with serine;
(Ab) Substitution of arginine at position 62 with serine, substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan and substitution of glycine at position 263 with serine;
(Ac) Substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan; substitution of glycine at position 263 with serine and substitution of alanine at position 355 with histidine;
(Ad) Substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan; substitution of glycine at position 263 with serine and substitution of alanine at position 355 with aspartic acid;
(Ae) Substitution of arginine at position 62 with serine, substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan, substitution of glycine at position 263 with serine and substitution of alanine at position 355 with histidine;
(Af) Selected from the group consisting of substitution of arginine at position 62 with serine, substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan, substitution of glycine at position 263 with serine, and substitution of alanine at position 355 with aspartic acid. The amadriase according to (4) above, which has a substitution of an amino acid residue.
(7) An amadriase gene encoding the amino acid sequence according to any one of (1) to (6) above.
(8) A recombinant vector containing the amadriase gene according to (7) above.
(9) A host cell containing the recombinant vector according to (8) above.
(10) The following steps:
(I) The step of culturing the host cell according to (9) above;
(Ii) A method for producing amadriase, which comprises a step of expressing an amadriase gene contained in a host cell; and (iii) a step of isolating the amadriase from a culture.
(10) A kit for measuring glycated hemoglobin containing the amadriase according to any one of (1) to (6) above.
本発明によれば、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る基質特異性の優れたアマドリアーゼ、具体的には、「αＦＶＨに対する反応性」に対する「αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性」の割合が低減しているアマドリアーゼを提供することができる。 According to the present invention, an amadriase having excellent substrate specificity, which can be advantageously used as a diagnostic enzyme for diabetes and in a measurement kit for diabetes markers, specifically, "reactivity to αFVH" other than "αFVH". It is possible to provide an amadriase having a reduced proportion of "reactivity to glycated amino acids".
以下、本発明を詳細に説明する。
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(Amadriase)
Amadriase is also called ketoamine oxidase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, or fructosylamine oxidase. In the presence of oxygen, imino2acetic acid or a derivative thereof (amadori compound) is oxidized to glyoxylic acid or α-. An enzyme that catalyzes the reaction that produces ketoaldehyde, amino acids or peptides, and hydrogen peroxide. Amadriase is widely distributed in nature and can be obtained by searching for microorganisms and enzymes of animal or plant origin. In the case of microorganisms, it can be obtained from, for example, filamentous fungi, yeast, bacteria and the like.
一態様において、本発明のアマドリアーゼは、配列番号１、３０、３３または３５に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼに基づき作製された、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体である。このような変異体の例としては、配列番号１、３０、３３または３５と高い配列同一性（例えば、７５％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、および、配列番号１、３０、３３または３５のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。 In one aspect, the amadriase of the present invention is a variant of the amadriase with modified substrate specificity, made based on the amadriase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 30, 33 or 35. Examples of such variants are SEQ ID NOs: 1, 30, 33 or 35 with high sequence identity (eg, 75% or greater, preferably 80% or greater, more preferably 85% or greater, even more preferably 90%. Above, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, most preferably 99% or more) in the amadriase and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 30, 33 or 35, from 1 to number. Amadriase in which an amino acid has a modified or mutated, or deleted, substituted, added and / or inserted amino acid sequence can be mentioned.
なお、特許請求の範囲に記載されたアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ属、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。
図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７５％以上の同一性を有する公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列の数例を、公知のアルゴリズムを用いて整列させたものである。１８４位及び２６５位以外は配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。図中に、本発明の変異体における変異点を示している。
As long as the conditions relating to the amino acid sequence described in the scope of the patent claim are satisfied, for example, the genus Eupenicillium, the genus Pyrenochaeta, the genus Arthrinium, the genus Curvularia, the genus Neocosmospora, the genus Cryptococcus, the genus Phaeosphaeria, the genus Asperulo Penicillium sp., Fusarium sp., Achaetomiella genus, Achaetomium genera, such as Thielavia sp., Chaetomium spp., Gelasinospora genus, Microascus spp., Leptosphaeria species, Ophiobolus genus, Pleospora genus, Coniochaetidium spp., Pichia spp., Corynebacterium spp., Agrobacterium sp., Arthrobacter sp. , It may be prepared based on amadriase derived from other species.
The various sequences shown in FIG. 1 are obtained by arranging several examples of known amino acid sequences of amadriase having 75% or more identity with the sequence of SEQ ID NO: 1 using a known algorithm. The amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 are shown at the top except for positions 184 and 265. The figure shows the mutation points in the mutant of the present invention.
図１には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ（配列番号２６）、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２７）、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２８）、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２９）、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号３０）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３１）、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３２）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３４）およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列を示してある。
図１から理解されるように、配列番号１で例示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置は、このような配列同一性に基づく公知の整列処理によって、当業者であれば容易に推定することができる。
In FIG. 1, amadriase derived from the genus Coniochaeta, amadriase derived from Eupenicularlium terrenum (SEQ ID NO: 26), Pyrenochaeta sp. Derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 27), Arthrinium sp. Ketoamine oxidase derived from Ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 28), ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata (SEQ ID NO: 29), ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta (SEQ ID NO: 30), fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans (SEQ ID NO: 31). , Fluctosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 32) derived from Phaeosphaeria nodolum, fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans, Ulocladium sp. The amino acid sequences of fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 34) derived from and fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium crysogenum are shown.
As can be seen from FIG. 1, the position in the amino acid sequence of the amadriase from another species corresponding to the amino acid at a particular position in the amino acid sequence of the amadriase from the genus Coniochaeta exemplified in SEQ ID NO: 1 is such. A known alignment process based on sequence identity can be easily estimated by those skilled in the art.
一態様において、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸への反応性が改変されたアマドリアーゼは、アマドリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つまたは数個のアミノ酸残基を欠失、挿入、付加、および／または置換することによって得ることができる。
αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸への反応性の低減をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換を見出した。
（１）６２位のアルギニンの置換、例えば、アラニン、セリンへの置換。
（２）６３位のロイシンの置換、例えば、アラニンへの置換。
（３）６４位のアルギニンの置換、例えば、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンへの置換。
（４）２６１位のチロシンの置換、例えば、フェニルアラニン、アスパラギン、トリプトファンへの置換。
（５）２６３位のグリシンの置換、例えば、セリンへの置換。
（６）３５５位のアラニンの置換、例えば、ヒスチジン、アスパラギン酸への置換。
（７）４１７位のアルギニンの置換、例えば、ヒスチジンへの置換。
In one embodiment, the amadriase modified in reactivity to glycated amino acids other than αFVH is by deleting, inserting, adding, and / or substituting at least one or several amino acid residues in the amino acid sequence of the amadriase. Obtainable.
As a substitution of an amino acid that reduces the reactivity to a saccharified amino acid other than αFVH, we found a substitution of an amino acid at a position corresponding to the amino acid at the following position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(1) Substitution of arginine at position 62, for example, substitution with alanine or serine.
(2) Substitution of leucine at position 63, for example, substitution with alanine.
(3) Substitution of arginine at position 64, for example, substitution with serine, aspartic acid, glutamic acid, histidine.
(4) Substitution of tyrosine at position 261, for example, substitution with phenylalanine, asparagine, tryptophan.
(5) Substitution of glycine at position 263, for example, substitution with serine.
(6) Substitution of alanine at position 355, for example, substitution with histidine or aspartic acid.
(7) Substitution of arginine at position 417, for example, substitution with histidine.
αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸への反応性を改変させたアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換や欠失を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換または欠失を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６または７を有している。
その中でも、以下のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の置換を有している変異体が好ましい。
（８）２６１位のチロシンの置換および２６３位のグリシンの置換、例えば、２６１位のトリプトファンへの置換および２６３位のグリシンのセリンへの置換。
（９）６２位のアルギニンの置換、２６１位のチロシンの置換および２６３位のグリシンの置換、例えば、６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換および２６３位のグリシンのセリンへの置換。
（１０）２６１位のチロシンの置換、２６３位のグリシンの置換および３５５位のアラニンの置換、例えば、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのヒスチジンへの置換。
（１１）２６１位のチロシンの置換、２６３位のグリシンの置換および３５５位のアラニンの置換、例えば、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのアスパラギン酸への置換。
（１２）６２位のアルギニンの置換、２６１位のチロシンの置換、２６３位のグリシンの置換および３５５位のアラニンの置換、例えば、６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのヒスチジンへの置換。
（１３）６２位のアルギニンの置換、２６１位のチロシンの置換、２６３位のグリシンの置換および３５５位のアラニンの置換、例えば、６２位のアルギニンのセリンへの置換、２６１位のチロシンのトリプトファンへの置換、２６３位のグリシンのセリンへの置換および３５５位のアラニンのアスパラギン酸への置換。
The mutant of amadriase having modified reactivity to a glycated amino acid other than αFVH may have at least one of the above amino acid substitutions or deletions, and may have a plurality of amino acid substitutions or deletions. .. For example, it has 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 of the above amino acid substitutions.
Among them, mutants having amino acid substitutions corresponding to the following amino acid positions are preferable.
(8) Substitution of tyrosine at position 261 and substitution of glycine at position 263, for example, substitution of tryptophan at position 261 and substitution of glycine at position 263 with serine.
(9) Substitution of arginine at position 62, substitution of tyrosine at position 261 and substitution of glycine at position 263, for example, substitution of arginine at position 62 with serine, substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan and glycine at position 263. Replacement with serine.
(10) Substitution of tyrosine at position 261 and substitution of glycine at position 263 and substitution of alanine at position 355, for example, substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan, substitution of glycine at position 263 with serine and alanine at position 355. Replacement with histidine.
(11) Substitution of tyrosine at position 261 and substitution of glycine at position 263 and substitution of alanine at position 355, for example, substitution of tyrosine at position 261 with tryptophan, substitution of glycine at position 263 with serine and alanine at position 355. Replacement with aspartic acid.
(12) Substitution of arginine at position 62, substitution of tyrosine at position 261 and substitution of glycine at position 263 and substitution of alanine at position 355, for example, substitution of arginine at position 62 with serine, substitution of tyrosine at position 261 to tryptophan. Substitution of glycine at position 263 with serine and substitution of alanine at position 355 with histidine.
(13) Substitution of arginine at position 62, substitution of tyrosine at position 261 and substitution of glycine at position 263 and substitution of alanine at position 355, for example, substitution of arginine at position 62 with serine, substitution of tyrosine at position 261 to tryptophan. Substitution of glycine at position 263 with serine and alanine at position 355 with aspartic acid.
本発明のαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸への反応性を改変させたアマドリアーゼ変異体は、配列番号１、３０、３３または３５に示すアミノ酸配列において、上記の基質特異性の改変をもたらすアミノ酸の置換を有し、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに１または数個(例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個)のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されたアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、基質特異性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。さらに、上記の基質特異性の改変をもたらすアミノ酸の置換変異を有し、配列番号１、３０、３３または３５に示すアミノ酸配列の該置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、７５％以上、好ましくは８６％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、基質特異性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。 The amadriase mutant modified in reactivity to a saccharified amino acid other than αFVH of the present invention has an amino acid substitution in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 30, 33 or 35 that causes the above-mentioned modification of substrate specificity. However, at positions other than those substituted amino acids, one or several more amino acids (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1) are deleted. Containing an inserted, added and / or substituted amino acid sequence, it comprises an amadriase variant having amadriase activity and modified substrate specificity. Further, with respect to the amino acid sequence of the portion of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 30, 33 or 35 excluding amino acids other than the substituted amino acid, which has an amino acid substitution variation resulting in the above-mentioned modification of substrate specificity. , 75% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, most preferably 99% or more amino acid sequences having amino acid sequence identity. Includes amadriase variants with amadriase activity and modified substrate specificity.
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、本明細書中ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７と称する組換え体プラスミド（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５９３）を保持する大腸菌が生産するＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７）であり、このアマドリアーゼは先に出願人が見出した熱安定性の優れた改変型アマドリアーゼである（国際特許第２００７／１２５７７９号参照）。ＣＦＰ−Ｔ７は、天然型のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対し、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した３重変異体である。 In the above amino acid substitution, the amino acid position is substituted in the amino acid sequence of Amadriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 at the position corresponding to the position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The meaning of "corresponding position" will be described later. The amadriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the genus Coniochaeta produced by Escherichia coli carrying a recombinant plasmid (deposit number: FERM BP-10593) referred to as pKK223-3-CFP-T7 in the present specification. Derived from the plasmid (CFP-T7), which is a modified plasmid with excellent thermal stability previously found by the applicant (see International Patent No. 2007/125779). CFP-T7 is a triple mutant obtained by sequentially introducing artificial mutations at positions 272, 302 and 388 with respect to the native Amadriase derived from the genus Coniochaeta.
（アミノ酸配列の同一性）
アミノ酸配列の同一性は、公知の任意の方法を用いて計算することができる。例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
(Amino acid sequence identity)
Amino acid sequence identity can be calculated using any known method. For example, GENETYX Ver. It can be calculated by a program such as maximum matching or search homology of 11 (manufactured by Genetics) or a program such as maximum matching or multiple alignment of DNASIS Pro (manufactured by Hitachi Software).
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
(Acquisition of gene encoding amadriase)
In order to obtain the gene of the present invention encoding these amadriase (hereinafter, also simply referred to as “amadriase gene”), a commonly used gene cloning method is used. For example, chromosomal DNA or mRNA can be extracted from microbial cells and various cells capable of producing amadriase by a conventional method, for example, the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989). Furthermore, cDNA can be synthesized using mRNA as a template. Using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained, a library of chromosomal DNA or cDNA can be prepared.
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報参照）が挙げられる。
Next, a method of synthesizing an appropriate probe DNA based on the amino acid sequence of the amadriase and selecting the amadriase gene from a library of chromosomal DNA or cDNA using this, or an appropriate primer DNA based on the amino acid sequence. The DNA containing the gene fragment of interest encoding the amadriase is amplified by an appropriate polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction, PCR method) such as the 5'RACE method or the 3'RACE method. Can be ligated to obtain DNA containing the full length of the target amadriase gene.
As a preferable example of the gene encoding the amadriase thus obtained, there is an amadriase gene derived from the genus Coniocaeta (see JP-A-2003-235585).
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ ｓｐ． ＮＩＳＬ ９３３０株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡがｐＫＫ２２３−３ Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・バイオテク社製）に挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ（特開２００３−２３５５８５号公報参照）が挙げられる。 It is preferable in terms of handling that these amadriase genes are linked to various vectors as usual. For example, Coniochaeta sp. Examples thereof include the recombinant plasmid pKK223-3-CFP (see JP-A-2003-235585) in which the DNA encoding the amadriase gene derived from the NISL 9330 strain is inserted into pKK223-3 Vector (manufactured by Amersham Biotech).
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等が好ましい。
(vector)
The vector that can be used in the present invention is not limited to the above-mentioned plasmid, and any other vector known to those skilled in the art such as bacteriophage and cosmid can be used. Specifically, for example, pBluescriptII SK + (manufactured by Stratagene) and the like are preferable.
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
(Mutation treatment of amadriase gene)
The mutation treatment of the amadriase gene can be carried out by any known method depending on the intended mutation form. That is, a wide range of methods such as a method of contacting and acting the amadriase gene or a recombinant DNA in which the gene is integrated with a drug that is a mutagen; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method that makes full use of a protein engineering method, etc. Can be used.
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２， ９４４１ （１９８４）： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４， ３５０ （１９８７）： Ｇｅｎｅ， ３７， ７３ （１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ８７４９ （１９８５）： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ８７６５ （１９８５）： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １４， ９６７９ （１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８２， ４８８ （１９８５）： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４， ３６７ （１９８７））等が挙げられる。 As a method that makes full use of the protein engineering method, a method known as Site-Specific Mutagenesis can be generally used. For example, the Kramer method (Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)), the Eckstein method (Nucleic Acids Res., 13). 1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)), Kunkel method (Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1985). ): Methods Enzymol., 154, 367 (1987)) and the like.
また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， １， １１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。 It is also possible to use a method known as a general PCR method (see Technique, 1, 11 (1989)). In addition to the above gene modification method, a desired modified amadriase gene can be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等を用いることにより行うことができる。 When determining or confirming the DNA base sequence of the amadriase gene obtained by the above method, for example, it can be performed by using a multicapillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies) or the like.
（形質転換・形質導入）
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
(Transformation / transduction)
The amadriase gene obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and a host corresponding to each vector is commonly used. Can be transformed or transduced. For example, as a host, a microorganism belonging to the genus Escherichia, for example, the obtained recombinant DNA is used to transduce, for example, Escherichia coli K-12 strain, preferably Escherichia coli JM109 strain, Escherichia coli DH5α strain (both manufactured by Takara Bio), and the like. Each strain is obtained by conversion or transduction into them.
（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１に示すコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
(Identification of the position corresponding to the amino acid)
The "position corresponding to an amino acid" refers to a position in the amino acid sequence of an amadriase derived from another species corresponding to an amino acid at a specific position in the amino acid sequence of the amadriase derived from the genus Coniocaeta shown in SEQ ID NO: 1.
As a method for identifying the "position corresponding to an amino acid", the amino acid sequences are compared using a known algorithm such as the Lippmann-Person method, and the maximum identity is the same as the conserved amino acid residue present in the amino acid sequence of each amadriase. It can be done by giving sex. By aligning the amino acid sequence of amadriase in this way, it is possible to determine the position of homologous amino acid residues in each amadriase sequence in the sequence regardless of insertion or deletion in the amino acid sequence. Homological positions are considered to be co-located in the three-dimensional structure and can be presumed to have similar effects on the specific function of the amadriase of interest.
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６２位のアルギニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６２位のセリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６１位のアルギニンである。
In the present invention, the "position corresponding to arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" refers to the determined amino acid sequence of amadriase as the amino acid sequence of amadriase derived from the genus Coniocaeta shown in SEQ ID NO: 1. When compared, it means the amino acid corresponding to the arginine at position 62 of the amadriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method for specifying the "amino acid at the corresponding position".
That is, Pyrenochaeta sp., An amadriase derived from Eupenicularlium terrenum. Derived ketoamine oxidase, Arthrinium sp. Ketoamine oxidase from Cryptococcus neoformans, Fructosyl amino acid oxidase from Cryptococcus neoformans, Ulocladium sp., Ketoamine oxidase from Curvalaria clavata, ketoamine oxidase from Neocosmospora vasinfecta. Fructosyl amino acid oxidase derived from Pelicillium crysogenum, arginine at position 62, fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodolum, serine at position 62, and arginine derived from Aspergillus nidulans, arginine at position 61. ..
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６３位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のロイシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のイソロイシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６２位のロイシンである。
Further, in the present invention, the "position corresponding to leucine at position 63 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" refers to the determined amino acid sequence of amadriase as the amino acid sequence of amadriase derived from the genus Coniocaeta shown in SEQ ID NO: 1. When compared, it means the amino acid corresponding to leucine at position 63 of the amadriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method for specifying the "amino acid at the corresponding position".
That is, Pyrenochaeta sp., An amadriase derived from Eupenicularlium terrenum. Derived ketoamine oxidase, Arthrinium sp. Ketoamine oxidase derived from Ketoamine oxidase, ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata, ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodolum, Ulocladium sp. Fructosyl amino acid oxidase derived from Pencillium crysogenum is leucine at position 63, fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans is isoleucine at position 63, and fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans is at position 62. ..
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６４位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６４位のアルギニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のアルギニンである。
Further, "the position corresponding to arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" is when the determined amino acid sequence of amadriase is compared with the amino acid sequence of amadriase derived from the genus Coniocaeta shown in SEQ ID NO: 1. , Means the amino acid corresponding to the arginine at position 64 of the amadriase of SEQ ID NO: 1. This can also be specified by aligning the amino acid sequences by the above method.
That is, Pyrenochaeta sp., An amadriase derived from Eupenicularlium terrenum. Derived ketoamine oxidase, Arthrinium sp. Ketoamine oxidase derived from Ketoamine oxidase, ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata, ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodolum, Ulocladium sp. The fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium crysogenum, the fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans is arginine at position 64, and the fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans is arginine at position 63.
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６１位のチロシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のチロシン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５９位のチロシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５７位のチロシンである。
Further, "the position corresponding to tyrosine at position 261 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" is when the confirmed amino acid sequence of amadriase is compared with the amino acid sequence of amadriase derived from the genus Coniocaeta shown in SEQ ID NO: 1. , Means the amino acid corresponding to the tyrosine at position 261 of the amadriase of SEQ ID NO: 1. This can also be specified by aligning the amino acid sequences by the above method.
That is, Arthrinium sp., An amadriase derived from Eupenicularium terrenum. Ketoamine oxidase derived from ketoamine oxidase, ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans, fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans, fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans, fluctosyl amino acid oxidase derived from Penicillium crysogenum Ketoamine oxidase from Curvularia clavata, ketoamine oxidase from Curvularia sp. The derived fructosyl amino acid oxidase is tyrosine at position 259, and the fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodom is tyrosine at position 257.
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６３位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のグリシン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のグリシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のセリン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５９位のグリシンである。
Further, "the position corresponding to glycine at position 263 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" is when the confirmed amino acid sequence of amadriase is compared with the amino acid sequence of amadriase derived from the genus Coniocaeta shown in SEQ ID NO: 1. , Means the amino acid corresponding to the glycine at position 263 of the amadriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method for specifying the "amino acid at the corresponding position".
That is, Arthrinium sp., An amadriase derived from Eupenicularium terrenum. Ketoamine oxidase derived from ketoamine oxidase, ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans, glycine at position 263 in Fluxtosyl amino acid oxidase derived from Penicillium crysogenum, Pyrenochaeta sp. Ketoamine oxidase from Curvularia clavata, ketoamine oxidase from Curvularia sp. The derived fructosyl amino acid oxidase is glycine at position 261, the fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans is serine at position 263, and the fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodom is glycine at position 259.
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５５位のアラニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５３位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３５５位のセリン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５１位のアラニンである。
Further, "the position corresponding to alanine at position 355 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" is when the determined amino acid sequence of amadriase is compared with the amino acid sequence of amadriase derived from the genus Coniocaeta shown in SEQ ID NO: 1. , Means the amino acid corresponding to alanine at position 355 of the amadriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method for specifying the "amino acid at the corresponding position".
That is, amadriase derived from Eupenicillium terrenum, fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans, fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans, fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium crysogenum, and fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium crysogenum at position 355. Ketoamine oxidase from Curvularia clavata, ketoamine oxidase from Curvularia sp. In the derived fructosyl amino acid oxidase, alanine at position 353, Arthrinium sp. The derived ketoamine oxidase is alanine at position 356, the ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta is serine at position 355, and the fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodolum is alanine at position 351.
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１７位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４１７位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。 Further, the "position corresponding to arginine at position 417 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" is when the determined amino acid sequence of amadriase is compared with the amino acid sequence of amadriase derived from the genus Coniocaeta shown in SEQ ID NO: 1. , Means the amino acid corresponding to arginine at position 417 of the amadriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method for specifying the "amino acid residue at the corresponding position".
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは４１７位のアルギニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１６位のアルギニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４１９位のアルギニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４１８位のイソロイシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１８位のアルギニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４１４位のアルギニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１７位のリジンである。 That is, arginine at position 417 in the amadriase derived from Eupenicularlium terrenum, Pyrenochaeta sp. Ketoamine oxidase from Curvularia clavata, ketoamine oxidase from Curvularia sp. In the derived fructosyl amino acid oxidase, arginine at position 416, Arthrinium sp. Arginine at position 419 for ketoamine oxidase derived from ketoamine oxidase, isoleucine at position 418 for ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans, fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulanes and fructosyl amino acid oxidase derived from It is arginine at position 414 in fructosyl peptide oxidase and lysine at position 417 in fructosyl amino acid oxidase derived from Pencillium crysogenum.
（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られた基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
(Production of Amadriase of the present invention)
In order to produce the amadriase using the strain having the ability to produce the amadriase with the improved substrate specificity obtained as described above, this strain may be cultured by a usual solid culture method. It is preferable to use the liquid culture method for culturing as much as possible.
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。 As a medium for culturing the above strains, for example, sodium chloride and dihydrogen phosphate are added to one or more nitrogen sources such as yeast extract, tripton, peptone, meat extract, corn steep liquor, or soybean or wheat bran leachate. Add one or more of inorganic salts such as potassium, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and if necessary, add sugar raw materials, vitamins, etc. as appropriate. Is used.
また、培地に当該アマドリアーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化蛋白質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化蛋白質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。 In addition, the amount of the target enzyme produced by adding a substrate on which the amadriase can act or a similar compound thereof, for example, glycated amino acids, glycated peptides, glycated protein degradation products, or glycated proteins such as glycated hemoglobin and glycated albumin to the medium. Can be improved.
培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３７℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。 It is appropriate to adjust the initial pH of the medium to pH 7-9. The culture is carried out at a culture temperature of 20 to 42 ° C., preferably a culture temperature of about 37 ° C. for 4 to 24 hours, more preferably a culture temperature of about 37 ° C. for 8 to 16 hours, aeration-stirred deep culture, shaking culture, and standing. It is preferable to carry out by culturing or the like.
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。 After completion of the culture, in order to collect amadriase from the culture, it can be obtained by using a usual enzyme collection means. For example, the cells are subjected to ultrasonic destruction treatment, grinding treatment, etc. by a conventional method, or this enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or the bacterium is shaken or left to stand in the presence of toluene or the like. This enzyme can be excreted from the cells. Then, the solid portion is removed by filtering, centrifuging, etc. of this solution, and if necessary, the nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate, etc., and then ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added thereto. Fractionate, and the precipitate is collected to obtain the crude enzyme of amadriase.
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の糖化アミノ酸に対する反応性が低減したアマドリアーゼを得ることができる。 In order to further obtain an amadriase purified enzyme preparation from the above crude enzyme of amadriase, for example, a gel filtration method using Sephadex, Superdex or Ultrogel, an ion exchange carrier, a hydrophobic carrier, an adsorption elution method using hydroxyapatite, etc. An electrophoresis method using a polyacrylamide gel or the like, a precipitation method such as a sugar density gradient centrifugation method, an affinity chromatography method, a fractionation method using a molecular sieving membrane or a hollow yarn membrane, etc. are appropriately selected, or a combination thereof is carried out. By doing so, a purified amadriase enzyme preparation can be obtained. In this way, amadriase with reduced reactivity to the desired glycated amino acid can be obtained.
（本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低下）
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性が低下し、結果として、αＦＶＨに対する基質特異性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のものと比較して、「αＦＶＨへの反応性」に対する「αＦＶＨ以外の各種糖化アミノ酸に対する反応性」の割合、例えば、「αＦＬへの反応性」の割合が低減していることを特徴とする。
「糖化アミノ酸」は、アミノ酸または短鎖のペプチドが糖化を受けたものであれば特に限定されないが、例えば、血中や輸液中に遊離状態で存在することが想定される各種のα−糖化アミノ酸、β−糖化アミノ酸および／またはε−糖化アミノ酸が挙げられる。
具体的には、例えば、α−フルクトシルロイシン（αＦＬ）、α−フルクトシルアラニン（αＦＡ）、α−フルクトシルグリシン（αＦＧ）、α−フルクトシルバリン（αＦＶ）、α−フルクトシルイソロイシン（αＦＩ）、α−フルクトシルスレオニン（αＦＴ）、α−フルクトシルフェニルアラニン（αＦＦ）、α−フルクトシルセリン（αＦＳ）、α−フルクトシルメチオニン（αＦＭ）、α−フルクトシルグルタミン酸（αＦＥ）、α−フルクトシルリジン、α−フルクトシルトリプトファン、α−フルクトシルシステイン、α−フルクトシルチロシン、α−フルクトシルアルギニン、α−フルクトシルヒスチジン、α−フルクトシルプロリン、α−フルクトシルアスパラギン酸、ε−フルクトシルリジン（εＦＫ）、α, ε−フルクトシルリジン、β−フルクトシルアラニン（βＦＡ）等が挙げられる。
これらの糖化アミノ酸は、例えば遊離状態で輸液や薬物投与等により血中に持ち込まれ得、あるいは、糖とアミノ酸が血中で反応することにより生成し得る。または、糖化ヘモグロビンを測定するための前処理において、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンなどの糖化蛋白質からプロテアーゼやペプチダーゼ等の作用を受けて糖化アミノ酸として切り出され得る。
例えば、輸液中には、αＦＬ、αＦＡ、αＦＧ、αＦＶ等が多く含まれ、これらは輸液を受けている患者の検体を測定する際の、αＦＶＨ以外の各種糖化アミノ酸の代表的な例として想定され得る。
本発明において、糖化アミノ酸には、αＦＶＨを測定することによってＨｂＡ１ｃを測定する方法において測定誤差を生じ得る短鎖の糖化ペプチドを含み得る。
(Reduction of reactivity with glycated amino acids other than αFVH in the amadriase of the present invention)
As a result of mutation in the amino acid sequence of the amadriase of the present invention obtained by the above means, the reactivity to saccharified amino acids other than αFVH is lowered as compared with the one before the modification. As a result, the substrate specificity for αFVH is improved. Specifically, the ratio of "reactivity to various glycated amino acids other than αFVH" to "reactivity to αFVH", for example, the ratio of "reactivity to αFL" is reduced as compared with the one before modification. It is characterized by being.
The "glycated amino acid" is not particularly limited as long as it is an amino acid or a short-chain peptide that has been glycated, but for example, various α-glycated amino acids that are assumed to be present in a free state in blood or infusion. , Β-glycated amino acids and / or ε-glycated amino acids.
Specifically, for example, α-fructosyl leucine (αFL), α-fructosylalanine (αFA), α-fructosylglycine (αFG), α-fructosylvaline (αFV), α-fructosyl isoleucine (αFV). αFI), α-fructosyl leucine (αFT), α-fructosylphenylalanine (αFF), α-fructosylserine (αFS), α-fructosylmethionine (αFM), α-fructosylglutamic acid (αFE), α- Fructosyl lysine, α-fructosyl tryptophan, α-fructosyl cysteine, α-fructosyl tyrosine, α-fructosyl arginine, α-fructosyl histidine, α-fructosylproline, α-fructosyl aspartic acid, ε-fluc Examples thereof include tosyllysine (εFK), α, ε-fructosyllysine and β-fructosylalanine (βFA).
These glycated amino acids can be brought into the blood, for example, in a free state by infusion or drug administration, or can be produced by the reaction of sugar and amino acids in the blood. Alternatively, in the pretreatment for measuring glycated hemoglobin, it can be cut out as a glycated amino acid by the action of protease, peptidase, etc. from a glycated protein such as glycated hemoglobin or glycated albumin.
For example, the infusion solution contains a large amount of αFL, αFA, αFG, αFV, etc., and these are assumed to be typical examples of various glycated amino acids other than αFVH when measuring a sample of a patient receiving the infusion solution. obtain.
In the present invention, the glycated amino acid may include a short chain glycated peptide that may cause a measurement error in the method of measuring HbA1c by measuring αFVH.
本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低下において、Ｌ−ロイシンとグルコースから生成され得る誤差原因物質であるαＦＬに対して反応性が低減していることは特に好ましい。αＦＬは、高カロリーアミノ酸輸液中に最も多く存在する。
具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨへの反応性に対するαＦＬへの反応性の割合を示す「αＦＬ／αＦＶＨ」は、改変前に対して１３％以上、好ましくは２３％以上、より好ましくは３８％以上、さらに好ましくは７２％以上、最も好ましくは８３％以上低減していることが好ましい。すなわち、改変前の割合を１００とした場合の、変異導入後の反応性の割合は、８７％以下まで低下し、好ましくは７７％以下まで低下し、より好ましくは６２％以下まで低下し、さらに好ましくは２８％以下まで低下し、最も好ましくは１７％以下まで低下していることが好ましい。
In the decrease in reactivity with glycated amino acids other than αFVH in the amadriase of the present invention, it is particularly preferable that the reactivity with αFL, which is an error-causing substance that can be produced from L-leucine and glucose, is reduced. αFL is most abundant in high calorie amino acid infusions.
Specifically, in the amadriase of the present invention, "αFL / αFVH" indicating the ratio of the reactivity to αFL to the reactivity to αFVH is 13% or more, preferably 23% or more, more preferably than before the modification. Is preferably reduced by 38% or more, more preferably 72% or more, and most preferably 83% or more. That is, when the ratio before modification is 100, the reactivity ratio after the introduction of the mutation is reduced to 87% or less, preferably 77% or less, more preferably 62% or less, and further. It is preferably reduced to 28% or less, and most preferably 17% or less.
また、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸に対する反応性の低下において、Ｌ−アラニンとグルコースから生成され得る誤差原因物質であるαＦＡに対して反応性が低減していることも好ましい。αＦＡは、高カロリーアミノ酸輸液中に多く存在する。
具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨへの反応性に対するαＦＡへの反応性の割合を示す「αＦＡ／αＦＶＨ」は、改変前に対して６％以上、好ましくは３３％以上、より好ましくは４６％以上、さらに好ましくは５３％以上、さらに好ましくは６７％以上、最も好ましくは７２％以上低減していることが好ましい。すなわち、改変前の割合を１００とした場合の、変異導入後の反応性の割合は、９４％以下まで低下し、好ましくは６７％以下まで低下し、より好ましくは５４％以下まで低下し、さらに好ましくは４７％以下まで低下し、さらに好ましくは３３％以下まで低下し、最も好ましくは２８％以下まで低下していることが好ましい。
It is also preferable that the reactivity of the amadriase of the present invention with respect to glycated amino acids other than αFVH is reduced with respect to αFA, which is an error-causing substance that can be produced from L-alanine and glucose. αFA is abundant in high-calorie amino acid infusions.
Specifically, in the amadriase of the present invention, "αFA / αFVH" indicating the ratio of reactivity to αFA to reactivity to αFVH is 6% or more, preferably 33% or more, more preferably than before modification. Is preferably reduced by 46% or more, more preferably 53% or more, further preferably 67% or more, and most preferably 72% or more. That is, when the ratio before modification is 100, the reactivity ratio after the introduction of the mutation is reduced to 94% or less, preferably 67% or less, more preferably 54% or less, and further. It is preferably reduced to 47% or less, more preferably 33% or less, and most preferably 28% or less.
さらに、高カロリーアミノ酸輸液中に多く存在するグリシンとグルコースから生成され得る誤差原因物質であるαＦＧに対する反応性が低減していることも、本発明のアマドリアーゼの性質として好ましい。
具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨへの反応性に対するαＦＧへの反応性の割合を示すαＦＧ／αＦＶＨは、改変前に対して１９％以上、好ましくは３１％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６９％以上、最も好ましくは７５％以上低減していることが好ましい。すなわち、改変前の割合を１００とした場合の、変異導入後の反応性の割合は、８１％以下まで低下し、好ましくは６９％以下まで低下し、より好ましくは５０％以下まで低下し、さらに好ましくは３１％以下まで低下し、最も好ましくは２５％以下まで低下していることが好ましい。
Furthermore, it is also preferable as a property of the amadriase of the present invention that the reactivity with αFG, which is an error-causing substance that can be produced from glycine and glucose, which are abundantly present in high-calorie amino acid infusions, is reduced.
Specifically, in the amadriase of the present invention, αFG / αFVH showing the ratio of reactivity to αFG to reactivity to αFVH is 19% or more, preferably 31% or more, more preferably 50, as compared with that before modification. % Or more, more preferably 69% or more, and most preferably 75% or more. That is, when the ratio before modification is 100, the reactivity ratio after the introduction of the mutation is reduced to 81% or less, preferably 69% or less, more preferably 50% or less, and further. It is preferably reduced to 31% or less, and most preferably to 25% or less.
さらに、高カロリーアミノ酸輸液中に多く存在するＬ−バリンとグルコースから生成され得る誤差原因物質であるαＦＶに対する反応性が低減していることも、本発明のアマドリアーゼの性質として好ましい。
具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨへの反応性に対するαＦＶへの反応性の割合を示すαＦＶ／αＦＶＨは、改変前に対して６％以上、好ましくは１９％以上、より好ましくは３７％以上、さらに好ましくは４９％以上、最も好ましくは５６％以上低減していることが好ましい。すなわち、改変前の割合を１００とした場合の、変異導入後の反応性の割合は、９４％まで低下し、好ましくは８１％まで低下し、より好ましくは６３％まで低下し、さらに好ましくは５１％まで低下し、最も好ましくは４４％まで低下していることが好ましい。
Furthermore, it is also preferable as a property of the amadriase of the present invention that the reactivity with αFV, which is an error-causing substance that can be produced from L-valine and glucose, which are abundantly present in high-calorie amino acid infusions, is reduced.
Specifically, in the amadriase of the present invention, αFV / αFVH showing the ratio of reactivity to αFV to reactivity to αFVH is 6% or more, preferably 19% or more, more preferably 37 than before modification. % Or more, more preferably 49% or more, and most preferably 56% or more. That is, when the ratio before modification is 100, the reactivity ratio after the introduction of the mutation is reduced to 94%, preferably to 81%, more preferably to 63%, and further preferably 51. It is preferably reduced to%, most preferably to 44%.
真の測定対象物質であるαＦＶＨに対する反応性に対する、上述のような測定誤差原因物質である糖化アミノ酸（例えば、αＦＬ）に対する反応性の割合は、公知のアマドリアーゼの測定法を用いて、任意の条件下で測定し、改変前のものと比較することができる。例えば、ｐＨ７．０において、５ｍＭのαＦＬを添加して測定した活性を、５ｍＭのαＦＶＨを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶＨに対する反応性に対するαＦＬに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。 The ratio of reactivity to saccharified amino acid (for example, αFL), which is a substance causing measurement error as described above, to reactivity to αFVH, which is a true measurement target substance, can be determined under arbitrary conditions using a known measurement method for amadriase. It can be measured below and compared to the one before modification. For example, at pH 7.0, the activity measured by adding 5 mM αFL is divided by the activity measured by adding 5 mM αFVH to determine the ratio of reactivity to αFL to reactivity to αFVH. It can be calculated and compared between the one before modification and the one after modification.
改変前のものと比較して基質特異性が向上している本発明のアマドリアーゼの一例としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄ）株により生産されるアマドリアーゼが挙げられる。このような基質特異性が改善されたアマドリアーゼは、糖化アミノ酸、例えば、αＦＬ、αＦＡ、αＦＧおよび／またはαＦＶをノイズとして測り込む度合が良好に低減され、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端由来の糖化アミノ酸であるαＦＶＨのみを測定することが可能となるため、精度の高い測定を行うことができ、産業利用上非常に有利である。 As an example of the amadriase of the present invention having improved substrate specificity as compared with the one before modification, for example, it is produced by Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D) strain. Amadriase is mentioned. Amadriase having such improved substrate specificity is a glycated amino acid derived from the β-chain amino terminus of HbA1c, with a good reduction in the degree to which glycated amino acids such as αFL, αFA, αFG and / or αFV are measured as noise. Since it is possible to measure only a certain αFVH, it is possible to perform highly accurate measurement, which is very advantageous for industrial use.
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
(Measurement method of amadriase activity)
Various methods can be used as the method for measuring the activity of amadriase. As an example, the method for measuring the activity of amadriase used in the present invention will be described below.
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。 Examples of the method for measuring the enzymatic activity of amadriase in the present invention include a method for measuring the amount of hydrogen peroxide produced by the enzymatic reaction and a method for measuring the amount of oxygen consumed by the enzymatic reaction. The method for measuring the amount of hydrogen peroxide is shown below as an example.
本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、αＦＬ、αＦＡ、αＦＧ、αＦＶ、若しくはαＦＶＨを基質として用いる。なお、酵素力価は、αＦＬ、αＦＡ、αＦＧ、αＦＶ、若しくはαＦＶＨを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
αＦＬ等の糖化アミノ酸、およびαＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らやＨａｓｈｉｂａやＨｅｙｎｓらの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１−９５５９８号公報、Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４２， ７６３−７６８ （１９７８）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１６， １８３−１９５（１９８３）参照）。
Unless otherwise specified, αFL, αFA, αFG, αFV, or αFVH is used as a substrate for measuring the activity of amadriase in the present invention. The enzyme titer is defined as 1 U as the amount of enzyme that produces 1 μmol of hydrogen peroxide per minute when measured using αFL, αFA, αFG, αFV, or αFVH as a substrate.
As the saccharified amino acid such as αFL and the saccharified peptide such as αFVH, those synthesized and purified based on the methods of Sakagami et al., Hashiba and Heins et al. Can be used (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-95598, Agric. Biol. See Chem., 42, 763-768 (1978), Carbohydrate Research, 116, 183-195 (1983)).
Ａ．：試薬の調製
試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマンバイオケミファ社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５、ｐＨ７．０またはｐＨ６．５）に溶解し、１，０００ｍｌに定容する。
試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学研究所社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ； 終濃度５ｍＭ）
αＦＶＨ ６２５ｍｇ、αＦＬ ４４０ｍｇ、αＦＡ ３７７ｍｇ、αＦＧ ３５５ｍｇ、またはαＦＶ ４１９ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
A. : Reagent preparation Reagent 1: Peroxidase, 4-aminoantipyrine solution 5.0 kU of peroxidase (manufactured by Kikkoman Biochemifa), 100 mg of 4-aminoantipyrine (manufactured by Tokyo Kasei) at 0.1 M potassium phosphate buffer Dissolve in a solution (pH 7.5, pH 7.0 or pH 6.5) and formulate to 1,000 ml.
Reagent 2: TOOS solution 500 mg of TOOS (manufactured by Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.) is dissolved in ion-exchanged water and the volume is adjusted to 100 ml.
Reagent 3: Substrate solution (150 mM; final concentration 5 mM)
625 mg of αFVH, 440 mg of αFL, 377 mg of αFA, 355 mg of αFG, or 419 mg of αFV are dissolved in ion-exchanged water and the volume is adjusted to 10 ml.
Ｂ：活性測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔＡｓ）を測定した。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔＡ０）を測定した。３７℃で１分間あたりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出した。
B: Activity measurement method 2.7 ml of
活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×3.0×ｄｆ｝÷（39.2×0.5×0.1）
ΔAs：反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の１分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数（mM-1・cm-1）
0.5：１ｍｏｌの過酸化水素により生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
df：希釈係数
Activity (U / ml) = {(ΔAs-ΔA0) × 3.0 × df} ÷ (39.2 × 0.5 × 0.1)
ΔAs: Change in absorbance of the reaction solution per minute ΔA0: Change in absorbance of the control solution per minute
39.2: mmol extinction coefficient of quinoneimine dye produced by the reaction (mM -1 · cm -1 )
Number of moles of quinoneimine dye produced by 0.5: 1 mol of hydrogen peroxide
df: Dilution coefficient
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to those examples.
［実施例１］
（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼの調製）
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡの調製
Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを得た。
[Example 1]
(Preparation of amadriase derived from the genus Coniochaeta)
(1) Preparation of recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7) strain having a recombinant plasmid of the amadriase gene (SEQ ID NO: 2) derived from the genus Coniochaeta (International Publication No. 2) (See 2007/125779) in 3 ml of LB-amp medium [1% (w / v) plasmid, 0.5% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) NaCl, 50 μg / Inoculated into ml ampicillin] and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours to obtain a culture.
This culture was centrifuged at 10,000 × g for 1 minute to collect cells to obtain bacterial cells. Recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 was extracted and purified from this cell using GenElute Plasmid Mini-Prep Kit (manufactured by Sigma-Aldrich), and 2.5 μg of recombinant plasmid pKK223-3-3 was extracted. CFP-T7 DNA was obtained.
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
(2) Site-specific modification operation of recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA Using the obtained recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template, synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 3 and 4, A PCR reaction was carried out using KOD-Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.) under the following conditions.
That is, 5 μl of 10 × KOD-Plus-buffer solution, 5 μl of dNTPs mixed solution prepared to have dNTPs of 2 mM each, 2 μl of 25 mM sulfonyl 4 solution, and 50 ng of pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. , 15 pmol of each of the above synthetic oligonucleotides and 1 unit of KOD-Plus- were added, and the total amount was adjusted to 50 μl with sterilized water. The prepared reaction solution was incubated at 94 ° C. for 2 minutes using a thermal cycler (manufactured by Eppendorf), followed by "94 ° C., 15 seconds"-"50 ° C., 30 seconds"-"68 ° C., 6 minutes". The cycle of was repeated 30 times.
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ａ）を得た。 A part of the reaction solution was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and it was confirmed that about 6,000 bp of DNA was specifically amplified. The DNA thus obtained was treated with a restriction enzyme DpnI (manufactured by NEW ENGLAND BIOLABBS), the remaining template DNA was cleaved, and then Escherichia coli JM109 was transformed and developed on an LB-amp agar medium. The grown colonies were inoculated into LB-amp medium and cultured with shaking, and plasmid DNA was isolated by the same method as in (1) above. The base sequence of the DNA encoding amadrianase in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies), and as a result, the position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was determined. A recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-62A) encoding a modified amadrianase in which arginine was replaced with alanine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンをセリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ）を得た。 Subsequently, in order to replace the arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with serine, the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 and 5, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-62S) encoding a modified amadriase in which arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with serine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンをアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号６、７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６３Ａ）を得た。 Subsequently, in order to replace leucine at position 63 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with alanine, the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 6 and 7, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-63A) encoding a modified amadrianase in which leucine at position 63 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with alanine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンをセリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号８、９の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｓ）を得た。 Subsequently, in order to replace the arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with serine, the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NOs: 8 and 9, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-64S) encoding a modified amadriase in which arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with serine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンをアスパラギン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号９、１０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｄ）を得た。 Subsequently, in order to replace the arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with aspartic acid, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 9 and 10 were prepared using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using KOD-Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-64D) encoding a modified amadriase in which arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンをグルタミン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号９、１１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｅ）を得た。 Subsequently, in order to replace the arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with glutamic acid, the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NOs: 9 and 11, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-64E) encoding a modified amadriase in which arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with glutamic acid was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンをヒスチジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号９、１２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｈ）を得た。 Subsequently, in order to replace the arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with histidine, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 9 and 12, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-64H) encoding a modified amadriase in which arginine at position 64 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with histidine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをフェニルアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３、１４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンがフェニルアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｆ）を得た。 Subsequently, in order to replace the tyrosine at position 261 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with phenylalanine, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 13 and 14, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-261F) encoding a modified amadriase in which the tyrosine at position 261 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with phenylalanine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをアスパラギンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１４、１５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｎ）を得た。 Subsequently, in order to replace the tyrosine at position 261 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with asparagine, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 14 and 15, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-261N) encoding a modified amadriase in which the tyrosine at position 261 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with asparagine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをトリプトファンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１４、１６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンがトリプトファンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗ）を得た。 Subsequently, in order to replace the tyrosine at position 261 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with tryptophan, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 14 and 16 and KOD were used as a template using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-261W) encoding a modified amadriase in which the tyrosine at position 261 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with tryptophan was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンをセリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１７、１８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６３Ｓ）を得た。 Subsequently, in order to replace the glycine at position 263 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with serine, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 17 and 18, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-263S) encoding a modified amadriase in which glycine at position 263 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with serine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンをヒスチジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９、２０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｈ）を得た。 Subsequently, in order to replace the alanine at position 355 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with histidine, the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NOs: 19 and 20, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-355H) encoding a modified amadriase in which alanine at position 355 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with histidine was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンをアスパラギン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号２０、２１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｄ）を得た。 Subsequently, in order to replace the alanine at position 355 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with aspartic acid, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 20 and 21 were prepared using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using KOD-Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-355D) encoding a modified amadriase in which alanine at position 355 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid was obtained.
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の４１７位のアルギニンをヒスチジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号２２、２３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の４１７位のアルギニンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−４１７Ｈ）を得た。 Subsequently, in order to replace arginine at position 417 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with histidine, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 22 and 23, KOD, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template. Using -Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed under the same conditions as above. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-417H) encoding a modified amadriase in which arginine at position 417 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with histidine was obtained.
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、基質特異性確認のための酵素液０．６ｍｌを調製した。
(3) Production of various modified amadriase Escherichia coli JM109 strains carrying the above recombinant plasmids obtained by the above procedure were added to 3 ml of LB-amp medium supplemented with 0.1 mM IPTG at 30 ° C. 16 Cultured for hours. Each of the obtained cultured cells was washed with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the buffer, ultrasonically crushed, and centrifuged at 20,000 × g for 10 minutes. Then, 0.6 ml of an enzyme solution for confirming the substrate specificity was prepared.
（４）αＦＬ／αＦＶＨ、αＦＡ／αＦＶＨ、αＦＧ／αＦＶＨおよびαＦＶ／αＦＶＨの測定
上述の酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨに対するαＦＬ、αＦＡ、αＦＧまたはαＦＶの酵素活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株から生産した改変前のアマドリアーゼについても、同様の測定を行った。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。
その結果、上述の酵素活性測定の結果から得られた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株によって生産される改変前のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨは１．５３であり、αＦＡ／αＦＶＨは２．８６であり、αＦＧ／αＦＶＨは０．１６であり、αＦＶ／αＦＶＨは３．０７であった。
これに対し、部位特異的変異導入により作製した改変後の各種のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨ、および改変前のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨの値を１００％とした時の改変後のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨの比率を算出した。同様に、αＦＡ／αＦＶＨ、αＦＧ／αＦＶＨおよびαＦＶ／αＦＶＨに対しても算出し、結果を表１に示した。表中のデータにおいて、上段の数値はαＦＶＨの反応性に対する各種糖化アミノ酸の反応性の割合であり、下段の数値はＣＦＰ−Ｔ７の反応性を１００とした場合の、変異導入後の反応性の比率である。
(4) Measurement of αFL / αFVH, αFA / αFVH, αFG / αFVH and αFV / αFVH Using the above-mentioned enzyme solution, αFL, αFA, αFG or αFV with respect to αFVH by the method shown in the above B: activity measurement method. The enzyme activity of was measured. For comparison, the same measurement was also performed on the unmodified amadriase produced from the Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7) strain. For the activity measurement, a reagent 1: peroxidase and 4-aminoantipyrine solution adjusted to pH 7.0 were used.
As a result, the αFL / αFVH of the unmodified amadriase produced by the Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7) strain obtained from the above-mentioned enzyme activity measurement results was 1.53, and the αFA / αFVH was 2. It was .86, αFG / αFVH was 0.16, and αFV / αFVH was 3.07.
On the other hand, αFL / αFVH of various modified amadriase prepared by site-specific mutagenesis, and αFL / αFVH of modified amadriase when the αFL / αFVH value of the amadriase before modification was set to 100%. The ratio was calculated. Similarly, calculations were made for αFA / αFVH, αFG / αFVH, and αFV / αFVH, and the results are shown in Table 1. In the data in the table, the upper value is the ratio of the reactivity of various glycated amino acids to the reactivity of αFVH, and the lower value is the reactivity after the introduction of mutation when the reactivity of CFP-T7 is 100. It is a ratio.
すなわち、表１に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｈを除く全ての改変型アマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨは、いずれも８７％以下にまで低下し、顕著なものでは７７％まで低下し、特に、ＣＦＰ−Ｔ７−６２ＳおよびＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｄにおいては６２％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｆにおいては２８％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗにおいては１７％まで低下し、基質特異性が改善されていることがわかった。
ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、改変型アマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨが６５％以下まで低下すると、輸液中に最も多く含まれ得るαＦＬよりもαＦＶＨが優先的に反応することとなるために、このような改変は特に有用であると考えられる。
同様に、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＡ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ａを除く全ての改変型アマドリアーゼのαＦＡ／αＦＶＨは、いずれも９４％以下にまで低下し、顕著なものでは６７％まで低下し、特に、ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｈにおいては５４％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓにおいては４７％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｄにおいては３３％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗにおいては２８％まで低下し、基質特異性が改善されていることがわかった。
同様に、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＧ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、表１に示す全ての改変型アマドリアーゼのαＦＧ／αＦＶＨは、いずれも８１％以下にまで低下し、より顕著なものでは６９％以下まで低下し、特に、ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｄにおいては５０％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−６４ＥおよびＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｆにおいては３１％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ、ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｓ、ＣＦＰ−Ｔ７−６４ＤおよびＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗにおいては２５％まで低下し、基質特異性が改善されていることがわかった。
さらに同様に、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＶ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、表１に示す全ての改変型アマドリアーゼのαＦＶ／αＦＶＨは、いずれも９４％以下にまで低下し、顕著なものでは８１％まで低下し、特に、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓにおいては６３％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１ＷおよびＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｈにおいては５１％まで低下し、さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｆにおいては４４％まで低下し、基質特異性が改善されていることがわかった。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７−３５５Ｄは、αＦＬ／αＦＶＨ、αＦＡ／αＦＶＨ、αＦＧ／αＦＶＨおよびαＦＶ／αＦＶＨ、全てにおいて少なくともＣＦＰ−Ｔ７と比較して６９％以下にまで低下し、同様にＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓは少なくとも６３％まで低下し、同様にＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗは少なくとも５１％まで低下する有用な変異であった。
一方、ＣＦＰ−Ｔ７−６４Ｈは、αＦＡ、αＦＧおよびαＦＶへの反応はＣＦＰ−Ｔ７に比べて顕著に低減しているにも関わらず、αＦＬに対しては反応性が向上することが分かった。また、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ａは、αＦＬ、αＦＧおよびαＦＶへの反応はＣＦＰ−Ｔ７に比べて顕著に低減しているにも関わらず、αＦＡに対しては反応性が向上することが分かった。
このように、いくつかの位置に置換を導入することにより、αＦＶＨを測定する際の誤差原因物質となり得るαＦＧおよびαＦＶへの反応を低減できた。また、置換の位置やアミノ酸の種類により効果の有無や程度には差がみられたが、αＦＬまたはαＦＡに対しても反応性を低減できる複数の置換を見出した。
That is, as shown in Table 1, under the conditions of this example, when αFL / αFVH of CFP-T7 is set to 100%, αFL / αFVH of all modified amadriase except CFP-T7-64H is All of them decreased to 87% or less, most notably decreased to 77%, particularly in CFP-T7-62S and CFP-T7-64D, decreased to 62%, and further decreased in CFP-T7-261F. Was reduced to 28%, and further decreased to 17% in CFP-T7-261W, indicating that the substrate specificity was improved.
When αFL / αFVH of modified amadriase decreases to 65% or less when αFL / αFVH of CFP-T7 is set to 100%, αFVH reacts preferentially over αFL which can be contained most in the infusion solution. Therefore, such modifications are considered to be particularly useful.
Similarly, when αFA / αFVH of CFP-T7 was set to 100%, αFA / αFVH of all modified amadriase except CFP-T7-62A decreased to 94% or less, which is remarkable. In particular, it decreased to 67% in CFP-T7-355H, further decreased to 47% in CFP-T7-62S, and further decreased to 33% in CFP-T7-355D. It decreased, and further decreased to 28% in CFP-T7-261W, indicating that the substrate specificity was improved.
Similarly, when the αFG / αFVH of CFP-T7 was set to 100%, the αFG / αFVH of all the modified amadriase shown in Table 1 decreased to 81% or less, and more notably. It decreased to 69% or less, especially in CFP-T7-355D, decreased to 50%, further decreased to 31% in CFP-T7-64E and CFP-T7-261F, and further decreased to CFP-T7-62S. , CFP-T7-64S, CFP-T7-64D and CFP-T7-261W decreased to 25%, indicating that the substrate specificity was improved.
Furthermore, similarly, when the αFV / αFVH of CFP-T7 was set to 100%, the αFV / αFVH of all the modified amadriase shown in Table 1 decreased to 94% or less, which was not remarkable. It decreased to 81%, especially in CFP-T7-62S, decreased to 63%, further decreased to 51% in CFP-T7-261W and CFP-T7-355H, and further decreased in CFP-T7-261F. Was reduced to 44%, indicating that substrate specificity was improved.
Furthermore, CFP-T7-355D was reduced to at least 69% or less in all of αFL / αFVH, αFA / αFVH, αFG / αFVH and αFV / αFVH as compared with CFP-T7, and similarly CFP-T7-62S. Was reduced to at least 63%, and CFP-T7-261W was also a useful mutation reduced to at least 51%.
On the other hand, CFP-T7-64H was found to have improved reactivity with αFL, although the reaction to αFA, αFG and αFV was significantly reduced as compared with CFP-T7. Further, it was found that the reactivity of CFP-T7-62A to αFA was improved even though the reaction to αFL, αFG and αFV was remarkably reduced as compared with CFP-T7.
In this way, by introducing substitutions at several positions, it was possible to reduce the reaction to αFG and αFV, which can be error-causing substances when measuring αFVH. In addition, although there were differences in the presence or absence and degree of effect depending on the position of substitution and the type of amino acid, we found multiple substitutions that can reduce the reactivity to αFL or αFA.
なお、国際公開第２００４／１０４２０３号において、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼの６２位のアルギニンをヒスチジンに置換することにより、αＦＶＨへの反応性に対するεＦＺＫ（ε−フルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニルリジン）に対する反応性の割合であるεＦＺＫ／αＦＶＨが０．９５から０．２４へと低減することが開示されていたため、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンをヒスチジンに置換した場合の効果についても検証した。
具体的には、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、２４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｈ）を得た。得られた組換え体プラスミドを用いて上記の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
In addition, in International Publication No. 2004/104203, by substituting arginine at position 62 of ketoamine oxidase derived from carbraria clavata YH923 with histidine, εFZK (ε-fructosyl- (α-benzyloxy)) with respect to reactivity to αFVH was used. Since it was disclosed that εFZK / αFVH, which is the ratio of reactivity to carbonyllysine), is reduced from 0.95 to 0.24, when arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine. The effect of was also verified.
Specifically, using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA as a template and using the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NOs: 4 and 24, KOD-Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), under the same conditions as above. PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and sequencing of the DNA encoding amadriase in the plasmid DNA retained by the growing colonies were performed. As a result, a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-62H) encoding a modified amadriase in which arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with histidine was obtained. The obtained recombinant plasmid was cultured by the above method to prepare 0.6 ml of a crude enzyme solution of various modified amadriase.
Ｃ．試薬の調製
試薬４：基質溶液（６０ｍＭ； 終濃度２ｍＭ）
αＦＶＨ ２５０ｍｇ、εＦＫ １８５ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
C. Preparation of Reagent Reagent 4: Substrate solution (60 mM;
Dissolve 250 mg of αFVH and 185 mg of εFK in ion-exchanged water and adjust the volume to 10 ml.
上述の酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法において試薬３の代わりに試薬４を用いた方法により、αＦＶＨに対するＦＫの酵素活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株から生産した改変前のアマドリアーゼについても、同様の測定を行った。なお、活性測定にはｐＨ７．５に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。
その結果、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株によって生産される改変前のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨは０．１８であり、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｈ）株によって生産される、６２位のアミノ酸をヒスチジンに置換する変異導入後のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨは０．２６であった。つまり、ＣＦＰ−Ｔ７においては、６２位のアルギニンをヒスチジンに置換することは、基質特異性を逆に悪化させ、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼにおけるεＦＺＫを用いた基質特異性改変知見と逆の効果を奏することが確認された。
Using the above-mentioned enzyme solution, the enzyme activity of FK with respect to αFVH was measured by the
As a result, the εFK / αFVH of the unmodified amadriase produced by the Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7) strain was 0.18, and was produced by the Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-62H) strain. The εFK / αFVH of amadriase after the introduction of the mutation in which the amino acid at position 62 was replaced with histidine was 0.26. That is, in CFP-T7, substituting arginine at position 62 with histidine adversely deteriorates substrate specificity, which is contrary to the finding of substrate specificity modification using εFZK in ketoamine oxidase derived from carbraria clavata YH923. It was confirmed that the effect of
［実施例２］
（基質特異性改善に有効な変異の蓄積）
表２に示した各種組換え体プラスミドＤＮＡを鋳型として、合成オリゴヌクレオチド（配列番号４、５、１８、１９、２０、２１、２５）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。
これにより、その結果、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、かつ２６３位のグリシンがセリンに置換された二重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗ／２６３Ｓ、６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、かつ２６３位のグリシンがセリンに置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがヒスチジンに置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｈ、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された三重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄ、６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがヒスチジンに置換された四重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｈ、６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された四重変異体であるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを得た。
そして、配列番号１記載のアミノ酸配列に表２中の「アミノ酸変異」の欄に記載した複数のアミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
上述の酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨに対するαＦＬ、αＦＡ、αＦＧまたはαＦＶの酵素活性を測定した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表２に示す。表中のデータにおいて、上段の数値はαＦＶＨの反応性に対する、各種糖化アミノ酸の反応性の割合であり、下段の数値はＣＦＰ−Ｔ７の反応性を１００とした場合の、変異導入後の反応性の比率である。
[Example 2]
(Accumulation of mutations effective for improving substrate specificity)
Using the various recombinant plasmid DNAs shown in Table 2 as templates, synthetic oligonucleotides (SEQ ID NOs: 4, 5, 18, 19, 20, 21, 25) and KOD-Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.) were used as described above. Under the same conditions as in (2), PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109 strain, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies were performed.
As a result, pKK223-3-CFP-T7-261W / 263S, a double variant in which tyrosine at position 261 was replaced with tryptophan and glycine at position 263 was replaced with serine, was added to arginine at position 62. PKK223-3-CFP-T7-62S / 261W / 263S, which is a triple variant in which serine is replaced, tyrosine at position 261 is replaced with tryptophan, and glycine at position 263 is replaced with serine, and tyrosine at position 261 PKK223-3-CFP-T7-261W / 263S / 355H, tyrosine at position 261 is a triple variant in which glycine at position 263 is replaced with serine and alanine at position 355 is replaced with histidine. PKK223-3-CFP-T7-261W / 263S / 355D, arginine at position 62, which is a triple variant in which glycine at position 263 is replaced with serine and alanine at position 355 is replaced with aspartic acid. Is replaced with serine, tyrosine at position 261 is replaced with tryptophan, glycine at position 263 is replaced with serine, and alanine at position 355 is replaced with histidine, pKK223-3-CFP-T7. -62S / 261W / 263S / 355H, arginine at position 62 was replaced with serine, tyrosine at position 261 was replaced with tryptophan, glycine at position 263 was replaced with serine, and alanine at position 355 was replaced with asparagic acid. A quadruple variant, pKK223-3-CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D, was obtained.
Then, an Escherichia coli JM109 strain producing a modified amadriase in which a plurality of amino acid substitutions described in the column of "amino acid mutation" in Table 2 was introduced into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained.
The Escherichia coli JM109 strain having the modified amadriase-producing ability obtained as described above was cultured by the method described in (3) above to prepare 0.6 ml of a crude enzyme solution of various modified amadriase.
Using the above-mentioned enzyme solution, the enzyme activity of αFL, αFA, αFG or αFV with respect to αFVH was measured by the method shown in the above-mentioned B: activity measurement method. For the activity measurement, a reagent 1: peroxidase and 4-aminoantipyrine solution adjusted to pH 7.0 were used. The results are shown in Table 2. In the data in the table, the upper value is the ratio of the reactivity of various glycated amino acids to the reactivity of αFVH, and the lower value is the reactivity after the introduction of mutation when the reactivity of CFP-T7 is 100. Is the ratio of.
すなわち、表２に示す通り、実施例１で確認された各種の単独変異を組み合わせて作製した各種多重変異体においては、ほとんどの場合、基質特異性が顕著に改善した。
具体的には、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、かつ２６３位のグリシンがセリンに置換された二重変異体におけるαＦＬ／αＦＶＨは、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して１７％であり、αＦＡ／αＦＶＨは、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＡ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して３０％であり、αＦＧ／αＦＶＨは、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＧ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して２５％であり、αＦＶ／αＦＶＨは、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＶ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して４４％であった。
さらに同様に、６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、かつ２６３位のグリシンがセリンに置換された三重変異体におけるαＦＬ／αＦＶＨは７％であり、αＦＡ／αＦＶＨは５％であり、αＦＧ／αＦＶＨは６％であり、αＦＶ／αＦＶＨは１７％であった。
さらに同様に、前記三重変異体に対して変異を蓄積させた６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された四重変異体におけるαＦＬ／αＦＶＨは２％であり、αＦＡ／αＦＶＨは２％であり、αＦＧ／αＦＶＨは０％であり、αＦＶ／αＦＶＨは６％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して顕著に改善した。
すなわち、得られたさらなる多重変異体の基質特異性は段階的に改善しており、実施例１で確認された本発明の変異点を適宜組み合わせることによって、一層優れた基質特異性を有するアマドリアーゼが作出され得ることが明らかとなった。
That is, as shown in Table 2, in most cases, the substrate specificity was remarkably improved in the various multiple mutants prepared by combining the various single mutations confirmed in Example 1.
Specifically, αFL / αFVH in the double mutant in which tyrosine at position 261 was replaced with tryptophan and glycine at position 263 was replaced with serine was obtained when αFL / αFVH of CFP-T7 was 100%. On the other hand, it was 17%, αFA / αFVH was 30% when αFA / αFVH of CFP-T7 was set to 100%, and αFG / αFVH was set to 100% of αFG / αFVH of CFP-T7. It was 25% with respect to the case, and αFV / αFVH was 44% with respect to the case where αFV / αFVH of CFP-T7 was 100%.
Similarly, αFL / αFVH was 7% and αFA / αFVH in the triple mutant in which arginine at position 62 was replaced with serine, tyrosine at position 261 was replaced with tryptophan, and glycine at position 263 was replaced with serine. αFVH was 5%, αFG / αFVH was 6%, and αFV / αFVH was 17%.
Similarly, arginine at position 62, which has accumulated mutations in the triple mutant, is replaced with serine, tyrosine at position 261 is replaced with tryptophan, glycine at position 263 is replaced with serine, and position 355. In the quadruplex in which alanine was replaced with aspartic acid, αFL / αFVH was 2%, αFA / αFVH was 2%, αFG / αFVH was 0%, αFV / αFVH was 6%, and CFP. -Significant improvement compared to T7.
That is, the substrate specificity of the obtained further multiple mutants is gradually improved, and by appropriately combining the mutation points of the present invention confirmed in Example 1, an amadriase having further excellent substrate specificity can be obtained. It became clear that it could be created.
［実施例３］
（本発明のアマドリアーゼにおける各種糖化アミノ酸に対する反応性の低下）
次に、改変型アマドリアーゼを用いて、αＦＶＨの反応性に対するαＦＬ、αＦＡ、αＦＧ、αＦＶ以外の糖化アミノ酸、すなわちαＦＩ、α−フルクトシルスレオニン（αＦＴ）、α−フルクトシルメチオニン（αＦＭ）、α−フルクトシルフェニルアラニン（αＦＦ）、α−フルクトシルセリン（αＦＳ）、α−フルクトシルグルタミン酸（αＦＥ）、εＦＫ、β−フルクトシルアラニン（βＦＡ）の反応性についても評価した。
Ｄ．：試薬の調製
試薬５：アマドリアーゼ溶液
配列番号１記載のアマドリアーゼ、及び配列番号１記載のアマドリアーゼの６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型のアマドリアーゼ（以降ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄと表記）を実施例１（３）と同様に調製した。
試薬６：基質溶液（６０ｍＭ； 終濃度２ｍＭ）
αＦＶＨ ２５０ｍｇ、αＦＬ １７６ｍｇ、αＦＡ １５１ｍｇ、αＦＧ １４２ｍｇ、αＦＶ １６７ｍｇ、αＦＩ １７６ｍｇ、αＦＴ １６９ｍｇ、αＦＦ １９６ｍｇ、αＦＭ １８７ｍｇ、αＦＳ １６０ｍｇ、αＦＥ １８５ｍｇ、εＦＫ １８５ｍｇまたはβＦＡ １５１ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
[Example 3]
(Reduction of reactivity to various glycated amino acids in the amadriase of the present invention)
Next, using the modified amadriane, saccharified amino acids other than αFL, αFA, αFG, and αFV for the reactivity of αFVH, that is, αFI, α-fructosylthreonine (αFT), α-fructosylmethionine (αFM), α- The reactivity of fructosylphenylalanine (αFF), α-fructosylserine (αFS), α-fructosylglutamic acid (αFE), εFK, β-fructosylalanine (βFA) was also evaluated.
D. : Preparation of Reagents Reagent 5: Amadriase solution The arginine at position 62 of the amadriase shown in SEQ ID NO: 1 and the amaliase shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with serine, the tyrosine at position 261 is replaced with tryptophan, and the glycine at position 263 is serine. A modified amadriase (hereinafter referred to as CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D) in which alanine at position 355 was replaced with aspartic acid was prepared in the same manner as in Example 1 (3).
Reagent 6: Substrate solution (60 mM;
αFVH 250 mg, αFL 176 mg, αFA 151 mg, αFG 142 mg, αFV 167 mg, αFI 176 mg, αFT 169 mg, αFF 196 mg, αFM 187 mg, αFS 160 mg, αFE 185 mg, εFK 185 mg or βFA 185 mg or βFA To do.
上記のＢ：活性測定法において酵素液の代わりに試薬５を、試薬３の代わりに試薬６を用いた方法により、αＦＶＨに対する各種糖化アミノ酸の酵素活性を測定した。なお、活性測定にはｐＨ６．５に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。
以上のように測定した活性値から、αＦＶＨの活性値を１とした場合のαＦＬの活性値に相当するαＦＬ／αＦＶＨを算出した。αＦＡ、αＦＶ、αＦＧ、αＦＩ、αＦＴ、αＦＦ、αＦＳ、αＦＭ、αＦＥ、εＦＫ、またはβＦＡに対しても同様にして、αＦＡ／αＦＶＨ、αＦＶ／αＦＶＨ、αＦＧ／αＦＶＨ、αＦＩ／αＦＶＨ、αＦＴ／αＦＶＨ、αＦＦ／αＦＶＨ、αＦＳ／αＦＶＨ、αＦＭ／αＦＶＨ、αＦＥ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶＨまたはβＦＡ／αＦＶＨを算出した。比較例としてＣＦＰ−Ｔ７、実施例としてＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いた。また、本発明の変異導入前の反応性の割合（比率１）に対する、変異導入後の反応性の割合（比率２）の比率を算出した（比率２／比率１）。以上の結果を表３に示す。
In the above B: activity measurement method, the enzyme activity of various glycated amino acids with respect to αFVH was measured by a method using reagent 5 instead of reagent solution and reagent 6 instead of
From the activity values measured as described above, αFL / αFVH corresponding to the activity value of αFL when the activity value of αFVH was set to 1 was calculated. Similarly for αFA, αFV, αFG, αFI, αFT, αFF, αFS, αFM, αFE, εFK, or βFA, αFA / αFVH, αFV / αFVH, αFG / αFVH, αFI / αFVH, αFT / αFVH, αFF / αFVH, αFS / αFVH, αFM / αFVH, αFE / αFVH, εFK / αFVH or βFA / αFVH were calculated. CFP-T7 was used as a comparative example, and CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D was used as an example. In addition, the ratio of the reactivity after the introduction of the mutation (ratio 2) to the ratio of the reactivity before the introduction of the mutation (ratio 1) of the present invention was calculated (
表３に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＬ／αＦＶＨは９５％となった。これに対し、ＣＦＰ−Ｔ７の６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型のアマドリアーゼのαＦＬ／αＦＶＨは３％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０３まで低減し、すなわち９７％もαＦＬ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＡ／αＦＶＨは１５１％であり、改変型のアマドリアーゼのαＦＡ／αＦＶＨは２％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０１まで低減し、すなわち９９％もαＦＡ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＶ／αＦＶＨは２２５％であり、改変型のアマドリアーゼのαＦＶ／αＦＶＨは７％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０３まで低減し、すなわち９７％もαＦＶ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＩ／αＦＶＨは２６９％であり、改変型のアマドリアーゼのαＦＩ／αＦＶＨは８％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０５まで低減し、すなわち９５％もαＦＩ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
さらに、ＣＦＰ−Ｔ７のαＦＭ／αＦＶＨは２４４％であり、改変型のアマドリアーゼのαＦＭ／αＦＶＨは４％であり、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して０．０２まで低減し、すなわち９８％もαＦＭ／αＦＶＨを低減することができ、基質特異性が顕著に改善した。
αＦＬ、αＦＡ、αＦＶ、αＦＩ、αＦＭ以外の糖化アミノ酸、具体的にはαＦＧ、αＦＴ、αＦＦ、αＦＳ、αＦＥ、εＦＫ、またはβＦＡに対しても、反応性が少なくとも０．５まで低下し、より顕著なものは０．２９まで低下し、さらに顕著なものは０．１４まで低下し、さらに顕著なものは０．０４まで低下した。すなわち、改変前の反応性の割合を１００％とした場合に、改変後の反応性の割合は、少なくとも５０％まで低下し、より顕著なものは７１％まで低下し、さらに顕著なものは８６％まで低下し、さらに顕著なものは９６％まで低下し、基質特異性が改善された。
以上より、ＣＦＰ−Ｔ７の６２位のアルギニンがセリンに置換され、２６１位のチロシンがトリプトファンに置換され、２６３位のグリシンがセリンに置換され、かつ３５５位のアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型のアマドリアーゼは、糖化アミノ酸の影響を低減させ、αＦＶＨに特異的に反応することが可能であることが示唆された。
As shown in Table 3, under the conditions of this example, the αFL / αFVH of CFP-T7 was 95%. In contrast, arginine at position 62 of CFP-T7 was replaced with serine, tyrosine at position 261 was replaced with tryptophan, glycine at position 263 was replaced with serine, and alanine at position 355 was replaced with aspartic acid. The αFL / αFVH of the modified amadrianase was 3%, which was reduced to 0.03 as compared with CFP-T7, that is, the αFL / αFVH could be reduced by 97%, and the substrate specificity was significantly improved. ..
Furthermore, the αFA / αFVH of CFP-T7 was 151%, and the αFA / αFVH of the modified amadriase was 2%, which was reduced to 0.01 compared to CFP-T7, that is, 99% of αFA / αFVH. Was able to be reduced, and the substrate specificity was significantly improved.
Furthermore, the αFV / αFVH of CFP-T7 was 225%, and the αFV / αFVH of the modified amadriase was 7%, which was reduced to 0.03 compared to CFP-T7, that is, 97% was also αFV / αFVH. Was able to be reduced, and the substrate specificity was significantly improved.
Furthermore, the αFI / αFVH of CFP-T7 was 269%, and the αFI / αFVH of the modified amadriase was 8%, which was reduced to 0.05 compared to CFP-T7, that is, 95% of αFI / αFVH. Was able to be reduced, and the substrate specificity was significantly improved.
Furthermore, the αFM / αFVH of CFP-T7 was 244%, and the αFM / αFVH of the modified amadriase was 4%, which was reduced to 0.02 compared to CFP-T7, that is, 98% was also αFM / αFVH. Was able to be reduced, and the substrate specificity was significantly improved.
Reactivity to saccharified amino acids other than αFL, αFA, αFV, αFI, αFM, specifically αFG, αFT, αFF, αFS, αFE, εFK, or βFA is reduced to at least 0.5, which is more remarkable. The most prominent ones decreased to 0.29, the more prominent ones decreased to 0.14, and the more prominent ones decreased to 0.04. That is, when the reactivity ratio before modification is 100%, the reactivity ratio after modification is reduced to at least 50%, the more remarkable one is reduced to 71%, and the more remarkable one is 86. It decreased to%, and more remarkable one decreased to 96%, and the substrate specificity was improved.
Based on the above, arginine at position 62 of CFP-T7 was replaced with serine, tyrosine at position 261 was replaced with tryptophan, glycine at position 263 was replaced with serine, and alanine at position 355 was replaced with aspartic acid. It was suggested that the type of amadriase can reduce the influence of glycated amino acids and react specifically with αFVH.
［実施例４］
（αＦＶ、αＦＬまたはεＦＫが共存するフルクトシルペプチド試料の測定）
（５）αＦＶ、αＦＬまたはεＦＫを含むフルクトシルペプチド試料の調製
（試薬７）に記載したαＦＶＨ、若しくはαＦＶの溶液を混合し、イオン交換水で希釈することで、０．６ｍＭ αＦＶＨ溶液、０．６ｍＭ αＦＶ溶液、０．１２ｍＭ αＦＶ溶液、０．０６ｍＭ αＦＶ溶液、０．６ｍＭ αＦＬ溶液、０．１２ｍＭ αＦＬ溶液、０．６ｍＭ εＦＫ溶液を調製した。
０．６ｍＭ αＦＶＨ溶液に等量のイオン交換水、あるいは０．６ｍＭ αＦＶ溶液、あるいは０．６ｍＭ αＦＬ溶液、あるいは０．６ｍＭ εＦＫ溶液を混合することで、０．３ｍＭ αＦＶＨ溶液、あるいは０．３ｍＭ αＦＶとの混合溶液、あるいは０．３ｍＭ αＦＬとの混合溶液、あるいは０．３ｍＭ εＦＫとの混合溶液とした。
同様にして、０．６ｍＭ αＦＶＨ溶液に０．１２ｍＭ αＦＶ溶液、あるいは０．０６ｍＭ αＦＶ溶液、あるいは０．１２ｍＭ αＦＬ溶液を混合することで、０．３ｍＭ αＦＶＨ溶液と０．０６ｍＭ αＦＶとの混合溶液、あるいは０．０３ｍＭ αＦＶとの混合溶液、あるいは０．０６ｍＭ αＦＬとの混合溶液とした。
[Example 4]
(Measurement of fructosyl peptide sample in which αFV, αFL or εFK coexist)
(5) Preparation of fructosyl peptide sample containing αFV, αFL or εFK The solution of αFVH or αFV described in (Reagent 7) is mixed and diluted with ion-exchanged water to obtain a 0.6 mM αFVH solution, 0. A 6 mM αFV solution, a 0.12 mM αFV solution, a 0.06 mM αFV solution, a 0.6 mM αFL solution, a 0.12 mM αFL solution, and a 0.6 mM εFK solution were prepared.
By mixing an equal amount of ion-exchanged water, 0.6 mM αFV solution, 0.6 mM αFL solution, or 0.6 mM εFK solution with 0.6 mM αFVH solution, 0.3 mM αFVH solution or 0.3 mM αFV A mixed solution with, a mixed solution with 0.3 mM αFL, or a mixed solution with 0.3 mM εFK was used.
Similarly, by mixing 0.12 mM αFV solution, 0.06 mM αFV solution, or 0.12 mM αFL solution with 0.6 mM αFVH solution, a mixed solution of 0.3 mM αFVH solution and 0.06 mM αFV, Alternatively, a mixed solution with 0.03 mM αFV or a mixed solution with 0.06 mM αFL was used.
（６）αＦＶ、αＦＬまたはεＦＫを含むフルクトシルペプチド試料の測定
（試薬７）
アマドリアーゼ溶液
比較例：５．０Ｕ／ｍｌ ＣＦＰ−Ｔ７
実施例：２１．０Ｕ／ｍｌ ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄ
（試薬８）
６．３Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（キッコーマンバイオケミファ社製）
０．６２ｍＭ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）
０．７ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学研究所社製）
１２６ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
(6) Measurement of fructosyl peptide sample containing αFV, αFL or εFK (Reagent 7)
Amadriase solution comparative example: 5.0 U / ml CFP-T7
Example: 21.0U / ml CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D
(Reagent 8)
6.3 U / ml peroxidase (manufactured by Kikkoman Biochemifa)
0.62 mM 4-aminoantipyrine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
0.7 mM TOOS (manufactured by Dojin Chemical Research Institute)
126 mM phosphate buffer (pH 6.5)
２５μｌの（試薬７）に１５０μｌの（試薬８）を加え、３７℃で５分間加温した。次いで上記（５）で調製した３５μｌのフルクトシルペプチド試料あるいはαＦＶ、αＦＬまたはεＦＫとの混合試料を添加して反応を開始し、３７℃で５分間反応後の波長５４５ｎｍにおける吸光度を自動分析装置Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ‐ＢＭ１６５０（日本電子）で測定した。試料の代わりにイオン交換水を用いて同様に操作して測定した波長５４５ｎｍにおける吸光度（試薬ブランク）を対照として、下記の式により、それぞれの試料を測定した場合の吸光度変化量を算出した。
吸光度変化量＝ΔＡｅｓ−Ａｅ０
ΔＡｅｓ：反応開始から５分経過後の吸光度
ΔＡｅ０：対照液を添加した場合の反応開始から５分経過後の吸光度
得られた各吸光度変化量を用いて、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の、αＦＶＨに加えてαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸を混合させた試料を測定した時の吸光度変化量の割合を求めた。
具体的には、まず、ＣＦＰ−Ｔ７を用いて、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を求めた。また、０．３ｍＭ αＦＶＨおよび０．３ｍＭ、０．０６ｍＭまたは０．０３ｍＭ αＦＶを含む混合試料を測定した時の吸光度変化量を求めた。そして、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の、０．３ｍＭ、０．０６ｍＭまたは０．０３ｍＭ αＦＶ混合試料を測定した時の吸光度変化量割合である「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＶ）／ΔＡαＦＶＨ」を算出した。
150 μl (Reagent 8) was added to 25 μl (Reagent 7), and the mixture was heated at 37 ° C. for 5 minutes. Next, 35 μl of the fructosyl peptide sample prepared in (5) above or a mixed sample with αFV, αFL or εFK was added to start the reaction, and the absorbance at a wavelength of 545 nm after the reaction at 37 ° C. for 5 minutes was measured by the automatic analyzer Bio. The sample was measured with Majesty JCA-BM1650 (JEOL Ltd.). Using ion-exchanged water instead of the sample and measuring the absorbance at a wavelength of 545 nm (reagent blank) as a control, the amount of change in absorbance when each sample was measured was calculated by the following formula.
Absorbance change = ΔAes-Ae0
ΔAes: Absorbance 5 minutes after the start of the reaction ΔAe0: Absorbance 5 minutes after the start of the reaction when the control solution was added
When the amount of change in absorbance when measuring a sample containing only 0.3 mM αFVH was set to 1 using each amount of change in absorbance obtained, a sample in which saccharified amino acids other than αFVH were mixed in addition to αFVH was measured. The ratio of the amount of change in absorbance was determined.
Specifically, first, the amount of change in absorbance when a sample containing only 0.3 mM αFVH was measured using CFP-T7 was determined. In addition, the amount of change in absorbance when a mixed sample containing 0.3 mM αFVH and 0.3 mM, 0.06 mM or 0.03 mM αFV was measured was determined. Then, when the amount of change in absorbance when measuring a sample containing only 0.3 mM αFVH is 1, it is the ratio of the amount of change in absorbance when measuring a 0.3 mM, 0.06 mM or 0.03 mM αFV mixed sample. “ΔA (αFVH + αFV) / ΔAαFVH” was calculated.
同様に、０．３ｍＭ αＦＶＨまたは０．３ｍＭ、０．０６ｍＭ αＦＬを含む混合試料を測定した時の吸光度変化量を求め、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の０．３ｍＭまたは０．０６ｍＭ αＦＬ混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合である「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＬ）／ΔＡαＦＶＨ」を算出した。
同様に、０．３ｍＭ αＦＶＨおよび０．３ｍＭ εＦＫを含む混合試料を測定した時の吸光度変化量を求め、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の０．３ｍＭ εＦＫ混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合である「ΔＡ（αＦＶＨ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨ」を算出した。
一方、ＣＦＰ−Ｔ７に代えて、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いて、同様に、上述の各試料を測定し、その吸光度変化量から、「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＶ）／ΔＡαＦＶＨ」「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＬ）／ΔＡαＦＶＨ」「ΔＡ（αＦＶＨ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨ」を算出した。そして、各々について、双方を比較した。結果を表４に示す。表中、右から３列目の数値は、ＣＦＰ−Ｔ７を用いて、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の、αＦＶＨに加えて右から４列目に記載の糖化アミノ酸を混合させた試料を測定した時の吸光度変化量の割合である。また、表中、右から２列目の数値は、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いて、同様に各試料を測定した場合の、０．３ｍＭ αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の、αＦＶＨに加えて右から４列目に記載の糖化アミノ酸を混合させた試料を測定した時の吸光度変化量の割合である。
Similarly, the amount of change in absorbance when measuring a mixed sample containing 0.3 mM αFVH or 0.3 mM, 0.06 mM αFL was determined, and the amount of change in absorbance when measuring a sample containing only 0.3 mM αFVH was set to 1. “ΔA (αFVH + αFL) / ΔAαFVH”, which is the ratio of the amount of change in absorbance when the 0.3 mM or 0.06 mM αFL mixed sample was measured, was calculated.
Similarly, the amount of change in absorbance when a mixed sample containing 0.3 mM αFVH and 0.3 mM εFK was measured was obtained, and 0 when the amount of change in absorbance when a sample containing only 0.3 mM αFVH was measured was 1. .. “ΔA (αFVH + εFK) / ΔAαFVH”, which is the ratio of the amount of change in absorbance when the 3 mM εFK mixed sample was measured, was calculated.
On the other hand, instead of CFP-T7, CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D was used to measure each of the above-mentioned samples in the same manner, and from the amount of change in absorbance, "ΔA (αFVH + αFV) / ΔAαFVH" and " ΔA (αFVH + αFL) / ΔAαFVH ”and“ ΔA (αFVH + εFK) / ΔAαFVH ”were calculated. Then, for each, both were compared. The results are shown in Table 4. In the table, the numerical values in the third column from the right are the four columns from the right in addition to αFVH when the amount of change in absorbance when a sample containing only 0.3 mM αFVH is measured using CFP-T7. It is the ratio of the amount of change in absorbance when the sample mixed with the saccharified amino acids described in the eyes is measured. In the table, the values in the second column from the right are the samples containing only 0.3 mM αFVH when each sample was measured in the same manner using CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D. It is the ratio of the amount of change in absorbance when the sample in which the saccharified amino acid described in the fourth column from the right is mixed in addition to αFVH is measured when the amount of change in absorbance at time is 1.
表４から明らかなように、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを含む試薬を用いて測定した「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＶ）／ΔＡαＦＶＨ」、「ΔＡ（αＦＶＨ＋αＦＬ）／ΔＡαＦＶＨ」、「ΔＡ（αＦＶ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨ」は、全て、本発明の置換を導入する前のＣＦＰ−Ｔ７を含む試薬を用いて得られた値よりも低値であった。すなわち、本発明の置換を導入することにより、混合させるαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸の測定値に与える影響が低減していることが確認された。
表４中、最右列には、上述の「混合させるαＦＶＨ以外の糖化アミノ酸の測定値に与える影響が低減」した度合を「糖化アミノ酸の影響低減率（％）」として示した。この数値は、右から３列目の数値と右から２列目の数値の差分（減少分）を計算し、これを右から３列目の数値で割ることにより算出される。
具体的には、ＣＦＰ−Ｔ７に代えてＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いた場合は、０．３ｍＭ αＦＬを混合させた時に、αＦＶＨのみを測定する場合よりも測定値が高値に出る度合が５３％減少した。また、０．０６ｍＭ αＦＬを混合させた時には、２４％減少することが分かった。また、０．３ｍＭ αＦＶを混合させた時には、αＦＶの影響が４１％減少し、０．０６ｍＭ αＦＶを混合させた時には、１８％減少し、０．０３ｍＭ αＦＶを混合させた時には、９％減少することが分かった。また同様に、ＣＦＰ−Ｔ７よりもＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いた場合は、０．３ｍＭ εＦＫを含んでいる時には、εＦＫの影響が８％減少することが分かった。
As is clear from Table 4, "ΔA (αFVH + αFV) / ΔAαFVH", "ΔA (αFVH + αFL) / ΔAαFVH", and "ΔA (αFV + εFK)" measured using reagents containing CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D. / ΔAαFVH ”was all lower than the values obtained using the reagent containing CFP-T7 before introducing the substitution of the present invention. That is, it was confirmed that by introducing the substitution of the present invention, the influence on the measured values of the saccharified amino acids other than αFVH to be mixed was reduced.
In the rightmost column of Table 4, the degree to which the above-mentioned "effect on the measured values of glycated amino acids other than αFVH to be mixed is reduced" is shown as "effect reduction rate (%) of saccharified amino acids". This numerical value is calculated by calculating the difference (decrease) between the numerical value in the third column from the right and the numerical value in the second column from the right, and dividing this by the numerical value in the third column from the right.
Specifically, when CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D is used instead of CFP-T7, the measured value is higher when 0.3 mM αFL is mixed than when only αFVH is measured. The degree of appearance decreased by 53%. It was also found that when 0.06 mM αFL was mixed, it decreased by 24%. Also, when 0.3 mM αFV is mixed, the effect of αFV is reduced by 41%, when 0.06 mM αFV is mixed, it is reduced by 18%, and when 0.03 mM αFV is mixed, it is reduced by 9%. It turned out. Similarly, it was found that when CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D was used rather than CFP-T7, the effect of εFK was reduced by 8% when 0.3 mM εFK was contained.
また、表４より、０．０６ｍＭのαＦＬまたは０．０３ｍＭのαＦＶを混合した場合、つまり終濃度が１０μＭのαＦＬまたは５μＭのαＦＶが共存している場合において、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄを用いることにより、共存するαＦＬまたは５μＭのαＦＶの影響は５％以内に抑えられ、正確にαＦＶＨを測定できることが分かった。
生物試料分析 Ｖｏｌ２７， ｐ９７−１０３， ２００４によれば、高カロリーアミノ酸輸液であるユニカリック（登録商標）を投与した患者の血液中に含まれる糖化アルブミンを酵素法で測定した際に、糖化アルブミン量を血清アルブミン量で割って得られる値が、ＨＰＬＣ法による測定値と比較して平均６．８８％高いことが示されている。この知見を元に、血清アルブミン量を３．８ｇ／ｄＬ、アルブミンの分子量を６６，０００として計算を行った場合、ユニカリック（登録商標）の投与により、血中の糖化アミノ酸濃度が３９．４μＭ上昇すると考えられる。また、ユニカリック（登録商標）にはＬ−ロイシンが１２．９％、Ｌ−バリンが９．６％含まれていることから、これらの全量が糖化されたと仮定すると、高カロリーアミノ酸輸液に由来して体内へと混入した３９．４μＭの糖化アミノ酸のうち、αＦＬは５μＭが含まれ、αＦＶは４μＭが含まれることになる。
例えば、上記のような値をもとに、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄの効果を推定してみると、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｓ／２６１Ｗ／２６３Ｓ／３５５Ｄは１０μＭのαＦＬまたは５μＭのαＦＶが共存しても、ほとんど影響を受けず、正確にαＦＶＨを測定できると考えられ、ユニカリック（登録商標）を投与された患者の血液中に持ち込まれると予測される糖化アミノ酸による影響を受ける可能性は顕著に低いことが示唆される。すなわち、本発明の置換を導入したアマドリアーゼを用いることにより、従来課題とされていた高カロリーアミノ酸輸液由来の糖化アミノ酸の影響をほとんど受けることなく、αＦＶＨを簡便かつ精度よく定量できることが分かった。
Further, from Table 4, when 0.06 mM αFL or 0.03 mM αFV is mixed, that is, when αFL having a final concentration of 10 μM or αFV having a final concentration of 5 μM coexists, CFP-T7-62S / 261W / 263S It was found that by using / 355D, the influence of coexisting αFL or 5 μM αFV was suppressed within 5%, and αFVH could be measured accurately.
According to Biological Sample Analysis Vol27, p97-103, 2004, the amount of glycated albumin contained in the blood of patients who received Unicalic (registered trademark), which is a high-calorie amino acid infusion, was measured by an enzymatic method. It has been shown that the value obtained by dividing by the amount of serum albumin is on average 6.88% higher than the value measured by the HPLC method. Based on this finding, when the serum albumin amount was 3.8 g / dL and the molecular weight of albumin was 66,000, administration of Unicalic (registered trademark) increased the blood glycated amino acid concentration by 39.4 μM. It is thought that. In addition, since Unicalic (registered trademark) contains 12.9% L-leucine and 9.6% L-valine, it is derived from a high-calorie amino acid infusion, assuming that all of these are saccharified. Of the 39.4 μM glycated amino acids mixed into the body, αFL contains 5 μM and αFV contains 4 μM.
For example, when the effect of CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D is estimated based on the above values, CFP-T7-62S / 261W / 263S / 355D is 10 μM αFL or 5 μM. Even if αFV coexists, it is considered that αFVH can be measured accurately with almost no effect, and it may be affected by glycated amino acids that are predicted to be brought into the blood of patients who received Unicalic®. It is suggested that the sex is significantly lower. That is, it was found that by using the substitution-introduced amadriase of the present invention, αFVH can be easily and accurately quantified without being affected by the glycated amino acid derived from the high-calorie amino acid infusion solution, which has been a problem in the past.
［実施例５］
（各種アマドリアーゼへの点変異導入）
本発明の知見は、まずＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼを用いて検証されたが、上述の通り、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様な効果を奏することが期待できるという示唆を与え得る。そこで、発明者らは、実際に本発明の知見を、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも導入して、この検証を行った。
[Example 5]
(Introduction of point mutations into various amadriase)
The findings of the present invention were first verified using amadriase derived from the genus Coniochaeta, but as described above, the amino acid sequence of amadriase derived from other species with reference to the information obtained by the known alignment treatment based on sequence identity. By introducing a similar mutation at the corresponding position in, it can be suggested that a similar effect can be expected. Therefore, the inventors actually introduced the findings of the present invention into a plurality of amadriase other than the amadriase derived from the genus Coniochaeta, and carried out this verification.
１．Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入 配列番号３０はＮｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼのアミノ酸配列であり、配列番号３０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３６）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを大腸菌で発現させることにより、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼの活性が確認されている（国際公開第２０１２／１８０９４号パンフレット参照）。 1. 1. Introducing a point mutation into a ketoamine oxidase gene derived from Neocospospora plasmid SEQ ID NO: 30 is an amino acid sequence of ketoamine oxidase derived from Neocospospora vasinfecta, and is a recombinant into which a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 (SEQ ID NO: 36) is inserted. By expressing the plasmid pET22b-NvFX in Escherichia coli, the activity of ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta has been confirmed (see International Publication No. 2012/18094).
Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号３７、３８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがセリンに置換されたＮｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｓ）株を得た。
Synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 37 and 38, KOD-Plus- (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.), using the recombinant plasmid pET22b-NvFX as a template, in order to introduce a substrate specificity-improving mutation into ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta. ) Was used for PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of the DNA encoding amadriase in the plasmid DNA retained by the growing colony under the same conditions as in Example 1. As a result, a recombinant plasmid (pET22b-NvFX-62S) encoding a ketoamine oxidase gene derived from Neocosmospora vasinfecta in which arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 was replaced with serine was obtained.
Then, Escherichia coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX-62S) strain.
２．Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号３５はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために６０位のセリンをグリシンへ置換したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、配列番号３５のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸを大腸菌で発現させることにより、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性が確認されている（国際公開第２０１２／１８０９４号パンフレット参照）。
2. 2. Introducing a point mutation into the fructosyl amino acid oxidase gene derived from Pencillium crysogenum SEQ ID NO: 35 is an amino acid sequence of fructosyl amino acid oxidase derived from Pencillium crysogenum in which serine at position 60 is replaced with glycine to impart fructosyl peptide oxidase activity. By expressing in Escherichia coli the recombinant plasmid pET22b-PcFX into which the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 has been inserted, the activity of fructosyl amino acid oxidase derived from Pencillium lysogenum has been confirmed (International Publication No. 2012/18094). See brochure).
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸを鋳型にして、配列番号４０、４１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３５記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがセリンに置換されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸ−６２Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸ−６２Ｓ）株を得た。
KOD-Plus- (Toyo Spinning Co., Ltd.), a synthetic oligonucleotide of SEQ ID NOs: 40 and 41, using the recombinant plasmid pET22b-PcFX as a template in order to introduce a substrate-specificity-improving mutation into fructosyl amino acid oxidase derived from Pencillium crysogenum. The same conditions as in Example 1 were used to carry out PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of the DNA encoding amadriase in the plasmid DNA retained by the growing colony. As a result, a recombinant plasmid (pET22b-PcFX-62S) encoding a fructosyl amino acid oxidase gene derived from Pencillium crysogenum in which arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 was replaced with serine was obtained.
Then, Escherichia coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-PcFX-62S) strain.
３．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号３３はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために５９位のセリンをグリシンへ置換したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、配列番号３３のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを大腸菌で発現させることにより、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの活性が確認されている（国際公開第２０１２／１８０９４号パンフレット参照）。
3. 3. Introducing a point mutation into the Aspergillus nidulans-derived fructosyl amino acid oxidase gene SEQ ID NO: 33 is an amino acid sequence of Aspergillus nidulans-derived fructosyl amino acid oxidase in which serine at position 59 is replaced with glycine in order to impart fructosyl peptide oxidase activity. The activity of Aspergillus nidulans-derived fructosyl amino acid oxidase has been confirmed by expressing in Escherichia coli the recombinant plasmid pET22b-AnFX into which the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 has been inserted (International Publication No. 2012/18094). See brochure).
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号４３、４４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３３記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがセリンに置換されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｓ）株を得た。
In order to introduce a substrate-specificity-improving mutation into fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans, a synthetic oligonucleotide of SEQ ID NOs: 43 and 44, KOD-Plus- (Toyo Spinning Co., Ltd.) was used as a template using the recombinant plasmid pET22b-AnFX. The same conditions as in Example 1 were used for PCR reaction, transformation of Escherichia coli JM109, and nucleotide sequence determination of DNA encoding amadriase in plasmid DNA retained by growing colonies. As a result, a recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61S) encoding a fructosyl amino acid oxidase gene derived from Aspergillus nidulans in which arginine at position 61 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 was replaced with serine was obtained.
Then, Escherichia coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-AnFX-61S) strain.
４．点変異を導入した各種アマドリアーゼの基質特異性改善効果の評価
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｓ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸ−６２Ｓ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｓ）株を、実施例１の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。比較対象として、変異を導入する前のアマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ）株も、同様の方法で培養して、各種アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、実施例１（４）に準じた活性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの基質特異性評価を行った。結果を表５に示す。表中のデータにおいて、上段の数値はαＦＶＨの反応性に対する各種糖化アミノ酸の反応性の割合であり、下段の数値は改変前の各種アマドリアーゼの反応性を１００とした場合の、変異導入後の反応性の比率である。
4. Evaluation of Substrate Specificity Improving Effect of Various Amadriase Introduced Point Mutations Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX-62S) strain, Escherichia coli BL21 (DE3) (DE3) having the modified amadriase-producing ability obtained as described above. The pET22b-PcFX-62S) strain and the Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-AnFX-61S) strain were cultured by the method of Example 1 to prepare 0.6 ml of a crude enzyme solution of various modified amadriase. For comparison, Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX) strain, Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-PcFX) strain, Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-AnFX) strain having amadriase-producing ability before introduction of the mutation Was also cultured in the same manner to prepare 0.6 ml of crude enzyme solution of various amadriase. Using each of the obtained crude enzyme solutions as a sample, the substrate specificity of various modified amadriase was evaluated according to the activity measurement method according to Example 1 (4). The results are shown in Table 5. In the data in the table, the upper value is the ratio of the reactivity of various glycated amino acids to the reactivity of αFVH, and the lower value is the reaction after the introduction of the mutation when the reactivity of various amadriase before modification is 100. The ratio of sex.
表５に示す通り、本実施例の条件下では、ＮｖＦＸのαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＮｖＦＸ−６２ＳのαＦＬ／αＦＶＨは、９１％まで低下した。同様に、αＦＡ／αＦＶＨは６４％まで低下し、αＦＧ／αＦＶＨは６８％まで低下し、αＦＶ／αＦＶＨは７８％まで低下した。
また、ＰｃＦＸのαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＰｃＦＸ−６２ＳのαＦＬ／αＦＶＨは、８１％まで低下した。同様に、αＦＡ／αＦＶＨは８６％まで低下し、αＦＧ／αＦＶＨは３６％まで低下し、αＦＶ／αＦＶＨは８７％まで低下した。
また、ＡｎＦＸのαＦＬ／αＦＶＨを１００％とした場合に対して、ＡｎＦＸ−６１ＳのαＦＬ／αＦＶＨは、６７％まで低下した。同様に、αＦＡ／αＦＶＨは２１％まで低下し、αＦＧ／αＦＶＨは３０％まで低下し、αＦＶ／αＦＶＨは６３％まで低下した。
すなわち、配列番号１に示すＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換は、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおいても実際に基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることが確認された。
As shown in Table 5, under the conditions of this example, αFL / αFVH of NvFX-62S decreased to 91% as compared with the case where αFL / αFVH of NvFX was set to 100%. Similarly, αFA / αFVH decreased to 64%, αFG / αFVH decreased to 68%, and αFV / αFVH decreased to 78%.
Further, the αFL / αFVH of PcFX-62S decreased to 81% with respect to the case where αFL / αFVH of PcFX was set to 100%. Similarly, αFA / αFVH decreased to 86%, αFG / αFVH decreased to 36%, and αFV / αFVH decreased to 87%.
Further, the αFL / αFVH of AnFX-61S decreased to 67% with respect to the case where the αFL / αFVH of AnFX was 100%. Similarly, αFA / αFVH decreased to 21%, αFG / αFVH decreased to 30%, and αFV / αFVH decreased to 63%.
That is, the substitution of the amino acid at the position corresponding to arginine at position 62 of the Amadriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 with serine is a ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, a fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium crysogenum, and Aspergillus. It was confirmed that amino acid oxidase is also an effective substitution for the production of amadriase whose substrate specificity is actually improved.
Claims (8)
（ｉ）配列番号３０、３３または３５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；
（ｉｉ）以下の置換：
（ｖ）配列番号１の６４位に対応する位置のアミノ酸の、セリン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸への置換；
を有し、基質終濃度５ｍＭ、ｐＨ７．０で活性を測定して、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対する、
以下の（ｂ）から（ｄ）：
（ｂ）α−フルクトシルアラニン
（ｃ）α−フルクトシルグリシン
（ｄ）α−フルクトシルバリン
よりなる群から選択される１以上の糖化アミノ酸への反応性の割合が、上記置換を有しないアマドリアーゼと比較して、低減している
の性質を有するアマドリアーゼ。 The following (i) and (ii):
(I) It has an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30, 33 or 35;
(Ii) Substitution:
(V) the amino acid positions corresponding to position 64 of SEQ ID NO: 1, serine, the substitution of aspartic acid or glutamic acid;
The activity was measured at a substrate final concentration of 5 mM and pH 7.0, and the reactivity to α-fructosylvalyl histidine was measured.
From ( b ) to (d) below:
( B) α-fructosylalanine (c) α-fructosylglycine (d) The percentage of reactivity to one or more glycated amino acids selected from the group consisting of α-fructosylvaline does not have the above substitutions. Amadriase with reduced properties compared to amadriase.
請求項１に記載のアマドリアーゼ。 (V) the amino acid position corresponding to position 64 of SEQ ID NO: 1 is substituted with serine;
The amadriase according to claim 1.
以下の（ｔ）から（ｚ）：
（ｔ）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニンまたはセリンに置換されている；
（ｕ）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている；
（ｗ）配列番号１の２６１位に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、アスパラギンまたはリプトファンに置換されている；
（ｚ）配列番号１の４１７位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換されている；
のいずれか１以上を有する、請求項１または２に記載のアマドリアーゼ。 Amadriase, and more
It follows from (t) (z):
(T) amino acid at the position corresponding to position 62 of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine or serine;
(U) amino acid at the position corresponding to position 63 of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine;
(W) an amino acid in the position corresponding to 261 of SEQ ID NO: 1 is substituted phenylalanine, aspartic or script fan;
(Z) the amino acid at the position corresponding to 417 of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine;
The amadriase according to claim 1 or 2 , which has any one or more of the above .
（ｉ）請求項６に記載の宿主細胞を培養する工程；
（ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程
を含む、アマドリアーゼを製造する方法。 The following steps:
(I) The step of culturing the host cell according to claim 6 ;
(Ii) A method for producing amadriase, which comprises a step of expressing an amadriase gene contained in a host cell; and (iii) a step of isolating the amadriase from a culture.
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